DE69024693T2

DE69024693T2 - Gene, die ein Protein mit menschlicher MACIF-Aktivität kodieren, Expressionsvektoren mit diesen Genen, Transformantenzellen und Proteine mit menschlicher MACIF-Aktivität

Info

Publication number: DE69024693T2
Application number: DE69024693T
Authority: DE
Inventors: Kiyoshi Furuichi; Katsuhisa Ito; Yuji Sugita; Makoto Takayama; Toshiyuki Takemoto; Motowo Tomita; Noboru Yamaji; Shinya Yano; Ko Yusakawa
Original assignee: Yamanouchi Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Astellas Pharma Inc
Priority date: 1989-04-21
Filing date: 1990-04-19
Publication date: 1996-07-11
Anticipated expiration: 2010-04-20
Also published as: KR900016465A; IE74168B1; ATE202570T1; EP0394035A3; GR3019347T3; IE901426L; AU5372690A; AU640643B2; DE69033756T2; DK0394035T3; IE960874L; US5532339A; EP0394035B1; JP2828148B2; ES2084658T3; EP0672683A1; KR0150000B1; EP0394035A2; JPH03201985A; CA2014948A1

Description

Diese Erfindung betrifft Gene, die für ein Protein mit humaner MACIF (membrane attack complex inhibition factor (Membranangriffskomplex-Inhibitionsfaktor))-Aktivität kodieren, Expressionsvektoren mit den jeweils darin insertierten Genen, mit den Expressionsvektoren transformierte Zellen und Proteine mit humaner MACIF-Aktivität. Der Begriff "Protein mit humaner MACIF-Aktivität" umfaßt im Rahmen seiner Bedeutung eine Gruppe von Proteinen, die das Komplementsystem im Endstadium einer Komplementaktivierung regulieren und eine Schädigung humaner Zellen und Gewebe als Ergebnis einer Bildung eines Membranangriffkomplexes (membrane attack complex) inhibieren.
Den Erfindern war es bereits gelungen, einen natürlich vorkommenden humanen MACIF, ein bis dahin unbekanntes, das Komplementsystem regulierendes Protein, in reiner Form aus der normalen menschlichen Erythrozytenmembran zu isolieren (Japanische Patentanmeldung Nr. 63-310642). Sie haben gefunden, daß der humane MACIF die Aktivierung der späten Komplementkomponenten inhibiert oder in anderen Worten eine Hämolyse aufgrund humaner MAC-Bildung inhibiert und daß sich der humane MACIF diesbezüglich von den bekannten komplementregulierenden Substanzen, die die Aktivierung der frühen Komplementkomponenten inhibieren, unterscheidet und er diesen überlegen ist und daß der natürlich vorkommende humane MACIF die folgende N-terminale Aminosäuresequenz aufweist:
Darüberhinaus haben sie gefunden, daß dieser natürlich vorkommende humane MACIF ein Glykoprotein mit einem Molekulargewicht von 18000 ± 1000 (bestimmt durch SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese) mit einem Phosphatidylinositol-Anker (nachfolgend abgekürzt als "PI-Anker") am C-Terminus ist.
Um ein Protein mit humaner MACIF-Aktivität weiter untersuchen und Entwicklungen bezüglich der praktischen Verwendung eines solchen Proteins als Arzneimittel vornehmen zu können, ist es essentiell, ein solches Protein in reiner und homogener Form und in ausreichend großen Mengen zu erhalten. Zu diesem Zweck erscheint die Anwendung rekombinanter DNA-Technologie das wirksamste Mittel
Die Erfindung kann ein Gen bereitstellen, das für ein Protein mit humaner MACIF-Aktivität kodiert.
Die Erfindung kann auch einen replizierbaren Expressionsvektor bereitstellen, der das für ein Protein mit humaner MACIF-Aktivität kodierende Gen exprimieren kann.
Die Erfindung kann ferner einen Mikroorganismus oder Zellen bereitstellen, der bzw. die mit dem Expressionsvektor transformiert ist bzw. sind.
Die Erfindung kann darüberhinaus ein durch Gentechnologie erzeugtes Protein mit humaner MACIF-Aktivität bereitstellen.
Die Erfindung stellt Gene bereit, die jeweils für Polypeptide mit humaner MACIF-Aktivität kodieren, in welchen eine Aminosäuresequenz durch die folgende allgemeine Formel (I) dargestellt wird:
In der vorstehenden Formel sind X und Y, wie folgt, definiert:
X ist H,
Met oder die Aminosäuresequenz:
Y ist OH oder
oder
Die Erfindung stellt ferner Expressionsvektoren bereit, die jeweils die obengenannten Gene enthalten, Mikroorganismen oder Zellen, die mit den Vektoren transformiert worden sind, und durch Gentechnologie erzeugte Proteine, die in den Mikroorganismen oder Zellen exprimiert werden und humane MACIF-Aktivität aufweisen.
Fig. 1 zeigt das aus menschlichen Leukozyten isolierte Gen, das für eine Aminosäureseguenz kodiert, die den natürlich vorkommenden humanen MACIF umfaßt.
Fig. 2 zeigt eine Aminosäuresequenz, die von der Nukleotidsequenz des in Fig. 1 gezeigten Gens abgeleitet ist.
Fig. 3 zeigt die Gesamtstruktur eines Expressionsvektors, pKK223-3 zur Verwendung in Escherichia coli.
Fig. 4 zeigt die Gesamtstruktur eines Expressionsvektors, PVY1 zur Verwendung in CHO-Zellen.
Fig. 4a zeigt einen Konstruktionsplan für den Expressionsvektor pVY1.
Fig. 5 zeigt die Gesamtstruktur eines Vektors, PTEJ001 für eine Expression in Escherichia coli.
Fig. 6 zeigt die Ergebnisse einer Reinigung eines in Escherichia coli exprimierten, humanen MACIF-Proteins (E86) unter Verwendung von Q-Sepharose.
Fig. 7 zeigt die Ergebnisse einer SDS-PAGE-Analyse von aus einer Reinigung des in Escherichia coli exprimierten, humanen MACIF-Proteins E86 unter Verwendung von Q-Sepharose erhaltenen Fraktionen.
Fig. 8 zeigt die Dosisabhängigkeit der inhibitorischen Aktivität des in Escherichia coli exprimierten, humanen MACIF- Proteins E86 hinsichtlich einer Hämolyse von Meerschweinchen- Erythrozyten und das Ergebnis einer Neutralisierung derselben mit einem anti-humanen MACIF-Antikörper.
Fig. 9 zeigt die Dosisabhängigkeit der inhibitorischen Aktivität des in transformierten CHO-Zellen exprimierten, humanen MACIF-Proteins (C77) hinsichtlich einer Hämolyse von Meerschweinchen-Erythrozyten und die Ergebnisse eines Neutralisierungsversuchs derselben mit einem anti-humanen MACIF-Antikörper.
Fig. 10 zeigt die Dosisabhängigkeit der inhibitorischen Aktivität des in transformierten CHO-Zellen exprimierten, humanen MACIF-Proteins (C70) hinsichtlich einer Hämolyse von Meerschweinchen-Erythrozyten.
Als Referenz enthält das durch die in Fig. 1 gezeigte DNA- Sequenz definierte Gen eine Gensequenz, die für die Aminosäuresequenz jenes Proteins kodiert, das physiologische Aktivitäten eines natürlich vorkommenden humanen MACIF aufweist, und zusätzlich ein Gen, das für eine natürlich vorkommende humane MACIF-Vorläufer-Aminosäuresequenz (umfassend u.a. eine sekretorische Signalpeptid- und eine PI-Anker-Anheftungssignal-Aminosäuresequenz) kodiert.
Das für das sekretorische Signalpeptid kodierende Gen ist ein Gen, das für ein Peptid kodiert, das für das Protein mit humaner MACIF-Aktivität erforderlich ist, das in Wirtszellen produziert wird, um aus der Zelle freigesetzt zu werden, während das für die PI-Anker-Anheftungssignal-Aminosäuresequenz kodierende Gen ein Gen ist, das für einen hydrophoben Aminosäuresequenzabschnitt kodiert, der für die Anheftung des PI- Ankers an das Protein mit humaner MACIF-Aktivität erforderlich ist.
Bei dem natürlich vorkommenden humanen MACIF wird der PI- Anker an den 76. Aminosäure (Glutaminsäure)-Rest der als Referenz in Figur 2 gezeigten Aminosäuresequenz angeheftet. Der PI- Anker hat eine aus Phosphoethanolamin, Glykan und Phosphatidylinositol (PI) bestehende Skelettstruktur. Die Aminogruppe des Phosphoethanolamins wird an die Carboxylgruppe des C-terminalen Aminosäurerests von Peptiden angeheftet und die Fettsäureseitenketten des PI werden an die Zellmembran gebunden. Auf diese Weise dient der PI-Anker als Anker, um Peptide an die Zellmembran zu binden.
In der in Figur 2 gezeigten Aminosäuresequenz ist die Sequenz vom Methioninrest an Position -25 bis zum Serinrest an Position -1 die sekretorische Signalsequenz und die Sequenz vom Asparaginrest an Position 77 bis zum Prolinrest an Position 103 die PI-Anker-Anheftungssignalsequenz. Demnach stellt die den 1. bis 76. Aminosäurerest umfassende Aminosäuresequenz ein Kernpeptid eines natürlich vorkommenden humanen MACIF dar.
Dieser humane MACIF kann eine Zuckerkette unterschiedlicher Strukturtypen aufweisen in Abhängigkeit von den für die phänotypische Expression verwendeten Wirtszellen oder in Abhängigkeit von den Kulturbedingungen von dafür verwendeten Zellen.
Für eine praktische Verwendung als Arzneimittel mit physiologischen Aktivitäten von humanem MACIF muß ein Protein nicht sämtliche Bestandteile des obengenannten humanen MACIF aufweisen. Der PI-Anker kann fehlen oder seine Aminosäuresequenz kann teilweise von der Aminosäuresequenz von humanem MACIF abweichen, vorausgesetzt, daß es humane MACIF-Aktivität aufweist. Demnach sind die erfindungsgemäßen Proteine Proteine mit humanem MACIF ähnlichen physiologischen Aktivitäten, die sich aber von natürlich vorkommendem humanem MACIF dahingehend unterscheiden, daß ein Teil der Aminosäuresequenz dieses humanen MACIF fehlt oder durch eine andere Aminosäuresequenz ersetzt ist, daß eine Aminosäuresequenz hinzugefügt wurde oder darin insertiert ist, daß sie keinen PI-Anker haben und/oder daß sie keine Kohlenhydratkette haben oder Unterschiede in der Art des Kohlenhydrats aufweisen.
Die durch die Erfindung bereitgestellten Gene sind für humane MACIF-Proteine kodierende Gene, spezifisch ein Gen, das für die Aminosäuresequenz vom ersten Aminosäurerest (Leu) bis zum 70. Aminosäurerest (Asn) der vorstehend angegebenen Aminosäuresequenz der Formel (I) kodiert, ein Gen, das für die Aminosäuresequenz vom ersten bis zum 77. Aminosäurerest (Asn) der Sequenz der Formel (I) kodiert, und ein Gen, das für die Aminosäuresequenz vom ersten bis zum 86. Aminosäurerest (Thr) der Sequenz der Formel (I) kodiert.
Die erfindungsgemäßen Gene können durch verschiedene Verfahren hergestellt werden. Beispielsweise umfaßt ein geeignetes Verfahren, einen Klon, der für humanen MACIF kodierende cDNA enthält, aus einer cDNA-Bibliothek, die aus von humanen MACIF produzierenden Zellen erhaltener mRNA hergestellt worden ist, zu isolieren und die MACIF-cDNA aus dem so isolierten Klon zu isolieren. Ein anderes Verfahren umfaßt eine chemische Synthese von Nukleinsäuren auf herkömmliche Weise, beispielsweise durch das Phosphoamidit-Verfahren [Hunkapiller, M. et al., Nature, 310, 105-111 (1984)], auf Basis der hier offenbarten, für humanen MACIF kodierenden genetischen Information. Eine Kombination der vorstehend aufgeführten zwei Verfahren kann als weiteres Beispiel aufgeführt werden. Im Folgenden wird das vorstehend angesprochene Verfahren, das von mRNA Gebrauch macht, detaillierter beschrieben.

