DE69533359T2

DE69533359T2 - Veränderte menschliche c3-proteine

Info

Publication number: DE69533359T2
Application number: DE69533359T
Authority: DE
Inventors: Alexander Richard HARRISON; Charles Timothy FARRIES
Original assignee: Imutran Ltd
Current assignee: Imutran Ltd
Priority date: 1994-09-08
Filing date: 1995-09-08
Publication date: 2005-07-28
Anticipated expiration: 2015-09-09
Also published as: NO971059D0; NZ292565A; AU3477295A; EP0779922B1; FI970979A0; ES2224133T3; BG101295A; EP0779922A2; JPH10505241A; BR9509172A; PL319040A1; FI970979L; WO1996007738A3; HUT77874A; FI970979A7; US5849297A; CZ290596B6; AU707004B2; NZ333949A; CA2197888A1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft neue modifizierte humane Proteine, die zur Bildung von stabilen C3 Konvertasen fähig sind, DNA Sequenzen, die solche Proteine kodieren und die Verwendung solcher Proteine als therapeutische Mittel, insbesondere zur Verwendung bei der Verringerung der Menge an Komplementsytemproteinen.
Das Komplementsystem ist Teil der Immunreaktion von Menschen und anderen Vertebralen, wobei es von hautsächlicher Bedeutung für die Effektorfunktionen ist, wie Phagocytose, Cytolyse und Anhäufung von Zellen, die lokale Entzündungsreaktionen hervorrufen [15]. Diese Eigenschaften sind zur Eliminierung von eindringenden Pathogenen erwünscht, wie Bakterien, sind aber unerwünscht, wenn sie ausgelöst werden, um gegen Wirtsgewebe zu wirken (beispielsweise bei der postischämischen Reperfusionsverletzung [3]) oder gegen fremdes therapeutisches Material (beispielsweise die hyperakute Abstoßung von Xenotransplantaten [7]). Es wurden Versuche unternommen, diese unerwünschten Eigenschaften durch die Ausnutzung von Derivaten der Komplementregulationsproteine zu beseitigen, deren normale Funktion die Unterdrückung der Komplementaktivierung ist [10, 18].
Das Komplementsystem umfasst Proteine sowohl auf der Oberfläche von Zellen (Rezeptoren und Regulatoren) wie auch in der flüssigen Phase (Blutplasma und andere extrazelluläre Umgebungen). Der entscheidende Schritt für die Erzeugung der Reaktionen ist die proteolytische Umwandlung von C3 zu den Fragmenten C3b und C3a. C3a ist ein Anaphylatoxin, das wie C5a Mastzellen an die Provokationsstelle dirigiert, was zur lokalen Freisetzung von Histamin, einer Vasodilatation und anderen Entzündungseffekten führt. Das naszente C3b hat eine Fähigkeit zur Bindung an die Oberflächen, die sich um dessen Erzeugung befinden. Dieses C3b fokussiert dann den Angriff durch die cytolytischen Komplementkomponenten (C5–C9).
Oberflächengebundenes C3b und dessen Abbauprodukte fungieren auch als Liganden für die C3 Rezeptoren, die beispielsweise die Phagocytose vermitteln [15]. Es gibt zwei unterschiedliche Wege der Komplementaktivierung, die beide zur Umwandlung von C3 zu C3b und den anschließenden Reaktionen führen. Der klassische Weg wird herkömmlich durch Antikörperkomplexe mit Antigen ausgelöst, die eine Enzymkaskade auslösen, die die Proteine C1q, C1r, C1s, C2 und C4 umfassen. Der alternative Weg hängt von einer Aktivierungsschleife ab, die C3 selbst umfasst und die Faktoren B und D erfordert.
Die Umwandlung von C3 zu C3b (oder C3i) bildet ein Produkt, das mit dem Faktor B unter Bildung von C3bB (oder C3iB) kombinieren kann. Diese Komplexe werden durch den Faktor D unter Bildung von C3bBb bearbeitet, das eine C3 Konvertase ist, die zur Spaltung von mehr C3 zu C3b fähig ist, was zu mehr C3bBb und noch mehr C3 Umwandlung führt. Unter bestimmten Umständen wird der C3bBb Komplex durch die Assoziation mit dem positiven Regulator Properdin (P) stabilisiert. Jedoch wird diese positive Feedback-Schleife normalerweise auf eine langsame Zunahme durch regulatorische Proteine begrenzt, vor allem Faktor H und Faktor I.
Der Faktor H (und strukturell ähnliche zellassoziierte Moleküle) (i) verdrängen B und Bb von C3b und (ii) wirken als Cofaktor für Faktor I, der C3b in iC3b umwandelt und hierbei jede Rekombination mit Faktor B unter Bildung von mehr C3 Konvertasen verhindert. Der Weg wird in Richtung der amplifizierten Erzeugung von C3b in Gegenwart von Oberflächen "geschürt", wie viele Zellwände, die naszentes C3b binden und dessen Regulation durch die Faktoren H und I verhindern. Naszentes C3b ist auch zur Bindung an endogene Zellen fähig. Endogene Zelloberflächen sind normalerweise gegenüber Komplement ausgesetzt und sind daher zusätzlich geschützt durch membrangebundene Regulatoren, wie MCP, DAF und CR, die ähnlich zu Faktor H wirken.
Es gibt einige wenige natürlich auftretende Zustände, worin die normale Flüssigphasenregulation nicht auftreten kann und die spontane C3 Umwandlung letztlich zum allgemeinen Verschwinden von C3 aus dem Kreislauf führt: (i) Genetische Defizienzen von Faktor H oder I [13], (ii) die Anwesenheit von Antikörpern (nephritischen Faktoren), die C3bBb binden und die Dissoziation verhindern [4] und (iii) Kontakt mit einem Protein im Gift der Cobra, der Cobragiftfaktor (CVF) genannt wird, der sich mit dem Faktor B vereinigt und ein C3 Konvertaseenzym bildet, das kein C3b enthält und nicht durch die Faktoren H und I beeinflusst wird [14]. Diese erläutern die normale physiologische Bedeutung der Herabregulation von Komplement in Gegenwart einer spezifischen Aktivierung.
Es gibt auch Umstände, bei denen eine spezifische Aktivierung auftritt, aber ungewollt, insbesondere wenn sie sich gegen Gewebe des Wirts (beispielsweise Gewebe, das durch Ischämie oder Operation geschädigt wurde) oder gegen fremdes Material richtet, das absichtlich für therapeutische Zwecke bereitgestellt wurde (wie ein Xenotransplantat, ein künstliches Organ oder eine Dialysemembran). Die Komplementaktivierung führt zu einer unerwünschten Attacke und weiteren Schädigung, so dass es in diesen Fällen nützlich wäre, die Aktivierung und Reaktion zu blockieren oder zu hemmen.
Existierende Ansätze zur Prävention von Komplement-vermittelter Schädigung haben auf die Verwendung der Herabregulationsproteine (CR1, MCP, DAF und der Faktoren H und I) gesetzt, um die Komplementaktivierung zu hemmen. Die Komplementinhibitoren, wie Faktor I, Faktor H und lösliche Derivate der membrangebundenen Proteine CR1, DAF und MCP unterdrücken die Amplifizierungsschleife in der flüssigen Phase des alternativen Wegs. Daher wurden Versuche unternommen, die Moleküle, insbesondere CR1 zu verwenden (das das stärkste zu sein scheint), um die durch Komplement vermittelte Schädigung in Modellen der physiologischen Situationen zu reduzieren [10, 18].
Faktor H kommt endogen in Blutplasma in hohen Konzentrationen vor (typischerweise 0,3–0,5 mg/ml [15]), das heißt obwohl erhöhte Inhibitormengen die Reaktionen in der flüssigen Phase dämpfen, ihre Wirkung schwach ist, so dass große Mengen an gereinigten Proteinen in vivo verabreicht werden müssten (beispielsweise wahrscheinlich mehr als 5 mg/kg Körpergewicht an löslichem CR1). Zusätzlich wird der alternative Weg durch Oberflächen aktiviert, wo die Wirkung des Faktors H bereits geschwächt ist. Da dies nicht notwendigerweise gleichzeitig die Aktivitäten der anderen Inhibitoren reduziert, legen dieselben Faktoren nahe, dass sie wahrscheinlich nicht vollständig oder universell wirksam sind.
Der Cobragiftfaktor (CVF) hat die Eigenschaft, eine stabile C3 Konvertase zu bilden, die experimentell zur Abreicherung von Komplement in Tieren in vivo und in anderen Proben (beispielsweise in humanem Blutplasma) in vitro verwendet werden kann. CVF wirkt stark (beispielsweise können 40 μg/kg die Komplementaktivität einer Maus zerstören [16]). Jedoch existieren Nachteile, die ihn für die therapeutische Verwendung beim Menschen ungeeignet machen.
Erstens wird er aus dem Cobragift erhalten (einer schwer zugänglichen Quelle, die schwierig in der Handhabung ist) und muss daher sorgfältig von den Neurotoxinen des Gifts abgetrennt werden. Es besteht ebenfalls die offensichtliche Schwierigkeit, eine Versorgung zu erhalten. Dieses Problem kann nicht leicht durch die Klonierung und Expression des Gens ex vivo überwunden werden, da posttranslationale Modifikationen im Schlangengift vorkommen (spezifische proteolytische Prozessierung), die schwierig (oder gar nicht) in vitro zu reproduzieren sind.
Zusätzlich sind die Enzyme und Verdaubedingungen, die für diese Prozessierung erforderlich sind, derzeit nicht bekannt. Zweitens ist das Protein aus einem fremden Ursprung (für den Menschen) und ist daher immunogen. Dies schließt die wiederholte therapeutische Verwendung aus, die erforderlich wäre, um einen Patienten über viele Wochen vom Komplement zu befreien (um beispielsweise einem Xenotransplantat ein Überleben zu erlauben).
Obwohl CVF einige strukturelle und funktionelle Homologien mit humanem C3 aufweist [17], weist es auch in zwei Gesichtspunkten große Unterschiede auf (beispielsweise Kettenstruktur, Biosynthesestelle, Unempfindlichkeit gegenüber Komplementregulatoren, Bildung einer stabilen C3 Konvertase). Es stammt nicht vom C3 Äquivalent der Cobra, das bekannt ist und kloniert und sequenziert worden ist und das in der groben Struktur und Funktion dem humanen C3 mehr ähnelt als CVF [8].
CVF ist ein giftspezifisches Produkt eines Tieres mit einem großen evolutorischen Abstand vom Homo sapiens. Es ist daher nicht praktikabel, eine genetische Manipulation zu verwenden, um das Protein zu einem Produkt zu modifizieren, das nicht-immunogen beim Menschen verwendet werden kann.
Es wurde nun eine alternative Strategie verfolgt, die auf der Umgehung der physiologischen Regulation beruht und die anstelle der Hemmung der Komplementaktivierung das System zur Überaktivierung bringt. Dies ergibt zwei Anwendungen. Erstens kann es in vivo zur Aktivierung von Komplement verwendet werden, bis eine oder mehrere Komponenten verbraucht sind, was zu einem Verlust der Fähigkeit führt, lokale Reaktion auf eine nachfolgende Provokation (wie durch ein Xenotransplantat) zu bilden. Zweitens kann die unregulierte Superaktivierung absichtlich gegen ein bestimmtes Ziel gerichtet werden (beispielsweise ein Virus oder eine durch ein Virus infizierte Zelle), um die Empfindlichkeit dieses Ziels für gegenüber einer durch Komplement vermittelten zerstörenden Reaktion zu erhöhen.
Der Ausdruck "Regulatoren der Komplementaktivierung" wird hierin verwendet, um alle Proteine zu umfassen, die zur Hemmung der Amplifizierung der C3 Umwandlung wirken und soll in seiner Bedeutung nicht auf die Proteine beschränkt werden, die im RCA Genlokus liegen. Er umfasst jedoch keine "Hochregulatoren", wie Properdin. "C3 Umwandlung" wird als proteolytische Umwandlung von C3 in C3b und C3a definiert, falls nichts anderes angegeben ist und "C3 Konvertase" (oder einfach "Konvertase") ist als Enzym definiert (typischerweise ein Komplex aus zwei oder mehreren Proteinkomponenten, beispielsweise C3bBb, C3iBb, CVFBb oder C4b2a), das diese Reaktion katalysiert.
Daher liefert die Erfindung in einem ersten Aspekt ein modifiziertes humanes C3 Protein, das zur Bildung einer stabilen C3 Konvertase fähig ist, worin das modifizierte Protein aus der Gruppe ausgewählt ist, die besteht aus

