DE69006100T2

DE69006100T2 - Fibronektin-Derivate.

Info

Publication number: DE69006100T2
Application number: DE69006100T
Authority: DE
Inventors: Ichiro Azuma; Kimizuka Fusao; Shouichi Goto; Ikunoshin Kato; Yasutoshi Kawase; Yoh Ichi Ohdate; Ikuo Saiki; Yuki Taguchi
Original assignee: Takara Shuzo Co Ltd
Current assignee: Takara Bio Inc
Priority date: 1989-05-26
Filing date: 1990-05-23
Publication date: 1994-08-04
Anticipated expiration: 2010-05-24
Also published as: EP0399806A1; DE69006100D1; EP0399806B1; US5198423A

Description

Diese Erfindung betrifft ein neues funktionales Polypeptid und insbesondere ein neues funktionales Polypeptid, das das Zellbindungsbereich-Peptid von Humanfibronectin und das Heparin-Bindungsbereich-Peptid von Humanfibronectin enthält, eine Methode zu dessen Herstellung, und ebenso die Verwendung eines solchen funktionalen Polypeptids zur Inhibierung von Gefäßbildung.
Fibronectin (im folgenden als FN bezeichnet) ist ein Glycoprotein, das im Plasma und in der extrazellulären Matrix gefunden wird und eine Reihe von Funktionen besitzt (Annu. Rev. Biochem., 57, 375-413, 1988). Natürliches FN wurde auf seine Verwendung in pharmazeutischen Produkten wie z.B. bei der Behandlung von Wunden und in Augentropfen sowie auch auf seine Verwendung in Kosmetika getestet, aber da natürliches FN aus dem Blut erhalten wird, ist die Versorgung damit beschränkt, und seine Kosten sind hoch. Darüberhinaus wird es, da es mit pathogenen Bakterien und Viren kontaminiert sein kann, gegenwärtig in der Praxis nicht verwendet. Aus denselben Gründen wurde der funktionale Bereich von FN nicht für dessen Verwendung in praktischen Anwendungen isoliert.
Es ist bekannt, daß die Gefäßbildung, worunter man das Wachstum neuer Blutgefäße wie z.ß. auch Kapillargefäße versteht, mit dem Krankheitsfortschritt bei Störungen wie z.B. chronischen Entzündungen, bestimmten Immunreaktionen und der Karzinogenese in Verbindung steht. Aus diesem Grund kann eine Substanz, die die Gefäßbildung inhibiert, in der Lage sein, das Wachstum von Tumoren, das Fortschreiten von Retinopathie und chronischem Gelenksrheumatismus, das Ausbreiten von Psoriasisherden und ähnliches weitgehend zu verhindern.
Bis heute wurde gefunden, daß Steroide einschließlich Prednisolon, 6α-Methylprednisolon und Dexamethason die Gefäßbildung inhibieren, die experimentell in Hühnerembryochorionen, Netzhäuten von Kaninchen und Wangentaschen von Hamstern induziert wurde.
Im FN gibt es zwei Bereiche, die Heparin binden (im folgenden als Heparin-Bindungsbereiche bezeichnet), von denen einer nahe am N-Terminus liegt, und Ca-Ionen werden benötigt, um in diesem Bereich zu binden. Der andere Bereich liegt nahe am C-Terminus, und die Aktivität beim Binden dieses Bereichs an Heparin ist größer als die Bindeaktivität des N-terminalen Bereichs, wobei Ca-Ionen keine Wirkung auf die Bindung haben.
Neue Forschungen haben gezeigt, daß der Heparin-Bindungsbereich von FN wichtig beim Anbringen, der Ausbreitung und der Bewegung von Fibroblasten, Endothelzellen und bestimmten Arten von Tumorzellen ist, ebenso wie der Zellbindungsbereich wichtig ist. Der Heparin-Bindungsbereich von FN bindet mit den Proteoglycanen auf der Zelloberfläche und verursacht Interaktionen zwischen der Zelle und der extrazellulären Matrix, wodurch er zum Anbringen, zur Ausbreitung und zur Bewegung der Zelle beiträgt. Daher ist zu erwarten, daß ein Polypeptid mit sowohl den Funktionen von Zellbindungsaktivität als auch Heparin-Bindungsaktivität in pharmazeutischen Präparaten und ähnlichem zu verwenden ist, indem es zur Wundheilung beiträgt, indem es im Bereich der Wunde sowohl mit den Zellen als auch mit der extrazellulären Matrix bindet, und ebenso indem es hilft, den Normalzustand aufrechtzuerhalten.
Das Ziel dieser Erfindung ist es, ein neues funktionales Polypeptid zur Verfügung zu stellen, das sowohl die Funktionen der Zellbindungsaktivität von FN als auch der Heparin-Bindungsaktivität von FN aufweist, eine Methode für die Herstellung eines solchen funktionalen Polypeptids zur Verfügung zu stellen, und ein neues Mittel für die Inhibierung von Gefäßbildung zur Verfügung zu stellen, welches eine Substanz verwendet, die den Körpersubstanzen ähnlich ist und die sicher ist.
Kurz gefaßt betrifft diese Erfindung ein neues funktionales Polypeptid, welches den Zellbindungsbereich von Humanfibronectin aufweist, der direkt oder mittels einer Linker-Aminosäure oder eines -Peptids an den Heparin-Bindungsbereich von Human-FN gebunden ist. Diese Erfindung betrifft auch ein rekombinantes Plasmid, welches eine DNA enthält, die dieses funktionale Polypeptid kodiert. Diese Erfindung betrifft auch einen Transformanten, der ein solches rekombinantes Plasmid trägt. Weiters betrifft die Erfindung auch ein Verfahren zur Herstellung des neuen funktionalen Polypeptids, welches die Kultivierung des oben erwähnten Transformanten umfaßt, gefolgt von der Rückgewinnung des funktionalen Polypeptids aus dem Kulturmedium des Transformanten. Die vorliegende Erfindung betrifft ebenso ein Mittel zur Inhibierung der Gefäßbildung, welches das oben erwähnte funktionale Polypeptid enthält.
Wir führten Forschungen über die Struktur und die Herstellungsmethode eines neuen Polypeptids durch, welches sowohl eine Zellausbreitungsaktivität als auch eine Heparin-Bindungsaktivität aufweist, und durch die Anwendung von Gentechnik gelang uns die Herstellung eines neuen funktionalen Polypeptids, welches den Zellbindungsbereich von Humanfibronectin enthält, der direkt oder mittels einer Linker- Aminosäure oder eines -Peptids an den Heparin-Bindungsbereich von Human-FN gebunden ist. Die Ergebnisse von Messungen der biologischen Aktivitäten dieses neuen funktionalen Polypeptids zeigten, daß das Polypeptid sowohl die Eigenschaften der Zellausbreitung als auch des Bindens mit Heparin besitzt. Es wurde auch gefunden, daß, wenn Nierenzellen von Hamsterbabies (BHK-Zellen) und Nierenzellen von Normalratten (NRK-Zellen) im Test verwendet werden, die Zellausbreitungsaktivität stärker ist, als es der Fall ist, wenn nur der Zellbindungsbereich gegenwärtig ist. Es wurde auch gefunden, daß dieses funktionale Polypeptid die Gefäßbildung stark inhibiert. Die vorliegende Erfindung beruht auf diesen Erkenntnissen.