Herstellung einer Oligonukleotid-Sonde

Eine Oligodesoxyribonukleotid-Sonde wird hergestellt, die zu mRNA komplementär ist, die für die N-terminale Aminosäuresequenz von gereinigtem, natürlich vorkommendem, humanem, aus menschlichen Erythrozyten isoliertem MACIF kodiert, beispielsweise durch chemische Synthese durch das Phosphoamidit-Verfahren unter Verwendung einer handelsüblichen DNA-Synthesevorrichtung (z.B. Applied Biosystems Modell 380A DNA-synthesizer).

Herstellung einer cDNA-Bibliothek

(1) Herstellung von Rohmaterialzellen

Humane Zellen beliebiger Art, in denen der erfindungsgemäße humane MACIF exprimiert werden kann, können als Material für humane MACIF-mRNA bei der praktischen Ausführung der Erfindung verwendet werden. Im Hinblick auf den hohen mRNA-Gehalt sind als derartige Zellen humane Leukozytenzellen aus peripherem Blut, humane lymphozytäre Zellen und andere Gewebezellen wie auch geeignete, daraus etablierte Zellinien vorteilhaft.
Humane Leukozyten aus peripherem Blut und Lymphozyten können aus normalem, vom Menschen gewonnenen "Buffy coat" durch Dichtegradientenzentrifugation [B yum, A. Scandinavian Journal of Clinical Laboratory Investigations, 21, Supplement 97, 77-89 (1968)] unter Verwendung von beispielsweise Dextran oder Ficoll-Hypaque isoliert werden. Gewebezellen können aus einem Gewebehomogenat oder ähnlichem auf herkömmliche Weise hergestellt werden.
Als etablierte humane Zellinien können beispielsweise humane Erythroblastenleukämiezellinien (Z.B. K562), humane B- Zell-Leukämiezellinien (z.B. Raji), humane T-Zell-Leukämiezelllinien (z.B. MT-2), humane monozytäre Leukämiezellinien (z.B. U937, HL60) und andere Gewebekrebszellinien (z.B. Bowes Melanom) aufgeführt werden. Die verwendbaren Zellinien sind jedoch nicht auf diese beschränkt. Solche Zellinien sind leicht von der Salk Institute Cell Bank (Kalifornien, U.S.A.) und anderen ähnlichen Institutionen erhältlich. Die Zellen werden beispielsweise in stationärer Kultur, Suspensionskultur ("Spinner"-Kultur) oder Drehflaschenkultur ("Roller bottle"- Kultur) unter Verwendung eines geeigneten Tierzellkulturmediums, z.B. im Handel erhältliches RPMI 1640-Medium [Moore, G.E. et al., Journal of American Medical Association, 199, 519- 524 (1967)], gezüchtet.
In einigen Fällen kann eine Stimulierung von Zellen während der Kultur zu einer intrazellulären Expression von humaner MACIF-mDNA in erhöhten Mengen führen. Die Verwendung eines Immunkomplexes als Stimulans ist vorteilhaft. Als Stimulans können ferner u.a. Lektine [z.B. Concanavalin A (ConA), Phytohaemagglutinin (PHA)], verschiedene Antigene, Phorbolester [insbesondere 12-O-Tetradecanoylphorbol-13-acetat (TPA)] und physiologische Stimulationsfaktoren (z.B. Interleukine, Interferone, koloniestimulierende Faktoren) aufgeführt werden. Diese können in Kombination von zwei oder drei von diesen verwendet werden.

(2) mRNA-Extraktion:

Eine RNA-Fraktion, die für humanen MACIF kodierende mRNA enthält, kann aus Zellen jeglicher obengenannter Art auf übliche Weise extrahiert werden. Dementsprechend werden beispielsweise die Zellen teilweise oder vollständig aufgebrochen und/oder solubilisiert mittels einer Guanidinthiocyanat-Lösung oder eines geeigneten Detergens (z.B. SDS, NP-40, Triton X-100, Desoxycholsäure) oder durch physikalische Mittel, wie Homogenisierung oder Hämolyse. Chromosomale DNA wird dann in einem gewissen Ausmaß der Schwerwirkung eines Mixers (z.B. Polytron) oder einer Spritze ausgesetzt, gefolgt von einer Trennung einer Nukleinsäurefraktion von Proteinen. Insbesondere nützlich für diese Fraktionierungsprozedur sind u.a. das Verfahren einer Extraktion mit Phenol und Chloroform oder eine Cäsiumchlorid- Dichtegradienten-Ultrazentrifugation [Chirgwin, J.M. et al., Biochemistry, 18, 5294-5299 (1979); Maniatis, T. et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, (1982)].
Bei dem obengenannten Extraktionsverfahren kann ein RNase- Inhibitor, beispielsweise Heparin, Polyvinylsulfat, Diethylpyrocarbonat oder ein Vanadiumkomplex als Zusatz verwendet werden, um einen RNA-Abbau aufgund einer Rnase zu verhindern.
Eine Isolierung und Reinigung von mRNA aus durch das obengenannte Extraktionsverfahren erhaltener RNA kann beispielsweise durch Verwendung einer Adsorptionssäule aus beispielsweise Oligo-dT-Cellulose (Collaborative Research) oder Poly-U-Sepharose (Pharmacia) oder chargenweise erzielt werden.
Die so erhaltene mRNA ist eine Mischung von mDNAs, die für eine Vielzahl von Proteinen kodieren. Dementsprechend kann sie bezüglich der gewünschten mDNA, die humanem MACIF entspricht, vor einer Herstellung einer cDNA-Bibliothek gereinigt und aufkonzentriert werden. Diese Reinigung und Aufkonzentrierung kann, wie folgt, bewerkstelligt werden. Demnach wird die auf die obengenannte Weise erhaltene mDNA beispielsweise durch Sucrose-Dichtegradientenzentrifugation fraktioniert und die resultierenden Fraktionen auf das Vorliegen der gewünschten humanen MACIF-mRNA beispielsweise durch dot-blot-Hybridisierung untersucht.

(3) Herstellung einer cDNA-Bibliothek

Die gereinigte, auf die obengenannte Weise erhaltene mRNA ist im allgemeinen instabil. Aus diesem Grunde wird die mRNA umgewandelt (revers transkribiert) in eine stabile komplementäre DNA (cDNA) und mit einem von einem Mikroorganismus stammenden Replikon verbunden, das eine Amplifizierung des gewünschten Gens ermöglicht. Die in vitro-mRNA-Umwandlung kann im allgemeinen durch das Okayama-Berg-Verfahren [Okayama, H. und Berg, P., Molecular and Cellular Biology, 2, 161-170 (1982)] ausgeführt werden.
Demnach wird Oligo-dT als Primer verwendet, das als freies Oligo-dT oder in bereits an einen Vektorprimer gebundener Form vorliegen kann, und eine einzelsträngige cDNA, die der mRNA komplementär ist, wird unter Verwendung der mRNA als Matrize und reverser Transkriptase in Anwesenheit von dNTPs (dATP, dGTP, dCTP und dTTP) synthetisiert. Der nächste Schritt hängt davon ab, ob Oligo-dT in freier Form oder in an einen Vektorprimer gebundener Form verwendet wird.
Im ersteren Fall wird die Matrizen-mRNA entfernt, indem sie beispielsweise durch Behandlung mit Alkali abgebaut wird, und dann wird eine doppelsträngige DNA in Anwesenheit von reverser Transkriptase oder DNA-Polymerase I mit der einzelsträngigen DNA als Matrize synthetisiert. Die resultierende doppelsträngige DNA wird dann an ihren beiden Enden mit SI-Nuklease behandelt und nach Hinzufügen einer geeigneten Linker-DNA oder einer Mehrzahl von Basen, deren Kombination ein Annealing an die jeweiligen Enden erlaubt, in einen geeigneten Vektor, beispielsweise einen EK-Systemplasmidvektor (entweder des stringenten oder des relaxierten Typs) oder einen λgt-Phagenvektor, insertiert.
Im letztgenannten Falle wird der mRNA, die als Matrize dienen soll, erlaubt, so zu bleiben, wie sie ist, und das geöffnete zirkuläre Plasmid mit den hierzu hinzugefügten denselben Linkem, wie oben angesprochen, wird mit einer Linker-DNA (häufig ein DNA-Fragment, das einen in Zellen autonom replizierbaren Bereich und einen mRNA-Transkriptions-Promotorbereich enthält) annelliert, um eine geschlossene zirkuläre Form herzustellen. Dann wird die mRNA durch eine DNA-Kette in Anwesenheit von dNTPs und in gleichzeitiger Anwesenheit von RNaseH und DNA- Polymerase I ersetzt, um eine vollständige Plasmid-DNA zu erhalten.
Der auf die obengenannte Weise erhaltene, cDNA-enthaltende Plasmidvektor kann in einen Wirt eingeführt werden, um diesen zu transformieren. Ein typischer Wirt ist Escherichia coli. Jedoch ist der Wirt nicht darauf beschränkt, sondern kann beispielsweise Bacillus subtilis oder Saccharomyces cerevisiae sein.
Der Wirt kann transformiert werden, indem die obengenannte DNA durch verschiedene, üblicherweise in diesem Fachbereich verwendete Verfahren eingeführt wird, beispielsweise, indem Zellen hauptsächlich in der logarithmischen Wachstumsphase gesammelt werden, diese mit Calciumchlorid behandelt werden, um sie aufnahmefähig für eine spontane DNA-Aufnahme zu machen, und man sie das Plasmid aufnehmen läßt. Bei dem oben angesprochenen sie aufnahmefähig für eine spontane DNA-Aufnahme zu machen, und man sie das Plasmid aufnehmen läßt. Bei dem oben angesprochenen Verfahren kann zugelassen werden, daß in dem Transformationssystem Magnesiumchlorid oder Rubidiumchlorid zusätzlich anwesend sind, um die Transformationseffizienz weiter zu erhöhen. was im Stand der Technik allgemein bekannt ist. Es ist gleichfalls möglich, Wirtszellen in Sphäroplasten oder Protoplasten vor einer Transformation umzuwandeln.