(a) einem C3 Protein, worin entweder Arg 1303, Arg 1320 oder beide durch eine andere Aminosäure ersetzt sind,
(b) einem C3 Protein, das eine verringerte Empfindlichkeit gegenüber Faktor H und/oder Faktor I relativ zu humaner C3 Konvertase aufweist, wobei das Protein ein oder mehrere Aminosäureaustausche relativ zu nativer humaner C3 Konvertase in der Region aufweist, die den Aminosäureresten 752–754 und/oder den Resten 758–780 der nativen humanen C3 Konvertase entspricht, und
(c) ein C3 Protein, das Aminosäureaustausche relativ zu nativer humaner C3 Konvertase an den Aminosäureresten 1427, 1431 und/oder 1433 der nativen humanen C3 Konvertase aufweist.

Typischerweise werden modifizierte Komplementsystemproteine von derselben Spezies verwendet.
Die Modifizierung der für C3 kodierenden DNA Sequenz, beispielsweise mittels ortsspezifischer Mutagenese, kann eine Variante von C3 bilden, die gegenüber regulatorischen Komplementproteinen resistent ist, während die positiven funktionellen Eigenschaften (Spaltung zu C3b durch C3 Konvertase) und die Merkmale der strukturellen Integrität (korrekte Kettenstruktur und Vorkommen einer Thiolesterbindung) beibehalten werden. Die hierin beschriebene Erfindung betrifft genetisch modifizierte Formen an nativen Komplementproteinen für beispielsweise humanes C3, deren C3b Fragment die Eigenschaft erwirbt, dass es gegenüber der physiologischen Komplementregulation resistent ist. Aufgrund dieser Resistenz können diese Moleküle stabilisierte Formen der entsprechenden C3 Konvertase erzeugen, die eine amplifizierte Umwandlung von C3 zu C3b und spätere Abbauprodukte in physiologischen Umgebungen (beispielsweise in vivo) bildet.
In einer Ausführungsform betrifft die Erfindung ein modifiziertes humanes C3 Protein, das zur Bildung einer stabilen C3 Konvertase fähig ist, worin das modifizierte Protein ein C3 Protein ist, worin entweder Arg 1303 oder Arg 1320 oder beide durch eine andere Aminosäure ersetzt sind.
In einer anderen Ausführungsform betrifft die Erfindung ein modifiziertes humanes C3 Protein, das zur Bildung einer stabilen C3 Konvertase fähig ist, worin das modifizierte Protein ein C3 Protein ist, das eine verringerte Empfindlichkeit gegenüber dem Faktor H und/oder dem Faktor I relativ zur nativen humanen C3 Konvertase aufweist, wobei das Protein einen oder mehrere Aminosäureaustausche relativ zur nativen humanen C3 Konvertase in der Region aufweist, die den Aminosäureresten 752–754 und/oder den Resten 758–780 der nativen humanen C3 Konvertase entspricht. Ein Beispiel ist in 6 gezeigt.
In einer weiteren Ausführungsform betrifft die Erfindung Aminosäureaustausche relativ zu nativer humaner C3 Konvertase, die den Resten 1427, 1431 und/oder 1433 der nativen humanen C3 Konvertase entsprechen.

i) Verringerte Empfindlichkeit gegenüber den hemmenden Wirkungen von Faktor H und verwandten Proteinen (beispielsweise MCP, DAF, CR1). Beispielsweise sind bei humanem C3 die Reste 767–776 und 1209–1271 bei der Bindung von Faktor H beteiligt [20, 24] und die Substitution eines oder mehrerer dieser Reste oder anderer Reste, die auch mit der Wirkung dieser Proteine assoziiert sind, könnten die Bindung von einem oder mehreren dieser regulatorischen Proteine verringern.
ii) Verringerte Dissoziationsgeschwindigkeit von C3bBb. Es können Mutationen eingeführt werden, die die Wechselwirkung zwischen C3b und Bb stärken würden. Dies würde sowohl zu einer Verringerung des spontanen Zerfalls des Enzyms als auch zur Minderung der Wirkung von Faktor H (und verwandter Regulatoren) zur Verdrängung von Bb von C3b führen. Diese Mutationen sind erwünscht, um die Geschwindigkeiten sowohl der spontanen als auch der durch Faktor H vermittelten Zersetzung von C3bBb zu verringern. Sogar in Abwesenheit des Faktors H hat der C3bBb Komplex in der flüssigen Phase eine Halbwertszeit von nur etwa 10 Minuten bei 37°C in Gegenwart von Properdin [6].
iii) Die Reste 752–761 in humanem C3 sind bei der Bindung von Faktor B beteiligt. Es ist eine hoch konservierte Region in C3 und man findet eine nahe verwandte Sequenz in C4. Wenn C4 das Faktor B Homolog C2 bindet, unterstützt die hohe Ähnlichkeit dieser Region zwischen C3 und C4 zusammen mit der starken Konservierung in C3 ferner die Rolle in C3 als Bindungsstelle für den Faktor B. Daher könnten Veränderungen in dieser Region Effekte auf die Affinität für B und auf die Stabilität von C3bBb haben.
iv) Die Resistenz gegenüber anderen Regulatoren der Komplementaktivierung, wie CR1, DAF und MCP wäre ebenfalls erwünscht. Die Wirkungsmechanismen dieser Regulatoren sind alle zu dem von Faktor H ähnlich, so dass eine zusätzliche Mutagenese nicht notwendigerweise erforderlich ist. Ähnlich exprimieren einige pathogene Organismen ihre eigenen Inhibitoren der Komplementaktivierung, die oft strukturell und funktionell zu Faktor H homolog sind (beispielsweise Sekretionspeptid des Vaccinia Virus). Diese Moleküle schützen die Eindringlinge gegen Immunreaktionen und es wäre vorteilhaft, sie mit zielgerichteten C3 Konvertaseenzymen anzugreifen, die gegen diese Abwehrmechanismen resistent sind.
v) Mutationen, die die Stabilisierung der C3 Konvertase durch Properdin erhöhen. Die Aktivität von Properdin ist es, den C3bBb Komplex zu stabilisieren und die spontane und Faktor H-abhängige Dissoziation zu verzögern. Diese Stabilisierung ist in der flüssigen Phase ineffektiv, scheint aber bei der Amplifizierung des Prozesses wichtiger zu sein, wenn er auf einer geeigneten Aktivierungsoberfläche begonnen hat [5]. Die Erhöhung der Aktivität (durch die Erhöhung der Affinität) kann die Balance in der flüssigen Phase stören und hierbei die spontane C3 Umwandlung fördern. Dies sollte insbesondere bei der Kombination mit den anderen oben beschriebenen Modifikationen brauchbar sein.
vi) Mutationen, die C3bBb davor bewahren, eine C5 Konvertaseaktivität aufzuweisen. Bei einem Einsatz zur Eliminierung von aktivem C3 aus dem Kreislauf könnte ein unerwünschter Effekt die Bildung von großen Mengen an anaphylaktischen Peptiden sein. Das stärkste hiervon ist C5a, das aus C5 durch einige C3 Konvertaseenzyme abgespalten wird. Diese Reaktion hängt vermutlich von der Affinität der Konvertase für ein weiteres Molekül an C3b ab [11] und könnte so durch Mutationen in C3 unterdrückt werden, die diese Wechselwirkung entfernen.
vii) Verbesserte Aktivität der C3 Konvertase. Das aktive Zentrum des C3bBb C3 Konvertaseenzyms liegt im Bb Teil. Die C3b Komponente gibt Bb vermutlich eine aktive Konformation und/oder bindet und orientiert das von Bb zu verarbeitende Substrat. Dies ist nicht bekannt, aber in jedem Fall besteht die Möglichkeit zur Steigerung der Aktivität der Konvertase durch Mutationen in C3.
viii) Expression in einer funktionellen Form. Wildtyp C3 erfordert eine Umwandlung zu C3b, bevor es einen neuen C3 Konvertasekomplex eingehen kann. Wenn es in vivo verwendet wird, würde die erforderliche Umwandlung zu C3b (oder C3i) die Wirkung von modifiziertem C3 verzögern. Es wäre daher erwünscht entweder das Protein in einer Form zu verabreichen, die zur unmittelbaren Konvertasebildung fähig ist oder vorgeformte Konvertasekomplexe zu verabreichen. Es ist daher vorteilhaft, ein funktionell C3b-ähnliches Reagenz ex vivo zu erzeugen. Dies könnte in vitro erreicht werden (beispielsweise durch Proteolyse).
ix) Modifikationen am nativen Protein, die zur Einführung von neuen Spaltstellen dienen, so dass die für die Faktor B Bindung erforderlichen Peptidregionen erhalten bleiben, aber die, welche nur für die Faktor H Bindung benötigt werden, spezifisch entfernt werden können. Beispielweise können Stellen so eingeführt werden, dass die C3b-ähnliche Form des modifizierten C3 weiter in eine Form gespalten werden kann, die immer noch den Faktor B bindet, aber weniger empfindlich gegenüber einer Inaktivierung durch die Faktoren H und I ist.
x) Modifikationen in anderen Regionen, die die C3b Wechselwirkung mit Faktor B und/oder Faktor H beeinflussen.

