DE3689977T2

DE3689977T2 - Dns-sequenzen, rekombinante dns-moleküle und verfahren zur herstellung menschlicher lipocortinähnlicher polypeptide.

Info

Publication number: DE3689977T2
Application number: DE3689977T
Authority: DE
Inventors: Jeffrey Garwin; Kuo-Seng Huang; Blake Pepinsky; Daniel Schindler; Barbara Wallner
Original assignee: Biogen Inc
Current assignee: Biogen Inc
Priority date: 1985-01-10
Filing date: 1986-01-10
Publication date: 1994-10-27
Anticipated expiration: 2006-01-11
Also published as: JPH0789996A; JPH0787980A; ES8704184A1; FI863626A0; EP0209568A4; DK433686A; AU5318286A; AU601676B2; CN86100721A; DE3689977D1; DK433686D0; JPH07101994A; ATE108830T1; JPS62501679A; ES550784A0; JPH0787789B2; EP0209568A1; HUT40695A; WO1986004094A1; FI863626A

Description

Diese Erfindung betrifft DNA-Sequenzen, rekombinante DNA-Moleküle und Verfahren zur Herstellung von mindestens einem menschlichen Lipocortin *. Die Erfindung betrifft ferner DNA-Sequenzen und rekombinante DNA-Moleküle, die dadurch gekennzeichnet sind, daß sie mindestens ein menschliches, Lipocortin-ähnliches Polypeptid codieren. Dementsprechend können in den erfindungsgemäßen Verfahren Wirte, die mit diesen Sequenzen transformiert sind, zur Herstellung der erfindungsgemäßen, menschlichen, Lipocortin-ähnlichen Polypeptide verwendet werden. Diese Polypeptide besitzen entzündungshemmende Aktivität und sind in der Behandlung von arthritischen, allergischen, dermatologischen, ophthalmischen und Kollagen-Erkrankungen nützlich.
Arachidonsäure ist eine ungesättigte Fettsäure, d. h., ein Vorläufer in der Synthese von Verbindungen wie beispielsweise von Prostaglandinen, Hydroxysäuren und Leukotrienen, die an entzündlichen Reaktionen beteiligt sind. Sie wird durch die Aktivität der Phospholipase A&sub2; aus Phospholipiden der Membran freigesetzt. Als Antwort auf entzündungshemmende Wirkstoffe, beispielsweise Glucocorticoide, setzen bestimmte Zellen Proteine frei, die in vitro durch ihre Fähigkeit zur Hemmung der Phospholipase A&sub2; charakterisiert worden sind. Dementsprechend hemmen die Lipocortine die Synthese von Prostaglandinen und weiterer Endzündungen verursachender Stoffe durch Hemmung der Arachidonsäure- Produktion, wodurch die Entzündung nachläßt [Hirata, F. et * Lipocortin wird auch als Phospholipase-Inhibitor-Protein bezeichnet. Die Anmelder verwendeten in den Patentanmeldungen 712,376 und 690,146 den Begriff Phospholipase-Inhibitor-Protein als Bezeichnung für Lipocortin.
al., "A Phospholipase A&sub2; Inhibitory Protein In Rabbit Neutrophils Induced By Glucocorticoids", Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, Nr.5 (1980), 2533-36).
Bisher sind mehrere Proteine, die die Phospholipase A&sub2; hemmen können, untersucht worden. Eines von ihnen - Lipomodulin - ist als ein Protein mit einem Molekulargewicht von etwa 40 000 charakterisiert worden, das in der Zelle wahrscheinlich durch Proteasen zu zwei kleineren, aktiven Molekülen mit einem Molekulargewicht von etwa 30 000 und 15 000 abgebaut wird [Hirata, F. et al., "Identification Of Several Species Of Phospholipase Inhibitory Protein(s) By Radioimmunoassay For Lipomodulin", Biochem. Biophys. Res. Commun. 109 Nr. 1 (1982), 223-30). Weitere experimentelle Befunde weisen darauf hin, daß auch zwei weitere Inhibitoren der Phospholipase A&sub2;, Macrocortin (Molekulargewicht etwa 15 000) und Renocortin (zwei Moleküle mit Molekulargewichten von etwa 15 000 bzw. 30 000), Spaltprodukte von größeren Inhibitor-Proteinen sein dürften, beispielsweise von Lipomodulin [Cloix, J. F. et al., "Characterization And Partial Purification of Renocortins: Two Polypeptides Formed In Renal Cells Causing The Anti-Phospholipase-like Action Of Glucocorticoids", Br. J. Pharmac. 79 (1983), 313-21, und Blackwell, G. J. et al., "Macrocortin: A Polypeptide Causing The Anti-Phospholipase Effect Of Glucocorticoids", Nature 287 (1980), 147-49).
Obwohl Lipomodulin aus neutrophilen Zellen von Kaninchen, Macrocortin aus Makrophagen von Ratten und Renocortin aus renomedullären interstitiellen Zellen von Ratten isoliert wurden, zeigen die drei Proteine ähnliche biologische Eigenschaften, Molekulargewichte und Kreuzreaktivitäten mit monoclonalen Antikörpern gegen Lipomodulin oder Macroccrtin. Ferner werden alle durch Glucocorticoide induziert. Daher wird angenommen, daß diese die Phospholipase hemmenden Proteine oder Lipocortine eng miteinander verwandt sind und ihre Produktion durch Zellen ein durch Steroide bewirkter, üblicher, physiologischer Mechanismus ist [Rothhut, B. et al., "Further Characterization Of The Glucocorticoid-Induced Antiphospholipase Protein "Renocor-tin"", Biochem. Biophys. Res. Commun. 117, Nr. 3 (1983), 878-84).
Neue Befunde zeigen ebenfalls, daß das von Lipomodulin stammende Molekül mit einem Molekulargewicht von 15 000 durch Lymphocyten als Antwort auf Immunogene produziert wird und als ein Glycosylierungs-hemmender Faktor wirkt, der die Glycosylierung von IgE-bindenden Faktoren hemmt und die Unterdrückung der IgE-Antwort zur Folge hat [Uede, T. et al., "Modulation Of The Biologic Activities Of IgE-Binding Factors: I. Identification of Glycosylation- Inhibitory Factor As A Fragment Of Lipomodulin", J. Immunol. 130, Nr. 2 (1983), 878-84).
Aufgrund ihrer entzündungshemmenden Wirkungen sind Lipocortine bei der Behandlung von mit Entzündungen verbundenen Erkrankungen nützlich. Zu solchen Erkrankungen gehören arthritische, allergische, dermatologische, ophthalmische und Kollagen-Erkrankungen. Ferner können durch Verwendung dieser Proteine zur Behandlung von Entzündungen die Nachteile vermieden werden, die bisher im Zusammenhang mit den vorhandenen entzündungshemmenden Verbindungen auftreten.
Zwei Klassen von Verbindungen werden gegenwärtig für die entzündungshemmende Therapie verwendet: Corticosteroide und nicht-steroide entzündungshemmende Wirkstoffe. Corticosteroide werden üblicherweise aufgrund der schweren, mit ihrer Verwendung verbundenen Nebenwirkungen abgelehnt. Zu diesen Wirkungen gehören Hypertension, Magen-Darm-Blutungen, Muskelschwäche, Katarakte und Krämpfe. Daher werden nichtsteroide entzündungshemmende Verbindungen bevorzugt. Diese nicht-steroiden Verbindungen verursachen jedoch ebenfalls Nebenwirkungen, beispielsweise nachteilige Wirkungen auf die Physiologie des Magens und der Blutplättchen, auf das Zentralnervensystem und die Hämopoese. Ferner hemmen die meisten nicht-steroiden, entzündungshemmenden Wirkstoffe die Produktion von entzündlichen Stoffen auf nur einem der beiden Wege zur Produktion dieser Stoffe, d. h., entweder auf dem Weg der Cyclooxygenase oder dem der Lipoxygenase.
Lipocortine hemmen hingegen die Produktion von entzündlichen Stoffen auf beiden Wegen. Da Lipocortine nur Vermittler der Steroid-Wirkung sind, ist es außerdem unwahrscheinlich, daß sie die oft im Zusammenhang mit der Verwendung von Corticosteroiden auftretenden Nebenwirkungen verursachen. Da diese Inhibitor-Proteine von der Zelle produzierte natürliche Vermittler sind, ist es auch unwahrscheinlich, daß sie die üblicherweise im Zusammenhang mit vielen nicht-steroiden, entzündungshemmenden Wirkstoffen auftretenden Nebenwirkungen aufweisen.
Lipocortin kann Entzündungen auch auf einem alternativen Weg durch Hemmung der chemotaktischen Antwort von Leukocyten beeinflussen. Es ist gezeigt worden, daß bestimmte Peptide, deren Sequenzen die innerhalb des pp60-src- und MT-Antigens festgestellten Tyrosin-Phosphorylierungsstellen codieren, d. h., das src-Peptid und das MT-Peptid, die Chemotaxis von Kaninchen-Neutrophilen hemmen, die durch einen chemischen Lockstoff stimuliert worden sind [Hirata, F. et al., "Inhibition Of Leukocyte Chemotaxis By Glu-Glu- Glu-Glu-Tyr-Pro-Met-Glu And Leu-Ile-Glu-Asp-Asn-Glu-Tyr-Thr- Ala-Arg-Gln-Gly", Biochem. Biophys. Res. Comm. 18 (1984), 682-90). Lipocortin enthält eine ähnliche Sequenz innerhalb seiner Aminosäuresequenz (Glu-Asn-Glu-Glu-Gln-Glu-Tyr, Nummer 15 bis 21 K der Reste). Lipocortin kann daher mit Hilfe dieser Sequenz entzündungshemmend wirken, indem es das Eindringen von Neutrophilen und Makrophagen in entzündetes Gewebe hemmt oder blockiert.
Menschliche Lipocortine sind bisher jedoch nicht aus Zellen gereinigt worden. Selbst wenn ein Verfahren zur Reinigung von Lipocortinen entwickelt werden könnte, wäre es noch zweifelhaft, ob diese in ausreichenden Mengen für ihre zahlreichen klinischen und kommerziellen Verwendungen produziert werden könnten. Dementsprechend wären Verfahren, die die Herstellung von menschlichen Lipocortinen in klinisch nützlichen Mengen ermöglichen, in der entzündungshemmenden Therapie sehr vorteilhaft.
Erfindungsgemäß wird eine rekombinante DNA-Sequenz bereitgestellt, wie sie nach einem der Ansprüche von 1 bis 9 beansprucht wird.
Außerdem stellt die Erfindung einen transformierten einzelligen Wirt bereit, wie er in Anspruch 10 oder 11 beansprucht wird.
Ferner stellt die Erfindung ein Polypeptid bereit, wie es in einem der Ansprüche von 12 bis 16 beansprucht wird.
Die Erfindung stellt auch eine DNA-Sequenz bereit, wie sie in Anspruch 17 oder 18 beansprucht wird.
Die Erfindung stellt außerdem ein Verfahren bereit, wie es in Anspruch 19 beansprucht wird, und ein Arzneimittel, wie es in Anspruch 20 oder 21 beansprucht wird.
Die erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen werden ausgewählt aus der Gruppe, die aus den cDNA-Insertionen von λLC (ATCC Hinterlegungsnr. 68812) bestehen, DNA-Sequenzen, die an diese cDNA-Insertionen hybridisieren und bei der Expression ein menschliches Lipocortin-ähnliches Polypeptid codieren, DNA-Sequenzen, die ein menschliches Polypeptid mit einer die Phospholipase A&sub2; hemmenden Aktivität und einer immunologischen Aktivität des menschlichen Lipocortins, das von der λLC-Insertion (ATCC Hinterlegungsnr. 68812) codiert ist, codieren und DNA-Sequenzen, die aufgrund des genetischen Codes hinsichtlich der vorstehenden DNA-Insertion und Sequenzen degeneriert sind. Rekombinante DNA-Moleküle, die diese DNA-Sequenzen, damit transformierte Wirte und davon bei der Expression codierte menschliche, Lipocortin-ähnliche Poly-peptide enthalten, sind auch ein Teil der Erfindung.
Die DNA-Sequenzen, rekombinanten DNA-Moleküle, Wirte und Verfahren dieser Erfindung ermöglichen die Herstellung von menschlichen, Lipocortin-ähnlichen Polypeptiden zur Verwendung bei der Behandlung von arthritischen, allergischen, dermatologischen, ophthalmischen und Kollagen-Erkrankungen, sowie weiterer Erkrankungen, einschließlich entzündlicher Vorgänge.

Kurze Beschreibung der Figuren

Fig. 1 stellt die Aminosäuresequenzen von Fragmenten dar, die durch eine Bromcyan-Spaltung des von Ratten stammenden Inhibitor-Proteins der Phospholipase A&sub2; erhalten wurden.
Fig. 2 stellt die Aminosäuresequenzen von Fragmenten dar, die durch eine Trypsin-Spaltung des von Ratten stammenden Inhibitor-Proteins der Phospholipase A&sub2; erhalten wurden.
Fig. 3 stellt die vier Pools der chemisch synthetisierten Oligonucleotid-DNA-Sonden dar, die zur Suche nach den erfindungsgemäßen Lipocortin-DNA-Sequenzen verwendet wurden.
Fig. 4 stellt die Nucleotidsequenz der cDNA-Insertion von λLC (ATCC-Hinterlegungsnr. 68812) dar, die menschliches Lipocortin codiert. Die Figur stellt auch die abgeleitete Aminosäuresequenz des Lipocortin-Proteins dar. Die Zahlen unter der Aminosäuresequenz (z. B. 1, 30 und 346) stehen für die erste, dreißigste und letzte Aminosäure des Proteins ausgehend von der codierenden Sequenz des Gens.
Fig. 5 stellt in einem schematischen Überblick die Konstruktion von Plasmid pKK233.LIP.1 dar, das in einer Ausführungsform zur Expression der erfindungsgemäßen DNA- Sequenzen verwendet wird.
Fig. 6 stellt in einem schematischen Überblick die Konstruktion von Plasmid pLiptrc 155A (ATCC-Hinterlegungsnr. 68763) dar, das in einer Ausführungsform zur Expression der erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen verwendet wird.
Fig. 7 bis 9 stellen die Konstruktion von Plasmid pBg120 (ATCC-Hinterlegungsnr. 74106) dar, einem Hefe-Expressionsvektor zur Herstellung von menschlichem Lipocortin gemäß einer Ausführungsform dieser Erfindung.
Fig. 10 stellt eine SDS-Polyacrylamidgel-Analyse von Hefe-Rohlysaten dar. Spur a enthält gereinigtes, menschliches Lipocortin, das erfindungsgemäß in E. coli hergestellt worden ist. Spur b enthält Hefeextrakte ohne Plasmid. Spur d enthält Hefeextrakte, die pBg120 enthalten. Spuren c und e enthalten Hefeextrakte, die andere Plasmide ohne menschliches Lipocortin codierende DNA-Sequenzen enthalten.
Fig. 11 bis 13 stellen die Konstruktion von Plasmid pSVL9109 dar, einem Expressionsvektor für Säugerzellen zur Herstellung von menschlichem Lipocortin gemäß einer Ausführungsform dieser Erfindung.
Fig. 14 stellt eine SDS-Polyacrylamidgel-Analyse eines Plasmin-gespaltenen, dem menschlichen Lipocortin ähnlichen Polypeptids dar. Spuren a bis f stellen Proben dar, die 0, 5, 10, 20, 40 bzw. 120 Minuten nach Zugabe des Plasmins entnommen worden sind.
Fig. 15 stellt die Hemmung der Phospholipase A&sub2; dar, die durch Plasmin-Fragmente vom menschlichen, Lipocortinähnlichen Polypeptid nach der Fraktionierung durch Chromatographie mit einer Biogel-P-60-Säule bewirkt wurde.
Fig. 16 stellt die Aminosäuresequenzen von Fragmenten dar, die durch Trypsin-Spaltung von menschlichem, Lipocortin-ähnlichem Polypeptid erhalten wurden.
Fig. 17 stellt die Aminosäuresequenzen von Fragmenten dar, die durch Trypsin-Spaltung von Lipo-S und Lipo-L erhalten wurden.
Fig. 18 stellt die Hemmung der Phospholipase A&sub2; dar, die durch die Elastase-Fragmente von menschlichem Lipocortin-ähnlichem Polypeptid nach der Trennung durch SDS- Polyacrylamid-Gelelektrophorese bewirkt wurde.
Fig. 19 stellt die Aminosäuresequenzen von Fragmenten dar, die durch Trypsin-Spaltung von e-1, e-4 und e-5 erhalten wurden.
Fig. 20 stellt die mutagenen Oligonucleotide dar, die gemäß den erfindungsgemäßen Verfahren zur Herstellung von biologisch aktiven, Lipocortin-ähnlichen Polypeptid- Fragmenten durch DNA-Rekombinationstechnik verwendet wurden.
Fig. 21 ist eine schematische lineare Karte der Aminosäuresequenz des Lipocortins, wobei die Stellen, an denen Methionine vorkommen, entlang der Sequenz durch Zahlen angezeigt sind. Die Zahlen in Klammern zeigen Stellen an, an denen Metionine eingeführt werden können, um die erfindungsgemäßen Fragmente zu erhalten. Mehrere erfindungsgemäße Fragmente und ihre Molekulargewichte sind unterhalb der Karte dargestellt.
Fig. 22 stellt eine SDS-Polyacrylamidgel-Analyse von unbehandeltem und Bromcyan-behandeltem, menschlichem, Lipocortin-ähnlichem Polypeptid dar, das von Lipo 8 extrahiert wurde, wobei ein 26 kd-Fragment erkennbar ist.
Fig. 23 stellt in Bild A das bei 280 nm gemessene Absorptionsprofil von Lipocortin (Peak I) und N-Lipocortin (Peak II) nach der Fraktionierung mit Hilfe von hoch auflösender Mono-S-Kationenaustausch-Chromatographie dar. Bild B stellt die durch das eluierte Lipocortin und N-Lipocortin der Erfindung bewirkte Hemmung der Phospholipase A&sub2; als % Hemmung dar.
Fig. 24 stellt die Karte der Trypsinspaltung der Lipocortin- und N-Lipocortin-Proteine dar, die gemäß den erfindungsgemäßen Verfahren isoliert wurden.
Fig. 25 stellt die Karte der Trypsinspaltung von erfindungsgemäßem N-Lipocortin dar und stellt einen Zusammenhang zwischen den Peaks der Karte und den in diesen Peaks enthaltenen Aminosäuresequenzen der Peptidfragmente her.
Fig. 26 stellt die vier Pools der chemisch synthetisierten Oligonucleotid-DNA-Sonden dar, die zur Suche nach den erfindungsgemäßen N-Lipocortin-DNA-Sequenzen verwendet wurden.
Fig. 27 stellt die Nucleotidsequenz der cDNA-Insertion von pNLip1 dar.
Fig. 28 vergleicht die Nucleotidsequenz von Lipocortin und die N-Lipocortin-cDNA-Sequenzen dieser Erfindung. Das "X" in der Figur zeigt das Ende der codierenden Sequenz und den Beginn der 3'-seitigen, nicht-codierenden Sequenz der Gene an.

Genaue Beschreibung der Erfindung

Zum besseren Verständnis wird die hier beschriebene Erfindung nachstehend genauer erläutert.
In der Beschreibung werden die nachstehenden Begriffe verwendet:

Nucleotid

Eine monomere, aus einem Zuckermolekül (Pentose), einem Phosphat und einer Stickstoff-enthaltenden, heterocyclischen Base bestehende DNA- oder RNA-Einheit. Die Base ist mit dem Zuckermolekül über ein glycosidisches Kohlenstoffatom (1'-Kohlenstoffatom der Pentose) verbunden und diese Kombination einer Base und eines Zuckers wird ein Nucleosid genannt. Die Base charakterisiert das Nucleotid. Die vier DNA-Basen sind Adenin ("A"), Guanin ("G"), Cytosin ("C") und Thymin ("T"). Die vier RNA-Basen sind A, G, C und Uracil ("U").

DNA-Sequenz

Eine lineare Anordnung von Nucleotiden, die miteinander über Phosphodiesterbindungen zwischen dem 3'- und 5'-Kohlenstoffatom von benachbarten Pentosen verbunden sind.

Codon

Eine DNA-Sequenz von drei Nucleotiden (ein Triplett), die über ihre mRNA eine Aminosäure, ein Translations-Startsignal oder ein Translations-Terminationssignal codiert. Zum Beispiel codieren die Nucleotidtripletts TTA, TTG, CTT, CTC, CTA und CTG die Aminosäure Leucin ("Leu"), TAG, TAA und TGA sind Translations-Stopsignale und ATG ist ein Translations-Startsignal.

Leserahmen

Die Anordnung von Codons während der Translation von mRNA in Aminosäuresequenzen. Während der Translation muß der geeignete Leserahmen beibehalten werden. Beispielsweise kann die DNA-Sequenz GCTGGTTGTAAG in drei Leserahmen oder Phasen ausgedrückt werden, von denen jede eine andere Aminosäuresequenz liefert:
GCT GGT TGT AAG - Ala-Gly-Cys-Lys G CTG GTT GTA AG - Leu-Val-Val GC TGG TTG TAA G - Trp-Leu-(STOP)

Polypeptid

Eine lineare Anordnung von Aminosäuren, die untereinander über Peptidbindungen zwischen der α-Amino- und Carboxyl-Gruppe benachbarter Aminosäuren verbunden sind.

Peptidase

Ein Enzym, das Peptidbindungen hydrolysiert.

Genom

Die gesamte DNA einer Zelle oder eines Virus. Zu ihm gehört unter anderem das Strukturgen, das die Polypeptide der Substanz, sowie die Operator-, Promotor- und Ribosomen-Bindungs- und Interaktionssequenzen codiert, einschließlich von Sequenzen wie beispielsweise den Shine- Dalgarno-Sequenzen.

Gen

Eine DNA-Sequenz, die über ihre Matrize oder Messenger-RNA ("mRNA") eine Aminosäuresequenz eines spezifischen Polypeptids codiert.

Transkription

Der Vorgang, in dem mRNA von einem Gen oder einer DNA-Sequenz erzeugt wird.

Translation

Der Vorgang zur Produktion eines Polypeptids von einer mRNA.

Expression

Der Vorgang, den ein Gen oder eine DNA- Sequenz zur Produktion eines Polypeptids durchlaufen muß. Es ist eine Kombination von Transkription und Translation.

Plasmid

Eine nicht-chromosomale, doppelsträngige DNA Sequenz, die ein intaktes "Replicon" in der Weise umfaßt, daß das Plasmid in einer Wirtszelle repliziert wird. Wenn das Plasmid in einen einzelligen Organismus eingeführt wird, können als Folge der Plasmid-DNA die Eigenschaften dieses Organismus verändert oder transformiert werden. Zum Beispiel transformiert ein Plasmid, das das Gen für die Tetracyclin-Resistenz (Tet®) trägt, eine zuvor Tetracyclinempfindliche in eine dagegen resistente Zelle. Eine durch ein Plasmid transformierte Wirtszelle wird als "Transformante" bezeichnet.

