DE68926916T2 - 14-Beta-gal Sauger-Lectin - Google Patents

Description

• Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von kohlehydratbindenden Proteinen als Regulatoren der Zelldifferenzierung und Immunität. Insbesondere betrifft sie eine Klasse von Laktose- oder Tensid-extrahierbaren Säugetier-Lectinen mit einem Molekulargewicht von etwa 12-18 kDa, die vorzugsweise eine Glykosylierungsstelle enthalten.
• Lectine sind als Proteine definiert, die Kohlehydrate unterschiedlicher Arten spezifisch binden, und man konzentrierte sich anfangs auf jene, die aus Pflanzen isoliert wurden, wie Concanavalin A und Ricinagglutinin. Es stellte sich heraus, daß diese Lectine aufgrund des Glykosylierungszustands einiger Proteine von Interesse für Proteinreinigungsverfahren geeignet waren. In letzter Zeit jedoch beschäftigte man sich eingehend mit einer Gruppe von Laktose-extrahierbaren Lectinen, die sich spezifisch an bestimmte β-D-Galaktosid enthaltende Gruppen binden und in einer Vielzahl an Säugetieren, wirbellosen Tieren, Vögeln und sogar in mikrobiellen Quellen gefunden werden. Alle Lectine dieser Klasse scheinen Untereinheiten der Größenordnung von 12-18 kDa zu enthalten und können mittels eines einfachen diagnostischen Tests -- ihre Fähigkeit, mit Trypsin behandelte rote Blutkörperchen von Kaninchen zu agglutinieren, wird durch bestimmte β-D-Galaktose enthaltende Gruppen spezifisch inhibiert -- leicht klassifiziert werden. Obwohl die Lectine selbst trypsin isierte Kaninchen-Erythrozyten agglutinieren, kann somit die Agglutinierung z.B. durch Laktose, Thiodigalaktosid und andere bestimmte β-D-Galaktose enthaltende Gruppen inhibiert werden. Andere bekannte Eigenschaften umfassen die Nicht-Notwendigkeit von Metallionen beim Bewirken der Agglutinierung und die Notwendigkeit des Vorhandenseins eines Reduktionsmittels wie z.B. eines Thiols.
• Citt, M.A. et al., Proc Natl Acad Sci USA (1986) 83: 7603-7607 erhielten zwei cDNA- Klone durch das Screenen einer menschlichen cDNA-Hepatombibliothek mit einem für ein menschliches Lungen-Lectin spezifischen Antiserum. Diese cDNAs kodierten für Proteine, die jenen ähnelten, die einige andere Forscher in einer Vielzahl an Geweben entdeckten. Z.B. beschreiben Kasai, K., et al. in JP-A-60/184020 ein menschliches Plazenta-Lectin von etwa 14 kDa; Arbeiten der gleichen Forschergruppe ergaben, daß die Sequenz dieses Lectins in etwa jener ähnelte, die aus Kükengeweben isoliert wurde (Ohyama, Y. et al., Biochem Biophys Res Commun (1986) 134: 51-56). Es zeigte sich, daß das aus Küken stammende Lectin eine ähnliche Struktur aufwies wie Discoidin I, das ein Lectin ist, das man während des Entwicklungsstadiums des zelligen Schleimpilzes Dictyostelium discoideum beobachten kann.
• Caron, M. et al., Biochim Biophys Acta (1987) 925: 290-296 beschreiben die Reinigung und Charakterisierung ähnlicher Lectine aus Ratten- und Rinderhirngewebe. deCabutti, N.E.F. et al., FEBS Letters (1987) 223: 330-334 beschreiben ein ähnliches Lectin aus Amphibien-Eierstöcken. Die Isolierung eines ähnlichen "Elektrolectins" aus Aal wurde bereits durch Levi, G. et al., J Biol Chem (1981) 256: 5735-5740 beschrieben. Ein zusätzliches analoges 14 kDa-Lectin wurde durch Klonieren und Exprimieren von cDNA, die aus verschiedenen Mäuse-Fibrosarkomzellinien stammte, von Raz, A. et al Experimental Cell Research (1987) 173: 109-116 hergestellt. Ein 14 kDa-Rattenlungen- Lectin und die dafür kodierende cDNA wurden durch Clerch, L.B. et al., Biochemistry (1988) 27: 692-699 beschrieben. Joubert, R. et al., Develop Brain Res (1987) 36:146- 150 beschreiben die Isolierung von Lectinen, die Gehimzellen agglutinieren können, aus Rattenhirn. Raz, A. et al., Cancer Research (1981) 41: 3642-3647 beschreiben eine Vielzahl von Lectinen aus neoplastischen Zellen verschiedener Säugetierspezies.
• Ein Homologievergleich unter verschiedenen Lectinen einschließlich der aus Küken, Aal, menschlicher Plazenta, menschlicher Lunge und zwei aus Hepatom stammenden Lectine (wobei alle diese Lectine in den obigen Literaturstellen beschrieben sind) wurde von Paroutaud, P. et al., Proc Natl Acad Sci USA (1987) 84: 6345-6348 durchgeführt. Es scheint, daß bestimmte Aminosäurepositionen der Proteine, darunter 23, 32, 35, 37, 43, 45, 70, 71, 76, 90, 91, 102, 103, 105 und 109-111 in allen verglichenen Spezies vollständig konserviert sind. Nur ein Lectin dieser Reihe, jenes aus Küken, enthält eine "N-gebundene" Glykosylierungsstelle, die jedoch nicht mit Saccharid konjugiert ist. Kein Säugetier-Lectin in dieser Familie, das im Fachgebiet charakterisiert wurde, besitzt eine N-gebundene Glykosylierungsstelle.
• Unter den löslichen Lectinen scheint es einige Varietäten unterschiedlicher Molekulargewichte und/oder Kohlehydrat-Spezifitäten zu geben. Sparrow, C.P. et al., Biol Chem (1987) 252: 7383-7390 beschreiben drei Klassen löslicher Lectine aus der menschlichen Lunge, eine mit 14 kDa, eine mit 22 kDa, eine dritte mit 29 kDa. Sie sind alle gegenüber β-D-Galaktosiden spezifisch. Die Kohlehydrat-Spezifitäten der 14 kDa- Klasse sind größtenteils ähnlich, doch die Spezies mit größerem Molekulargewicht besitzen zumeist unterschiedliche Spezifitäten. Andere Spezies weisen auch mehr als ein lösliches, β-D-Galaktosid bindendes Lectin auf, darunter Mäuse (Roff, C.F. et al., Biol Chem (1983) 258: 10637-10663; Ratten (Cerra, R.F. et al., J Biol Chem (1985) 260: 10474-10477) und Hühner (Beyer, E.C. et al., J Biol Chem (1980) 255: 4236-4239). Unter den verschiedenen β-D-Galaktosid-spezifischen löslichen Lectinen variiert die Rezeptorspezifität beträchtlich, wobei sich die Gruppe mit etwa 14 kDa von den durch Sparrow et al. (s.o.) beschriebenen Repräsentanten mit 22 kDa und 29 kDa zu unterscheiden scheint.
• Die bevorzugten Lectine der vorliegenden Erfindung werden aus der menschlichen promyelozytischen Leukämie-Zellinie HL-60 oder aus menschlichem Plazentagewebe isoliert. Lectine wurden bereits durch andere Forscher aus der HL-60-Zellinie isoliert, aber sie entsprechen nicht den Lectinen dieser Klasse. Paietta, E. et al., Cancer Research (1988) 48: 280-287 beschreiben ein mutmaßlich membrangebundenes (unlösliches) Lectin, das N-Acetylneuraminsäure sowie "Doppelantennen"-Oligosaccharidstrukturen mit Galaktoseenden erkennt. Die Aktivität ist kalzium-unabhängig. Das scheinbare Molekulargewicht beträgt 17 kDa. Somit unterscheidet sich der Spezifitäts- und Löslichkeitsstatus deutlich vom hierin beschriebenen Lectinprotein.
• Ein β-Galaktosid-bindendes Lectin wurde unter Verwendung eines Affinitätschromatografie-Verfahrens aus menschlichem Plazenta-Homogenat isoliert (Hirabayashi Biochem Biophys Com (1984) 122 (3) S. 938-944). Dieses Protein wurde weiter charakterisiert (Hirabayashi et al., J Biochem (1987) 101, 987-995), und die Aminosäure-Analyse zeigt unter anderem, daß sich das Protein vom hierin beschriebenen unterscheidet.
• Da die Aktivitäten der Lectine bei der Regulierung des Immunsystems und der Vermittlung anderer Arten interzellulärer Kommunikation eine so subtile Beschaffenheit aufweisen und so genau auf die Wirtsumgebung abgestimmt sind, ist es entscheidend, daß eine Vielfalt solcher Regulatoren zur therapeutischen und diagnostischen Verwendung zur Verfügung steht. Wie hierin im Kapitel über den Hintergrund der Erfindung beschrieben, sind einige Mitglieder der Klasse von β-D-Galaktosid bindenden, löslichen Lectinen mit etwa 14 kDa auf dem Gebiet bekannt. Diese Lectine weisen zwar ähnliche Eigenschaften auf, doch sie sind therapeutisch oder diagnostisch nicht austauschbar. Außerdem scheint es, daß, wenn die Lectine glykosyliert werden können, das Ausmaß und die Art der Glykosylierung manipuliert werden kann, um die Spezifität (z.B. Halbwertszeit im Kreislauf, in vivo-Stoffwechsel, Löslichkeit, Stabilität oder spezifische Aktivität) des Moleküls zu verändern. Die vorliegende Erfindung bietet eine Klasse von Lectinen, die solche Manipulation ermöglicht, und auch ein spezifisches Element dieser Klasse, wobei sie alle das Repertoire therapeutischer und diagnostischer Möglichkeiten erweitern. Die Erfindung bietet weiters rekombinante Materialien und Verfahren zur Herstellung dieser spezifischen neuen Elemente des Repertoires. In einem Aspekt betrifft die Erfindung ein menschliches HL-60-Lectin, das aus HL-60-Zellen (ATCC CCL 240) oder aus menschlicher Plazenta gewonnen werden kann, im unglykosylierten Zustand ein Molekulargewicht von 14 kDa aufweist, zumindest eine Glykosylierungsstelle enthält, die aus einer Tripeptidsequenz Asn-X-Thr oder Asn-X-Ser besteht, und das die nachstehend beschriebenen Bindungs- und Agglutinierungseigenschaften besitzt. In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung ein menschliches HL- 60-Lectin mit 14 kDa, das im wesentlichen aus der Aminosäuresequenz besteht, die als die Aminosäuren 2-1:35 in Fig.1 dargestellt ist, und zumindest eine Tripeptidsequenz Asn-X-Thr oder Asn-X-Ser enthält. Die Aminosäure an Position 1, Methionin, wird üblicherweise entfernt, wenn das Protein rekombinant in Säugetierzellen produziert wird, und kann entfernt werden, wenn das Protein rekombinant in Bakterienzellen produziert wird; sie ist natürlich nicht vorhanden und für die Aktivität nicht entscheidend. In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung die obigen HL-60- und die aus Plazenta gewonnenen Lectine mit einem Molekulargewicht von 14 kDa sowie glykosylierte Formen davon mit einem Molekulargewicht im Bereich von 17-20 kDa.