Die Erfindung basiert auf der Umkehr des traditionellen Ansatzes, indem man die C3 Umwandlung zum Verbrauch von C3 fördert und hierbei das System ausschaltet. Eine zusätzliche Anwendung der Erfindung ist das Potential zur Förderung der C3 Umwandlung an einer bestimmten Stelle und hierbei die Heranziehung der Komplement-abhängigen Effektormechanismen, um ein spezifisches Ziel anzugreifen.
Daher ist die letztliche Wirkung die Erhöhung der Menge an C3 Konversion, wenn das modifizierte Protein in ein physiologisches Medium verabreicht wird (beispielsweise Blut), worin Regulatoren der Komplementaktivierung enthalten sind. Diese Aktivität kann dann entweder dazu verwendet werden, im Medium natives C3 abzureichern oder die C3 Umwandlung an einem bestimmten Ziel zu lokalisieren.
Das Analogon von C3, dessen C3b Fragment gegenüber den Wirkungen von Faktor I resistent ist (beispielsweise das in Beispiel 1 beschriebene Derivat) würde an den Faktor B binden, der dann durch den Faktor D gespalten werden und eventuell in eine inaktive Form dissoziieren würde. Bei fehlender Inaktivierung durch den Faktor I wäre das modifizierte C3b fähig, wiederholt an neue Moleküle des Faktors B zu binden und hierbei dessen Inaktivierung zu fördern. Daher wäre eine weitere potentielle Anwendung der in der Erfindung beschriebenen Modifikationen die Inaktivierung des alternativen Wegs durch den Verbrauch der Faktor B Aktivität. Ein analoger Ansatz könnte auch zur Modifizierung von C4 verwendet werden, um den Verbrauch von C2 zu fördern und hierbei den klassischen Weg der Komplementaktivierung zu verhindern.
Die Erfindung umfasst jede andere Protease, die auf analoge Weise zum C3bBb Enzym verwendet wird, die trotz der Anwesenheit der Regulatoren der Komplementaktivierung zur Spaltung von C3 in C3b führt.
Die Erfindung umfasst auch DNA Sequenzen, die für ein Protein der Erfindung kodieren, wie auch DNA Konstrukte, die solche DNA Sequenzen umfassen.
"DNA Sequenzen" umfassen alle anderen Nukleinsäuresequenzen, die durch die Degeneriertheit des genetischen Codes auch für die angegebene Aminosäuresequenz kodieren oder die im wesentlichen zu dieser Sequenz homolog sind. Diese Sequenzen sind daher auch im Schutzumfang der Erfindung enthalten.
Nukleinsäuresequenzen, die "im wesentlichen homolog" sind liegen auch im Schutzumfang der vorliegenden Erfindung. "Im wesentlichen homolog" kann entweder auf Nukleinsäureebene oder auf Aminosäureebene ermittelt werden. Auf Nukleinsäureebene können Sequenzen mit einer wesentlichen Homologie als die betrachtet werden, die an die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren unter stringenten Be dingungen hybridisieren (beispielsweise bei 35 bis 65°C in einer Salzlösung von etwa 0,9 M). Auf Aminosäureebene kann eine Proteinsequenz als im wesentlichen homolog zu einer anderen Proteinsequenz betrachtet werden, falls eine signifikante Anzahl der Aminosäurebestandteile eine Homologie zeigt. In aufsteigender Bevorzugungsreihenfolge sollen mindestens 55%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% oder sogar 99% der Aminosäuren homolog sein.
Wie oben diskutiert, können die erfindungsgemäßen Proteine verwendet werden, um lokalisierte Komplementaktivierungseffekte zu erreichen. Ein Weg, um dies sicherzustellen, ist es, das Protein an einen Rest zu konjugieren, der an das gewünschte Ziel bindet. Daher liefert die Erfindung in einem weiteren Aspekt ein Konjugat, das ein erfindungsgemäßes Protein umfasst, welches an einen spezifischen Bindungsrest gebunden ist, beispielsweise ein spezifisches Bindeprotein. Ein Beispiel für ein solches Protein wäre ein Antikörper oder ein Antigen-bindendes Fragment hiervon.
Die Proteine der Erfindung sollen einem Patienten verabreicht werden, um einen gewünschten therapeutischen Effekt auszulösen. Daher liefert die Erfindung hierfür auch:

a) Ein erfindungsgemäßes Protein zur Verwendung in der Therapie,
b) Die Verwendung eines Proteins oder eines Konjugats der Erfindung zur Herstellung eines Arzneimittels zur Verwendung bei der Verringerung der Mengen an Komplementsystemprotein und insbesondere zur Verwendung bei der Verhinderung der Abstoßung fremder Materie,
c) Eine pharmazeutische Formulierung, die ein oder mehrere Proteine oder Konjugate der Erfindung zusammen mit einem oder mehreren pharmazeutisch annehmbaren Trägern und/oder Hilfsstoffen enthält, und
d) Ein Verfahren zur Verringerung von Komplementsystemprotein bei einem Säuger, das die Verabreichung eines erfindungsgemäßen Proteins an diesen Säuger umfasst, vorzugsweise in Form einer pharmazeutischen Formulierung.

Pharmazeutische Formulierungen können in Einheitsdosierungsformen vorliegen, die eine vorbestimmte Menge Wirkstoff pro Dosis enthalten. Eine solche Einheit kann als Minimum beispielsweise 1 mg Wirkstoff und vorzugsweise 2–3 mg enthalten. Das obere Limit, das eine solche Einheitsdosierung enthalten kann, hängt von vielen Faktoren ab, wie dem zu behandelnden Zustand, dem Verabreichungsweg und dem Alter, dem Gewicht und dem Zustand des Patienten wie auch von ökonomischen Überlegungen. Als Beispiel kann eine Einheitsdosierungsform bis zu 10 mg oder sogar 100 mg Wirkstoff enthalten.
Die erfindungsgemäßen Proteine können in vivo zur Untauglichmachung des Komplementsystems führen. Umstände, bei denen dies erwünscht ist, umfassen die folgenden:

(a) Um eine durch Komplement vermittelte Zerstörung oder Beschädigung eines Transplantats, insbesondere eines Xenotransplantats (Material, das von einer unterschiedlichen Tierart transplantiert wurde) und insbesondere eines unverträglichen Xenotransplantats (wobei die Donor- und Empfängerarten unverträglich verwandt sind) zu verhindern. Der Empfänger würde vor der Operation vom Komplementsystem befreit werden und in diesem Zustand gehalten werden, bis das Transplantat sich entweder eingenistet hat oder durch ein passenderes Organ ersetzt wurde.

Die anfängliche Behandlung könnte innerhalb einiger Tage vor der Transplantation ausgeführt werden. Eine zusätzliche Befreiung vom Komplement könnte bei Zuständen einer Abstoßungskrise erforderlich sein. Die Behandlungen können durch die Verwendung von Antihistaminmitteln begleitet werden, um die allgemeinen Entzündungsreaktionen (beispielsweise Vasodilatation) zu kontrollieren, die wahrscheinlich aus der Erzeugung von C3a und/oder C5a resultieren.
Eine Befreiung vom Komplement kann auch zur Verwendung von künstlichen Organen oder Geweben nützlich sein (beispielsweise künstlichen Nierendialysemembranen), die das Komplementsystem aktivieren. Wie oben beschrieben kann das Protein entweder als nicht aktivierte Form, als funktionell C3b-ähnliche Form oder als vorgeformte aktive C3 Konvertase (wie C3bBb) verabreicht werden. Diese können durch jeden Weg verabreicht werden, bei dem die aktive Konvertase auf zirkulierendes C3 trifft (beispielsweise intravenös, subkutan etc.).
Eine weitere Alternative wäre eine ex vivo Behandlung, beispielsweise durch Transfusion des Blutkreislaufs durch eine Matrix, die aktive Konvertase enthält. Die könnte den Vorteil haben, dass anaphylaktische Peptide (C3a und C5a) und andere niedermolekulare Entzündungsmediatoren (beispielsweise Histamin und Stickstoffmonooxid) entfernt werden (beispielsweise durch Dialyse), bevor das vom Komplement befreite Blut (oder Plasma) in den Patienten zurückgeführt wird.

(b) Um eine durch Komplement vermittelte Zerstörung zu verhindern, die aus einer großen Operation resultiert. Der Patient würde wie oben vorzugsweise vor der Operation (aber erforderlichenfalls auch nachher) vom Komplement befreit werden und in diesem Zustand gehalten werden, bis die Gefahr einer zusätzlichen inneren Verletzung aufgrund der Komplement-abhängigen Immunattacke nachgelassen hat.
(c) Um eine durch Komplement vermittelte Schädigung zu minimieren, die aus einer nicht-operationsbedingten Verletzung stammt. In diesen Fällen muss die Dekomplementierung nach der anfänglichen Verletzung ausgeführt werden, aber die Formulierungen und Verabreichungsverfahren sind sonst wahrscheinlich ähnlich zu den oben beschriebenen. Dies kann besonders brauchbar sein, wenn die Erholung eine Reperfusion eines ischämischen Gewebes durch den Blutkreislauf umfasst (beispielsweise Myokardischämie, Erfrierungen, Verbrennungen etc.).
(d) Um die durch Komplement vermittelte Schädigung zu minimieren, die aus Antikörper-Antigen-Wechselwirkungen resultiert. Die durch Komplement vermittelten Abwehrreaktionen sind besonders bei Autoimmunerkrankungen unerwünscht, die Glomerulonephritis, hämolytische Anämie, Myasthenia Gravis und durch Collagen induzierte Arthritis vom Typ II umfassen. Die Abschaltung des Komplementsystems während schwerer Krankheitsepisoden kann den Zustand lindern.
(e) Um ein spezifisches pathogenes Ziel noch empfindlicher gegenüber durch Komplement vermittelte Immunmechanismen zu machen. Bei diesem Ansatz ist es nicht das Ziel, die sehr aktive C3 Konvertase zur Herstellung eines allgemeinen Mangels an C3 zu verwenden, sondern anstelle dessen die Konvertase lokal zu verwenden, um die C3 Konversion lokal an einem bestimmten Ziel zu konzentrieren. Das Ziel kann ein pathogener Organismus sein, wie ein Bakterium, ein Virus oder ein anderer Parasit oder eine schädliche Wirtszelle oder ein schädliches Gewebe, wie eine Tumorzelle oder eine viral infizierte Zelle. Die C3 Konvertase könnte entweder durch lokale Verabreichung (beispielsweise direkte Injektion, möglicherweise in einem Medium, das die Dispersion in den allgemeinen Kreislauf verhindert) oder durch die Kombination mit einem zielführenden Rest, beispielsweise einem Antikörper, am Ziel lokalisiert werden. Daher kann das modifizierte Protein mit einem spezifischen Immunglobulin entweder durch chemische Quervernetzung der Proteine oder durch Verbinden der kodierenden DNA Sequenzen und der Expression (und Reinigung) des Fusionsproteins (beispielsweise im Fall von IgG könnte entweder die schwere Kette oder die leichte Kette an C3 gebunden und mit C3 exprimiert werden oder beide Ketten könnten innerhalb eines kompletten Fusionspolypeptids kombiniert werden) oder durch Einbau von spezifischen kodierenden Sequenzen (beispielsweise für "Leucin-Zipper"-ähnliche Domänen) an die DNA beider Fusionspartner (beispielsweise modifiziertes C3 und spezifischer Antikörper), gebunden werden, so dass die exprimierten Produkte, wenn sie zusammengemischt werden, unter Bildung von stabilen Konjugaten selbstassoziieren. Das Fusionsprotein könnte dann lokal oder in den allgemeinen Kreislauf verabreicht werden.