Klonierung von cDNA

Ein Stamm, der die gewünschte humane MACIF-cDNA trägt, kann unter den auf die obengenannte Weise erhaltenen Transformanten durch verschiedene Verfahren, beispielsweise die nachstehend beschriebenen Verfahren, detektiert werden.

(1) Screening unter Verwendung einer synthetischen Oligonukleotid-Sonde:

In den Fällen, wo ein Teil der Aminosäuresequenz des gewünschten Proteins bekannt ist, wie im Falle der vorliegenden Erfindung, werden Oligonukleotide entsprechend dem Aminosäuresequenzabschnitt synthetisiert und diese als Sonde verwendet (nach Markierung mit ³²P oder ³&sup5;S), um einen positiven Stamm durch Hybridisierung mit von Transformanten gewonnenen, denaturierten und auf einem Nitrocellulosefilter immobilisierten DNAs zu detektieren und zu selektieren. Das Oligonukleotid kann eine auf Basis der Codonhäufigkeitsdaten abgeleitete Basensequenz haben oder eine Kombination voraussichtlicher Basensequenzen darstellen. Im letzteren Falle kann die Anzahl von Sonden durch Einbau von Inosin verringert werden.

(2) Selektion unter Verwendung eines Antikörpers gegen humanen MACIF:

Die cDNA wird vorab in einen Vektor insertiert, der eine Proteinexpression in Transformanten ermöglichen kann; man läßt eine Proteinproduktion in diesen erfolgen und der anti-humane MACIF-Antikörper und ein zweiter Antikörper gegen den Antikörper werden verwendet, um eine gewünschte Produzenten-Zelle für humanen MACIF zu detektieren und zu selektieren.

(3) Screening durch Produktion von humanem MACIF in anderen tierischen Zellen

Transformanten-Stämme werden für eine Genamplifizierung gezüchtet. Die Gene werden verwendet, um tierische Zellen zu transfizieren (unter Verwendung eines Plasmids, das zu einer autonomen Replikation fähig ist und einen RNA-Transkriptions- Promotorbereich enthält, oder eines Plasmids, das sich in Tierzell-Chromosomen integrieren kann). Man läßt die Proteine, die von diesen Genen kodiert werden, produzieren und die Kulturüberstände oder Zellextrakte werden hinsichtlich humaner MACIF-Aktivität untersucht. Alternativ wird ein Transformanten- Stamm, der die gewünschte, für humanen MACIF kodierende cDNA trägt, unter den Transformanten-Stämmen selektiert, indem der humane MACIF, der darin produziert wird, unter Verwendung eines Antikörpers gegen humanen MACIF detektiert wird.

Bestätigung humaner MACIF-DNA

Das durch die Verwendung von mRNA als Ausgangsmaterial erhaltene erfindungsgemäße Gen kann als Gen, das korrekt für humanen MACIF kodiert, bestätigt werden, indem ein geeignetes Translationssystem verwendet wird. Am häufigsten wird das von Krieg et al. [Krieg, P.A. et al., Nucleic Acids Research, 12, 7057-7070 (1984)] entwickelte Verfahren verwendet, das umfaßt, in vitro eine große Menge mRNA unter Verwendung eines starken Promotors und einer für den Promotor spezifischen RNA-Polymerase zu synthetisieren, gefolgt von einer Translation der mRNA in ein Protein unter Verwendung eines einfachen Translationssystems. Demnach wird in dem obengenannten Verfahren die cDNA der Erfindung in ein geeignetes Plasmid stromabwärts von einem starken Promotor, wie dem SP6-Promotor, dem T7-Promotor oder dem T3-Promotor, insertiert (im Falle der Verwendung von mRNA als Ausgangsmaterial kann der Vektor, der diese Promotoren enthält, vorab zur Herstellung der Bibliothek verwendet werden) und das resultierende Plasmid wird gereinigt und dann an einer geeigneten Restriktionsenzymschnittstelle, die stromabwärts von der stromabwärts von einem solchen Promotor befindlichen humanen MACIF-cDNA vorliegt, gespalten. Die resultierende doppelsträngige DNA wird in vitro in mRNA transkribiert unter Verwendung einer für den verwendeten Promotor spezifischen Polymerase, wie SP6-Polymerase, T7-Polymerase bzw. T3-Polymerase.
Die so transkribierte mRNA wird dann in ein Protein translatiert unter Verwendung eines zellfreien Proteinsynthese-Systems, wie einem Kaninchenretikulocytenlysats oder Weizenkeimlysats, oder durch das Verfahren, das eine Injektion der mRNA in Xenopus laevis-Oocyten umfaßt. Durch Untersuchung des Translationsproduktproteins auf MACIF-Aktivität oder durch ein immunologisches Verfahren unter Verwendung eines für humanen MACIF spezifischen Antikörpers kann bestätigt werden, daß das korrekt für humanen MACIF kodierende Gen erhalten worden ist.

Bestimmung der Gensequenz

Die Nukleotidsequenz des so erhaltenen Gens der Erfindung kann beispielsweise durch das Dideoxyverfahren unter Verwendung eines Plasmidvektors [Chen, E.Y., DNA, 4, 165-170 (1985)] oder durch das 7-DEAZA-Verfahren [Mizusawa, S. et al., Nucleic Acids Research, 14, 1319-1324 (1986)] bestimmt werden. Das so erhaltene Gen für natürlich vorkommenden humanen MACIF (erhalten aus menschlichen Leukozyten) ist in Fig. 1 gezeigt.
Obwohl das detailliert vorstehend beschriebene Verfahren zum Herstellen des Gens der Erfindung über mRNA vorgeht, kann das für humanen MACIF kodierende Gen auch durch chemische Synthese auf Basis der hier offenbarten Nukleotidsequenz hergestellt werden. Ein typisches Beispiel für das Verfahren einer chemischen Synthese ist das Phosphoamidit-Verfahren.

Konstruktion von Expressionsvektoren

(1) Auswahl des Wirt-Vektor-Systems:

Der kodierende Bereich des gewünschten humanen MACIF-Gens kann unter Verwendung eines Eukaryoten oder Prokaryoten als Wirt exprimiert werden. Der Vektor, der in derartige Wirtszellen integriert werden soll, kann auf in Abhängigkeit von den Wirtszellen geeignete Weise konstruiert werden.
Als prokaryotischer Wirt können Escherichia coli-Stämme [z.B. E. coli K12 294 (ATCC 31446), E. coli B, E. coli χ1776 (ATCC 31537), E. coli C600, E. coli W3110 (F-, λ-, phototroph; ATCC 27325)], Bacillus-Stämme [z.B. B. subtilis], andere Darmbakterien als E. coli, beispielsweise Salmonella typhimurium und Serratia marcescens, und Pseudomonas-Stämme aufgeführt werden.
Als Vektor für solche Mikroorganismen-Wirte kann ein Expressionsvektor verwendet werden, der das Gen der Erfindung mit einem Promotor und einer SD-Basensequenz [Shine, J. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 71, 1342-1346 (1974)], stromaufwärts von dem Gen lokalisiert, zusammen mit einem für die Initiation der Proteinsynthese erforderlichen ATG enthält. Im allgemeinen sind pBR322, pBR327 und ähnliche Vektoren Vektoren, die für eine Verwendung in Escherichia coli und anderen Bakterienstämmen geeignet sind.
Als Promotor können beispielsweise der Tryptophan-Promotor, PL-Promotor, lac-Promotor, lpp-Promotor und der β-Lactamase-Promotor verwendet werden.
Als typische Beispiele für das Markergen können das Ampicillinresistenzgen und das Tetracyclinresistenzgen aufgeführt werden.
Hefen werden im allgemeinen als eukaryotischer Mikroorganismus verwendet. Insbesondere können Hefen, die zu der Gattung Saccharomyces gehören, mit Vorteil verwendet werden. Ein typisches Beispiel für den Expressionsvektor für eine Verwendung in Hefen und anderen eukaryotischen Mikroorganismen ist YRp7.
Nützliche Beispiele für den Promotor, den der Expressionsvektor für eine Expression in Hefen aufweisen sollte, sind die 3-Phosphoglyceratkinase-Enolase-, Glyceraldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase- oder Hexokinase-Promotoren.
Das trp1-Gen kann beispielsweise als Markergen verwendet werden.
Der Replikationsursprung, das Terminationscodon und andere DNA-Sequenzen, die zur Transkriptions- und Translationsregulierung in Hefezellen dienen, können gewöhnliche DNA-Sequenzen sein, die als für eine Verwendung in Hefezellen geeignet bekannt sind.
Wenn in Kultur befindliche höhere tierische Zellen als Wirt verwendet werden, können diese beispielsweise Nierenzellen von Rhesusaffen, Moskitolarvenzellen, Nierenzellen von afrikanischen grünen Meerkatzen, fötale Mausfibroblasten, chinesische Hamster-Eierstockzellen (CHO), ein Dihydrofolatreduktase-defizienter Stamm davon [Urlaub, G. et al., Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A., 77, 4216-4220 (1980)], humane Zervixepithelzellen, humane fötale Nierenzellen, Motteneierstockzellen, humane Myelomzellen oder Mausfibroblasten sein.
Der Vektor enthält im allgemeinen funktionale Sequenzen für eine Expression der DNA der Erfindung in Wirtszellen, beispielsweise den Replikationsursprung, einen stromaufwärts von der DNA der Erfindung befindlichen Promotor, eine Ribosomenbindungsstelle, eine Polyadenylierungsstelle und eine Transkriptionsterminationssequenz.
Bevorzugte Beispiele des Promotors sind der späte Adenovirus 2-Hauptpromotor (adenovirus 2 major late promoter), der frühe SV40-Promotor (SV40 early promoter), der späte SV40- Promotor (SV40 late promoter) und eukaryotische, von Genen (z.B. vom Östrogen-induzierbaren Hühnereialbumingen, Interferongen, Glucocorticoid-induzierbaren Tyrosinaminotransferasegen, Thymidinkinasegen, frühen und späten Adenovirus-Hauptgenen, Phosphoglyceratkinasegen, α-Faktorgen) abgeleitete Promotoren.
Der Replikationsursprung kann von Adenovirus, SV40, Rinderpapillomavirus (BPV), vesikulärem Stomatitisvirus (VSV) oder von jedem beliebigen, von diesen abgeleiteten Vektor abgeleitet sein.
Das Neomycinresistenzgen und das Methotrexat-resistente Dihydrofolatreduktase (DHFR)-Gen können unter anderem als Markergen in diesem Falle verwendet werden.
Die Beispiele für den Wirt, Vektor und Bestandteile desselben, die vorstehend als einsetzbar für die Expression der humanen MACIF-cDNA und von modifizierten humanen MACIF-Protein- cDNAs beschrieben worden sind, beschränken keinesfalls den Umfang der vorliegenden Erfindung.