Phage oder Bacteriophage

Bakterien-Viren, von denen viele aus DNA-Sequenzen bestehen, die in eine Proteinhülle oder einen Mantel ("Capsid") eingekapselt sind.

Cosmid

Ein Plasmid, das die "cohesive end" ("cos")- Stelle des Bakteriophagen λ enthält. Cosmide können aufgrund von vorhandenen "cos-Stellen" in λ-Hüllprotein verpackt und zur Infektion eines geeigneten Wirts verwendet werden. Aufgrund ihrer Kapazität für große Fragmente von Fremd-DNA sind Cosmide als Clonierungsvehikel nützlich.

Clonierungsvehikel

Ein Plasmid, eine Phagen-DNA, ein Cosmid oder eine andere DNA-Sequenz, die zur Replikation in einer Wirtszelle befähigt ist und die durch eine oder eine kleine Zahl von Endonuclease-Erkennungsstellen charakterisiert sind, an denen solche DNA-Sequenzen in einer vorherbestimmbaren Weise gespalten werden können, ohne daß dies mit dem Verlust von einer wesentlichen biologischen Funktion der DNA verbunden ist, z. B. der Replikation, Produktion von Hüllproteinen oder dem Verlust von Promotor- oder Bindungsstellen, und die einen Marker tragen, der für die Verwendung bei der Identifizierung von transformierten Zellen geeignet ist, z. B. eine Tetracyclin-Resistenz oder Ampicillin-Resistenz. Ein Clonierungsvehikel wird oft als Vektor bezeichnet.

Clonieren

Das Verfahren zum Erhalt einer Population von Organismen oder DNA-Sequenzen, die von einem solchen Organismus oder von einer solchen Sequenz durch asexuelle Reproduktion abstammen.

Rekombinante DNA-Moleküle oder Hybrid-DNA

Ein Molekül, das aus DNA-Segmenten von verschiedenen Genomen besteht, die außerhalb von lebenden Zellen über ihre Enden miteinander verbunden worden sind und die Fähigkeit aufweisen, in lebenden Zellen erhalten zu bleiben.

Expressions-Kontrollsequenz

Eine Sequenz von Nucleotiden, die die Expression von Genen kontrolliert und steuert, wenn sie mit solchen Genen funktionell verbunden ist. Zu ihr gehören das lac-System, β-Lactamase-System, trp- System, die tac- und trc-Systeme, die wichtigsten Operator- und Promotorregionen des Phagen λ, die Kontrollregion des fd-Hüllproteins, die frühen und späten Promotoren von SV40, die vom Polyoma-Virus und Adenovirus stammenden Promotoren, der Metallothionin-Promotor, der Promotor der 3-Phosphoglycerat-Kinase oder anderer glycolytischer Enzyme, die Promotoren der sauren Phosphatase, z. B. Pho5, die Promotoren der α-Paarungsfaktoren der Hefe und weitere Sequenzen, von denen man weiß, daß sie die Expression von Genen von prokaryotischen oder eukaryotischen Zellen und ihrer Viren und deren Kombinationen kontrollieren. Für Säugerzellen kann das Gen mit einem eukaryotischen Promotor verbunden sein, beispielsweise dem für die frühe Region von SV40, der an das die Dihydrofolat-Reduktase codierende Gen gekuppelt ist, und selektiv in Ovariumzellen des Chinesischen-Hamsters amplifiziert werden, um eine Zellinie herzustellen, die viele Kopien von aktiv transkribierten eukaryotischen Genen enthält.

Lipocortin-ähnliches Polypeptid

Ein Polypeptid, das eine biologische oder immunologische Aktivität eines Lipocortins zeigt. Dieses Polypeptid kann neben den Aminosäuren eines nativen Lipocortins weitere Aminosäuren oder nicht alle Aminosäuren des nativen Lipocortins einschließen. Ferner kann es ein N-terminales Methionin enthalten. Lipocortin wird auch als Phospholipase-Inhibitor-Protein bezeichnet.
Die vorliegende Erfindung betrifft DNA-Sequenzen und rekombinante DNA-Moleküle, die menschliche Lipocortin-ähnliche Polypeptide codieren, sowie Verfahren zur Herstellung dieser Polypeptide.
Obwohl mehrere Verfahren zur Selektion und DNA- Clonierung hätten verwendet werden können, um eine erfindungsgemäße DNA-Sequenz zu isolieren und zu clonieren, wurde in einer erfindungsgemäßen Ausführungsform eine Selektionsstrategie gewählt, die auf dem Phospholipase A&sub2;-Inhibitor- Protein von Ratten beruhte. Dementsprechend wurde Phospholipase A&sub2;-Inhibitor-Protein von Ratten aus dem extrazellulären Überstand von Bauchhöhlenexsudat von Ratten isoliert und die Aminosäuresequenz von unterschiedlichen Fragmenten dieses Proteins ermittelt. Ausgehend von diesen Proteinsequenzen wurden mehrere Anti-Sense-Oligonucleotid-DNA- Sonden synthetisiert, die den Regionen von gereinigtem Rattenprotein entsprachen, die eine minimale Nucleotid- Degenerierung aufwiesen. Die Sonden wurden anschließend verwendet, um eine menschliche cDNA-Bank abzusuchen, die E. coli-Zellen umfaßte, die in einen Phagen-Clonierungsvektor inserierte, menschliche Makrophagen-cDNA-Sequenzen enthielten.
Zum Absuchen wurden die Oligonucleotid-Sonden unter Verwendung eines Plaque-Hybridisierungs-Screening-Tests an die menschliche cDNA-Bank hybridisiert, und es wurden Clone selektiert, die an mehrere der Sonden hybridisierten. Nach Isolierung und Subclonierung der ausgewählten menschlichen cDNA-Insertionen in Plasmide wurden ihre Nucleotidsequenzen ermittelt und mit den Aminosäuresequenzen der Peptide von gereinigtem Ratten-Lipocortin verglichen. Als Ergebnis dieses Vergleichs wurde festgestellt, daß die Nucleotidsequenzen sämtlicher isolierter Clone Aminosäuresequenzen codierten, die eine deutliche Homologie zu den Aminosäuresequenzen des gereinigten Ratten-Lipocortins aufwiesen (Vergleiche die Fig. 1 und 2 mit Fig. 4). Es wurde festgestellt, daß mindestens einer der isolierten Clone die vollständige, menschliches Lipocortin codierende Sequenz enthielt.
Die cDNA-Sequenzen dieser Erfindung können mit Expressions-Kontrollsequenzen funktionell verbunden und in unterschiedlichen Säugerzellen oder anderen eukaryotischen oder prokaryotischen Wirtszellen verwendet werden, um die durch sie codierten menschlichen, Lipocortin-ähnlichen Polypeptide zu produzieren. Es wurden beispielsweise Vektoren mit hoher Expressionsrate zur Herstellung eines menschlichen 37 kd-Lipocortins konstruiert.
Ferner sind die erfindungsgemäßen cDNA-Sequenzen als Sonden zum Absuchen menschlicher cDNA-Banken nach anderen, Lipocortin-ähnliche Polypeptide codierenden Sequenzen nützlich. Die erfindungsgemäßen cDNA-Sequenzen sind auch als Sonden zum Absuchen menschlicher, genomischer DNA-Banken zur Selektion menschlicher, genomischer DNA-Sequenzen, die Lipocortin-ähnliche Polypeptide codieren, nützlich. Diese genomischen Sequenzen, wie die vorstehend beschriebenen erfindungsgemäßen cDNA-Sequenzen, sind dann zur Produktion durch sie codierter Lipocortin-ähnlicher Polypeptide nützlich. Die genomischen Sequenzen sind besonders bei der Transformation von Säugerzellen zur Produktion von menschlichen, Lipocortin-ähnlichen Polypeptiden nützlich.
Gemäß einer zweiten Ausführungsform der Erfindung wurde aus menschlicher Plazenta ein menschliches Lipocortinähnliches Polypeptid isoliert, das eine strukturelle Ähnlichkeit, d. h., Aminosäure-Homologie, zum erfindungsgemäßen rekombinanten 37 kd-Lipocortin aufweist. Dieses Protein zeigt auch eine die Phospholipase A&sub2; hemmende Aktivität. Das Protein erhielt die Bezeichnung N-Lipocortin. Lipocortin und N-Lipocortin sind diskrete Proteine, die durch Trypsin-Kartierung chemisch definiert worden sind. Die Aminosäuresequenzen von mehreren Fragmenten von N-Lipocortin wurden bestimmt, und ausgehend von diesen Sequenzen wurden anti-Sense-Oligonucleotid-DNA-Sonden synthetisiert. Diese Sonden wurden zum Absuchen einer menschlichen cDNA-Bank verwendet, die E. coli-Zellen umfaßte, die in einen Phagen- Cloniervektor inserierte menschliche Plazenta-cDNA-Sequenzen enthielten. Es wurden mehrere Clone isoliert, die an die Sonden hybridisierten. Nach der Einführung der cDNA- Insertion von einem dieser Clone in ein Plasmid wurde die Nucleotidsequenz der cDNA-Insertion bestimmt. Sie codierte einen Teil von N-Lipocortin.
Diese cDNA-Sequenz ist als eine Sonde zum Absuchen menschlicher cDNA-Banken nach anderen Sequenzen, die N- Lipocortin-ähnliche Polypeptide codieren, nützlich. Diese cDNA-Insertion kann beispielsweise zum Absuchen der erfindungsgemäßen menschlichen Plazenta-cDNA-Bank nach der N- Lipocortin-codierenden, die vollständige Länge aufweisenden Sequenz verwendet werden. In einer anderen Ausführungsform sind die Oligonucleotid-Sonden, die zum Erhalt der partiellen erfindungsgemäßen N-Lipocortin-cDNA-Sequenz verwendet wurden, als Sonden zum erneuten Absuchen der Plazenta-Bank nach der N-Lipocortin-codierenden, die vollständige Länge aufweisenden Sequenz nützlich. Ferner können die erhaltenen N-Lipocortin-cDNA-Sequenzen oder die hier beschriebenen Sonden zur Isolierung anderer Teile des N-Lipocortin-Gens verwendet werden, und das vollständige Gen kann durch im Stand der Technik bekannte Standardverfahren rekonstruiert werden. Schließlich können die Sonden oder cDNA-Sequenzen als Primer zur Synthese von codierenden, die vollständige Länge aufweisenden Sequenzen verwendet werden.
Die erfindungsgemäßen cDNA-Sequenzen von N-Lipocortin sind auch als Sonden zum Absuchen menschlicher, genomischer DNA-Banken zur Selektion menschlicher, genomischer DNA- Sequenzen, die N-Lipocortin-ähnliche Polypeptide codieren, nützlich. Diese genomischen Sequenzen, wie die cDNA- Sequenzen von N-Lipocortin, sind dann zur Produktion von N- Lipocortin-ähnlichen Polypeptiden in mit diesen Sequenzen transformierten Wirten nützlich.
Eine weitere erfindungsgemäße Ausführungsform betrifft die Herstellung von biologisch aktiven, menschlichen, Lipocortin-ähnlichen Polypeptid-Fragmenten, die eine bessere Charakterisierung des aktiven Zentrums des Lipocortin- Proteins und die Entwicklung von Molekülen ermöglichen, die einen optimalen therapeutischen Wert aufweisen. Dementsprechend wurden solche Fragmente durch Behandlung der erfindungsgemäßen Lipocortin-ähnlichen Polypeptide mit mehreren Proteasen erzeugt. Solche biologisch aktiven Fragmente wurden auch durch DNA-Rekombinationsverfahren erzeugt.
Die durch die erfindungsgemäßen Verfahren produzierten menschlichen, Lipocortin-ähnlichen Polypeptide sind als entzündungshemmende Wirkstoffe und in entzündungshemmenden Verfahren und Therapien nützlich. Beispielsweise können solche Zusammensetzungen eine Menge eines erfindungsgemäßen Lipocortin-ähnlichen Polypeptids, das eine Entzündung pharmazeutisch wirksam reduzieren kann, und einen pharmazeutisch verträglichen Träger umfassen. Zu solchen Therapien gehört üblicherweise ein Verfahren zur Behandlung von Patienten mit diesen Zusammensetzungen auf eine pharmazeutisch geeignete Art und Weise.

Verfahren und Materialien

Zur Clonierung oder Expression der erfindungsgemäß hergestellten DNA-Sequenzen für menschliche, Lipocortin-ähnliche Polypeptide können viele unterschiedliche Wirt/Clonierungsvehikel-Kombinationen verwendet werden. Beispielsweise können nützliche Clonierungs- oder Expressionsvehikel aus Segmenten von chromosomalen, nicht-chromosomalen und synthetischen DNA-Sequenzen bestehen, beispielsweise aus mehreren bekannten Derivaten von SV40 und bekannten bakteriellen Plasmiden, z. B. Plasmiden von E. coli, einschließlich colE1, pCR1, pBR322, pMB9 und ihre Derivate, Plasmiden mit einem breiteren Wirtsspektrum, z. B. RP4, Phagen-DNA- Moleküle, z. B. die zahlreichen Derivate des Phagen λ, z. B. NM 989, und anderen DNA-Phagen, z. B. M13 und filamentäre, einzelsträngige DNA-Phagen und Vektoren, die von Kombinationen von Plasmiden und Phagen-DNA-Molekülen stammen, beispielsweise von Plasmiden, die modifiziert worden sind, um Phagen-DNA oder andere Expressions-Kontrollsequenzen aufzunehmen, oder Hefe-Plasmide, beispielsweise das 2u- Plasmid oder seine Derivate.
Innerhalb jedes spezifischen Clonierungs- oder Expressionsvehikels können mehrere Stellen zur Insertion der erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen für menschliche, Lipocortinähnliche Polypeptide ausgewählt werden. Diese Stellen erhalten üblicherweise die Bezeichnung der sie spaltenden Restriktionsendonuclease und sind dem Fachmann gut bekannt. Ferner sind mehrere Verfahren gut bekannt, mit denen DNA- Sequenzen unter Bildung von rekombinanten DNA-Molekülen in diese Stellen inseriert werden können. Diese schließen beispielsweise ein dG-dC- oder dA-dT-Tailing ein, eine direkte Ligierung, synthetische Linker, Exonuclease- und Polymerasegebundene Reparaturreaktionen mit anschließender Ligierung, oder eine Verlängerung des DNA-Stranges mit DNA-Polymerase und einer geeigneten einzelsträngigen Matrize mit anschließender Ligierung. Es versteht sich natürlich, daß ein in dieser Erfindung nützliches Clonierungs- oder Expressionsvehikel keine Stelle einer Restriktionsendonuclease zur Insertion des gewählten DNA-Fragments aufweisen muß. Stattdessen könnte das Vehikel durch alternative Verfahren mit dem Fragment verbunden werden.
Es können außerdem mehrere Expressions-Kontrollsequenzen gewählt werden, um die erfindungsgemäßen DNA- Sequenzen zu exprimieren. Zu diesen Expressions-Kontrollsequenzen gehören beispielsweise das lac-System, β-Lactamase-System, trp-System, tac-System, trc-System, die wichtigsten Operator- und Promotorregionen des Phagen λ, die Kontrollregion des fd-Hüllproteins, der Promotor der 3-Phosphoglycerat-Kinase oder anderer glycolytischer Enzyme, die Promotoren der sauren Phosphatase, z. B. Pho5, die Promotoren der α-Paarungsfaktoren der Hefe, Promotoren für Säugerzellen, beispielsweise der frühe Promotor von SV40, der späte Promotor von Adenovirus und der Metallothionin- Promotor und weitere Sequenzen, von denen bekannt ist, daß sie die Expression von Genen von prokaryotischen oder eukaryotischen Zellen oder ihrer Viren und deren Kombinationen kontrollieren. In Säugerzellen ist es außerdem möglich, die Expressions-Einheiten zu amplifizieren, indem das Gen mit dem für die Dihydrofolat-Reduktase verbunden und über ovariale Wirtszellen des Chinesischen-Hamsters selektiert wird.
Diese erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen werden zur Expression mit einer oder mehreren der vorstehend beschriebenen Expressions-Kontrollsequenzen im Expressionsvektor funktionell verknüpft. Eine solche funktionelle Verknüpfung, die vor oder nach der Insertion der gewählten, menschlichen, Lipocortin-DNA-Sequenz in ein Clonierungsvehikel durchgeführt werden kann, ermöglicht die Kontrolle und Unterstützung der Expression der DNA-Sequenz durch die Expressions-Kontrollsequenzen.
Die Entscheidung für den Vektor oder das Expressionsvehikel und insbesondere für die zur Insertion des selektierten DNA-Fragments ausgewählten Stellen und für die in dieser Erfindung verwendeten Expressions-Kontrollsequenz richtet sich nach mehreren Faktoren, beispielsweise der Zahl der für ein bestimmtes Restriktionsenzym empfindlichen Stellen, der Größe des zu exprimierenden Proteins, den Charakteristika der Expression, beispielsweise der Lage von Start- und Stopcodons relativ zu den Vektorsequenzen, und weiteren Faktoren, die dem Fachmann bekannt sind. Die Wahl eines Vektors, einer Expressions-Kontrollsequenz und Insertionsstelle für eine bestimmte Lipocortin-Sequenz wird durch Abwägen dieser Faktoren entschieden, da nicht jede Wahl in einem bestimmten Fall gleich wirksam ist.
Es sollte auch selbstverständlich sein, daß die die erfindungsgemäßen, Lipocortin-ähnlichen Polypeptide codierenden DNA-Sequenzen, die an der ausgewählten Stelle eines Clonierungs- oder Expressionsvektors inseriert sind, Nucleotide, die nicht Teil des eigentlichen, das gewünschte Lipocortin codierenden Gens sind, oder nur ein Fragment des gesamten Gens des Proteins einschließen können. Es ist nur erforderlich, daß unabhängig von der verwendeten DNA-Sequenz ein transformierter Wirt ein Lipocortin-ähnliches Polypeptid produziert. Die erfindungsgemäßen, Lipocortin-verwandten DNA-Sequenzen können beispielsweise in einem erfindungsgemäßen Expressionsvektor im gleichen Leserahmen an mindestens einen Teil einer DNA-Sequenz fusioniert werden, die mindestens ein eukaryotisches oder prokaryotisches Trägerprotein codiert, oder an eine DNA-Sequenz, die mindestens eine eukaryotische oder prokaryotische Signalsequenz codiert oder an Kombinationen davon. Solche Konstruktionen können die Expression der gewünschten, Lipocortin-verwandten DNA-Sequenz unterstützen, die Aufreinigung verbessern oder die Sekretion aus der Wirtszelle und vorzugsweise die Reifung des Lipocortin-ähnlichen Polypeptids ermöglichen. Die Lipocortin-verwandte DNA-Sequenz kann in einer anderen Ausführungsform ein ATG-Startcodon einschließen, allein oder zusammen mit anderen Codons, die direkt mit der Sequenz, die die erste Aminosäure eines reifen, nativen, Lipocortin-ähnlichen Polypeptids codiert, fusioniert sind. Solche Konstruktionen ermöglichen beispielsweise die Herstellung von einem Methionyl oder einem anderen Peptidyl-Lipocortinähnlichen Polypeptid, das ein Teil dieser Erfindung ist. Dieses N-terminale Methionin oder Peptid kann anschließend durch mehrere bekannte Verfahren intra- oder extrazellulär gespalten oder das Polypeptid kann zusammen mit dem an das Peptid gebundene Methionin in entzündungshemmenden Zusammensetzungen und Verfahren dieser Erfindung verwendet werden.
Das Clonierungsvehikel oder der Expressionsvektor, der die das erfindungsgemäße, Lipocortin-ähnliche Polypeptid codierenden Sequenzen enthält, wird erfindungsgemäß zur Transformation eines geeigneten Wirts verwendet, damit dieser Wirt das von der DNA-Sequenz codierte, Lipocortin-ähnliche Polypeptid exprimieren kann.
Zu den zur Clonierung oder Expression nützlichen Wirten gehören Stämme von E. coli, beispielsweise E. coli W3110IQ, E. coli JA221, E. coli C600, E. coli ED8767, E. coli DHI, E. coli LE392, E. coli HB101, E. coli X1776, E. coli X2282, E. coli MRCI und Stämme von Pseudomonas, Bacillus und Streptomyces, Hefen und andere Pilze, tierische Wirte, beispielsweise CHO-Zellen oder Mauszellen, weitere tierische (einschließlich menschliche) Wirte, gezüchtete Pflanzenzellen oder andere Wirte.
Die Wahl eines geeigneten Wirts ist auch von mehreren im Stand der Technik bekannten Faktoren abhängig. Zu diesen gehören beispielsweise die Kompatibilität mit dem gewählten Vektor, die Toxizität der vom Hybridplasmid codierten Proteine, die Empfindlichkeit des gewünschten Proteins gegen proteolytischen Abbau durch Enzyme der Wirtszelle, die Verunreinigung oder Bindung des zu exprimierenden Proteins durch Proteine der Wirtszelle, die bei der Reinigung schwer zu entfernen sind, die Einfachheit der Gewinnung des gewünschten Proteins, die Charakteristika der Expression, die biologische Sicherheit und die Kosten. Diese Faktoren müssen gegeneinander abgewogen werden, wobei berücksichtigt werden muß, daß nicht alle Wirt-Vektor-Kombinationen bei der Clonierung oder Expression eines bestimmten rekombinanten DNA-Moleküls gleich wirksam sind.
Es sollte selbstverständlich sein, daß zu den menschlichen, Lipocortin-ähnlichen (in diesen Wirten erfindungsgemäß produzierten) Polypeptiden Polypeptide in Form von Fusionsproteinen gehören können (z. B. an prokaryotische, eukaryotische oder mit einem N-Terminus kombinierte Abschnitte gebunden, um die Ausscheidung zu lenken, die Stabilität zu erhöhen, die Reinigung zu verbessern oder die mögliche Abspaltung des N-terminalen Bereichs zu verbessern), in Form eines Vorläufers von Lipocortin-ähnlichen Polypeptiden (z. B. beginnend mit der gesamten oder Teilen einer Lipocortin-ähnlichen Polypeptid- Signalsequenz oder anderen eukaryotischen oder prokaryotischen Signalsequenzen), in Form eines reifen, Lipocortin-ähnlichen Polypeptids oder in Form eines Met- Lipocortin-ähnlichen Polypeptids.
Eine besonders nützliche erfindungsgemäße Form eines Polypeptids, oder wenigstens eines Vorläufers davon, ist ein reifes Lipocortin-ähnliches Polypeptid mit einer leicht abspaltbaren Aminosäure oder mehreren Aminosäuren, die an den Amino-Terminus angefügt sind. Eine solche Konstruktion ermöglicht die Synthese des Proteins in einem geeigneten Wirt, in dem ein im reifen Lipoprotein nicht vorhandenes Startsignal benötigt wird, und anschließend die Abspaltung der zusätzlichen Aminosäuren in vivo oder in vitro, um reife, Lipocortin-ähnliche Polypeptide herzustellen. Solche Verfahren sind im Stand der Technik vorhanden. Vgl., z. B. die US-Patente 4,332,892, 4,338,397 und 4,425,437. Die Polypeptide können auch glycosyliert sein, wie einige native Lipocortine, unglycosyliert sein oder ein anderes Glycosylierungsmuster als native Lipocortine aufweisen. Eine solche Glycosylierung erfolgt durch die Wirtszelle oder durch eine für das bestimmte Lipocortin ausgewählte Behandlung nach der Expression.
Zu den erfindungsgemäßen Polypeptiden gehören auch biologisch aktive Polypeptid-Fragmente, die durch Behandlung von Lipocortin-ähnlichen Polypeptiden mit Proteasen oder durch Expression eines ein Lipocortin-ähnliches Polypeptid codierenden Fragments der DNA-Sequenz erhalten werden. Zu den erfindungsgemäßen Polypeptiden gehören auch Lipocortinähnliche Polypeptide, die bei der Expression von DNA- Sequenzen codiert sind, die durch unterschiedliche Codons im Hinblick auf einige oder alle Codons der betreffenden DNA- Sequenzen gekennzeichnet sind. Diese substituierten Codons können Aminosäuren codieren, die mit den von den ersetzten Codons codierten identisch sind, die jedoch eine höhere Ausbeute des Polypeptids liefern. In einer anderen Ausführungsform kann der Austausch eines oder einer Kombination von Codons, der den Austausch einer Aminosäure oder ein längeres oder kürzeres Lipocortin-ähnliches Polypeptid zur Folge hat, seine Eigenschaften in einer nützlichen Weise verändern (z. B. die Stabilität, die Löslichkeit oder therapeutische Aktivität erhöhen).
Zum besseren Verständnis dieser Erfindung werden die nachstehend beschriebenen Beispiele angeführt. Diese Beispiele dienen nur der Veranschaulichung und sollen nicht so ausgelegt werden, daß sie den Schutzbereich der Erfindung in irgendeiner Weise einschränken.

