DE68911461T2

DE68911461T2 - Derivate des basischen Mensch-/Rinder-Fibroblastwachstumsfaktors.

Info

Publication number: DE68911461T2
Application number: DE68911461T
Authority: DE
Inventors: Laura Bergonzoni; Gilles Cauet; Antonella Isacchi; Paolo Sarmientos
Original assignee: Carlo Erba SpA
Current assignee: Pfizer Italia SRL
Priority date: 1988-09-16
Filing date: 1989-09-15
Publication date: 1994-05-19
Anticipated expiration: 2009-09-16
Also published as: MY104910A; EP0396664A1; CA1340834C; AU620925B2; NZ230621A; IL91615A0; ZA897020B; DK120290D0; KR900702027A; ES2061855T3; WO1990002800A1; GB8821795D0; JP2888575B2; ATE98693T1; PT91719B; YU179489A; DE68911461D1; HUT53937A; JPH03501855A; FI902391A0

Description

Die Erfindung betrifft neue Derivate von molekularen Einheiten des basischen Fibroblasten-Wachstumsfaktors (bFGF), ihre Herstellung durch rekombinante DNA-Techniken sowie damit verbundene Expressionsplasmide und codierende DNA-Sequenzen. Die neuen erfindungsgemäßen molekularen bFGF-Varianten können als Antagonisten und/oder Superagonisten des Wildtyp-Moleküls im angiogenen Prozeß wirken.
Das in der vorliegenden Anmeldung offenbarte Verfahren zur Herstellung dieser neuen Moleküle sowie des Wildtyp-bFGF basiert auf rekombinanten Stämmen von E. coli, die mit Plasmiden transformiert worden sind, die Nucleotidsequenzen tragen, die für bFGF von Mensch und Rind und ihre Derivate codieren.