Diese Erfindung wird unten in Einzelheiten erklärt, wobei teilweise auf die angefügten Zeichnungen Bezug genommen wird, worin:
Figur 1 eine Figur ist, die das Aufbauverfahren des Plasmids pHD101 zeigt, welches H-271 exprimiert. Figur 2 ist eine Figur, die das Aufbauverfahren des Plasmids pHD102 zeigt, welches H-296 exprimiert. Figur 3 ist eine Figur, die das Aufbauverfahren des Plasmids pCH101 zeigt, welches C&sub2;&sub7;&sub7;- Met-H&sub2;&sub7;&sub1; exprimiert. Figur 4 ist eine Figur, die das Aufbauverfahren des Plasmids pCH102 zeigt, welches C&sub2;&sub7;&sub7;-Met-H&sub2;&sub9;&sub6; exprimiert.
Die Struktur des Gens, das Human-FN kodiert, wurde in EMBO J., 4, 1755-1759 (1985) berichtet. Die cDNA-Klone (pLF2, pLF3, pLF4 und pLF5), die den Zellbindungsbereich und den Heparin- Bindungsbereich kodieren, wurden ebenfalls in Biochemistry, 25, 4936-4941 (1986) beschrieben. Wir haben ein Polypeptid mit Zellausbreitungsaktivität entwickelt und zum Patent angemeldet (Offengelegte Japanische Patentanmeldung 206998/89), welches aus Escherichia coli-Zellen erhalten wurde, die einen Expressionsvektor tragen, der an dem cDNA-Fragment angefügt ist, welches dem Zellbindungsbereich entspricht, welches Fragment aus pLF5 erhalten wurde. Die cDNA, die den Zellbindungsbereich kodiert, die in dieser Erfindung benötigt wird, kann die des rekombinanten Plasmids sein, das in der Japanischen Offengelegten Patentanmeldung 206998/89 geoffenbart wurde, welches Plasmid als pTF7021 bezeichnet wurde. pTF7021 ist ein Plasmid, das die Aminosäuresequenz Pro¹²³&sup9;-Met¹&sup5;¹&sup7;(279 Aminosäuren) von FN exprimiert. Durch die Einfügung von beispielsweise der NcoI-Stelle unmittelbar vor dem Terminationskodon des Translationsbereichs beim C-Terminus von pTF7021 ist es möglich, die cDNA des Zellbindungsbereichs und die cDNA eines anderen Bereichs zu linken.
Die vorliegende Erfindung stellt ein Polypeptid mit folgender Strukturformel [1] zur Verfügung:
C&sub2;&sub7;&sub7;(Met)nH&sub2;&sub7;&sub1;-(X)m [I]
wonn C&sub2;&sub7;&sub7; die Sequenz mit 277 Aminosäuren ist, die Pro¹²³&sup9;-Ser¹&sup5;¹&sup5; des Zellanfügungsbereichs von Human-FN entspricht; welche Sequenz durch die Formel [II] dargestellt wird:
und worin H&sub2;&sub7;&sub1; die Sequenz mit 271 Aminosäuren ist, die Ala¹&sup6;&sup9;&sup0;-Thr¹&sup9;&sup6;&sup0; des Heparin-Bindungsbereichs von Human-FN entspricht; welche Sequenz durch die Formel [III] dargestellt wird:
worin X die folgende Formel [4] besitzt:
oder eine Peptidstruktur, die einen Abschnitt oder alle dieser Reste verloren hat, und worin Met fur einen Methioninrest steht, n entweder 1 oder Null ist, und m 1 oder Null ist.
In dieser Beschreibung sind die zur Kennzeichnung der Aminosäuren verwendeten Zahlen die Zahlen des Aminosäure-Restes vom N-Terminus der Aminosäuresequenz, die durch Translation der cDNA-Sequenz von FN in der EMBL-Datenbank erhalten wurde.
Der Heparin-Bindungsbereich ist in Fragmenten von einem Abbau mit Verwendung von Trypsin, Thermolysin, Cathepsin D, etc., erhalten worden. Die für die Fragmente berichteten Größen sind von 29 bis 38 kDa. Der Bereich ist im Detail nicht identifiziert worden, aber es wird allgemein angenommen, daß er aus drei, Typ III-wiederholenden Sequenzen besteht welche aus 90 Aminosäuren bestehen, wobei jede an einen Teil der IIIcs-Sequenz angebracht ist. Das X der Strukturformel [I] dieser Erfindung entspricht einem Abschnitt der IIIcs-Sequenz. Die IIIcs-Sequenz ist für die Heparin-Bindungsaktivität nicht erforderlich, aber es scheint, daß die IIIcs-Sequenz zur Anbringung an bestimmte Arten von Lymphozyten gebraucht wird. Wir haben die Expression eines Fragments hervogerufen, welches drei Repeats der Typ III-Sequenz (das H&sub2;&sub7;&sub1; der Strukturformel [I] dieser Erfindung entspricht diesen drei Repeats) und auch eines Fragments, welches einen Abschnitt der IIIcs-Sequenz (das H&sub2;&sub7;&sub1;-X der Strukturformel [I] dieser Erfindung) in E. coli enthält und die Heparin-Bindungsaktivität und die Zellbindungsaktivität, die in diesen zwei Fällen erhalten wurden, gemessen. Die Ergebnisse zeigten, daß beide Fragmente sowohl eine Heparin-Bindungsaktivität als auch eine Zellbindungsaktivität aufwiesen, wenn BHK-Zellen im Test verwendet wurden. Zellbindungsaktivität bedeutet sowohl eine Aktivität zur Anbringung an Zellen als auch eine Aktivität zur Zellausbreitung. Die Zellanbringungs- und die Zellausbreitungsaktivität des H&sub2;&sub7;&sub1;-X-Fragmentes waren stärker als jene des H&sub2;&sub7;&sub1;-Fragmentes.
Die cDNA, welche den Heparin-Bindungsbereich kodiert, kann aus pLF2435 extrahiert werden. pLF2435 ist ein Plasmid, welches durch Rekonstruktion der oben erwähnten Plasmide pLF2, pLF3, pLF4 und pLF5 erhalten wurde, und dieses rekonstruierte Plasmid enthält die cDNA welche den Heparin-Bindungsbereich von FN kodiert. Die cDNA, welche dem IIIcs-Abschnitt entspricht, ist in diesem Plasmid jedoch nicht enthalten, und es ist notwendig, eine DNA-Sequenz, die X entspricht, mittels einer chemischen Synthese zu konstruieren. Das benötigte cDNA-Fragment kann von pLF2435 durch die Anwendung von Restriktionsenzymen abgeschnitten werden. Mit der Verwendung einer DNA-Ligase kann eine synthetische DNA, welche das Initiierungskodon enthält, an das 5'-Ende des cDNA-Fragmentes ligiert werden, und synthetische DNA, welche das Terminationskodon enthält, kann an das 3'-Ende das cDNA-Fragmentes ligiert werden. Dann ist es durch Verbindung mit einem geeigneten Expressionsvektor möglich, ein Plasmid zu erhalten, welches ein Polypeptid exprimiert, das drei Repeats der den Typ III wiederholenden Sequenz aufweist (siehe Figur 1). Figur 1 ist eine Figur, die das Aufbauverfahren des PlasmidspHD101, welches H&sub2;&sub7;&sub1; exprimiert, zeigt.
Durch den Einbau des Plasmids in die chemisch synthetisierte DNA, die X entspricht, welches ein Abschnitt von IIIcs ist, ist es möglich, ein Plasmid zu erhalten, welches ein Peptid, welches IIIcs enthält, zu exprimieren (siehe Figur 2). Figur 2 ist eine Figur, die das Aufbauverfahren des Plasmids pHD102, welches H&sub2;&sub9;&sub6; exprimiert, zeigt.