Beispiele

A. Reinigung des Ratten-Phospholipase A&sub2;-Inhibitor-Proteins

Männlichen Wistar-Ratten (200-250 kg) wurden subcutan 0,1 ml des Glucocorticoids Dexamethason-Phosphat (1,25 mg/kg Ratte) in 0,9% NaCl injiziert, um die Produktion des Phospholipase A&sub2;-Inhibitor-Proteins zu induzieren. Anschließend wurden die Ratten eine Stunde nach der Injektion durch eine intracardiale Injektion mit Euthasat getötet und die Bauchfellhöhlen mit 10 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung (50 mM KH&sub2;PO&sub4;, pH-Wert 7,3, 150 mM NaCl, die 2 E/ml Heparin und 50 uM Phenylmethylsulfonylfluorid enthielt) gewaschen. Nachdem die Waschflüssigkeiten von Zellen und anderen partikulären Stoffen durch 30 minütige Zentrifugation in einer Zentrifuge von International bei Höchstgeschwindigkeit gereinigt worden waren, wurden die vereinigten Überstände auf Lipocortin getestet, indem die Hemmung der Freisetzung von markierter Ölsäure aus autoklavierten E. coli-Membranen in Gegenwart des Überstandes und der Phospholipase A&sub2; der Bauchspeicheldrüse vom Schwein gemessen wurde.
Dieser in vitro-Test wurde wie nachstehend beschrieben durchgeführt: 200 ul Proben wurden aus dem Überstand der Bauchhöhlenexsudate in 1,5 ml Eppendorf-Röhrchen mit 50 ul 0,7 M Tris-HCl (pH-Wert 8,0) und 60 mM CaCl&sub2;-Puffer auf Eis gemischt. Es wurden 50 ul verdünnter Phospholipase A&sub2; der Schweine-Bauchspeicheldrüse (Katalognr. P9139, Sigma-Chemicals) zugesetzt, gemischt und die Lösungen eine Stunde auf Eis inkubiert. Die Suspension der Phospholipase A&sub2; wurde mit 2,5 mg/ml Rinderserumalbumin (BSA) enthaltendem Puffer (70 mM Tris-HCl (pH-Wert 8,0), 6 mM CaCl&sub2;) so verdünnt, daß die Endkonzentrationen von Phospholipase und BSA 100 ng/50 ul bzw. 125 ug/50 ul waren. Anschließend wurden 25 ul autoklavierte, mit ³H-Ölsäure markierte E. coli als Substrat zugesetzt und die Gemische 8 Min. bei 6ºC inkubiert (sowohl die Temperatur als auch die Inkubationsdauer müssen für jede verwendete Charge von E. coli ermittelt werden).
Das Substrat aus mit ³H-Ölsäure-markierten E. coli wurde wie nachstehend beschrieben hergestellt: Eine E. coli- Kultur wurde über Nacht in Trypton-Medium gezüchtet (1% Bactotrypton, 0,5% NaCl), mit frischer Brühe 1 : 20 verdünnt und das Zellwachstum mit einem Klett-Meßgerät überwacht. Bei einer Anzeige von 40 (d. h., bei gutem Wachstum der Zellen), wurde eine 1 : 100 Verdünnung von Br&ijlig;-35 (Polyoxyethylen-23- ether, Sigma-Chemicals, 10% Lösung in Wasser) und eine 1 : 200 verdünnte ³H-Ölsäure (9,10-³H-[N]-Ölsäure, New England Nuclear) mit 10 mCi/ml zugesetzt. Nach 5 Std., wenn das Zellwachstum nachließ, wurde die Suspension 20 Min. bei 120ºC autoklaviert und die Flasche über Nacht bei 4ºC aufbewahrt. Anschließend wurden die Bakterien 30 Min. bei 4ºC durch Zentrifugation in einem SS34-Rotor mit 16 000 UpM pelletiert und die lockeren Pellets in einem einzigen Röhrchen vereinigt. Die Bakterien wurden viermal oder solange mit Suspensionspuffer (0,7 M Tris-HCl (pH-Wert 8,0), 10 mM CaCl&sub2;) sowie 0,1% BSA gewaschen, bis nur noch wenige Zerfälle im Überstand vorhanden waren. Die Bakterien wurden bei 4ºC in 0,2% Natriumazid enthaltendem Suspensionspuffer aufbewahrt. Üblicherweise wurde eine mit 20 mCi ³H-Ölsäure markierte 400 ml Kultur hergestellt. Diese ergab in den markierten Bakterien etwa 7·10&sup8; cpM oder etwa 10% der zugesetzten Zerfälle. Für jeden Punkt in einem Test wurden 100 000 cpM verwendet, die in einem Volumen von 25 ul zugesetzt wurden. Unmittelbar vor der Verwendung wurden die Aliquots zunächst in 200 mM Tris-HCl (pH-Wert 8,0) und 12 mM EDTA (30 Min. auf Eis stehengelassen) und anschließend in 25 mM Tris-HCl (pH-Wert 8,0) gewaschen.
Nach kurzer Inkubation des Substrats (autoklavierte markierte E. coli) mit dem Inhibitor sowie der Phospholipase A&sub2; wurde die Umsetzung durch Zusatz von 100 ul 2 N HCl zu jedem Röhrchen mit einer anschließenden Zugabe von 100 ul 20 mg/ml entfettetem BSA (99% Albumin, Sigma-Chemicals) sofort gestoppt. Die Röhrchen wurden gevortext und 30 Min. auf Eis inkubiert. Der letztere Schritt war zur Extraktion des Lipase-Abbauproduktes aus den partikulären Membranen äußerst wichtig.
Anschließend wurden die E. coli in einer Eppendorf- Zentrifuge 5 Min. mit 10 000 g pelletiert und 250 ul jedes Überstandes in 4 ml eines mit wäßrigen Lösungen verträglichen Scintillations-Cocktails ausgezählt. In diesem Test wurde jede Probe unter Verwendung einer internen Kontrolle, in der die Probe sowie das E. coli-Substrat sowohl in Gegenwart als auch in Abwesenheit von zugesetzter Phospholipase inkubiert wurden, doppelt getestet. Dieser in vitro-Test zeigte, daß die Bauchhöhlenexsudate eine die Phospholipase hemmende Aktivität enthielten.
Zur Reinigung des Lipocortins von dem vorstehend beschriebenen Überstand der Bauchhöhlenexsudate wurden dem Überstand zunächst weitere Protease-Inhibitoren zugesetzt. Zu diesen gehörten üblicherweise Aprotinin (20 ug/ml), Soyabohnen-Trypsin-Inhibitor (20 ug/ml) und EGTA (Ethylenglycol-bis-(aminoethylether) -N,N'-tetraessigsäure) (0,5 mM). Das Exsudat wurde 1 Std. bei 37ºC in Gegenwart von 0,1 E/ml alkalischer Phosphatase aus Kälberdarm inkubiert und durch Ultrafiltration unter Verwendung eines Amicon-Geräts (PM10-Membran) zu einer Protein-Endkonzentration von 5 mg/ml zweifach konzentriert. Als nächstes wurde der Überstand über Nacht bei 4ºC gegen 40 Volumina 20 mM Tris-HCl (pH-Wert 8,1) dialysiert und eine DE52-Ionenaustausch-Säulenchromatographie (Whatman Ltd., Abmessungen der Säule: 1 cm Durchmesser·17 cm) durchgeführt. Vor der Verwendung wurde das DE52-Harz mit 25 mM Tris-HCl (pH-Wert 8,1) äquilibriert. Die durchfließenden Fraktionen wurden gesammelt und durch Amicon-Ultrafiltration (PM10-Membran) zusätzlich 25fach konzentriert. Anschließend wurde das Konzentrat durch eine Gelfiltrationssäule (P150-Harz) in 25 mM Tris-HCl geleitet (Abmessungen der Säule: 2,5 cm Durchmesser·40 cm) und die Fraktionen der Säule unter Verwendung der Absorption bei 280 nm und des vorstehend beschriebenen Phospholipase- Inhibitions-Aktivitätstests auf Protein überprüft. Die höchste Aktivität wurde bei einem Molekulargewicht von 35 000 bis 40 000 nachgewiesen.
Diese Fraktionen mit hoher Aktivität wurden gefriergetrocknet, gegen 25 mM 0,2% SDS enthaltendes Tris-HCl (pH- Wert 6,8) dialysiert und unter Verwendung eines präparativen SDS-Polyacrylamidgels (Hauptgel: 15% Acrylamid, 0,08% Methylen-bis-acrylamid; Sammelgel: 7,6% Acrylamid, 0,21% Methylen-bis-acrylamid) analysiert. Die Gelanalyse ergab vier Hauptproteinbanden. Mittels einer Modifikation des Western-Blot-Verfahrens [Towbin, H. et al., "Electrophoretic Transfer Of Proteins From Polyacrylamide Gels To Nitrocellulose Sheets", Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76 (1979), 4350-54) unter Verwendung eines Meerrettich- Peroxidase-Antikörper-Konjugats zur Sichtbarmachung der immunreaktiven Moleküle wurde festgestellt, daß nur eine der vier Hauptbanden mit einem neutralisierenden, gegen ein Schlangengift-Lipocortin hergestellten Antikörper kreuzreagierte. Dementsprechend wurde dieser Bereich des Gels ausgeschnitten, elektroeluiert und das darin enthaltene Protein mit 20% Trichloressigsäure ausgefällt und 20 Min. durch Zentrifugation mit 10 000 g pelletiert. Nachdem die Pellets zweimal mit 5 ml -20ºC kaltem Aceton gewaschen worden waren, wobei auf jedes Waschen ein Zentrifugationsschritt folgte, wurden die Pellets im Vakuum getrocknet.
Anschließend wurde das Protein entweder mit Bromcyan oder mit Trypsin gespalten. Bei Verwendung der Bromcyan- Spaltung wurden die etwa 100 ug Protein enthaltenden Pellets 16 Std. bei 25ºC im Dunkeln mit 200 mg/ml Bromcyan in 0,5 ml 70% Ameisensäure gespalten. Anschließend wurde das Reaktionsgemisch mit Wasser 15fach verdünnt und gefriergetrocknet. Bei Verwendung der Trypsin-Spaltung wurden die Pellets zuerst in 0,1 M NH&sub4;HCO&sub3; sowie 0,1 mM CaCl&sub2; resuspendiert, das Gemisch mit Iodessigsäure carboxymethyliert und anschließend 24 Std. bei 37ºC mit Trypsin inkubiert. Während dieser Inkubation wurde dreimal Trypsin bis zu einer Endkonzentration von 1,5% des Gesamtproteins zur Zeit Null, 2,5% nach 4 Std. und 3,5% nach 19 Std. zugesetzt.
Die Spaltfragmente dieser Spaltungen wurden bei den Produkten der Bromcyan-Spaltung unter Verwendung einer C8- Säule (Brownlee RP-3) und bei den Produkten der Trypsin- Spaltung unter Verwendung einer C18-Säule (Spectraphysics) durch Hochdruckflüssigkeits-Chromatographie gewonnen, wobei zur Elution gebundener Fragmente in beiden Fällen ein Acetonitril-Gradient von 0 bis 75% in 0,1% Trifluoressigsäure verwendet wurde. Anschließend wurde mit den Peak- Fraktionen unter Verwendung eines Gasphasen-Sequenzierers (Applied-Biosystems 470A) eine Sequenzanalyse durchgeführt. Die PITH-Aminosäuren wurden durch Hochdruckflüssigkeits- Chromatographie auf einer 5 um Cyano-Säule (Hypersil) unter Verwendung eines Gradienten aus Acetonitril:Methanol (4 : 1) von 15 bis 55% in 0,02 M Natriumacetat (pH-Wert 5,7) analysiert.
Fig. 1 stellt die Aminosäuresequenzen der Fragmente dar, die durch Bromcyan-Spaltung des gereinigten Ratten- Lipocortins produziert worden sind. Von sechs Haupt-Peaks ergaben nur drei eindeutige Sequenzen (CNBr 1, 2 und 3). Diese Sequenzen sind unterhalb von Fig. 1 dargestellt. Von den verbleibenden Peaks enthielten zwei (CNBr 5 und 6) Fragmentgemische und konnten daher nicht sequenziert werden, und Peak 4 war ein Säulen-Artefakt, in dem kein Protein nachgewiesen werden konnte.
Fig. 2 stellt die Aminosäuresequenzen von Fragmenten der Trypsin-Spaltung dar. Obwohl die Trypsin-Spaltung mehr als vierzig Peaks produzierte, sind in Fig. 2 nur die Aminosäuresequenzen von neun Fraktionen dargestellt. Wenn Peaks mehr als ein Peptid enthielten, wurde mit den entsprechenden Fraktionen ein zweiter Chromatographie-Schritt durchgeführt. T22a und T22b sind Sequenzen, die von zwei Komponenten von Peak 22 stammten, die aufgelöst wurden, wenn Peak 22 auf der gleichen Säule, jedoch bei einem neutralen pH-Wert, erneut chromatographiert wurde.

B. Synthese der Oligonucleotid-DNA-Sonden für die Lipocortin-Proteinsequenzen

Nach der Bestimmung der Aminosäuresequenzen von unterschiedlichen Regionen eines Ratten-Lipocortins (vgl. die Fig. 1 und 2) wurden vier Pools von Anti-Sense- Oligonucleotid-DNA-Sonden, die einige dieser Proteinsequenzen (vgl. Fig. 3) codierten, chemisch synthetisiert. Es wurde entschieden, die vier in Fig. 3 dargestellten Pools zu synthetisieren, da sie den eine minimale Nucleinsäure- Degeneration aufweisenden Regionen des Ratten-Lipocortins entsprachen. Für jede Aminosäuresequenz wurden Gemische von Sonden, die allen möglichen Codons komplementär waren, synthetisiert. Ferner wurden die Sonden so synthetisiert, daß sie den die Aminosäuresequenz codierenden DNA-Sequenzen komplementär waren, d. h., die Sonden waren anti-sense, damit die Sonden die entsprechenden Sequenzen sowohl in der mRNA als auch in der DNA erkennen konnten. Die Aminosäuresequenzen der vier ausgewählten Bereiche des Ratten- Lipocortins und alle möglichen sie codierenden Nucleotid- Codon-Kombinationen sind in Fig. 3 dargestellt. Die Degeneration des Codes ist wie nachstehend beschrieben dargestellt: N = C, T, A oder G; R = A oder G; Y = C oder T und H = A, C oder T.
Zwei Pools der Sonden, die von Sequenzen in den Trypsin-gespaltenen Fragmenten T22a und T24 von Fig. 2 abgeleitet wurden, sind 20-mere mit 48 bzw. 256facher Degeneration. Die beiden anderen Sonden-Pools sind 17-mere mit 64 und 128facher Degeneration. Zur weiteren Verminderung der Degeneration in den Sonden, wurde jeder Pool in Subpools hergestellt, z. B. wurden die 48fach degenerierten 20-mere von T22a in drei Subpools von 16 hergestellt und die anderen Sonden in vier Subpools synthetisiert. Die Sonden in jedem Pool wurden mit ³²P unter Verwendung von [γ]-³²P-ATP und T4- Polynucleotid-Kinase endmarkiert.
Um zu testen, ob die synthetischen Sonden tatsächlich menschliche Sequenzen erkennen, wurden die vier Subpools von T24 unter Verwendung des Northern-Blot-Verfahrens an GeneScreen-Filter hybridisiert, die Poly (A)&spplus;-mRNA aus der menschlichen Makrophagen-Zellinie U937 enthielten, die mit 10&supmin;&sup7; M PMA [4β-Phorbol-12β-myristat-13α-acetat) und 10&supmin;&sup5; Dexamethason induziert worden waren [Lehrach, H. et al., Biochemistry 10 (1977), 4743-51). Die Subpools 2 und 3 von T24 hybridisierten an die mRNA und wurden durch Autoradiographie als eine Bande von 1800 Basenpaaren nachgewiesen.

C. Konstruktion und Absuchen einer menschlichen cDNA-Bank

Eine menschliche cDNA-Bank wurde aus Poly(A)&spplus;-mRNA konstruiert, die aus der menschlichen Makrophagen-Zellinie U937 isoliert worden war. Die cDNA-Sequenzen wurden in gt10 inseriert und in E. coli C600-hfl-Zellen vermehrt.

1. Extraktion von RNA aus menschlichen U937-Zellen

Menschliche Makrophagen-U937-Zellen wurden während der Züchtung mit Dexamethason (10&supmin;&sup5; M) und Phorbolestern (10&supmin;&sup7; M) induziert und die 1,2·10&sup9; Zellen enthaltenden Pellets durch Vortexen in 48 ml Lysispuffer (0,2 M Tris-HCl (pH-Wert 8,0), 0,1 M LiCl, 25 mM EDTAf 1% SDS) sowie 5 mM Vanadyl-Komplex (Bethesda Research Labs) resuspendiert. Die Zellen wurden durch Zusatz von 24 ml Phenol lysiert und 5 Min. gevortext. 24 ml Chloroform wurden dem Lysis-Gemisch zugesetzt, worauf 10 Min. geschüttelt wurde. Die organischen und wäßrigen Phasen wurden in einer klinischen Zentrifuge durch 10-minütige Zentrifugation bei Raumtemperatur getrennt. Die wäßrige Phase wurde erneut zweimal mit Phenol:Chloroform (1 : 1), anschließend zweimal nur mit Chloroform extrahiert. Die Nucleinsäuren wurden anschließend bei -20ºC über Nacht in 0,3 M Natriumacetat mit Ethanol ausgefällt und 20 Min. bei 4ºC in einer Sorvall RC2B-Zentrifuge (SS34-Rotor) mit 14 000 UpM pelletiert. Die Pellets wurden in 5 ml 0,3 M Natriumacetat-Puffer resuspendiert und die Nucleinsäure erneut wie vorstehend beschrieben mit Ethanol ausgefällt. Das zuletzt erhaltene Pellet wurde in 300 ul H&sub2;O resuspendiert und bei -20ºC aufbewahrt. Die Poly(A)&spplus;-RNA wurde in dieser RNA-Präparation angereichert, indem sie durch eine Oligo(dT)-Cellulosesäule (PL Biochem.) geleitet wurde.

2. Konstruktion einer U937-cDNA-λgt10-Bank

cDNA-Synthese

Die cDNA wurde aus 20 ug wie vorstehend beschrieben isolierter Poly(A)&spplus;-mRNA synthetisiert. Die Poly(A)&spplus;-mRNA wurde auf 500 ug/ml in H&sub2;O verdünnt, 3 Min. auf 65ºC erhitzt, in einem Trockeneis-Propanol-Bad schnell abgekühlt und anschließend aufgetaut. Die RNA wurde anschließend einem Reaktionsgemisch zugesetzt, das aus 0,1 M Tris-HCl (pH-Wert 8,3) bei 42ºC, 0,01 M MgCl&sub2;, 0,01 M DTT, 1 mM dCTP, 1 mM dGTP, 1 mM dTTP, 0,5 mM dATP und 100 uCi α-³²P-ATP (3000 Ci/mmol, Amersham oder New England Nuclear), 20 ug Oligo(dT)&sub1;&sub2;&submin;&sub1;&sub8; (PL-Biochem), 0,03 M β-Mercaptoethanol, 5 mM Vanadyl-Ribonucleosid-Komplex (Bethesda Research Labs) und 169 E AMV-Reverse-Transcriptase (Seikagaku America) bestand. Das Endvolumen des Reaktionsgemisches war 200 ul. Dieses Gemisch wurde 2 Min. bei Raumtemperatur und 6 Std. bei 44ºC inkubiert. Die Umsetzung wurde durch Zusatz von 1/10 Vol. 0,5 M Na&sub2;EDTA (pH-Wert 8,0) beendet.
Das Reaktionsgemisch wurde auf 0,15 M NaOH eingestellt und das Gemisch 12 Std. bei 37ºC inkubiert, worauf mit 1/10 Vol. 1 M Tris-HCl (pH-Wert 8,0) und HCl neutralisiert wurde. Dieses wurde mit Phenol:Chloroform-gesättigtem TE-Puffer (10 mM Tris-HCl (pH-Wert 7,0) und 1 mM Na&sub2;EDTA) extrahiert. Die wäßrige Phase wurde durch eine sterile 5 ml Plastikpipette chromatographiert, die eine Füllung aus Sephadex G150 von 7·29 cm in 0,01 M Tris-HCl (pH-Wert 7,4), 0,4 M NaCl, 0,01 M Na&sub2;EDTA und 0,05% SDS enthielt. Die ersten Peaks wurden ohne die anschließenden Schwanzfraktionen vereinigt und die cDNA bei -20ºC mit 2,5 Vol. 95% Ethanol ausgefällt. Diese Umsetzung lieferte 1 ug einzelsträngiger cDNA.