Liposome (die den Antikörper auf der Oberfläche mit dem modifizierten Protein entweder auf der Oberfläche oder im Liposom aufweisen) und/oder Virionen (beispielsweise verändert zur Expression der Proteine auf ihrer Oberfläche) könnten auch zur gemeinsamen Abgabe des Antikörpers und des modifizierten Proteins verwendet werden. Diese Strategie könnte direkt, alleine oder in Kombination mit anderen Behandlungen bei jeder Stufe im Erkrankungsprozess verwendet werden. Dies kann besonders zur Verwendung bei der Eliminierung von krebsartigen Zellen geeignet sein, die nach einer operativen Entfernung eines Tumors im Kreislauf verbleiben. Die Antikörper-modifizierten Proteinkonjugate könnten auch ex vivo zur Eliminierung von pathogenem Gewebe verwendet werden. Beispielsweise können Leukämiezellen aus einem extrahierten Knochenmark abgetötet und die verbleibenden gesunden Zellen können dann in den Patienten zurückgeführt werden.
Alternativ dazu können Lymphozyten, die nicht die MHC Typen des Empfängers aufweisen, vor der Transplantation aus einem Knochenmark entfernt werden. Das modifizierte Protein könnte auch an ein Antigen gebunden werden und diese Kombination könnte entweder in vivo oder ex vivo für den Angriff auf Lymphocyten mit unerwünschten Reaktivitäten verwendet werden (beispielsweise gegen ein Transplantat oder ein eigenes Gewebe).
Dieselbe Technologie wäre auf die Behandlung von anderen Spezies unter Verwendung entweder eines humanen modifizierten Proteinderivats oder einem ähnlichen Analogon anwendbar, das für diese Spezies maßgeschneidert wurde.
Bevorzugte Merkmale jeden Aspekts der Erfindung gelten auch mutatis mutandis für jeden anderen Aspekt.
Die Erfindung wird nun durch die folgenden Beispiele beschrieben, die nicht so aufgefasst werden, dass sie die Erfindung in irgendeiner Weise beschränken. Die Beispiele beziehen sich auf die begleitenden Zeichnungen, worin gilt:
1: Sie zeigt die abgeleitete Proteinsequenz des humanen C3, wie es in PC3 kodiert ist (mittels des Einaminosäurenstandardbuchstabencodes).
2: Sie zeigt die cDNA Sequenz in PC3 (mittels des Standardeinbuchstabendesoxynukleotidcodes für den Sinnstrang, der 5'-3' angegeben ist).
3: Sie zeigt eine Visualisierung von modifizierten Proteinen der Erfindung.
4: Sie zeigt die Wirkung von verschiedenen Mutationen auf humanes C3, die Arg 1303 oder Ar 1320 ersetzen, auf die durch Faktor I vermittelte Spaltung an diesen Stellen.
N. B.

1. [³⁵S]-biosynthetisch markierte Proben
2. Reaktionen, die bei normaler Ionenstärke ausgeführt werden
3. Immunpräzipitation mit anti-C3
4. SDS-PAGE unter reduzierenden Bedingungen
5. Autoradiographie

5: Sie zeigt eine erhöhte Resistenz von humanem C3 gegenüber einer Inaktivierung durch die Faktoren I und H, das die Arg 1303 → Gln 1303 Mutation aufweist.
6: Sie zeigt eine Analyse der Spaltung einer C3 Konvertase, die an den Aminosäureresten 752–754 und 758–760 mutiert ist.
Sie ist eine Photographie eines Western Blots, der aus einem 7,5% SDS-PAGE Polyacrylamidgel (reduzierenden Bedingungen) nach einem elektrophoretischen Transfer auf Nitrocellulose, Sondierung mit einem Schaf-anti-human C3 Antikörper und einer Entwicklung mit Pferd-Meerrettichperoxidasegekuppelten anti-Schaf-Immunglobulinantikörper und Enhance ChemiLuminescence (Verfahren und Detektionsreagenzien von Amersham, UK), die auf einem Röntgenfilm aufgezeichnet wurde. Die Spaltungsreaktionen und das Detektionsverfahren werden ausgeführt, wie dies in Beispiel 4 beschrieben ist, wobei auf die in 3 gezeigten Ergebnisse Bezug genommen wird.
Schlüssel

Spuren 1–4: Wildtyp C3 (exprimiert in COS Zellen)
Spuren 5–8: Mutiertes C3 (Reste 752–754 verändert zu Gly-Ser-Gly und die Reste 758–760 ebenfalls zu Gly-Ser-Gly verändert (exprimiert in COS Zellen).
Spuren 1, 5: keine Zugabe
Spuren 2, 6: + CVFBb
Spuren 3, 7: + Faktoren H + I
Spuren 4, 8: + CVFBb + Faktoren H + I

Die durch die Pfeile angedeuteten Banden sind:

A: C3 α-Kette
B: C3 α'-Kette
C: C3 β-Kette
D: 68 kDa Spaltprodukt der C3 α'-Kette
E: IgG schwere Kette

7: Sie zeigt eine Analyse der Spaltung von radioaktiv markiertem Faktor B durch Faktor D in Gegenwart von Wildtyp und mutierten C3's (C3i's).
Es wird eine Photographie des Autoradiogramms des SDS-PAGE Gels gezeigt. Alle Proben enthalten den Faktor D und ¹²⁵-I markierten Faktor B und werden für 3 Stunden bei 37°C inkubiert.
Die Proben in den nummerierten Spuren umfassen auch:

1. Puffer alleine
2. 1/125 Wildtyp C3
3. 1/25 Wildtyp C3
4. 1/5 Wildtyp C3
5. 1/25 mutiertes C3 (Reste 1427 Gln, 1431 Asp und 1433 Gln)
6. 1/5 mutiertes C3
7. unverdünntes mutiertes C3

Die durch die Pfeile angezeigten Banden sind:

A. Ungespaltener ¹²⁵Ι-markierter Faktor B (93 kDa)
B. 60 kDa Spaltprodukt ("Bb")
C. 33 kDa Spaltprodukt ("Ba")

8: Sie zeigt eine SDS-PAGE Untersuchung, die die Bildung eines Konjugats zwischen C3i und IgG erläutert.
Dies ist eine Coomassie Färbung eines 4% Acrylamid SDS-PAGE Gels, das unter nicht-reduzierenden Bedingungen gefahren wird. Die nummerierten Spuren enthalten Proben von:

1. PDP-IgG
2. C3i
3. PDP-IgG + C3i Reaktionsgemisch

Angezeigt durch Pfeile sind:

A. Vermutlich C3i-IgG Konjugat (350 kDa)
B. C3i (200 kDa)
C. IgG (150 kDa)

9: Sie zeigt, dass das Konjugat die C3 Konvertaseaktivität gegen die Schaferythrozyten richtet. (Dieser Graph zeigt den Prozentsatz an lysierten Schaferythrocyten nach einer Beschichtung mit Verdünnungen von entweder dem C3i-IgG Konjugat, PDP-IgG oder C3i gefolgt von Waschen, Erzeugung der C3 Konvertasen mit Properdin und den Faktoren B und D und schließlich Entwicklung der Lyse durch NGPS in CFD/EDTA, wie dies in den Verfahren beschrieben ist. Nur das Konjugat bildet eine Lyse und diese Lyse ist dosisabhängig.)
Die folgenden Standardverfahren und Definitionen sind auf alle Beispiele anwendbar.
Alle Komplementkomponenten, auf die Bezug genommen wird, sind humanen Ursprungs, falls nichts anderes angegeben ist und es wird die Standardterminologie für alle Proteine und ihre abgeleiteten Fragmente verwendet (wie dies beispielsweise in Literaturstelle [15] angegeben ist). Zusätzlich bezieht sich der Ausdruck "C3i" auf jede molekulare Form an C3 ohne einer intakten Thiolesterbindung, wobei aber das C3a Polypeptid auf der α-Kette zurückgehalten wird.
Die cDNA und kodierende Sequenz für humanes C3 sind nummeriert, wie dies in 2 angegeben ist, wobei die in der EMBL Nukleotiddatenbank angegebene Nummerierung verwendet wird (abgeleitet aus Literaturstelle [2]). Die gezeigte Sequenz ist die des vorliegenden Konstrukts ("PC3"), dem die ersten 11 Nukleotide der 5'-untranslatierten Region, die in Literaturstelle [2] angegeben ist fehlen und daher wird die erste Base mit 12 nummeriert. Das putative Initiationscodon hat die Nukleotidnummer 61–63, das Codon für den aminoterminalen Serinrest der β-Kette entspricht den Nukleotiden 127–129 und das Codon für den aminoterminalen Serinrest der alpha-Kette entspricht den Nukleotiden 2074–2076.
Die Proteinsequenz ist gemäß der Vorläufersequenz nummeriert, die in 1 gezeigt ist, welche eine abgeleitete Translation der DNA in Appendix 1 ist (Aminosäuren 1–22 dürften eine Signalsequenz umfassen, die während der Biosynthese entfernt wird und die Aminosäuren 668–671 dürften entfernt werden, wenn der Vorläufer in die α- und β-Ketten gespalten wird).
Die folgenden Abkürzungen haben die folgenden Bedeutungen: CVF für Cobragiftfaktor, ELISA für Enzymgebundener Immunosorbenttest, E. coli für Escherichia coli, kb für Kilobase, HSV-1 für Herpes simplex Virus Typ 1, PBS für phosphatgepufferte Kochsalzlösung. COS-1 ist eine Zelllinie, die sich von Affennierenzellen ableitet. Die folgenden sind Restriktionsendonukleasen: AflII, DraI, DraIII, EcoRI, EcoRV, HindIII, NaeI, NheI und XbaI.
Standardverfahren
Die Verfahren für die molekularbiologischen Standardverfahren, wie Plasmidisolierungen, Agarosegelelektrophorese und DNA Ligationen können in Referenz [21] gefunden werden. Die doppelsträngige DNA wird mittels des Sequenase Version 2.0 Kits sequenziert, der von United States Biochemicals geliefert wird. Die C3 Expression wird mittels eines ELISA Tests unter Verwendung von Plastikplatten gemessen, die mit einem Affinitäts-gereinigten, polyklonalen Schaf-anti-Mensch C3 vorbeschichtet sind, zu denen die Proben des Kulturüberstands gegeben werden. Gebundenes C3 wird mittels eines monoklonalen Rattenantikörpers gegen C3, der an eine alkalische Phosphatase gekuppelt ist und dem chromogenen Substrat p-Nitrophenolphosphat deletiert. Die Tests werden mit gereinigtem C3 aus Humanplasma kalibriert.
Die Verfahren zur Reinigung der Komplementproteine und CVF und zur Reinigung der durch Affinität gereinigten anti-C3 Antikörper, die bei der Analyse verwendet werden, können in der Literaturstelle [28] gefunden werden. Äquivalente Reagenzien können auch von Sigma Chemical Company Ltd bezogen werden.
Für C3 kodierende cDNA Sequenz
Die vorliegende für C3 kodierende cDNA Sequenz wird aus zwei Segmenten konstruiert, die aus einer zufällig geprimten humanen Leber-cDNA-Bank isoliert wurden, welche im Vektor pGEM4 (Promega) vorliegt. Es werden 5 Oligodesoxynukleotide, die bekannten Segmenten in der humanen für C3 kodierenden Sequenz entsprechen, mit T4 Polynukleotidkinase und [γ-³²P ATP] radioaktiv markiert und zur Sondierung von Filterabdrücken der Genbank von den Agaroseplatten verwendet. Zwei Klone, die Inserts mit etwa 4 kb enthalten, werden isoliert. Ein Restriktionsendonukleaseverdau, eine Hybridisierung an spezifische Oligodesoxynukleotidsonden und eine partielle Sequenzanalyse zeigen, dass einer hiervon ("A13") das 5'-Ende der 5,1 kb Information enthält, während der andere ("B44") über das 3'-Ende hinausgeht.
Diese Inserts überlappen daher um etwa 3 kb und enthalten eine EcoRI Einzelschnittstelle. Der unvollständige Teil des 5'-Abschnitts von A13 wird mit EcoRI und NheI ausgeschnitten und durch das vollständige Segment ersetzt, das aus B44 durch einen Verdau mit EcoRI und XbaI isoliert wurde. Beide Stücke werden durch Gelelektrophorese in Agarose mit einem niedrigen Schmelzpunkt gereinigt, bevor sie mit T4 DNA Ligase unter Bildung des Vektors ("PCG3") ligiert werden, der 5,1 kb der für das vollständige C3 Vorläuferprotein kodierenden DNA enthält.
Die Linkersequenzen 5' zur für C3 kodierenden Region enthalten zwei ATGs, die potentiell falsche Translationsstartstellen sind. Diese werden daher durch Gapped-Plasmidmutagenese entfernt, wie es im Verfahren von Beispiel 1 beschrieben ist, wobei ein Oligonukleotid PL-ATC-3 (TAGGGAGACC GGAAGCTTGC CCTCTCCCTC TGTCCCTCTG T) verwendet wird, das etwa 50 Basenpaare der Linker/Adaptor DNA deletiert, ohne die für C3 kodierende Sequenz zu verändern. Dieser mutierte Vektor wird als PC3 bezeichnet, wobei die 7,7 kb 5,1 kb der C3 cDNA Sequenz plus 2,6 kb der Sequenz vom PGEM4 Vektor (Promega) enthalten.
Die für C3 kodierende Region des PGC3 Plasmids wird vollständig sequenziert und zeigt nur vier Unterschiede gegenüber einer vorher veröffentlichten humanen C3 cDNA Sequenz ("S" Allel) [2].