• In anderen Aspekten betrifft die Erfindung DNA-Sequenzen, die für die obigen 14-β-gal- Säugetier-Lectine kodieren, welche Lectine N-gebundene Glykosylierung ermöglichen, und insbesondere das Protein aus Fig.1 bzw. andere HL-60- oder menschliche Plazenta- Lectine dieser Klasse in isolierter und gereinigter Form und/oder an heterologe Steuersequenzen, die sich zur rekombinanten Expression eignen, ligiert. In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung Wirtszellen, die mit den hierin beschriebenen DNA-Sequenzen transformiert sind, und Verfahren zur Herstellung der gewünschten Lectinproteine. Sie betrifft außerdem Antikörper, die mit den Lectinen der Erfindung spezifisch reagieren.
Kurze Beschreibung der Abbildungen
• Fig.1A zeigt die cDNA-Sequenz und die abgeleitete Aminosäuresequenz des HL-60 und des Plazenta-Lectins. Die hochgesetzten Zahlen korrelieren mit den entsprechenden Nukleotiden, und die Kästchen zeigen Start- und Stopcodons. Das Sternchen zeigt die mögliche N-gebundene Glykosylierungsstelle an.
• Fig. 1B zeigt Restriktionskarten zweier HL-60-cDNA-Klone, wobei der Kodierbereich durch offene Kästchen angezeigt wird, und die verwendete Sequenzierstrategie.
• Fig.2A zeigt einen Southern-Blot der DNA aus HL-60- und menschlichen Plazentazellen, die mit HL-60-cDNA sondiert wurden, wobei dies auf ein Gen für das 14 kDa-Lectin hinweist.
• Fig.28 zeigt einen mit der HL-60-cDNA sondierten Northern-Blot, wobei dieser darauf hinweist, daß die mRNA-Messages, die in einer Vielzahl an mutmaßlicherweise für Lectine kodierenden Zellinien enthalten sind, die gleiche Länge aufweisen und homolog sind.
• Fig.3 zeigt die SDS-PAGE eines gereinigten Lectin-Präparat.
• Fig.4A zeigt die HPLC-Reinigung von HL-60-Lectin und die SDS-PAGE der Eluatfraktionen.
• Fig.4B zeigt die Agglutinierungsaktivität jeder Fraktion, überlagert über der Absorption bei 214 nm.
• Fig.5 zeigt die SDS-PAGE-Analyse (Einfärbung mit Silber) von mit N-Glycanase behandelten HL-60-Lectinen.
• Figuren 6A und 6B zeigen die SDS-PAGE- und Western-Blot-Analysen verschiedener 14 kDa-Lectine, einschließlich des aus mit Lectin-cDNA transfizierten E.coli-Zellen stammenden.
• Fig.7 zeigt die SDS-PAGE-Analyse immungefällter, metabolisch markierter HL- 60/Plazenta-Lectine, die durch CHO-Zellen, welche mit HL-60-Lectin-cDNA oder mit HL-60-Lectin-cDNA und einem operabel verbundenen Sekretionssignal transfiziert sind, erzeugt wurden.
• Fig.8 zeigt die SDS-PAGE-Analyse von immungefälltem, metabolisch markiertem Lectin aus verschiedenen Zellinien.
• Fig.9 zeigt die SDS-PAGE-Analyse von immungefälltem Lectin, das durch CHO-Zellen sekretiert wird, die mit HL-60-Lectin-cDNA, die operabel mit einem Sekretionssignal verbunden ist, transfiziert sind.
• Fig.10 zeigt die SDS-PAGE-Analyse von immungefälltem Lectin, das durch CHO-Zellen sekretiert wird, die mit HL-60-Lectin-cDNA, die mit einem Sekretionssignal operabel verbunden ist, transfiziert sind, und das mit N-Glycanase behandelt ist.
• Fig.11 zeigt die Laktose-Sepharose-Reinigung von Lectinen, die durch CHO-Zellen sekretiert werden, die mit HL-60-Lectin-cDNA, die mit einem Sekretionssignal operabel verbunden ist, transfiziert sind, und die SDS-PAGE der Eluatfraktionen.
• Fig.12 zeigt die Ergebnisse eines Hämagglutin-Bioassays gereinigter Lectine aus menschlicher Plazenta, HL-60-Zellen und E.coli-Zellen, die mit Vektoren, die Lectin- cDNA und ein operabel verbundenes Sekretionssignal enthalten, transfiziert sind, sowie die Agglutinationshemmung durch Zucker.
• Figuren 13A, 13B, 13C und 13D sind Graphen, die die Auswirkung von HL-60-Lectin auf die primäre Immunreaktion zeigen.
Ausführungsformen der Erfindung A. Definitionen
• Es ist allgemein bekannt, daß Proteine in einer Vielzahl von im wesentlichen äquivalenten Formen einschließlich ihrer sauren und basischen Salze sowie der Formen, die an funktionalen Gruppen der Seitenketten derivatisiert sind, sowie der Formen, die mit Lipiden und Membranen assoziiert sind, sowie anderer Modifikationen, die durch die posttranslationale Verarbeitung durch die Zelle, die die für das gewünschte Lectin kodierende DNA exprimieren, herbeigeführt werden, existieren können. Alle der nachstehend definierten Proteine schließen diese unterschiedlichen Formen ein.
• "HL-60-Lectin" bezieht sich hierin auf ein menschliches Lectin, das aus HL-60-Zellen (ATCC CCL 240) oder aus menschlicher Plazenta erhältlich ist und im unglykosylierten Zustand ein Molekulargewicht von 14 kDa sowie zumindest eine Tripeptidsequenz Asn- X-Thr oder Asn-X-Ser aufweist, und die Fähigkeit, Gruppen zu binden, die β-D- Galaktosid enhalten, und trypsinisierte Kaninchen-Erythrozyten zu agglutinieren, welche Fähigkeit durch die genannten Gruppen gehemmt werden kann. Eine Ausführungsform besteht im wesentlichen aus den in Fig.1 dargestellten Aminosäuren 2-135, die zumindest eine Tripeptidsequenz, Asn-X-Thr oder Asn-X-Ser, enthalten, die eine Clykosylierungsstelle bereitstellt. Man ist der Ansicht, daß selbst bei nativer Produktion durch HL-60-Zellen und Plazentagewebe das N-terminale Methionin des HL-60-Lectins abgespalten wird und das verbleibende Protein acetyliert werden kann. Verschiedene Formen posttranslationaler Verarbeitung können je nach der Zelle, die das Proteins erzeugt, erwartet werden, wobei die resultierenden verarbeiteten Proteine natürlich im Schutzbereich der Erfindung enthalten sind.
• Es ist insbesondere zu beachten, daß im Gegensatz zu analogen Säugetier-Lectinen, deren Proteinsequenzen bekannt sind, das HL-60-Lectin eine Clykosylierungsstelle (Asn- Leu-Thr) enthält, die bei Position 96 beginnt. Das native Material enthält offensichtlich - zumindest teilweise - keine Glykosylierung an dieser Stelle; wenn es jedoch in geeigneter Weise in anderen rekombinanten Wirten erzeugt wird, kann die Stelle glykosyliert sein. Glykosylierte Formen sind demnach im Schutzbereich der Erfindung enthalten, soferne die Glykosylierung nicht die Aktivität zerstört.
• Weiters ist auch zu beachten, daß die Ausführungsform von "HL-60-Lectin", wie in Fig.1A gezeigt, mehr Cysteinreste (6) als andere bekannte homologe Tier-Lectine enthält. Die vorliegende Erfindung ist jedoch nicht darauf beschränkt und es kann eine beliebige Anzahl an Cysteinresten oder keine Cysteinreste vorliegen, soferne die Aktivität beibehalten wird. "HL60-Lectin" schließt weiters das Peptid ein, das die Positionen 2-135 in Fig. 1 umfaßt, oder die natürlich vorkommenden Mutanten oder Allelvariationen davon. Weiters ist zu beachten, daß durch Organismen produzierte Proteine in der untersuchten Form nicht notwendigerweise stabil verbleiben, sondern daß die für sie kodierenden Gene natürlichen Mutationen und Variationen unterliegen; sie sind daher im Schutzbereich der Erfindung enthalten.
• Es ist derzeit unbekannt, ob HL-60-Lectin, wenn es in seiner nativen Umgebung von HL- 60-Zellen oder Plazentagewebe erzeugt wird, als solches sekretiert wird oder ob es ein lösliches oder proteinassozuertes zytoplasmisches Protein des Zytoplasmas oder des Kerns der Zelle ist. Das HL-60-Lectin kann, um die Sekretion sicherzustellen, durch rekombinante Addition einer bekannten Signalsequenz produziert werden. Die Gewinnung des Proteins aus dem Medium ist natürlich leichter als eine Gewinnung, die eine Zellyse erfordert.
• Es wird hierin gezeigt, daß HL-60-Zellen und Plazentagewebe β-gal-bindendes Lectin mit 14 kDa herstellen.
• Die oben beschriebenen "HL-60"-Lectine sind Vertreter der Klasse menschlicher HL-60- Lectine mit zumindest einer Clykosylierungsstelle und die hierin beansprucht sind. Die hierin verwendete Phrase "14-β-gal-Saügetier-Lectin mit zumindest einer Glykosylierungsstelle" bezieht sich auf eine Klasse von Peptiden, die die Eigenschaften jener Gruppe von Lectinen aufweist, für die das HL-60-Lectin aus Fig.1 ein Beispiel ist, die zumindest eine Tripeptidsequenz, Asn-X-Thr oder Asn-X-Ser enthalten, die eine Glykosylierungsstelle bereitstellt.
• Um in der Klasse von 14-β-gal-Säugetier-Lectinen mit zumindest einer Glykosylierungsstelle enthalten zu sein, muß ein Peptid die biologischen Eigenschaften dieser Klasse aufweisen, die wie folgt lauten: ein Molekulargewicht im nicht-glykosylierten Zustand von etwa 14 kDa (in der Praxis ein gemessenes Molekulargewicht von 12-18 kDa). Das Lectin muß bestimmte β-D-Galaktosid enthaltende Gruppen (z.B. Laktose) binden können und muß spezifisch die Hämagglutination trypsinisierter Kaninchen- Erythrozyten in Standard-Lectin-Assays bewirken, worin die Agglutination durch bestimmte, eine β-Galaktosid-Bindung enthaltende Gruppen wie z.B. Laktose und Thiogalaktosid gehemmt wird. Die Notwendigkeit, Hämagglutination bewirken zu können, umfaßt das Vorhandensein eines Reduktionsmittels, das Thiolgruppen und Tryptophanreste in der reduzierten Form beibehalten kann, wobei jedoch die Aktivität unabhängig von Metallionen ist. Typischerweise zeigen Peptide der Erfindung, die diese Aktivität aufweisen, eine starke Homologie mit den im obigen Kapitel über den Hintergrund der Erfindung angeführten Tier-Lectinen, wobei es zusätzlich notwendig ist, daß zumindest eine Glykosylierungsstelle vorhanden ist.