Einführung

Die Bildung von Blutkapillaren tritt bei einer Anzahl wichtiger biologischer Prozesse auf, und zwar entweder bei physiologischen Prozessen, wie der Organentwicklung und der Wundheilung, oder bei pathologischen Prozessen, wie dem Tumorwachstum (J. Denekamp: Vascular endothelium as the vulnerable element in tumors. Acta Radiol. (oncol), Bd. 23 (1984), S. 217-225; B. Hobson und J. Denekamp: Endothelial proliferation in tumours and normal tissues: continous labelling studies. Br. J. Cancer, Bd. 49 (1984), S. 405-413; J. Folkman: Tumor angiogenesis. Adv. Cancer Res., Bd. 43 (1985), S. 175-203).
Während die Abfolge von Ereignissen, die zur Neubildung von Gefäßen führt, morphologisch charakterisiert worden ist, werden die molekularen Mechanismen, durch die dieser Prozeß auftritt, immer noch schlecht verstanden. Die Steuerung des Wachstums des kapillaren Endothels scheint sehr streng zu sein, da diese Zellen normalerweise eine statische Monoschicht bilden, deren Proliferation im angiogenen Prozeß ausgelöst wird (J. Folkman: Tumor angiogenesis. Adv. Cancer Res., Bd. 43 (1985), S.175-203; J. Joseph-Silverstein und B.D. Rifkin: Endothelial cell growth factors and the vessel wall. Seminars in Thromb. and Hemost., Bd. 13 (1987), S. 504- 513).
Die normalerweise untätige Natur der Endothelzellen kann möglicherweise teilweise durch das offensichtliche Fehlen von Endothelzell-Wachstumsfaktoren im Plasma erklärt werden.
Die hauptsächlichen Endothelzellmitogene werden in der Tat nicht im Plasma gefunden, obwohl sie in Extrakten von fast allen untersuchten Geweben sowie in vielen normalen Zellinien und Tumorzellinien vorhanden sind (J. Joseph-Silverstein und B.D. Rifkin: Endothelial cell growth factors and the vessel wall. Seminars in Thromb. and Hemost., Bd. 13 (1987), S. 504- 513; J. Folkman und M. Klagsbrun: Angiogenic Factors. Science, Bd. 235 (1987), S. 442-447).
Die örtliche Induktion einer raschen Endothelzell- Proliferation beinhaltet daher möglicherweise die Freisetzung von Endothelzellmitogenen aus Zellen als Antwort auf Umweltreize.
Die am besten charakterisierten Endothelzellmitogene sind eine Familie von Polypeptidwachstumsfaktoren unter Einschluß des basischen Fibroblasten-Wachstumsfaktors (bFGF), die aufgrund ihrer hohen Affinität für Heparin auch als Heparinbindende Wachstumsfaktoren bekannt sind (K. Thomas: Fibroblast growth factors. FASEB J., Bd. 1 (1987), S. 434- 440; D. Gospodarowicz, G. Neufeld und L. Schweigerer. Fibroblast growth factor: structural and biological properties. J. Cell. Physiol., Bd. 5 (1987), S. 15-26).
Basischer FGF ist aus den meisten aus Mesoderm oder Neuroectoderm abgeleiteten Geweben oder Zellen isoliert worden.
Strukturelle Untersuchungen haben gezeigt, daß es sich bei bFGF um ein einzelsträngiges Polypeptid aus 146 Aminosäuren handelt, das auch in NH&sub2;-terminal verkürzten Formen vorliegen kann, denen die ersten 10 bis 20 Aminosäuren fehlen.
Die verkürzten Formen von FGF sind so wirksam wie der native bFGF, wie durch Radiorezeptorbindung und biologische Assays gezeigt wurde (D. Gospodarowicz, G. Neufeld und L. Schweigerer: Fibroblast growth factor. Mol. Cell. Endocrin., Bd. 46 (1986), S. 187-206; D. Gospodarowicz, G. Neufeld und L. Schweigerer: Molecular and biological characterization of fibroblast growth factor: an angiogenic factor which also controls the proliferation and differentiation of mesoderm and neuroectoderm derived cells. Cell. Differ., Bd. 19 (1986), S. 1-17; K. Thomas und G. Gimenez-Gallego: Fibroblast growth factors: broad spectrum mitogens with potent angiogenic activity. Trends Biochem. Sci., Bd. 11 (1986), S. 81-84).
Außerdem haben Modifizierungen der Reinigungsvorschrift durch Ersatz der sauren Extraktion durch eine neutrale Extraktion aus homogenisiertem Gewebe und Zugabe von Proteaseinhibitoren eine längere, 154 Reste umfassende Form ergeben (N. Ueno, A. Baird, F. Esch, N. Ling und R. Guillemin: Isolation of an amino terminal extended form of basic fibroblast growth factor. Biochem. Biophys. Res. Commun., Bd. 138 (1986), S. 580-588; M.T. Story, F. Esch, S. Shimasaki, J. Sasse, S.C Jacobs und R.K. Lawson: Aminoterminal sequence of a large form of basic fibroblast growth factor isolated from human benign prostatic hyperplastic tissue. Biochem. Biophys. Res. Commun., Bd. 142 (1987), S. 702-709; M. Klagsbrun, S. Smith, R. Sullivan, Y. Shing, S. Davidson, J.A. Smith und J. Sasse: Multiple forms of basic fibroblast growth factor: aminoterminal cleavages by tumor cell- and brain cell-derived acid proteinases. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 84 (1987), S. 1839-1843).
Die beobachtete Mikroheterogenität von FGFs scheint mindestens zum Teil ihre Ursache in einer teilweisen Proteolyse nahe dem Aminoterminus zu haben, die entweder in vivo oder während der Reinigung auftritt. Da jedoch die verschiedenen Formen gleich aktiv zu sein scheinen, ist die Mikroheterogenität wahrscheinlich physiologisch irrelevant.
Basischer FGF scheint während der Evolution überaus gut konserviert zu sein. Zum Beispiel unterscheiden sich bFGF von Rind und Mensch nur in zwei ihrer 146 Aminosäuren, was eine gesamte Aminosäuresequenzhomologie von 98,7 % ergibt (D. Gospodarowicz, G. Neufeld und L. Schweigerer: Molecular and biological characterization of fibroblast growth factor: an angiogenic factor which also controls the proliferation and differentiation of mesoderm and neuroectoderm derived cells. Cell. Differ., Bd. 19 (1986), S. 1-17).
Verwandt mit bFGF ist saurer FGF (aFGF), der eine gesamte Sequenzhomologie von 55 % mit bFGF aufweist. Bei saurem FGF handelt es sich um ein 140 Aminosäuren umfassendes Polypeptid, das ebenfalls in einer NH&sub2;-terminal verkürzten Form, der die ersten 6 Aminosäuren fehlen, vorliegen kann (G. Gimenez-Gallego, G. Conn, V.B. Hatcher und K.A. Thomas: The complete amino acid sequence of human brain-derived acidic fibroblast growth factor. Biochem. Biophys. Res. Commun., Bd. 138 (1986), S. 611-617).
Basischer FGF und saurer FGF besitzen zwei mögliche Bindungsdomänen für Heparin, wobei eine nahe dem NH&sub2;-Terminus angeordnet ist, während die andere nahe dem COOH-Terminus angeordnet ist. Beide Domänen können an der starken Affinität von FGF gegenüber Heparin beteiligt sein (D. Gospodarowicz, G. Neufeld und L. Schweigerer: Fibroblast growth factor. Mol. Cell. Endocrin., Bd. 46 (1986), S. 187-206; D. Gospodarowicz, G. Neufeld und L. Schweigerer: Molecular and biological characterization of fibroblast growth factor: an angiogenic factor which also controls the proliferation and differentiation of mesoderm and neuroectoderm derived cells. Cell. Differ., Bd. 19 (1986), S. 1-17; A. Baird, D. Schubert, N. Ling und R. Guillemin: Receptor- and heparin-binding domains of basic fibroblast growth factor. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 85 (1988), S. 2324-2328).
Der hohe Grad an Homologie zwischen aFGF und bFGF deutet an, daß sie von einem einzigen Urgen abstammen. Kürzlich sind die FGF-Gene cloniert worden, und komplementäre DNA-Sequenzen sowohl von bFGF als auch von aFGF sind bestimmt worden (J.A. Abraham, J.L. Whang, A. Tumolo, A. Mergia, J. Friedman, D. Gospodaropwicz und J.C. Fiddes: Human basic fibroblast growth factor: nucleotide sequence and genomic organization. EMBO J., Bd. 5 (1986), S. 2523-2528; J.A. Abraham, A. Mergia, J.L. Whang, A. Tumolo, J. Friedman, K.A. Hjerrild, D. Gospodarowicz und J.C. Fiddes: Nucleotide sequence of a bovine clone encoding the angiogenic protein, basic fibroblast growth factor. Science, Bd 233 (1986), S. 545-548; M. Jaye, R. Howk, G.A. Burgess, W. Ricca, I.M. Chiu, M.W. Ravera, S.J. O'Brien, W.S. Modi, T. Maciag und W.N. Drolian: Human endothelial cell growth factor: Cloning nucleotide sequence and chromosome localization. Science, Bd. 233 (1986), S. 541-545).
Die Analysen der Nucleotidsequenz von cDNA-Clonen von Mensch und Rind deuten darauf hin, daß das primäre Translationsprodukt für basischen FGF aus 155 Aminosäuren besteht. Kürzlich haben jedoch Sommer et al. eine neue, 157 Aminosäuren umfassende Form des menschlichen basischen FGF mit zwei zusätzlichen Aminosäuren am NH&sub2;-Terminus isoliert (A. Sommer, M.T. Brewer, R.C. Thompson, D. Moscatelli, M. Presta und D.B. Rifkin: A form of human basic fibroblast growth factor with an extended amino terminus. Biochem. Biophys. Res. Commun., Bd. 144 (1987), S. 543-550).
Interessanterweise entsprechen diese beiden Aminosäuren den Codons, die im zuvor beschriebenen menschlichen cDNA-Clon gefunden werden. Fig. 1 faßt die verschiedenen Formen von basischem FGF zusammen, die bisher isoliert oder aus der cDNA-Sequenz abgeleitet wurden. Fig. 2 zeigt die Primärstruktur der 155 Aminosäuren umfassenden Form.
Wie zuvor erwähnt wurde, betrifft die vorliegende Erfindung molekulare Varianten von menschlichem basischem FGF. Diese neuen molekularen Einheiten, die niemals zuvor in der Natur gefunden wurden, sind durch gerichtete Mutagenese des für die 155 Aminosäuren umfassende Form codierenden Gens erhalten worden.
Die Mikroheterogenität des Aminoterminus von basischen FGFs und ihre physiologische Irrelevanz deuten jedoch darauf hin, daß die Modifikationen, die in der vorliegenden Erfindung für die 155 Aminosäuren umfassende Form offenbart und beschrieben werden, äquivalent zu den gleichen Modifikationen sind, die möglicherweise für andere Formen von FGF erhalten werden (siehe nachstehend).