Es können zufriedenstellende Ergebnisse erzielt werden, indem jeglicher bekannte Expressionsvektor verwendet wird, inklusive zum Beispiel pUC118N/pUC119N, beschrieben in FEBS Lett. (223, 174-180, 1987) und Derivate davon. Durch den Einbau eines solchen Plasmids in Zellen von E. coli ist es möglich, ein Polypeptid mit Heparin-Bindungsaktivität zu exprimieren, und ist es möglich, die Eigenschaften eines solchen Polypeptids zu erforschen. Als nächstes können cDNA-Fragmente von diesen Plasmiden exträhiert und an die NcoI-Stelle am 3'-Ende des Translationsbereichs des Plasmids pTF7520, welches aus dem oben erwähnten Plasmid pTF7021 aufgebaut ist, gebunden werden, durch welche Mittel es möglich ist, ein rekombinantes Plasmid zu erhalten, welches ein Polypeptid exprimiert, das einen Zellbindungsbereich von Human-FN enthält, direkt angebunden mittels eines Methionin-Linkerrestes mit dem Heparin-Bindungsbereich von Human-FN (siehe die Figuren 3 und 4). Figur 3 ist eine Figur, die das Aufbauverfahren des Plasmids pCH101 zeigt, welches C&sub2;&sub7;&sub7;-Met-H&sub2;&sub7;&sub1; exprimiert, und Figur 4 ist eine Figur, die das Aufbauverfahren des Plasmids pCH102 zeigt, welches C&sub2;&sub7;&sub7;-Met-H&sub2;&sub9;&sub6; exprimiert.
Der Verbindungsabschnitt in den oben erwähnten Plasmiden ist eine DNA, welche einen Methionin-Rest kodiert, welcher von der NcoI-Stelle stammt und als ein Linker verwendet wird. Die Wirkungen dieser Erfindung werden durch die Anwesenheit oder Abwesenheit eines Linkers nicht beeinträchtigt. Falls notwendig, ist es möglich, den Linker auf einfache Weise mittels einer ortsgerichteten Mutagenese zu entfernen.
Das auf diese Weise erhaltene Plasmid wird in E. coli-Zellen eingebracht, und die Zellen werden unter geeigneten Bedingungen kultiviert, wodurch das erwünschte Peptid in den Zellen von E. coli akkumuliert. Es kann ein Immunblotten angewendet werden, um auf Exprimierung des Polypeptids zu testen. Nach der Abtrennung des Ganzzellenproteins der rekombinanten E. coli-Zellen mittels SDS- Polyacrylamidelektrophorese (PAGE) wird das Elektrophoresemuster auf eine Nitrozellulosemembran übertragen. Die Bande, welche sowohl durch einen monoklonalen Antikörper, FN-10 (Takara Shuzo), welcher den Zellbindungsbereich von FN erkennt, als auch durch einen monoklonalen Antikörper, entweder IST-1 oder IST-2 (Sera-Lab), welcher den Heparin-Bindungsbereich von FN erkennt, ist das gewünschte Polypeptid.
Das erwünschte Polypeptid kann zum Beispiel auf die folgende Weise gereinigt werden. Rekombinante E. coli-Zellen werden in einem Medium, wie z.B. L-Nährmedium, kultiviert, und die Zellen gewonnen und beschallt. Der beschallte Zellenextrakt wird zentrifugient und der Überständ erhalten. Der Überständ wird zuerst dialysiert und dann durch eine DEAE-Ionenaustauschersäule geschickt. Dann wird er mit CM-Ionenaustauscherchromatographie und/oder Affinitätschromatographie auf Heparin-Agarose oder dergleichen behandelt.
Das auf diese Weise erhaltene Polypeptid kann auf Zellausbreitungsaktivität gegen BHK- oder NRK-Zellen und auf Heparin-Bindungsaktivität getestet werden. Für die Messung der Zellausbreitungsaktivität kann zum Beispiel die Methode von Ruoslahti et al. (Methods in Enzymology, 82, 803-831, 1981) angewendet werden. Kurz gefaßt wird die Probe zuerst verwendet, um die Vertiefungen einer Mikrotiterplatte zu beschichten, worauf Rindersetumalumin (BSA) zum Blockieren verwendet wird, und dann wird eine Suspension von BHK- oder NRK-Zellen den Vertiefungen zugegeben und die Platte etwa 1 Stunde bei 37ºC inkubiert. Die nicht gebundenen Zellen werden durch Waschen der Platte entfernt, und die verbleibenden Zellen werden mit Formalin fixiert, worauf das Ausbreiten der Zellen unter einem Mikroskop beobachtet wird. Aus den Ergebnissen kann die Stärke der Zellausbreitungsaktivität berechnet werden. Für die Messung der Heparin-Bindungsaktivität wird die Probe auf eine Säule, zum Beispiel AF- Heparin-Toyopearl (Tosoh Corp.) oder einen mit Heparin gebundenen Träger, gegeben, so daß die Probe adsorbiert wird, und wird die Elution mit einem Gradienten zunehmender NaCl-Konzentrationen vorgenommen. Die Salzkonzentration, bei welcher die Probe eluiert wird, kann verwendet werden, um die Stärke der Bindung an Heparin auszudrücken.
Durch die oben erwähnten Meßverfahren kann gesehen werden, daß jedes erhaltene Polypeptid eine starke Zellausbreitungsaktivität gegen sowohl BHK- als auch NRK-Zellen besitzt, und daß es auch eine starke Affinität gegen Heparin aufweist.
Das funktionale Polypeptid dieser Erfindung besitzt eine starke Wirkung beim Inhibieren von Gefäßbildung und es kann helfen, Metastasen und das Wachstum von Tumoren zu verhindern, um ein Ausmaß an Regression in der Größe von Tumoren zu bewirken, als ein von Frauen zu verwendendes empfängnisverhütendes Mittel, das sogar wirksam ist, wenn es nach der Insemination genommen wird, zur Verringerung der Schwere von Osteoporose, zur Inhibierung des Fortschreitens von Retinopathie und chronischem Artikularrheumatismus, als ein Inhibitor der Ausbreitung von Psoriasisherden und für andere Beschwerden oder Krankheitszustände, die mit Gefäßbildung verbunden sind.
Wenn das funktionale Polypeptid dieser Erfindung als eine pharmazeutische Präparation verwendet werden soll, kann sie auf üblichem Weg mit passenden bekannten Trägem zur Verwendung in pharmazeutischen Präparationen hergestellt werden und auf oralem oder anderem Weg genommen werden.
Die Menge einer Einzeldosis hängt vom Alter, vom Gewicht, den Anzeichen und Symtomen des Patienten und auch vom Behandlungszweck, etc., ab, in der Regel ist jedoch eine therapeutische Dosis, die auf nicht-oralem Weg verabreicht wird, 1-100 mg/kg pro Tag, und ist eine Dosis, die auf oralem Weg verabreicht ist, 5-500 mg/kg pro Tag.
Wenn C57BL/6 Mäuse in einem Test auf Toxizität des funktionalen Peptids verwendet wurden, wurden keine Anzeichen von Toxizität gefunden, wenn 100 mg/kg durch intravenöse Injektion gegeben wurden.
Diese Erfindung wird detaillierter mit Bezug auf die folgenden Beispiele erklärt. Diese Erfindung soll jedoch nicht auf diese Beispiele beschränkt werden.