• Es ist vorzuziehen, daß die Lectine eine Homologie von zumindest 40% mit dem HL- 60-Lectin aus Fig.1A, vorzugsweise eine Homologie von 75% und am bevorzugtesten eine Homologie von über 90% aufweisen. Die bevorzugte Position der Glykosylierungsstelle ist bei den Resten 96-99, wie im Falle des Lectins von Fig.1A, oder stromauf innerhalb eines Abstands von höchstens 4 Aminosäuren oder stromab innerhalb eines Abstands von höchstens 3 Aminosäuren, d.h. zwischen den Resten 92 und 101 (Grenzwerte eingeschlossen). Andere bevorzugte Positionen sind jene, die Asn, X (eine beliebige Aminosäure) und Ser/Thr-Reste in einem beliebigen Tier-Lectin in nichtkonservierten Bereichen enthalten.
• Besonders bevorzugte Ausführungsformen sind Peptide mit zumindest 95% Homologie mit den bekannten, oben angeführten Säugetier-Lectinen, worin jedoch im Gegensatz zu den nativen Formen zumindest eine Glykosylierungsstelle in der Sequenz enthalten ist. In diesen bevorzugten Ausführungsformen ist die bevorzugte Position für die Glykosylierungsstelle ebenfalls bei den Positionen 96-99 oder zumindest zwischen den Positionen 92-101 (Grenzwerte eingeschlossen). Die bevorzugteste Ausführungsform der Glykosylierungsstellen enthaltenden 14-β-gal-Lectine ist das HL-60-Lectin aus Fig. 1A (basierend auf HL-60-Zellquellen oder Plazentagewebe-Quellen und den natürlich vorkommenden Mutanten und Allelvarianten davon).
B. Isolierung der für HL-60-Lectin kodierenden cDNA a. Aus HL-60-Zellen
• HL-60-Zellen (ATCC CCL 240) wurden 40 Stunden lang in der Gegenwart von DMSO kultiviert. Die Zellen wurden dann lysiert, die mRNA mittels Standardverfahren isoliert und eine cDNA-Bibliothek in λ-GT10 nach dem Verfahren von Huynh, TV. et al., DNA Cloning 1, DM. Glover, Hg., R.L. Press (1985) S. 49-78 konstruiert. Die Bibliothek wurde mit zwei Gruppen der folgenden 14-mer-Sonden sondiert:
• Diese Sonden wurden auf der Grundlage bekannter Lectinsequenzen entworfen, insbesondere jener der konservierten Bereiche in der Nähe des C-Terminus. Sie kodieren für die Aminosäuresequenzen Glu-Phe-Lys-Phe-Pro (die sich in HL-60-Lectin an den Positionen 106-110 befindet) und Asp-Phe-Lys-Ile-Lys (die sich in HL-60-Lectin an den Positionen 126-130 befindet). Die Sonden wurden an ihren Enden mit ³²P mittels T4-Polynukleotid-Kinase und [γ-³²P]ATP markiert.
• Die Phagenkolonien wurden gescreent, indem LP59 mit doppelten Nitrozellulosefiltern, die 2-4 Stunden lang bei 37ºC vorhybridisiert wurden, hybridisiert wurde. Der Hybridisierungspuffer enthielt 6 x SSC, 20 mM Phosphatpuffer, pH 7, 2 x Denhardt- Lösung, 0,1% SDS, 2 mM EDTA und 100 µg/ml Hefe-RNA. Die Filter wurden dann bei Raumtemperatur in 4 x SSC gewaschen.
• In etwa 106 Phagenkolonien wurden 17 positive Klone gefunden, die an LP59 hybridisierten; 9 davon hybridisierten auch mit der LP60-Sonde. Alle 9 Klone enthielten eine interne EcoRI-Stelle, die ein "kurzes" und ein "langes" Fragment ergab. Das Didesoxy-Sequenzieren dreier dieser Klone, die an beide Sonden hybridisierten, zeigte identische DNA-Sequenzen, die sich nur in den 5'- und 3'-Verlängerungen des offenen Leserahmens unterschieden.
• Die für einen dieser Klone ermittelte 507 bp-Sequenz ist in Fig.1A dargestellt. Der offene Leserahmen der 405 Basenpaare (Klon 11), die für ein Protein von 135 Aminosäuren mit einem theoretischen Molekulargewicht von 14.744 Da kodieren, ist gezeigt. Laut Berechnungen ohne das N-terminale Methionin besitzt das Protein ein theoretisches Molekulargewicht von 14.613. Dieses Protein ist mit anderen Tier-14-β- gal-Lectinen wie z.B. Rattenlungen-Lectin homolog. Homologien mit anderen bekannten Tier-Lectinproteinsequenzen reichen von 40% (Mäuse-Hepatom) bis 96% (menschliche Lungen-Peptide).
b. Aus menschlichem Plazentagewebe
• Eine menschliche Plazenta-DNA-Bibliothek wurde aus menschlicher Plazenta-Poly(A&spplus;)- RNA in λ-GT10 konstruiert (siehe Tarantino, A.L. et al., Biochemistry (1985) 24: 4665- 4671), indem ein synthetischer Primer, der zum untranslatierten 3'-Bereich komplementär war, die Nukleotide 486-502 des HL-60-cDNA-Klons 11 (3'- TCCGTCGACGGAGACGA 5') und nicht Oligo-dT verwendet wurde, um die Synthese des ersten cDNA-Strangs zu primen. Die Bibliothek wurde mit einem markierten 311 bp-Fragment voll HL-60 (Klon 2, Fig.1B) gescreent, das einen Großteil der für Lectin kodierenden Sequenz aber keine untranslatierte 3'-Primersequenz enthielt. Vier positive Klone wurden mittels der Sonde wie beim Screenen der HL-60-Bibliothek isoliert.
• Es ist aus der abgeleiteten Aminosäuresequenz offensichtlich, daß eine Glykosylierungs steile Asn-Leu-Thr an Positionen 96-98 des HL-60-Lectins aus Fig.1A vorhanden ist. Dies ist das erste bekannte Säugetier-Lectin, das eine Glykosylierungsstelle enthält und seine Gegenwart bietet die Möglichkeit, die Kohlehydratbindefähigkeit, die Löslichkeit, die Halbwertszeit im Kreislauf, den in vivo-Stoffwechsel, die Stabilität oder die spezifische Aktivität des Lectins möglicherweise zu verändern, ohne seine Fähigkeit zu zerstören, sich an β-D-Galaktosid-Verbindungen zu binden.
• Außerdem bietet die Verfügbarkeit der in Fig.1A dargestellten DNA-Sequenz und der für andere Säugetier-Lectine beschriebenen cDNA-Sequenzen (siehe Kapitel über den Hintergrund der Erfindung) die Möglichkeit, das Gen so zu manipulieren, daß eine Glykosylierungsstelle bereitgestellt werden kann, selbst wenn im Nativzustand keine vorhanden ist. Bei einem Verfahren zur Herstellung der bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung kann somit eine Tripeptidsequenz zwischen den Positionen 92- 101 durch stellenspezifische Mutagenese zu einer Glykosylierungsstelle umgewandelt werden. Es ist nicht zu erwarten, daß das Vorsehen einer Glykosylierungsstelle an dieser Position die 14-β-gal-Lectinaktivität des Peptids zerstört.
• In einem alternativen Verfahren können die gewonnene HL-60- und Plazenta-cDNA manipuliert werden, um für zusätzliche Homologie mit 14-β-gal-Lectinsequenzen aus anderen Quellen zu sorgen, wobei aber gleichzeitig die für die Glykosylierungsstelle kodierende Sequenz beibehalten wird.
C. Eigenschaften der genomischen und cDNA
• Southern Blots menschlicher genomischer DNA, die aus HL-60-Zellen und menschlichem Plazentagewebe isoliert wurde, erfolgten nach der Spaltung mit BamHI, Hindlil oder EcoRI und sondierten das 445 bp-SmaI/NcoI-Fragment des HL-60-cDNA- Klons 2 (Fig.18), wie dies aus Fig.2A ersichtlich ist. Für mit HindIII (Bahn 1: Plazenta, Bahn 2: HL-60) oder BamHI (Bahn 3: Plazenta, Bahn 4: HL-60) gespaltene DNA gab es eine hybridisierende Bande mit etwa 7,5 oder 15 kbp; die Spaltung mit EcoRI (Bahn 5: Plazenta, Bahn 6: HL-60) ergab zwei hybridisierende Banden mit 5,1 und 3,2 kbp, was mit einer internen EcoRI-Stelle übereinstimmte.
• Northern Blots (Fig.28) unter Verwendung von mRNA-Präparaten aus HL-60-Zellen (Bahnen 1, 5 und 6), normaler menschlicher Plazenta (Bahn 3) und menschlichen SK- Hepatomzellen (ATCC CCL 24601) (Bahn 4), menschlichen Erythroleukämie-Leukämie- KG-1A-Zellen (ATCC HTB 52) (Bahn 7), und menschlichen Choriokarzinom JEG-3- Zellen (ATCC HTB 36) (Bahn 2), die mit einem 311 bp-EcoRI-cDNA-Fragment von Klon 2 (Fig.1B) sondiert wurden, wiesen eine Hybridisierungsbande mit etwa 700 Nukleotiden auf, wobei dies auf mRNA-Messages geringerer oder identischer Länge für alle untersuchten Zellen hindeutete.
D. Mit den Lectinen der Erfindung reaktive Antikörper
• Die Lectine der Erfindung können in herkömmlicher Weise zur Bildung von Antiseren verwendet werden, die mit diesen Lectinen reagieren und für sie spezifisch sind. Ein für HL-60-Lectin "spezifischer" Antikörper ist einer, der mit diesem Lectin oder mit Proteinen, für die die natürlich vorkommenden Mutationen und Allelvarianten dieses Gens kodieren, immunreaktiv ist, jedoch mit anderen Lectinen nicht immunreaktiv ist.
• Tatsächlich sind aufgrund der starken Homologie des HL-60-Lectins aus Fig.1A mit anderen Lectinen der 14-β-gal-Klasse nicht alle gegen das HL-60-Lectin gebildeten Antikörper dafür spezifisch. Durch Produzieren monoklonaler Antikörper gegen das HL- 60-Ledin können jedoch spezifische Antikörper erzeugt werden. Außerdem können Antikörper gebildet werden, die für verschiedene glykosylierte Formen spezifisch sind.
• Ebenso können Antikörper gebildet werden, die für einen bestimmten Teil der 14-β-gal- Lectine mit oder ohne zumindest einer Glykosylierungsstelle der Erfindung spezifisch sind - sowohl in nichtglykosilierter als auch vor allem in glykosylierter Form.
• Kurz gesagt sind die Antikörper innerhalb des Schutzbereichs der Erfindung jene monoklonalen Linien, die mit einem oder mehreren Teilen der Lectine der Erfindung reagieren, die jedoch mit den derzeit auf dem Gebiet der Erfindung bekannten Lectinen nicht kreuzreaktiv sind. Im Schutzbereich der Erfindung sind auch Antiseren enthalten, die gegen ein beliebiges erfindungsgsgemäßes Lectin gebildet werden, da diese Antiseren für diese Lectine einzigartig sind, selbst wenn sie in einem bestimmten Ausmaß Antikörper, die mit bekannten Lectinen kreuzreaktiv sind, enthalten.
E. Rekombinante Produktion von HL-60-Protein
