JP2983224B2 - 哺乳動物の１４―β―ｇａ１レクチン類 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明，糖結合タンパク類を細胞の分化および免疫性
の調節物質として使用することに関する。特に，本発
明，ラクトースまたは界面活性剤で抽出可能な分子量約
12〜18kDaの哺乳動物レクチン類（好ましくは，グリコ
シル化部位を含む）と，ヒトのHL−60細胞および胎盤組
織に由来する特異な14kDaレクチンと，約17〜20kDaの分
子量範囲を有するこの特異なレクチンのグリコシル化形
とに関する。これらはすべて，組換え技術により，生産
し，診断および治療に使用することができる。

（従来の技術） レクチン類は，様々なタイプの糖類と特異的に結合す
るタンパクとして定義される。初期の頃には，コンカナ
バリンＡやリシン凝集素のように植物から単離されたレ
クチン類に関心が寄せられた。これらレクチン類は，対
象となる数多くのタンパク類がグリコシル化された状態
にあるので，タンパクの精製法に有用であることが認め
られた。しかしながら，最近では，ある種のβ−Ｄ−ガ
ラクトシド含有成分と特異的に結合し，広範囲の哺乳動
物，無脊椎動物，鳥類，さらには微生物源においても見
い出されている，ラクトースで抽出可能なレクチン類に
興味が集中している。この種のレクチン類はすべて,12
〜18kDa程度のサブユニットを含むと思われる。簡単な
診断試験により，容易に分類し得るトリプシン処理した
ウサギ赤血球を凝集させるそれらの能力は，ある種のβ
−Ｄ−ガラクトース含有成分により，特異的に阻害され
る。従って，レクチン自体はトリプシン処理したウサギ
赤血球を凝集させるが，その凝集反応は，例えばラクト
ース，チオガラクトシド，およびある種のβ−Ｄ−ガラ
クトース含有成分により，阻害され得る。他の一般的な
特性には，凝集を行なう際に金属イオンを必要としない
こと，およびチオールのような還元剤の存在が必要であ
ることが含まれる。

Gitt,M.A.ら（Proc Natl Acad Sci USA（1986）83:76
03〜7607）は，ヒト肺レクチンに特異的な抗血清を用い
てヒト肝癌cDNAライブラリーをスクリーニングすること
により,2つのcDNAクローンを得た。これらのcDNAは，他
の数多くの研究者が様々な組織において発見したものと
類似するタンパクをコードしていた。例えば，特許公開
公報昭60−184020において,Kasai,K.らは，約14kDaのヒ
ト胎盤レクチンについて述べている；このレクチンの配
列は，同研究グループにより，ヒナ組織から分離された
ものに多少類似していることが示された（Ohyama,Y.
ら，Biochem Biophys Commun（1986）134:51〜56）。ヒ
ナに由来するレクチンは，細胞性粘菌Dicytostelium di
scoideumの増殖段階において認められるレクチンである
ジスコイジンＩと構造が類似していることが明らかにな
った。

Caron,M.ら，（Biochem Biophys Acta（1987）925:29
0〜296）は，ラットおよびウシの脳組織に由来する類似
レクチンの精製および特徴付けについて述べている。de
Cabutti,N.E.F.ら（FEBSLetters（1987）223:330〜33
4）は，両生類の卵巣に由来する類似レクチンについて
述べている。類似の「電気レクチン（electrolecti
n）」をウナギから単離することは，すでにLevi,G.ら
（J.Biol Chem（1981）256:5735〜5740）により述べら
れている。さらに他の類似14kDaレクチンが,Raz.A.ら
（Experimental Cell Research（1987）173:109〜116）
により，様々なマウス線維肉腫細胞系から誘導されたcD
NAをクローニングおよび発現することによって生産され
た。ラット肺14kDaレクチンおよびそれをコードするcDN
Aは,Clerch,L.B.ら（Biochemistry（1988）27:692〜69
9）により述べられた。Joubert,R.ら（Develop Brain R
es（1987）36:146〜150）は，脳細胞を凝集させ得る，
ラットの脳由来のレクチンを単離することについて述べ
ている。Ray,A.ら（Cancer Research（1981）41:3642〜
3647）は，様々な哺乳動物種の新生細胞に由来する様々
なレクチンについて述べている。

レクチン（ヒナ，ウナギ，ヒト胎盤，ヒト肺などに由
来するものを包含する）と,2種の肝癌由来のレクチンと
の間の相同性に関する比較が,Paroutaud,P.ら（Proc Na
tl Acad Sci USA（1987）84:6345〜6348）により行われ
た（これらのレクチンはすべて上で引用した文献に記載
されている）。これらのタンパクの特性のアミノ酸位置
（23位,32位,35位,37位,43位,45位,70位,71位,76位,90
位,91位,102位,103位,105位,109〜111位を包含する）
は，比較したすべての種において完全に保持されている
ようである。この系列のうち，ただ１つのレクチン（す
なわち，ニワトリから得られたレクチン）だけが，「Ｎ
結合グリコシル化部位」を含むが，この部位は糖類に結
合していない。当該技術分野においてこれまでに特徴付
けられたこの種のいずれの哺乳動物レクチンも,N結合グ
リコシル化部位を有していない。

可溶性レクチンには，様々な分子量および／または糖
特異性を持った数多くの変種が存在すると思われる。Sp
arrow,C.P.ら（J.Biol Chem（1987）252:7383〜7390）
は，ヒト肺に由来する３種の可溶性レクチン（それぞ
れ,14kDa,22kDa,および29kDaの分子量を有するレクチ
ン）について述べている。これらはすべて，β−Ｄ−ガ
ラクトシドに特異的である。14kDaのレクチン類の糖特
異性は大体類似しているが，分子量がより大きい種は異
なる特異性を持つ傾向がある。他の種も,1つより多くの
可溶性のβ−Ｄ−ガラクトシド結合レクチンを含むこと
が知られている［例えば，マウス（Roff,C.F.ら，J.Bio
l Chem（1983）258:10637−10663）；ラット（Cerra,R.
F.ら，J.Biol Chem（1985）260:10474−10477），およ
びニワトリ（Beyer,E.C.ら，J.Biol Chem（1980）255:4
236−4239）］。β−Ｄ−ガラクトシドに特異的な種々
の可溶性レクチンにおいては，受容体特異性がかなり異
なっており，約14kDaのレクチン群は,Sparrow,ら（前
出）により述べられた22kDaおよび29kDaの代表的なレク
チン類とは別個のものであると思われる。

本発明の好ましいレクチン類は，ヒト前骨髄細胞性白
血病細胞系HL−60またはヒト胎盤組織から単離される。
他の研究者らにより,HL−60細胞からレクチンが単離さ
れているが，それらのレクチンはこの種のレクチンには
相当しない。Paietta,E.ら（Cancer Research（1988）4
8:280−287）は，分岐状オリゴ糖構造の末端にあるＮ−
アセチルノイラミン酸およびガラクトースを認識する膜
結合（可溶性ではない）レクチンについて推定的に述べ
ている。その活性はカルシウムには依存しない。見かけ
の分子量は17kDaである。従って，特異性および可溶性
に関する点では，本発明のレクチンタンパクとは著しく
異なる。

（発明の要旨） 免疫系を調節し，他の形態の細胞間伝達を媒介するレ
クチン類の活性は，実際上極めて鋭敏であり，宿主環境
に極めて厳密に同調するので，広範囲のこのような調節
物質が治療および診断の用途に使用できることが重要で
ある。上で述べたように，β−Ｄ−ガラクトースが結合
した約14kDaの可溶性レクチン類の数多くのメンバーが
当該技術分野において知られている。しかしながら，こ
れらのレクチン類は互いに類似する特性を有している
が，治療あるいは診断に用いる場合には交換可能ではな
い。さらに，これらのレクチン類がグリコシル化され得
る場合，グリコシル化のレベルおよび性質は，その分子
の特異性（例えば，循環半減期，インビボでの代謝，可
溶性，安定性，あるいは比活性）を変化させるように処
理されると考えられる。本発明は，このような処理を行
なうことができるレクチン類と，このレクチン類の特定
メンバーであるレクチンを提供するものである。これら
はすべて治療用および診断用の手段のレパートリーを拡
大する。本発明はまた，このレパートリーに包含される
これらの新しい特定メンバーを生産するための組換え用
材料および方法を提供する。

ある局面では，本発明は，β−Ｄ−ガラクトシドが結
合した14kDaの哺乳動物レクチン（14−β−galレクチ
ン）を目的とする。該14−β−galレクチンは，好まし
くは少なくとも１つのグリコシル化部位を有する。他の
局面では，本発明は，第１図Ａにアミノ酸２〜135とし
て示されたアミノ酸配列から実質的になる14−β−gal
哺乳動物レクチンを目的とする。１位のアミノ酸である
メチオニンは，このタンパクが哺乳動物細胞において組
換え技術により生産される場合には通常除去され，細菌
細胞において組換え技術により生産される場合には除去
されることがある。また，このメチオニンは，自然界で
は存在せず，活性にとって必須ではない。他の局面で
は，本発明は,HL−60および胎盤に由来する分子量14kDa
のレクチン類ならびに分子量が17〜20kDaの範囲にある
それらのグリコシル化形を目的とする。

他の局面では，本発明は,N結合グリコシル化を行ない
得る14−β−gal哺乳動物レクチン類をコードするDNA配
列と，特に第１図のタンパク，あるいは他のHL−60また
はヒト胎盤由来のレクチン類をコードするDNA配列とを
目的とする。これらのDNA配列は，単離および精製され
た形であるか，および／または組換え発現に適した異種
制御配列に連結されている。他の局面では，本発明は，
これらのDNA配列により形質転換される宿主細胞，およ
び所望のレクチンタンパクを生産するための方法を目的
とする。また，本発明のレクチンと特異的に反応する抗
体も目的としている。

さらに他の局面では，本発明は哺乳動物の疾患（例え
ば，自己免疫疾患，重症筋無力症，および多発性硬化
症）を治療するのに適した薬剤組成物およびそれを用い
た治療方法を目的としている。