Beispiel 1

Klonieren von cDNA-Fragment, welches den Heparin-Bindungsbereich von FN, Ala¹&sup6;&sup9;&sup0;- Thr¹&sup9;&sup6;&sup0; (eine Sequenz mit 271 Aminosäuren, im folgenden als H-271 bezeichnet; siehe Fig. 1) kodiert:

(1-1) Herstellung eines synthetischen DNA-Adapters:

Ein DNA-Synthesegerät von Applied Biosystems (Modell 380A) wurde verwendet, um Adapter auf dem 5'-Ende (Kettenlänge 63 oder 55; siehe Fig. 1) und auf dem 3'-Ende (Kettenlänge 25 oder 33; siehe Fig 1) zu synthetisieren, um das cDNA-Fragment, welches den Heparin-Bindungsbereich kodiert, mit einem Vektor zu verbinden. Nachdem 2 ug jeder dieser zwei Präparationen an ihren 5'-Enden phosphoryliert worden war, wurde das Annealen durchgeführt, was zu einem Doppelstrang führte.

(1-2) Herstellung eines NcoI-SacI-Fragmentes

Zuerst wurden 100 ug Plasmid pLF2435, welches 5,9 kB lang ist und welches das cDNA-Fragment enthält, das H-271 von FN kodiert (Biochemistry, 25, 4936-4941, 1986), mit BamHI und SacI verdaut. Dann wurde das Verdaute mit Agarosegelelektrophorese behandelt, und das 1,2 kB-Fragment wurde erhalten. Dieses Fragment wurde mit HaeII weiterverdaut, und das Verdaute wurde mit Agarosegelelektrophorese behandelt, wodurch ein 0,46 kB HaeII-SacI-Fragment erhalten wurde. Dann wurden 700 ng dieses Fragmentes und 120 ng des 5'-Ende-Adapters vom Abschnitt 1-1 in 20 ul eines Puffers, zur Verwendung mit T4-DNA-Ligase, gemischt, welcher Puffer 0.5 mMol ATP, 10 mMol Dithiothreitol (DTT) und 2,8 Einheiten T4-DNA-Ligase enthielt. Das Reaktionsgemisch wurde bei 16ºC über Nacht inkubiert. Dann wurde das Reaktionsgemisch 10 Minuten auf 65ºC erwärmt, mit NcoI und SacI verdaut und mit Agarosegelelektrophorese behandelt. Auf diese Weise wurden etwa 120 ng eines 0,52 kB NcoI- SacI-Fragmentes erhalten.

(1-3) Herstellung eines SacI-BamHI-Fragmentes:

Zuerst wurden 100 ug des oben erwähnten Plasmids, pLF2435, mit Eco0109I und SacI verdaut, und das Verdaute wurde mit Agarosegelelektrophorese behandelt, um ein 0,52 kB-Fragment zu erhalten. Dieses Fragment wurde mit BanII weiterverdaut, und das Verdaute wurde mit Agarosegelelektrophorese behandelt, was ein 0,27 kB SacI-BanII-Fragment ergab. Dann wurden 400 ng dieses Fragmentes und 80 ng des 3'-Ende-Adapters vom Abschnitt 1 l in 20 ul eines Puffers, zur Verwendung mit T4-DNA-Ligase, gemischt, welcher Puffer 0,5 mMol ATP. 10 mMol DTT und 2,8 Einheiten T4 DNA-Ligase enthielt. Das Reaktionsgemisch wurde bei 16ºC über Nacht inkubiert. Dann wurde das Reaktionsgemisch 10 Minuten auf 65ºC erwärmt, mit BamHI und SacI verdaut und mit Agarosegelelektrophorese behandelt. Auf diese Weise wurden etwa 65 ng eines 0,30 kB SacI-BamHI-Fragmentes erhalten.

(1-4) Herstellung eines NcoI-BamHI-Fragmentes:

Zuerst wurden 120 ng des NcoI-SacI-Fragmentes, welches in (1-2) erhalten wurde, und 65 ng des SacI-BamHI-Fragmentes, welches in (1-3) erhalten wurde, in 20 ul eines Puffers gemischt, der mit T4- DNA-Ligase verwendet wird, enthaltend 0,5 mMol ATP, 10 mMol DTT und 2,8 Einheiten von T4- DNA-Ligase. Das Reaktionsgemisch wurde bei 16ºC über Nacht inkubiert. Dann wurde es 10 Minuten bei 65ºC erwärmt und mit BamHI und NcoI verdaut. Das Verdaute wurde mit Agarosegelelektrophorese behandelt, wodurch etwa 28 ng eines 0,82 kB NcoI-BamHI-Fragmentes erhalten wurden.

(1-5) Aufbau von pUC118NT:

Als erstes wurde 1 ug des Sekretionsexpressionsvektors pINIII-ompA&sub1; (EMBO J, 3, 2437-2442, 1984) mit BamHI und SalI verdaut, und das Verdaute wurde mit Agarosegelelektrophorese behandelt, wodurch ein 0,95 kB BamHI-SalI-Fragment, welches die 1 pp-Terminatorsequenz enthielt, erhalten wurde. Dann wurden 30 ng dieses Fragments mit 30 ng Plasmid pUC118N, welches mit BamHI und SalI verdaut worden war und welches in 20 ul eines Puffers, der mit T4-DNA-Ligase verwendet wird, enthaltend 0,5 mMol ATP, 10 mMol DTT und 2,8 Einheiten von T4-DNA-Ligase, dephosphoryliert worden war, gemischt. Das Reaktionsgemisch wurde bei 16ºC über Nacht inkubient, und 10 ul des Reaktionsgemisches wurden verwendet, um Zellen von E. coli HB101 zu transformieren, wodurch ein Plasmid erhalten wurde, welches die 1 pp-Terminatorsequenz trägt. Das Plasmid wurde als pUC118NT bezeichnet.
Das Plasmid pUC118NT wurde durch Schaffiing einer NcoI-Stelle, die das Translationsinitiierungskodon des im Handel erhältliehen Vektors pUC118 (Takara Shuzo) umgibt, erhalten. Der Abstand zwischen dem Initiierungskodon und der Ribosomen-Bindungsstelle war acht Basen.