• Die cDNA, die für die Aminosäuresequenz von Fig.1A oder für synthetische oder halbsynthetische Varianten davon oder für das 14 kDa-HL-60 kodiert, kann zur rekombinanten Produktion von HL-60-Lectin in einer Vielzahl an Systemen herangezogen werden. Geeignete DNAs, die für die verschiedenen 14-β-gal-Lectine kodieren, z.B. jene, die zumindest eine Glykosylierungsstelle enthalten, können auch rekombinant exprimiert werden. Die für Lectin kodierende DNA wird mobilisiert, indem man die geeignete Intron-lose Sequenz an Regulationssequenzen ligiert, die die Expression steuern, die resultierenden Expressionssysteme in geeignete Wirte transfiziert und die transformierten oder transfizierten Wirte unter Bedingungen kultiviert, die die Expression der DNA begünstigen. Genomische DNA, die für das HL-60- und Plazenta- Lectin sowie für seine natürliche vorkommenden Mutanten und Allelvarianten kodiert, kann mittels der cDNA als Sonde aus dem HL-60- oder Plazenta-Genom gewonnen werden. Diese genomische DNA kann auch in eukaryotischen Systemen, die zur Verarbeitung von Introns fähig sind, verwendet werden. Die für Lectin kodierende Sequenz kann mit einem voranstehenden ATG in das Expressionssystem ligiert werden, um das Lectin als reifes Protein zu erhalten. Alternativ dazu können Signalsequenzen, die bekanntermaßen im zur Verwendung beabsichtigten Wirt operabel sind, z.B. das Penicillinase- oder das alkalische Phosphatase-System in Bakterien, das α-Faktor-System in Hefe oder verschiedene Hormonsignalsequenzen in Säugetierzellen, dazu verwendet werden, um die Sekretion zu bewirken, indem das Expressionssystems mit dem DNA Kodiersignal in Lesephase mit der Lectin-DNA konstruiert wird. Das Lectin könnte auch als Fusionsprotein hergestellt werden, indem die Kodiersequenz, falls gewünscht mit einer zusätzlichen Kodiersequenz, in einen Leserahmen ligiert wird.
• Mittlerweile sind viele Wirtssysteme mit geeigneten Steuerungen im Fachgebiet allgemein bekannt. Unter prokaryotischen Wirten wird z.B. E.coli bevorzugt, obwohl andere Spezies wie z.B. Bacillus, Pseudonomas oder andere Bakterienstämme ebenfalls brauchbar wären. Geeignete Steuersysteme umfassen mit bakteriellen Proteinen assoziierte Promotoren, wie die β-Laktamase- und Laktose- (lac) Promotorsysteme (Chang et al., Nature (1977) 198: 1056; das Tryptophan- (trp) Promotorsystem (Goeddel et al., Nucleic Acids Res. (1980) 8: 4057) und das aus λ stammende PL-Promotor- und N-Gen-Ribosomenbindestellen-System (Shimatake et al., Nature (1981) 292: 128). Diese Liste enthält die in Prokaryoten am gebräuchlichsten verwendeten Promotoren und erhebt keinen Anspruch auf Vollständigkeit.
• Ebenso ist eine Vielzahl an Vektoren und Promotoren für Hefesysteme bekannt, z.B. der Promotor für 3-Phosphoglycerat-Kinase (Hitzeman et al., J Biol Chem (1980) 255: 2073); der Enolase-Gen-Promotor (Holland, M.J. et al., J Biol Chem (1981) 256: 1385) oder das leu2-Gen aus YEp 13 (Broach, J. et al., Gene (1978) 8: 121).
• Zur Expression in Zellen höherer Organismen zählen zu den in solchen Zellen operablen Promotoren virale Promotoren wie der SV40-Promotor (Fiers et al., Nature (1978) 273: 113) oder aus Adenovirus, Rinder-Papillomvirus, Rous-Sarkomvirus usw. stammende Promotoren. Geeignet sind weiters regulierbare Promotoren wie z.B. der Metallothionein I- oder Metallothionein II-Promotor. Steuersequenzen zur Retroregulation sind auch verfügbar, wie jenes, das mit dem Kristallprotein-Gen von B. thurengiensis assoziiert ist. Es stehen derzeit auch Systeme zur Herstellung rekombinanter Proteine in Insekten- und Pflanzenzellen zur Verfügung, obwohl Pflanzenzellsysteme derzeit weniger gebräuchlich sind. Ihre mangelnde Eignung ist jedoch das Ergebnis des Stands der Technik und keine inhärente Unverträglichkeit dieses Wirtszellsystems mit dem für die Proteine der Erfindung kodierenden Gen.
• Die geeigneten Kodiersequenzen werden an die Steuersequenzen in operabler Konfiguration und in geeignete Vektoren zur Transfektion in den zur Verwendung beabsichtigten Wirt ligiert. Die Vektoren können üblicherweise Plasmide, Virusteilchen oder Phagen umfassen, wobei dies vom beabsichtigten Wirt und der Art der Transformation abhängt. "Transformation" bezieht sich hierin auf alle Formen des Bewirkens der Aufnahme fremder DNA durch eine Wirtszelle, einschließlich viraler Infektion, Transduktion, Konjugation oder - wahrscheinlich am häufigsten - Herbeiführung der in vitro-Aufnahme durch Transfektion mit Transfektionsmitteln wie z.B. Kalziumchlorid oder DEAE/Dextran, in Abhängigkeit vom Wirt.
• Die transformierten Zellen werden dann hinsichtlich jener gescreent, die die gewünschte DNA enthalten, und die erfolgreichen Transformanten unter Bedingungen kultiviert, die die Expression der Kodiersequenzen bewirken. Das erzeugte Lectin wird dann aus dem Medium (wenn die Konstruktion zur Sekretion führt) oder aus den lysierten Zellen (wenn die Konstruktion ein intrazelluläres Protein ergibt) gereinigt.
• In beiden Fällen wird das Lectin durch Standardverfahren gereinigt, z.B. durch Extraktion in Laktose-Lösung oder anderen (Puffer, Triton X-100), gefolgt von chromatographischen Verfahren. Ein zweckmäßiges chromatographisches Verfahren ist Chromatographie auf Laktose-Sepharose-Gelen. Dabei wird der Extrakt auf das Gel geladen, das Gel gewaschen und das Eluieren durch Ergänzen des Äquilibrationspuffers mit 100 mM Laktose entweder in Chargen- oder in Gradientenform durchgeführt. Die Gegenwart des Proteins in den aktiven Fraktionen kann durch die Fähigkeit der Fraktion, nach der Entfernung von Laktose, die Hämagglutination trypsinisierter Kaninchen-Erythrozyten zu bewirken, worin die genannte Hämagglutination durch mill imolare Konzentrationen von Laktose oder Thiodigalaktosid gehemmt wird, leicht nachgewiesen werden.
Nützlichkeit der Erfindung
• Die erfindungsgemäßen Lectine eignen sich für eine Reihe therapeutischer und diagnostischer Anwendungen. In Analogie zu Elektrolectin (siehe Levy, G. et al., Eur J Immunol (1983) 13: 500-507) können die 14-β-gal-Säugetier-Lectine mit Glykosylierungsstelle(n) hierin zur Behandlung von Autoimmunerkrankungen wie z.B. Myasthenia gravis verwendet werden. Andere Autoimmunerkrankungen, die durch diese Lectine behandelt werden können, sind primärchronische Polyarthritis, systemischer Lupus erythematosus, jugendliche Diabetes und multiple Sklerose.
• Da diese Proteine Immunsystem-Regulatoren sind, eignen sie sich auch zur Prävention von Transplantat-Wirt-Krankheiten und zur Verhinderung der Abstoßung von Transplantaten im allgemeinen. Die hergestellten Antikörper, die mit diesen Proteinen immunreaktiv sind, eignen sich überdies zur Diagnose von Tumoren, da die Mengen dieser Lectine auf der Zelloberfläche mit Metastasenkrebs korrelieren. Die Lectine kommen auch für Arzneimittelzufuhr-Anwendungen in Frage, indem sie das Ankommen des Arzneimittels an geeigneten Zielen bewirken, wenn diese an das Lectin konjugiert sind. Die erfindungsgemäßen Lectine eignen sich auch als "Targetisiermittel", wenn sie an bestimmte zytotoxische Moleküle gekoppelt sind.
• Bei therapeutischen Anwendungen wird das Protein in einer seiner Verabreichungsart entsprechenden Weise formuliert, wobei auf dem Gebiet bekannte Formulationsverfahren zum Einsatz kommen; siehe z.B. Remington's Pharmaceutical Sciences, neueste Ausgabe, Mack Publishing Co., Philadelphia, PA. Typische Injektionsformulierungen umfassen ein Gemisch mit physiologischem Puffer zur Injektion wie Hank-Lösung oder Ringer-Lösung, die Einkapselung in Liposomen oder anderen Emulgatoren, die zur Arzneimittelzufuhr geeignet sind, u.dgl..
• Die Dosierung und Verabreichungsart der erfindungsgemäßen Lectine hängen von der Indikation und dem Patient sowie dem Schweregrad der zu behandelnden Krankheit ab. Bevorzugte Dosierungen reichen von etwa 0,004 mg/kg/Tag bis etwa 2 mg/kg/Tag. Bevorzugte Verabreichungsverfahen umfassen intravenöse, subkutane und orale Verfahren.
• Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung veranschaulichen, aber nicht einschränken.
Beispiel 1 Expression der HL-60-Lectin-cDNA in Säugetierzellen zur Bildung von intrazellulärem Protein
• Plasmid pHL11 wurde durch Ligieren des Inserts des LP59/LP60-Hybridisierungsklons aus der obigen λ-gt10-Bibliothek in einen bakteriellen Kloniervektor konstruiert. Somit enthält pHL11 die gesamte Kodiersequenz sowie die untranslatierten 5'- und 3'- Bereiche.
• Das Gen wird in zwei Segmenten in das Expressionsvektorplasmid p171 ligiert. Plasmid 171 enthält ein Expressionssystem für Mäuse-DHFR sowie einen SV40-Promotor und eine Polyadenylationsstelle, die durch einen HindIII- und BamHI-Restriktionsstellen enthaltenden Polylinker getrennt sind.
• Der 5'-Abschnitt der HL-60-Lectinsequenz wird durch Spalten von pHL11 mit EcoRI und SmaI und Ligieren des Fragments in mit EcoRI/SmaI gespaltenes pUC13 kloniert; die Replikation in E.coli ergibt pL1. Der stromabwärts befindliche Abschnitt wird durch folgende Schritte amplifiziert: Spalten von pHL11 mit NcoI, Abstumpfen mit Klenow, Spalten mit EcoRI, Isolieren eines 140 bp EcoRI/stumpfen Fragments und Ligieren dieses Fragments in EcoRI/SmaI-gespaltenes pUC13 sowie Amplifizieren in E.coli, um pL2 zu ergeben.