Hintergrund der Erfindung

Es ist bereits betont worden, daß die Angiogenese ein streng gesteuerter Prozeß ist, der eine pathologische Bedeutung annehmen kann, da er zur Entwicklung fester Tumoren beiträgt. Im Hinblick auf die Schlüsselrolle von bFGF bei der Angiogenese wären Varianten dieses Moleküls, die mit endogenem FGF konkurrieren können, während sie biologisch inaktiv sind, wertvolle Mittel bei der Antikrebstherapie.
Andererseits ist das neue kapillare Wachstum die Grundlage normaler homöostatischer Mechanismen, die die Basis für Fortpflanzung, Wachstum und Entwicklung bilden. Dementsprechend könnten Analoga von bFGF mit verstärkter biologischer Aktivität eine Anzahl möglicher Anwendungen umfassen, wie das Heilen von Verbrennungen, Wunden (unter Einschluß der Hornhaut des Auges) und chirurgischer Schnitte; die Behandlung von Hautgeschwüren, unter Einschluß von Wunden; die Wiederingangsetzung des Blutstroms nach Herzattacken durch Erneuerung geschädigter Gewebe; und die Behandlung einiger Skelettmuskelverletzungen.
Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht daher darin, rekombinante Analoga von basischem FGF, die eine modifizierte biologische Aktivität aufweisen, zu entwickeln und herzustellen.
Um zu verstehen, welche Änderungen in der Aminosäuresequenz von basischem FGF seine funktionellen Eigenschaften beeinflussen könnten, kann eine Anzahl verwandter Proteine, die eine sehr hohe Homologie mit basischem FGF aufweisen, in Betracht gezogen werden. Diese Familie von Proteinen umfaßt sauren FGF sowie hst und int-2, zwei kürzlich entdeckte Oncogenprodukte (T. Yoshida, K. Miyagawa, H. Odagiri, H. Sakamoto, P.F.R. Little, M. Terada und T. Sugimura: Genomic sequence of hst, a transforming gene encoding a protein homologous to fibroblast growth factors and the int-2-encoded protein. proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 84 (1987) S. 7305- 7309; P. Delli Bovi, A.M. Curatola, F.G. Kern, A. Greco, M. Ittmann und C. Basilico: An oncogene isolated by transfection of kaposi's sarcoma DNA encodes a growth factor that is a member of the FGF family. Cell, Bd. 50 (1987), S. 729-737).
Alle diese Moleküle unter Einschluß von bFGF bilden eine Familie von Faktoren, die am Zellwachstum und an der Regulation beteiligt sind. Die primären Sequenzen dieser Proteine werden in Fig. 3 miteinander verglichen.
Wenn die Homologie zwischen diesen Proteinen in Betracht gezogen wird, dann können hochgradig konservierte Regionen der Primärstruktur festgestellt werden. Die Konservierung derartiger Domänen zeigt möglicherweise nicht nur eine strukturelle, sondern auch eine gewisse funktionelle Homologie zwischen diesen Proteinen an.
In der Tat ist allen diesen Proteinen eine starke Affinität für Heparin gemeinsam, und sie scheinen eine wichtige Rolle bei angiogenen Prozessen zu spielen, möglicherweise unter Einschluß einer Proliferation neuer Kapillaren, die die Tumorentwicklung unterstützen.
Wenn die konservierten Domänen für die gemeinsamen Merkmale dieser Proteine verantwortlich sind, dann sind die stark verschiedenartigen Sequenzen möglicherweise die Ursache für die verschiedenen biologischen Rollen dieser Faktoren.
Dementsprechend können Änderungen in einer dieser Regionen möglicherweise die biologische Aktivität von basischem FGF dramatisch beeinflussen.
Im Hinblick auf diese Überlegungen haben die Autoren der vorliegenden Erfindung durch gentechnische Verfahren neue Derivate von basischem FGF aus Mensch und Rind konstruiert, die, in einem Fall, Aminosäuresequenzen innerhalb verschiedener Regionen des bFGF-Moleküls verloren haben und die, in einem zweiten Fall, Aminosäuresubstitutionen in spezifischen Positionen aufweisen. Die Modifizierungen wurden entsprechend den Homologien und den Unterschieden zwischen den verschiedenen bekannten Wachstumsfaktoren gewählt. Die molekularen Merkmale der Mutanten werden nachstehend beschrieben.
Analoga können als rekombinante Proteine in einem ausgewählten Expressionssystem erhalten werden.
Die gewünschten Änderungen können unter Modifizierung des bFGF-Gens durch gentechnische Verfahren vor seiner Expression in einem geeigneten Organismus erzielt werden. Unter bFGF-Gen wird eine DNA-Sequenz verstanden, die durch Clonierung aus einer cDNA-Bibliothek oder durch Zusammensetzen synthetischer Oligonucleotide erhalten werden kann (T. Maniatis, E.F. Frisch und J. Sambrook, Molecular cloning. A laboratory manual. Cold Spring Harbour Laboratory. Cold Spring Harbour, NY, 1982).
Die Erfindung betrifft auch ein rekombinantes DNA-Verfahren zur Herstellung von bFGF und seiner Derivate.

Molekulare Merkmale der Mutanten

In der vorliegenden Erfindung bedeuten "Analoga", "Mutanten" oder "Derivate" Moleküle von bFGF mit veränderten Aminosäuresequenzen. Alle natürlichen Formen von bFGF, die bis heute isoliert und in der Einleitung beschrieben wurden, können verändert werden, um äquivalente Analoga zu erhalten. Bevorzugte Analoga sind Mutanten der 155 Aminosäuren umfassenden Form. Sowohl die Sequenz aus Mensch als auch aus Rind sind in der vorliegenden Erfindung modifiziert worden.
Die neuen bFGF-Derivate wurden durch gerichtete Oligonucleotid-Mutagenese konstruiert.
Insbesondere wurden Oligonucleotide entwickelt und synthetisiert, um Deletionen codierender Regionen innerhalb der bFGF-Gene aus Mensch und Rind zu verursachen. Die Mutagenesetechniken, die verwendet wurden, um die Mutanten zu erhalten, sind ausführlich im Methodenabschnitt beschrieben.
Die mutierten Gene wurden anschließend in E. coli- Expressionsvektoren inseriert, die die Synthese von neuen bFGF-Derivaten steuern können. Die rekombinanten Moleküle werden anschließend gereinigt, charakterisiert und schließlich in großen Mengen hergestellt.
Die neuen bFGF-Derivate, die die Aufgabe der vorliegenden Erfindung bilden, werden nachstehend ausführlich beschrieben und in Fig. 4 allgemein erläutert. Die Numerierung der Aminosäuren entspricht der 155 Aminosäuren umfassenden Form, wobei ein Methionin den Rest Nr. 1 und ein Serin den Rest Nr. 155 darstellt. Es können jedoch alle beschriebenen Formen von bFGF verändert werden, um die gleichen Deletionen zu erhalten. Darüber hinaus können sowohl die Form aus Rind als auch aus Mensch zur Konstruktion der Mutanten verwendet werden.
Bevorzugte bFGF-Derivate sind nachstehend angegeben:
M1-bFGF ist ein Derivat von bFGF, dem die Reste 27 bis 32 (Lys-Asp-Pro-Lys-Arg-Leu) der Aminosäuresequenz fehlen;
M2-bFGF ist ein Derivat von bFGF, dem die Reste 54 bis 58 (Glu-Lys-Ser-Asp-Pro) der Aminosäuresequenz fehlen;
M3-bFGF ist ein Derivat von bFGF, dem die Reste 70 bis 75 (Gly-Val-Val-Ser-Ile-Lys) der Aminosäuresequenz fehlen;
M4-bFGF ist ein Derivat von bFGF, dem die Reste 78 bis 83 (Cys-Ala-Asn-Arg-Tyr-Leu) der Aminosäuresequenz fehlen;
M5-bFGF ist ein Derivat von bFGF, dem die Reste 110 bis 120 (Asn-Asn-Tyr-Asn-Thr-Tyr-Arg-Ser-Arg-Lys-Tyr) der Aminosäuresequenz fehlen;
M6a-bFGF ist ein Derivat von bFGF, bei dem die Reste Lysin und Arginin in den Positionen 128 bzw. 129 durch Glutaminreste ersetzt sind;
M6b-bFGF ist ein Derivat von bFGF, bei dem die Lysinreste in den Positionen 119 und 128 und die Argininreste in den Positionen 118 und 129 alle durch Glutaminreste ersetzt sind.
Die ausführliche Aminosäuresequenz der Mutanten ist in Fig. 5 erläutert.
Polypeptide mit zusätzlichen Aminosäureresten, die entweder am NH&sub2;-Terminus oder am COOH-Terminus oder an beiden addiert wurden, werden innerhalb der vorliegenden Erfindung in Betracht gezogen. Derartige Extensionen können aus technischen Gründen bei der Expression von Mutanten durch rekombinante DNA-Techniken erforderlich sein (M. Courtney, S. Jallat, L.H. Tessier, A. Benavente und R.G. Crystal: Synthesis in E. coli of alfal-antitrypsin variants of therapeutic potential for emphysema and thrombosis. Nature, Bd. 313 (1985), S. 149-151; K. Nagai und H.C. Thogersen: Generation of ß-globin by sequence specific proteolysis of a hybrid protein produced in E. coli. Nature, Bd. 309 (1984), S. 810-812).
Alternativ dazu können die zusätzlichen Reste dazu dienen, um die pharmakologische Wirksamkeit der Mutanten zu verstärken, z.B. durch Verlängerung ihrer Halbwertszeit im Plasma.