Synthese des Doppelstrangs

Die einzelsträngige cDNA wurde in 200 ul (Endvol.) 0,1 M Hepes (pH-Wert 6,9), 0,01 M MgCl&sub2;&sub1; 0,0025 M DTT, 0,07 M KCl, 1 mM dXTPs und 75 E Klenow-Fragment der DNA-Polymerase I (Boehringer-Mannheim) resuspendiert und das Reaktionsgemisch 21 Std. bei 14ºC inkubiert. Die Umsetzung wurde durch Zusatz von Na&sub2;EDTA (pH-Wert 8,0) bis zu 0,0125 M beendet, wie im ersten Schritt der Herstellung von cDNA mit Phenol:Chloroform extrahiert und die wäßrige Phase auf einer G150-Säule in 0,01 M Tris-HCl (pH-Wert 7,4), 0,1 M NaCl, 0,01 M Na&sub2;EDTA und 0,05% SDS chromatographiert. Die radioaktiven Peaks wurden erneut ohne die Schwanzfraktionen vereinigt und die DNA mit Ethanol ausgefällt.
Die erhaltene DNA wurde anschließend 1 Std. bei 37ºC mit 42 E Reverse Transkriptase in 50 ul 0,1 M Tris-HCl (pH- Wert 8,3), 0,01 M MgCl&sub2;, 0,01 M DTT, 0,1 M KCl, 1 mM dXTPs, 0,03 M β-Mercaptoethanol inkubiert, um die Doppelstrang- Synthese zum Abschluß zu bringen. Die Umsetzung wurde beendet und wie vorstehend beschrieben weiter verarbeitet.
Die während der Doppelstrang-Synthese gebildete Haarnadelschleife wurde wie nachstehend beschrieben gespalten: Das Pellet wurde erneut in 50 ul 0,03 M Natriumacetat (pH-Wert 4,5), 0,3 M NaCl und 0,003 M ZnCl&sub2; gelöst und 30 Min. bei Raumtemperatur mit 100 E Si-Nuclease (Sigma) behandelt. Die Umsetzung wurde durch Zusatz von EDTA beendet und wie vorstehend beschrieben weiter verarbeitet. Die Ausbeute nach der S&sub1;-Behandlung war 900 ng dsDNA.
Um nach der S&sub1;-Nuclease-Spaltung mit Sicherheit glatte Enden zu erhalten, wurde die DNA 90 Min. bei 14ºC mit Klenow in 0,01 M Tris-HCl (pH-Wert 7,4), 0,01 M MgCl&sub2;, 1 mM DTT, 0,05 M NaCl, 80 uM dXTP und 12,5 E Klenow in 60 ul behandelt, mit Phenol:Chloroform (50 : 50) extrahiert und auf einer G50-"Spin"-Säule (1 ml Spritze) in 0,01 M Tris-HCl (pH-Wert 7,4), 0,1 M NaCl, 0,01 M EDTA und 0,05% SDS chromatographiert.
Die dsDNA wurde anschließend 20 Min. bei 37ºC durch Behandlung der DNA mit EcoRI-Methylase in 30 ul Endvol. 0,1 M Tris-HCl (pH-Wert 8,0), 0,01 M Na&sub2;EDTA, 24 ug BSA, 0,005 M DTT, 30 uM S-Adenosylmethionin und 5 E EcoRI-Methylase methyliert. Die Reaktionslösung wurde 10 Min. auf 70ºC erhitzt, abgekühlt, mit Phenol:Chloroform (50 : 50) extrahiert und auf einer G50-"Spin"-Säule, wie vorstehend beschrieben, chromatographiert.
Die 900 ng cDNA wurden 32 Std. bei 14ºC unter Einhaltung der nachstehend beschriebenen Bedingungen an phosphorylierte EcoRI-Linker (New England Biolabs) ligiert: 0,05 M Tris-HCl (pH-Wert 7,8), 0,01 M MgCl&sub2;&sub1; 0,02 M DTT, 1 mM ATP, 50 ug/ml BSA, 0,5 ug Linker, 300 E T4-DNA-Ligase in 7,5 ul Endvolumen.
Die Reaktionslösung wurde auf 0,1 M Tris-HCl (pH-Wert 7,5), 0,05 M NaCl, 5 mM MgCl&sub2;, 100 ug/ml BSA, 125 E EcoRI (New England Biolabs) eingestellt, das Gemisch 2 Std. bei 37ºC inkubiert, mit Phenol:Chloroform (50 : 50) extrahiert und auf einer G50-"Spin"-Säule, wie vorstehend beschrieben, chromatographiert.
Die cDNA wurde in 100 ul 0,01 M Tris-HCl (pH-Wert 7,5), 0,1 M NaCl und 1 mM EDTA erneut gelöst und auf einer 1· 50 cm Biogel A50 (BIORAD)-Säule chromatographiert, die im gleichen Puffer ausgiebig gewaschen worden war (zur Entfernung von Inhibitoren der Ligierung). Aliquots der Fraktionen wurden durch ein 1% Agarosegel in TBE-Puffer (0,089 M Tris-HCl, 0,089 M Borsäure und 2,5 mM Na&sub2;EDTA) geleitet, getrocknet und über Nacht bei -70ºC exponiert. Sämtliche Fraktionen, die größer als 500 Basenpaare waren, wurden vereinigt und die DNA zur Clonierung in einen EcoRI- gespaltenen λgt10-Clonierungsvektor mit Ethanol ausgefällt. Die nach Größe fraktionierende Säule lieferte 126 ng cDNA mit einer durchschnittlichen Größe von etwa 1500 bp.

Konstruktion der Bank

5 ug EcoRI-gespaltener λgt10 wurden mit 20 ng cDNA und T4-DNA-Ligase-Puffer 15 Min. bei 42ºC inkubiert, um die cos-Sites aneinanderzulagern, worauf 5 Sek. in einer Eppendorf-Zentrifuge zentrifugiert wurde und ATP bis zu 1 mM und 2400 E T4-DNA-Ligase (New England Biolabs) in einem Endvolumen von 50 ul zugesetzt wurden. [Vgl. Huynh, Young und Davis, "Constructing And Absuchen cDNA Libraries in gt10 And λgt11", in: DNA Cloning: A Practical Approach (D. Glover, Hrsg.), IRL Press (Oxford 1984)). Das Ligierungsgemisch wurde über Nacht bei 14ºC inkubiert. Das gt10-cDNA- Ligierungsgemisch wurde unter Verwendung eines Amersham Verpackungsgemisches [Amersham-Verpackungs-Protokol) in Phagen-Partikel verpackt und mit 0,5 ml SM-Puffer (100 mM NaCl, 10 mM MgSO&sub4;, 50 mM Tris-HCl (pH-Wert 7,5) und 0,01% Gelatine) verdünnt.
E. coli C600-hfl-Zellen wurden anschließend zur Herstellung einer cDNA-Bank mit 1·10&sup7; unabhängigen Rekombinanten mit diesen Phagen-Partikeln infiziert [vgl. Maniatis, T. et al., Molecular Cloning, S. 235 (Cold Spring Harbor 1982)).
Zur Plattierung und Amplifikation der Bank wurden 1 ml der Zellen sowie 250 ul Verpackungsgemisch 15 Min. bei Raumtemperatur inkubiert, in LB sowie MgSO&sub4; und Top-Agarose bei 50ºC auf 50 ml verdünnt und auf LB-Mg-Nunc-Platten plattiert. Dies ergab eine Plaque-Dichte von 2·10&sup5; pro Platte. Die Platten wurden etwa 8 Std. bei 37ºC inkubiert, bis die Plaques sich beinahe berührten.
Die Platten wurden mit 50 ml kaltem SM-Puffer (0,01 M Tris-HCl (pH-Wert 7,5), 0,01 M MgCl&sub2;, 0,1 mM Na&sub2;EDTA) übergossen und über Nacht bei 4ºC auf einem Rundschüttler eluiert. Die eluierten Fraktionen wurden in 250 ml-Flaschen vereinigt und 10 Min. in einer Sorvall-G5A-Zentrifuge mit 6k abgeschleudert. Die Überstände wurden 3 Std. mit einem gleichen Volumen kaltem 20% PEG 4000-2 M NaCl in Eis behandelt und die Phagen durch Zentrifugation mit 4k in einem H4000-Rotor in einer RC-3B-Sorvall-Zentrifuge 30 Min. pelletiert. Von den Phagen-Pellets wurde sorgfältig die Flüssigkeit entfernt, sie wurden in 60 ml SM resuspendiert und zur Entfernung von Debris in einer 5534-Zentrifuge mit 10 000 UpM abgeschleudert. Die Überstände wurden durch Zusatz von 7 g CsCl zu 10 ml Überstand auf 3,5 M CsCl eingestellt. Die Phagen-Banden wurden durch 18-stündige Zentrifugation bei 15ºC in einem 70.1-Beckman-Rotor mit 50 000 UpM erhalten. Die Phagen-Banden wurden vereinigt und bei 4ºC als Vorrats-Genbank aufbewahrt. Der erhaltene Titer war 2,2 ·10¹³ PFU/ml.

Absuchen der Bank

Die Bank wurde unter Verwendung des Plaque-Hybridisierungs-Screening-Verfahrens von Woo [Woo, S. L. C.,"A Sensitive And Rapid Method For Recombinant Phage Screening", Methods In Enzymology 68 (Academic Press 1979), 389-96] mit unseren markierten Oligonucleotid-Sonden, Pool 2 und 3, nach Lipocortin-Sequenzen abgesucht.
Eine Übernachtkultur C600-hfl-Zellen in L-Nährlösung und 0,2% Maltose wurde pelletiert und in einem gleichen Volumen SM-Puffer resuspendiert. 2·10&sup5; Phagen-Partikel wurden 15 Min. bei Raumtemperatur an 0,9 ml Zellen präadsorbiert. Die Suspension wurde bei 55ºC in LB sowie 10 mM MgSO&sub4; und 0,7% Agarose auf 50 ml verdünnt und auf LB-Mg- Nunc-Platten plattiert. 10 solcher Platten wurden abgesucht. Die Platten wurden etwa 8 Std. bei 37ºC inkubiert, bis sich die Plaques beinahe berührten. Die Platten wurden anschließend 1 Std. auf 4ºC abgekühlt, damit die Agarose erhärten konnte. Die GeneScreen-Plus-Filter wurden 10 Min. bei Raumtemperatur mit einer 1 : 10-Verdünnung der Übernachtkultur von E. coli C600-hfl-Zellen getränkt, so daß jeder Filter von einem Rasen aus E. coli-Zellen bedeckt wurde. Anschließend wurden die λ-Phagen-Partikel der Platten mit den Plaques der Genbank, wie nachstehend beschrieben, auf diese mit Bakterien beschichteten Filter übertragen:
Die Filter wurden 5 Min. auf die Platten gelegt, die die rekombinanten Plaques enthielten, anschließend abgenommen und 5 Std. bei 37ºC mit der Phagen-enthaltenden Seite nach oben auf LB + 10 mM MgSO&sub4;-Platten inkubiert.
Diese Filter wurden daraufhin lysiert, indem sie 5 Min. auf eine Flüssigkeit aus 0,5 N NaOH gegeben wurden, anschließend auf 1 M Tris-HCl (pH-Wert 7,0) neutralisiert, in 1 M Tris-HCl (pH-Wert 7,0) getaucht und die Zelltrümmer abgewischt.
Die Filter wurden in 0,2% Polyvinylpyrrolidon (M.G. 40 000), 0,2% Ficoll (M. G. 40 000), 0,2% Rinder- Serumalbumin, 0,05 M Tris-HCl (pH-Wert 7,5), 1 M Natriumchlorid, 0,1% Natriumpyrophosphat, 1% SDS, 10% Dextransulfat (M. G. 500 000) und denaturierter DNA von Lachssperma (≥ 100 ug/ml) gemäß den Angaben des Herstellers (New England Nuclear) für Plaque-Screen-Membranen an die Oligonucleotid-Sonden 2 und 3 vorhybridisiert und hybridisiert. Die hybridisierenden λ-cDNA-Sequenzen wurden durch Autoradiographie nachgewiesen.
Mit Hilfe dieses Verfahrens wurden 20 positive Plaques ausgewählt und unter Verwendung der gleichen Sonden bei geringerer Dichte erneut abgesucht.
Die DNA dieser Clone wurde isoliert, mit EcoRI gespalten und mit den vier Pools von Ratten-Lipocortin-Sonden unter Verwendung des Southern-Blot-Verfahrens [Southern, E.
M., "Detection Of Spezific Sequences Among DNA Fragments Separated By Gel Electrophoresis", J. Mol. Biol. 98 (1975), 503-18] hybridisiert. Zwei der Clone, λ9-111 und λ4-211, enthielten inserierte cDNA, die nicht nur an die T24-Sonde, sondern auch an die T22a- und T29-Sonde hybridisierten.
Die DNAs dieser Phagen wurden mit EcoRI gespalten und die cDNA-Insertionen isoliert. Durch Restriktion des Clons 9-111 mit EcoRI wurde ein 1400-Basenpaar-Fragment erhalten, während bei Restriktion des Clons 4-211 drei EcoRI-Fragmente mit 1300, 300 und 75 Basenpaaren entstanden. Einige dieser Fragmente wurden in das Plasmid pUC13 subcloniert, um die rekombinanten Plasmide pL9/20 (9-111), pL4/10 groß (4-211, 1300 Bp) und pL4/10 klein (4-211, 300 Bp) herzustellen. Diese Plasmide wurden anschließend durch das Verfahren von Maxam und Gilbert [Maxam, A. M. und Gilbert, W., "A New Method For Sequencing DNA", Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74 (1977), 560-64] sequenziert. Diese Sequenzanalyse zeigte, daß die Clone Nucleotidsequenzen enthielten, die den Aminosäuresequenzen des gereinigten Ratten-Lipocortins entsprachen, denen jedoch anscheinend der größte Teil der 5'- seitigen Sequenz fehlte.
Ein 480 bp EcoRI-BglII-Fragment von pL9/20 wurde als Sonde verwendet, um die U937-λgt10-Bank erneut abzusuchen. 72 positive wurden isoliert und durch erneutes Absuchen bei geringerer Dichte partiell von Plaques gereinigt. Die DNA von jedem dieser Positiven wurde mit HhaI gespalten und durch das Southern-Blot-Verfahren [Southern, E. M., a. a. O.] unter Verwendung eines Oligonucleotids mit einer Sequenz aus 306 (Lipo 16) als Sonde analysiert. Lipo 16 entspricht der Sequenz, die am Basenpaar 81-111 der in Fig. 4 dargestellten Sequenz beginnt. Vierzehn dieser Clone zeigten ein positives Signal und wurden durch genomische Sequenzierung [Church, G. und Gilbert, W., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 (1984), 1991] durch Spaltung der DNA mit MspI und unter Verwendung von Lipo 16 als Sonde weiter analysiert. Sieben Clone, λL110, λL106, λL112, λLC, λLH, λLN und λLDD, enthielten eine 81 Basenpaar-Sequenz 5'-seitig zur Sequenz der Lipo 16-Sonde.
Diese Clone enthielten cDNA-Sequenzen mit einem ununterbrochenen offenen Leserahmen, der 363 Aminosäuren (vgl. Fig. 4) codiert. Es wird angenommen, daß das an den Nucleotiden 52 bis 54 von Fig. 4 gelegene ATG das initiierende ATG-Codon für Lipocortin ist. Der DNA-Sequenz des in Fig. 4 dargestellten Clons können ein oder mehrere Codons fehlen, die Aminosäuren am N-Terminus des nativen Lipocortins codieren. Diese potentiell fehlenden Codons können durch einen Fachmann mittels üblicher Hybridisierungsbedingungen aus den vorstehend beschriebenen Banken oder anderen Banken aus genomischer DNA und cDNA, falls erforderlich, isoliert werden, wobei die vorstehend beschriebenen Clone als Sonden oder, mehr bevorzugt, Teile des 5'-Terminus dieser Clone verwendet werden. Clone mit vollständiger Länge können anschließend unter Verwendung der üblichen Ligierungsverfahren und der Lipocortin-codierenden Clone hergestellt werden.
Es wurde festgestellt, daß Clon λLC von Fig. 4 das vollständige Gen von Lipocortin enthielt. Um zu bestätigen, daß das ATG an den Nucleotiden 52 bis 54 in der λLC-cDNA (Fig. 4) das erste im Leserahmen liegende Methionin-Codon und daher das initiierende Methionin ist, wurde die 5'-seitige Sequenz der Lipocortin-mRNA durch Primer-Verlängerung bestimmt. Ein 27 b langes Oligonucleotide (Lipo 18), das zu der Sequenz von 10 bis 37 von λLC homolog war, wurde mit ³²P-(γ)-ATP markiert und an menschliche Plazenta-Poly(A)&supmin;RNA hybridisiert. Unter Verwendung dieses Oligonucleotids als Primer und der AMV-Reversen-Transkriptase wurde ein 60 bp Fragment des äußersten 5'-Endes der Lipocortin-mRNA transkribiert. Dieses Fragment wurde durch ein Gel gereinigt und durch das Sequenzierungsverfahren von Maxam und Gilbert (a. a. O.) sequenziert. Die erhaltene Sequenz zeigte 37 Basenpaare, die zur Sequenz 1 bis 37 von λLC homolog waren, und 23 weitere Nucleotide, die das 5'-Ende der Lipocortin-mRNA darstellten.
Um die Möglichkeit auszuschließen, daß die mRNA in Wirklichkeit länger war als die Primer-Verlängerung anzeigte, daß sie also ein starkes Stopsignal für die Reverse Transkriptase aufwies, das irrtümlich für das 5'-Ende gehalten wurde, wurde die genaue Größe der mRNA bestimmt. Ein Oligonucleotid (Lipo 17), das zur Sequenz 94 bis 128 von λLC homolog ist, wurde an Plazenta-Poly(A)&spplus;-RNA hybridisiert und mit RNase H gespalten. RNase H spaltet RNA nur, wenn sie mit DNA als Hybrid vorliegt, und daher wurde die mRNA genau an der Stelle gespalten, an der Lipo 17 hybridisierte. Diese RNA wurde anschließend auf einem Sequenziergel getrennt, auf GeneScreen geblottet und mit ³²P-markiertem Lipo 18 als Sonde getestet. Dieses ermöglichte die Bestimmung der exakten Größe des 5'-Endes der Lipocortin-mRNA, die mit der bei der Primer-Verlängerung erhaltenen übereinstimmte.
Die erfindungsgemäßen cDNA-Sequenzen können außerdem zum Absuchen von menschlichen, genomischen Cosmid- oder Phagen-Banken verwendet werden, um menschliche, Lipocortinähnliche Polypeptide codierende Sequenzen des menschlichen Genoms zu isolieren *.
Diese menschlichen cDNA- und genomischen Sequenzen können zur Transformation von eukaryotischen und prokaryotischen Wirtszellen durch im Stand der Technik gut bekannte Verfahren verwendet werden, um menschliche, Lipocortin-ähnliche Polypeptide in klinisch und kommerziell nützlichen Mengen herzustellen.
Es sollte auch selbstverständlich sein, daß die erfindungsgemäßen cDNA-Sequenzen in größeren mRNA-Spezies enthalten sein können, die beim alternativen Spleißen entstehen. Solche mRNAs können zusätzlich zum reifen Protein eine * Beispielsweise wurde ein EcoRI-Fragment von Plasmid pL9/20 verwendet, um eine partielle HaeIII-Alul-Bank der menschlichen Leber abzusuchen (Lawn, R. et al., "The Isolation And Characterisation of Linked δ- and β-Globin Genes From A Cloned Library of Human DNA", Cell 15 (1978), 1157-74, und positive Clone wurden erhalten.
Signalsequenz für Lipocortin codieren.