• Das stromaufwärts befindliche Fragment wird durch Spalten mit HindIII und EcoRI und Isolieren des 370 bp-Fragments aus pHL1 isoliert. Das stromabwärts befindliche EcoRI/BamHI-150 bp-Fragment wird aus pHL2 isoliert. Die isolierten Fragmente werden in den BamHI/HindIII-gespaitenen Expressionsvektor p171 ligiert und das Ligationsgemisch in E.coli transfomiert und einer Auswahl hinsichtlich erfolgreicher Transformanten unterzogen. Das Plasmid, das das HL-60-Lectin-Gen unter der Steuerung des SV40-Promotors und der Polyadenylierungsstellen enthält (pSV/HL-60) wurde so iert. Der isolierte Vektor diente dann dazu, eine chinesische Hamstereierstock- (CHO) Zellinie, der DHFR fehlt, zu transformieren; erfolgreiche Kolonien, die zu Wachstum in F12-Medien ohne Glycin, Hypoxanthin und Thymidin fähig waren, wurden isoliert und in selektiven Medien erweitert.
• Die ausgewählten Zellen wurden dann in einer Menge von 2 x 10&sup6; Zellen/ml F12- Medium ausgeimpft, 48 Stunden lang inkubiert und geerntet. Die Zellen wurden lysiert, und es wurde durch den Kaninchen-Erythrozyten-Agglutinationsassay bestätigt, daß das Lysat HL-60-Lectin enthielt.
Beispiel2 Expression der HL-60-Lectin-cDNA in Säugetierzellen zur Herstellung von sekretiertem Protein
• Eine Clai-Restriktionsstelle wurde unmittelbar stromaufwärts von dem Codon für Aminosäure 1 von Fig.1 eingefügt, wodurch das lnitiationscodon bewahrt und die stromabwärts befindliche Kodiersequenz beibehalten wurde. Diese stromaufwärts befindliche Sequenz wurde durch Spalten mit Clal/EcoRI entfernt und als ein 310 bp- ClaI/EcoRI-Fragment isoliert. Dieses wurde gemeinsam mit einem 150 bp-EcoRI/BamHI- Fragment, das aus obigem pHL2 isoliert wurde und das das stromabwärts befindliche Fragment enthält, an einen ClaI/BamHI-gespaltenen Expressionsvektor ligiert, der eine hydrophobe Sekretionsprotein-Signalsequenz unter der Steuerung des SV40-Promotors und eine ClaI-Stelle am 3'-Ende des Signals enthält. Dieser Expressionsvektor enthält auch ein Expressionssystem für Mäuse-DHFR.
• Das Ligationsgemisch wurde in CHO-Zellen ohne DHFR wie oben transformiert und wie in Beispiel 1 kultiviert. Nach 48 Stunden in F12- (gHT-) Medium wurde das Kulturmedium geerntet und hinsichtlich der HL-60-Lectin-Produktion unter Verwendung eines ELISA untersucht.
Beispiel 3 Isolieren von HL-60-Lectin aus HL-60-Zellen
• Natives HL-60-Lectin wurde wie folgt aus HL-60-Zellysat isoliert: Das Protein wurde durch Behandlung mit Lactose- oder Triton X-100-Lösung aus dem Lysat solubilisiert und das solubilisierte Lectin durch Affinität auf Lactose-Sepharose- oder Asialofetuin- Sepharose-Säulen gereinigt.
• Proteinhältige Fraktionen aus dem Elutionsgradienten von Lactose-Sepharose zeigten, wenn sie einer SDS-PAGE unterzogen wurden, Peaks sowohl bei 14 als auch bei 17 kDa (Fig.3, Bahn 4), die die geeignete Lectin-Aktivität aufweisen. Proteinhältige Peaks aus Asialofetuin-Sepharose-Säulen enthalten ein Lectin mit 14 kDa (Bahn 2) und in geringerem Ausmaß eine Spezies bei 30 kDa. Lectin, das aus menschlicher Plazenta isoliert wird und einer ähnlichen Behandlung unterzogen wird, zeigt ungeachtet der Affinitätssäule einen großen 14 kDa-Peak und in geringerem Ausmaß eine Spezies bei 30 kDa (Bahn 1: Asialofetuin; Bahn 3: Lactose) und keine 17 kDa-Spezies.
• Nach der Affinitätschromatografie wird das HL-60-Lectin unter Verwendung einer C4- HPLC-Säule mittels eines Acetonitril/Wasser-TFA-Lösungsmittelsystems bis zur Homogenität gereinigt. Die Figuren 4A und 48 zeigen das Ergebnis der Gradientenelution mit Acetonitril/TFA und die SDS-PAGE-Analyse der Fraktionen. Das 14 kDA- Lectin scheint in Fraktion 2 auf, wie dies aus den SDS-PAGE-Ergebnissen hervorgeht.
• Die Bestimmung, welche der 14 kDa- und 17 kDA-Proteine für die Hämagglutinierungsaktivität verantwortlich waren, erfolgte durch HPLC-Analyse der eluierten HL-60-Proteinfraktionen aus der Lactose-Sepharose-Affinitätschromatografie. Während das 14 kDA-Lectin vom 17 kDa-Protein getrennt wurde, enthielten Fraktionen, die die 17 kDa-Spezies enthielten, auch beträchtliche Mengen des 14 kDa-Lectins. Wie aus Fig.4B ersichtlich, entspricht das 14 kDa-Protein dem Peak der Hämagglutinationsaktivität. Außerdem zeigte die Western Blot-Analyse der 14 kDa- und 17 kDa-Proteine unter Verwendung von Kaninchen-Antiseren gegen gereinigtes 14 kDa- Plazenta-Lectin eine Kreuzimmunreaktivität mit dem 14 kDa-Protein, jedoch nicht mit dem 17 kDa-Lectin (siehe Fig.5).
• Die Möglichkeit, daß das 17 kDa-Protein eine glykosylierte Form des 14 kDa-Proteins ist, wurde durch die Behandlung der Proteine mit N-Glycanase (Genzyme) untersucht die N-Asparagin-gebundene Oligosaccharide aus Glykoproteinen hydrolysiert. Gereinigte Lectin-Proben (2 µg) wurden in 10 µl 0,5% SDS-0,1 M 2-Mercaptoethanol aufgelöst und mit 0,15 Units N-Glycanase behandelt. Wie aus Fig.5 ersichtlich, übte das Enzym unter Bedingungen, bei denen die Orosomucoid- und Fetuin-Glycoproteine deglykosyliert wurden, keinen Einfluß auf irgendeines der HL-60-Proteine aus. Bahn 1 enthält N-Glycanase; Bahn 2 menschliches Orosomucoid; Bahn 3 Orosomucoid und N- Glycanase; Bahn 4 Rinder-Fetuin; Bahn 5 Rinder-Fetuin und N-Glycanase; Bahn 6 HL- Lectin, das auf Lactose-Sepharose gereinigt wurde; und Bahn 7 HL-60-Lectin und N- Glycanase. Da das beobachtete Molekulargewicht für das 14 kDa-Lectin fast mit dem vorausgesagten Molekulargewicht von 14.613 Da übereinstimmt, ist es unwahrscheinlich, daß das 14 kDa-Lectin glykosyliert ist.
• Die gereinigten 14 kDa- und 17 kDa-HL-60-Proteine wurden nach der SDS-PAGE einer Aminosäuresequenzanalyse unterzogen. Die Blockade des Aminoterminus und des 14 kDa-Lectins machte die Behandlung des Lectins mit Bromcyan erforderlich, um das Lectin an einem imeren Methionin zu spalten. Die Aminosäuresequenz dieses Fragments war mit der Sequenz eines aus 14 Resten bestehenden C-terminalen Fragments von 14 kDa-Plazenta-Lectin identisch, das durch Abspalten eines Methionins an Position 121 entstand. Während das 17 kDa-HL-60-Protein auch am N-Terminus blockiert war, ergab das Bromcyan-Fragment eine einzigartige Aminosäuresequenz, die mit dem 14 kDa-HL-60-Protein in keinem Zusammenhang stand. Dieses Fragment zeigt weiters keine signifikante Homologie mit irgendwelchen anderen Proteinen der Swiss Protein Data Bank auf.
• Somit wird das 17 kDa-Protein durch N-Glycanase nicht beeinflußt, es ist nicht für die Hämagglutinationsaktivität verantwortlich, es reagiert nicht mit polyklonalen Antikörpern, die für das 14 kDa-Plazenta-Lectin spezifisch sind (siehe Fig.6, weiter unten), und seine Aminosäuresequenz unterscheidet sich deutlich von jener der 14 kDa- Sequenz.
Beispiel 4 Isolieren von Lectin aus menschlichem Plazentagewebe
• Frische oder gefrorene menschliche Plazenta wurde in 3 Volumina (ml/g) Homogenisierungspuffer homogenisiert und das Homogenat 15 Minuten lang bei 10.000 x g zentrifugiert. Das resultierende Pellet wurde dann in 2 Volumina Homogenisierungspuffer (bezogen auf das ursprüngliche Gewebegewicht) und 0,1 M β- Lactose suspendiert, 1 Stunde lang bei 4ºC gerührt und 1 Stunde lang bei 10.000 x g zentrifugiert. Festes Ammoniumsulfat wurde dann dem resultierenden Überstand bis zu 50%-iger Sättigung zugegeben und die Lösung bei 4ºC 3 Stunden lang inkubiert. Die Lösuiig wurde 15 Minuten lang bei 30.000 x g zentrifugiert, das Pellet verworfen und festes Ammoniumsulfat dem Überstand bis zur Sättigung zugegeben. Die resultierende Lösung wurde dann 16 Stunden lang bei 4ºC inkubiert, 1 Stunde lang bei 30.000 x g zentrifugiert und das resultierende Pellet in 1/10 Volumen (bezogen auf das ursprüngliche Gewebegewicht) 10 mM Tris-1 mM EDTA, pH 7,5, aufgelöst und gegen Homogenisierungspuffer dialysiert. Das resultierende Lectin wurde durch Affinität auf Lactose-Sepharose- oder Asialofetuin-Säulen gereinigt.
Beispiel 5 Expression von HL-60-Lectin-cDNA in E.coli-Zellen
• Ein Expressionsvektor zur Verwendung in E.coli wurde aus Vektor pKK223-3 (Pharmacia) konstruiert, der den durch Isopropylthiogalactosid (IPTG) induzierbaren trp- lac- (tac) Promotor enthielt. Lectin-cDNA wurde am 5'-Ende der Kodiersequenz unter Verwendung des Muta-Gene M13 Kits von Bio-Rad durch Otigonukleotid-gerichtete Mutagenese mutagenisiert, um eine Clai-Restriktionsstelle in der Nähe des Lectin-ATG- Codons einzuführen. Das verwendete synthetische Oligonukleotid besaß die Sequenz:
• Das 421 bp-ClaI/NcoI-Fragment der mutagenisierten Lectin-cDNA von Klon 11 (Fig.1B) wurde abgestumpft und unter Verwendung von T4 DNA-Ligase an eine abgestumpfte EcoRI-Stelle im Vektor ligiert. E.coli JM101 wurden durch Standard-Verfahren transformiert und die resultierenden Klone durch Hybridisieren mit einer Lectin-cDNA- Sonde getestet. Die Klonstruktur wurde durch Restriktionsstellenanalyse bestätigt. Klone, die durch Hybridisierung ein positives Testergebnis aufwiesen, wurden ausgewählt und in Großkultur gezüchtet.
• Zur Expression der Lectin-cDNA wurden 500 ml LB-Medium mit 2,5 ml einer Über- Nacht-Kultur von E.coli-JM101-Transformanten beimpft. Nach 90 Minuten wurden die Zellen durch Zugabe von mM IPTG induziert und 6,0 Stunden lang bei 37ºC gezüchtet. Die Zellen wurden dann geerntet und in 25 ml 20 mM Tris-HCl, pH 7,4, 2 mM EDTA, 150 mM NaCl, 4 mM 2-Mercaptoethanol und 1 mM PMSF gewaschen.