Einzelheiten des zur Herstellung der Mutanten entwickelten Verfahrens

Um wirksam die neuen bFGF-Derivate herzustellen, haben wir ein rekombinantes DNA-Verfahren entwickelt, das im Labormaßstab und im Pilotmaßstab die Herstellung der erforderlichen Mengen für eine biologische und klinische Bewertung der verschiedenen Moleküle erlaubt.
Dieses Verfahren basiert auf der Fermentation von Stämmen von E. coli, die durch gentechnische Verfahren modifiziert wurden, um in hohen Konzentrationen die mutierten Gene zu exprimieren.
Einzelheiten des Herstellungsverfahrens sind nachstehend angegeben:

1) Konstruktion einer synthetischen DNA-Sequenz für bFGF

Alle für die Expression der Wildtypform des basischen FGF und seiner Derivate verwendeten Sequenzen wurden synthetisch rekonstruiert. Dies wurde durch Synthese von Oligonucleotiden mit überlappenden Sequenzen in einem DNA-Synthese-Automaten, wie einem Synthese-Automaten der Bezeichnung Applied Biosystem Inc. Model 380B, durchgeführt (M.H. Caruthers: Gene synthesis machines; DNA chemistry and its uses. Science, Bd. 230 (1985), S. 281-285).
Die überlappenden Oligonucleotide wurden unter Bildung doppelsträngiger DNA-Ketten zusammengefügt, Lücken wurden mit DNA-Polymerase und mit T4-Ligase aufgefüllt.
Unmittelbar in 5'-Position der für FGF-codierenden Sequenz wurde im codierenden Strang ein ATG-Startsignal bereitgestellt. Im Fall der 155 Aminosäure umfassenden Form von bFGF konnten wir als Startcodon das ATG für ein Methionin, das natürlicherweise als erster Rest auftritt, verwenden, so daß keine zusätzliche Aminosäure am N-Terminus des exprimierten Polypeptids addiert wurde (J.A. Abraham, J.L. Whang, A. Tumolo, A. Mergia, J. Friedman, D. Gospodarowicz und J.C. Fiddes: Human basic fibroblast growth factor: nucleotide sequence and genomic organization. EMBO J., Bd. 5 (1986), S. 2523-2528; J.A. Abraham, A. Mergia, J.L. Whang, A. Tumolo, J. Friedman, K.A. Hjerrild, D. Gospodarowicz und J.C. Fiddes: Nucleotide sequence of a bovine clone encoding the angiogenic protein, basic fibroblast growth factor. Science, Bd. 233 (1986), S. 545- 548).
Alternativ dazu wurde, um die Expression von FGF in E. coli zu erhöhen, das 5 -Ende der Sequenz ohne Änderung der Primärstruktur des Proteins verändert. Genauer gesagt wurde die Nucleotidsequenz so modifiziert, wie es in Fig. 6 erläutert ist.

2) Konstruktion von mutierten Sequenzen für bFGF-Derivate

Um die in der vorliegenden Erfindung beschriebenen Mutanten zu erhalten, wurden die Wildtyp-bFGF-Sequenzen verändert, um die gewünschten Deletionen zu erzielen. Dies wurde durch Modifizierung des Gens durch gerichtete Mutagenese erzielt (K. Norris, F. Norris, L. Christiansen und N. Fiil: Efficient site-directed mutagenesis by simultaneous use of two primers. Nucleic Acid Research, Bd. 11 (1983), S. 5103-5112).
Das Prinzip dieses Verfahrens besteht darin, einen Subclon des bFGF-Gens in einem Vektor zu erzeugen, der in einer einzelsträngigen Form erhalten werden kann, wie der Phagen- Vektor M13. Der rekombinante Einzelstrang wird mit einem komplementären synthetischen Oligodesoxyribonucleotid, das für die gewünschten Modifizierungen codiert, anelliert. DNA- Polymerase und Ligase werden anschließend verwendet, um den neuen Strang auszudehnen und in die kreisförmige Form zu ligieren. Der neu erzeugte DNA-Heteroduplex wird verwendet, um eine Zellinie zu transformieren, in der er repliziert werden kann und in der Nachkommen gebildet werden können, bei denen sich der Phage, der das Wildtypgen oder das Gen mit der gewünschten Deletion trägt, sich in zwei verschiedene molekulare Spezies trennt.
Die mutagenen Ausgangsoligonucleotide können dann als Sonden verwendet werden, um die mutierten Gene zu erkennen. Die Technik der gerichteten Mutagenese wird ausführlich im Methodenabschnitt beschrieben.
Insbesondere wurde die synthetische Sequenz für Wildtyp-bFGF und zwar alternativ aus Rind oder Mensch, in einen M13-Vektor inseriert, und der resultierende Einzelstrang wurde als Mutagenesematrize verwendet (K. Norris, F. Norris, L. Christiansen und N. Fiil: Efficient site-directed mutagenesis by simultaneous use of two primers. Nucleic Acid Research, Bd. 11 (1983), S. 5103-5112).

3) Expression von Wildtyp-bFGF und seinen Derivaten

Um die Expression des Wildtyps und der mutierten Sequenzen von bFGF in rekombinanten Stämmen von E. coli zu erzielen, wurden diese Sequenzen in Expressionsplasmide inseriert, die die für die Transkription und Translation der neuen Gene verantwortlichen Sequenzen enthielten. Genauer gesagt haben wir als regulatorische Signale den Tryptophan-Promotor von E. coli und die Ribosombindungsstelle des lambda-CII-Proteins verwendet (R.W. Hendrix, J.W. Roberts, F.W. Stahl und R.A. Weisberg: Lambda 11 Cold Spring Harbour Laboratory, Cold Spring Harbour, N.Y. 1983).
Der Promotor Ptrp wurde aus dem im Handel erhältlichen Plasmid pDR720 (Pharmacia) erhalten. Die Shine-Dalgarno-CII- Sequenz wurde durch chemische Synthese gemäß der veröffentlichten Sequenz erhalten (R.W. Hendrix, J.W. Roberts, F.W. Stahl und R.A. Weisberg: Lambda II Cold Spring Harbour Laboratory, Cold Spring Harbour, N.Y. 1983).
Ein typischer Expressionsvektor für Wildtyp-bFGF und seine Derivate ist in Fig. 7 gezeigt. Genauer gesagt wurde er durch Zusammensetzen der folgenden Fragmente konstruiert:
a) Das große EcoRI-BamHI-Fragment des Plasmids pDS20 (G. Duester, R.M. Elford, W.N. Holmes: Fusion of the Escherichia coli leucyl transfer RNA-I promotor to the gal-K gene. Analysis of sequences necessary for growth rate dependent regulation. Cell, Bd. 30 (1982), S. 855-964);
b) ein EcoRI-SalI-Fragment des Plasmids pDR720 (Pharmacia, Schweden), das den Tryptophan-Promotor trägt;
c) ein synthetisches SalI-NdeI-Oligonucleotid, das für die cII-Ribosombindungsstelle codiert;
d) ein synthetisches NdeI-XhoII- (BamHI-kompatibles) Fragment, das die Wildtypsequenz oder die mutierte Sequenz für bFGF und seine Derivate enthält.
Eine bevorzugte Sequenz für Wildtyp-bFGF ist in Fig. 6 angegeben. Bevorzugte Sequenzen für bFGF-Analoga sind Modifikationen dieser Sequenz gemäß den in Fig. 5 gezeigten Mutationen.
Die Induktion der Expression der neuen Gene und die Analyse der erhaltenen rekombinanten Proteine wurde durchgeführt, wie es im Methodenabschnitt beschrieben ist.