哺乳動物の疾患を治療するのに適した本発明の薬剤組
成物は，少なくとも１つのグリコシル化部位を有する哺
乳動物14−β−galレクチンを，薬学的に許容される賦
形剤と混合された形で含有する。

（発明の構成） A.定義 一般に，タンパクは，様々な実質的に等価な形（酸性
塩および塩基性塩の形，側鎖の官能基が修飾された形，
脂質および膜に結合した形，ならびに所望のレクチンを
コードするDNAを発現する細胞の翻訳後のプロセッシン
グにより形成される他の修飾形を包含する）で存在し得
ることが知られてる。以下で説明するタンパクは，すべ
てこれらの様々な形のものを含む。

ここで使用されるように，「HL−60レクチン」は，以
下で説明するレクチン類を表わす。HL−60レクチンは,H
L−60細胞に由来するレクチンならびにヒト胎盤組織に
由来するレクチンを包含する。ある実施態様は，グリコ
シル化部位を与える少なくとも１つのトリペプチド配列
（Asn−Ｘ−ThrあるいはAsn−Ｘ−Ser）を含む,2〜135
の番号を付した第１図Ａのアミノ酸から実質的になる。
HL−60細胞および胎盤組織による自然の産生において
も,HL−60レクチンのＮ末端メチオニンは切断され，残
りのタンパクがアセチル化され得ると考えられている。
タンパクを産生する細胞によっては，様々な形の翻訳後
プロセッシングが予想され，プロセッシングを受けたタ
ンパクは，もちろん本発明の範囲内に含まれる。

特に，タンパク配列が知られている類似の哺乳動物レ
クチンとは異なり,HL−60レクチンは，好ましくは96位
を先頭とするグリコシル化部位Asn−Leu−Thrを含むこ
とに留意しなければならない。天然物質は明らかに，少
なくとも部分的には，この部位がグリコシル化されてい
ない；しかしながら，他の組換え宿主において適切に産
生された場合には，この部位はグリコシル化され得る。
従って，グリコシル化形は，そのグリコシル化が活性を
損なわない限り，本発明に包含される。

さらにまた，第１図Ａに示すような，「HL−60レクチ
ン」の実施態様は，他の既知の同種動物レクチンよりも
多くのシステイン残基（６）を含む。本発明はそれに限
定されるものではなく，活性が保持される限り，どのよ
うな数のシステイン残基を持つもの，あるいは全くシス
テイン残基を持たないものも包含することに留意しなけ
ればならない。

「HL−60レクチン」はさらに，第１図Ａの２〜135位
のアミノ酸を含むペプチド，あるいはその天然に存在す
る変異体または対立変異体を包含する。生物により産生
されるタンパクが，検討される形において必ずしも安定
なままではないこと，またそれらをコードする遺伝子が
自然の変異および変化を受けやすいことは，広く理解さ
れている。従って，これらは本発明に包含される。

HL−60レクチンが,HL−60細胞あるいは胎盤組織の天
然環境で産生される場合に，それ自体で分泌されるのか
どうか，あるいはHL−60レクチンが細胞の細胞質または
核の可溶性またはタンパク結合の細胞質タンパクである
のかどうかは，現在のところ不明である。HL−60レクチ
ンは，既知のシグナル配列を組換え技術を用いて付加す
ることにより，確実に分泌するように生産され得る。培
地からのタンパクの回収は，もちろん細胞溶解を必要と
する回収よりも簡単である。

ここでは,HL−60細胞および胎盤組織が14kDaβ−gal
結合レクチンを産生することが示されている。

上に述べた「HL−60」レクチンは，好ましくは少なく
とも１つのグリコシル化部位を有する14−β−gal哺乳
動物レクチン類の代表例である。ここで使用されるよう
に，「少なくとも１つのグリコシル化部位を含む14−β
−gal哺乳動物レクチン」という文言は，グリコシル化
部位を与える少なくとも１つのトリペプチド配列（Asn
−Ｘ−ThrあるいはAsn−Ｘ−Ser）を含む第１図のHL−6
0レクチンにより例示されるレクチン群の特性を持った
ペプチド類を表わす。しかしながら，上で述べたよう
に，本発明はグリコシル化部位を有さない14−β−gal
哺乳動物レクチンを包含する。

少なくとも１つのグリコシル化部位を含む14−β−ga
l哺乳動物レクチン類に包含されるためには，以下に挙
げる生物学的特性を示すペプチドでなければならない：
グリコシル化されていない場合の分子量が約14kDaであ
り，実際に測定した場合の分子量が約12〜18kDaである
こと。このレクチンは，特定のβ−Ｄ−ガラクトシド含
有成分（すなわち，ラクトース）を結合することができ
なければならない。また，標準的なレクチン分析におい
て，トリプシン処理したウサギ赤血球の血球凝集を特異
的に生じさせなければならない。ただし，この凝集は，
ラクトースやチオガラクトシドのようなβ−Ｄ−ガラク
トシド結合を含む特定成分により阻害される。血球凝集
を生じさせる能力には，例えばチオール基およびトリプ
トファン残基を還元された形で保持し得る還元剤の存在
が必要である。しかし，その活性は，金属イオンには依
存しない。典型的には，この活性を有する本発明のペプ
チドは，少なくとも１つのグリコシル化部位が存在する
ということをさらに条件として，上で述べた動物レクチ
ンに対して広範囲にわたる相同性を示す。

上記のレクチン類は，第１図ＡのHL−60レクチン類と
少なくとも40％，好ましくは75％，そして最も好ましく
は90％以上の相同性を有する。グリコシル化部位の好ま
しい配置は，第１図Ａのレクチンの場合のように,96〜9
9位の残基あるいは，多くとも４個のアミノ酸だけ上流
から３個のアミノ酸だけ下流（すなわち,92〜101残基
（両端を含む）までの間）の範囲内である。他の好まし
い配置には，動物レクチン類のいずれかにおいて，保存
されない領域にAsn,X（任意のアミノ酸），およびSer/T
hr残基を有する配置が包含される。

特に好ましい実施態様は，上で述べた既知の哺乳動物
レクチンと少なくとも95％の相同性を持つが，天然の形
とは異なり，少なくとも１つのグリコシル化部位が配列
に含まれるペプチドである。これらの好ましい実施態様
においては，また，グリコシル化部位の好ましい位置
は,96〜99位あるいは少なくとも92〜101位の間（両端を
含む）である。グリコシル化部位を含む14−β−galレ
クチンの最も好ましい実施態様は，第１図ＡのHL−60レ
クチン（HL−60細胞源あるいは胎盤組織源に基づくも
の，ならびに天然に存在するその変異体および対立変異
体）である。

B.HL−60レクチンをコードするcDNAの単離 a.HL−60細胞からの単離 HL−60細胞,ATCC CCL240をDMSOの存在下で40時間培養
した。次に，これらの細胞を溶解し，標準的な方法を用
いてmRNAを単離し，そしてHuynh,T.V.ら（DNA Cloning
I,D.M.Glover編集,R.L.Press（1985）p.49−78）の方法
に従って，λ−GT10でcDNAライブラリーを構築した。こ
のライブラリーを以下に示す２組の14量体プローブで調
べた： および これらのプローブは，既知のレクチン配列，特にＣ末端
近くの保存領域の配列に基づいて設計された。これらの
プローブは，アミノ酸配列Glu−Phe−Lys−Phe−Pro（H
L−60レクチンの106〜110位に存在する）およびAsp−Ph
e−Lys−Ile−Lys（HL−60レクチンの126〜130位に存在
する）をコードする。これらのプローブは,T4ポリヌク
レオチドキナーゼおよび〔γ−³²P〕ATPを使用して，末
端を³²Pで標識した。

37℃で２〜４時間プレハイブリダイズした２組のニト
ロセルロースフィルターを用いて,LP59をハイブリダイ
ズさせることにより，ファージコロニーをスクリーニン
グした。ハイブリダイゼーション用の緩衝液は,6×SSC,
20mMリン酸緩衝液（pH7）,2×デンハート溶液,0.1％SD
S,2mM EDTA,および100μg/ml酵母RNAを含有していた。
次いで，これらのフィルターを，室温にて,4×SSC中で
洗浄した。

約10⁶のファージコロニーから,LP59にハイブリダイズ
する17個の陽性クローンを検出した；これらのうち９個
は,LP60プローブともハイブリダイズした。これらの９
個のクローン全部が，「短い」断片および「長い」断片
を与える内部E coR I部位を含んでいた。両方のプロー
ブとハイブリダイズするクローンのうちの３個につい
て，ジデオキシ法により配列決定を行ったところ，オー
プンリーディングフレームの５′側延長部分および３′
側延長部分においてのみ異なる同一のDNA配列が得られ
た。

これらのクローンの１つについて決定された507bpの
配列を第１図Ａに示す。14,744ダルトンの理論的分子量
を有する135アミノ酸のタンパクをコードする405塩基対
（クローン11）のオープンリーディングフレームを示
す。Ｎ末端メチオニンを含めずに計算した場合には，こ
のタンパクは14,613の理論的分子量を有する。このタン
パクは，ラット肺レクチンのような他の動物の14−β−
galレクチンと相同である。他の既知の動物レクチンタ
ンパクの配列に対する相同性は,40％（マウス肝癌）か
ら96％（ヒト肺ペプチド）の範囲である。

b.ヒト胎盤組織からの単離 λ−GT10におけるヒト胎盤ポリ（A⁺）RNAからヒト胎
盤cDNAライブラリーを構築した。この構築は，第１のcD
NA鎖合成を開始させるために，オリゴDTではなく,3′側
非翻訳領域（HL−60cDNAクローン11のヌクレオチド486
〜502）に相補的な合成プライマー（３′−TCCGTCGACGG
AGACGA−５′）を用いて,Tarantino,A.L.ら（Biochemis
try（1985）24:4665−4671）が述べているように行っ
た。レクチンをコードする配列の大部分を含むが３′側
非翻訳プライマー配列を全く含まない,HL−60の標識化3
11bP断片（クローン２）（第１図Ｂ）を用いて，このラ
イブラリーをスクリーニングした。HL−60ライブラリー
のスクリーニングについて述べたようにして，このプロ
ーブを用いて,4つの陽性クローンを単離した。