(2) Konstruktion von Expressionsvektoren für humanes MACIF- Protein

Ein Verfahren zum Konstruieren von Vektoren für die Expression von humanen MACIF-Proteinen wird im Folgenden beschrieben.
Diese sind rekombinante Vektoren, die eine DNA-Sequenz umfassen, die von der in Figur 1 gezeigten DNA-Basissequenz abgeleitet ist, indem ein beliebiger Abschnitt davon deletiert ist, beispielsweise so, daß dem Expressionsprodukt ein Teil seiner N-terminalen oder C-terminalen Aminosäuresequenz fehlt, oder indem ein beliebiger Abschnitt davon so modifiziert wird, daß die entsprechende Aminosäuresequenz durch irgendeine andere Aminosäuresequenz ersetzt wird, oder indem eine geeignete Sequenz hinzugefügt wird, so daß irgendeine Aminosäuresequenz dem Expressionsprodukt hinzugefügt wird, zusammen mit jenen Bestandteilen, die für eine Expression in einer Vielzahl von Wirtssystemen, die im vorstehenden Abschnitt (1) aufgeführt worden sind, erforderlich sind. Genauer umfassen diese Expressionsvektoren eine Reihe von rekombinanten Vektoren, in denen ein Gen, das für ein durch die Aminosäuresequenz der Formel (I) definiertes Polypeptid kodiert, wirksam verbunden wird mit und unter die Kontrolle gestellt wird von regulatorischen DNA-Sequenzen, die eine Expression des Polypeptids bewirken können.
Wenn Bakterienzellen, die keinen PI-Anker-Synthesemechanismus haben, als Wirt für eine Expression der obengenannten Expressionsvektoren verwendet werden, ist das Expressionsprodukt immer ein Polypeptid ohne PI-Anker.
Wenn Säugetierzellen als Wirt verwendet werden, wird die Zufügung von PI-Ankern auf komplizierte Weise gesteuert. Es ist allgemein bekannt, daß, wenn eine PI-Anker-Anheftung an den C- Terminus eines Polypeptids stattfindet, eine Entfernung eines spezifischen hydrophoben, C-terminalen Polypeptidabschnitts (PI-Anker-Anheftungssignalsequenz) von einem Vorläufer des Polypeptids der Modifizierung mit dem PI-Anker vorausgeht. Im Falle von humanem MACIF, der in Fig. 2 gezeigt ist, wirkt das Polypeptid vom 77. Aminosäurerest (Asn) bis zum 103. Aminosäurerest (Pro) als Signal für eine PI-Anker-Anheftung. Jedoch fehlt den jeweiligen, in die Expressionsvektoren insertierten Proteingenen für solche erfindungsgemäßen Proteine, die die Aminosäuren Nr. 1 bis Nr. 70, 77 und 86 umfassen, der DNA- Abschnitt, der für einen Teil oder die Gesamtheit der PI-Anker- Anheftungssignalsequenz kodiert. Es ist bekannt, daß eine Deletion eines Genfragments, das für einen Teil der hydrophoben Anheftungssignalsequenz kodiert, aus einem Gen, das für einen Proteinvorläufer kodiert, an den ein PI-Anker angeheftet werden soll, zu einer Produktion eines löslichen Proteins führt [Berger, J. et al., Journal of Biological Chemistry, 263, 10016-10021 (1988)]. Dementsprechend können die Gene der vorliegenden Erfindung möglicherweise als Gene zum Herstellen löslicher humaner MACIF-Proteine verwendet werden.
Unter den Vektoren für die Expression dieser Proteine werden ein Vektor für die Expression von MACIF-Proteinen, die diese Aminosäurereste bis zum 86., 77. bzw. 70. Aminosäurerest umfassen, in Eschericha coli und in Säugetierzellen im Folgenden detaillierter zusammen mit Verfahren zu deren Konstruktion und Expression beschrieben.

(a) Expression eines Proteins, das die Aminosäurereste Nr. 1 bis 86 umfaßt:

Wenn Escherichia coli als Wirt verwendet wird, wird das Plasmid pGEM2-3 mit AvaII gespalten. Davon getrennt wird eine synthetische DNA der Formel (III):
an der AvaII-Schnittstelle phosphoryliert. Das Spaltungsprodukt und die phosphorylierte synthetische DNA werden unter Verwendung von T4-DNA-Ligase ligiert. Das Ligationsprodukt wird dann mit PstI gespalten und mit der an der PstI-Schnittstelle phosphorylierten, synthetischen DNA der Formel (II):
unter Verwendung von T4-DNA-Ligase ligiert. Das so hergestellte Ligationsprodukt (jetzt EcoRI/HindIII-Fragment) aus der synthetischen DNA und dem DNA-Fragment wird durch Agarose- Gelelektrophorese isoliert und gereinigt.
Das so hergestellte EcoRI/HindIII-DNA-Fragment wird mit einem in Fig. 3 gezeigten EcoRI/HindIII-Hauptfragment von pKK223-3 ligiert. Ein rekombinanter Escherichia coli-Stamm, der eine Expression eines Polypeptids, das die 1. bis 86. Aminosäure umfaßt, ermöglicht, kann unter Verwendung dieses Ligationsprodukts erhalten werden. Plasmide können dann aus transformierten Zellen durch das alkalische Verfahren isoliert und unter Verwendung von Restriktionsenzymen analysiert werden. Auf diese Weise kann eine Transformante, die das gewünschte Plasmid mit dem darin insertieren EcoRI/HindIII-DNA- Fragment beherbergt, selektiert werden.
Für eine Polypeptidexpression in CHO-Zellen wird pGEM2-3 mit AvaII gespalten und dann mit der synthetischen DNA der Formel (III) ligiert wie im Falle einer Expression in Escherichia coli-Zellen. Das Ligationsprodukt wird dann mit SacI gespalten und ein DNA-Fragment von ungefähr 375 Basenpaaren wird durch Agarosegelelektrophorese isoliert und gereinigt. Dieses DNA- Fragment wird durch Behandlung mit Mungobohnen-Nuklease mit stumpfen Enden versehen. Das resultierende DNA-Fragment wird in mit BglII gespaltenen pVY1 insertiert und mit stumpfen Enden ver-sehen, um ein Expressionsplasmid zu erhalten. Eine Transformation von CHO-Zellen mit dem Expressionsplasmid liefert CHO-Zellen, die ein Polypeptid, das den 1. bis 86. Aminosäurerest umfaßt, exprimieren und produzieren können.

(b) Expression von Proteinen, die den 1. bis 77. Aminosäurerest bzw. den 1. bis 70. Aminosäurerest umfassen:

Um eine Expression des Gens, das für den 1. bis 77. Aminosäurerest oder den 1. bis 70. Aminosäurerest kodiert, in Escherichia coli oder in CHO-Zellen zu bewirken, kann im wesentlichen demselben Verfahren, wie vorstehend aufgeführt, gefolgt werden mit der Ausnahme, daß in dem Plasmidherstellungsschritt die synthetische DNA, die mit pGEM2-3 nach einer Spaltung des letzteren mit AvaII verbunden werden soll, eine synthetische DNA der Formel (IV):
wenn das Polypeptid, das den 1. bis 77. Aminosäurerest umfaßt, exprimiert werden soll, oder eine synthetische DNA der Formel (V):
ist, wenn das Polypeptid, das den 1. bis 70. Aminosäurerest umfaßt, exprimiert werden soll.
Die folgenden Schritte, die entsprechenden Gene und rekombinanten Vektoren für die Expression der Gene können erhalten werden, indem in derselben Weise, wie vorstehend unter (a) beschrieben, vorgegangen wird.

Transformation

Eine Einführung der so erhaltenen Expressionsvektoren, die die humane MACIF-Protein-cDNA enthalten, in gewünschte Wirtszellen, nämliche eine Transformation der Zellen mit den Vektoren, kann unter Verwendung der Verfahren, die im allgemeinen angewendet werden, bewirkt werden.
Jedes Expressionsvektorplasmid kann aus dem für die Genkonstruktion verwendeten Wirt (z.B. E. coli HB101) durch ein allgemein verwendetes Verfahren, beispielsweise alkalische Bakteriolyse, präpariert werden. Das präparierte Vektorplasmid wird verwendet, um den Wirt zu transformieren. Die Transformation kann beispielsweise vorgenommen werden durch das Verfahren von Hanahan [Hanahan, D., Journal of Molecular Biology, 166, 557-580 (1983)], wenn Bakterienzellen als Wirt verwendet werden, oder beispielsweise durch das Calciumphosphatverfahren (van der Eb, A. J. et al., Methods in Enzymology, 65, 826-839 (1980), Academic Press], wenn Säugetierzellen als Wirt verwendet werden.