4) Reinigung der rekombinanten Moleküle und biologische Assays

Die rekombinanten Mutanten können aus bakteriellen Lysaten gereinigt und auf ihre biologischen Merkmale im Vergleich mit Wildtyp-bFGF untersucht werden.
Ein typisches Reinigungsverfahren besteht aus folgenden Stufen: Zellen werden durch Ultraschallbehandlung aufgebrochen und zentrifugiert. Der Überstand wird auf eine Ionenaustausch-S-Sepharose-Säule aufgetragen.
Das Protein wird mit einem Natriumchlorid-Gradienten eluiert und direkt auf eine Heparin-Sepharose-Affinitätssäule aufgetragen.
Das Protein wird mit einem Natriumchlorid-Gradienten eluiert und durch Gelfiltration vor der Lyophilisierung entsalzt.
Gereinigte Analoga können nachfolgend auf ihre biologische Aktivität untersucht werden.

Eigenschaften der Mutanten, ihre Brauchbarkeit und Verabreichung

Die neuen erfindungsgemäßen Moleküle können als Antagonisten und/oder Superagonisten des Wildtyp-bFGF-Moleküls wirken.
Die Aktivität als bFGF-Agonist wurde z.B. auf der Basis der Fähigkeit zur Erhöhung der Proliferation von Endothelzellen gemäß einem Testverfahren, das dem von Presta et al. in: Molecular and Cellular Biol., Bd. 6 (1986), S.4060 beschriebenen Verfahren analog war, bewertet.
Die Aktivität als bFGF-Antagonist wurde z.B. auf der Grundlage der Hemmung der Bindung von ¹²&sup5;I-bFGF gemäß einem Testverfahren, das analog dem von Baird et al. in: Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 85 (1988), S. 2324 beschriebenen Verfahren war, bewertet.
Auf diese Weise wurde z.B. festgestellt, daß die erfindungsgemäße Verbindung, die durch die Abkürzung M6b identifiziert wird, zu einer 50 %-igen Erhöhung der Endothelzellproliferation bei einer Dosis von 1 ng/ml führt, was auf eine besonders bemerkenswerte Aktivität als b-FGF- Agonist hindeutet.
Wiederum als Beispiel wurde festgestellt, daß die erfindungsgemäßen Verbindungen, die als M3-bFGF und M6a identifiziert werden, eine etwa 20 %-ige bzw. etwa 70 %-ige Hemmung der Bindung von ¹²&sup5;I-bFGF (3 ng/ml) in Gegenwart von 300 ng/ml der Mutante ergeben, was auf eine Aktivität als bFGF-Antagonist hindeutet.
Als bFGF-Superagonisten können die erfindungsgemäßen Verbindungen die Gefäßbildung, das Zellwachstum oder das Überleben von Zellen fördern, und daher können sie z.B. Anwendung bei der Wiederherstellung von Gewebe, z.B. bei der Heilung von Wunden, Verbrennungen, Knochenbrüchen, chirurgischen Abschabungen und Geschwüren unter Einschluß der Wiederherstellung von Geweben während ischämischen und mikrocardialen Infarkten finden.
Als Antagonisten von bFGF können die erfindungsgemäßen Verbindungen als Angiogenese-Inhibitoren wirken und daher z.B. für die Behandlung von Erkrankungen geeignet sein, bei denen die Neubildung von Gefäßen eine wichtige pathologische Erscheinung ist, wie die Retinopathie des Auges; neovaskulare Glaukome; Hautstörungen, z.B. Psoriasis; chronische Entzündungen; rheumatoide Arthritis sowie, wie bereits vorstehend erwähnt wurde, als wertvolle Mittel zur Hemmung der Tumorangiogenese für die Behandlung bestimmter Neoplasmen, insbesondere angiogener Neoplasmen.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen können Säugern unter Einschluß von Menschen in Kombination mit einem oder mehreren pharmazeutisch verträglichen Trägern und/oder pharmazeutisch verträglichen Verdünnungsmitteln in Form einer pharmazeutischen Zusammensetzung verabreicht werden.
Die erforderliche Dosierung des Wirkstoffs hängt vom Alter, Gewicht und Zustand des zu behandelnden Patienten sowie vom Weg der Verabreichung und der Dauer der gewünschten Behandlung ab.
Die pharmazeutischen Zusammensetzungen z.B. für die topische Verabreichung, die Verabreichung ins Auge, die orale Verabreichung, die intravenöse Verabreichung, die subcutane Verabreichung oder die intramuskuläre Verabreichung können auf herkömmliche Weise unter Verwendung herkömmlicher Träger hergestellt werden.
Zusammensetzungen für die topische Anwendung, wie Cremes, Lotionen oder Pasten, können z.B. durch Vermischen des Wirkstoffs mit einem herkömmlichen ölartigen oder emulgierenden Träger hergestellt werden. Lotionen für die topische Verabreichung können z.B. 10 mg/ml bis 100 mg/ml des Wirkstoffs enthalten und bis zu 7 mal täglich auf das betroffene Gebiet aufgetragen werden.
Formulierungen in einem Puffer oder physiologischer Kochsalzlösung oder einem anderen geeigneten Träger können als Augentropfen-Formulierung geeignet sein.
Formulierungen zur oralen Verabreichung, wie Tabletten oder Kapseln, können, zusammen mit dem Wirkstoff, Verdünnungsmittel, z.B. Lactose, Dextrose, Saccharose, Cellulose, Maisstärke oder Kartoffelstärke; Gleitmittel, z.B. Siliciumdioxid, Talk, Stearinsäure, Magnesium- oder Calciumstearat und/oder Polyethylenglykole; Bindemittel, z.B. Stärken, Gummiarabikum, Gelatine, Methylcellulose, Carboxymethylcellulose oder Polyvinylpyrrolidon; Desaggregationsmittel, z.B. Stärke, Alginsäure, Alginate oder Natriumstärkeglycolat; Brausegemische; Farbstoffe; Süßstoffe; Netzmittel, wie Lecithin, Polysorbate, Laurylsulfate; und im allgemeinen nicht-toxische und Pharmakologisch inaktive Substanzen, die in pharmazeutischen Formulierungen verwendet werden, enthalten. Diese pharmazeutischen Zubereitungen können auf bekannte Weise hergestellt werden, z.B. durch Verfahren des Mischens, Granulierens, Tablettierens, Überziehens mit Zucker oder Überziehens mit einem Film.
Die Suspensionen oder Lösungen für intramuskuläre Injektionen können, zusammen mit dem Wirkstoff, einen pharmazeutisch verträglichen Träger, z.B. steriles Wasser, Olivenöl, Ethyloleat, Glycole, z.B. Propylenglycol, und gegebenenfalls eine geeignete Menge an Lidocain-Hydrochlorid enthalten.
Die Lösungen für intravenöse Injektionen oder Infusionen können als Träger z.B. steriles Wasser enthalten, oder sie können vorzugsweise in Form einer sterilen, wäßrigen, isotonischen Kochsalzlösung vorliegen.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen können entweder direkt oder in Form von pharmazeutisch verträglichen Salzen oder Komplexen verabreicht werden.
Beispiele für Salze sind Säureadditionssalze sowohl anorganischer Säuren, wie Chlorwasserstoffsäure, Bromwasserstoffsäure, Schwefelsäure und Phosphorsäure, als auch organischer Säuren, wie Maleinsäure, Citronensäure, Essigsäure, Benzoesäure, Bernsteinsäure, Ascorbinsäure und Weinsäure.
Beispiele für Komplexe sind z.B. Zink- oder Eisenkomplexe.