(1-6) Klonieren eines Ncol-BamHI-Fragmentes in pUC118NT:

Zuerst wurde 0,1 ug des Plasmids pUC118NT, welches in (1-5) erhalten worden war, mit NcoI und BamHI verdaut und entphosphoryliert. Dann wurden 20 ng dieses Plasmids mit 20 ng des NcoI- BamHI-Fragments, welches in (1-4) erhalten worden war, in 20 ul-Puffer, der mit T4-DNA-Ligase verwendet wird, enthaltend 0,5 mMol ATP, 10 mMol DTT und 2,8 Einheiten von T4-DNA-Ligase, verwendet wird, gemischt. Das Reaktionsgemisch wurde bei 16ºC über Nacht inkubiert, und dann wurden 10 ul des Reaktionsgemisches verwendet, um Zellen von E. coli HB101 zu transformieren.

(1-7) Transformation von E. coli und Analyse das Plasmids.

Zehn Microliter das in (1-6) erhaltenen Reaktionsgemisches wurden verwendet, um Zellen von E. coli HB101 zu transformieren. Von den erhaltenen rekombinanten Materialien wurden die Plasmide von 18 Klonen analysiert. Bei dieser Analyse wurde die Alkalilyse Methode verwendet, um Plasmide zu isolieren. Dann wurden die Plasmide mit BamHI und NcoI verdaut. Dag Verdaute wurde mit Agarosegelelektrophorese behandelt. Die Bande, die für dar NcoI-BamHI-Fragment bei 0,82 kB erwartet wurde, wurde gesucht. Einem der Klone produzierte die gewünschte Bande. Die Dideoxymethode wurde verwendet, um die Basensequenz des Plasmids zu identifizieren, und es wurde gefunden, daß die gewünschte Sequenz vorhanden war. Dieses rekombinante Plasmid wurde als pHD101 bezeichnet.
E. coli HB101, das dieses Plasmid trug, wurde als E. coli HB101/pHD101 bezeichnet, und wurde beim Fermentation Research Institute der Agency of Industrial Science and Technology, Japan, als FERM BP-2264 hinterlegt.

(1-8) Reinigung des Polypeptids aus dem rekombinanten Material:

Zuerst wurden Zellen von E coli HM101/pHD101, die in (1-7) erhalten wurden, über Nacht bei 37ºC in einem Schüttelteströhrchen, das 5 ml L-Nährmedium enthielt, welches Ampicillin in der Konzentration von 50 ug/ml enthielt, kukiviert. Der Inhalt wurde verwendet, um 500 ml desselben Nährmediums in einem Erlenmeyerkolben mit einer 2-1-Kapazität zu inokulieren. Dies wurde mit Schütteln bei 100 Upm kultiviert. Dann, als die Adsorption bei 660 nm 0,3 erreichte, wurden 2 mMol Isopropyl-β-thiogalactosid (IPTG) zugegeben, und die Zellen wurden nach 20 weiteren Stunden der Kultivierung geemtet. Ein Teil der gesammelten Zellen wurde zum Immunblotten verwendet. Auf diese Weise wurde das Ganzzellenprotein auf SDS-PAGE aufgetrennt, und das Elektrophoresemuster wurde auf eine Nitrozellulosemembran übertragen, wonach ein monoklonaler Antikörper, IST-1 (Sera-Lab), der spezifisch den Hepann-Bindungsbereich von FN erkennt, als der erste Antikörper, und ein Peroxidase- markierter Antikörper als der zweite Antikörper verwendet wurde. Die Peroxidaseaktivität des gebundenen zweiten Antikörpers wurde durch Färben in Gegenwart von 4-Chlor-1-naphthol und Wasserstoffperoxid geprüft, um auf die Bildung des gewünsehten Polypeptids in der Nähe von 29 kDa zu untersuchen. Als nächstes wurde das Ganzzellenpellet in einem Gemisch suspendiert, das 20 mMol K&sub2;HPO&sub4; (pH 7,0), 1 mMol EDTA, 5 mMol Mercaptoethanol und 3uMol p-Amidinophenyl-methansulfonylfluorid (p-APMSF) enthielt, und das Gemisch wurde beschallt. Dann wurde das Gemisch 20 Minuten lang bei 12 000 Upm zentrifugiert, und 25 ml des Überstandes wurden erhalten. Der Überstand wurde durch eine 15 ml-Säule von CM-Toyopearl 650M, die mit 20 mMol K&sub2;HPO&sub4;-Puffer (pH 7,0) äquilibriert war, geschickt. Die nicht adsorbierte Fraktion wurde durch die Säule mit Verwendung des gleichen Puffers gewaschen, und dann wurde die Säule mit 20 mMol K&sub2;HPO&sub4;-Puffer (pH 7,0), der 0,15 Mol NaCl enthielt, eluiert, und das Eluat wurde in Fraktionen gesammelt. Das Eluat wurde beim Immunblotten verwendet, und gewünschte Fraktionen wurden aus diesem Schritt gesammelt. Als nächstes wurde diese Fraktion durch eine 80 ml-Säule Heparin-Toyopearl 650M, die mit 20 mMol K&sub2;HPO&sub4; (pH 7,0) äquilibiriert war, das 0,15 Mol NaCl enthielt, geschickt. Dann wurde die Säule mit 20 mMol K&sub2;HPO&sub4;- Puffer (pH 7,0), der 0,2 Mol NaCl enthielt, gewaschen, und mit einem linearen Gradienten an Salzkonzentrationen von 0, Mol NaCl bis 0,45 Mol NaCl im 20 mMol K&sub2;HPO&sub4;-Puffer (pH 7,0) eluiert. Die gewünschten Fraktionen wurden durch Immunblotten gesammelt, entsalzt, lyophilisiert, und durch Elektrophorese wurde gefunden, daß sie etwa 20 mg eines fast homogenen Polypeptids enthielten. Dann wurde ein Peptid-Sequenzer (Applied Biosystems 477A/120A) verwendet, um die Aminosaurensequenz dieses Peptids, vom N-Terminus ausgehend, zu identifizieren. Es wurde gefunden, daß die Sequenz Ala- Ile-Pro-Ala-Pro-Thr-Asp-Leu war. Dies war die gleiche Sequenz vom N-Terminus wie die des gewünschten Polypeptids. Durch Verdauung mit Carboxy-Peptidase P (Takara Shuzo) wurde gefunden, daß Threonin die C-terminale Aminosäure war.

Beispiel 2

Klonieren des cDNA-Fragments, welches den Heparin-Bindungsbereich kodiert (Ala¹&sup6;&sup9;&sup0;- Thr¹&sup9;&sup8;&sup5;, eine Aminosäurensequenz mit 296 Resten, in folgenden als H-296 bezeichnet), welche einen Abschnitt (Asp¹&sup9;&sup6;¹-Thr¹&sup9;&sup8;&sup5;, eine Aminosäurensequenz mit 25 Aminosäuren) des IIIcs-Bereichs von (siehe Figur 2) enthält.