• Die Zellen wurden zweimal durch jeweils fünfminütige Ultraschallbehandlung lysiert und das Zellysat durch 10 Minuten langes Zentrifugieren bei 25.000 x g geklärt.
• Der lectinhältige Überstand wurde durch Affinitätschromatografie mittels einer Säule, die β-Lactose, gekuppelt an Vinylsulfon-aktivierte Sepharose, umfaßte, gereinigt und mit 0,1 M β-Lactose in Homogenisierungspuffer eluiert. Alle erhaltenen Fraktionen wurden durch SDS-PAGE, Immunoblotten und Hämagglutinationsaktivität mittels Standardverfahren analysiert. Die N-terminale Aminosäure-Sequenzanalyse zeigte ein N-terminales Alanin, ein Hinweis darauf, daß die Bakterien das Protein verarbeiten, indem sie das Anfangs-Methionin abspalten. Man beachte weiters, daß das N-terminale Alanin z.B. durch Acetylierung modifiziert werden kann.
• Die Western Blot-Analyse des gereinigten E.coli-Lectins zeigte, daß das Lectin die gleiche elektrophoretische Mobilität und Immunreaktivität wie Plazenta- und HL-60- Lectin aufwies. Fig.6 zeigt die SDS-PAGE- und Western Blot-Analyse einiger 14 kDa- Lectine. In Feld A wurden die Lectine einer Elektrophorese unterzogen und mit Coomassie-Blue R-250 eingefärbt; in Feld B wurden die Lectine auf eine PVDF- Membran übertragen und dann durch Behandlung mit anti-Plazenta-Lectin-Antikörpern und HRP-konjugiertem Ziegen-anti-Kaninchen-IgG sichtbar gemacht.
• Die Bahnen für beide Felder sind: Bahn Al: 50 µg JM101 E.coli-Lysat; Bahn A2: 50 µg Lysat aus E.coli mit einem HL-60-Lectin-Expressionsplasmid; Bahn A3: 5 µg Plazenta- Lectin; A4: 5 µg HL-60-Lectin; Bahn A5: 5 µg Lectin aus E.coli; Bahn B1: 10 µg JM101- Lysat; Bahn B2: 10 µg Lysat aus E.coli mit einem HL-60-Lectin-Expressionsplasmid; Bahn B3: 0,2 µg Plazenta-Lectin; Bahn B4: 0,2 µg HL-60-Lectin; Bahn BS: 0,2 µg Lectin aus E.coli. Zusätzlich zeigte das aus E.coli stammende und einem Hämagglutin-Assay unterzogene Lectin eine ähnliche Aktivität wie HL-60- und Plazenta-Lectine.
• Die Untersuchung des Lectins aus E.coli sowie der HL-60- und Plazenta-Lectine zeigte, daß das durch E.coli exprimierte Lectin etwa die gleiche spezifische Aktivität aufwies wie Plazenta- und HL-60-Lectine (Fig.12, weiter unten). Dies zeigt, daß das rekombinante Lectin biologisch aktiv ist und den Lectinen ähnelt, die aus natürlichen Quellen wie z.B. HL-60-Zellen und Plazenta isoliert wurden.
Beispiel 6 Expression des HL-60-Lectin-Gens in CHO-Zellen zur Bildung von intrazellulärem oder sekretiertem Protein
• CHO-Zellen wurden mit Vektoren, die Lectin-cDNA (cDNA-Vektor) enthielten, oder mit Lectin-cDNA und einem operabel verbundenen Sekretionssignal (Sekretionsvektor) transfiziert. Fig.7 zeigt die SDS-PAGE-Analyse immungefällter, metabolisch markierter Lectine, die durch CHO-Zellen hergestellt wurden, die gemäß nachstehend erklärtem Verfahren transfiziert und behandelt worden waren. Die Bahn 2 enthält Überstand von P-18- (cDNA-Vektor) transformierten Zellen plus Immunserum; Bahn 3 enthält P-18- Überstand plus normalem Kaninchenserum (NRS); Bahn 4 enthält PS-2- (Lectin- Sekretionsvektor) Überstand Immunserum und N-Glycanase; Bahn 5 enthält PS-2- Überstand und Immunserum; Bahn 6 enthält PS-2-Überstand und NRS; Bahn 7 enthält PS-2-Extrakt und Immunserum; Bahn 8 enthält PS-2-Extrakt und NRS; Bahn 9 enthält PS- 2-Extrakt, Immunserum und N-Glycanase; Bahn 10 enthält P-18-Extrakt und NRS; und Bahn 11 enthält P-18-Extrakt und Immunserum.
• Verschiedene Spezies des Lectins, 18-20 kDa-Formen und die 14 kDa-Spezies wurden immungefällt. Wie aus Bahn 5 ersichtlich, wird die große Form des Lectins nur durch Zellen sekretiert, die mit operabel mit einem Sekretionssignal verbundener cDNA transfiziert sind, findet sich jedoch nicht in Zellysaten (Bahn 7). Die großen Formen des Lectins werden zur 14 kDa-Spezies umgewandelt, wenn sie mit N-Glycanase behandelt werden (Bahn 4).
• Die SDS-PAGE-Analyse von immungefälltem, metabolisch markiertem Lectin aus Lysaten verschiedener anderer Zellinien ist in Fig.8 dargestellt. Die Bahnen 3 und 4 enthalten Lectin aus menschlichem Vorhaut-Fibroblastenlysat, das mit NRS bzw. Immunserum behandelt ist; Bahnen 5 und 6 enthalten Lectin aus dem Lysat transfizierter CHO-Zellen, das mit NRS bzw. Immunserum behandelt ist; die Bahnen 7 und 8 enthalten Lectin aus Lysat von HL-60-Zellen, das mit NRS bzw. Immunserum behandelt ist; die Bahnen 9 und 10 enthalten Lectin aus Lysat von U937-Zellen, das mit NRS bzw. Immunserum behandelt ist; die Bahnen 11 und 12 enthalten Lectin aus KGla-Zellysat, das mit NRS bzw. Immunserum behandelt ist; und Bahnen 13 und 14 enthalten Lectin aus Lysat von PBL-Zellen, das mit NRS bzw. Immunserum behandelt ist. Nur eine 14 kDa-Form von Lectin ist im Zellysat vorhanden, was mit den in Fig.7 dargestellten Ergebnissen übereinstimmt. Bei der Immunfällung von Überständen kann kein sekretiertes Lectin nachgewiesen werden.
• In Fig.9 sieht man die SDS-PAGE-Analyse von immungefälltem, metabolisch markiertem Lectin, das durch CHO-Zellen sekretiert wird, die mit operabel mit einem Sekretionssignal verbundener Lectin-cDNA transfiziert sind. Die Bahnen 1 und 2 enthalten PS-2- (Lectin-Sekretionsvektor) Überstand und NRS bzw. Immunserum; die Bahnen 3 und 4 enthalten PS-2-Überstand, 200 ng/ml Lectin und entweder Immunserum oder NRS. Die Bahnen 2 und 3 zeigen die Sekretion einer 14 kDa- und einer 18 kDa-Spezies.
• Lectine, die durch CHO-Zellen sekretiert werden, die mit operabel mit einem Sekretionssignal verbundener Lectin-cDNA transfiziert sind, wurden mit N-Glycanase behandelt und einer SDS-PAGE unterzogen; die Ergebnisse sind in Fig.10 dargestellt. Die Bahnen 1, 2, 5 und 6 enthalten PS-2- (Lectin-Sekretionsvektor) Überstand und Immunserum und die Bahnen 3 und 4 enthalten mit N-Glycanase behandelten PS-2- Überstand. Die Abwesenheit der 18-20 kDa-Lectine in Bahnen 3 und 4 zeigt, daß die 18-20-kDa-Lectine die glykosylierte Form des 14 kDa-Lectins sind.
• Lectine, die durch CHO-Zellen sekretiert werden, die mit operabel mit einem Sekretionssignal verbundener Lectin-cDNA transfiziert sind, wurden auf einer Lactose- Sepharose-Säule gereinigt und die Elutionsfraktionen einer SDS-PAGE unterzogen. Wie aus Fig.11 ersichtlich, binden sich sowohl die große als auch die kleine Form von Lectin an Lactose und sind im Agglutinationsassay aktiv, wie dies im folgenden Beispiel belegt wird.
Beispiel 7 Assay auf β-Galactosid-Bindungsaktivität von Lectinen
• Die biologische Aktivität von 14 kDa-Lectin aus HL-60-Zellen, Plazentagewebe und aus E.coli-Zellen, die mit mit einem Sekretionssignal verbundender Lectin-cDNA transfiziert sind, wurde durch Agglutination trypsinisierter Kaninchen-Erythrozyten bestimmt. Wie aus Fig.12 ersichtlich, zeigt die oberste Reihe einen Concanavalin Avergleich mit einem Agglutinations-Endpunkt bei 1,5 µg/ml. Die unteren sechs Reihen zeigen die drei gereinigten 14 kDa-Lectine, die mit verschiedenen Konzentrationen an ergänzenden Zuckern, β-Galactose und Thiodigalactosid, die erwiesenermaßen wirksame Inhibitoren des 14 kDa-Plazenta-Lectins sind, inkubiert sind. Thiodigalactosid hemmte die Agglutination der Erythrozyten bei Konzentrationen von mehr als 0,31 mM, und β- Lactose hemmte die Agglutination bei Konzentrationen von mehr als 1,25 mM.
Beispiel 8 Auswirkung von HL-60-Lectin auf die primäre humorale Immunreaktion gegen Proteine und Polysaccharide in zwei unterschiedlichen Mäusestämmen A. Immunisierung von Mäusen mit Acetylcholin-Rezeptor von Torpedo Marmorata Tetanus-Toxoid und kapselförmigen Polysacchariden
• Der Acetylcholin-Rezeptor aus dem elektrischen Organ des Rochens Torpedo marmorata wurde durch Affinitätschromatografie auf Naja naja siamensis-Neurotoxin gereinigt. Tetanustoxoid stammte vom Schwedischen Nationalen Bakteriologischen Laboratorium und bestand aus formalinbehandeltem Tetanus-Toxin (normalerweise zu Impfzwecken verwendet). Ein Gemisch von Kapselpolysaccharid-Extrakten aus 23 unterschiedlichen Serotypen von Streptococcus pneumoniae stammte von Merck Sharpe Dome, Inc. (Pneumovax).
• Junge, erwachsene, weibliche BALB/c- und C56BL/6-Mäuse (2-4 Monate alt) wurden verwendet. Den Mäusen wurde subkutan 10 µg gereinigter Acetylcholin-Rezeptor, Tetanus-Toxoid oder pneumokokkalem Polysaccharid in vollständigem Freund-Adjuvans mit und ohne HL-60-Lectin injiziert. Die Menge an injiziertem Lectin in diesen Vorexperimenten betrug zwischen 0,1 und 25 µg pro Maus.
• Blut wude nach 3 Tagen sowie nach 1, 2, 3 und 4 Wochen abgenommen. Um die Entwicklung experimenteller autoimmuner Myasthenia gravis in mit Acetylchol in- Rezeptor injizierten Mäusen zu verfolgen, wurden die Mäuse täglich auf Anzeichen neuromuskulärer Dysfunktion beobachtet und nach 10 Tagen Zwangsübungen mit wiederholtem Fassen, Schwimmen und umgedrehtem Hängen unterzogen. Nach 5 Minuten langem Erwärmen unter einer Erwärmungslampe bei 35ºC wurden diese Übungen wiederholt. Die Ergebnisse dieser Beobachtungen werden in Tabelle 1 veranschaulicht und zeigen, daß in beiden bei höheren Dosierungen untersuchten Mäusestämmen rekombinantes HL-60-Lectin einen deutlich positiven Einfluß auf die Verlangsamung neuromuskulärer Dysfunktion ausübte. Tabelle 1 Klinische Anzeichen neuromuskulärer Dysfunktion in mit Acetylcholin-Rezeptor mit und ohne Lectin injizierten Mäusen
Mäusestamm Balbk C57B/6