D. Expression eines Lipocortin-Proteins in E. coli

Das Plasmid pKK233.LIP.1 (das eine partielle Sequenz der Lipocortin-codierenden Region enthält) wurde durch eine dreiteilige Ligierung unter Verwendung von NcoI-PstI-gespaltenem pKK233-2 [Amann, E. et al., "Vectors Bearing A Hybrid Trp-Lac Promotor Useful For Regulated Expression Of Cloned Genes In Escherichia coli", Gene 25 (1983), 167-78], BglII- PstI- und NciI-BglII-Fragmenten von pL9/20 (vgl. Fig. 5) konstruiert. Plasmid PL9/20 enthält die DNA-Sequenz der Nucleotide 67 bis 1376 der in Fig. 4 dargestellten cDNA- Insertion von λLC, die in die EcoRI-Stelle von pUC13 inseriert worden war.
Die Transformanten, die aus dieser Ligierung und der anschließenden Transformation des E. coli-Stamms HB101 IQ erhalten wurden, wurden in L-Nährlösung sowie Ampicillin enthaltende Vertiefungen von Mikrotiterplatten gegeben und über Nacht gezüchtet. Die über Nacht gezüchteten Kulturen wurden anschließend vierfach auf Nitrozellulose-Filter auf L-Nährlösung sowie Ampicillin enthaltenden Agarplatten übertragen und etwa 4 Std. bei 37ºC inkubiert. Die Nitrozellulose-Filter wurden anschließend auf IPTG (10 ug/ml) enthaltende Platten mit L-Nährlösung übertragen und 0, 30, 60 oder 120 Min. inkubiert, worauf anschließend zur Lyse der Kolonien eine Lysozym-Detergens-Behandlung und schließlich eine Western-Blot-Analyse mit einem kreuzreaktiven Antiserum folgte, das gegen das Ratten-Lipocortin hergestellt worden war. Die Transformanten wurden auch durch Plasmid-Restriktionskartierung analysiert. Sämtliche im Western positive Kolonien enthielten Plasmide, die die erwarteten Restriktionsfragmente trugen. E. coli-Präparationen der positiven Kolonien wurden auch durch SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese analysiert. Mit der Western-Blot-Analyse dieser Präparationen unter Verwendung des Antikörpers gegen Ratten- Lipocortin wurde ein unvollständiges Protein mit einem Molekulargewicht von 31 000 nachgewiesen.
Es wurden zur Herstellung von menschlichem Lipocortin von vollständiger Länge auch unterschiedliche Expressionsvektoren in E. coli konstruiert. Alle sind perfekte Konstrukte, die mit dem ersten Methionin in der in Fig. 4 dargestellten Sequenz beginnen. Die Expression des unvollständigen Proteins wurde durch das vorstehend beschriebene Verfahren unter Verwendung eines gegen Ratten- Lipocortin hergestellten Antiserums bestätigt.
Beispielsweise stellt Fig. 6 das Plasmid pLiptrc155A dar, ein von Plasmid pKK233-2 [Amann, E. et al., a. a. O.) stammender trc-Expressionsvektor. pLiptrc155A weist einen Hybrid-Promotor auf, der die -10-Region von lac und die -35- Region von trp enthält. Er enthält auch die 5S-RNA-T&sub1;T&sub2;- Terminatoren und das β-Lactamase-Gen, das die Ampicillin- Resistenz überträgt.
pLiptrc155A wurde wie nachstehend beschrieben konstruiert: Plasmid pKK233-2 wurde mit NcoI und HindIII unter Bildung eines linearen Fragments gespalten. Plasmid pL9/20 wurde mit HindIII partiell gespalten, anschließend mit EcoRI vollständig gespalten und das 1090 Fragment durch Agarose- Gelelektrophorese isoliert. Diese beiden Fragmente wurden anschließend vollständig gespalten und in Gegenwart eines NcoI-EcoRI-Linkers ligiert, der das initiierende ATG und die Sequenz enthielt, die fünf Aminosäuren 5'-seitig zur EcoRI- Stelle in der menschlichen Lipocortin-cDNA codiert.
Der erhaltene Expressionsvektor pLiptrc155A wurde anschließend zur Transformation der E. coli-Stämme JA221 und W3110IQ verwendet und die Expression durch 4-stündige Züchtung der transformierten Stämme in 1 mM IPTG und 35 ug/ml Ampicillin enthaltendem LB-Medium induziert. Eine SDS- Polyacrylamidgel-Analyse der Rohlysate der transformierten Wirtszellen zeigte eine einzige neue Protein-Bande mit einem relativen Molekulargewicht von 37 kd. Kontrollextrakte von nicht mit pLiptrc155A transformierten Stämmen oder mit dem Plasmid transformierten Stämmen, deren Protein-Produktion aber unterdrückt war, zeigten dieses 37 kd-Protein nicht. Es wurde beispielsweise festgestellt, daß bei einer Transformation des JA221-Wirts mit pLiptrc155A das 37 kd-Protein für 2% des Gesamtproteins verantwortlich war.
Um weiter zu bestätigen, daß das menschliche Lipocortin exprimiert wurde, wurde mit den gleichen Lysaten auch eine Western-Blot-Analyse unter Verwendung eines gegen das Ratten-Lipocortin gerichteten Antikörpers durchgeführt. Nur das 37 kd-Protein zeigte eine Immunreaktion mit dem gegen das Ratten-Protein gerichteten Antikörper. Es wurde durch die Western-Blot-Analyse auch gezeigt, daß das natürliche menschliche Lipocortin von U937-Zellen (durch seine Immunreaktivität mit dem gegen Ratten-Protein gerichteten Antikörper nachgewiesen) mit dem exprimierten 37 kd-Protein, das an der gleichen Stelle auf dem Gel eine Bande bildete, in der Größe praktisch identisch ist.
Schließlich wurde eine kleine Menge des exprimierten Proteins aus dem SDS-Polyacrylamidgel elektroeluiert und mit ihr eine Sequenzanalyse des N-Terminus durchgeführt. Die erhaltene Aminosäuresequenz stimmte mit der von der λLC- cDNA-Sequenz von Fig. 4 abgeleiteten Aminosäuresequenz überein.
Das exprimierte menschliche Lipocortin hemmte die exogene Phospholipase A&sub2; im vorstehend in Beispiel A beschriebenen in vitro-Test. Diese Hemmung wurde zunächst unter Verwendung von Rohlysaten und später mit einer reineren Präparation aus exprimiertem Protein nachgewiesen. Wenn die lösliche Fraktion der Rohlysate, die mit einer French-press hergestellt wurden, auf eine die Phospholipase hemmende Aktivität getestet wurde, wurden die nachstehend in Tabelle I dargestellten Ergebnisse erhalten. Die hemmende Aktivität wurde in Lysaten von das Plasmid pLiptrc155A enthaltenden E. coli nachgewiesen, während in Lysaten von das Plasmid nicht enthaltenden E. coli keine Aktivität nachgewiesen wurde. Wie durch Gelanalyse ermittelt wurde, bestand der einzige Unterschied zwischen diesen beiden Extrakten darin, daß in der hemmenden Fraktion das 37 kd-Protein vorhanden war. Es wurde festgestellt, daß das Gesamtprotein des Lysats weniger als 1% 37 kd-Protein enthielt. Ähnliche Ergebnisse wurden auch in Tests erhalten, in denen Lysate mit Ultraschall behandelt worden waren.
Obwohl eine hemmende Aktivität unmittelbar im löslichen Lysat nachgewiesen werden konnte, war der größte Teil des 37 kd-Proteins in E. coli unlöslich und wurde daher nach der Lyse der Zellen mit der French-press durch langsame Zentrifugation entfernt. Das unlösliche Protein wurde mit Guanidinhydrochlorid aus dem partikulären Material extrahiert, gegen 1 M Harnstoff dialysiert und anschließend auf eine die Phospholipase hemmende Aktivität getestet. Die Ergebnisse dieses Tests sind nachstehend in Tabelle II dargestellt. Das Dialysat enthielt etwa 200 E hemmende Aktivität pro ml (1 E hemmt 15 ng A&sub2;). Um sicherzustellen, daß diese Aktivität das Ergebnis eines Proteins und nicht das anderer Bestandteile im Extrakt war, beispielsweise eines Lipids, wurden 25 ul des in Tabelle II verwendeten Lysats mit Trypsin inkubiert. Wie nachstehend in Tabelle III dargestellt, war die hemmende Aktivität sehr Trypsinempfindlich.

Tabelle I

Phospholipase-hemmende Aktivität in E. coli-Rohlysaten

Kulturen des E. coli-Stamms W3110IQ, der entweder das Plasmid pLiptrc155A enthielt oder nicht, wurden mit IPTG induziert und mit einer French-press lysiert. Das partikuläre Material wurde 20 Min. durch Zentrifugation mit 10 000 x g entfernt. Die lösliche Fraktion wurde auf eine die Phospholipase hemmende Aktivität getestet. Die dargestellten Zahlen sind die Durchschnittswerte von mehreren Tests, in denen 50 ul Extrakt mit 100 ng Schweine-Pankreas-Phospholipase A&sub2; getestet wurden. Probe Prozent Hemmung allein kein Plasmid trc-Plasmid enthaltend

Tabelle II

Dosis-Wirkung-Kurve von partiell gereinigtem Inhibitor

Die unlösliche Präparation, die aus den mit pLiptrc155A transformierten JA22I-Zellen gewonnen wurde (unter Verwendung der vorstehend beschriebenen, die Lyse bewirkenden Behandlung), wurde 6 M Guanidinhydrochlorid in 25 mM Natriumacetat (pH-Wert 6,0) ausgesetzt. Das partikuläre Material wurde durch Zentrifugation entfernt (100 000 x g, 1 Std.). Das extrahierte Protein, das mit menschlichem 37 kd- Protein stark angereichert war, wurde gegen 1 M Harnstoff in 25 mM Natriumacetat (pH-Wert 6,0) dialysiert und anschließend auf eine die Phospholipase A&sub2; hemmende Aktivität getestet. ul Getesteter Extrakt Prozent Hemmung

Tabelle III

Empfindlichkeit des Inhibitors gegen Trypsin

Die in Tabelle II beschriebene, partiell gereinigte Präparation wurde 15 Min. bei Raumtemperatur mit Trypsin behandelt und anschließend mit 100 ng Schweine-Pankreas- Phospholipase A&sub2; getestet. Bei den verwendeten Bedingungen veränderte die Trypsin-Behandlung nicht die Phospholipase A&sub2;-Aktivität. In jeder Probe wurden 25 ul Inhibitor getestet. Probe Trypsin Prozent Hemmung allein Inhibitor
Neben pLiptrc155A wurden noch andere erfindungsgemäße Vektoren mit hoher Expressionsrate konstruiert. Das Plasmid pLipPLT4A wurde beispielsweise wie nachstehend beschrieben konstruiert: Plasmid pPLT4HTNF, ein Geschenk von Walter Fiers, (dieses Plasmid ist fit dem Plasmid identisch, das am 27. Dezember 1984 unter der DSM-Nr. 3175 bei der Kultursammlung der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen in Göttingen, Deutschland, und im E. coli-Stamm C600 hinterlegt wurde und die Bezeichnung pBR322-pL-T4-hTNF erhielt) wurde mit den Restriktionsenzymen ClaI und HindIII gespalten und ein lineares Fragment erhalten. Das Plasmid pL9/20 wurde mit HindIII partiell und anschließend mit EcoRI vollständig gespalten, und das 1350 bp-Fragment wurde aus einem Agarosegel isoliert. Diese beiden Fragmente wurden in Gegenwart eines ClaI-EcoRI-Linkers ligiert, der ein initiierendes ATG und die Sequenz enthielt, die fünf Aminosäuren 5'-seitig zur EcoRI-Stelle in der Lipocortin-cDNA codiert. Im erhaltenen Expressionsvektor steuert der PL-Promotor die Transkription einer Hybrid-mRNA, die Sequenzen von PL-, T&sub4;- und die Lipocortin-mRNA beinhaltet. Die Translation dieser mRNA initiiert am ersten ATG der menschliches Lipocortin codierenden Sequenz, wobei ein 37 kd-Protein erhalten wurde. Ein zweites Tetracyclin-resistentes Plasmid pLipPLT4T wurde durch Insertion des Tetracyclin-Resistenzgens von pBR322 in die ScaI-Stelle von pLipPLT4A konstruiert.
Die E. coli-Stämme MC1061 und C600pCi 857 wurden mit pLipPLT4A transformiert und die Expression durch SDS-Polyacrylamid-Elektrophorese und Western-Blot-Analyse, wie vorstehend beschrieben, ermittelt. Die E. coli-Extrakte zeigten ein 37 kd-Protein, das mit Antikörpern gegen Ratten-Lipocortin reagierte.

E. Expression von menschlichem Lipocortin-Protein in Hefe

Es wurden auch Expressionsvektoren zur Produktion von menschlichem Lipocortin in Hefe konstruiert. Die Fig. 7 bis 9 zeigen die Konstruktion von pBg120, das bei der Verwendung zur Transformation von Hefezellen menschliches Lipocortin exprimierte, wie durch Western-Blot-Analyse mit dem gegen Ratten-Lipocortin gerichteten Antikörper nachgewiesen wurde.
pBg120 wurde wie nachstehend beschrieben konstruiert:
Plasmid pLXV-1 enthält den DNA-Replikationsstartpunkt vom E. coli-Plasmid pBR322 und der Hefe-2u-Plasmid-DNA. Es kann daher sowohl in E. coli als auch in Hefe replizieren (J. Ernst, persönliche Mitteilung). Die BamHI-Stelle von Plasmid pLXV-1 wurde durch Spaltung mit BamHI, Behandlung mit S1-Nuclease 30 Min. bei 37ºC und erneutem Ringschluß mit T4-DNA-Ligase entfernt (Fig. 7). E. coli JA221 wurde mit dem Ligierungsgemisch transformiert und das Plasmid pLXV-1- BamHI&supmin; isoliert.
Um das ATG-Initiations-Codon des Act in-Gens in pLXV-1 zu rekonstituieren, wurde pLXV-1-BamHI mit EcoRI und HindIII gespalten. Das den Actin-Promotor enthaltende große Fragment wurde isoliert. Dieses Fragment wurde mit einem DNA-Fragment ligiert, das das menschliche α1-Anti-Trypsin- Gen enthielt, das ein BamHI-Ende, einen HindIII-Linker * und * Das ul-Anti-Trypsin-DNA-Fragment wurde nur verwendet, um die BamHI- und HindIII-Spaltstellen in das Plasmid einzuführen. Die α1-Anti-Trypsin-codierende DNA-Sequenz zwischen den beiden Spaltstellen wurde später entfernt und durch die Lipocortin-DNA-Sequenz ersetzt. Die zur Bereitstellung dieser Restriktionsstellen im Plasmid verwendete spezifische Sequenz war ohne Bedeutung, und jede DNA-Sequenz hätte anstelle der αl-Anti-Trypsin-DNA verwendet werden können.
zwei synthetische Linker (Linker 9 & 10) * enthielt. Die Linker 9 und 10 enthielten beide überstehende Enden von EcoRI und BamHI, und der Linker 9 enthielt eine Ncol- Spaltstelle und das ATG-Initiations-Codon. Diese Ligierung führte zum Verlust der EcoRI- und BamHI-Spaltstellen. E. coli IA221 wurde mit diesem Ligierungsgemisch transformiert und auf Ampicillin- und Kanamycin-Resistenz selektiert, um sicherzustellen, daß die innerhalb des Kam®-Gens liegende HindIII-Stelle wiederhergestellt war. Das erhaltene Plasmid erhielt die Bezeichnung pAPN.
Fig. 8 zeigt die Insertion der menschliches Lipocortin codierenden DNA-Sequenzen in einen Hefe-Expressionsvektor. Die menschliche Lipocortin-Sequenz wurde in zwei Teilen cloniert. Zunächst wurde die N-terminale Region hinter der Actin-Expressions-Kontrollsequenz der Hefe inseriert und mit ihr funktionell verbunden. Das Plasmid pTrp321 (Devos, R. et al., "Molecular cloning of human interleukin 2 cDNA and its expression in E. coli", Nucleic Acids Research 11 (1983), 4307-23) wurde mit ClaI und HindIII gespalten und das große Fragment an das vorstehend auf S. 34 hergestellte pL9/20 1090-Linker-Fragment ligiert. Das Plasmid pTrplip wurde über das Absuchen nach der Expression von menschlichem Lipocortin isoliert.
pAPN wurde mit NcoI gespalten und das kleine Frag- * Der Linker 9 war ein Gemisch aus den zwei Sequenzen AATTAACAATGGAA und AATTAACCATGGAG. Der Linker 10 war ein Gemisch aus GATCCTCCATGGTT und GATCTTCCATTGTT.
ment, das die Actin-Expressions-Kontrollsequenz der Hefe enthielt, isoliert. Dieses Fragment wurde an pTrp-lip ligiert, das mit NcoI linearisiert worden war. Das Plasmid erhielt die Bezeichnung pTrp-lip-apn-nco. ptrp-lip-apn-nco wurde mit HindIII gespalten und das Fragment isoliert, das die Actin-Expressions-Kontrollsequenz der Hefe und die DNA- Sequenzen enthielt, die der N-terminalen Region des menschlichen Lipocortins entsprachen. Dieses Fragment wurde zur Herstellung des Plasmids pBg114 an das große HindIII- Fragment von pAPN ligiert.
Es wurden die DNA-Sequenzen erhalten, die dem verbliebenen C-terminalen Fragment des menschlichen Lipocortins aus dem 800 bp-BgIII-BamHI-Fragment von pL9/20, a. a. O. (Fig. 9), entsprachen. pL9/20 wurde mit BgIII und BamHI gespalten und das 800 bp-Fragment elektroeluiert. Dieses Fragment wurde mit pBg114 ligiert, das mit BgIII gespalten worden war. Es wurde das Plasmid pBg120 isoliert, das die DNA-Sequenzen enthielt, die das mit der Actin-Expressions- Kontrollsequenz funktionell verbundene menschliche Lipocortin codierten.
In mit pBg120 transformierten Hefeextrakten wurde ein 37 kd-Protein nachgewiesen, das in nicht-transformierten Hefezellen oder in Hefezellen, die mit Plasmiden transformiert worden waren, die kein menschliches Lipocortingen enthielten, nicht beobachtet wurde. Dieses Protein entsprach in einer SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese genau dem in E. coli hergestellten, menschlichen 37 kd-Protein (Fig. 10).
In Hefe wird das menschliche 37 kd-Protein als lösliches Protein produziert. Es macht etwa 4% des Gesamtproteins der Zelle aus. Bei der Lyse von Hefekulturen, die das rekombinante Protein enthalten, mit einer French-press bei 20 000 p. s. i. und der Entfernung des partikulären Materials durch Zentrifugation (10 000 x g, 10 Min.) wurden etwa 80% der hemmenden Aktivität aus der löslichen Fraktion gewonnen. Die Verteilung der hemmenden Aktivität entsprach genau der Verteilung des menschlichen Proteins ausgehend von einer SDS-Polyacrylamidgel-Analyse Das in Hefe produzierte rekombinante Protein weist einen blockierten Amino-Terminus auf.

F. Expression von menschlichem Lipocortin-Protein in Säugerzellen

Es wurden auch Expressionsvektoren zur Herstellung von menschlichem Lipocortin in Säuger-Wirten konstruiert. Die Fig. 11 bis 13 zeigen die Konstruktion von pSVL9109, das bei der Transfektion in cos- und CHO-Wirtszellen durch das CaPO&sub4;-Verfahren (Graham, F. et al., J. Virology 52 (1973), 455-56) menschliches Lipocortin exprimierte, wie es durch Western-Blot-Analyse mit dem Anti-Ratten-Lipocortin- Antikörper nachgewiesen wurde. Es wurde ein in nicht-transfizierten Zellen nicht beobachtetes, immunreaktives 37 kd- Protein nachgewiesen, wodurch gezeigt wurde, daß der Vektor das menschliche Inhibitor-Protein produzierte. pSVL9109 wurde wie nachstehend beschrieben konstruiert:
Wie in Fig. 11 dargestellt, wurde das Plasmid pSV2gpt (Mulligan, R. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78 (1981), 2072-76) mit PvuII und HindIII gespalten und das den frühen Promotor von SV40 enthaltende 340 bp-Fragment wurde isoliert und in pAT153 inseriert, das zuvor mit EcoRI gespalten, mit S1 behandelt und anschließend mit HindIII gespalten worden war. Das erhaltene Plasmid pAT.SV2 enthielt den Promotor. Dieses Plasmid wurde anschließend mit HindIII und BamHI gespalten. In diese Stelle wurde eine Sequenz cloniert, die die Spleißstelle für das kleine t "small t-splice site" enthielt. Diese Sequenz wurde aus einem anderen Plasmid, pTPA119, durch Spaltung mit HindIII und BamHI isoliert. Die 3 kb-Insertion enthielt die DNA-Sequenz, die den menschlichen Gewebe-Plasminogen-Aktivator zusammen mit der Spleißstelle für das kleine t "small t-splice site" codierte. Diese Sequenz ist äquivalent zu der, die im HindIII- BamHI-Segment von pTPA25 festgestellt wurde, die am 21. August 1984 bei der American Type Culture Collection in Rockville, Maryland, unter der ATCC-Nr. 39808 hinterlegt wurde. Das 3 kb-HindIII-BamHI-Fragment wurde mit pAT.SV2 ligiert, um das Plasmid pAT.SV2.TPA zu erhalten. Dieser Vektor enthält den frühen Promotor von SV40, worauf eine HindIII- Stelle und das Spleißsignal für das kleine t "small t-splice site" von SV40 folgt, dem eine BgIII-Stelle vorausgeht.
Anschließend wurde die menschliches Lipocortin codierende Sequenz in pAT.SV2.TPA inseriert. Ein Oligonucleotid von 29 bp mit EcoRI- und HindIII-Enden wurde synthetisiert (vgl. Fig. 12). Dieses Oligonucleotid schließt die codierende Sequenz für die ersten sechs Aminosäuren von menschlichem Lipocortin ein. Diese Sequenz wurde in pUC9 (Vieira, J. et al., Gene 19 (1982), 259-68) cloniert, das mit EcoRI und HindIII gespalten worden war, wobei pLP0900 erhalten wurde. Dieses Plasmid wurde mit EcoRI gespalten und mit alkalischer Phosphatase vom Kalb behandelt. Anschließend wurde das 1,3 kb-EcoRI-Fragment von pL9/20 in pLP0900 cloniert, das der codierenden Region für menschliches Lipocortin entsprach. Das erhaltene Plasmid pLP0905 enthält die gesamte codierende Region für menschliches Lipocortin mit einer HindIII-Stelle stromaufwärts (vgl. Fig. 12). Daher kann das Gen hinter den SV40-Promotor von pAT.SV2.TPA cloniert werden.
Fig. 13 stellt die Insertion des menschlichen Lipocortin-Gens in pAT.SV2.TPA dar, wobei ein erfindungsgemäßer Expressionsvektor für Säuger gebildet wird. Die menschliche Lipocortin-Sequenz wurde in zwei Teilen in den Expressionsvektor cloniert. Zuerst wurde die N-terminale Region hinter den SV40-Promotor inseriert und anschließend die C-terminale Region hinzugefügt. Das Plasmid pLP0905 wurde mit HindIII und BgIII gespalten und das 560 bp- Fragment, das die N-terminale Region von menschlichem Lipocortin enthielt, isoliert. pAT.SV2.TPA wurde mit HindIII und BgIII gespalten und das den Vektor enthaltende 5 kb-Fragment ohne TPA-Sequenzen isoliert. In diesen HindIII-BgIII-Vektor wurde das die N-terminale Region von menschlichem Lipocortin enthaltende 560 bp-HindIII-BglII-Fragment inseriert, um das Plasmid pLP0908 zu erhalten.
Die C-terminale Region von menschlichem Lipocortin liegt innerhalb des 800 bp-BglII-BamHI-Fragments von pL9/20. Daher wurde pL9/20 mit BglII und BamHI gespalten, worauf das 800 bp-Fragment elektroeluiert wurde. Dieses Fragment wurde mit dem Plasmid pLP0908 ligiert, das mit BglII gespalten und mit alkalischer Phosphatase vom Kalb behandelt worden war. Das Plasmid pSVL9109 wurde isoliert. Dieses Plasmid wies die gesamte menschliches Lipocortin codierende Sequenz stromabwärts des frühen Promotors von SV40 gefolgt vom Spleißsignal für das kleine t "small t-splice signal" von SV40 auf. Das Plasmid pSVL9109 wurde zur Transfektion von cos- und CHO- Wirten, wie vorstehend beschrieben, verwendet.
So wurden unter Verwendung der erfindungsgemäßen DNA- Sequenzen leistungsfähige Expressionsvektoren zur Expression von menschlichem Lipocortin in einer biologisch aktiven Form konstruiert.
Für die durch die hier beschriebenen Verfahren hergestellten rekombinanten DNA-Sequenzen gibt es eine Referenzkultur, die bei der Kultursammlung der In Vitro International, Inc., Ann Arbor, Michigan, hinterlegt wurde. Die Kultur wurde am 9. Januar 1985 hinterlegt und ist wie nachstehend beschrieben ausgewiesen:
λLC: IVI Nr. 10042 (nun in die ATCC-Hinterlegungsnr. 68812 überführt)
Für die durch die hier beschriebenen Verfahren hergestellten Mikroorganismen gibt es eine Referenzkultur, die am 12. März 1985 bzw. am 14. August 1985 bei der vorstehend beschriebenen Hinterlegungsstelle hinterlegt wurde und wie nachstehend beschrieben ausgewiesen ist:
E. coli W3110IQ (pLiptrc155A: IVI Nr. 10046 (nun in die ATCC-Hinterlegungsnr. 68763 überführt)
S. cerevisiae 331-17A (pBg120): IVI Nr. 10088 (nun in die ATCC-Hinterlegungsnr. 74106 überführt).