Methoden

1) Konstruktion von Plasmiden

Synthetische DNA-Fragmente wurden durch Synthese von Oligonucleotiden mit überlappenden Sequenzen mit einem DNA- Synthese-Automaten der Bezeichnung Applied Biosystem Model 380B hergestellt. Nucleotidsequenzen wurden gemäß der Didesoxymethode nach dem Subclonieren von Fragmenten in M13- Vektoren bestimmt (J. Messing: Methods Enzymol., Bd. 101 (1983), S. 20-78).
Restriktionsenzyme, Ligase und Polymerase wurden verwendet, wie es von den Herstellern empfohlen wurde. E. coli-Zellen wurden gemäß Standardverfahren transformiert (T. Maniatis, E.F. Frisch und J. Sambrook: Molecular cloning. A. laboratory manual. Cold Spring Harbour Laboratory, Cold Spring Harbour, NY 1982).

2) Mutagenese

Die synthetische Sequenz für Wildtyp-bFGF, und zwar entweder für die Form aus Mensch oder die Form aus Rind, wurde in einen M13-Phagenvektor subcloniert. Einzelsträngige Formen der rekombinanten Phagenvektoren wurden gemäß veröffentlichter Verfahren gezüchtet (J. Messing: Methods Enzymol., Bd. 101 (1983), S. 20-78).
20 ng dieser einzelsträngigen M13-DNAs wurden 5 Minuten auf 95ºC in 10 millimolar Tris-HCl (pH-Wert: 7,5), 0,1 millimolar EDTA, 50 millimolar NaCl erwärmt und an geeignete Oligonucleotide durch stufenweises Abkühlen auf Raumtemperatur anelliert. Nacheinander wurden die nachstehenden Bestandteile zugegeben: ATP bis zu einer Endkonzentration von 0,4 millimolar; dCTP, dGTP, dTTP bis 0,12 millimolar; dATP bis 0,04 millimolar; 1 Einheit Klenow- Fragment von E. coli-DNA-Polymerase I und 0,5 Einheiten T4- DNA-Ligase (Boehringer Mannheim). Das Endvolumen betrug 50 ul an 35 millimolar Tris-HCl (pH-Wert: 7,5), 0,1 millimolar EDTA, 6 millimolar MgCl&sub2;, 0,006 millimolar DTT. Nach 12- stündiger Inkubation bei 15ºC wurde die DNA verwendet, um E. coli-JM 101-Zellen gemäß veröffentlichter Verfahren zu transfizieren (T. Maniatis, E.F. Frisch und J. Sambrook: Molecular cloning. A laboratory manual. Cold Spring Harbour Laboratory, Cold Spring Harbour, NY, 1982).
Die Oligonucleotide, die verwendet wurden, um die gewünschten Mutationen zu bewirken, wurden radioaktiv unter Verwendung von 150 uCi (gamma-32P) ATP (New England Nuclear, 6000 Ci/mMol) in 70 millimolar Tris-HCl-Puffer (pH-Wert: 8) mit einem Gehalt an 10 millimolar MgCl&sub2;, 5 millimolar DTT und 10 Einheiten T4-Polynucleotidkinase (Boehringer Mannheim) in 50 u1 Reaktionsgemisch, das 30 Minuten bei 37ºC inkubiert wurde, markiert. Die markierten Oligonucleotide wurden anschließend zur Plaque-Hybridisierung an die mutierten Phagen-DNAs verwendet.
Die Hybridisierung lief über Nacht bei 65ºC in 10 millimolar Tris-HCl (pH-Wert: 8) mit einem Gehalt an 3 x SSC, 0,1 % SDS, 10 x Denhardt-Lösung und 0,2 mg/ml denaturierter Lachssperma- DNA ab.
Nitrocellulosefilter wurden 30 Minuten in 0,4 x SSC, 0,1 % SDS bei 65ºC mit mehrfachem Wechsel gewaschen und über Nacht Röntgenfilmen exponiert. Positive Hybridisierung anzeigende Plaques wurden für die Sanger-Didesoxynucleotidsequenzierung unter Verwendung des Amersham M13-Sequenzierungsreagenzsatzes ausgewählt.

3) Induktion und Analyse der Genexpression

Luriabrühe mit Tetracyclin (3 ug/ml) wurde zum Züchten von das Plasmid tragenden Zellen verwendet. Mit 0,4 % Glucose, 0,4 % Casaminosäuren und 10 mg/ml Thiamin angereichertes M9- Medium wurde zur Induktion der Genexpression unter dem Tryptophan-Promotor verwendet.
Nach 6-stündigem Wachstum in M9-Medium ohne Tryptophan wurden die Zellen durch Zentrifugation geerntet. Anteile der Bakterienkulturen wurden pelletiert, in Probenauftragungspuffer resuspendiert und durch SDS-PAGE gemäß Laemmli (U.K. Laemmli: Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature, Bd. 227 (1970), S. 680-685) analysiert.
Alternativ dazu wurden Zellen mit Lysozym oder durch Ultraschallbehandlung aufgebrochen, und die löslichen und unlöslichen Fraktionen wurden durch Zentrifugation getrennt und getrennt analysiert.
Nach der Elektrophorese wurden die Gele mit Coomassie-Blau für die gesamten Zellprotein angefärbt.
Western-Blots wurden mit polyclonalem Kaninchen-Antiserum gegen synthetische Peptide mit von bFGF abgeleiteten Sequenzen untersucht. Vectastain-ABC-Reagenzsätze (Vector Laboratories, CA, USA) die biotinyliertes Ziegen-anti- Kaninchen IgG als zweiten Antikörper enthielten, wurden, wie von den Herstellern empfohlen, verwendet.