グリコシル化部位Asn−Leu−Thrが第１図ＡのHL−60
レクチンの96〜98位に存在することは，推定アミノ酸配
列から明らかである。これはグリコシル化部位を含む最
初の既知哺乳動物レクチンであり，その存在は，β−Ｄ
−ガラクトシド化合物に結合する能力を損なわずに，レ
クチンの糖結合能力，可溶性，循環半減期，インビボで
の代謝，安定性，あるいは比活性を潜在的に変化させる
可能性を提供する。

さらに，第１図Ａに示すDNA配列，ならびに上で述べ
た他の哺乳動物レクチンに対するcDNA配列の有用性は，
グリコシル化部位が天然では全く存在しない場合でもグ
リコシル化部位を与えうるように遺伝子を操作する可能
性を提供する。従って，本発明の好ましい実施態様であ
るレクチン類を調製するためのあるアプローチにおいて
は,92〜101位の間のトリペプチド配列を，部位特異的変
異誘発法により，グリコシル化部位に変換することがで
きる。この位置にグリコシル化部位を与えることは，こ
のペプチドの14−β−galレクチン活性を損なわないと
予想される。

他のアプローチでは，回収されたHL−60および胎盤cD
NAを，他の起源に由来する14−β−galレクチン配列と
の相同性をより高め，同時にグリコシル化部位をコード
する配列を保持するように操作することができる。

C.ゲノムDNAおよびcDNAの特性 HL−60細胞およびヒト胎盤組織から単離されたヒトゲ
ノムDNAのサザンブロット分析は，第２図に見られるよ
うに,BamH I,Hind III,またはEcoR Iで消化した後に,HL
−60cDNAクローン２（第１図Ｂ）の445bp Sma I/Nco I
断片をプローブとして行った。HInd IIIで消化したDNA
（レーン1,胎盤由来；レーン2,HL−60由来）あるいはBa
mH Iで消化したDNA（レーン3,胎盤由来；レーン4,HL−6
0由来）については，約7.5あるいは15kbpの１つのハイ
ブリダイゼーションバンドが存在した;EcoR Iによる消
化（レーン5,胎盤由来；レーン6,HL−60由来）は，内部
EcoR I部位と一致する5.1kbpおよび3.2kbpの２つのハイ
ブリダイゼーションバンドを与えた。

HL−60細胞（レーン1,5,および６），正常ヒト胎盤
（レーン３），ヒトSK肝癌細胞（ATCC CCL24601）（レ
ーン４），ヒト赤白血病性白血病KG−1A細胞（ATCC HTB
52）（レーン７），およびヒト繊毛癌JEG−３細胞（ATC
C HTB36）（レーン２）に由来するmRNA調製物に対し
て，クローン２の311bp EcoR I cDNA断片（第１図Ｂ）
をプローブとして得られたノーザンブロット（第２図
Ｂ）は，検討したすべての細胞に対して類似の長さある
いは同一の長さを有するmRNAメッセージを与える約700
個のヌクレオチドからなる１つのハイブリダイゼーショ
ンバンドの存在を示した。

D.本発明のレクチン類と反応性のある抗体 本発明のレクチン類は，従来の方法により，これらの
レクチン類と反応性があり，かつこれらのレクチン類に
特異的な抗血清を調製するために使用できる。HL−60レ
クチン類に「特異的な」抗体とは，このレクチンと，あ
るいはその遺伝子の天然に存在する変異体および対立変
異体によりコードされるタンパクと免疫反応性がある
が，他のレクチン類とは免疫反応性がない抗体を意味す
る。第１図ＡのHL−60レクチンと，他の14−β−galレ
クチン類とには広範囲にわたる相同性が存在するため
に,HL−60レクチンに対して生じた抗体は，実際には，
このレクチンに対して必らずしも特異的なわけではな
い。しかしながら,HL−60レクチンに対するモノクロー
ナル抗体を生産することにより，特異的抗体を生成させ
ることができる。さらに，種々のグリコシル化形に対し
て特異的な抗体も調製することができる。

同様に，非グリコシル化形および特にグリコシル化形
の，少なくとも１つのグリコシル化部位を含むか，ある
いは含まない，本発明の14−β−galレクチンのいずれ
かの特定メンバーに対して特異的な抗体を調製すること
ができる。

つまり，本発明の範囲内の抗体は，本発明のレクチン
の１つまたはそれ以上のメンバーと反応性であるが，当
該技術分野において現在知られているレクチン類と交差
反応性ではないモノクローナル抗体系である。同様に，
本発明のレクチン類のいずれかにより生じた抗血清は，
既知のレクチン類と交差反応性の抗体をいくらか含む場
合でも，これらの抗血清はこれらのレクチン類に特異的
であるので，本発明の範囲内に含まれる。

E.HL−60レクチンの組換え生産 第１図Ａのアミノ酸配列をコードするcDNAまたはその
合成もしくは半合成変異体，あるいは14kDa HL−60をコ
ードするcDNAは，各種の系でHL−60レクチンを組換え生
産するのに利用することができる。他の14−β−galレ
クチン類（例えば，少なくとも１つのグリコシル化部位
を有するもの）をコードするのに適したDNAも，組換え
技術により発現させ得る。イントロンのない適切な配列
を連結して発現を調節する配列を制御し，得られた発現
系を適切な宿主にトランスフェクトし，そして形質転換
もしくはハランスフェクトされた宿主を,DNAを発現させ
るのに好ましい条件下で培養することにより，レクチン
をコードするDNAを起動させる。HL−60レクチンと胎盤
レクチンとをコードするゲノムDNA,ならびにその天然に
存在する変異体および対立変異体は，上記のcDNAをプロ
ーブとして用いて,HL−60もしくは胎盤のゲノムから回
収することができる。このゲノムDNAは，イントロンを
プロセッシングし得る真核生物系にも使用できる。レク
チンをコードする配列を,ATGが先行する発現系に連結し
て，成熟タンパクとしてレクチンを得ることができる。
あるいは，目的とする宿主内で作動可能なことが知られ
ているシグナル配列（例えば，細菌中のペニシリナーゼ
もしくはアルカリホスファターゼ系，酵母内のα−因子
系，もしくは哺乳類細胞中の各種ホルモンのシグナル配
列）を使用して，レクチンDNAを有する読取り領域内に
シグナルをコードするDNAを挿入するように発現系を構
築することにより，分泌を起こさせることができる。ま
た，レクチンは，所望により，コーディング配列を，追
加のコーディング配列を有する読取り枠に連結すること
により，融合タンパクとして生産することも可能であ
る。

適正な制御系を有する各種の宿主系は，従来，当該技
術分野ではよく知られている。例えば，原核生物宿主
中，エセリヒア・コリ（E.coli）が好ましいが，バシラ
ス（Bacillus），シュードモナス（Pseudomonas），ま
たは他の細菌株のような他の種も使用できる。適切な制
御系には，β−ラクタマーゼおよびラクトース（lac）
のプロモーター系〔チャンら（Chang et al.Nature（19
77），198:1056〕；トリプトファン（trp）プロモータ
ー系〔ゴデルら（Geoddel et al.）Nucleic Acids Res.
（1980），８:4057〕；およびλ−由来P_Lプロモーター
とＮ−遺伝子リボソーム結合部位系〔シマタケら（Shim
atake et al.），Nature（1981），292:128〕のような
細菌タンパクに関連するプロモーターが包含される。こ
のリストには，原核生物において最も一般的に用いられ
ているプロモーターが与えられているが，必ずしも全部
を含んでいるわけではない。

同様に，酵素系では,3−ホスホグリセリン酸キナーゼ
のプロモーター〔ヒッツマンら（Hitzeman et al.），
J.Biol.Chem.（1980），255:2073〕；エノラーゼ遺伝子
プロモーター〔ハランド,M.J.ら（Holland,M.J.,et a
l.），J.Biol.Chem.（1981），256:1385〕またはYEp13
から得たleu2遺伝子〔ブローチ,J.ら（Broach,J.,et a
l.），Gene（1978），８:121〕を包含する各種のベクタ
ーおよびプロモーターが知らている。

高等生物の細胞での発現に対し，このような細胞で作
動するプロモーターには,SV40プロモーター〔フィアー
ズら（Fiers et al.），Nature（1978），273:113〕も
しくはアデノウイルス，ウシ乳頭腫ウイルス，ラウス肉
腫ウイルスなどに由来するプロモーターのようなウイル
スプロモーターが挙げられる。また，メチロチオネイン
ＩまたはメタロチオネインIIのプロモーターのような調
節可能なプロモーターも有用である。例えば,B.スリン
ジエンシス（B.thuringiensis）の結晶タンパク遺伝子
に関連するレトロ調節を行う制御配列も利用できる。昆
虫細胞および植物細胞中で組換えタンパクを産生する系
も，現在利用できるが，植物細胞系は現在のところ余り
便利ではない。しかし，植物細胞系が不便なのは，現在
の技術水準が原因であり，この宿主細胞系と，本発明の
タンパクをコードする遺伝子とは，本来不適合なもので
はない。

適当なコーディング配列は，作動可能な構造で，目的
とする宿主にトランスフェクトするために適切なベクタ
ー中の制御配列に連結される。ベクターとしては，目的
とする宿主と形質転換の方法とによるが，プラスミド，
ウイルス粒子，またはファージが，通常含まれる。本願
で用いられる「形質転換」という用語は，宿主細胞によ
って引き起こされるあらゆる形態の異種DNAの取込みを
包含する。例えば，ウイルス感染，形質導入，接合，ま
たはおそらく最も一般的なものであるが，トランスフェ
クティング剤（宿主に依存して，例えば塩化カルシウ
ム，もしくはDEAE/デキストラン）を用いてトランスフ
ェクトすることによるインビトロでの取り込みの誘発が
包含される。