(i) Die Veränderungen C2481 → G und C2805 → T verändern die Codierung nicht,
(ii) T1001 → C kodiert für die vorher beschriebene polymorphe Form HAV 4-1 (Leucin314 → Prolin) [20] und
(iii) G2716 → A kodiert für Valin886 → Isoleucin, das vorher nicht in humanem C3 beschrieben wurde, obwohl Ile an dieser Position im C3 der Maus und der Ratte gefunden wird.

Die Sequenz umfasst Start- und Stoppcodons mit einer vollständigen Signalsequenz und sollte daher funktionelles C3 kodieren.
Es werden Mengen bis zu 1,7 μg/ml an exprimiertem Wildtyp C3 in Kulturüberständen von COS-1 Zellen (transfiziert mittels Lipofectamin und des pcDNA3 Expressionsvektors (Invitrogen)) durch ELISA detektiert. Es wird kein detektierbares C3 durch Zellen gebildet, die mit dem pcDNA3 Vektor alleine trans fiziert wurden. Ferner zeigt eine Analyse des exprimierten Produkts durch Spaltungsreaktionen, gefolgt von Immunfällung, SDS-PAGE und Immunblot, dass

(i) das primäre Translationsprodukt korrekt in die reife zweikettige Form prozessiert wurde,
(ii) dieses Produkt wie natives C3 zu C3b durch C3 Konvertase (CVFBb) spaltbar ist, und
(iii) das exprimierte Protein, wie natives C3, nicht durch den Faktor H plus I spaltbar ist, aber nach einer Umwandlung zu C3b durch das C3 Konvertaseenzym. Dies bestätigt, dass das vorliegende Ausgangsplasmid in funktionelles C3 translatiert werden kann.

Für eine alternative Beschreibung der Konstruktion und Expression einer für C3 kodierenden Sequenz siehe Literaturstelle [25].
Beispiel 1: Herstellung von C3, bei dem die Argininreste an beiden Spaltstellen für Faktor I (Aminosäurepositionen 1303 und 1320) zu Glutaminresten umgewandelt wurden, um eine Spaltung des C3b Fragments durch den Faktor I zu verhindern
a) Mutagenese
Es werden die mutagenen Oligodesoxynukleotide QRI1 (CAACTGCCCA GCCAAAGCTC CAA-GATCACC), QRI2 (GCCAGCCTCC TGCAATCAGA AGAGACCAAG) und AFL4149 (TAATAAATTC GACCTTAAGG TCACCATAAA AC) wie auch die entsprechenden Antisinnoligodesoxynukleotide QRI1n (GGTGATCTTG GAGCTTTGGC TGGGCAGTTG), QRI2n (CTTGGTCTCT TCTGATTGC AGGAGGCTG GC) und AFL4149n (GTTTTATGGT GACCTTAAGG TCGAATTTAT TA) verwendet.
QRI1 und QRI1n spezifizieren den Austausch von Arginin gegen Glutamin an der Spaltstelle für Faktor I am Aminosäurerest 1303 in der C3 Vorläufersequenz (durch den Austausch G3968C3969 zu AA in der cDNA Sequenz) und QRI2 und QRI2n bewirken dieselbe Substitution an der Faktorspaltstelle am Aminosäurerest 1320 (durch Austausch von Nukleotid G4019 zu A).
AFL4149 und AFL4149n führen eine Spaltstelle für die Restriktionsendonuklease AflII an der Position 4149 in der cDNA Sequenz (durch Austausch von C4149 zu T) ohne der Veränderung der kodierten Aminosäuresequenz ein. Die zwei Primer werden als Marker verwendet, die die Indentifizierung einer erfolgreichen Mutagenese auf der Basis der Spaltung des DNA Produkts durch AflII erlauben.
Die Mutagenese wird mittels der Gapped-Plasmidmethode ausgeführt. Ein Ansatz an PGC3 ("UPGC3"), der anstelle von Thymidin in Uridin angereichert ist, wird durch die Anzucht des E. coli Stamms CJ236 in Gegenwart von 0,25 μg/ml Uridin hergestellt. Das Plasmid wird mit SmaI verdaut und das 7,2 kb Produkt ("US1") wird durch ein Agarosegel gereinigt, um ein 0,5 kb Fragment aus der C3 Sequenz zu entfernen (Reste 1463–1947). Die andere Komponente des Plasmids mit Lücke ("DN2") wird durch den Verdau von PGC3 mit DraIII plus NaeI und der Reinigung des 5,1 kb Stücks zweimal durch Agarosegelelektrophorese hergestellt. 200 ng DN2 werden mit etwa 500 ng US1 in 50 μl H₂O gemischt, auf 100°C erhitzt und langsam unter 50°C abgekühlt, bevor 20 μl bis 25 μl 2XT7 Puffer (100 mM Tris/ HCl/pH 7,4/14 mM MgCl₂, 100 mM NaCl, 2 mM Dithiothreit und jeweils 1 mM an ATP, dATP, dCTP, dTTP und dGTP) plus 10 nmol jedes 5'-phosphorylierten mutagenen Primers (eine Reaktion verwendet QRI1, QRI2 plus AFL4149, die andere Reaktion verwendet QRI1n, QRI2n plus AFL4149n) zugegeben werden. Die Gemische werden erneut für 5 Minuten auf 70°C erhitzt und langsam (über 30–60 Minuten) auf 20°C abgekühlt. Bei 0°C werden 10 Einheiten an T7 DNA Polymerase plus 80 Einheiten T4 DNA Ligase zugegeben. Das Gemisch (Gesamtvolumen 50 μl) wird zuerst bei 0°C für 5 Minuten und dann bei Raumtemperatur für 5 Minuten und schließlich bei 37°C für 3 Stunden inkubiert. 1 μl jedes Gemisches wird zur Transformation von 100 μl superkompetenten E. coli XL1 (Stratagene) gemäß den Anleitungen des Herstellers verwendet.
Ampicillin-resistente Kolonien werden durch die AflII Spaltung gescreent und erfolgreiche Mutanten werden in 100 ml Kulturen angezogen, aus denen Plasmide isoliert und sequenziert werden (mittels eines Sequenzierprimers C3pa-3876, CTTCATGGTG TTCCAAGCCT, der mit den Nukleotiden 3876–3895 der C3 cDNA übereinstimmt), um die Mutationen an den Spaltstellen für Faktor I zu charakterisieren.
Für ein alternatives Protokoll für die "gapped Plasmidmutagenese" siehe Literaturstellen [26, 27].
b) Transfer der mutierten DNA in einen eukaryontischen Expressionsvektor
Die für C3 kodierenden Fragmente aus mutierten Plasmiden werden durch zweifachen Verdau mit HindIII und NaeI ausgeschnitten. DraI wird auch einbezogen, um das restliche Plasmid unschädlich zu machen. Die für C3 kodierende Sequenz wird durch ein Agarosegel gereinigt und in den pcDNA3 Vektor (Invitrogen) ligiert, der mit HindIII und EcoRV Enzymen linearisiert und mit Phosphorylase aus dem Kälberdarm dephosphoryliert wurde. Die Ligationsgemische werden zur Transformation von superkompetenten E. coli XL1 verwendet, die dann auf Kulturplatten plattiert werden, die Ampicillin enthalten.
Eine zufällige Auswahl (drei oder vier) Ampicillin-resistente Kolonien werden in 2–3 ml Kulturen angezogen und es wird eine Isolierung der Plasmid DNA im kleinen Maßstab ausgeführt. Die Plasmide, die das korrekte Insert enthalten, werden durch den Verdau der Plasmid DNA mit den Restriktionsendonukleasen EcoRI, HindIII und AflII identifiziert. Die entsprechenden Kolonien werden in 100 ml Kulturen angezogen und die Plasmide werden durch das Standardverfahren gereinigt. Diese Mutanten werden ursprünglich aus PGC3 konstruiert und behalten so die zwei ATG's 5' zur kodierenden Region. Diese Region (plus der 3 kb 5' der für C3 kodierenden Sequenz) werden daher mit HindIII plus EcoRI ausgeschnitten und durch eine Ligation desselben Segments ersetzt, das aus PC3 ausgeschnitten wurde. Diese rekonstruierten Vektoren werden durch das Standardverfahren hergestellt und für die Transfektion von COS Zellen verwendet.
c) Expression des Wildtyps und der mutierten C3
Mutierte und Wildtyp C3 werden transient von Plasmiden exprimiert, die in COS-1 Zellen mittels Lipofectamin^® (GIBCO) gemäß den Anleitungen des Herstellers transfiziert wurden. Typischerweise werden 1–1,5 × 10⁵ Zellen pro Vertiefung einer Standardkulturplatte mit 6 Vertiefungen mit 2–4 μg Plasmid mittels 9 μl Lipofectaminreagenz transfiziert. Die Überstände werden auf C3 Sekretion getestet und man erhält typische Ausbeuten von 0,3–1,7 μg pro ml Überstand 3–6 Tage nach der Transfektion.
Ergebnisse
a) Erzeugung von Mutanten
Die folgenden Mutanten, die gemäß den mutagenen Oligonukleotidsequenzen benannt werden, die eingebaut wurden, werden isoliert:

(i) 3 Mutanten mit sowohl QRI1 und QRI2 Mutationen plus AFL4149: C3M-26, C3M-58 und C3M-61,
(ii) 1 Mutante mit QRI1 und QRI2, aber ohne AFL4149: C3M-8 und
(iii) 1 Mutante mit QRI2 und AFL4149, aber ohne QRI1: C3M-51 (verwendet in Beispiel 3).

b) Validierung, dass funktionelle Effekte auf die Mutationen beruhen, die spezifisch an den Spaltstellen für Faktor I eingeführt wurden
Die Sequenzierung hat die Abwesenheit von anderen Veränderungen in 178–350 Basen um die mutierte Region jeder Mutante bestätigt. Die Sequenz einer Mutante, die durch dieses Verfahren hergestellt wurde, nämlich C3M-51 (siehe Beispiel 3) wurde über die gesamte "Lücke" (Basen 2463–5067), die in der Mutagenese verwendet wurde, untersucht und es wurden keine weiteren Abweichung von der Wildtypsequenz gefunden.
Darüberhinaus zeigt eine repräsentative Sequenzierung von insgesamt 2922 Basen aus allen Mutanten keine Einzelmutationen, die durch Polymerase-bedingte Fehler verursacht werden können. Die exprimierten Mutanten zeigen alle die zweikettige Struktur und die Spaltung durch die C3 Konvertase ist eine Charakteristik für natives C3. Zusammengefasst dürften die Mutanten wahrscheinlich keine unerwünschten Veränderungen enthalten, obwohl sie nicht vollständig erneut sequenziert wurden.
Beispiel 2: Herstellung von C3, das den Argininrest an einer Faktor I Spaltstelle (Aminosäureposition 1303) in einen Glutaminrest umgewandelt aufweist
Es wird das Verfahren von Beispiel 1 befolgt, außer dass nur die mutagenen Oligonukleotide AFL4149 plus QRI1 oder AFL4149 plus QRIn (das heißt nicht QRI2 oder QRI2n) bei der Mutagenese verwendet werden.
Ergebnisse
a) Erhaltene Mutanten
2 Mutanten mit QRI1 und AFL4149, aber ohne QRI2, werden isoliert: C3M-I23,27. Die Mutante C3M-I23 wird exprimiert, wie dies in Beispiel 1 beschrieben ist.
Dieses Protein ist durch CVFBb spaltbar. Das C3b-ähnliche Produkt ist relativ (im Vergleich zu dem Wildtyp) gegenüber der Spaltung an der Position 1303 durch die Faktoren I und H resistent, kann aber noch an der Position 1320 gespalten werden. Dieses C3b Derivat ist daher partiell gegenüber Faktor I resistent.
Beispiel 3: Herstellung von C3, das den Argininrest an einer Faktor I Spaltstelle (Aminosäureposition 1320) in einen Glutaminrest umgewandelt aufweist
Das Verfahren von Beispiel 1 wird befolgt, außer dass nur die mutagenen Oligonukleotide AFL4149 plus QRI2 oder AFL4149n plus QRI2n (das heißt nicht QRI1 oder QRI1n) bei der Mutagenese verwendet werden können. Zusätzlich ergibt das in Beispiel 1 verwendete Verfahren auch eine Mutante mit QR2 und AFL4149, aber ohne QRI1.
Ergebnisse
a) Erhaltene Mutanten
Es werden 3 Mutanten mit QRI2 und AFL4149, aber ohne QRI1 isoliert: C3M-51, C3M-Q2 und C3M-Q13. Die Mutante C3M-51 wird exprimiert, wie dies in Beispiel 1 beschrieben ist. Dieses Protein ist durch CVFBb spaltbar. Das C3b-ähnliche Produkt wird nicht leicht durch die Faktoren I und H an der Position 1320 gespalten, aber es kann immer noch an der Position 1303 gespalten werden. Dieses C3b Derivat ist daher partiell gegenüber Faktor I resistent.
Beispiel 4: Analyse der funktionellen Effekte der Mutationen
Überstände (100–400 μl) aus transfizierten COS Zellen werden bei 37°C für 2 Stunden inkubiert mit:
COS Zellen werden mit pcDNA3 transfiziert, die folgende Inserts aufweisen:

1) Die nicht mutierte C3 Sequenz,
2) Die Mutante C3M-I23 (kodiert Arg¹³⁰³ → Gln),
3) Die Mutante C3M-26 (kodiert Arg1303 → Gln, Arg¹³²⁰ → Gln), und
4) Die Mutante C3M-51 (kodiert Arg1320 → Gln).

200 μl der Kulturüberstände, die 3 tage nach der Transfektion entnommen werden, werden mit 2 mM Phenylmethansulfonylfluorid (0°C, 15 Minuten) vorbehandelt und dann bei 37°C für 2 Stunden mit folgendem inkubiert:

A) Keine Zugabe,
B) Vorgeformte C3 Konvertase, CVFBb (10 μl aus 200 μl, worin 6,6 μg CVF, 100 μg Faktor B und 1,4 μg Faktor D in Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS) enthalten sind, worin 10 mM MgCl₂ enthalten sind, vorinkubiert für 15 Minuten bei 37°C),
C) Faktoren H (5 μg) und I (1 μg) und
D) CVFBb plus die Faktoren H und I.

Diese werden dann durch die Zugabe von 0,6 μg an affinitätsgereinigtem Schaf-anti-Mensch C3 Immunglobulin bei Raumtemperatur gefällt und nach 1 Stunde werden 20 μl einer 5% Suspension an gewaschenen mit Formalin fixierten Gruppe C Streptococcus sp. Zellen (Protein G) (Sigma) zugegeben. Nach 45 Minuten bei Raumtemperatur werden die Partikel einmal in PBS/5 mM NaN₃ und einmal in 20 mM Tris/HCl, 137 mM NaCl, 0,1% (V/V) Tween 20 pH 7,6 gewaschen, bevor sie in 1% SDS/2% 2-Mercaptoethanol (90–100°C, 5 Minuten) eluiert werden. Diese Eluate werden durch SDS-PAGE getrennt, durch Elektroblot auf Nitrocellulose überführt und die C3 Banden werden durch Sondierung mit einem affinitätsgereinigtem Schaf-anti-Mensch C3 Immunglobulin, gefolgt von einem an Meerrettichperoxidasegekuppelten Esel-anti-Schaf Immunglobulin (Sigma) und einer Detektion unter Verwendung der "Enhanced Chemoluminescence" Substrate, die von Amersham bezogen werden, detektiert. Eine Photographie einer 2 Minuten dauernden Exposition gegenüber einem Röntgenfilm ist gezeigt. Die sichtbaren von C3 stammenden Banden werden durch markierte Pfeile angezeigt und die einzelnen Proben (1–4, A–D) sind die eben beschriebenen. (Die hervorstechende Bande mit etwa 50 kDa (zwischen den 46 kDa und 68 kDa Banden), die in allen Proben vorkommt, ist die schwere Kette des IgG, das zur Immunpräzipitation und Detektion durch das mit Meerettichperoxidase gekuppelte Esel-anti-Schaf Immunglobulin verwendet wurde).
Ergebnisse (siehe 3)