Züchtung und Reinigung

Die auf die obengenannte Weise erhaltene Transformante kann auf herkömmliche Weise gezüchtet werden und die Züchtung derselben führt zu einer Produktion und Anhäufung von biologisch aktiven humanen MACIF-Proteinen. Das Züchtungsmedium kann geeigneterweise in Abhängigkeit von den eingesetzten Wirtszellen unter den verschiedenen herkömmlichen Medien ausgewählt werden. Werden beispielsweise die obengenannten CHO-Zellen als Wirt verwendet, kann MEM-α-Medium, sofern erforderlich, supplementiert mit einem Blutbestandteil, wie fötalem Kälberserum (FCS), verwendet werden.
Der Expressionsort für die Produktion der rekombinanten humanen MACIF-Proteine in der Transformante variiert in Abhängigkeit von der Aminosäuresequenz, für die die ausgewählte cDNA kodiert, der Art der Vektoren, jener der Wirtszellen und der Kombination von diesen. Demnach kann der rekombinante humane MACIF auf der Zellmembran, innerhalb der Zelle oder im Zellkulturüberstand hergestellt werden. Die in transformierten Zellen produzierten humanen MACIF-Proteine können aus diesen isoliert und gereinigt werden durch ver-schiedene Trennverfahren [z.B. Japanese Biochemical Society (Hrsg.), Biochemical Data Book II, 1. Ausgabe, 1. Druck, S. 1175, Tokyo Kagaku Dojin (1980)] auf Basis ihrer physikalischen und chemischen Eigenschaften.
Konkret umfassen die Verfahren unter anderem eine Behandlung mit einem gewöhnlichen proteinpräzipitierenden Mittel, Ultrafiltration, Molekularsiebchromatographie (Gelfiltration), Adsorptionschromatographie, Ionenaustauschchromatographie, Affinitätschromatographie, Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC), andere Flüssigchromatographieverfahren, Dialyse und Kombinationen davon. Genauer kann das zu verwendende Verfahren von dem Expressionsort des rekombinanten Proteins abhängen.
Im Kulturüberstand produzierte rekombinante Proteine können auf die folgende Weise isoliert und gereinigt werden.
Zuerst wird die gewünschte Substanz teilweise vorab von dem Kulturüberstand gereinigt. Diese teilweise Aufreinigung wird beispielsweise durch Behandlung mit einem Mittel zum Aussalzen, wie Ammoniumsulfat, Natriumsulfat oder Natriumphosphat, und/oder eine Ultrafiltrationsbehandlung unter Verwendung einer Dialysemembran, Flachmembran oder Hohlfasermembran bewirkt. Die Vorgehensweise und die Bedingungen für jede dieser Behandlungen können dieselben sein, die üblicherweise in diesem Fachbereich verwendet werden. Das auf die vorstehend aufgeführte Weise erhaltene, grob aufgereinigte Produkt wird einer Adsorptionschromatographie, Affinitätschromatographie, Gelfiltration, Ionenaustauschchromatographie, Umgekehrte-Phase- Chromatographie ("reversed-phase"-Chromatographie) oder ähnlichem oder einer Kombination davon unterworfen und eine Fraktion, die humane MACIF-Aktivität aufweist, wird gewonnen. Auf diese Weise kann die gewünschte Substanz in reiner und homogener Form isoliert werden.
Ein auf der Zellmembran produziertes rekombinantes Protein kann einen PI-Anker haben und dementsprechend an die Zellmembran über den Anker gebunden sein. Ein solches membrangebundenes rekombinantes Protein kann gereinigt werden, indem die Zellmembran durch Behandlung mit einem geeigneten Detergens (z.B. NP-40, Triton X-100, Octylglykosid) aufgebrochen wird und dann auf dieselbe Weise, wie oben beschrieben, vorgegangen wird. Alternativ kann ein an die Zellmembran über den PI-Anker gebundenes rekombinantes Protein durch eine geeignete Behandlung zur Abspaltung des PI-Ankers in Lösung gebracht werden. Als Mittel zur Abspaltung des PI-Ankers können beispielsweise eine Spaltung mit Phosphatidylinositol-spezifischer Phospholipase C (PI-PLC) und eine Spaltung mit Phosphatidylinositolspezifischer Phospholipase D(PI-PLD) aufgeführt werden. Das durch die vorstehend aufgeführte Behandlung solubilisierte, rekombinante Protein wird in den Zellkulturüberstand freigesetzt und kann dementsprechend auf dieselbe Weise, wie oben beschrieben, gereinigt werden.
Ein in der Zelle produziertes rekombinantes Protein kann gereinigt werden, indem die Zellmembran durch Behandlung mit einem geeigneten Detergens wie im Falle membrangebundener rekombinanter Proteine aufgebrochen wird, um dadurch eine Freisetzung des rekombinanten Proteins in die Lösungsphase zu bewirken, und dann auf die gleiche Weise, wie vorstehend aufgeführt, fortgefahren wird.
Die Aktivität des so gereinigten rekombinanten humanen MACIF oder löslichen rekombinanten humanen MACIF kann beispielsweise durch Ausführen des Nachweises einer die reaktive Lyse inhibierenden Aktivität [Thompson, R. A. et al., Journal of Experimental Medicine, 131, 629-641 (1970) und Lachmann, P.J. et al., Journal of Experimental Medicine, 131, 643-657 (1970)] identifiziert werden.
Im Vorangegangenen wurden die erfindungsgemäßen Gene, die Vektoren für die Expression der Gene und die transformierten Mikroorganismen und Zellen, die die Expression der Gene ermöglichen können, sowie die Verfahren zu deren Herstellung beschrieben. Als Ergebnis der vorliegenden Erfindung wurden Gene, die für humane MACIF-Proteine kodieren, die in praktischer Hinsicht als Arzneimittel verwendet werden können, bereitgestellt. Demnach ist es jetzt möglich, eine reine und homogene Qualität von humanem MACIF-Protein in großen Mengen unter Verwendung rekombinanter DNA-Technologie herzustellen.
Humane MACIF-Proteine sind von menschlichem Ursprung. Dementsprechend weisen sie keine antigene Potenz auf und ihre Toxizität ist gering. Sie können Zellen und Geweben davor schützen, als Ergebnis einer MAC-Bildung in der letzten Stufe einer Komplement-Aktivierung geschädigt zu werden. Demnach können sie vorteilhaft als therapeutische Mittel für verschiedene Erkrankungen verwendet werden, insbesondere für Erkrankungen, die aus dem Fehlen oder einer verringerten Menge einer oder mehrerer komplementregulierenden Komponente(n) resultieren, und sämtliche Erkrankungen, die unter der Kategorie von Typ II- oder Typ III-Allergie klassifiziert werden können.
Darüberhinaus kann möglicherweise eine qualitative oder quantitative Abnormalität hinsichtlich humanem MACIF nicht nur bei Erkrankungen aufgrund des Fehlens oder einer verringerten Menge einer oder mehrerer komplementregulierenden Komponente(n), typisch bei paroxysmaler nächtlicher Hämoglobinune (PNH), sondern auch bei verschiedenen Entzündungs- und Autoimmunerkrankungen, die von einer Zell- und/oder Gewebeschädigung begleitet werden, beobachtet werden. Dementsprechend können humaner MACIF, für humanen MACIF spezifische monoklonale oder polyklonale Antikörper, humane MACIF-Protein-DNAs und ferner hinsichtlich humaner MACIF-Proteingene komplementäre DNAs bei der spezifischen Diagnose der obengenannten Erkrankungen verwendet werden.
Die Dosierungsform humaner MACIF-Proteine kann in Abhängigkeit von den Erkrankungen, Symptomen und den aus dem Patienten resultierenden Bedingungen variieren. Im allgemeinen werden jedoch nicht-orale Dosierungsformen, wie Injektionen, Nasalpräparationen, Suppositorien und Implantate, für eine systemische Verabreichung verwendet, während intraartikuläre Zubereitungen und Zubereitungen, die in betroffene Stellen implantiert werden, beispielsweise für eine lokale Verabreichung verwendet werden.
Bei der Herstellung dieser Dosierungsformen werden Zusammensetzungen, die für die jeweiligen Formen geeignet sind, verwendet. Bei der Herstellung von Injektionen wird humanes MACIF- Protein beispielsweise in phosphatgepufferter physiologischer Kochsalzlösung oder einer wäßrigen Dextrose-Lösung gelöst und nach einer Zugabe eines Stabilisierungsmittels, eines Dispergiermittels und/oder ähnlichem, sofern erforderlich, in Ampullen abgefüllt oder in Gefäßen lyophilisiert. Im letztgenannten Fall wird die Zubereitung vor der Verwendung durch Auflösen in destilliertem Wasser für eine Injektion oder in physiologischer Kochsalz lösung rekonstituiert.
Die tägliche MACIF-Dosis für erwachsene Menschen beträgt im allgemeinen zwischen 100 µg und 5000 mg, vorzugsweise zwischen 1 mg und 500 mg. Eine solche tägliche Dosis wird in einer einzelnen Gabe oder in Teilgaben verabreicht.

Beispiel für die Herstellung einer Dosierungsform

Eine Lösung von 5 g MACIF in 100 ml physiologischer Kochsalzlösung wird einer Sterilfiltration unterworfen und dann in 2 ml-Portionen in Gefäße abgefüllt. Eine Lyophilisierung liefert eine Zubereitung für eine Injektion, wobei jedes Gefäß 100 mg MACIF enthält.