(2-1) Herstellung des BanII-BamHI-Fragments:

Mit einem DNA-Synthetisiergerät (Applied Biosystems, Modell 380A) wurde DNA synthetisiert, die eine Kettenlänge von 77 oder 78 Basen aufwies (siehe Fig. 2) und die ein DNA-Fragment, das den CSI-Bereich von IIIcs von FN kodiert, enthielt (J.Cell Biol., 103, 2637-2647, 1986). Dann wurden 2 ug beider Stränge an den 5'-Enden phosphoryliert und die nächste Doppelstrang-DNA wurde hergestellt, indem eine Einzelstrang-DNA mit komplementären Sequenzen annealt wurde.
Diese DNA wurde in 100 ul eines Reaktionsgemisches von 7 mMol Tris-HCl (pH 7,5), das 0.1 mMol EDTA, 20 mMol NaCl, 7 mMol MgCl&sub2;, 0,1 mMol dATP, 0,1 mMol dGTP, 0,1 mMol dCTP, 0.1 mMol dTTP und 2 Einheiten Klenow-Enzym enthielt, gemischt. Das Reaktionsgemisch wurde 30 Minuten lang bei 37ºC inkubiert. Dann wurde die Reaktion beendet, indem das Gemisch 5 Minuten lang auf 70ºC erwärmt wurde, und das Reaktionsgemisch wurde mit BamHI und BanII verdaut. Das Verdaute wurde mit Agarosegelelektrophorese behandelt, und etwa 400 ng von 0,11 kB BanII-BamHI-Fragment wurdeN erhalten.

(2-2) Herstellung des SacI-BamHI -Fragments:

Zuerst wurden 200 ng des BanII-BamHI-Fragments, das in (2-1) erhalten wurde, und 490 ng des 0,27 kB SacI-BanII-Fragments, das in (1-3) erhalten wurde, in 20 ul eines Reaktionsgemisches von Puffer gemischt, der mit T4-DNA-Ligase verwendet wird, enthaltend 0.5 mMol ATP, 10 mMol DTT und 2,8 Einheiten von T4-DNA-Ligase. Das Reaktionsgemisch wurde über Nacht bei 16ºC inkubiert. Dann wurde das Reaktionsgemisch 10 Minuten lang bei 65ºC erwärmt und mit BamHI und SacI verdaut. Das Verdaute wurde mit Agarosegelelektrophorese behandelt und ergab etwa 100 ng 0,38 kB SacI-BamHI- Fragment.

(2-3) Herstellung eines SacI-BamHI-Fragments (Vektorfragments) von pHD101:

Zuerst wurde 1ug Plasmid pHD101, welches H-271 kodiert, mit SacI und BamHI verdaut. Das Verdaute wurde entphosphoryliert und mit Agarosegelelektrophorese behandelt und ergab etwa 280 ng 4,6 kB SacI-BamHI-Vektorfragment.

(2-4) Verbindung von SacI-BamHI-Fragment und Vektor:

Zuerst wurden 50 ng des 0,38 kB SacI-BamHI-Fragments, das in (2-2) erhalten wurde, und 20 ng des 4,6 kB SacI-HamHI-Vektors, der in (2-3) erhalten wurde, in 20 ul eines Reaktionsgemisches von Puffer gemischt, der mit T4 DNA Ligase verwendet wird, enthaltend 0,5 mMol ATP, 10 mMol DTT und 2,8 Einheiten von T4-DNA-Ligase Das Raktionsgemisch wurde über Nacht bei 16ºC inkubiert, und dann wurden 10ul des Gemisches verwendet, um Zellen von E. coli HB101 zu transformieren.

(2-5) Transformation von E. coli und Analyse der Plasmide:

Wie oben beschrieben, wurden 10 ul des Reaktionsgemisches, welches in (2-4) erhalten wurde, verwendet, um Zellen von E. coli HB101 zu transformieren. Von den aus den rekombinanten Materialien erhaltenen Klonen wurden 12 Klone auf Plasmide untersucht. Die Alkalilyse-Methode wurde angewendet, um Plasmide zu isolieren. Dann wurden die Plasmide mit BamHI und NcoI verdaut. Das Verdaute wurde mit Agarosegelelektrophorese behandelt. Die für das NcoI-BamHI-Fragment bei 0,9 kB erwartete Bande wurde gesucht. Eines der Klone produzierte die gewünschte Bande. Die Dideoxymethode wurde angewendet, um die Basensequenz dieses Plasmids zu identifizieren, und es wurde gefunden, daß die gewünschte Sequenz vorhanden war. Dieses rekombinante Plasmid wurde als pHD102 bezeichnet.
E. coli HB101, das dieses Plasmid trug, wurde als E. coli HB101/pHD102 bezeichnet und beim Fermentation Research Institute der Agency of Industrial Science and Technology, Japan, als FERM P- 10721 hinterlegt.

(2-6) Reinigung des Polypeptids aus dem rekombinanten Material:

Durch die in (1-8) verwendete Methode wurden Zellen von E. coli HB101/pHD102, die in (2-5) erhalten wurden, in 500 ml Kulturnährmedium kultiviert, und von diesem Kulturnährmedium wurden etwa 5 mg Poypeptide erhalten, das durch Elektrophorese relativ homogen war. Ein Peptidsequenzer (Applied Biosystems 477A/120A) wurde verwendet, um die Aminosäurensequenz dieses Peptids vom N- Terminus zu identifizieren. Es wurde gefunden, daß die Sequenz die gleiche war wie die der N-terminalen Sequenz des gewünschten Peptids. Durch Verdauen mit Carboxy-Peptidase P wurde gefunden, daß Threonin die C-terminale Aminosäure war.

Beispiel 3

Klonieren des cDNA-Fragments, das das Fusionsprotein von Pro¹²³&sup9;-Ser¹&sup5;¹&sup5;, die Sequenz mit 277 Aminosäuren des Zellbindungsbereichs von FN, und H-271 kodiert (siehe Fig. 3):

(3-1) Aufbau eines Plasmids, das den Pro¹²³&sup9;-Ser¹&sup5;¹&sup5;-Zellbindungsbereich (mit einer Sequenz mit 277 Aminosäuren) kodiert:

Ein Plasmid wurde durch das Finfugen der NcoI-Stelle direkt vor dem Terminationskodon des Translationsbereichs des rekombinanten Plasmids pTF7021, geoffenbart in der Offengelegten Japanischen Patentanmeldung 206998/89, durch ortsgerichtete Mutagenese aufgebaut. Das Oligonucleotid d[pCTATTACACCATCGATGGTTTG] wurde synthetisiert und ein Kit (ortsgerichtetes Mutagenesesystem Mutan-K; Takara Shuzo) wurde verwendet, um das Einfugen der NcoI-Stelle in pTF7021 zu erzielen. Mit dieser Einfügung der NcoI-Stelle wurde die Gln¹&sup5;¹&sup6;-Mct¹&sup5;¹&sup7; des C-Terminus des Zellbindungsbereichs durch Met¹&sup5;¹&sup6;-Val¹&sup5;¹&sup7; ersetzt (siehe Fig. 3). Das erhaltene Plasmid wurde als pTF7520 bezeichnet.