G. Herstellung von biologisch aktiven, menschlichen, Lipocortin-ähnlichen Polypeptid-Fragmenten

Es ist äußerst wünschenswert, Polypeptid-Fragmente herzustellen, die kleiner als das menschliche Lipocortin mit einem Molekulargewicht von 37 000 sind und eine Phospholipase hemmende Aktivität zeigen. Eine kleineres Polypeptid kann leichter zu den Zielzellen gebracht werden, z. B. durch transdermale Infusion anstelle der intravenösen Injektion. Ein kleineres Polypeptid könnte auch eine stabilere Konformation als das 37 K-Protein aufweisen. Beispielsweise enthält das N-terminale Ende des 37-K Proteins eine Anhäufung von hydrophoben Aminosäuren, die die Bildung von intermolekularen Aggregaten verursachen können, während der C- Terminus vier Cysteine enthält, die unerwünschte Disulfid- Bindungen bilden können (vgl. Fig. 4). Daher können bei der Produktion des Proteins in hohen Konzentrationen durch die Entfernung der N-terminalen und C-terminalen Enden des großen Proteins heterogene Konformationen vermieden werden. Die Isolierung von biologisch aktiven Fragmenten ermöglicht auch eine verbesserte Charakterisierung des aktiven Zentrums des Lipocortin-Moleküls und führt zur Entwicklung von Fragmenten mit optimalem therapeutischen Wert.
Obwohl unter diesem erfindungsgemäßen Gesichtspunkt mehrere Verfahren zur Erzeugung von Polypeptid-Fragmenten aus ihrem parentalen Molekül verwendet werden können, wurde es in der nachstehend beschriebenen beispielhaften Ausführungsform vorgezogen, mit dem menschlichen, Lipocortinähnlichen Polypeptid eine begrenzte Protease-Spaltung durchzuführen. Zunächst wurden die Spaltungsbedingungen für jede Protease optimiert, so daß nur wenige, üblicherweise weniger als zehn Fragmente erzeugt wurden, die dann leicht isoliert werden konnten. Die optimalen Bedingungen wurden üblicherweise durch die nachstehend beschriebenen Faktoren bestimmt: (1) die Art der verwendeten Protease, (2) der physikalische Zustand des Zielproteins, d. h., denaturierter oder nichtdenaturierter Zustand, (3) die Dauer der Spaltung, (4) die Temperatur, (5) die Menge an verwendeter Protease und (6) der pH-Wert.
Zwei unterschiedliche Typen von Proteasen wurden zur Spaltung des 37 K-Lipocortin-ähnlichen Polypeptids verwendet. Der erste Typ hydrolysiert Peptidbindungen nicht-spezifisch. Dieser Typ wird durch Elastase- und Proteinase K- Proteasen repräsentiert. Der durch die Proteasen Plasmin und Thrombin repräsentierte zweite Typ hydrolysiert eine spezifische Peptidbindung. Dieser zweite Typ erkennt Zielproteine wahrscheinlich sowohl an der Aminosäuresequenz als auch an der Konformation in der Umgebung der Spaltstellen. Es wurde auch Trypsin, ein dritter Typ Protease, verwendet, um den c- Terminus der aktiven Peptidfragmente zu lokalisieren (vgl. S. 50 und 51, nachstehend). Trypsin hydrolysiert die Peptidbindungen an spezifischen Aminosäuren. Zu weiteren Proteasen diesen Typs gehören Chymotrypsin und die V8-Protease. Da wunschgemäß Fragmente mit biologischer Aktivität erhalten werden sollten, wurde unter nicht-denaturierenden Bedingungen gespalten.

1. Produktion, Isolierung und Charakterisierung von Plasmingespaltenen Fragmenten von rekombinantem, menschlichem Lipocortin

Zur Optimierung der Bedingungen für die Plasmin- Spaltung wurde ein Aliquot des von E. coli produzierten, menschlichen, Lipocortin-ähnlichen Polypeptids (100 ug) in 100 ul 0,2 M Tris-HCl (pH-Wert 8,0), 5 mM EDTA und 0,1 mg Rinderserumalbumin/ml Lösung bei Raumtemperatur mit 10 ul (1 ug/ul) Plasmin (Calbiochem) inkubiert. In unterschiedlichen Zeitabständen wurden 15 ul entnommen und die Reaktion durch Zusatz von 5 ul 8% SDS enthaltendem Puffer und anschließendes 5-minütiges Kochen der Aliquots beendet. Das Gemisch aus gespaltenem Material wurde nach jeder Entnahme durch SDS-Gelelektrophorese analysiert. Die in Fig. 14 dargestellten Ergebnisse zeigen, daß nach einer einstündigen Inkubation fast das gesamte Protein in ein Fragment mit einem Molekulargewicht von 33 000 gespalten war. Dieses 33 K-Fragment war gegen eine weitere Spaltung entweder mit einer längeren Inkubationszeit oder in Gegenwart von erhöhten Mengen Plasmin resistent.
Unter Verwendung der vorstehend beschriebenen Spaltungsbedingungen wurden 500 ug menschliches, Lipocortinähnliches Polypeptid 1 Stunde mit 75 ug Plasmin inkubiert. Die Umsetzung wurde mit 250 KIE des Protease-Inhibitor- Aprotinin (Sigma) beendet. Die gespaltenen Proben wurden auf eine Biogel P-60-Säule (1,0·50 cm) aufgetragen, die bei 4ºC mit 0,2 M Tris-HCl, pH-Wert 7,5, 5 mM EDTA und 0,1% Rinderserumalbumin äqulibriert worden war. 1,1 ml Fraktionen wurden gesammelt. Das bei 280 nm aufgenommene Elutionsprofil der Fragmente zeigte zwei Protein-Peaks (Fig. 15). Aliquots von Fraktionen von jedem Peak wurden durch Hochdruck- Flüssigkeitschromatographie und SDS-Gelelektrophorese analysiert. Die Ergebnisse zeigten, daß Peak I ein Fragment mit einem Molekulargewicht von 33 000 (als Lipo-L bezeichnet) und Peak II ein Fragment mit einem Molekulargewicht von 4 000 (als Lipo-S bezeichnet) enthielt.
Die Fraktionen der Biogel P-60-Säulenchromatographie wurden auf eine die Phospholipase A&sub2; hemmende Aktivität, wie vorstehend beschrieben, getestet. Der Hauptteil der Aktivität war in Peak I festzustellen (Fig. 15). Obwohl eine geringe hemmende Aktivität in Peak II nachgewiesen wurde, war diese Aktivität nicht von der Fragment-Konzentration abhängig und wurde wahrscheinlich durch nicht-spezifische Bindung des Fragments an die Membran verursacht.
Zwei gespaltene Produkte wurden auch unter Verwendung der C4-Säulen-Chromatographie (Vydac) durch Umkehrphasen- Hochdruck-Flüssigkeitschromatographie mit einem Gradienten aus 0 bis 75% Acetonitril in 0,1% Trifluoressigsäure isoliert. Lipo-S wurde mit 38% Acetonitril und Lipo-L mit 48% Acetonitril eluiert.
Die N-terminale Aminosäuresequenz von Lipo-L (33 K; Peak I) wurde unter Verwendung eines Gasphasen-Sequenzierers (Applied-Biosystems 470A) durch sequentiellen Edman-Abbau ermittelt. Die PTH-Aminosäuren wurden durch Hochdruckflüssigkeits-Chromatographie auf einer 5 um Cyano-Säule (Hypersil) unter Verwendung eines Gradienten aus 15 bis 55% Acetonitril:Methanol (4 : 1) in 0,02 M Natriumacetat-Puffer (pH-Wert 5,7) analysiert. Die N-terminale Aminosäuresequenz von Lipo-L wurde als H&sub2;N-Gly-Gly-Pro-Gly-Ser-Ala-Val bestimmt. Das N-terminale Glycin von Lipo-L entspricht dem Gly-30 des 37 K-Proteins.
Zur Bestimmung der C-terminalen Aminosäuresequenz der Fragmente wurde die Peptidkarte der Trypsinspaltung des 37 K-Ratten-Lipocortins (Fig. 16) mit einer Peptidkarte der Trypsinspaltung verglichen, die für jedes der Fragmente hergestellt wurde. 20 ul des 37 K-Lipocortin-ähnlichen Polypeptids (40 ug) in 0,2 M Tris-HCl, pH-Wert 8,0, 5 mM EDTA und 0,1 mg Rinderserumalbumin/ml wurden mit 0,2 ml 0,1 M NH&sub4;CO&sub3; sowie 1 mM CaCl&sub2; verdünnt. Das Gemisch wurde anschließend 24 Stunden bei 37ºC mit Trypsin inkubiert. Während dieser Inkubation wurde dreimal Trypsin zugesetzt: 0,5 ug zur Zeit 0, 0,25 ug nach 4 Std. und 0,25 ug nach 19 Std. Die Spaltung wurde beendet, indem 10 ul 90% Ameisensäure dem Reaktionsgemisch zugesetzt wurden. Die Plasmin-Fragmente wurden unter identischen Bedingungen gespalten, ausgenommen, daß die Fragmente, die durch Hochdruck-Flüssigkeitschromatographie gereinigt worden waren, zuerst mit einem "Speedvac"-Konzentrationsgerät (Savant) getrocknet, und die Rückstände in 0,1 M NH&sub4;HCO&sub3; und 1 mM CaCl&sub2; gelöst wurden.
Die Trypsin-Fragmente wurden auf einer C&sub1;&sub8;-Säule (Spectraphysics) durch Umkehrphasen-Hochdruck-Flüssigkeitschromatographie mit einem Gradienten von 0 bis 75% Acetonitril in 0,1% Trifluoressigsäure getrennt. Anschließend wurde die Aminosäuresequenz von jeder der Peak-Fraktionen ermittelt. Zuerst wurde durch 24-stündige Hydrolyse der Peptide in 6 N HCl und durch Bestimmung der Zusammensetzung auf einem Beckman 6300-Aminosäure-Analysator die Aminosäure- Zusammensetzung von jedem Peak etabliert. Die beobachteten Zusammensetzungen wurden mit den Zusammensetzungen verglichen, die auf der Grundlage von Sequenzdaten von sämtlichen möglichen Fragmenten vom 37 K-Polypeptid abgeleitet worden waren, und jedem Peak wurden Kennungen zugeordnet. Die Aminosäuresequenz von einigen Peaks wurde auch direkt durch Sequenzanalyse ermittelt.
Durch einen Vergleich der Karte des Fragments Lipo-L (Fig. 17B) mit der vom 37 K-Polypeptid (Fig. 16) wurde festgestellt, daß das biologisch aktive Lipo-L-Fragment die gleiche C-terminale Aminosäuresequenz wie das 37 K-Polypeptid aufweist. Daher zeigen diese Daten zusammen mit den Daten der N-terminalen Sequenz, daß Lipo-L die Aminosäure- Reste #30 bis #346 des 37 K-Polypeptids enthält. Durch einen Vergleich der Peptid-Karten des Fragments Lipo-S (Fig. 17A) mit den des 37 K-Polypeptids wurde festgestellt, daß Lipo-S die Aminosäurereste #1 bis #29 des 37 K-Proteins enthält.

2. Herstellung, Isolierung und Charakterisierung von Elastase-gespaltenen Fragmenten von rekombinantem, menschlichem Lipocortin

50 ul des menschlichen, Lipocortin-ähnlichen 37 K- Polypeptids (75 ug), 0,2 M Tris-HCl, pH-Wert 8,0, 5 mM EDTA und 0,1 mg/ml Rinderserumalbumin wurden bei Raumtemperatur mit 2,5 ug (1 ug/ul in 10 mM Ammoniumacetat, pH-Wert 6,0) Elastase (Sigma) behandelt. Die Spaltprodukte wurden nach unterschiedlichen Zeitabständen, wie vorstehend beschrieben, analysiert, um die Bedingungen für die Elastase-Spaltung zu optimieren. Die Ergebnisse zeigten, daß 20 Min. Inkubation Fragmente mit Molekulargewichten im Bereich von 10 K bis 33 K erzeugten.
150 ug des 37 K-Polypeptids wurden unter optimalen Bedingungen, wie vorstehend beschrieben, mit 5 ug Elastase inkubiert, und mit den gespaltenen Polypeptiden wurde eine SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese durchgeführt (Hager, D. A., und Burgess, R. R., Anal. Biochem. 109 (1980), 76-86). Die Polypeptid-Banden wurden sichtbar gemacht, indem das Gel 5 bis 10 Minuten bei 4ºC in 0,25 KCl und 2 mM DTT getaucht wurde. Anschließend wurden die Polypeptid-Banden ausgeschnitten und das KCl aus den Gel-Scheibchen entfernt, indem jedes Scheibchen 10 Min. bei Raumtemperatur in entionisiertes, 2 mM DTT enthaltendes H&sub2;O getaucht wurde. Die Fragmente wurden anschließend 2 Std. bei Raumtemperatur mit einer Lösung aus 0,1% SDS, 0,2 M Tris-HCl, pH-Wert 7,5, 5 mM EDTA, 5 mM DTT und 0,01% Rinderserumalbumin aus dem Gel eluiert. Die die Fragmente enthaltende Lösung wurde anschließend bei -70ºC mit einer eiskalten Aceton-Lösung gemischt und 30 Min. bei -70ºC inkubiert. Der Niederschlag wurde durch 10-minütige Zentrifugation mit 10 000 UpM (5534- Rotor) bei 4ºC gewonnen und einmal mit eiskaltem 80% Aceton und 0,2 M Tris-HCl, pH-Wert 7,5 und 5 mM DTT enthaltendem 20 % Puffer gewaschen. Der Niederschlag wurde durch Zentrifugation gewonnen und 5 bis 10 Min. im Vakuum getrocknet. Anschließend wurde das getrocknete Pulver 20 Min. in 6 M Guanidinhydrochlorid in 0,2 M Tris-HCl (pH-Wert 7,9), 2 mM DTT, 5 mM EDTA und 0,1% Rinderserumalbumin gelöst. Der Lösung wurde anschließend ein "Renaturierungs"-Puffer (20% Glycerin und 80% 0,2 M Tris-HCl (pH-Wert 7,9), 2 mM DTT, 5 mM EDTA und 0,1% Rinderserumalbumin) zugesetzt. Die Lösung wurde anschließend über Nacht bei 4ºC stehengelassen. Anschließend wurde auf eine die Phospholipase A&sub2; hemmende Aktivität, wie beschrieben, getestet. Die Aktivitäten der SDS-Gelfragmente sind in Fig. 18 dargestellt. Die Fragmente e-1, e-2, e-3, e-4 und e-5 mit den Molekulargewichten 33 K, 30 K, 27 K, 20 K bzw. 18 K zeigten eine die Phospholipase A&sub2; hemmende Aktivität.
Anschließend wurden die aktiven Hauptfragmente (e-1, e-4 und e-5 von Fig. 18) durch präparative SDS-Gelelektrophorese gereinigt. Die Polypeptid-Banden wurden sichtbar gemacht, indem das Gel in 0,25 M KCl getaucht wurde und die biologisch aktiven Polypeptid-Banden ausgeschnitten. Die Fragmente wurden unter Verwendung von Standardverfahren (Hunkapiller, M. W., Lujan, E., Ostrader F. und Hood, L. E., Methods Enzymol. 91 (1983), 227-236) elektroeluiert.
Die N-terminalen und C-terminalen Aminosäuresequenzen von e-1, e-4 und e-5 wurden ermittelt. Die gereinigten Fragmente zeigten alle die identische N-terminale Aminosäuresequenz: H&sub2;N-Gly-Gly-Pro-Gly-Ser-Ala-Val-Ser-Pro-Tyr. Dieses N-terminale Glycin entspricht dem Gly-30 des 37 K- Proteins.
Fig. 19 stellt die Peptid-Karten der Trypsinspaltung dieser gereinigten Fragmente dar. Diese Karten wurden mit der des 37 K-Proteins (Fig. 16) verglichen, und es wurde festgestellt, daß dem 18 K e-5-Fragment das Trypsin-Fragment Ala-Leu-Tyr-Glu-Ala-Gly-Glu-Arg (Reste #205-212 des 37 K- Proteins) und sämtliche Fragmente über diesem Peptid fehlten. Dies weist darauf hin, daß die Spaltung vor diesem Peptid war. Die Peptid-Karte enthält das Fragment Asn-Ala- Leu-Leu-Ser-Leu-Ala-Lys (Reste #178-185 des 37 K-Proteins). Daher ist der C-Terminus dieses Fragments zwischen Lys-185 und Arg-212 des 37 K-Proteins. In ähnlicher Weise enthält die Peptid-Karte des 20 K e-4-Fragments alle Fragmente, die im 18 K-Fragment festgestellt worden sind, sowie ein weiteres Peptid Ala-Leu-Tyr-Glu-Ala-Gly-Glu-Arg-Arg-Lys (Reste #205-214 des 37 K-Proteins). Der C-Terminus dieses Fragments ist daher zwischen Lys-214 und Arg-228 des 37 K-Proteins. Der C-Terminus des 33 K e-1-Fragments liegt zwischen Lys-337 und Asn-346 des 37 K-Proteins.
Daher wurden mindestens drei biologisch aktive Peptidfragmente des Lipocortin-ähnlichen 37 K-Polypeptids isoliert. Alle drei Fragmente weisen identische N-Termini auf, die mit Gly-30 des 37 K-Polypeptids beginnen, wobei jedes an einer unterschiedlichen Stelle entlang des 37 K- Moleküls endet. Alle drei zeigen die Phospholipase A&sub2; hemmende Aktivität des vollständigen Lipocortin-ähnlichen Polypeptids.
Obwohl die vorstehend beschriebenen Verfahren zur Herstellung von Polypeptidfragmenten aus in E. coli-produziertem menschlichem, Lipocortin-ähnlichem Polypeptid verwendet wurden, ist es selbstverständlich, daß solche Moleküle auch durch mehrere andere Verfahren produziert werden können. Beispielsweise können solche Moleküle durch andere als die verwendeten Proteasen oder durch Chemikalien produziert werden, die Peptidbindungen spalten oder synthetisieren können. Ferner können solche Moleküle auch durch Expression von diese Fragmente codierenden, verkürzten DNA- Sequenzen produziert werden. Dieses Verfahren kann jedoch unterschiedliche Reinigungsverfahren für jedes Fragment erfordern und führt gelegentlich zur Herstellung von DNA- Sequenzen, die im Expressionsvektor instabil sind.

H. Herstellung von biologisch aktiven, menschlichen, Lipocortin-ähnlichen Polypeptidfragmenten durch DNA- Rekombinationsverfahren