REFERENZBEISPIELE

(1) Bestimmung N-terminaler und C-terminaler Aminosäuresequenzen einer gereinigten Probe von natürlich vorkommendem humanem MACIF:

1) Bestimmung der N-terminalen Aminosäuresequenz

Eine gereinigte Probe von natürlich vorkommendem humanem MACIF (18 kD) wurde auf herkömmliche Weise mit 2-Mercaptoethanol in Anwesenheit von 8M Harnstoff reduziert, dann mit Iodessigsäure S-carboxymethyliert und hinsichtlich ihrer N-terminalen Aminosäuresequenz unter Verwendung einer Gasphasenproteinsequenziervorrichtung (Modell 470A, Applied Biosystems, U.S.A.) analysiert. Das Ergebnis war, wie folgt:

2) Bestimmung der C-terminalen Aminosäuresequenz

Eine 0,6 mg-Portion der gereinigten Probe von natürlich vorkommendem humanem MACIF wurde auf herkömmliche Weise mit Dithiothreitol in Anwesenheit von 6 M Guanidinhydrochlond reduziert und mit Iodessigsäure S-carboxymethyliert. Die Alkylierungsmischung wurde gegen destilliertes Wasser über Nacht bei 4ºC dialysiert und das Dialysat wurde auf 0,5 ml unter Verwendung einer Zentrifugen-Typ-Unterdruck-Aufkonzentriervorrichtung (centrifuge-type reduced-pressure concentrator) aufkonzentriert. Die gesamte carboxymethylierte humane MACIF-Lösung wurde durch Zugabe von 1 M Tris-HCl-Puffer (pH 8,0) gepuffert. Dann wurde eine Lösung von 100 µg Pronase (Calbiochem) in 20 µl 50 mM Tris-HCl-Puffer der Lösung zugesetzt und die Reaktion bei 37ºC 22 h fortgeführt.
Eine Chloroform-Methanol (1:1)-Mischung (0,5 ml) wurde der Reaktionsmischung zugesetzt. Nach gründlichem Schütteln wurde die gesamte Mischung zentrifugiert, wobei sie sich in eine transparente obere Phase, eine trübe mittlere Phase und eine transparente untere Phase trennte. Ein Anteil jeder Phase wurde abgenommen, mit 6 N Salzsäure hydrolysiert und auf herkömmliche Weise unter Verwendung eines Picotag work station equipment (Waters, U.S.A.) analysiert. In der mittlere Phase wurde Ethanolamin nachgewiesen. Es wurde so festgestellt, daß die mittlere Phase ein Pronase-Verdauungs-Fragment mit einem an den C- Terminus gebundenen PI-Anker enthielt. Die mittlere Phase (600 µl), die das obengenannte C-terminale Fragment mit angeheftetem PI-Anker enthielt, wurde lyophilisiert, 1,2 ml einer Wasser:n-Butanol:1 N HCl (600:600:3)-Mischung wurden zugesetzt und die Mischung nach gründlichem Schütteln zentrifugiert. Eine Hydrolyse wurde mit 6 N HCl auf dieselbe Weise, wie vorstehend beschrieben, ausgeführt und eine Analyse unter Verwendung eines Picotag work station equipment vorgenommen. Ethanolamin wurde in der Butanolphase nachgewiesen (obere Phase). Ein gleiches Volumen an n-Butanol-gesättigter 5 mM HCl wurde der oberen Phase zugesetzt, die Mischung geschüttelt und dann zentrifugiert und die obere Phase abgetrennt. Dieses Extraktionsverfahren mit angesäuertem Butanol wurde insgesamt zweimal wiederholt.
Die Hälfte der zuletzt vorliegenden n-Butanol-Phase wurde einer Aminosäuresequenzbestimmung unter Verwendung der obengenannten Proteinsequenziervorrichtung unterzogen.
Als Ergebnis wurde die folgende Sequenz gefunden:
die den Bereich zwischen dem 72. und dem 76. Aminosäurerest in der in Fig. 2 gezeigten Sequenz umfaßt. Hinter dem 76. Aminosäurerest (Glu) wurde kein Aminosäurerest mehr nachgewiesen. Die vorstehend angegebenen Fakten zeigten, daß natürlich vorkommender humaner MACIF aus Erythrozyten den PI-Anker an das Glu, das der 76. Aminosäurerest vom N-Terminus gerechnet ist, angeheftet aufweist.

(2) Herstellung von Oligonukleotid-Sonden zum Nachweisen von für humanen MACIF kodierenden cDNA-Klonen

Auf Basis der in dem vorangegangenen Abschnitt (1) ermittelten Aminosäuresequenz wurden 15-mere und 17-mere gemischte Desoxyoligonukleotid-Sonden, die den mDNA-Bereichen, die für Aminosäurereste Nr. +1 bis +5 bzw. +4 bis +9 kodieren, komplementär waren, durch das Phosphoamidit-Verfahren unter Verwendung einer Model 380A DNA-Synthesevorrichtung (Applied Biosystems) chemisch synthetisiert und am 5'-Ende mit ³²P markiert.
Die gemischte 15-mere Sonde (nachfolgend als "M1-Sonde" bezeichnet) hatte die Nukleotidsequenzen: Sequenzen
während die gemischte 17-mere Sonde (nachfolgend als "M4-Sonde" bezeichnet) die Nukleotidsequenzen ( Sequenzen) hatte

(3) Herstellung einer humanen Monozyten-cDNA-Bibliothek:

Rekombinante Plasmide wurden durch das Okayama-Berg-Verfahren (s.o.) ausgehend von mDNA aus Immunkomplex-stimulierten menschlichen Monozyten aus peripherem Blut und von im Handel erhältlichem Plasmidvektor pGEM4 (Promega) konstruiert. Die so konstruierten rekombinanten Plasmide wiesen cDNA zwischen der KpnI-Schnittstelle und der SacI-Schnittstelle der multiplen Klonierungsstellen, die zwischen dem SP6-Promotorbereich und dem T7-Promotorbereich von pGEM4 lokalisiert sind, insertiert auf. Die Orientierung der cDNA war dergestalt, daß die KpnI- Stelle (T7-Promotorstelle) auf der 3'-Seite der mRNA und die SacI-Stelle (SP6-Promotorstelle) auf der 5'-Seite der mRNA lag.
Die so erhaltene rekombinante Plasmidmischung wurde verwendet, um kompetente E. coli HB101-Zellen (Takara Shuzo) zu transformieren, und es wurde eine cDNA-Bibliothek, die ungefähr 400000 Transformanten umfaßte, erhalten.

(4) Klonierung humaner MACIF-cDNA:

Um eine Transformante, die ein für humanen MACIF kodierende cDNA enthaltendes Plasmid beherbergte, zu isolieren, wurde die wie in Abschnitt (3) beschrieben erhaltene humane Monozyten-cDNA-Bibliothek einer Kolonie-Hybridisierung unter Verwendung der wie in Abschnitt (2) beschrieben hergestellten synthetischen Oligonukleotid-Sonden unterworfen, um Klone, die sowohl mit der M1- als auch mit der M4-Sonde hybridisieren, nachzuweisen. Ein Klon, der die längste cDNA enthielt (ca. 2000 bp) wurde ausgewählt und von dem daraus isolierten Plasmid pGEM 352-3 wurde eine Teilbasensequenz des cDNA-Abschnitts durch das Dideoxyverfahren (s.o.) unter Verwendung des Plasmidvektors und durch das 7-DEAZA-Verfahren (s.o.) bestimmt. Die so bestimmte cDNA-Sequenz (ungefähr 500 bp) von dem SP6-Promotorbereich (5'-Seite der mRNA) von pGEM4 ist in Fig. 1 gezeigt.
In der cDNA-Sequenz des pGEM2-3-Klons gibt es eine Sequenz, die für die zehn N-terminalen Aminosäurereste des in Abschnitt (1) beschriebenen gereinigten humanen MACIF kodiert, mit dem Translationsinitiationscodon ATG an einer Stelle, die dem Aminosäurerest Nr. -25 stromaufwärts vom N-Terminus entspricht, und dem Translationsterminationscodon TAA an einer Stelle, die dem 104. Aminosäurerest stromabwärts vom N-Terminus entspricht. Der so gebildete offene Leserahmen kodiert für ein Protein mit 128 Aminosäureresten. Es wird stark angenommen, daß die dem Abschnitt von - 25 bis -1 entsprechende Aminosäuresequenz die sogenannte Sekretionssignalsequenz mit sehr hoher Hydrophobizität ist.

BEISPIELE

(1) Expression eines für ein humanes MACIF-Protein kodierenden Gens in Escherichia coli

1) Konstruktion eines Expressionsvektors für ein humanes MACIF-Protein und Expression in Escherichia coli

1-1) Herstellung eines Vektors für eine Expression in Escherichia coli

Der Vektor pYEJ001 (Pharmacia; Fig. 5) für eine Expression in Escherichia coli wurde mit dem Restriktionsenzym HindIII gespalten und das Vektorhauptfragment, das den Replikationsursprung und den Promotor für eine Expression des fraglichen Gens enthielt, wurde durch Agarosegelelektrophorese isoliert und gereinigt und dann mit alkalischer Phosphatase zur Entfernung terminaler Phosphatgruppen behandelt.
Das in den Vektor zu insertierende DNA-Fragment einschließlich der SD-Sequenz, des humanen MACIF-Proteingens und der Transkriptionsterminationssequenz wurde auf die folgende Weise hergestellt.

1-2) Herstellung eines DNA-Fragment-Inserts für die Expression eines modifizierten humanen MACIF-Proteins (E86), umfassend die Peptidsequenz bis zum 86. Aminosäurerest.

pGEM2-3 wurde mit den Restriktionsenzymen PstI, HincII und BamHI gespalten und ein DNA-Fragment von ungefähr 310 Basenpaaren wurde durch Agarosegelelektrophorese isoliert und gereinigt.
Dieses 310 Basenpaar-DNA-Fragment wurde mit dem Restriktionsenzym MboII gespalten und ein DNA-Fragment von ungefähr 250 Basenpaaren wurde durch Agarosegelelektrophorese isoliert und gereinigt.
Davon getrennt wurden zwei (B und C) der vier synthetischen DNAs der Formeln (VII):
unter Verwendung von Polynukleotidkinase terminal phosphoryliert. A und das phosphorylierte B wurden auf 90ºC erwärmt und dann schrittweise auf 16ºC abgekühlt, um eine Annellierung zu bewirken. Das phosphorylierte C und unphosphorylierte D wurden auf dieselbe Weise für eine Annellierung behandelt. Die beiden Annellierungsprodukts-DNAs und das vorab hergestellte DNA-Fragment von ungefähr 250 Basenpaaren wurden unter Verwendung von T4-DNA-Ligase miteinander ligiert und ein DNA-Fragment von ungefähr 325 Basenpaaren, das den für das modifizierte MACIF- Protein E86 kodierenden Bereich enthielt, wurde durch Agarosegelelektrophorese isoliert und gereinigt.