(3-2) Herstellung des NcoI-HincII-Fragments von pHD101.

Zuerst wurde 1 ug des rekombinanten Plasmids pHD101, das in (1-7) erhalten wurde, mit NcoI und HincII verdaut und das Verdaute wurde mit Agarosegelelektrophorese behandelt und ergab etwa 100 ng 1,77 kB NcoI-HincII-Fragment.

(3-3) Klonieren des NcoI-HincII-Fragments von pHD101 in pTF7520:

Zuerst wurde das Plasmid pTF7520, das in (3-1) erhalten wurde, mit NcoI und HincII verdaut und das Verdaute wurde entphosphoryliert. Dann wurden 50 ng dieses Fragments und 50 ng des NcoI- HincII-Fragments, das in (3-2) erhalten wurde, mit 20 ul eines Puffers gemischt, der mit T4-DNA-Ligase verwendet wird, enthaltend 0.5 mMol ATP, 10 mMol DTT und 2,8 Einheiten von T4-DNA-Ligase. Dieses Reaktionsgemisch wurde über Nacht bei 16ºC inkubiert. Dann wurden 10ul des Reaktionsgemisches verwendet, um Zellen von E. coli HB101 zu transformieren. Ein Plasmid wurde erhalten, welches das Fusionsprotein C&sub2;&sub7;&sub7;-Met-H&sub2;&sub7;&sub1;, welches Pro¹²³&sup9;-Ser¹&sup5;¹&sup5; war, die Sequenz mit 277 Aminosäuren des Zellbindungsbereichs von FN, via Methionin an H-271 gebunden, exprimierte. Das Plasmid wurde als pCH101 bezeichnet.
E. coli HB101, das dieses Plasmid trug, wurde als E. coli HB101/pCH101 bezeichnet und beim Fermentation Research Institute der Agency of Industrial Science and Technology, Japan, als FERM BP- 2799 hinterlegt.

(3-4) Entfernung der Zwischensequenz ATG aus pCH101:

Ein Methionin wurde dem Raum zwischen Pro¹²³&sup9;-Ser¹&sup5;¹&sup5;, der Sequenz mit 277 Aminosäuren des Zellbindungsbereichs, und H-271 zugefügt, was das Fusionsprotein C&sub2;&sub7;&sub7;-Met-H&sub2;&sub7;&sub1; ergab, exprimiert vom Plasmid pCH101, das in (3-3) erbalten wurde. Die Sequenz die diesem Methionin entsprach, ATG, wurde durch ortsgerichtete Mutagenese entfernt. Das Oligonucleotid d[pAGGAATAGCGGATGGTTT] wurde synthetisiert und ein ortsgerichtetes Mutagenesesystem Mutan-K wurde verwendet, was zur Entfernung der Zwischensequenz ATG führte.
Ein Plasmid wurde erhalten, welches das Fusionsprotein C&sub2;&sub7;&sub7;-H&sub2;&sub7;&sub1; exprimierte, das aus Pro¹²³&sup9;-Ser¹&sup5;¹&sup5;, der Sequenz mit 277 Aminosäuren des Zellbindungsbereichs, direkt an H-271 gebunden, bestand. Das Plasmid wurde als pCH201 bezeichnet.

(3-5) Reinigung des Polypeptids aus dem rekombinanten Material:

Durch die in (1-8) beschriebene Methode wurden Zellen von E. coli HB101/pCH101, die in (3-3) erhalten wurden, in 500 ml Kulturnährmedium kultiviert, und aus diesem Kulturnährmedium wurde ein Zellenextrakt erhalten. Die Fraktionen, welche sowohl mit einem monoklonalen Antikörper, der den Zell bindungsbereich von FN (FN-10, Takara) erkannte, als auch dem monoklonalen Antikörper IST-1 reagierten, wurden durch die Methoden von (1-8) gereinigt, und 15 mg gereinigtes Produkt wurden erhalten. Die Sequenz vom N-Terminus diesem Peptids war identisch mit der des gewünschten Peptids. Durch Verdauung mit Carboxypeptidase P wurde gefunden, daß Threonin die C-terminale Aminosäure war.

Beispiel 4

Klonieren des cDNA-Fragments, welches das Fusionsprotein von Pro¹²³&sup9;-Ser¹&sup5;¹&sup5;, die Sequenz mit 277 Aminosäuren des Zellbindungsbereichs von FN, und H-296 kodiert (siehe Fig 4):

(4-1) Herstellung des NcoI-HincII-Fragments von pHD102

Zuerst wurde 1ug des rekombinanten Plasmids pHD102, das in (2-5) erhalten wurde, mit NcoI und HincII verdaut, und das Verdaute wurde mit Agarosegelelektrophorese behandelt und ergab etwa 100 ng von 1,84 kB NcoI-HincII-Fragment

(4-2) Klonieren des NcoI-HincII-Fragments von pHD102 in pTF7520:

Zuerst wurde 1ug Plasmid pTF7520, das in (3-1) erhalten wurde, mit NcoI und HincII verdaut, und das Verdaute wurde entphosphoryliert. Dann wurden 50 ng dieses Fragments und 50 ng des NcoI- HincII-Fragments, das in (4-1) erhalten wurde, mit 20 ul Puffer gemischt, der mit T4-DNA-Ligase verwendet wird, enthaltend 0,5 mMol ATP, 10 mMol DTT und 2,8 Einheiten von T4-DNA-Ligase. Das Reaktionsgemisch wurde über Nacht bei 16ºC inkubiert und dann wurden 10 ul dieses Reaktionsgemisches verwendet, um Zellen von E. coli HB101 zu transformieren. Ein Plasmid wurde erhalten, welches das Fusionsprotein C&sub2;&sub7;&sub7;-Met-H&sub2;&sub9;&sub5;, das Pro¹²³&sup9;-Ser¹&sup5;¹&sup5; war, die Sequenz mit 277 Aminosäuren des Zellbindungsbereichs von FN, via Methionin an H-296 gebunden, exprimierte. Das Plasmid wurde als pCH102 bezeichnet.
E. coli HB101, das dieses Plasmid trug, wurde als E. coli HB101/pCH102 bezeichnet und beim Fermentation Research Institute der Agency of Industrial Science and Technology, Japan, als FERM BP- 2800 hinterlegt.

(4-3) Entfernung der Zwischensequenz ATG aus pCH102:

Ein Methionin wurde dem Raum zwischen Pro¹²³&sup9;-Ser¹&sup5;¹&sup5;, der Sequenz mit 277 Aminosäuren des Zellbindungsbereichs, und H-296 zugefügt, was das Fusionsprotein C&sub2;&sub7;&sub7;-Met-H&sub2;&sub9;&sub6; ergab, exprimiert vom Plasmid pCH102, das in (4-2) erhalten wurde. Die Zwischensequenz, die diesem Methionin entsprach, ATG, wurde durch die gleichen Methoden wie in (3-4) entfernt. Ein Plasmid wurde erhalten, welches das Fusionsprotein C&sub2;&sub7;&sub7;-H&sub2;&sub9;&sub6; exprimierte, das aus Pro¹²³&sup9;-Ser¹&sup5;¹&sup5;, der Sequenz mit 277 Aminosäuren des Zellbindungsbereichs, direkt an H-296 gebunden, bestand. Das Plasmid wurde als pCH202 bezeiehnet.