次いで，形質転換された細胞を，所望のDNAを含有す
る細胞についてスクリーニングし，成功裏に形質転換さ
れた細胞を，コーディング配列を発現させる条件で培養
する。次に，産生されたレクチンを，培地（生成物が分
泌される場合）または溶解された細胞（生成物が細胞内
タンパクの場合）から精製される。

いずれの場合も，レクチンは，ラクトース溶液もしく
は他の溶液（緩衝液，トリトンＸ−100）で抽出し，次
いでクロマトグラフィーに付すという標準的な方法で精
製される。便利なクロマトグラフィーには，ラクトース
・セファロースゲル（lactose Sepharose gel）による
クロマトグラフィーがある。この方法では，抽出物をゲ
ルに添加し，ゲルを洗浄し，次いで,100mMのラクトース
を含有する平衡緩衝液を，一度にもしくは徐々に加える
ことによって溶離を行う。活性画分中に核タンパクが存
在していることは，ラクトースを除去した後，画分がト
リプシン処理したウサギ赤血球を凝集させることができ
るかどうかにより，容易に検出できる。なお，この赤血
球凝集性は，数ミリモルの濃度のラクトースもしくはチ
オジガラクトシドで阻害される。

用途 本発明によるレクチンは，治療および診断の用途に有
用である。レビー，ジィら（Levy,G.et al.），Eur J.I
mmunol（1983）13:500〜507）により述べられた電気レ
クチンと類似の方法で，本発明のグリコシル化部位を有
する14−β−gal哺乳動物レクチンは，重症筋無力症の
ような自己免疫疾患の治療に使用することができる。こ
れらのレクチンにより治療する必要がある他の自己免疫
疾患には，リウマチ様関節炎，全身性エリテマトーデ
ス，若年型糖尿病，および多発性硬化病が包含される。

これらのタンパクは，免疫系の調節物質であるから，
一般に移植片対宿主病の予防および移植組織に対する拒
絶反応の阻害にも有用である。さらに，これらタンパク
に対して免疫活性を有する調製された抗体は，腫瘍の診
断に有用である。その理由は，細胞表面におけるこれら
レクチンの濃度が，転移性癌と相関関係があるからであ
る。また，薬剤をレクチンに結合させると，薬剤を適切
な標的に向わせるのに有用であるので，本発明のレクチ
ンは，薬剤投与法の応用に有用である。本発明のレクチ
ンは，同様にある種の細胞毒性分子に結合させて，ター
ゲッティング剤として使用することができる。

治療用途に用いる場合，該タンパクは，当該技術分野
で公知の製剤法（例えば,Remington′s Pharmaceutical
Sciences,最新版,Mack Publishing Co.,ペンシルバニ
ア州，フィラデルフィアに記載）を用いてその投与法に
適した様式で製剤される。典型的な注射用処方物として
は，ハンクス液もしくはリンガー溶液のような注射用の
生理学的緩衝液との混合物；リポソーム類または他の薬
剤投与に適した乳化剤によりカプセル化したものなどが
包含される。

本発明のレクチンの投与量および投与方法は，症状，
患者，および治療する疾患の重さにより決定される。好
ましい投与量は，約0.004mg/kg/日〜約2mg/kg/日であ
る。好ましい投与法は，静脈投与，皮下投与，および経
口投与が含まれる。

次に実施例によってこの発明を説明するがこの発明を
限定するもではない。

実施例１ 細胞内タンパクを与える，哺乳類細胞内でのHL−60レク
チンcDNAの発現 上記のλgt10ライブラリー由来のLP59/LP60雑種形成
クローンに挿入物を，細菌クローニングベクターに連結
することによって，プラスミドpHL11を構築した。従っ
て,pHL11は，全コード配列と,5′および３′の非翻訳領
域とを有する。

この遺伝子を，発現ベクタープラスミドp171に,2つの
セグメントで結合させた。プラスミド171は，ネズミのD
HFRと,SV40プロモーターと,Hind IIIおよびBamH I制限
部位を含むポリリンカーで分離されたポリアデニル化部
位と，を含む発現系を有する。

HL−60レクチン配列の５′部分は,pHL11をE.coR IとS
ma Iとで消化し，得られた断片をEcoR I/Sma Iで消化し
たpUC13に連結し，E.coli内で複製することによってク
ローン化され,pL1が得られる。その下流部分の増幅は次
のようにして行われる。つまり,pHL11をNco Iで消化
し，クレノーで平滑末端とし,EcoR Iで消化し,140bp Ec
oR I/平滑末端断片を単離し，この断片をE.coR I/Sma I
で消化したpUC13に連結し，次いでE.coli内で増幅する
ことによってpL2が得られる。

上流部の断片は,Hind IIIとEcoR Iとで消化し,370bp
の断片を単離することによって,pHL1から単離され，下
流のEcoR I/BamH I150bp断片はpHL2から単離される。単
離された断片を,BamH I/Hind IIIで切断した発現ベクタ
ーp171に連結し，得られた連結混合物をE.coliに形質転
換し，満足すべき形質転換体を選択する。SV40プロモー
ターの制御下にあるHL−60レクチン遺伝子とポリアデニ
シル化部位とを有するプラスミド（pSV/HL−60）が単離
された。次いで単離されたベクターを,DHFRを欠いたチ
ャイニーズハムスター卵巣（CHO）を細胞系を形質転換
するのに用い，次にグリシン，ヒポキサンチンおよびチ
ミジンを欠いたF12培地中で増殖しうる満足すべきコロ
ニーを単離し，選択培地中で増殖させた。

選択した細胞を，次に,F12培地で1ml当り２×10⁶の細
胞数で48時間培養し，採集した。得られた細胞を溶解
し，ウサギ赤血球凝集を検出法を用いて，得られた溶解
物がHL−60レクチンを含有していることを確認した。

実施例２ 哺乳類細胞内でのHL−60レクチンcDHAの分泌タンパク産
生の発現 Cla I制限部位を，開始コドンを保持し，下流のコー
ド配列を維持する第１図のアミノ酸１のコドンのすぐ上
流に導入した。この上流の配列を,Cla I/EcoR Iによる
消化によって取り出し,310bp/Ca I/EoR I断片として単
離した。この断片を，上記のpHL2から単離されかつ下流
の断片を有する150bp EcoR I/BamH I断片とともに,Cla/
BamH Iで消化した発現ベクターに連結した。この発現ベ
クターは,SV40プロモーターの制御下にある疎水性分泌
タンパクシグナル配列と，該シグナルの３′末端におけ
るCla I部位とを有する。この発現ベクターはまた，ネ
ズミDHFRの発現系を有する。

得られた連結混合物を，上記のように,DHFRを欠いたC
HO細胞に形質転換し，実施例１と同様にして培養した。
F12（gHT−）培地中で48時間培養後，培養を採集し,ELI
SA法を用いてHL−60のレクチン産生を検定した。

実施例３ HL−60レクチンのHL−60細胞からの単離 天然のHL−60レクチンを,HL−60細胞溶解物から次の
ようにして単離した。ラクトースまたはトリトンＸ−10
0溶液で処理することによって，溶解物中の該タンパク
を可溶化し，得られた可溶化レクチンを，ラクトース・
セファロースカラム又はアシアロフェチュイン・セファ
ロースカラムによるアフィニティー法によって精製し
た。

ラクトース・セファロースのグラジエント溶離によっ
て得たタンパク含有画分は,SDS−PAGEに付したところ,1
4kDaと17kDaとの位置にピークを示し（第３図のレーン
４），これらのピークは適当なレクチン活性を示す。ア
シアロフェチュインセファロースカラム由来のタンパク
含有ピークは,14kDaのレクチンを含有し（レーン２），
そして30kDaの位置に小量のレクチンを含有している。
同様の処理を受けたヒト胎盤から単離されたレクチン
は，アフィニティカラムにかかわらず（レーン1,アシア
ロフェチュイン；レーン3,ラクトース）,14kDa主ピーク
と,30kDaにおける小量のピークを示し17kDaの種類は全
く存在しなかった。

アフィニティクロマトグラフィに続いて，アセトニト
リル／水−TFA溶媒系を使うC4HPLCカラムを用いて,HL−
60レクチンを均質に精製した。第４図Ａおよび第４図Ｂ
は，アセトニトリル/TFAを用いた濃度勾配溶出の結果；
および画分のSDS−PAGE分析を示す。14kDaレクチンは,S
DS−PAGEの結果でわかるように，画分２に現れている。

14kDaおよび17kDaのタンパクが，赤血球凝集活性に関
与しているということが，ラクトース−セファロースア
フィニティークロマトグラフィーで溶離したHL−60タン
パクの画分をHPLCで分析することによって決定された。
14kDaのレクチンが,17kDaのタンパクから分離されたと
はいっても,17kDa型を含有する画分は，かなりの量の14
kDaレクチンを含有していた。第４図Ｂでわかるように,
14kDaのタンパクは，赤血球凝集活性ピークに対応す
る。さらに，精製14kDaの胎盤レクチンに対して生じた
ウサギ抗血清を用いて,14kDaおよび17kDaのタンパクを
ウェスタンブロット分析した結果,14kDaのタンパクには
交差免疫反応性が認められたが17kDaのレクチンには認
められなかった（第５図参照）。