Legende für die Figuren

Fig. 1: Schematische Darstellung der verschiedenen natürlichen Formen von basischem FGF, die bis heute isoliert wurden. Die 155 Aminosäure umfassende Form wurde aus der cDNA-Nucleotidsequenz abgeleitet.
Fig. 2: Es wird die Aminosäuresequenz von FGF aus Mensch und Rind erläutert. Die beiden Sequenzen unterscheiden sich in den Positionen 121 und 137. Die Aminosäuren, die der Rinderform entsprechen, sind fett gedruckt gezeigt.
Fig. 3: Diese Figur ist bereits veröffentlicht worden (T. Yoshida, K. Miyagawa, H. Odagiri, H. Sakamoto, P.F.R. Little, M. Terada und T. Sugimura: Genomic sequence of hst, a transforming gene encoding a protein homologous to fibroblast growth factors and the int-2-encoded protein. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 84 (1987), S. 7305-7309).
Die gesamten Aminosäuresequenzen für das hst-Protein, basischen FGF aus Mensch (hbFGF), sauren FGF aus Mensch (haFGF) und das int-2-Protein aus Maus werden ausgerichtet und verglichen. Striche geben Lücken an, die für eine optimale Ausrichtung eingefügt wurden. Zur hst-Sequenz identische Reste sind eingerahmt. Zahlen oberhalb der Sequenzlinie beziehen sich auf hst-Reste.
Fig. 4: Schematische Darstellung von Derivaten von basischem FGF. Zahlen beziehen sich auf die 155 Aminosäuren umfassende Form. Ausgefüllte Bereiche stellen deletierte Aminosäuresequenzen dar. Schwarze Punkte stellen einzelne Aminosäuresubstitutionen dar.
Fig. 5: Die gesamten Aminosäuresequenzen von menschlichem bFGF und seinen Mutanten sind ausgerichtet. Striche bezeichnen deletierte Aminosäuren. Sterne bezeichnen einzelne Aminosäuresubstitutionen.
Fig. 6: Nucleotidsequenz von bFGF aus Mensch und Rind. Diese Sequenz wurde synthetisch rekonstruiert und zur Expression von bFGF verwendet. Die Codons der ersten 20 Aminosäuren, die mit Sternen gekennzeichnet sind, sind modifiziert worden, ohne die entsprechenden Aminosäurereste zu verändern. Die Codons, die für die beiden Aminosäuren codieren, die sich in der Rindersequenz unterscheiden, sind unterhalb angegeben.
Fig. 7: pDS20 stellt als Hintergrund das allgemeine Plasmid dar, das zur Konstruktion der bFGF-Expressionsplasmide verwendet wurde. Der Ersatz des galK-Gens durch das bFGF-Gen und die Insertion der Expressionssignale Ptrp und der Shine- Dalgarno-Sequenz "cII" aus dem Phagen lambda führt zur Konstruktion von pFC80.

Diskussion und Schlußfolgerungen

Die vorliegende Erfindung betrifft die Isolierung neuer molekularer Derivate von basischem FGF. Das basische FGF- Referenzmolekül kann entweder aus Mensch oder aus Rind stammen.
Diese neuen Derivate, die durch rekombinante DNA-Techniken erhalten wurden, sind Deletions- oder Substitutionsmutanten der 155 Aminosäure umfassenden Form von bFGF. Es ist aus der Literatur bekannt, das basischer FGF aus Mensch oder Rind in verschiedenen Formen isoliert werden kann, deren einzige Unterschiede in der Länge der NH&sub2;-terminalen Extension bestehen. Insbesondere scheint es, daß bFGFs in einer kurzen, 126-Aminosäure umfassenden Form, und in einer langen, 157- Aminosäure umfassenden Form gleich aktiv sind.
Die Autoren der vorliegenden Erfindung haben Mutationen in Regionen des bFGF-Moleküls durchgeführt, die sich deutlich von dieser heterogenen NH&sub2;-terminalen Domäne unterscheiden. Sie haben als Beispiel die 155 Aminosäuren umfassende Form verwendet. Es ist daher offensichtlich, daß die Modifizierungen, die die Aufgabe der vorliegenden Erfindung bilden, auch für andere Formen von bFGF, z.B. die Formen mit 126 bis 157 Aminosäuren, durchgeführt werden können.
Wie zuvor angegeben wurde, können die neuen erfindungsgemäßen Moleküle als Antagonisten und/oder Superagonisten des Wildtyp-bFGF-Moleküls wirken. Wie bereits zuvor erwähnt wurde, können Antagonisten von bFGF insbesondere als wirksame Mittel zur Hemmung der Tumorangiogenese eingesetzt werden.
Superagonisten von bFGF können verbesserte pharmakologische Eigenschaften im Vergleich zur nativen Sequenz zeigen.
Die Bewertung der biologischen Aktivität der erfindungsgemäßen Verbindungen hat es ermöglicht, einige Regionen des bFGF-Moleküls aufzufinden, die besonders wichtig für die biologischen und biochemischen Eigenschaften von vFGF zu sein scheinen.
Die Identifizierung derartiger Regionen, insbesondere der in den Derivativen M1-bFGF, M2-vGFG und M3-vFGF deletierten Regionen, deutet darauf hin, daß weitere Mutationen (Substitution, Deletion oder Modifikation) in den gleichen Regionen möglicherweise zu therapeutisch verbesserten bFGF-Derivativen führen.
Die vorliegende Erfindung umfaßt diese weiteren Mutationen innerhalb ihres Schutzumfangs.
Wie bereits festgestellt wurde, betrifft die vorliegende Erfindung auch ein rekombinantes DNA-Verfahren zur Herstellung dieser neuen molekularen Einheiten. Interessanterweise kann dieses Verfahren auch erfolgreich auf die Herstellung von Wildtyp-bFGF angewandt werden. Alle diese Überlegungen sind widerum für die Sequenzen von basischem FGF aus Mensch und aus Rind gültig.
Das rekombinante DNA-Verfahren, das in der vorliegenden Anmeldung offenbart wird, basiert auf Stämmen des Bakteriums E. coli, die mit Plasmid-DNA transformiert wurden, die das für das gewünschte FGF-Molekül codierende Gen tragen.
Natürlich sind sich die Autoren der vorliegenden erfindung der Tatsache bewußt, daß andere rekombinante DNA-Verfahren bereits offenbart und veröffentlicht worden sind (M. Iwane, T. Kurokawa, R. Sasada, M. Seno, S. Nakagawa, K. Igarashi: Expression of cDNA encoding human basic fibroblast growth factor in E. coli. Biochem. Biophys. Res. Commun., Bd. 146 (1987), S. 470-477).
Das hier beschriebene Verfahren zeigt jedoch Merkmale der Neuheit und ergibt Mengen an rekombinantem bFGF, die niemals zuvor beschrieben wurden.
Ein hauptsächliches Merkmal dieses Verfahrens ist der Typ von E. coli-Stamm, der als Wirt für die Herstellung von basischem FGF verwendet wird. Es ist in der Tat bekannt, daß der Typ von Stamm einer der hauptsächlichen Parameter ist, der die heterologe Genexpression in E. coli beeinflußt (T.J.R. Harris und J.S. Emtage: Expression of heterologous genes in E. coli. Microbiological Sciences, Bd. 3 (1986), S. 28-31).
Erfindungsgemäß ist festgestellt worden, daß die E. coli- Stämme vom Typ B sehr wirksame Wirte für die Herstellung von rekombinantem bFGF sowie von bFGF-Derivaten sind. In der Tat ergeben die gleichen bFGF-Expressionsvektoren, wenn sie in andere E. coli-Stämme (Typ K-12, Typ C und dergl.) inseriert werden, nicht soviel bFGF.
Ein zweites Merkmal des vorliegenden Verfahrens ist die Einführung einiger "optimierter Codons" innerhalb des Gens, das für die verschiedenen bFGF-Moleküle codiert. Die Autoren haben in der Tat festgestellt, daß es erforderlich war, eine bestimmte Anzahl an DNA-Codons zu modifizieren, wobei die gleiche Aminosäuresequenz beibehalten wurde, um den Grad der Expression zu erhöhen. Die bevorzugte codierende DNA-Sequenz ist in der vorliegenden Anmeldung offenbart (vgl. Fig. 6).
Diese beiden Merkmale, der Typ des als Wirt verwendeten Stamms und die optimierten Codons, machen den Aspekt der Neuheit des vorliegenden rekombinanten DNA-Verfahrens für die Herstellung von bFGF und seiner Mutanten aus. Diese beiden Aspekte, sind, angewandt auf basischen FGF, niemals zuvor in der wissenschaftlichen Literatur erwähnt oder veröffentlicht worden.