In einem alternativen Verfahren zur Erzeugung von Lipocortin-ähnlichen Polypeptidfragmenten durch DNA-Rekombinationsverfahren werden Codons in die Lipocortin-codierende DNA-Sequenz eingeführt, die bei der Expression der DNA-Sequenz in Form des Polypeptids Stellen ergeben, an denen das Polypeptid gespalten werden kann (z. B. chemisch oder proteolytisch). Diese Codons können durch mehrere im Stand der Technik bekannte Verfahren, beispielsweise Mutagenese oder Insertion, in die DNA eingeführt werden. Dementsprechend wird durch die Wirtszelle ein verändertes, Lipocortin-ähnliches Polypeptid produziert, in der gleichen Weise wie das nicht-veränderte, vollständige Polypeptid gereinigt und zum Erhalt eines gewünschten Fragments oder von Fragmenten gespalten. Unter Verwendung dieser Strategie wurde die erfindungsgemäße Lipocortin-DNA-Sequenz verändert, um veränderte Polypeptide herzustellen, die bei einer in vitro-Spaltung Lipocortin-ähnliche Polypeptidfragmente liefern, die die Phospholipase A&sub2; hemmende Aktivität zeigen.
Entsprechend einer Ausführungsform dieses Verfahrens wurden DNA-Sequenzen konstruiert, die veränderte, Lipocortin-ähnliche Polypeptide codieren, in denen die Lipocortin- DNA-Sequenz zur Einführung von Methionin-Codons in die Sequenz modifiziert wurde. Bei der Expression dieser Sequenz in einer Wirtszelle wurden veränderte, Lipocortin-ähnliche Polypeptide produziert, bei denen entweder eine spezifische Aminosäure durch ein Methionin ersetzt war, oder die ein inseriertes Methionin an einer bestimmten Stelle entlang der Polypeptidsequenz aufwiesen. Die Behandlung dieser veränderten Polypeptide mit Bromcyan, das Polypeptide spezifisch an Methionin-Resten spaltet, lieferte Lipocortin-ähnliche Polypeptidfragmente, die eine Phospholipase A&sub2; hemmende Aktivität aufwiesen.
Es wurde festgestellt, daß das natürliche, menschliche Lipocortin-Protein nur zwei Methionin-Reste (an den Aminosäuren 56 und 127) aufweist, die in den vorstehend in Beispiel G(2) beschriebenen, biologisch aktiven Elastase- Fragmenten enthalten sind. Da die Spaltung eines Lipocortinähnlichen Polypeptids mit Bromcyan das Polypeptid und jedes aus ihm erzeugte Fragment inaktivierte, wurde angenommen, daß eines oder beide dieser Methionine für die biologische Aktivität des Proteins erforderlich waren. Daher erforderte ein vorbereitender Schritt bei der Herstellung von aktiven Lipocortin-ähnlichem Polypeptidfragmenten durch Bromcyan- Behandlung den Ersatz dieser beiden Methionine durch eine andere Aminosäure, ohne das dadurch die biologische Aktivität des Lipocortin-Proteins zerstört wurde. Daher wurden die Methionine 56 und 127 durch Leucin-Reste ersetzt und nach einer Behandlung mit Bromcyan wurde ein biologisch aktives Polypeptidfragment erhalten.
Die Methionine 56 und 127 wurden durch Mutagenese der Lipocortin-codierenden DNA-Sequenz, wie nachstehend beschrieben, ersetzt: Das Plasmid pLiptrc155A, das die Lipocortin-codierende DNA-Sequenz enthält, wurde mit dem Restriktionsenzym PvuI gespalten, wobei ein linearisiertes pLiptrc155A-Molekül erhalten wurde. Das Plasmid pKK233-2 wurde mit den Restriktionsenzymen NcoI und HindIII ebenfalls gespalten, wobei sie das Plasmid auf jeder Seite der das Lipocortin codierenden DNA-Sequenz spalteten (vgl. zur Konstruktion dieser Plasmide Beispiel D und Fig. 6). Das Gemisch der beiden gespaltenen Plasmide lieferte nach der Denaturierung und erneuten Aneinanderlagerung eine Heteroduplex mit einer Lücke, wobei die das Lipocortin codierende DNA-Sequenz eine 1300 Basenpaare lange einzelsträngige Region war. Die mutagenen Oligonucleotide Lipo 60 und 61 wurden am 5'-Ende phosphoryliert und ein 320facher Überschuß dem Heteroduplex-Gemisch zugesetzt. Lipo 60 und 61 enthalten DNA-Sequenzen, die einem Teil der Lipocortin-DNA-Sequenz ähnlich waren, die jedoch spezifische Nucleotid-Veränderungen aufwiesen, so daß die Expression der Oligonucleotid-Sequenzen den Austausch von met 127 bzw. met 56 des Lipocortins gegen einen Leucin-Rest zur Folge hatte (vgl. Fig. 20). Diese Oligonucleotide hybridisierten daher an die einzelsträngige Region der Heteroduplex-Moleküle. Die DNA- Lücken in den Heteroduplex-Molekülen wurden mit dem Klenow- Fragment der DNA-Polymerase I aufgefüllt und die DNA mit T4- Ligase ligiert [vgl. Morinaga et al., Biotechnology 2 (1984), 636-39]. Der E. coli-Stamm JA221 wurde mit dieser DNA transformiert und durch Züchtung der Wirtszellen auf LB- Ampicillin-Platten selektiert.
Die Transformanten wurden durch Hybridisierung mit ³²P-markierten Oligonucleotiden Lipo 60 und 61, wie nachstehend beschrieben, nach Kolonien abgesucht, die eine veränderte Lipocortin-DNA-Sequenz enthielten: Die Kolonien wurden auf einen Nitrozellulose-Filter übertragen und die Filter mit der die Kolonie tragenden Seite nach oben auf eine frische LB-Ampicillin-Platte gelegt. Die Platte wurde 4 Std. bei 37ºC inkubiert. Der Filter wurde anschließend auf eine frische, Ampicillin und Chloramphenicol (250 ug/ml) enthaltende LB-Platte übertragen und die Platte über Nacht bei 37ºC inkubiert. Die Kolonien wurden mit 0,5 M NaOH-1,5 M NaCl lysiert und das Lysat zweimal mit 0,5 M Tris-HCl (pH- Wert 7,7)-1,5 M NaCl neutralisiert. Die Filter wurden in einem Vakuum-Ofen 2 Std. bei 80ºC gebacken und unter Schütteln mehrere Stunden bei 55ºC in 200 ml 6·SSPE (0,9 M NaCl, 90 mM Natriumphosphat, 6 mM Natrium-EDTA, pH-Wert 7,0), 0,5% SDS, 100 ug/ml tRNA und 5 x Denhardts-Lösung vorhybridisiert Die Filter wurden anschließend über Nacht bei 55ºC in 200 ml Vorhybridisierungs-Gemisch, das 10 pMol ³²P-markiertes Oligonucleotid enthielt, hybridisiert. Die Filter wurden mit 6·SSPE gewaschen und die Hybridisierung durch Autoradiographie nachgewiesen [vgl. Maniatis, T. et al., a. a. O.].
Mehrere positive Clone wurden durch dieses Verfahren isoliert. Einer dieser Clone mit der Bezeichnung Lipo 8 wurde gezüchtet, seine Plasmid-DNA mit der Bezeichnung pLipo 8 extrahiert und gemäß dem Verfahren von Maxam und Gilbert, a. a. O., sequenziert. Diese Sequenzanalyse zeigte, daß der beabsichtigte Austausch der Nucleotide, d. h., der Ersatz der met 56 und 127 codierenden DNA-Codons durch Leucin codierende Codons, erreicht worden war.
Das exprimierte Protein wurde auch aus Lipo 8 extrahiert und diese Präparation mit 3 mg/ml Bromcyan in 70% Ameisensäure behandelt, um Lipocortin-ähnliche Polypeptidfragmente herzustellen. Dieses Rohgemisch aus Fragmenten wurde unter Verwendung des vorstehend beschriebenen in vitro-Tests auf eine die Phospholipase A&sub2; hemmende Aktivität getestet. Während das Wildtyp-Lipocortin durch 1-stündige Bromcyan-Behandlung inaktiviert wurde, zeigte das Fragment- Gemisch nach 4 Stunden Behandlung eine Aktivität. Anschließend wurde durch SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese ein 26 kd-Polypeptidfragment aus diesem Gemisch isoliert (vgl. Fig. 21 und 22) und das Fragment, wie vorstehend in Beispiel G(2) beschrieben, renaturiert. Dieses gereinigte Fragment wurde unter Verwendung des in vitro-Tests auf eine die Phospholipase A&sub2; hemmende Aktivität getestet, und es wurde festgestellt, daß dieses große Lipo 8-Fragment biologische Aktivität zeigte.
Nachdem gezeigt worden war, daß der Ersatz von met 56 und 127 möglich ist, ohne die biologische Aktivität des erhaltenen Lipocortin-Polypeptidfragments zu beeinflussen, konnten anschließend weitere Aminosäure-Reste des Lipocortin-Proteins durch Methionin ersetzt oder Methionine in verschiedene Stellen innerhalb der Aminosäuresequenz des Lipocortin-Proteins inseriert werden. Auf diese Weise wurden neue Spaltfragmente von Lipocortin mit biologischer Aktivität isoliert.
Unter Verwendung des vorstehend skizzierten Verfahrens wurde beispielsweise das Leucin am Rest 109 der Aminosäuresequenz von Lipocortin durch ein Methionin ersetzt. Das mutagene Oligonucleotid Lipo 68 (vgl. Fig. 20) wurde an eine durch Spaltung der Plasmide pKK233-2 und pLipo8 (das mit dem pLiptrc155A von Fig. 6 identisch ist, ausgenommen der Nucleotid-Veränderungen von Lipo 60 und 61) erzeugte Heteroduplex hybridisiert. So wurde eine Transformante, Lipo 11, erhalten, die die gewünschten Nucleotid- Veränderungen enthielt, wobei Leu 109 durch ein Methionin ersetzt wurde. Die pLipo11-DNA wurde aus dieser Transformante extrahiert, und eine Sequenzierung zeigte, daß die gewünschten Nucleotid-Veränderungen erreicht worden waren. Der Clon Lipo 11 wurde anschließend in Kultur gezüchtet, das exprimierte Protein extrahiert und mit Bromcyan behandelt, um Fragmente herzustellen. Ein 14,6 kd-Polypeptidfragment (vgl. Fig. 21) wurde durch SDS-Polyacrylamid-Gelfiltration des behandelten Proteinextrakts isoliert [Vgl. Biorad Katalog/Preisliste K, 5. 37 (1985)], und dieses Fragment unter Verwendung des in vitro-Tests auf eine biologische Aktivität getestet. Dieser Test zeigte, daß das Lipo 11-Fragment eine die Phospholipase A&sub2; hemmende Aktivität aufwies.
In ähnlicher Weise wurde das Oligonucleotid Lipo 78 (vgl. Fig. 20) zur Erzeugung einer Transformante, Lipo 15, verwendet, die die gewünschten Nucleotid-Veränderungen enthielt, durch die Leu 198 durch ein Methionin ersetzt wurde. Die Spaltung des extrahierten exprimierten Proteins mit Bromcyan mit einer anschließend durchgeführten SDS-Polyacrylamid-Gelfiltration führte zur Reinigung eines 20,7 K- Polypeptidfragments (vgl. Fig. 21), das anschließend auf biologische Aktivität getestet wurde. Dieser Test zeigte, daß das Lipo 15-Fragment eine die Phospholipase A&sub2; hemmende Aktivität aufwies.
Außerdem wurde durch Insertion eines synthetischen Oligonucleotids in eine Spaltstelle auf der Lipocortin-DNA- Sequenz ein Methionin am Rest 169 in die Aminosäuresequenz von Lipocortin inseriert, wobei an dieser Stelle ein Codon für Methionin erzeugt wurde. pLipo8 wurde mit BgIII gespalten, und unter Verwendung von T4-Ligase wurden die Oligonucleotide Lipo 75 und 76 (vgl. Fig. 20) in diese Stelle ligiert. Diese komplementären Oligonucleotide wurden mit überstehenden Enden, die zu den überstehenden Enden der BglII-Stelle komplementär waren, konstruiert, um sie in das Plasmid inserieren zu können. Die E. coli JA221-Zellen wurden mit diesem Ligierungsgemisch transformiert und die Transformanten durch Züchtung auf einer LB-Ampicillin-Platte selektiert. Die Transformanten wurden durch Restriktions- Kartierung nach den Kolonien abgesucht, die die inserierten Oligonucleotide in der richtigen Orientierung enthielten. Eine solche Kolonie mit der Bezeichnung Lipo 9 wurde in Kultur gezüchtet und ihr exprimiertes Protein extrahiert. Der Protein-Rohextrakt wurde mit Bromcyan behandelt und eine SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese durchgeführt. Ein 17,7 kd-Polypeptidfragment wurde hergestellt und die zusätzlichen Aminosäuren, die durch Insertion der synthetischen Oligonucleotide in die Sequenz eingeführt worden waren, waren abgespalten (vgl. Fig. 21).
Es wurden so unter Verwendung von DNA-Rekombinationsverfahren mindestens drei biologisch aktive Lipocortinähnliche Polypeptidfragmente isoliert -- das 26 kd-Lipo 8- Fragment, das 14,6 kd-Lipo 11-Fragment und das 20,7 kd-Lipo 15-Fragment. Es ist jedoch selbstverständlich, daß durch das vorstehend beschriebene Verfahren weitere Lipocortin-ähnliche Polypeptidfragmente produziert werden können (z. B. durch Ersatz von weiteren Aminosäuren entlang der Aminosäuresequenz von Lipocortin durch Methionin). Ferner können Lipocortin-ähnliche Fragmente durch Veränderung der Lipocortin-codierenden DNA-Sequenz hergestellt werden, wobei zum Erhalt eines veränderten Polypeptids andere Aminosäuren als Methionin eingeführt oder inseriert werden. Dieses Polypeptid kann anschließend durch ein geeignetes Enzym oder eine geeignete Chemikalie gespalten werden, um biologisch aktive Fragmente zu erhalten (z. B. können Cysteine inseriert und das Protein mit NTCB, 2-Nitro-5-thiocyanobenzoesäure, gespalten werden).

Isolierung einer N-Lipocortin-codierenden DNA-Sequenz

Es wurde auch eine Nucleotidsequenz erhalten, die einen Teil von N-Lipocortin, einem menschlichen, Lipocortinähnlichen Polypeptid, codiert, das eine die Phospholipase A&sub2; hemmende Aktivität zeigt und eine Aminosäure-Homologie zum erfindungsgemäß hergestellten 37 kd-Lipocortin aufweist.

I. Reinigung von Lipocortin und N-Lipocortin aus menschlicher Plazenta

Eine frische Plazenta wurde unmittelbar nach der Geburt auf Eis gegeben und innerhalb von 6 Std., wie nachstehend beschrieben, verarbeitet: Die Plazenta wurde enthäutet, in Würfel geschnitten und das Gewebe zehnmal mit 300 ml eiskaltem PBS (50 mM Na&sub2;HPO&sub4;, pH-Wert 7,2, 150 mM NaCl) und 5% Saccharose gewaschen, bis das Gewebe rosa war und kein weiteres Hämoglobin ausgewaschen wurde. Die gewaschene Plazenta wog etwa 350 g.
30 g Plazenta-Gewebe wurden mit 150 ml Extraktionspuffer (25 mM Tris-HCl, pH-Wert 7,7, 5 mM EDTA, 0,1 mg/ml Aprotinin, 0,1 mg/ml Soyabohnen-Trypsin-Inhibitor und 40 uM Pepstatin A) gewaschen und anschließend wurde das Gewebe in 100 ml des gleichen Puffers suspendiert. Die Präparation wurde 5 bis 7 Min. auf Eis mit einem Polytron aufgebrochen und das Homogenat 15 Min. bei 4ºC in einem SS34-Rotor mit 10 000 UpM zentrifugiert. Die Überstände wurden dekantiert, die Pellets mit einem Polytron in weiteren 100 ml Extraktionspuffer aufgebrochen und die Suspension erneut 15 Min. mit 10 000 UpM zentrifugiert. Die Überstände beider Extraktionen wurden vereinigt und weiterverarbeitet.
Zuerst wurde mit dem Extrakt auf einer 80 ml-Säule (DE52, Whatman Ltd., Säulenabmessungen: 2,5 cm Durchmesser· 16 cm), die mit 25 mM Tris-HCl (pH-Wert 7,7) äquilibriert worden war, eine DEAE-Zellulose-Chromatographie durchgeführt. Die durchlaufenden Präparationen wurden durch Ultrafiltration mit einer Amicon-PM10-Membran auf 15 ml konzentriert. Anschließend wurden die konzentrierten Präparationen 15 Min. mit 18 000 x g in einem SS34-Rotor zentrifugiert. Die relative Ionen-Stärke des Konzentrats wurde näherungsweise durch Messung der Leitfähigkeit des Durchlauf s der Ultrafiltration bestimmt. Ausgehend von diesem Wert wurde das Konzentrat mit Wasser bis zu einer relativen Ionen-Stärke, die der von 25 mM Tris-HCl (pH-Wert 7,7) (10 ml Wasser wurden zugesetzt) entsprach, verdünnt. Anschließend wurde mit dieser Präparation ein zweiter DEAE- Zellulose-Schritt auf einer 40 ml Säule durchgeführt und der DEAE-Durchlauf durch Gelfiltrations-Chromatographie auf einer 200 ml P150-Säule (Säulenabmessungen: 2,5 cm Durchmesser ·40 cm) weiter fraktioniert, wobei dies ebenfalls in 25 mM Tris-HCl (pH-Wert 7,7) durchgeführt wurde. 5 ml-Fraktionen dieses Eluats wurden gesammelt und ein Aliquot unter Verwendung des vorstehend in Beispiel A beschriebenen in vitro-Tests auf eine die Phospholipase hemmende Aktivität getestet. Entsprechend diesem Test enthielt das Eluat einen einzelnen breiten Peak mit hemmender Aktivität mit einem relativen Molekulargewicht von 40 K, wie durch Gelfiltration ermittelt. Ein Aliquot des Eluats wurde auch durch SDS- Polyacrylamid-Gelelektrophorese charakterisiert. Diese Gelanalyse zeigte, daß die hemmende Aktivität im Eluat einer auffallenden Protein-Bande mit 35 kd entsprach. Eine Western-Blot-Analyse zeigte, daß die 35 kd-Bande mit einem Kaninchen-Antiserum gegen in E. coli produziertes rekombinantes Lipocortin immunreaktiv war.
Anschließend wurde mit dem Eluat der Gelfiltrationssäule unter Verwendung eines Gradienten von 0 bis 75% Acetonitril in 0,1% Trifluoressigsäure auf einer C4-Säule (Vydac) eine Umkehrphasen-Hochdruck-Flüssigkeitschromatographie (HPLC) durchgeführt, um die gebundenen Fragmente zu eluieren. Es wurde festgestellt, daß das Eluat tatsächlich zwei 35 kd-Bestandteile enthielt: einen natürlichen, menschlichen Lipocortin-Bestandteil, der bei 65,8% Acetonitril aus der Säule eluierte und einen N-Lipocortin-Bestandteil, der bei 65,1% Acetonitril eluierte. Nur der natürliche Lipocortin-Bestandteil war mit dem gegen rekombinantes Lipocortin gerichteten Antikörper immunreaktiv.
Zur weiteren Reinigung der beiden Bestandteile unter Erhalt der die Phospholipase A&sub2; hemmenden Aktivität wurde mit der partiell gereinigten Präparation aus der Gelfiltrations-Säule eine schnelle Protein-Flüssigkeitschromatographie (FPLC, Pharmacia) auf einem hochauflösenden, Kationen-Austauscher Mono-S-Chromatographieharz (HR5/5, Pharmacia) durchgeführt. Bei einem pH-wert von 6,0 in 50 mM MES- Puffer (2-Morpholinethansulfonsäure) banden beide Bestandteile an die Mono-S-Säule und wurden mit einem NaCl- Gradienten eluiert. Fig. 23 stellt das Elutionsprofil der Proteine dar (bei 280 nm aufgenommene Absorption) (Bild A) und das Profil der die Phospholipase A&sub2; hemmenden Aktivität aus der Mono-S-Säule (Bild B). In Bild A entspricht Peak I dem Lipocortin und Peak II dem N-Lipocortin. Nur das Material in Peak I war mit Kaninchen-Antiserum gegen rekombinantes Lipocortin immunreaktiv. Bild B zeigt deutlich, daß sowohl Lipocortin als auch N-Lipocortin eine die Phospholipase A&sub2; hemmende Aktivität aufweisen. Ausgehend von ihren relativen Mengen in den gereinigten Präparationen wird angenommen, daß die spezifischen Aktivitäten der beiden Proteine als Phospholipase-Inhibitoren etwa identisch sind.
Diese beiden Proteine wurden auch durch Trypsin- Kartierung analysiert. Ein größerer Teil einer Plazenta wurde verarbeitet und die Proteine unter Verwendung des vorstehend genau beschriebenen Protokolls gereinigt. Die Größen und Volumina von Lösungen und Säulen wurden in geeigneter Weise angepaßt. Nach der Trennung der beiden 35 kd-Proteine durch Umkehrphasen-HPLC wurde mit jeweils 100 ug der gereinigten Proteine eine Trypsin-Kartierungsanalyse, wie nachstehend beschrieben, durchgeführt: Die geeigneten HPLC-Fraktionen wurden im Vakuum in einem "Speed-Vac"-Konzentrationsgerät (Savant) getrocknet, die erhaltenen Pellets in 400 ul 0,1 M Ammoniumbicarbonat, pH-Wert 8,0, 0,1 mM CaCl&sub2;, resuspendiert, und das erhaltene Gemisch wurde mit Trypsin gespalten. TPCK-Trypsin (Worthington, 5 ug insgesamt) wurden 100 ug Protein zugesetzt, und es wurde 16 Std. bei 37ºC gespalten. Das Trypsin wurde in drei gleichen Aliquots zugesetzt: das erste zur Zeit 0, das zweite nach 4 Stunden und das dritte nach 12 Std. Inkubation. Das Spaltprodukt wurde mit Ameisensäure auf 20% (Vol./Vol.) angesäuert.
Anschließend wurden die gespaltenen Fragmente der Trypsin-Spaltung bei 40ºC, wie vorstehend in Beispiel A beschrieben, auf einer C-18-Säule durch Umkehrphasen-Hochdruck-Flüssigkeitschromatographie getrennt. Das Säulen-Eluat wurde bei 214 nm überwacht. Die Karten der Trypsinspaltung für Lipocortin (Bild A) und N-Lipocortin (Bild B) sind in Fig. 24 dargestellt. Die Karten der Trypsinspaltung des aus der Plazenta isolierten natürlichen, menschlichen Lipocortins ist mit der Karte der Trypsinspaltung identisch, die vom 37 kd-Lipocortin erhalten wurde, das bei der Expression von menschlicher Makrophagen-cDNA entsteht. Die DNA-Sequenz- Analyse zeigte zwei Unterschiede in den Aminosäuren zwischen den von der Plazenta und den von Makrophagen stammenden Lipocortinen. Die Karte für N-Lipocortin zeigt, daß es sich um ein einziges Protein handelt.
Die Eluat-Fraktionen, denen elf der Peaks von der Karte der Trypsinspaltung von N-Lipocortin entsprachen, wurden auf einem "Speed Vac"-Konzentrationsgerät konzentriert und mit ihnen unter Verwendung eines Gasphasen- Sequenzierers (Applied-Biosystems 470A) eine Protein- Sequenzanalyse des Amino-Terminus durchgeführt. Die PTH- Aminosäuren von jedem Zyklus des Edman-Abbaus wurden durch Umkehrphasen-Hochdruck-Flüssigkeitschromatographie unter Verwendung des Applied-Biosystems-120A-PTH-Analysators analysiert. Die von diesen Analysen stammenden Sequenzen sind in Fig. 25 dargestellt. (Die "T"-Zahlen auf der linken Seite der Sequenzen in Fig. 25 entsprechen den Nummern der Peaks, die auf dem Säulen-Profil im oberen Teil der Figur gezeigt sind).
Der größte Teil der Peptidsequenzen von N-Lipocortin ist einmalig, obwohl einige eine Sequenz-Homologie zu erfindungsgemäß gereinigtem, menschlichem Lipocortin zeigen, was darauf hinweist, daß die beiden 35 kd-Bestandteile -- Lipocortin bzw. N-Lipocortin -- von der gleichen Protein- Familie abgeleitet werden können. Wie in der Fig. 25 dargestellt, wurde bis jetzt die Primärstruktur von etwa einem Drittel des N-Lipocortin-Moleküls ermittelt. Da die Sequenzen dieser Fragmente, die von mehrere Fragmente enthaltenden HPLC-Peaks stammen, unter Verwendung von im Stand der Technik bekannten Verfahren bestimmt werden können, wurden somit die zur Bestimmung der Primärstruktur von etwa 50% des Moleküls erforderlichen Daten bereitgestellt.

J. Synthese von Oligonucleotid-Sonden für N-Lipocortin- Proteinsequenzen

Nach der Ermittlung der Aminosäuresequenzen von unterschiedlichen Regionen von N-Lipocortin der menschlichen Plazenta (vgl. Fig. 25) wurden vier Pools von anti-Sense- Oligonucleotid-DNA-Sonden, die einige dieser Protein-Sequenzen codierten, synthetisiert. Es wurden die gleiche Strategie und das gleiche Verfahren verwendet, wie vorstehend in Beispiel B für das rekombinante Lipocortin genauer beschrieben. Die Aminosäuresequenzen der vier ausgewählten Regionen von N-Lipocortin und sämtliche möglichen, sie codierenden Nucleotid-Codon-Kombinationen sind in Fig. 26 dargestellt. Degenerationen des Codes werden, wie nachstehend dargestellt, angegeben: N = C, T, A oder G, R = A oder G, Y = C oder T, H = A, C oder T, P = G oder C, X = A, G oder T und Z = A oder T.
Wie in Fig. 26 dargestellt, entsprechen die vier Pools von DNA-Sonden den Aminosäuresequenzen der Trypsin- Fragmente T20, T25, T24 bzw. T9. Um die Degeneration in den Sonden weiter zu reduzieren, wurde jeder Pool in Subpools aufgeteilt. Die Oligonucleotide NLip1 bis NLip3, die der Aminosäuresequenz von Fragment T20 entsprechen, sind 24-mere mit 128facher Degeneration. Die Oligonucleotide NLip4 bis NLip7 sind 18-mere mit 32facher Degeneration und der Amino- Säuresequenz von Fragment T25 homolog. Die Oligonucleotide NLip8 bis NLipl1, die der Aminosäuresequenz von Fragment T24 entsprechen, sind 20-mere mit 72facher Degeneration, und NLip12 bis NLip15, die von der Aminosäuresequenz von Fragment T9 abgeleitet sind, sind 17-mere mit 128facher Degeneration.
Um zu testen, ob die synthetischen Sonden tatsächlich menschliche Sequenzen erkannten, wurden die 3 Subpools NLip1, NLip2 und NLip3, deren Enden unter Verwendung von [γ]-³²P-ATP und T4-Polynucleotid-Kinase mit ³²P markiert worden waren, unter Verwendung des Northern-Blot-Verfahrens [Lehrach, H. et al., a. a. O.] an GeneScreen-Filter hybridisiert, die Poly(A)&spplus;-mRNA der menschlichen Plazenta enthielten. Der Subpool NLip1 hybridisierte an eine 1800 NucleotidmRNA, die anscheinend die gleiche Größe wie die LipocortinmRNA aufwies.