17kDaのタンパクが,14kDaタンパクのグリコシル化さ
れたものである可能性について，両タンパクをＮ−グリ
カナーゼ（Ｎ−glycanase）（Genzyme）で処理して試験
した。このＮ−グリカナーゼは，糖タンパク由来のＮ−
アスパラギン結合オリゴ糖を加水分解する。精製レクチ
ン試料（２μｇ）を,10μｌの0.5％SDS−0.1M ２−メ
ルカプトエタノールに溶解し,0.15単位のＮ−グリカナ
ーゼで処理した。第５図に示すように，この酵素は，オ
ロソムコイドおよびフェチュイン両糖タンパクが脱グリ
コシル化される条件下では，いずれのHL−60タンパクに
も全く効力がなかった。レーン１は,N−グリカナーゼを
含み；レーン２はヒトオロソムコイドを含み；レーン３
はオロソムコイドとＮ−グリカナーゼとを含み；レーン
４はウシフェチュインを含み；レーン５はウシフェチュ
インとＮ−グリカナーゼとを含み；レーン６はラクトー
ス・セファロースで精製されたHL−60レクチンを含み；
レーン７はHL−60レクチンとＮ−グリカナーゼを含む。
14kDaはレクチンについて観察された分子量は，予想さ
れた分子量にほとんど一致する,14,613ダルトンである
から,14kDaのレクチンはグリコシル化されていないよう
である。

精製した14kDaおよび17kDaのHL−60のタンパクを,SDS
−PAGE分析に付した後，アミノ酸配列を決定した。アミ
ノ末端および14kDaレクチンをブロックするには，レク
チンを臭化シアンで処理して，分子内のメチオニンの位
置でレクチンを切断する必要がある。その断片のアミノ
酸配列は,121位におけるメチオニンの開裂で得た,14kDa
胎盤レクチンの14残基Ｃ末端断片の配列と同一であっ
た。17kDa HL−60タンパクもまた,N末端でブロックされ
ており，臭化シアン処理で得た断,14kDa HL−60タンパ
クとは無関係の独特のアミノ酸配列となった。さらにこ
の断片は，スイスタンパクデータバンク（Swiss Protei
n Data Bank）の他のいずれのタンパクとも有意な相同
性を示さなかった。

従って,17kDaのタンパクは,N−グリカナーゼによって
影響されず，赤血球凝集活性に関与しておらず,14kDa胎
盤レクチンに対して特異的なポリクローナル抗体とは反
応せず（後述の第６図参照），そのアミノ酸配列は,14k
Daの配列とは大きく異なる。

実施例４ レクチンのヒト胎盤組織からの単離 新鮮なまたは凍結したヒト胎盤を,3倍容量（mg/g）の
ホモジナイジング緩衝液中で均質化し，得られたホモジ
ネートを10,000×ｇで15分間遠心分離した。次いで，得
られたペレットを２倍容量のホモジナイジング緩衝液
（もとの組織の重量に対して）と,0.1Mβ−ラクトース
との混合物中で,4℃で１時間撹拌して懸濁させ,10,000
×ｇで１時間遠心分離した。得られた上澄み液に固体の
硫酸アンモニウムを,50％飽和度まで添加し，得られた
溶液を４℃で３時間インキュベートした。次に，得られ
た溶液を30,000×ｇで15分間遠心分離し，ペレットを廃
棄し，得られた上澄み液に固体の硫酸アンモニウムを添
加して飽和させた。次に，得られた溶液を４℃で16時間
インキュベートし,30,000×ｇで１時間遠心分離し，得
られたペレットを,1/10倍容量（もとの組織の重量に対
して）の10mMトリス−1mM EDTA,pH7.5に溶解し，ホモジ
ナイジング緩衝液に対して透析した。得られたレクチン
を，ラクトース・セファロースカラムもしくはアシアロ
フェチュインカラムによるアフィニティクロマトグラフ
ィによって精製した。

実施例５ HL−60レクチンcDNAのE.coli細胞中での発現E.coli内で
用いる発現ベクターを，イソプロピルチオガラクトシド
（IPTG）誘発性trp−lac（tac）プロモーターを含有す
るベクターpKK223−３（ファルマシア社）を用いて構築
した。レクチンcDNAを，コード配列の５′末端で変異さ
せて，レクチンATGコドンに接してCla I制限部位を導入
した。この処理は，バイオーラド ムタジーンM13キッ
ト（Bio−Rad Muta−Gene M13 Kit）を用い，オリゴヌ
クレオチドダイレクティド変異誘発法により行なった。
用いた合成オリゴヌクレオチドは下記の配列を有する。

クローン11の変異誘発したレクチンcDNAの421bp Cla
I/Nco I断片（第１図Ｂ）を平滑末端とし,T4DNAリガー
ゼを用いて，ベクター中の平滑末端としたEcoR I部位に
連結した。E.coli JM101を標準法で形質転換し，得られ
たクローンを，レクチンcDNAプローブと雑種形成させる
ことによって試験した。クローンの構造を制限部位分析
法で確認した。雑種形成法で試験して陽性のクローンを
選択して，大量に増殖させた。

レクチンのcDNAを発現させるために,500mlのLB培地
に,E.coli JM101形質転換体の一夜培養物2.5mlを接種し
た。90分後，細胞に1mMのIPTGを添加することによって
誘発し,37℃にて6.0時間増殖させた。次いで細胞を採集
し,20mMトリス−HCl,pH7.4,2mM EDTA,150mM NaCl,4mM2
−メルカプトエタノールおよび1mM PMSFの混合物25mlで
洗浄した。次に，得られた細胞を,5分間の音波処理を２
回行って溶解し，得られた細胞溶解物を,10分間,25,000
×ｇの遠心分離にかけて透明にした。

得られたレクチン含有上澄み液を，ビニルスルホンで
活性化したセファロースに結合させたβ−ラクトースの
カラムを用い,0.1M β−ラクトース含有ホモジナイジ
ング緩衝液で溶離するアフィニティークロマトグラフィ
ーで精製した。得られた全画分を，標準法を用いてSDS
−PAGE法，免疫ブロッティング法および赤血球凝縮活性
法で分析した。Ｎ末端アミノ酸配列分析法によってＮ末
端がアラニンであることがわかり，これは，細菌がイニ
シャルメチオニンを分解することによって，タンパクを
プロセッシングすることを示す。Ｎ−末端アラニンは，
例えばアセチル化することによって修飾することができ
ることもまた，明らかである。

精製E.coliのレクチンをウェスタンブロット分析に付
したところ，このレクチンが胎盤レクチンおよびHL−60
レクチンと同じ電気泳動度および免疫反応性を有するこ
とが分かった。第６図は，いくつかの14kDaレクチンのS
DS−PAGE分析およびウェスタンブロット分析の結果を示
す。パネルＡでは，各レクチンを，電気泳動法に付し，
コマシー・ブルーＲ−250で染色した；パネルＢでは，
各レクチンは,PVDF膜に移して，抗胎盤レクチン抗体お
よびHRPを結合したヤギ抗ウサギIgGで処理して可視化し
た。

両ポリルの各レーンは次のとおりである：レーンA1,J
M101 E.coli溶解物50μg;レーンA2,HL−60レクチン発現
プラスミドを含有するE.coli由来の溶解物50μg;レーン
A3,胎盤レクチン,5μg;レーンA4,HL−60レクチン５μg;
レクチンA5,E.coli由来レクチン５μg;レーンB1,JM101
溶解物10μg;レーンB2,HL−60レクチン発現プラスミド
を含有するE.coli由来の溶解物10μg;レーンB3,胎盤レ
クチン0.2μg;レーンB4,HL−60レクチン0.2μg;レクチ
ンB5,E.coli由来レクチン0.2μｇ。さらに，赤血球凝縮
検定法に付したE.coli由来のレクチンは,HL−60レクチ
ンおよび胎盤レクチンと類似の活性を示した。

E.coli由来のレクチン,HL−60レクチン，および胎盤
レクチンの分析により，E.coliで発現されたレクチン
が，胎盤レクチンおよびHL−60レクチンとほぼ同じ比活
性を有することが分かった（第12図，後記）。上記のこ
とは，組換え体レクチンが，生物学的に活性であり,HL
−60細胞および胎盤のような天然の起源から単離された
レクチンと類似のものであることを示している。

実施例６ 細胞内もしくは分泌されたタンパクを与える,CHO細胞内
でのHL−60レクチン遺伝子の発現 CHO細胞は，レクチンcDNAを含むベクター（cDNAベク
ター），もしくはレクチンcDNAおよび作動可能に結合し
た分泌シグナルを含むベクター（分泌ベクター）でトラ
ンスフェクトされた。第７図は，免疫沈降反応し，代謝
的に標識されたレクチンのSDS−PAGE分析の結果を示し
ている。このレクチンは，後述のようにトランスフェク
トし，ならびに処理されたCHO細胞によって生成する。
レーン２は,P−18（cDNAベクター）形質転換細胞の上清
と免疫血清とを含み；レーン３は,P−18の上清と正常な
ウサギの血清（NRS）とを含み；レーン４は,PS−２（レ
クチン分泌べクター）の上清と，免疫血清と,N−グリカ
ナーゼとを含み；レーン５は,PS−２の上清と免疫血清
とを含み；レーン６は,PS−２の上清とNRSとを含み；レ
ーン７は,PS−２の抽出物と免疫血清とを含み；レーン
８は,PS−２の抽出物とNRSとを含み；レーン９は,PS−
２の抽出物と，免疫血清と,N−グリカナーゼとを含み；
レーン10は,P−18の抽出物とNRCとを含み；そしてレー
ン11は,P−18の抽出物と免疫血清とを含む。

数種のレクチン（18〜20kDa型および14kDa型のレクチ
ン）は免疫沈降反応した。レーン５に見られるように，
大きな型のレクチンは，分泌シグナルと作動可能にして
結合したcDNAによりトランスフェクトされた細胞によっ
てのみ分泌される。しかし，そのレクチンは，細胞溶解
産物中では見い出されない（レーン７）。大きな型のレ
クチンは,N−グリカナーゼで処理すると,14kDa型に変化
する（レーン４）。