Claims

1. Derivat von basischem Fibroblasten-Wachstumsfaktor aus Mensch oder Rind, gekennzeichnet durch die Deletion der Aminosäurereste 27 bis 32 (Lys-Asp-Pro-Lys-Arg-Leu), wobei die Numerierung der vorstehenden Aminosäurereste der 155 Aminosäuren umfassenden Form von basischem FGF aus Mensch oder Rind entspricht.

2. Derivat von basischem Fibroblasten-Wachstumsfaktor aus Mensch oder Rind, gekennzeichnet durch die Deletion der Aminosäurereste 54 bis 58 (Glu-Lys-Ser-Asp-Pro), wobei die Numerierung der vorstehenden Aminosäurereste der 155 Aminosäuren umfassenden Form von basischem FGF aus Mensch oder Rind entspricht.

3. Derivat von basischem Fibroblasten-Wachstumsfaktor aus Mensch oder Rind, gekennzeichnet durch die Deletion der Aminosäurereste 70 bis 75 (Gly-Val-Val-Ser-Ile-Lys), wobei die Numerierung der vorstehenden Aminosäurereste der 155 Aminosäuren umfassenden Form von basischem FGF aus Mensch oder Rind entspricht.

4. Derivat von basischem Fibroblasten-Wachstumsfaktor aus Mensch oder Rind, gekennzeichnet durch die Deletion der Aminosäurereste 78 bis 83 (Cys-Ala-Asn-Arg-Tyr-Leu), wobei die Numerierung der vorstehenden Aminosäurereste der 155 Aminosäuren umfassenden Form von basischem FGF aus Mensch oder Rind entspricht.

5. Derivat von basischem Fibroblasten-Wachstumsfaktor aus Mensch oder Rind, gekennzeichnet durch die Deletion der Aminosäurereste 110 bis 120 (Asn-Asn-Tyr-Asn-Thr-Tyr-Arg- Ser-Arg-Lys-Tyr), wobei die Numerierung der vorstehenden Aminosäurereste der 155 Aminosäuren umfassenden Form von basischem FGF aus Mensch oder Rind entspricht.

6. Derivat von basischem Fibroblasten-Wachstumsfaktor aus Mensch oder Rind, gekennzeichnet durch Ersatz der Aminosäurereste 128 (Lys) und 129 (Arg) durch Glutamin (Gln), wobei die Numerierung der vorstehenden Aminosäurereste der 155 Aminosäuren umfassenden Form von basischem FGF aus Mensch oder Rind entspricht.

7. Derivat von basischem Fibroblasten-Wachstumsfaktor aus Mensch oder Rind, gekennzeichnet durch Ersatz aller der Aminosäurereste 118 (Arg), 119 (Lys), 128 (Lys) und 129 (Arg) durch Glutaminreste (Gln), wobei die Numerierung der vorstehenden Aminosäurereste der 155 Aminosäuren umfassenden Form von basischem FGF aus Mensch oder Rind entspricht.

8. Derivat von basischem Fibroblasten-Wachstumsfaktor aus Mensch oder Rind, bestehend aus einer beliebigen anderen natürlichen Form von bFGF aus Mensch oder Rind mit den Mutationen gemäß einem der vorstehenden Ansprüche.

9. bFGF-Derivat gemäß einem der vorstehenden Ansprüche, ferner bestehend aus zusätzlichen Aminosäureresten am NH&sub2;-Terminus und/oder COOH-Terminus.

10. bFGF-Derivat gemäß einem der vorstehenden Ansprüche mit oder ohne glykosidische Seitenketten.

11. bFGF-Derivat nach einem der vorstehenden Ansprüche zur Verwendung als bFGF-Superagonist.

12. bFGF-Derivat nach einem der vorstehenden Ansprüche zur Verwendung als bFGF-Antagonist.

13. bFGF-Derivat nach Anspruch 12 zur Hemmung der Tumorangiogenese.

14. Rekombinantes DNA-Verfahren zur Herstellung eines basischen Fibroblasten-Wachstumsfaktorderivats gemäß einem der Ansprüche 1 bis 10.

15. Expressionsplasmid pFC80 gemäß Fig. 7 für die Expression von genomischer DNA, cDNA, synthetischer oder modifizierter Gene, die für eine natürliche oder modifizierte Aminosäuresequenz von bFGF aus Mensch oder Rind codieren.

16. Expressionsplasmid nach Anspruch 15, umfassend mindestens ein Gen, das Resistenz gegenüber einem Antibiotikum verleiht, oder einen beliebigen anderen selektierbaren Marker.

17. Expressionsplasmid nach Anspruch 15 oder 16 für die Expression eines Gens, das für ein Derivat gemäß einem der Ansprüche 1 bis 10 codiert.

18. Verwendung von E. coli-Wirtsstämmen des Typs B zur Herstellung eines rekombinanten Derivats gemäß einem der Ansprüche 1 bis 10.

19. Verwendung eines Plasmids gemäß Anspruch 15 oder 16 und der E. coli-Wirtsstämme des Typs B zur Herstellung eines Derivats gemäß einem der Ansprüche 1 bis 10.

20. Codierende DNA-Sequenz, wie sie in Fig. 6 angegeben ist.

21. Die kombinierte Verwendung von E. coli-Wirtsstämmen des Typs B und einer DNA-Sequenz, wie sie in Fig. 6 angegeben ist, zur Herstellung eines rekombinanten bFGF aus Mensch oder Rind.

22. Die kombinierte Verwendung von E. coli-Wirtsstämmen des Typs B und einer DNA-Sequenz, wie sie in Fig. 6 angegeben ist, für die Herstellung eines rekombinanten Derivats gemäß einem der Ansprüche 1 bis 10.