K. Konstruktion und Absuchen einer menschlichen PlazentacDNA-Bank

Eine menschliche cDNA-Bank wurde aus Poly(A)&spplus;-mRNA konstruiert, die aus menschlicher Plazenta unter Verwendung des im wesentlichen gleichen Verfahrens isoliert worden ist, das wie vorstehend in Beispiel C zur Konstruktion der menschlichen Makrophagen-cDNA-Bank beschrieben worden ist. In dieser Ausführungsform wurde jedoch die gesamte RNA durch das Guanidinisothiocyanat-Verfahren, wie es im wesentlichen von Chirgwin, J.M. et al., [Biochemistry 18 (1979), 5294-99] beschrieben worden ist, aus der menschlichen Plazenta eines weiblichen Fötus extrahiert. Diese RNA-Präparation wurde durch zwei Passagen über eine Oligo(dT)-Zellulosesäule (PL- Biochem.) mit Poly(A)&spplus;-RNA angereichert und zur Synthese von doppelsträngigen cDNA-Sequenzen verwendet, die anschließend in λgt10 inseriert und in E. coli C600 hfl-Zellen vermehrt worden sind.
Die menschliche Plazenta-cDNA-Bank wurde unter Verwendung von Nitrozellulose-Filtern, wie nachstehend beschrieben, mit der markierten Oligonucleotid-Sonde NLip1 abgesucht. Eine über Nacht gezüchtete Kultur von C600-hfl- Zellen in L-Nährlösung und 0,2% Maltose wurde pelletiert und in einer gleichen Menge SM-Puffer resuspendiert. 2·10&sup6; Phagen-Partikel wurden 15 Min. bei Raumtemperatur an 0,9 ml Zellen präadsorbiert. Die Suspension wurde bei 55ºC auf 50 ml in LB mit 10 mM MgSO&sub4; und 0,7% Agarose verdünnt und auf LB-Platten mit 10 mM MgSO&sub4; plattiert. 30 solcher Platten wurden abgesucht. Die Platten wurden etwa 5 Std. bei 37ºC inkubiert und anschließend 1 Std. auf 4ºC abgekühlt, um die Agarose hart werden zu lassen. Anschließend wurden die λ- Phagen-Partikel von den Plaques der Genbank-Platten auf S & S-Nitrozellulose-Filter durch 5-minütiges Auflegen der Filter auf die die rekombinanten Plaques enthaltenden Platten übertragen. Die Filter wurden anschließend von den Platten genommen, die Phagen auf den Filtern durch 5- minütiges Auflegen der Filter auf eine Lösung aus 0,5 N NaOH-1,5 M NaCl lysiert, neutralisiert und die Filter in 1 M Tris-HCl-1,5 M NaCl (pH-Wert 7,0) getaucht. Die Filter wurden anschließend an der Luft getrocknet und 2 Std. bei 80ºC gebacken.
Die behandelten Filter wurden an die Oligonucleotid- Sonde NLip1 in 0,2% Polyvinylpyrrolidon (M. G. 40 000), 0,2 % Ficoll (M. G. 400 000), 0,2% Rinderserumalbumin, 0,05 M Tris-HCl (pH-Wert 7,5), 1 M Natriumchlorid, 0,1% Natriumpyrophosphat, 1% SDS, 10% Dextransulfat (M. G. 500 000) und denaturierter Lachssperma-DNA (≥ 100 ug/ml) gemäß den Angaben des Herstellers (New England Nuclear) für Kolonie/Plaque-Screen-TM-Membranen vorhybridisiert und hybridisiert. Die hybridisierenden cDNA-Sequenzen wurden durch Autoradiographie nachgewiesen.
Unter Verwendung dieses Verfahrens wurden sechs positive Plaques ausgewählt und unter Verwendung der gleichen Sonde bei einer geringeren Dichte erneut abgesucht. Die DNA dieser Clone wurde isoliert, mit EcoRI gespalten und die Sequenzen unter Verwendung des Southern-Blot-Verfahrens [Southern, E. M., a. a. O.] an die NLip1-Sonde hybridisiert. Die cDNA-Insertionen von allen sechs Clonen hybridisierten an die NLip1-Sonde.
Die DNA dieser Phagen wurde anschließend mit EcoRI gespalten und die cDNA-Insertionen wurden isoliert. Die Spaltung von einem der Clone, λ-NLipo21-2, mit EcoRI ergab ein Fragment von etwa 500 Basenpaaren, das in das Plasmid pUC9 subcloniert wurde, um das Plasmid pNLip1 herzustellen. Dieses Plasmid wurde durch das Verfahren von Maxam und Gilbert [Maxam, A. M., und Gilbert, W., a. a. O.) sequenziert. Wie in Fig. 27 dargestellt, trägt das Plasmid eine 394 Basenpaar-cDNA-Insertion, die 99 Basenpaare der N- Lipocortin-codierenden Sequenz (die 33 Aminosäuren entsprechen) enthält, und 295 Basenpaare der 3'-seitig vom N- Lipocortin liegenden, nicht-codierenden Region, die eine Poly(A)-Anknüpfungsstelle und einen etwa 50 Basenpaare langen Poly(A)-Schwanz beinhaltet. Die codierende DNA-Sequenz von N-Lipocortin enthält nicht nur die Sequenz, die der Oligonucleotid-Sonde entspricht, die vom Trypsin-Fragment T20 abstammt, d. h., NLip1, sondern auch die Sequenz, die dem Trypsin-Fragment T32 entspricht (vgl. Fig. 25), wodurch sich bestätigte, daß ein Teil des Gens cloniert worden ist, das das N-Lipocortin-Protein codiert. Diese cDNA-Sequenz sowie die Oligonucleotid-Sonden, die in Beispiel J beschrieben worden sind, können nun als Sonden verwendet werden, um die das vollständige N-Lipocortin codierende DNA-Sequenz zu suchen und zu isolieren.
Obwohl der Clon λ-NLipo21-2 die N-Lipocortin-DNA- Sequenz enthält, die nur eine kleine Region des Proteins codiert, zeigt sich die strukturelle Homologie zwischen Lipocortin und N-Lipocortin durch diese Region. Wie nachstehend in Tabelle 4 beschrieben, sind 11 der letzten 17 Aminosäuren am Carboxy-Terminus der beiden Proteine identisch. Die fünf Unterschiede sind meistens konservative Aminosäure-Austausche. Ausgehend von der Ähnlichkeit in der die Phospholipase A&sub2; hemmenden Aktivität der beiden Proteine und der Ähnlichkeit der Protein- und DNA-Sequenzen der Proteine wurde geschlossen, daß N-Lipocortin und Lipocortin eine Familie von verwandten Proteinen darstellen.

Tabelle IV

Sequenz-Homologie am C-Terminus von Lipocortin und N- Lipocortin

Ein Vergleich der Nucleotidsequenzen des erfindungsgemäßen Lipocortins und N-Lipocortins zeigt eine Homologie von etwa 60% (vgl. Fig. 28).
Eine Referenzkultur für die durch die hier beschriebenen Verfahren hergestellten Mikroorganismen und rekombinanten DNA-Sequenzen wurde bei der Kultursammlung der In Vitro International, Inc., Ann Arbor, Michigan hinterlegt. Die Kultur wurde am 8. Januar 1986 hinterlegt und ist wie nachstehend beschrieben gekennzeichnet:
E. coli JA221 (pNLip1): IVI Nr. 10093 (nun auf die ATCC-Hinterlegungsnr. 68811 transferriert).

Erhöhung der Ausbeute und Aktivität von erfindungsgemäß hergestellten, menschlichen, Lipocortin-ähnlichen Polypeptiden

Die produzierte Menge eines Proteins wird von drei Hauptfaktoren beherrscht: der Zahl der Kopien seines Gens innerhalb der Zelle, der Effizienz mit der diese Genkopien transkribiert und der Effizienz mit der sie translatiert werden. Die Effizienz von Transkription und Translation (die zusammen die Expression umfassen) hängt andererseits von den Nucleotidsequenzen ab, die üblicherweise vor der gewunschten codierenden Sequenz liegen. Diese Nucleotidsequenzen oder Expressions-Kontrollsequenzen definieren unter anderem den Ort, mit dem die RNA-Polymerase zur Initiation der Transkription interagiert (die Promotorsequenz), und den Ort auf der mRNA (Transkriptionsprodukt), an den zur Initiation der Translation Ribosomen binden und mit dem sie interagieren. Nicht jede der Expressions-Kontrollsequenzen funktioniert mit der gleichen Effizienz. Es ist daher vorteilhaft, die erfindungsgemäßen, spezifischen, Lipocortin-codierenden Sequenzen von ihren benachbarten Nucleotidsequenzen zu trennen und sie statt dessen an andere bekannte Expressions-Kontrollsequenzen zu fusionieren, um die Expression und Produktion größerer Mengen von Lipocortin-ähnlichen Polypeptiden zu begünstigen. Nachdem dies erreicht worden ist, können die neu konstruierten DNA-Fragmente in Plasmide mit hoher Kopienzahl oder Bakteriophagen-Derivate inseriert werden, um die Zahl der Genkopien innerhalb der Zelle und dadurch die Ausbeute an exprimierten Lipocortin-ähnlichen Polypeptiden zu erhöhen.
Es können mehrere Expressions-Kontrollsequenzen, wie vorstehend beschrieben, verwendet werden. Zu diesen gehören die Operator-, Promotor- und Ribosomen-Bindungs- und Interaktionssequenzen (einschließlich von Sequenzen wie beispielsweise der Shine-Dalgarno-Sequenzen) des Lactose- Operons von E. coli ("das lac-System"), die entsprechenden Sequenzen des Tryptophan-Synthetase-Systems von E. coli ("das trp-System"), die Haupt-Operator- und Promotorregionen des Phagen λ (OLPL, wie vorstehend beschrieben, und ORPR), eine Kontrollregion von filamentösen, einzelsträngigen DNA- Phagen, das tac- oder trc-System, der Promotor für die 3- Phosphoglycerat-Kinase oder andere glycolytische Enzyme, die Promotoren der sauren Phosphatase, z. B. Pho5, die Promotoren der α-Paarungsfaktoren der Hefe, Promotoren für Säugerzellen, beispielsweise die frühen und späten Promotoren von SV40, der späte Promotor von Adenovirus und der Metallothionin-Promotor und andere Sequenzen, die die Expression von Genen von prokaryotischen oder eukaryotischen Zellen und ihrer Viren oder Kombinationen davon kontrollieren.
Zur Erhöhung der Produktion von erfindungsgemäßen, Lipocortin-ähnlichen Polypeptiden können daher die DNA- Sequenzen für diese Polypeptide wie vorstehend beschrieben hergestellt und in ein rekombinantes DNA-Molekül näher an ihre vorherige Expressions-Kontrollsequenz oder unter der Kontrolle einer der vorstehend beschriebenen, besseren Expressions-Kontrollsequenzen inseriert werden. Solche Verfahren sind im Stand der Technik bekannt.
Zu weiteren Verfahren, die zur Erhöhung der Effizienz der Translation nützlich sind, gehört die Insertion von chemisch oder enzymatisch hergestellten Oligonucleotiden vor dem initiierenden Codon der erfindungsgemäßen, Lipocortinverwandten DNA-Sequenzen oder der Austausch von Codons am N- Terminus der DNA-Sequenz durch diese chemisch oder enzymatisch hergestellten Oligonucleotide. Durch dieses Verfahren kann eine optimalere Primär-Struktur und Struktur höherer Ordnung der Messenger-RNA erhalten werden. Insbesondere kann eine Sequenz so verändert werden, daß das initiierende AUG- Codon in einer leicht zugänglichen Position (d. h., nicht durch eine Sekundärstruktur maskiert) entweder auf der Spitze einer Haarnadelstruktur oder in anderen einzelsträngigen Regionen vorkommt. Die Position und Sequenz des vorstehend beschriebenen Shine-Dalgarno-Segments können in ähnlicher Weise optimiert werden. Die Wichtigkeit der allgemeinen Struktur (Faltung) der Messenger-RNA ist dokumentiert worden (Iserentant, D., und Fiers, W., "Secondary Structure Of mRNA And Efficiency Of Translation Initiation", Gene 9 (1980), S. 1-12).
Die zelluläre Ausbeute der erfindungsgemäßen, Lipocortin-ähnlichen Polypeptide kann weiter erhöht werden, indem die Zahl der in der Zelle verwendbaren Gene erhöht wird. Dies kann durch Insertion des Lipocortin-Gens (mit oder ohne seine(n) Transkriptions- und Translations-Kontrollelemente(n)) in ein Plasmid mit höherer Kopienzahl oder in ein Temperatur-induzierbares Plasmid mit kontrollierter Kopienzahl (d. h., ein Plasmid, das eine Mutation trägt, die die Kopienzahl des Plasmids nach einer Veränderung der Temperatur erhöht (Uhlin, B. et al., "Plasmids With Temperature-Dependent Copy Number For Amplification Of Cloned Genes And Their Products", Gene 6 (1979), 91-106)) erreicht werden.
Andererseits kann eine Erhöhung der Gen-Dosis beispielsweise durch Insertion von in der vorstehend beschriebenen Weise konstruierten, rekombinanten DNA-Molekülen in den temperenten Bakteriophagen λ erreicht werden, am einfachsten durch Spaltung des Plasmids mit einem Restriktionsenzym, um ein lineares Molekül zu erhalten, das anschließend mit einem gespaltenen Phagen λ-Clonierungsvehikel vermischt wird (z. B. von dem Typ, der von Murray, N. E. et al., "Lambdoid Phages That Simplify The Recovery Of In Vitro Recombinants", Mol. Gen. Genet. 150 (1977), 53-61, und Murray, N. E. et al., "Molecular Cloning Of The DNA Ligase Gene From Bacteriophage T4", J. Mol. Biol. 132 (1979), 493- 505, beschrieben worden ist), wobei das rekombinante DNA- Molekül durch Inkubation mit DNA-Ligase erzeugt wird. Der gewünschte rekombinante Phage wird anschließend selektiert und zur Lysogenisierung eines Wirtsstamms von E. coli verwendet.
Daher sollte es selbstverständlich sein, daß die das Lipocortin-ähnliche Polypeptid codierenden erfindungsgemäßen Sequenzen aus den beschriebenen Vektoren entfernt und in andere Expressionsvektoren inseriert werden können, wie vorstehend beschrieben, und daß diese Vektoren in unterschiedlichen Wirten, wie vorstehend beschrieben, verwendet werden können, um die Produktion von erfindungsgemäßen, menschlichen, Lipocortin-ähnlichen Polypeptiden zu erhöhen.
Während hier vorstehend einige erfindungsgemäße Ausführungsformen vorgestellt wurden, liegt es auf der Hand, daß die Grundkonstruktion verändert werden kann, um andere Ausführungsformen bereitzustellen, die die erfindungsgemäßen Verfahren und Zusammensetzungen verwenden. Daher wird der Schutzbereich der Erfindung durch die beigefügten Ansprüche definiert und nicht durch die speziellen Ausführungsformen, die hier vorstehend als Beispiele vorgebracht worden sind.

Claims

1. Rekombinantes DNA-Molekül, gekennzeichnet durch eine DNA-Sequenz, die ein menschliches Polypeptid mit Hemmwirkung auf Phospholipase A&sub2; und der immunologischen Aktivität eines menschlichen Lipocortins codiert und ausgewählt ist aus der Gruppen bestehend aus

(a) der cDNA-Insertion von λLC,

(b) DNA-Sequenzen, die mit der DNA-Insertion von Anspruch 1 (a) hybridisieren und ein menschliches Polypeptid mit Hemmwirkung auf Phospholipase A&sub2; und einer immunologischen Aktivität des von der cDNA-Insertion von Teil (a), oben, codierten menschlichen Lipocortins codieren, und

(c) DNA-Sequenzen, die als Ergebnis des genetischen Codes gegenüber der DNA-Insertion und den Sequenzen von (a) und (b), oben, degeneriert sind.

2. Rekombinantes DNA-Molekül nach Anspruch 1, wobei die DNA-Sequenz besteht aus:

3. Rekombinantes DNA-Molekül, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus:

(a) der cDNA-Insertion von pNLip1 (ATCC-Hinterlegung Nr. 68811), die an beiden Enden von EcoRI- Restriktionsstellen begrenzt ist,

(b) DNA-Sequenzen, die mit der DNA-Insertion nach Anspruch 3(a) hybridisieren und ein menschliches Polypeptid codieren, das eine Hemmwirkung auf die Phospholipase A&sub2; und eine immunologische Aktivität des menschlichen Lipocortins aufweist, das von der vorstehenden cDNA-Insertion von Teil (a) codiert wird, und

(c) DNA-Sequenzen, die als Ergebnis des genetischen Codes gegenüber der vorstehenden DNA-Insertion und den Sequenzen von (a) und (b), oben, degeneriert sind.

4. Rekombinantes DNA-Molekül, gekennzeichnet durch die Sequenz:

5. Rekombinantes DNA-Molekül nach Anspruch 1 oder 2, wobei die DNA-Sequenz funktionell an eine Expressionskontrollsequenz im Molekül gebunden ist.

6. Rekombinantes DNA-Molekül nach Anspruch 5, wobei die Expressionskontrollsequenz ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus dem lac-System, β-Lactamase-System, trp-System, tac-System, trc-System, den wichtigsten Operator- und Promotorregionen des Phagen λ, der Kontrollregion des fd-Hüllproteins, dem Promotor der 3- Phosphoglycerat-Kinase oder anderen glycolytischen Enzymen, den Promotoren der sauren Phosphatase, den Promotoren der α-Paarungssfaktoren der Hefe, Promotoren von Säugerzellen, den frühen und späten Promotoren von SV40, dem späten Promotor von Adenovirus und dem Metallothionin-Promotor und weiteren Sequenzen, die die Expression von Genen von prokaryotischen oder eukaryotischen Zellen und ihrer Viren und deren Kombinationen kontrollieren.

7. Rekombinantes DNA-Molekül nach Anspruch 5, das ausgewählt ist aus der Gruppe, die aus pLipPLT4A, pLipPLT4T und pSVL9109 besteht.

8. Rekombinantes DNA-Molekül pBg120 (ATCC-Hinterlegung Nr. 74106).

9. Rekombinantes DNA-Molekül pNLip1 (ATCC-Hinterlegung Nr. 68811).

10. Einzelliger Wirt, der mit mindestens einem rekombinanten DNA-Molekül nach Anspruch 5 transformiert ist.

11. Transformierter Wirt nach Anspruch 10, der ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus den Stämmen E. coli, Pseudomonas, Bacillus und Streptomyces, und aus Hefezellen oder anderen Pilzen, Mauszellen oder anderen Zellen von tierischen oder pflanzlichen Wirten und Zellen von menschlichem Gewebe.

12. Menschliches Polypeptid, das eine Hemmwirkung auf die Phospholipase A&sub2; und die immunologische Aktivität eines menschlichen Lipocortins aufweist, wobei das Polypeptid ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus

(a)

(b)

und

(c) Polypeptidfragmenten des Polypeptids des vorstehenden Teils (a) oder (b), das eine biologische oder immunologische Aktivität des im vorstehenden Teil (a) oder (b) definierten Lipocortins zeigt.

13. N-Lipocortin-Polypeptid, das durch die nachstehenden Eigenschaften gekennzeichnet ist:

(a) es hat die Fähigkeit zur Hemmung des Enzyms Phospholipase A&sub2;,

(b) es enthält die Trypsin-Fragmente:

(1) LeuTyrAspSerMetLys;

(2) LeuSerLeuAsnGlyAspThrSer ThrProProSerAlaTyrGly;

(3) SerLeuTyrTyrTyrIleGln GlnAspThrLys;

(4) TrpIleSerIleMetThrGluArg;

(5) SerTyrSerProTyrAspMet LeuGluSerIle;

(6) LeuLeuValValTyrProX ThrGlnIleLeu;

wobei X eine beliebige Aminosäure ist, und

(c) es weist einen Carboxy-Terminus auf, der aus der Aminosäuresequenz

besteht.

14. Menschliches Lipocortin-ähnliches Polypeptid, das von den rekombinanten DNA-Molekülen nach Anspruch 1 oder 2 codiert wird.

15. Polypeptid nach Anspruch 12, wobei das Polypeptid ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus

(a)

(c)

(f)

16. Polypeptid nach Anspruch 12, wobei das Polypeptid die Aminosäuresequenz

aufweist.

17. DNA-Sequenz, bestehend aus

18. DNA-Sequenz, bestehend aus

19. Verfahren zur Herstellung eines menschlichen Polypeptids, das eine Hemmwirkung auf die Phospholipase A&sub2; und die immunologische Aktivität eines menschlichen Lipocortins aufweist, umfassend die Schritte der Züchtung eines mit einem rekombinanten DNA-Molekül nach Anspruch 5 transformierten Wirts und Gewinnung des Polypeptids.

20. Pharmazeutisch verträgliche Zusammensetzung, die zur Behandlung von arthritischen, allergischen, dermatologischen, ophthalmischen und Kollagen-Erkrankungen und anderen Störungen nützlich ist, einschließlich entzündlicher Vorgänge, umfassend eine pharmazeutisch wirksame Menge von mindestens einem Polypeptid, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Polypeptiden nach Anspruch 12, 14, 15 oder 16.

21. Pharmazeutisch verträgliche Zusammensetzung, die zur Behandlung von arthritischen, allergischen, dermatologischen, ophthalmischen und Kollagen-Erkrankungen und anderen Störungen nützlich ist, einschließlich entzündlicher Vorgänge, umfassend eine pharmazeutisch wirksame Menge von mindestens einem Polypeptid nach Anspruch 13.