免疫沈降反応し，代謝的にラベルされたレクチン（こ
のレクチンは，いくつかの他の細胞系の溶解産物から得
られた）のSDS−PAGE分析を第８図に示す。レーン３お
よび４はそれぞれNRSおよび免疫血清で処理したヒトの
包皮繊維芽細胞の溶解産物から得られたレクチンを含
む。レーン５および６は，それぞれNRSおよび免疫血清
で処理された，トランスフェクトされたCHO細胞の溶解
産物から得られたレクチンを含む。レーン７および８
は，それぞれNRSおよび免疫血清で処理したHL−60細胞
の溶解産物から得られたレクチンを含む。レーン９およ
び10は，それぞれNRSおよび免疫血清で処理したU937細
胞の溶解産物から得られたレクチンを含む。レーン11お
よび12は，それぞれNRSおよび免疫血清で処理したKGla
細胞溶解産物から得られたレクチンを含む。レーン13お
よび14は，それぞれNRSおよび免疫血清で処理したPBL細
胞の溶解産物から得られたレクチンを含む。細胞溶解産
物中には，レクチンの14kDa型のみが存在し，このこと
は，第７図に示される結果と一致する。上清の免疫沈降
反応において，いくつかの分泌されたレクチンが示され
ていない。

第９図には，免疫沈降反応し代謝的にラベルされたレ
クチン（レクチンcDNAは，分泌シグナルと作動可能に結
合したレクチンcDNAでトランスフェクトされたCHO細胞
によって分泌される）のSDS−PAGE分析が示されてい
る。レーン１および２は，それぞれPS−２（レクチン分
泌ベクター）上清およびNRS;およびPS−２および血清を
含む。レーン３および４は，それぞれPS−２上清,200ng
/mlのレクチン，および免疫血清；およびPS−２上清,20
0ng/μｍのレクチンおよびNRSを含む。レーン２および
３は,14kDaおよび18kDa型の分泌を示す。

分泌シグナルと作動可能に結合したレクチンcDNAによ
りトランスフェクトされたCHO細胞によって分泌された
レクチンを,N−グリカナーゼで処理し,SDS−PAGEにかけ
た。その結果を第10図に示す。レーン1,2,5および６は,
PS−２（レクチン分泌ベクター）の上清と免疫血清とを
含む。レーン３および４は,N−グリカナーゼで処理され
た,PS−２の上清を含む。レーン３と４において,18〜20
kDaレクチンが存在しないということは,18〜20kDaレク
チンが14kDaレクチンのグリコシル化された形のもので
あることを示す。

分泌シグナルに作動可能に結合したレクチンcDNAによ
りトランスフェクトされたCHO細胞により分泌されたレ
クチンを，ラクトース・セファロースカラムで精製し，
そしてその溶質画分をSDS−PAGEにかけた。第11図に示
されるように，大型レクチンおよび小型レクチンのいず
れもがラクトースと結合し，そして，次の実施例に示さ
れるように，凝集分析において活性を有する。

実施例７ レクチンのβ−ガラクシド結合活性に関する分析 14kDaレクチンの生物的活性を，トリプシンで処理し
たウサギの赤血球の凝集反応によって確かめた。上記14
kDaレクチンは,HL−60細胞，胎盤の組織，そして，分泌
シグナルと作動可能に結合したレクチンcDNAでトランス
フェクトされたE.coli細胞から得られた。第12図に示さ
れるように，一番上の列は，コンカナバリンＡのコント
ロールであり，凝集のエンドポイントは1.5μg/mlであ
る。その下の６列は,3種の精製された14kDaのレクチン
を種々の濃度の完全糖（completing sugar）とともにイ
ンキュベートした結果を示す。上記完全糖は,14kDa胎盤
レクチンの強力なインヒビターとして知られているβ−
ラクトースおよびチオジガラクトシドである。チオジガ
ラクトシドは,0.31mMを越える濃度のときに赤血球の凝
集反応を阻害し，そしてβ−ラクトースは,1.25mMを越
える濃度のときに赤血球の凝集反応を阻害した。

実施例８ ２種の異なるマウスの系統を用いてのタンパクおよび多
糖類に対する初期体液免疫反応におけるHL−60レクチン
の影響 A.シビレエイ（Torpedo Marmorata），破傷風毒素，お
よび莢膜多糖類から得られるアセチルコリンレセプター
によるマウスの免疫 シビレエイ（ray Torpedo Marmorata）の電気器官か
ら得られたアセチルコリンレセプターを，ナジャ ナジ
ャ シアメンシス（Naja naja siamensis）の神経毒を
用いたアフィニティクロマトグラフィーによって精製し
た。破傷風毒素は，スウェーデン国立微生物研究所から
入手し，該毒素は，ホルマリンで処理された破傷風毒素
（通常，ワクチンとして使われている）でなる。肺炎連
鎖球菌の23種の異なる血清型から抽出した莢膜多糖類抽
出物の混合物は，マーク シャープ ドーム（Merck Sh
arpe Dome）Inc.から入手した。BALB/cおよびC56BL/6マ
ウスの若い成体の雌（生後２〜４ヶ月）を使用した。マ
ウスに，完全フロイントアジュバント中に10μｇの精製
されたアセチルコリンレセプター，または破傷風毒素，
または肺炎双球菌の多糖類のいずれかを含み，かつHL−
60レクチンを含むかまたは含まない混合物を注射した。
これらの予備実験で注射するレクチン量はマウス１匹あ
たり0.1から25μｇの間であった。血液を３日後,1週間
後,2週間後,3週間後および４週間後に採取した。アセチ
ルコリンレセプターを注射されたマウスにおいて，実験
的自己免疫重症筋無力症を発現させるために，マウス
を，神経筋の機能障害の微行について毎日観察した。10
日後には，このマウクは，くりかえして物をつかむこ
と，泳ぐこと，および逆さにぶらさがる運動が強いられ
た。なお，これらの運動は，熱ランプで35℃にて５分間
あたためた後，繰り返して行われた。これらの観察の結
果を表１に示す。表１から，高投与量でテストされた両
系統のマウスにおいて，組み換え型のHL−60レクチン
は，神経筋の機能障害を遅延されるのに明らかに有益な
効果をもたらすことがわかる。

観察した後，動物を殺し，皮膚をはぎ，そして，内臓
を摘出し，そして，コリン作動性のレセプターの抽出物
を動物の胴体全体から調製した。

Ｂ アセチルコリンレセプターで免疫したマウス中のフ
リーレセプター量の測定 本実施例Ａ項で調製したのと同様の方法で調製された
レセプター抽出物の既知の部分を定量のために該レセプ
ターをラベルする目的で,37℃で１時間,10倍過剰量の
¹²⁵I−α−ブンガロトキシンとともにインキュベートし
た。その混合物をセファクリルG200でゲルろ過し，遊離
の，ならびに結合した毒素を分離した。マウスの胴体中
に存在するレセプターの量を同時に投与された組み換え
HL−60レクチンの量とともに表２に示す。これらのデー
タにより，約15〜25μｇの投与量において，組み換えHL
−60レクチンが，注射されたアセチルコリンレセプター
の生体内での影響を妨げることが示される。

C.シビレエイ（Torpeo）およびマウスのレセプターに対
するレセプター結合免疫グロブリンＧおよびＭの測定 これらの測定は，レセプター抽出物を10倍過剰量の標
識ブンガロトキシンとともに一晩,4℃にインキュベート
し，沈澱を分離し，洗浄し，そして放射能を計数するこ
とにより行なわれた。表２の結果により，レクチン処理
されたマウスにおいては，約15〜25μｇの投与量が，免
疫グロブリン（Ig）と結合した筋肉アセチルコリンレセ
プターの量を減少させるのに効果があることが示され
る。

D. アセチルコリンレセプター，破傷風毒素および肺炎
球菌多糖類を用いて免疫されたマウスのＢ細胞レパート
リー 1.免疫されたBALB/cマウスからのモノクローナル抗体の
初期クローンの調製 ３匹のBALB/c雌マウス（７〜８週）のそれぞれに，完
全フロイントアジュバント中５μｇのレセプター抗原，
破傷風毒素もしくは肺炎球菌多糖類を腹腔内注射し，そ
して２週間後に,0.15Mリン酸ナトリウム緩衝液,pH7.4中
の同量の抗原を静脈注射した。同じ株の３匹のマウス
に，これらの抗原と15μｇのHL−60レクチンとを組み合
わせて免疫した。動物を，ブースター注射４日後に殺
し，脾臓細胞（10⁸細胞）を非分泌型Ｂリンパ細胞腫細
胞系SP2−OAg14（２×10⁷細胞）と融合させた。細胞混
合物を,2×10⁵細胞／ウェルの割合で,6×96コスター（C
ostar）トレーのウェル内に，マウスの腹膜マクロファ
ージのフィーダー層（５×10⁵細胞／ウェル）とともに
分配した。培養の３日目からHAT（ヒポキサチン−アミ
ノプテリン−チミジン）培地を加えた。

10〜14日後に，上澄みを分析し，免疫化に使用した各
抗原に結合している否かを調べた。前述の通り,BLISAを
使用した。

表３の結果から，抗体とともにレクチンを与えた場合
には，投与したタンパク抗原に対する特異的な抗体を産
生するＢ細胞レパートリーが初期免疫後に減少すること
がわかる。

表３ HL−60レクチン（15μｇ）とともに，もしくはHL−60レ
クチンなしで抗原（シビレエイレセプター，破傷風毒素
および肺炎球菌多糖類）を注射したBALB/cマウス由来の
ハイブリドーマクローンの数（各抗原について初期クロ
ーン180） 抗原＋レクチン 抗原のみ シビレエイレセプター 54 129 破傷風毒素 79 161 肺炎球菌多糖類 111 143 実施例９ 初期免疫応答に対するHL−60レクチンの影響 A.シビレエイアセチルコリンレセプターに対する抗体の
決定 実施例8,A項と同様にして調製した精製レセプター５
μg/mlを含有する溶液100μでマイクロタイターのウ
ェルを一晩コートし，血清（1/25に希釈）を用いて,37
℃で３時間インキュベートした。洗浄後，アルカリフォ
スファターゼ接合ヤギ抗マウスの免疫グロブリンを用い
て,37℃で３時間プレートをインキュベートした。次
に，プレートをよく洗浄し,p−フェニルリン酸エタノー
ルアミン緩衝液を用いて37℃で１時間インキュベートし
た。3M NaOH25μを添加して反応を停止させ，そし
て，ラベルした抗体の結合をELISAマイクロリーダーを
用いて405nmで測定した。50匹を越える数のマウス由来
の正常マウス血清プールを負のコントロールとする。遮
断限界（cut−off limit）は正常血清プールで得られた
累積値の平均値＋4SDであった。結果を，放射性免疫分
析によって得られた結果と比較し，正常固体群（50匹を
越えるマウス）からの累積結果の平均値＋4SDを差し引
いた後，血清１で沈澱するトキシンレセプターのモル
数で表わした。