1-3) Herstellung eines Vektors für die Expression des humanen MACIF-Proteins in Escherichia coli und Transformation hiermit:

Das so hergestellte DNA-Fragment wurde unter Verwendung von Polynukleotidkinase terminal phosphoryliert und dann mit dem separat hergestellten Vektorhauptfragment unter Verwendung von T4-DNA-Ligase ligiert. Die Ligationsmischung wurde verwendet, um E. coli K12JM109 zu transformieren. Plasmide wurden aus den erhaltenen Transformanten durch das alkalische Verfahren (s.o.) hergestellt und unter Verwendung von Restriktionsenzymen (z.B. Spaltung mit PstI) analysiert und ein Plasmid, das das fragliche Gen in der eine Genexpression ermöglichenden Richtung darin insertiert enthielt, wurde selektiert.

1-4) Expression und Züchtung:

Ein Volumen 2xYT-Medium (16 g Bactotrypton, 10 g Hefeextrakt und 5 g Natriumchlorid pro Liter) supplementiert mit 100 µg/ml Ampicillin wurde mit 1/50 Volumen einer Vorkultur eines rekombinanten E. coli-Stamms, der eine Expression des fraglichen Gens erlaubt, angeimpft. Dann wurde die Kultur bei 37ºC geschüttelt und der rekombinante E. coli-Stamm gezüchtet, bis die Zelldichte ungefähr 5 x 10&sup7;/ml erreicht hatte, und dann wurde Isopropylthiogalactopyranosid in einer Konzentration von 2,5 mM zugegeben. Nach weiteren 16 h Züchtung wurden die Zellen geerntet.
Die gesammelten Zellen wurden in PES mit 2 mM EDTA, 2 mM EGTA, 1 mM Benzamidin, 2 mM Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF) (sämtlich bezogen von Sigma) suspendiert und unter Verwendung eines Manton-Gaulin-Homogenisators aufgebrochen.

2) Reinigung des aus der Expression des humanen MACIF- Proteingens in Escherichia coli resultierenden Proteins und Nachweis seiner biologischen Aktivität:

2-1) Reinigung:

Das wie vorstehend beschrieben hergestellte Produkt aus dem Aufbrechen der Escherichia coli-Zellen wurde zentrifugiert (12000 Upm, 30 min) und der Niederschlag über Nacht bei 4ºC in Anwesenheit von 6 M Guanidinhydrochlond gerührt, um eine Solubilisierung zu bewirken.
Das verbleibende unlösliche Material wurde durch Zentrifuation unter denselben Bedingungen wie vorstehend angegeben entfernt. Das in dem Überstand enthaltene Expressionsproduktsprotein (E86) wurde durch Behandlung in Anwesenheit von Glutathion (Sigma) in oxidierter und reduzierter Form entsprechend dem Verfahren von Winkler und Blaber [Winkler, M. E. und Blaber, M., Biochemistry, 256, 4041-4045 (1986)] rekonstituiert.
Die Rekonstitutionsmischung wurde gründlich gegen 10 mM Tris-Puffer (pH 8,0) dialysiert und dann durch Auftragen auf Q- Sepharose (Pharmacia), die mit demselben Puffer voräquilibriert worden war, gereinigt.

2-2) Aktivität des modifizierten humanen MACIF-Proteins (E86):

Die erhaltenen Aktivitätsdaten ergaben keinen Hauptpeak an durch den Antikörper neutralisierbarer Aktivität (Fig. 6). Jedoch wurden auf Basis der Ergebnisse einer in Fig. 7 gezeigten SDS-PAGE-Analyse die die Hauptbanden enthaltenden Fraktionen (Nr. 26-30) über eine anti-humane MACIF-Antikörper-Säule gereinigt, gefolgt von einer Messung der reaktive Lyse hemmenden Aktivität. Wie in Fig. 8 gezeigt, zeigte das gereinigte Expressionsproduktsprotein (E86) eine dosisabhängige antihämolytische Aktivität. Darüberhinaus wurde die inhibitorische Aktivität vollständig durch den Antikörper neutralisiert.
Die obengenannten Ergebnisse zeigen, daß das in Escherichia coli exprimierte humane MACIF-Protein dieselbe Aktivität wie aus Erythrozyten gewonnener humaner MACIF hat und daß humaner MACIF eine inhibierende Aktivität hinsichtlich reaktiver Lyse sogar dann zeigen kann, wenn er keine Kohlenhydratkette oder keinen PI-Anker hat.

(2) Expression des für ein humanes MACIF-Protein kodierenden Gens in CHO-Zellen und Bestätigung von dessen biologischer Aktivität:

1) Expression eines humanen MACIF-Proteins (C86) in CHO- Zellen:

1-1) Konstruktion eines rekombinanten Plasmids für eine Expression in CHO-Zellen:

Das Plasmid pVY1 wurde als Vektor für eine Expression in CHO-Zellen verwendet und wurde, wie in Fig. 4a gezeigt, wie folgt, konstruiert.
a) Die DNA des Vektors pAdD26SV(A) Nr. 3 [erhalten von Dr. H. Handa; hergestellt, wie bekannt aus der Veröffentlichung: Kaufman, R. J. und Sharp, P. A., Molecular and Cellular Biology, 2, 1304-1319 (1982)] wurde zuerst mit BglII gespalten, gefolgt von einer Phenol-Chloroform-Extraktion und einer Ethanol-Präzipitation. Das so erhaltene Präzipitat wurde in sterilem destilliertem Wasser gelöst, auf herkömmliche Weise unter Verwendung von Klenow-Enzym (Boehringer Mannheim) mit stumpfen Enden versehen, dann einer Phenol-Chloroform-Extraktion und einer Ethanol-Präzipitation unterworfen und in sterilem destilliertem Wasser gelöst. Sie wurde ferner selbstligiert unter Verwendung eines DNA-Ligation-Kit (Takara Shuzo). Die Ligationsmischung wurde verwendet, um kompetente E. coli HB101- Zellen zu transformieren. Plasmid-DNAs wurden aus Tetracyclinresistenten Transformanten erhalten. Ein Teil jeder dieser DNAs wurde mit BalII behandelt und auf einem 0,7% Agarose-gel einer Elektrophorese unterworfen. Auf diese Weise wurde ein Klon erhalten, der keinerlei BglII-Schnittstelle mehr aufwies, pAdD26SV(A) Nr. 3(N).
Die Plasmid-DNA wurde dann mit EcoRI verdaut, gefolgt von einer Phenol-Chloroform-Extraktion und einer Ethanol-Präzipitation. Das Präzipitat wurde in sterilem destilliertem Wasser gelöst und die EcoRI-Schnittstelle wurde unter Verwendung von Mungobohnen-Nuklease (Pharmacia) mit stumpfen Enden versehen, gefolgt von einer Phenol-Chloroform-Extraktion und einer Ethanol-Präzipitation. Das so erhaltene Präzipitat wurde in sterilem destilliertem Wasser gelöst.
b) Die pKSV10-DNA (Pharmacia) wurde auf übliche Weise mit den Restriktionsenzymen KpnI und BamHI geschnitten und dann unter Verwendung von T4-DNA-Polymerase (Takara Shuzo) und Klenow-Enzym mit stumpfen Enden versehen. Nach einer Elektrophorese auf einem 0,7% Agarosegel wurde der Gelabschnitt, der ein Fragment von ungefähr 2,9 kbp Größe enthielt, abgetrennt und die DNA durch Elektroelution wiedergewonnen.
c) Das wie oben unter 1) beschrieben erhaltene DNA- Fragment und das wie in oben unter 6) beschrieben erhaltene DNA-Fragment wurden miteinander unter Verwendung eines DNA- Ligation-Kits ligiert und die Ligationsmischung wurde verwendet, um kompetente E. coli HB101-Zellen zu transformieren.
Plasmid-DNAs wurden aus Tetracyclin-resistenten Transformanten durch ein übliches Verfahren hergestellt. Ein Teil jeder Plasmid-DNA wurde mit PstI verdaut und das Material aus dem Verdau wurde einer Elektrophorese auf einem 1,0% Agarosegel unterworfen. Auf diese Weise wurde das Plasmid pVY1 erhalten, das Banden von ungefähr 3,6 kbp, ungefähr 3,25 kbp und ungefähr 1,5 kbp liefert. Danach wurde pVY1 mit BalII gespalten und zur folgenden Konstruktion eines rekombinanten Plasmids eingesetzt.
pGEM2-3 wurde mit Eco0109I und StyI gespalten und mit einer an der StyI-Schnittstelle phosphorylierten synthetischen DNA der Formel (VIII) und einer an der Eco0109I- Schnittstelle phosphorylierten synthetischen DNA der Formel (IX) unter Verwendung von T4-DNA-Ligase ligiert.
Ein DNA-Fragment von 341 Basenpaaren wurde dann durch Agarosegelelektrophorese isoliert und gereinigt. Dieses DNA-Fragment wurde mit dem BglII-gespaltenen pVY1 unter Verwendung von T4- DNA-Ligase ligiert und die Ligationsmischung verwendet, um E. coli HB101 zu transformieren, um Tetracyclin-resistente Transformanten zu erhalten. Plasmide wurden daraus durch das alkalische bakteriolytische Verfahren hergestellt und unter Verwendung von Restriktionsenzymen (PstI etc.) analysiert und ein rekombinantes Expressionsplasmid für das fragliche Gen wurde selektiert.