(4-4) Reinigung des Polypeptids aus dem rekombinanten Material:

Durch die in (3-5) beschriebene Methode wurden Zellen von E. coli HB101/pCH102, die in (4-2) erhalten wurden, kultiviert und auf die gleiche Weise wie in (3-5) gereinigt. Aus dem 500 ml Kulturnährmedium wurden etwa 6 mg Polypeptid, das durch Elektrophorese relativ homogen war, erhalten. Analysen der N-terminalen Sequenz und das C-Terminus zeigten Ergebnisse, welche mit denen, die für das gewünschte Peptid erwartet wurden, identisch waren.

Beispiel 5

Messung der biologischen Aktivität:

Die in den Beispielen 1-4 erhaltenen Polypeptide wurden auf Zellausbreitungsaktivität und auf Heparin-Bindungsaktivität untersucht.
Zellausbreitungsaktivität wurde durch die Methode von Ruoslahti et al. (Methods in Enzymology, 82, 803-831, 1981) gemessen. Die zu untersuchende Probe wurde in destilliertem Wasser, Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS) usw. gelöst, und schrittweise auf einer Microtiterplatte mit 96 Vertiefungen verdünnt. Das verwendete Volumen betrug 50ul pro Vertiefung. Die Proben wurden 2 Stunden lang bei 4ºC inkubiert, um das Hatten der Probe an der Platte zu ermöglichen. Dann wurden 100 ul/Vertiefung PBS, die 3% BSA enthielt, zugesetzt, und ein Blockieren wurde durch Inkubieren der Platte bei 37ºC für eine Stunde durchgeführt. Dann wurden die Vertiefungen mit PBS gewaschen, und 100 ul einer Suspension von Nierenzellen von Hamsterbabies, BHK-21, suspendiert zur Konzentration von 37ºC 10&sup5;/ml in Dulbecco-modifiziertem Eagle-Medium (DMEM), wurde in jede Vertiefung gegeben. Die BHK-21-Zellen waren tiefgefroren gelagert worden und wurden wiederholt kultiviert, bevor sie vor ihrem Gebrauch mit Trypsin 5 Minuten bei 37ºC behandelt wurden. Die Platte wurde dann 1 Std. lang bei 37ºC inkubiert. Die Platte wurde nach dem Inkubieren mit PBS gewaschen, und die Zellen wurden mit 3% Formalin fixiert.
Hier wurde der ED&sub5;&sub0; der Proben als die Konzentration der Probe definiert, die 50% soviel sich ausbreitende Zellen ergab wie die Höchstanzahl an sich ausbreitenden Zellen, die produziert wurden, wenn Human-FN in einer hohen Konzentration verwendet wurde. Das Ausbreiten von BHK-21-Zellen wurden unter einem Mikroskop beobachtet, und der ED&sub5;&sub0; jeder Probe wurde berechnet.
Die Heparin-Bindungsaktivität wurde wie folgt gemessen.
Die Probe wurde auf eine 1,5 ml-Säule von AF-Heparin-Toyopearl 650M, äquilibriert mit 20 mMol Phosphatpuffer (pH 7,0), gegeben, und die NaCl-Konzentration des Puffers wurde schrittweise erhöht, um die Probe zu eluieren. Die Salzkonzentration, bei der die Elution auftrat, wurde verwendet, um die Heparin-Bindungsaktivität auszudrücken.
Die biologischen Aktivitäten der verschiedenen Proben, gemessen wie oben beschrieben, sind in Tabelle 1 dargestellt. Tabelle 1 Probe Zellausbreitungsaktivität ED&sub5;&sub0;(nMol/ml) Heparin-Bindungsaktivität (Salzkonz., mMol, zur Elution)

Beispiel 6

Inhibition der Gefäßbildung:

Mit drei Mäusen in jeder Gruppe wurden C57BL/6-Mäusen intradermal an zwei Stellen des Rückens 5 x 10&sup5; Zellen von B16-BL6 Melanoin allein oder ein Gemisch derselben Anzahl dieser Zellen mit 100 ug eines der Polypeptide dieser Erfindung, C&sub2;&sub7;&sub7;-Met-H&sub2;&sub9;&sub6;, injiziert. Drei Tage nach der Injektion wurde eine i.v.-Injektion (0,2 ml) von 1% Evans Blue durchgeführt, die Mäuse sofort getötet und die Rückenhaut der Mäuse von den darunterliegenden Geweben abgelöst. Die Gefäßbildung wurde bewertet, indem die Anzahl an Gefäßen gezählt wurde, die gegen die Tumormasse ausgerichtet waren. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 dargestellt. Tabelle 2 Anzahl an Gefäßen (Mittel ± SA) Kontrollmäuse Mäuse, denen C&sub2;&sub7;&sub7;-Met-H&sub2;&sub9;&sub6; gegeben wurde

Beispiel 7

30 Gewichtsteilen des Polypeptids C&sub2;&sub7;&sub7;-Met-H&sub2;&sub9;&sub6; wurde PBS bis zu einem Gesamtgewicht von 2 000 Teilen zugegeben, und die Lösung wurde durch Filtration durch ein Millipor-GS-Filter sterilisiert. Dann wurden 2 g des erhaltenen Filtrats in ein 10 ml-Glasfläschchen gegeben und lyophilisiert. Das ergab ein Glasfläschchen, das 30 mg lyophilisertes Polypeptid enthielt, das in dieser Erfindung verwendet wird.
Wie oben beschrieben, stellt diese Erfindung ein neues Polypeptid zur Verfügung, welches sowohl die Aktivitäten der Zellenausbreitung als auch des Heparin-Bindens aufweist, und sie stellt auch ein Verfahren zu dessen Herstellung zur Verfügung. Dieses Polypeptid wirkt zugunsten der Zellbindung, mit Heparinsulfat und anderen Komponenten der extrazellulären Matrix, und ist brauchbar zur Behandlung von Wunden, zur Inhibierung von Gefäßbildung und ähnlichem.

Claims

1. Polypeptid mit der folgenden Strukturformel [I]:

C&sub2;&sub7;&sub7;(Met)nH&sub2;&sub7;&sub1;-(X)m [I]

worin C&sub2;&sub7;&sub7; die Formel [II] bedeutet:

H&sub2;&sub7;&sub1; die Formel [III] bedeutet:

worin X die folgende Strukturformel [IV] hat:

und worin Met einen Methioninrest bedeutet, n entweder 1 oder 0 ist und m 1 oder 0 ist.

2. Mittel zur Inhibierung von Gefäßbildung, enthaltend eine wirksame Menge des Polypeptids nach Anspruch 1.