B.マウスアセチルコリンレセプターに対する抗体 抗体は抗原として部分的に精製した正常マウスの骨格
筋レセプターと¹²⁵I−α−ブンガロトキシンとの複合体
を用いて決定された。結果は，正常個体群（50匹を越え
るマウス）からの累積結果の平均値＋4SDを差し引いた
後，血清１で沈澱するトキシンレセプターのモル数で
表わした。

C.破傷風毒素および莢膜多糖類に対する抗体 抗体は，酵素結合免疫分析法（ELISA）で決定した。
抗原の５μg/mlを含有する溶液100μでマイクロタイ
ターのウェルを一晩コートし，血清（1/200に希釈）を
用いて37℃で３時間インキュベートした。洗浄後，アル
カリフォスファターゼ接合ヤギ抗マウスの免疫グロブリ
ンを用いて37℃で３時間プレートをインキュベートし
た。次に，プレートをよく洗浄し,p−フェニルリン酸エ
タノールアミン緩衝液を用いて37℃で１時間インキュベ
ートした。3M NaOH25μｌを添加して反応を停止せさ，
そして，ラベルした抗体を結合をELISAマイクロリーダ
ーを用いて405nmで測定した。50匹を越える数のマウス
由来の正常マウス血清プールを負のコントロールとす
る。遮断限界は（cut−cff limit）は正常血清プールで
得られた累積値の平均値＋4SDであった。値は正常血清
プールの平均値＋4SDを差し引いた後のミリ吸光度単位
で表した。

BALB/cマウス群は，破傷風毒素，肺炎球菌多糖類，シ
ビレエイレセプターおよびマウスレセプターで免疫され
た。この時,HL−60レクチンを添加せずに，あるいは抗
原に加えて種々の量のHL−60レクチンを添加して免疫を
行った。

３日後に血液を採取し，再び1,2,3および４週間後に
採取して，抗体量を決定した。この結果を第13図A,第13
図B,第13図Ｃおよび第13図Ｄに示す。第13図A,第13図Ｃ
および第13図Ｄに示すように,T型依存抗原に対する初期
免疫反応はレクチンを高濃度に投与した場合，有意に低
くなる。同様の結果は,T型非依存抗原である肺炎球菌多
糖類では観測されなかった（第13図Ｂ）。

実施例10 実験的自己免疫脳脊髄炎に対するHL−60レクチンの影
響，多発硬化症に対する動物モデル ラットに組み変え型HL−60レクチンを静脈注射した場
合の結果を表４および表５に示す。レクチンの静脈投与
は０日目に開始し,4日目および６日目に追加レクチンの
処理を行った。このことにより，疾患の発生にわずかな
遅延を生じた。疾患はレクチン処理をしなかった場合に
比べて軽症で，疾患期間が短く，ならびに体重の減少も
少なかった。

表５より，免疫される３日前からレクチンを投与し,7
日目まで毎日注射することによって，病気の発生は完全
に防止されたことがわかる。

実施例11 選択されたリンパ球の表現型におけるレクチン処理ラッ
トのインビボでの影響 表6Aはレクチン処理したラット由来のラットリンパ
節，サプレッサーＴ細胞〔モノクローナル抗体0X8（Ser
otec−Bioproducts,インディアナポリス，インディアナ
州）と反応する〕の数が28％増加することを示してい
る。

表6Bは，脾臓サプレッサーＴ細胞の数が32％増加し，
そして，ヘルパーＴ細胞（W3/25抗体反応性,Serotec−B
ioproducts,）および全Ｔ細胞（W3/13抗体反応性,Serot
ec−Bioproducts,）の数がそれぞれ19％および24％減少
することを示している。

実施例12 表７の結果は組み換えヒトレクチンが特異的にヒトの
マクロファージと反応することを示している。ヒトの血
液細胞をHL−60レクチンで前処理し，その後特異的な抗
体（螢光標識化）で螢光を発するようにした場合に,CD3
＋,CD4＋,NK（Ｌ−Ａ）またはHLA−DR細胞マーカー（Be
cton−Dickenson）については，有意な変化が認められ
なかった。しかし,M1およびM3マクロファージでのレク
チン処理の効果は重要であり，陽性の細胞の割合がM1お
よびM3で，それぞれ33％および26％減少していることか
ら,M1およびM3抗体で認識されるエピトープとレクチン
との相互作用が示唆される。

（発明の要約） 他の既知の動物レクチン類とは異なるアミノ酸配列を
有するヒトHL−60レクチンが開示されている。このヒト
HL−60レクチンは，ラクトースまたは界面活性剤で抽出
可能であり，かつβ−Ｄ−ガラクトシドに特異的な哺乳
動物レクチン類の１種である（少なくとも１つのグリコ
シル化部位を有する14−β−galレクチン）。さらに，
哺乳動物の14−β−galレクチン類（特に,HL−60レクチ
ン）を種々の宿主で生産するための組み換え方法および
その材料，そして得られたレクチン類の利用方法につい
ても記載されている。ひとHL−60レクチンはHL−60細胞
や胎盤組織中に存在する。

【図面の簡単な説明】

第１図ＡはヒトHL−60レクチンおよび胎盤レクチンの両
方に対するcDNA配列および推定アミノ酸配列を示す図で
ある。図中，配列の上側に付記された数字は対応するヌ
クレオチドに関するものであり，枠で囲まれた部分は開
始コドンおよび終止コドンを示す。また，星印はＮ結合
によるグリコシル化が可能な部位を示す。 第１図Ｂは２つのHL−60cDNAクローンに対する制限酵素
切断地図を示す図である。図中，コード領域は白抜きの
枠部分で示されており，用いた配列決定の方針も併せて
示されている。 第２図Ａは,HL−60cDNAをプローブとして用いた,HL−60
細胞およびヒト胎盤細胞に由来のDNAに対するサザンブ
ロッド分析結果を示す図である。この図は,14kDaのレク
チンに対する１つの遺伝子の存在を示している。 第２図Ｂは,HL−60cDNAをプローブとして用いたノーザ
ンブロット分析の結果を示す図である。この図は，様々
な細胞系に含まれ，レクチンをコードすると推定される
mRNAのメッセージが，同じ長さであり，かつ相同性を有
することを示している。 第３図は精製されたレクチン調製物に対するSDS−PAGE
分析結果を示す図である。 第４図Ａは,HL−60レクチンのHPLC精製における溶出画
分のSDS−PAGE分析結果を示す図である。 第４図Ｂは，各画分の凝集活性と,214nmにおける吸光度
とを重複させて示した図である。 第５図は,N−グリカナーゼで処理されたHL−60レクチン
に対する銀染色SDS−PAGE分析の結果を示す図である。 第６図ＡおよびＢは，レクチンcDNAでトランスフェクト
されたE.coli細胞に由来するレクチンを含む，様々な14
kDaのレクチンに対するSDS−PAGE分析およびウェスタン
ブロット分析の結果を示す図である。 第７図は,HL−60レクチンcDNAでトランスフェクトされ
るか，あるいはHL−60レクチンcDNAおよび作動可能なよ
うに連結された分泌シグナルでトランスフェクトされた
CHO細胞により産生される，免疫沈降反応を起こし，代
謝的に標識されたHL−60/胎盤レクチンに対するSDS−PA
GE分析結果を示す図である。 第８図は，数種の細胞系に由来する，免疫沈降反応を起
こし，代謝的に標識されたレクチンに対するSDS−PAGE
分析結果を示す図である。 第９図は，分泌シグナルに作動可能なように連結された
HL−60レクチンcDNAでトランスフェクトされたCHO細胞
により分泌される，免疫沈降反応を起こしたレクチンに
対するSDS−PAGE分析結果を示す図である。 第10図は，分泌シグナルに作動可能なように連結された
HL−60レクチンcDNAでトランスフェクトされ，かつＮ−
グリカナーゼで処理されたCHO細胞により分泌される，
免疫沈降反応を起こしたレクチンに対するSDS−PAGE分
析結果を示す図である。 第11図は，分泌シグナルに作動可能なように連結された
HL−60レクチンcDNAでトランスフェクトされたCHO細胞
により分泌されるレクチンのラクトース・セファロース
精製における溶出画分のSDS−PAGE分析結果を示す図で
ある。 第12図は，レクチンcDNAと，作動可能なように連結され
た分泌シグナルとを有するベクターでトランスフェクト
された，ヒト胎盤,HL−60細胞，およびE.coli細胞に由
来する精製されたレクチンの血球凝集に関する生物学的
分析結果と，糖類による凝集阻害とを示す図である。 第13図Ａは，破傷風トキソイドに対する一次免疫反応に
及ぼすHL−60レクチンの影響を示すグラフである。 第13図Ｂは，肺炎球菌多糖体に対する一次免疫反応に及
ぼすHL−60レクチンの影響を示すグラフである。 第13図Ｃは,Torpedo受容体に対する一次免疫反応に及ぼ
すHL−60レクチンの影響を示すグラフである。 第13図Ｄは,Torpedo受容体で免疫された動物におけるマ
ウス受容体に対する一次免疫反応に及ぼすHL−60レクチ
ンの影響を示すグラフである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ａ６１Ｋ 37/00 (72)発明者 ピエール―オリビエ クロー フランス国 ペー．オー．セ． 78610 ルペレ，オファルジ，リュー ドュ ペレ ペー．オー．セ． ９ (56)参考文献 特開 平１−110698（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.⁶，ＤＢ名) C12N 15/00 - 15/90 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＧｅｎｅＳｅｑ ＥＰＡＴ（ＱＵＥＳＴＥＬ)