1-2) Bestätigung einer Genexpression in CHO-Zellen:

DHFR-defiziente CHO-Zellen (s.o.) wurden mit dem auf die obengenannte Weise konstruierten Expressionsplasmid durch das Calciumphosphatverfahren transfiziert. Ein Transformantenstamm, der in einem selektiven Medium [MEM alpha (-), Gibco] in Anwesenheit von Methotrexat wachsen konnte, wurde erhalten und für die nachfolgenden Untersuchungen verwendet.
10&sup8; auf die vorstehend angegebene Weise transformierte CHO-Zellen wurden gezüchtet und der Kulturüberstand wurde einer Affinitätschromatographie unterworfen unter Verwendung einer monoklonalen anti-MACIF-Antikörper-Säule, die hergestellt wurde durch Binden eines gereinigten monoklonalen Maus-anti-humanen MACIF-Antikörpers an aktivierte Sepharose 4B (Pharmacia, Schweden). Die Säule wurde dann gründlich mit phosphatgepufferter physiologischer Kochsalziösung (PBS) mit 0,1 % NP40 und mit wäßriger 2 M Natriumchloridlösung mit 0,1 % NP40 gewaschen.
An diese Antikörpersäule gebundene Fraktionen wurden mit einer wäßrigen 3 M Natriumthiocyanatlösung eluiert. Jede Eluatfraktion wurde auf einer PD-10-Säule (Pharmacia) entsalzt und hinsichtlich des Vorliegens oder Fehlens von Antigen durch einen kompetitiven ELISA unter Verwendung eines gegen natürlich vorkommenden humanen MACIF gerichteten Kaninchen-Antikörpers untersucht. Als Ergebnis wurde bestätigt, daß ein humanes MACIF-Antigen in einer in der vorstehend aufgeführten Affinitätschromatographie "gebundenen" Fraktion vorlag.
Dieses Ergebnis beweist, daß ein humanes MACIF-Protein, das das Peptid bestehend aus dem 1. bis 86. Aminosäurerest umfaßt, erfolgreich in CHO-Zellen entsprechend der Erfindung exprimiert worden war.

2) Expression eines modifizierten humanen MACIF-Proteins (C77) in CHO-Zellen und Bestätigung von dessen biologischer Aktivität:

2-1) Konstruktion eines rekombinanten Plasmids für eine Genexpression in CHO-Zellen:

Das wie oben unter a), b) und c) beschrieben erhaltene Plasmid pVY1 wurde als Vektor für eine Genexpression in CHO- Zellen verwendet. pVY1 wurde mit BglII geschnitten und für die folgende Konstruktion eines rekombinanten Plasmids eingesetzt.
pGEM2-3 wurde mit Eco0109I und StyI gespalten und mit einem an der StyI-Schnittstelle phosphorylierten synthetischen DNA-Fragment der Formel (VIII) und einem an der Eco0109I- Schnittstelle phosphorylierten synthetischen DNA-Fragment der Formel (XI) unter Verwendung von T4-DNA-Ligase ligiert.
Ein DNA-Fragment von 314 Basenpaaren wurde dann durch Agarosegelelektrophorese isoliert und gereinigt. Dieses DNA-Fragment wurde mit dem BglII-gespaltenen pVY1 unter Verwendung von T4- DNA-Ligase ligiert und die Ligationsmischung verwendet, um E. coli HB101 zu transformieren, um Tetracyclin-resistente Transformanten zu erhalten. Plasmide wurden daraus durch das alkalische bakteriolytische Verfahren hergestellt und unter Verwendung von Restriktionsenzymen (PstI etc.) analysiert und ein rekombinantes, zu einer Expression des fraglichen Gens fähiges Plasmid Gen wurde selektiert.

2-2) Bestätigung einer Genexpression in CHO-Zellen:

DHFR-defiziente CHO-Zellen (s.o.) wurden mit dem auf die obengenannte Weise konstruierten Expressionsplasmid durch das Calciumphosphatverfahren transfiziert und eine Transformante, die in einem selektiven Medium [MEM alpha (-), Gibco] in Anwesenheit von Methotrexat wachsen konnte, wurde isoliert und für weitere Untersuchungen verwendet.
10&sup8; durch das vorstehend angegebene Verfahren transformierte CHO-Zellen wurden gezüchtet und der Kulturüberstand wurde einer Affinitätschromatographie unterworfen unter Verwendung einer monoklonalen anti-MACIF-Antikörper-Säule, indem auf dieselbe Weise, wie vorstehend unter (2)-1-2) beschrieben, verfahren wurde. An diese Antikörpersäule gebundene Fraktionen wurden mit einer wäßrigen 3 M Natriumthiocyanatlösung eluiert und die Eluatfraktionen wurden auf einer PD-10-Säule (Pharmacia) entsalzt und hinsichtlich des Vorliegens oder Fehlens von Antigen durch einen kompetitiven ELISA unter Verwendung eines Kaninchen-anti-MACIF-Antikörpers untersucht. Es wurde bestätigt, daß ein MACIF-Antigen in einer in der vorstehend aufgeführten Affinitätschromatographie "gebundenen" Fraktion vorlag.
Dieses Ergebnis zeigt, daß ein humanes MACIF-Protein, das das Peptid bestehend aus dem 1. bis 77. Aminosäurerest umfaßt, erfolgreich in CHO-Zellen exprimiert worden war.

2-3) Betätigung der biologischen Aktivität:

Eine Probe des aus dem aus einer Massenkultur der transformierten CHO-Zellen resultierenden Kulturüberstand durch das vorstehend unter (2)-2-2) beschriebene Aufreinigungsverfahren teilweise aufgereinigten humanen MACIF-Proteins C77 wurde einem Pufferaustausch gegen SGVB²&spplus; unterworfen, gefolgt von einem Nachweis einer die MAC-Bildung inhibierenden Aktivität, der wie folgt ausgeführt wurde:
Humaner C5-C6-Komplex (gefroren gelagert und vor Verwendung aufgetaut; C f) wurde aus humanem C5 und C6 durch das Verfahren von Dessauer et al. [Dessauer, A. et al., Acta Pathologica Microbiologica Scandinavia, Section C, Supplement 284, 92, 75-81 (1984)] hergestellt und mit einer Meerschweinchen- Erythrozytensuspension (10&sup7; Zellen/ml) gemischt und die Mischung bei 33ºC 5 min inkubiert. Dann wurde nach einer Zugabe von C7 die Inkubation für weitere 15 min weitergeführt, um einen Komplex aus Meerschweinchen-Erythrozyten und humanem Komplement C5-7 zu erhalten (nachfolgend bezeichnet als "ECS-7- Intermediat"). Die ECS-7-Intermediat-Suspension (1,5 x 10&sup8;/ml) wurde mit C8, C9 und einer Probenlösung gemischt, um ein Gesamtvolumen von 1 ml zu erhalten (1,5 x 10&sup7;/ml). Es wurde 1 h bei 37ºC inkubiert. Parallel dazu wurde eine auf dieselbe Weise, aber ohne Zugabe jeglicher Probenlösung hergestellte Kontrollsuspension gleichzeitig inkubiert. Die Reaktionsmischung wurde bei 2000 x g 5 min zentrifugiert und die Absorption des Überstands (bei 414 nm) zur Berechnung des Prozentsatzes an Hämolyse gemessen. Danach wurde die Anzahl von Stellen (Z) pro Erythrozyt durch das Verfahren von Hammer et al. [Hammer, C. H. et al., Journal of Biological Chemistry, 256, 3995-4005 (1981)] berechnet und das prozentuale Verhältnis des Z-Werts zu dem Z- Wert für die Kontrolle als Aktivitätsindex genommen. Wie in Fig. 9 gezeigt, zeigte das in CHO-Zellen exprimierte humane MACIF-Protein C77 eine dosisabhängige, die Bildung von MAC inhibierende Aktivität. Die inhibitorische Aktivität wurde durch einen monoklonalen Maus-Antikörper gegen natürlich vorkommenden, aus Erythrozyten gewonnenen, humanen MACIF neutralisiert.
Aus den vorstehend aufgeführten Ergebnissen ist klar, daß das in CHO-Zellen exprimierte und in das Medium sezernierte humane MACIF-Protein C77 dieselbe Aktivität aufweist wie der natürlich vorkommende, aus Erythrozyten gewonnene, humane MACIF.

3) Expression eines humanen MACIF-Proteins (C70) in CHO- Zellen und Bestätigung von dessen biologischer Aktivität:

3-1) Konstruktion eines rekombinanten Plasmids für eine Genexpression in CHO-Zellen:

Das Verfahren war dasselbe wie das unter (2)-1-1) Beschriebene mit der Ausnahme, daß ein an der Eco0109I-Schnittstelle phosphoryliertes DNA-Fragment der Formel (XIV) zur Konstruktion des Expressionsplasmids verwendet wurde.

3-2) Bestätigung einer Genexpression in CHO-Zellen:

Es wurde ein humanes MACIF-Antigen durch das Verfahren aus (2)-1-2) in dem aus mit dem obengenannten rekombinanten Vektor transformierten Zellen erhaltenen Kulturüberstand nachgewiesen. Dieses Ergebnis zeigt, daß ein humanes MACIF-Protein, das das Peptid bestehend aus dem 1. bis 70. Aminosäurerest umfaßt, erfolgreich in CHO-Zellen exprimiert worden war.

3-3) Bestätigung der biologischen Aktivität:

Die eine MAC-Bildung inhibierende Aktivität des in CHO- Zellen exprimierten humanen MACIF-Proteins (C70) wurde unter Verwendung des aus einer Massenkultur der transformierten CHO- Zellen erhaltenen Kulturüberstands gemessen, indem nach dem Verfahren aus (2)-2-3) vorgegangen wurde. Wie in Fig. 10 gezeigt, wies C70 eine dosisabhängige Aktivität auf.
Aus den vorstehend aufgeführten Ergebnissen ist es klar, daß das in CHO-Zellen exprimierte und in das Medium sezernierte humane MACIF-Protein (C70) dieselbe Aktivität aufweist wie natürlich vorkommender, aus Erythrozyten gewonnener, humaner MACIF.

Claims

1. Gen, das für ein Peptid mit der folgenden Aminosäuresequenz kodiert:

in der X H, Met oder die folgende Aminosäuresequenz ist:

und Y OH oder

oder

ist.

2. Rekombinanter Expressionsvektor, der ein Gen entsprechend Anspruch 1 umfaßt,

wobei das Gen in wirksamer Weise mit einer DNS für ein regulatorisches Gen gekoppelt ist, das in der Lage ist, eine Expression des Polypeptids zu ermöglichen.

3. Rekombinanter Expressionsvektor nach Anspruch 2, der in Wirtszellen repliziert und in diesen gehalten bzw. aufrechterhalten werden kann, in denen der Phosphatidylinositol- Anker (PI-Anker) an den C-Terminus von Polypeptiden angeheftet werden kann.

4. Zelle, die mit einem rekombinanten Expressionsvektor nach Anspruch 2 oder 3 transformiert worden ist.

5. Peptid, definiert durch die folgende Aminosäuresequenz:

in der

X H oder Met ist und

Y OH oder

oder

ist.

6. Peptid, definiert durch die folgende Aminosäuresequenz:

in der X H oder Met ist.