• Nach der Beobachtungsphase wurden die Tiere euthanisiert, gehäutet, ihre Eingeweide entnommen und cholinergischer Rezeptorextrakt wurde aus den ganzen Kadavern hergestellt.
B. Bestimmung der Menge an freiem Rezeptor in mit Acetylcholin-Rezeptor immunisierten Mäusen
• Bekannte Mengen von Rezeptorextrakten (wie in Kapitel A dieses Beispiels hergestellt) wurden mit einem zehnfachen Überschuß von ¹²&sup5;I-α-Bungarotoxin 1 Stunde lang bei 37ºC inkubiert, um den Rezeptor zur Quantifizierung zu markieren. Das Gemisch wurde einer Gelfiltration auf Sephacryl-G200 unterzogen, um freies und gebundenes Toxin zu trennen. Die Menge des in den Mäusekadavern vorhandenen Rezeptors ist in Tabelle 2 gemeinsam mit der Menge an ebenfalls verabreichtem rekombinantem HL-60- Lectin vermerkt. Diese Daten zeigen, daß bei Dosen von etwa 15-25 µg rekombinantes HL-60-Lectin den in vivo-Effekten des injizierten Acetylcholin-Rezeptors entgegenwirkte. Tabelle 2 Muskel-Acetylcholinrezeptor-Mengen in mit Acetylcholin-Rezeptor mit und ohne Lectin immunisierten Mäusen (Bestimmungen erfolgten 10 Tage nach Injektion)
C. Bestimmungen von rezeptorgebundenen IgG- und IgM-Antikörpern gegen Torpedo- und Mäuse-Rezeptor
• Diese Bestimmungen erfolgten durch Inkubieren von Rezeptorextrakt mit einem zehnfachen Überschuß an markiertem Bungarotoxin über Nacht bei 4ºC, gefolgt vom Trennen der Niederschläge, Waschen und Zählen der Radioaktivität. Die Ergebnisse in Tabelle 2 zeigen, daß in mit Lectin behandelten Mäusen Dosen von etwa 15-25 µg die Menge an mit Immunoglobul in (Ig) komplexiertem Muskel-Acetylcholin-Rezeptor wirkungsvoll verringern konnten.
D. B-Zellen-Repertoire von Mäusen die mit dem Acetylcholinrezeptor, Tetanustoxoid und pneumokokkalem Polysaccharid immunisiert wurden 1. Herstellung primärer Klone monoklonaler Antikörper aus immunisierten BALB/c- Mäusen
• Drei weibliche BALB/c-Mäuse (7-8 Wochen alt) wurden intraperitoneal 5 µg Rezeptor- Antikörper, Tetanus-Toxoid bzw. pneumokokkalem Polysaccharid in vollständigem Freund-Adjuvans injiziert und 2 Wochen später die gleiche Menge an Antigen in 0,15 M Natriumphosphatpuffer, pH 7,4, intravenös injiziert. Drei Mäuse des gleichen Stamms wurden mit diesen Antigenen in Kombination mit 15 µg HL-60-Lectin immunisiert. Die Tiere wurden 4 Tage nach der Auffrischungsinjektion euthanisiert und Milzzellen (10&sup8; Zellen) mit der nichtsekretierenden B-Lymphozytom-Zellinie SP2- OAg14 (2 x 10&sup7; Zellen) fusioniert; das Zellgemisch wurde in 6 x 96 Costar- Schalennäpfen (2 x 10&sup5; Zellen/Napf) mit einer Nährstoffschicht aus peritonealen Mäuse- Makrophagen (5 x 10&sup5; Zellen/Napf) verteilt. Ab dem dritten Tag in Kultur wurde HAT- (Hypoxanthin-Aminopterin-Thymidin) Medium zugegeben.
• Nach 10-14 Tagen wurden die Überstände hinsichtlich der Bindung an die jeweils zur Immunisierung verwendeten Antigene geprüft. Ein ELISA wurde wie oben verwendet. Die Ergebnisse aus Tabelle 3 zeigen, daß bei Verabreichung von Lectin mit Antigenen eine Verringerung des B-Zellen-Repertoires, das spezifische Antikörper gegen die verabreichten Proteinantigene nach primärer Immunisierung herstellt, zu beobachten ist. Tabelle 3 Anzahl der Klone, die Antikörper gegen Torpedorezeptor-, Tetanustoxoid- und pneumokokkale Polysaccharid-Hybridome (180 primäre Klone für jedes Antigen) herstellen, aus BALB/c-Mäusen, die mit den Antigenen mit und ohne 15 µg HL-60- Lectin injiziert werden
Beispiel 9 Auswirkung von HL-60-Lectin auf die primäre Immunreaktion A. Bestimmung von Antikörpern gegen Torpedo-Acetylcholin-Rezeptor
• Mikrotiter-Näpfe wurden über Nacht mit 100 µl einer Lösung enthaltend 5 µg/ml gereinigten Rezeptor (hergestellt wie in Beispiel 8, Kapitel A) beschichtet und mit Serum (1/25 verdünnt) 3 Stunden lang bei 37ºC inkubiert. Nach dem Waschen wurden die Platten 3 Stunden lang bei 37ºC mit an alkalische Phosphatase konjugierten Ziegenanti-Maus-Immunglobulinen inkubiert. Die Platten wurden anschließend gründlich gewaschen und 1 Stunde lang bei 37ºC mit p-Phenylphosphatethanolamin-Puffer inkubiert. Die Reaktion wurde durch die Zugabe von 25 µl 3 M NaOH abgebrochen und die Bindung des markierten Antikörpers in einem ELISA-Mikrolesegerät bei 405 nm gemessen. Ein normaler Mäuseseren-Pool aus mehr als 50 Mäusen diente als negativer Vergleich. Die Cutoff-Grenze war der Mittelwert +4 x die Standardabweichung der kumulierten Werte, die mit diesem normalen Serumpool erzielt wurden. Die Ergebnisse wurden mit jenen des Radioimmunassays verglichen und in Mol Toxin-Rezeptor gefällt durch 1 Liter Serum, nach Subtraktion des Mittelwerts +4 x die Standardabweichung der kumulierten Ergebnisse aus einer normalen Population (mehr als 50 Mäuse), ausgedrückt.
B. Antikörper gegen Mäuse-Acetylcholin-Rezeptor
• Die Antikörper wurden unter Verwendung eines Komplexes zwischen einem teilweise gereinigten normalen Mäuse-Skelettmuskel-Rezeptor und ²&sup5;I-α-Bungarotoxin als Antigen bestimmt. Die Ergebnisse wurden in Mol Toxin-Rezeptor gefällt durch 1 Liter Serum, nach Subtraktion des Mittelwerts +4 x die Standardabweichung der kumulierten Ergebnisse aus einer normalen Population (mehr als 50 Mäuse), ausgedrückt.
C. Anti körper gegen Tetanus-Toxoid und Kapselpolysaccharide
• Die Antikörper wurden in einem enzymgebundenen Immunsorptions-Assay (ELISA) bestimmt. Mikrotiter-näpfe wurden über Nacht mit 100 µl einer Lösung, die 5 µg/ml Antigen enthielt, beschichtet und mit Serum (1/200 verdünnt) 3 Stunden lang bei 37ºC inkubiert. Nach dem Waschen wurden die Platten 3 Stunden lang bei 37ºC mit an alkalische Phosphatase-konjugierten Ziegen-anti-Maus-Immunglobulinen inkubiert. Die Platten wurden anschließend gründlich gewaschen und 1 Stunde bei 37ºC mit p- Phenylphosphatethanolamin-Puffer inkubiert. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 25 µl 3 M NaOH abgebrochen und die Bindung des markierten Antikörpers in einem ELISA-Mikrolesegerät bei 405 nm gemessen. Ein normaler Mäuseserum-Pool aus mehr als 50 Mäusen diente als negativer Vergleich. Die Cutoff-grenze war der Mittelwert +4 x die Standardabweichung der kumulierten Werte, die mit dieseni normalen Serumpool erzielt wurden. Die Werte wurden in Milli-Absorptions-Einheiten nach Subtraktion des Mittelwerts +4 x die Standardabweichung vom normalen Serumpool ausgedrückt.
• Gruppen von BALB/c-Mäusen wurden mit Tetanus-Toxoid, pneumokokkalem Polysaccharid, Rochen-Torpedo-Rezeptor und Mäuse-Rezeptor ohne zugegebenes HL- 60-Lectin und mit Antigen plus verschiedenen Mengen an HL-60-Lectin immunisiert. Blut wurde nach 3 Tagen und dann wieder nach 1, 2, 3 und 4 Wochen entnommen und die Antikörper-Werte ermittelt. Diese Ergebnisse sind aus Figuren 13A, 13B, 13C und 13D ersichtlich. Wie man in Figuren 13A, 13C und 13D erkennen kann, war die primäre Immunreaktion auf T-abhängige Antigene deutlich erniedrigt, wenn hohe Lectin-Konzentrationen verabreicht wurden. Für pneumokokkales Polysaccharid (Fig.138), ein Tunabhängiges Antigen, wurden keine ähnlichen Ergebnisse beobachtet.
Beispiel 10 Wirkung von HL-60-Lectin auf experimentelle Autoimmun-Enzephalomyelitis, ein Tiermodel 1 für multiple Sklerose
• Die Ergebnisse hinsichtlich intravenöser Injektionen von rekombinantem HL-60-Lectin bei Ratten sind in den Tabellen 4 und 5 veranschaulicht. Die intravenöse Verabreichung von Lectin (bei Beginn am Tag 0 und zusätzlicher Lectin-Behandlung an den Tagen 4 und 6) führte zu einer geringen Verzögerung beim Einsetzen der Krankheit, die Krankheit war weniger schwer, ihre Dauer kürzer und der Gewichtsverlust geringer.
• Tabelle 5 zeigt, daß bei Verabreichung des Lectins bereits 3 Tage vor der Immunisierung und in nachfolgenden täglichen Injektionen bis zum Tag 7 die Krankheitsentwicklung vollständig verhindert wurde. Tabelle 4 IV Injektion von Lectin und Puffer Tabelle 5 IV Injektion von Lectin und Puffer
Beispiel 11 In vivo-Wirkung von mit Lectin behandelten Ratten auf die Phenotypen ausgewählter Lymphozyten
• Die Tabelle 6A zeigt eine 28%-ige Zunahme der Zahl der Ratten-Lymphknoten- Suppressor-T-Zellen (reaktiv mit monoklonalem Antikörper 0X8, Serotec-Bioproducts, Indianapolis, IN) bei mit Lectin behandelten Tieren.
• Die Tabelle 68 zeigt eine 32%-ige Zunahme der Zahl der Milz-Suppressor-T-Zellen sowie eine 19%-ige bzw. 24%-ige Abnahme der Zahl der Helfert-Zellen (reaktiv mit w3/25-Antikörpern, Serotec-Bioproducts) bzw. der gesamten 1-Zellen (reaktiv mit w3/1 3-Antikörpern, Serotec-Bioproducts). Tabellen 6A und 6B In vivo-Wirkung von mit Lectin behandelten Ratten auf die Phenotypen ausgewählten Lymphozyten
Beispiel 12
• Die Ergebnisse in Tabelle 7 zeigen, daß rekombinantes menschliches Lectin spezifisch mit menschlichen Makrophagen reagiert. Wenn menschliche Blutkörperchen mit HL-60- Lectin vorbehandelt und dann mit spezifischem (Fluoreszenz-markiertem) Antikörper eingefärbt wurden, konnte man keine signifikanten Änderungen für CD3+-, CD4+-, NK(L-A)- oder HLA-DR-Zellmarker (Becton-Dickinson) beobachten. Die Auswirkung der Lectin-Behandlung auf M1- und M3-Makrophagen war jedoch deutlich. Der Prozentsatz positiver Zeilen sank um 33% bzw. 26%, was auf eine Wechselwirkung zwischen Lectin und Epitopen, die von M1- und M3-Antikörpern erkannt werden, schließen läßt. Tabelle 7 Histogramm-Analyse