Claims (35)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】哺乳動物の14−β−galレクチンであっ
   て、６×SSC、20mMリン酸緩衝液（pH7）、２×デンハー
   ト液、0.1％SDS、2mM EDTA、および100μg/ml酵母RNAを
   含む溶液中で、以下から選択される少なくとも１つのプ
   ローブ： （ａ）３′−CT（T/C）AA（A/G）TT（T/C）AA（A/G）GG
   −５′、 （ｂ）３′−CT（A/G）AA（A/G）TT（T/C）TA（A/G）TT
   −５′、 （ｃ）３′−TCCGTCGACGGAGACGA−５′、または （ｄ）HL−60細胞ATCC CCL240由来のcDNAをEcoR I消化
   することにより得られる311bpのフラグメント、ここで
   該cDNAは、該溶液中で、該プローブ（ａ）および（ｂ）
   とハイブリダイズする：とハイブリダイズするDNA配列
   によりコードされるタンパク質を含み、 ここで、該DNA配列が、ストリンジェントな条件下で以
   下のヌクレオチド配列とハイブリダイズし： そして 該タンパク質が、複数のシステインを有するが、以下の
   アミノ酸配列： を有しない、レクチン。
2. 【請求項２】少なくとも１つのグリコシル化部位を有す
   る、請求項１に記載の哺乳動物14−β−galレクチン。
3. 【請求項３】前記グリコシル化部位が92位〜101位の範
   囲内にある、請求項２に記載の哺乳動物14−β−galレ
   クチン。
4. 【請求項４】前記グリコシル化部位で糖に結合してい
   る、請求項２に記載の哺乳動物14−β−galレクチン。
5. 【請求項５】約17kDaと20kDaとの間の分子量を有する、
   請求項４に記載の哺乳動物14−β−galレクチン。
6. 【請求項６】組換え技術により製造される、請求項２に
   記載の哺乳動物14−β−galレクチン。
7. 【請求項７】分子量14kDaのヒトHL−60レクチンであ
   る、請求項２に記載の哺乳動物14−β−galレクチン。
8. 【請求項８】胎盤組織から産生される、請求項７に記載
   の哺乳動物14−β−galレクチン。
9. 【請求項９】HL−60細胞から産生される、請求項７に記
   載の哺乳動物14−β−galレクチン。
10. 【請求項１０】組換え技術によって製造される、請求項
    ７に記載のHL−60レクチン。
11. 【請求項１１】Ｎ末端アミノ酸が、メチオニン、アラニ
    ン、またはアセチル化アラニンであるアミノ酸配列を有
    する、請求項10に記載のHL−60レクチン。
12. 【請求項１２】哺乳動物14−β−galレクチンをコード
    する、単離された純粋な形態の組換えDNA配列であっ
    て、 ６×SSC、20mMリン酸緩衝液（pH7）、２×デンハート
    液、0.1％SDS、2mM EDTA、および100μg/ml酵母RNAを含
    む溶液中で、以下から選択される少なくとも１つのプロ
    ーブ： （ａ）３′−CT（T/C）AA（A/G）TT（T/C）AA（A/G）GG
    −５′、 （ｂ）３′−CT（A/G）AA（A/G）TT（T/C）TA（A/G）TT
    −５′、 （ｃ）３′−TCCGTCGACGGAGACGA−５′、または （ｄ）HL−60細胞ATCC CCL240由来のcDNAをEcoR I消化
    することにより得られる311bpのフラグメント、ここで
    該cDNAは、該溶液中で、該プローブ（ａ）および（ｂ）
    とハイブリダイズする：とハイブリダイズし、 そしてストリンジェントな条件下で以下のヌクレオチド
    配列とハイブリダイズする、DNA配列：
13. 【請求項１３】少なくとも１つのグリコシル化部位をコ
    ードする、請求項12に記載の組換えDNA配列。
14. 【請求項１４】哺乳動物14−β−galレクチンをコード
    し、かつ適切な宿主細胞中でその発現を起こさせ得る制
    御配列に作動可能に連結されるDNA配列を含む発現系で
    あって、 該DNA配列が、６×SSC、20mMリン酸緩衝液（pH7）、２
    ×デンハート液、0.1％SDS、2mM EDTA、および100μg/m
    l酵母RNAを含む溶液中で、以下から選択される少なくと
    も１つのプローブ： （ａ）３′−CT（T/C）AA（A/G）TT（T/C）AA（A/G）GG
    −５′、 （ｂ）３′−CT（A/G）AA（A/G）TT（T/C）TA（A/G）TT
    −５′、 （ｃ）３′−TCCGTCGACGGAGACGA−５′、または （ｄ）HL−60細胞ATCC CCL240由来のcDNAをEcoR I消化
    することにより得られる311bpのフラグメント、ここで
    該cDNAは、該溶液中で、該プローブ（ａ）および（ｂ）
    とハイブリダイズする：とハイブリダイズし、 そしてストンジェントな条件下で以下のヌクレオチド配
    列とハイブリダイズする、発現系：
15. 【請求項１５】前記DNA配列が、少なくとも１つのグリ
    コシル化部位をコードする、請求項14に記載の発現系。
16. 【請求項１６】前記宿主細胞がE.coli細胞である、請求
    項14に記載の発現系。
17. 【請求項１７】前記宿主細胞がCHO細胞である、請求項1
    4に記載の発現系。
18. 【請求項１８】前記宿主細胞がE.coli細胞である、請求
    項15に記載の発現系。
19. 【請求項１９】前記宿主細胞がCHO細胞である、請求項1
    5に記載の発現系。
20. 【請求項２０】哺乳動物14−β−galレクチンをコード
    するDNA配列でトランスフェクトされた細胞であって、 該DNA配列が、６×SSC、20mMリン酸緩衝液（pH7）、２
    ×デンハート液、0.1％SDS、2mM EDTA、および100μg/m
    l酵母RNAを含む溶液中で、以下から選択される少なくと
    も１つのプローブ： （ａ）３′−CT（T/C）AA（A/G）TT（T/C）AA（A/G）GG
    −５′、 （ｂ）３′−CT（A/G）AA（A/G）TT（T/C）TA（A/G）TT
    −５′、 （ｃ）３′−TCCGTCGACGGAGACGA−５′、または （ｄ）HL−60細胞ATCC CCL240由来のcDNAをEcoR I消化
    することにより得られる311bpのフラグメント、ここで
    該cDNAは、該溶液中で、該プローブ（ａ）および（ｂ）
    とハイブリダイズする：とハイブリダイズし、 そしてストンジェントな条件下で以下のヌクレオチド配
    列とハイブリダイズする、細胞：
21. 【請求項２１】前記DNA配列が、少なくとも１つのグリ
    コシル化部位をコードする、請求項20に記載の細胞。
22. 【請求項２２】請求項14に記載の発現系でトランスフェ
    クトされた細胞。
23. 【請求項２３】請求項15に記載の発現系でトランスフェ
    クトされた細胞。
24. 【請求項２４】請求項16に記載の発現系でトランスフェ
    クトされた細胞。
25. 【請求項２５】請求項17に記載の発現系でトランスフェ
    クトされた細胞。
26. 【請求項２６】請求項18に記載の発現系でトランスフェ
    クトされた細胞。
27. 【請求項２７】請求項19に記載の発現系でトランスフェ
    クトされた細胞。
28. 【請求項２８】少なくとも１つのグリコシル化部位を有
    する組換え14−β−galレクチンを製造する方法であっ
    て、 請求項22に記載の細胞を培地中にて14−β−galレクチ
    ンの産生に適した条件下で培養する工程、および 該培地から14−β−galレクチンを回収する工程と、を
    包含し、 ここで、組換え14−β−galレクチンは、複数のシステ
    インを有するタンパク質を含むが、以下のアミノ酸配
    列： を有しない、方法。
29. 【請求項２９】哺乳動物の自己免疫疾患を治療するのに
    適した薬剤組成物であって、 薬学的に許容される賦形剤と混合された哺乳動物14−β
    −galレクチンを含み、該哺乳動物14−β−galレクチン
    が、 ６×SSC、20mMリン酸緩衝液（pH7）、２×デンハート
    液、0.1％SDS、2mM EDTA、および100μg/ml酵母RNAを含
    む溶液中で、以下から選択される少なくとも１つのプロ
    ーブ： （ａ）３′−CT（T/C）AA（A/G）TT（T/C）AA（A/G）GG
    −５′、 （ｂ）３′−CT（A/G）AA（A/G）TT（T/C）TA（A/G）TT
    −５′、 （ｃ）３′−TCCGTCGACGGAGACGA−５′、または （ｄ）HL−60細胞ATCC CCL240由来のcDNAをEcoR I消化
    することにより得られる311bpのフラグメント、ここで
    該cDNAは、該溶液中で、該プローブ（ａ）および（ｂ）
    とハイブリダイズする：とハイブリダイズするDNA配列
    によりコードされるタンパク質を含み、 ここで、該DNA配列が、ストリンジェントな条件下で以
    下のヌクレオチド配列とハイブリダイズし： そして 該タンパク質が、複数のシステインを有するが、以下の
    アミン酸配列： を有しない、組成物。
30. 【請求項３０】前記哺乳動物14−β−galレクチンが少
    なくとも１つのグリコシル化部位を有する、請求項29に
    記載の薬剤組成物。
31. 【請求項３１】前記哺乳動物14−β−galレクチンが、
    細胞毒性分子に結合している、請求項29に記載の薬剤組
    成物。
32. 【請求項３２】前記自己免疫疾患が重症筋無力症であ
    る、請求項29に記載の薬剤組成物。
33. 【請求項３３】前記自己免疫疾患が重症筋無力症であ
    る、請求項30に記載の薬剤組成物。
34. 【請求項３４】前記自己免疫疾患が多発性硬化症であ
    る、請求項29に記載の薬剤組成物。
35. 【請求項３５】前記自己免疫疾患が多発性硬化症であ
    る、請求項30に記載の薬剤組成物。