Claims (19)

1. Menschliches Lectin, das von HL-60-Zeilen (ATCC CCL 240) oder von menschlicher Plazenta erhältlich ist und in unglykosyliertem Zustand ein Molekulargewicht von 14 kDa sowie zumindest eine Tripeptidsequenz Asn-X-Thr oder Asn-X-Ser aufweist, die eine Glykosylierungsstelle und die Fähigkeit liefert, (i) Gruppen zu binden, die β-D- Galaktosid enthalten, und (ii) trypsinisierte Kaninchen-Erythrozyten zu agglutinieren, welche Agglutinationsfähigkeit durch Gruppen gehemmt werden kann, die β-D- Galaktosid enthalten.

2. Lösliches, menschliches HL-60-Lectin, das im unglykosylierten Zustand ein Molekulargewicht von 14 kDa aufweist und ein Polypeptid umfaßt, das zumindest eine Tripeptidsequenz Asn-X-Thr oder Asn-X-Ser aufweist, die eine Glykosylierungsstelle und eine Aminosäuresequenz bereitstellt, die im wesentlichen aus den Aminosäuren 2-135 in Fig. 1A besteht.

3. Menschliches HL-60-Lectin in gereinigter und isolierter Form, das im unglykosylierten Zustand ein Molekulargewicht von 14 kDa aufweist und ein Polypeptid umfaßt, das zumindest eine Tripeptidsequenz Asn-X-Thr oder Asn-X-Ser aufweist, die eine Glykosylierungsstelle und eine Aminosäuresequenz bereitstellt, die im wesentlichen aus den Aminosäuren 2-135 in Fig. 1A besteht, und worin das Lectin, wenn es C4-HPLC unterzogen wird, hinsichtlich des Kriteriums der Erzeugung eines einzelnen Peaks homogen ist.

4. Lectin nach einem der Ansprüche 2 bis 3, worin die Glykosylierungsstelle im Bereich der Aminosäuren 92-101 (Grenzwerte eingeschlossen) liegt.

5. Lectin nach einem der Ansprüche 1 bis 4, welches an der Glykosylierungsstelle an ein Saccharid konjugiert ist.

6. Konjugiertes Lectin nach Anspruch 5, das ein Molekulargewicht zwischen 17 und 20 kDa aufweist.

7. Lectin nach Anspruch 1, welches eine in Fig. 1A als Sequenz 2-135 gezeigte Aminosäuresequenz in gereinigter Form umfaßt.

8. Lectin nach einem der Ansprüche 1 bis 7, das eine Aminosäuresequenz aufweist, bei der die N-terminale Aminosäure Methionin, Alanin oder acetyliertes Alanin ist.

9. Rekombinante DNA-Sequenz in isolierter und gereinigter Form, die für ein Lectin nach einem der Ansprüche 1 bis 8 kodiert.

10. Expressionssystem, umfassend die DNA-Sequenz nach Anspruch 9 operabel verbunden mit Steuersequenzen, die in der Lage sind, deren Expression in geeigneten Wirtszellen herbeizuführen.

11. Expressionssystem nach Anspruch 10, worin die Wirtszellen E.coli-Zellen sind.

12. Expressionssystem nach Anspruch 10, worin die Wirtszellen CHO-Zeilen sind.

13. Mit der DNA-Sequenz nach Anspruch 9 transfizierte Zelle oder Zellkultur.

14. Mit dem Expressionssystem nach einem der Ansprüche 10 bis 12 transfizierte Zelle oder Zellkultur.

15. Verfahren zur Produktion von rekombinantem Lectin, welches das Kultivieren der Zeilen nach Anspruch 14 in einem Medium unter für die Produktion des Lectins geeigneten Bedingungen sowie die Gewinnung des Lectins aus dem Medium umfaßt.

16. Pharmazeutische Zusammensetzung, die ein Lectin nach einem der Ansprüche 1 bis 8 im Gemisch mit einem pharmazeutisch annehmbaren Exzipienten umfaßt.

17. Verwendung eines Lectins nach einem der Ansprüche 1 bis 8 zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Autoimmunerkrankungen.

18. Verwendung eines Lectins nach einem der Ansprüche 1 bis 8 zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Myasthenia gravis.

19. Verwendung eines Lectins nach einem der Ansprüche 1 bis 8 zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von multipler Sklerose.