1. Alle unbehandelten Proben (1-A, 2-A, 3-A, 4-A) enthalten Banden der korrekten Migration für die α- und β-Ketten von C3, was zeigt, dass alle Mutanten exprimiert werden und posttranslational korrekt prozessiert werden. Das Vorkommen der 43 und 46 kDa Banden in diesen Proben zeigt das Vorkommen einer Faktor H und Faktor I ähnlichen Aktivität im Kulturmedium. Eine spontane Hydrolyse von C3 während der 3 Tage dauernden Biosyntheseperiode bildet C3i, das durch diese Aktivität gespalten wird. Im nicht mutierten C3 erzeugt sie die Banden mit 43 und 75 kDa (die 75 kDa Bande ist nicht sichtbar, da sie (i) von der 75 kDa β-Kette verdeckt wird und der zur Entwicklung des Western Blots verwendete Antikörper eine sehr geringe Aktivität gegenüber diesem Teil der C3 β-Kette aufweist. Die Anwesenheit wird anschließend durch erneute Sondierung mit einem monoklonalen Rattenantikörper "Clone 3" bestätigt, der für diese Region spezifisch ist). Die Zugabe der Faktoren H und Ι ohne CVFBb (1-C, 2-C, 3-C, 4-C) spaltet nicht das verbleibende C3, was zeigt, dass diese aktives C3 repräsentiert (intakter Thiolester).
2. Das nicht mutierte C3 (1) wird durch CVFBb gespalten und das C3b Produkt wird weiter durch endogene Enzyme in 1-B oder durch die zugegebenen Faktoren H und I in 1-D gespalten. Die 43 kDa Bande zeigt die Spaltung an Arg¹³²⁰ an und die 68 kDa Bande (sichtbar bei längeren Expositionszeiten) zeigt eine Spaltung bei Arg1303 an.
3. Die Mutante C3M-I23 (Arg¹³⁰³ → Gln) ist durch CVFBb spaltbar und das Produkt ist relativ resistent gegenüber der Aktivität der endogenen Faktor H und I ähnlichen Aktivität (2-B) mit distinkten Mengen an persistierender α'-Kette (C3b), die aber noch spaltbar sind, wenn zusätzlicher Faktor H und I zugegeben werden (2-D). Das 43 kDa Produkt zeigt die Spaltung bei Arg¹³²⁰ an (eine schwache Bande bei 71 kDa, die das andere Fragment der α'-Kette darstellt, kann bei längerer Expositionszeit gesehen werden), aber es ist keine 68 kDa Bande vorhanden, die zeigt, dass diese Mutante gegenüber der Spaltung am mutierten Gln¹³⁰³ resistent ist.
4. Die Mutante C3M-26 (Arg¹³⁰³ → Gln, Arg¹³²⁰ → Gln) ist durch CVFBb spaltbar und das C3b ähnliche Produkt (α') ist gegenüber der endogenen Faktor Η und Ι ähnlichen Aktivität resistent (3-B). Sie ist ebenfalls sehr resistent gegenüber den zusätzlichen Faktoren Η und Ι (3-D) im Vergleich mit dem unmutierten C3 (1) und anderen Mutanten (2 und 4). Es gibt eine kleine Menge an 46 kDa Produkt, was eine geringe Spaltung am mutierten Gln¹³⁰³ zeigt (das begleitende 68 kDa Fragment ist ebenfalls bei längeren Expositionszeiten sichtbar). Es kommt nur wenig oder keine detektierbare 43 kDa Bande vor, die einer Spaltung bei Gln¹³²⁰ entsprechen würde. Daher ist die Arg → Gln Mutation an der Position 1303 bei der Prävention der Spaltung durch Faktor Ι weniger wirksam, als die an der Position 1320. (Die langsame verbleibende Spaltung kann auch in der Mutante C3M-I23 (Arg¹³⁰³ → Gln) auftreten, aber das 46 kDa Zwischenprodukt wird vermutlich schnell zum 43 kDa Produkt durch weitere Spaltung am nicht mutierten Arg¹³²⁰ prozessiert.)
5. Die Mutante C3M-51 (Arg¹³²⁰ → Gln) ist durch CVFBb spaltbar und das Produkt wird durch die endogene Faktor Η und Ι ähnliche Aktivität (4-B) und durch zusätzlichen Faktor Η und Ι (4-D) gespalten. Das 46 kDa Produkt (und die schwache 68 kDa Bande) zeigen eine Spaltung bei Arg¹³⁰³ an. Jedoch zeigt das Fehlen einer 43 kDa Bande an, dass es nicht am mutierten Gln¹³²⁰ gespalten wird.

Beispiel 5: Vergleich von verschiedenen Aminosäuresubstitutionen an Position 1303
1. Einführung
Die vorhergehenden Beispiele beschreiben Mutationen von Arg 1303 und Arg 1320 zu Glutaminresten. Beide Mutationen verleihen eine Resistenz gegenüber einer Spaltung an diesen Positionen durch den Faktor Ι. Jedoch besteht ein geringes aber detektierbares Maß an Spaltung an Gln 1303. Daher wurden mehrere andere Aminosäuresubstitutionen an dieser Position vorgenommen und getestet. Die Spaltung tritt in abnehmender Wirksamkeit auf, wenn der Rest 1303 folgender ist: Arg > Tyr > [Cys oder Trp] > Gln > [Glu oder Gly]. Diese Ergebnisse sind unerwartet, da (i) alle bekannten natürlich vorkommenden durch den humanen Faktor Ι vermittelten Spaltungen C-terminal zu Argininresten auftreten, so dass es abgeleitet wurde, dass das Enzym Arginin braucht und (ii) falls es nicht an anderen Resten schneidet, würde man vorhersagen, dass sie elektrostatisch ähnlich zu Arg sind, das heißt einen basischen Rest (Lys oder His) (beispielsweise spaltet Trypsin selektiv C-terminal zu Arg, Lys oder His), so dass man keine Spaltung der Tyrosinsubstitution vorhersagen würde.
Daher ist die Substitution von Arg 1303 mit Glycin oder Glutaminsäure für die Erzeugung eines C3 Derivats bevorzugt, das gegenüber der Inaktivierung durch den Faktor I resistent ist.
2. Verfahren
2.1 Mutagenese: Der verwendete degenerierte mutagene Primer ist:
CAACTGCCCAGC(GT)(AG)(CG)AGCTCCAAGATCACC (Die Buchstaben in Klammen zeigen ein Gemisch der Basen an der Position an). Die Mutanten werden entweder durch das Gapped-Plasmidverfahren (wie dies in den früheren Beispielen beschrieben ist) oder durch das "Megaprimerverfahren" (V. Picard et al., Nuc. Acid Res. 22: 2587–91 (1994)), worin der stromaufwärts liegende Primer CACCAGGAAC TGAATCTAGA TGTGTCCCTC ist und der stromabwärts liegende Primer GTTTTATGGT GACCTTAAGG TCGAATTTAT TA ist. Alle Mutationen werden auf Matrizen ausgeführt, worin die für C3 kodierende DNA bereits so mutiert wurde, dass der Aminosäurerest 1320 Glutamin ist und eine Restriktionsstelle für AflII an der Position 4149 eingeführt wurde (wie dies früher in den Beispielen beschrieben ist) und dies wird durch DNA Sequenzierung bestätigt.
2.2 Expression: Die Mutanten werden in COS Zellen mittels des pcDNA3 Vektors exprimiert, wie dies in den vorhergehenden Beispielen beschrieben ist, und biosynthetisch mit [³⁵S] Methionin in serumfreiem Medium markiert.
2.3 Test: Die Überstände werden mit CVFBb (gebildet durch die Umsetzung von CVF mit den Faktoren B und D in Magnesium-enthaltendem Puffer) und den Faktoren H und I behandelt, wonach eine Immunfällung mit anti-C3 und eine Abtrennung durch SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese erfolgt, die unter reduzierenden Bedingungen ausgeführt wird (wie dies in den vorhergehenden Beispielen beschrieben ist). Das Gel wird fixiert, mit Amersham "Amplify" Reagenz behandelt, getrocknet und gegenüber einem Autoradiographiefilm exponiert, um das in der Figur gezeigte Ergebnis zu erhalten.
3. Ergebnisse
Die Faktor I vermittelte Spaltung an der Position 1303 (Stelle 1) ohne Spaltung an 1320 (Stelle 2) (wo dies zu Glutamin mutiert wurde), bildet die Banden mit 46 und 68 kDa. Man kann erkennen, dass die Spaltung in der folgenden Reihenfolge auftritt: Arg(R) > Tyr(Y) > Cys(C) und Trp(W) > Gln(Q) > Gly(G) und Glu(E). Der Wildtyp (Arginin an beiden Positionen) wird an beiden Positionen unter Bildung von Fragmenten mit 43 (zu klein, um auf diesem Gel sichtbar zu sein) und 68 kDa gespalten.
4. Figur
Die Ergebnisse sind in 4 gezeigt. Die Reste an der Stelle 1 (Position 1303) und der Stelle 2 (1320) sind oben in den jeweiligen Spuren angegeben.
Beispiel 6: Demonstration der erhöhten Resistenz gegenüber der Inaktivierung durch die Faktoren I und H nach einer Mutation von Arg 1303 zu Gln
1. Einführung
Die vorhergehenden Beispiele zeigen, dass die Umwandlung von entweder Arg 1303 oder Arg 1320 zu Glutamin die Stelle gegenüber einer Spaltung durch den Faktor I resistent macht. Die Mutation von beiden Stellen erzeugt ein Molekül, das gegenüber einer Spaltung an einer dieser Stellen resistent ist. Hier wird gezeigt, dass die Mutation von Arg1303 zu Gln alleine (ohne der Veränderung zu Arg 1320) zu einer beträchtlichen Resistenz gegenüber einer funktionellen Inaktivierung durch die Faktoren I und H im Vergleich zum Wildtyp führt.
2. Verfahren
2.1 Expression: Die Herstellung der Arg 1303 → Gln Mutation wird in einem früheren Beispiel beschrieben. Diese Mutation wird in CHO (einer herkömmlichen Laborzelllinie, die von Ovarzellen vom Chinesischen Hamster stammt) durch das Calciumphosphatverfahren transfiziert und stabile Transfektanden werden auf der Basis der Resistenz gegenüber G418 ("Geneticin", verfügbar von Sigma) selektiert. Die Zellkulturüberstände werden gewonnen und das exprimierte C3 wird partiell durch Natriumsulphatfällung (10–20% (G/V) Fraktion) und Ionenaustauschchromatographie auf Q-Sepharose und Mono-Q Sepharose gereinigt (A. W. Dodds, Methods Enzymol 223: 46 (1993)).
2.2 Test: Es werden Schaferythrocyten mit monoklonalem SO16 Antikörper (R. A. Harrison und P. J. Lachmann, Handbook of Experimental Immunology, 4. Ausgabe, Kapitel 39 (1986)) beschichtet und 4,4 ml einer 5% (V/V) Suspension werden dann mit etwa 10 μg C2, 24 μg C4 und 1 μg C1 (gereinigte Humankomponenten) für 10 Minuten bei 37°C in CFD inkubiert (R. A. Harrison und P. J. Lachman, siehe obige Literaturstelle). 0,8 ml dieses Gemisches werden dann für 105 Minuten mit 0,25 ml inkubiert, worin das halbgereinigte Mutanten- oder Wildtyp-C3 und EDTA in einer Endkonzentration von 12,5 mM enthalten sind. Die Zellen werden dann in CFD gewaschen und in CFD verwendet, worin 0,1% (G/V) Gelatine enthalten sind (CFD-Gel). Die radioaktive Bindung mit [¹²⁵I]-markierten Klon 4 monoklonalen anti-C3 Antikörper wird verwendet, um zu bestätigen, dass ähnliche Mengen an Wildtyp oder Mutanten-C3 abgelagert wurden.
Für den Test werden 40 μl einer 5% Suspension an Zellen in 250 μl CFD-Gel verdünnt und 50 μl Aliquots werden mit 50 μl CFD-Gel bei 37°C für 30 Minuten inkubiert, worin Verdünnungen der Faktoren I und H auf Endkonzentrationen von jeweils 100, 10, 1 und 0 μg/ml enthalten sind. 0,9 ml an CFD werden dann zugegeben und die Zellen werden durch Zentrifugation pelettiert und weitere zweimal jeweils mit 1 ml CFD gewaschen. Die Zellen werden dann in 100 μl CFD-Gel resuspendiert, worin 100 μg/ml Faktor B, 100 μg/ml Properdin, 1 μg/ml Faktor D und 0,3 mM NiCl₂ enthalten sind. Nach 10 Minuten bei 37°C werden 0,9 ml an CFD zugegeben, worin 10 mM EDTA und 2% (V/V) normales Meerschweinchenserum enthalten sind. Nach weiteren 30 Minuten bei 37°C werden die nicht lysierten Zellen durch Zentrifugation pelletiert und das Maß der Lyse wird durch Messen der Absorption des Überstands bei 412 nm bestimmt. Die Absorption, die 100% Lyse entspricht, wird aus einem Aliquot an Zellen bestimmt, die in Wasser lysiert wurden und so wird der Prozentsatz der Lyse berechnet.
Der Test misst die Fähigkeit von abgelagertem C3b zur Bildung einer funktionellen C3bBbP Konvertase. Die Umwandlung zu iC3b verhindert die Konvertasebildung und die anschließende Lyse in Serum/EDTA.
3. Ergebnisse
Die in der Figur gezeigten Ergenbnisse deuten an, dass mehr als zehnmal so viel Faktor I und Faktor H erforderlich sind, um die hämolytische Aktivität der Arg 1303 → Gln Mutante im Vergleich zum Wildtyp zu beseitigen. Diese Mutation ist daher zur Bildung eines C3 Derivats vorteilhaft, dessen C3b Produkt gegenüber einer Inaktivierung durch die Faktoren H und I resistent ist. Die Wirkung könnte entweder auf der größeren Resistenz gegenüber der Spaltung an der Position 1303 (wenn Arg zu Gln mutiert ist) oder einer größeren Resistenz gegenüber der Spaltung an der Position 1320 beruhen, wenn die Spaltung zuerst an der Position 1303 stattfinden kann.
4. Figur
Die Ergebnisse sind in 5 gezeigt. Die X-Achse gibt die Konzentration der Faktoren H und I an. Q1 repräsentiert die Arg 1303 → Gln Mutation. Die prozentuale Lyse wird gemessen, wie dies in den Verfahren beschrieben ist.
Diskussion
Die wesentlichen Merkmale von humanem C3 in Bezug auf die hierin beschriebenen modifizierten Varianten sind folgende:

(i) Das Molekül ist dadurch ein funktionell C3b-ähnliches Derivat, dass es mit funktionell aktivem humanem Faktor B kombinieren kann, der dann durch den humanen Faktor D unter Bildung eines Enzyms gespalten werden kann, das zur Spaltung von humanem C3 fähig ist.
(ii) Die Aminosäuresequenzen der Derivate sind homologer zu C3 von Menschen als zu C3 von anderen Spezies, für die derzeit eine Sequenz bekannt ist oder zu jeder anderen derzeit bekannten Proteinsequenz. Strukturelle Merkmale von C3, die in Wildtypprotein vorkommen, aber nicht notwendigerweise in modifizierten Derivaten, umfassen die folgenden:
(a) Die kodierende DNA Sequenz und die translatierte Proteinsequenz für die Variante des humanen C3, das in den erfindungsgemäßen Beispielen verwendet wird, sind jeweils in den 2 und 1 beschrieben. Diese Proteinsequenz unterscheidet sich von der veröffentlichten Sequenz [2] an genau zwei Aminosäuren (Details sind in den Beispielen angegeben). Es wird angenommen, dass viel mehr Variationen mit der C3 Funktion kompatibel sind, obwohl die meisten in der Population nicht vorkommen.
(b) Das primäre Translationsprodukt wird proteolytisch in zwei durch Disulfid verbundene Ketten gespalten, nämlich α (Reste 672–1663) und β (Reste 23–667), wobei die Signalsequenz entfernt wird (Reste 1–22).
(c) Das reife Protein enthält eine Thiolesterbindung zwischen den Resten Cys1010 und Gln1013.
(d) Die C3 Konvertase spaltet C3 unter Entfernung von C3a ab (Reste 672–748). Auf diese Reaktion folgt eine Spaltung der Thiolesterbindung.
(e) In Gegenwart von Faktor H spaltet Faktor I C3b zwischen den Resten Arg 1303 und Ser 1303 und zwischen Arg 1320 und Ser 1321.

Modifikationen, die im nativen C3 Molekül ausgeführt werden
Ersatz von Arg 1303 durch Gln
Diese Modifikation erfolgt an einer Stelle durch die Spaltung von C3b durch den Faktor I. Die Wirkung ist die Verringerung der Geschwindigkeit der Spaltung durch den Faktor I an dieser Position. Die Veränderung zu Glutamin wird ausgewählt, um die positive Ladung des Arginins wegzunehmen, die wahrscheinlich für die Serinproteaseaktivität des Faktors I wichtig ist, wobei ein hydrophiler Charakter und eine ähnliche Größe der Seitenkette erhalten bleiben, die Zerstörungen der tertiären Proteinstruktur minimieren sollten. Eine Tatsache, die diese Annahme unterstützt ist, dass die Mutation die Prozessierung in eine zweikettige Struktur, die Bildung eines Thiolesters oder die Spaltung von C3 durch C3 Kon vertase nicht verhindert. Die Mutation von Arg 1303 zu einer anderen Aminosäure kann einen ähnlichen oder sogar besseren Effekt erreichen, wie dies in Beispiel 5 gezeigt wird.
Es kann auch möglich sein, die Spaltung durch die Mutation von Ser 1304 (die andere Seite der Spaltstelle) oder anderen Resten zu verringern, die in der Enzym-Substrat-Wechselwirkung beteiligt sind.
Austausch von Arg 1320 durch Gln
Diese Modifikation findet an der anderen Spaltstelle von C3b durch den Faktor I statt. Die Wirkung ist die drastische Verringerung (im wesentlichen Abschaffung) der Spaltungsgeschwindigkeit durch den Faktor I an dieser Position. Die Veränderung von Glutamin wird mittels derselben Kriterien ausgeführt, wie sie oben beschrieben sind und diese Mutation verhindert ebenfalls nicht die Prozessierung in eine zweikettige Struktur, die Bildung eines Thiolesters oder die Spaltung von C3 durch die C3 Konverta- se. Erneut kann eine Mutation zu einer anderen Aminosäure denselben Effekt bewirken, wie die Mutation von Ser 1321 oder einem anderen Rest, der in der Enzym-Substrat-Wechselwirkung beteiligt ist.
In der Kombination schützen die zwei Mutationen Arg 1303 → Gln und Arg 1320 → Gln C3b vor der Inaktivierung und erhalten so die Fähigkeit unter Bildung eines Teils einer aktiven C3bBb Konvertase. Andere Mutationen (einschließlich Kombinationen von Mutationen) die beide Spaltungsreaktionen aufheben, können ebenfalls verwendet werden (beispielsweise Arg 1303 → Glu oder Arg 1303 → Gly kann in Kombination mit Arg 1320 → Gln verwendet werden).
Beispiel 7: Verschiedene Mutationen, die die Interaktion von C3b/C3i mit Faktor H verringern
7.1 Einführung
Andere Laboratorien haben entweder auf der Basis von synthetischen Peptiden (V. S. Ganu und H. J. Muller-Eberhard, 1985, Complement 2: 27, J. D. Becherer et al., 1992, Biochemistry 31: 1787–1794) oder einer limitierten Mutagenese (A. Taniguchi-Sidle und D. E. Iserman, 1994, J. Immunol. 153: 5285–5302) Daten geschaffen, die nahelegen, dass die Reste 752–761 in der Primärsequenz des C3 Transkripts (siehe 1) bei der Wechselwirkung mit Faktor H beteiligt sein könnten. Jedoch legen andere publizierte Daten nahe, dass nur die Reste 767–776 bei der Wechselwirkung mit Faktor H beteiligt sind, während die Reste 752–761 für die Wechselwirkung mit Faktor B wichtig sind (Fishelsin, 1991, Mol. Immunol. 28: 545–552). Es wird vermutet, dass eine ausgiebigere Mutagenese dieser Region die Affinität für den Faktor H reduzieren könnte und daher für das Ziel der Bildung eines C3 Derivats erwünscht wäre, das gegen Faktor H resistent ist. Ferner wird vermutet, dass die wichtigen Reste, die mutiert werden müssen, die auffälligen sauren Reste (Asparagin- und Glutaminsäuren) sind und dass es erwünscht wäre, sie in neutrale Reste zu verwandeln, die weniger wahrscheinlich starke Wechselwirkungen vermitteln. In diesem Beispiel werden die Reste 752–754 von Asp-Glu-Asp zu Gly-Ser-Gly in Kombination mit den Veränderungen der Reste 758–760 von Glu-Glu-Asn zu Gly-Ser-Gly verändert. Das Produkt zeigt verringerte Spaltungseigenschaften, die mit einer Reduktion der Empfindlichkeit gegenüber dem Faktor H übereinstimmen. Dies liefert den Beweis, dass C3 modifiziert werden kann, um die Bindung des Faktors H zu verringern und so die Empfindlichkeit gegenüber den Faktoren H und I. Diese Modifikationen sind zur Bildung einer C3 Konvertase erwünscht, die unter physiologischen Bedingungen stabil ist.
7.2 Verfahren
Die Verfahren der Mutagenese, Expression und Analyse wurden in den vorhergehenden Beispielen beschrieben. Das mutagene Oligonukleotid, das synthetisiert wird, hat die Sequenz AGTAACCTGG GTTCGGGCAT CATTGCAGGA TCGGGCATCG TTTCC.
7.3 Ergebnisse
Die Ergebnisse der Spaltungsreaktionen sind in 6 gezeigt. Dies zeigt, dass:

1. Die Zugabe von CVFBb zu Wildtyp C3 zur Eliminierung der α-Kette (Spur 2) führt, da das gebildete C3b gegenüber geringen Konzentrationen an Faktor Ι und H im Kulturüberstand empfindlich ist. C3i, das während der Expression oder der anschließenden Inkubation gebildet wurde, wird auf dieselbe Weise zu iC3i abgebaut. Der Zusatz der endogenen Faktoren Ι und H (Spuren 3 und 4) unterscheidet sich daher nicht von den Spuren 1 und 2, da das Medium selbst jeweils ausreichend Faktor Η und Ι Aktivität enthält, um eine vollständige Spaltung zu erreichen.
2. Im Gegensatz dazu führt die Behandlung des mutierten C3 mit CVFBb (Spur 6) nicht zum Verschwinden der α-Kette. Es wird etwas α', das C3b entspricht, gebildet, aber es bleibt einiges oder alles hiervon bestehen, was zeigt, dass die Persistenz der α-Kette nicht einfach das Ergebnis eines Versagens bei der Spaltung durch CVFBb ist. Die verbleibende ungespaltene α-Kette in Spur 2 kann daher C3i repräsentieren, das nicht durch die endogenen Aktivitäten der Faktoren Η und Ι gespalten wurde, obwohl es auch möglich ist, dass einiges hiervon natives C3 repräsentiert, falls die Mutante eine partielle Resistenz gegenüber CVFBb erworben hat. Die Zugabe von hohen Konzentrationen an exogenen Faktoren H und I (Spur 7 und 8) verursacht keinen Abbau der α und α' Ketten, was zeigt, dass (i) die Mutante nicht vollkommen resistent gegenüber diesen Faktoren ist und (ii) die α-Kette, die in Spur 2 nicht durch CVFBb gespalten wird, vorwiegend von C3i (das durch die Faktoren H und I spaltbar ist aber nicht durch CVFBb) statt von nativem C3 stammt (das durch CVFBb spaltbar ist, aber nicht durch die Faktoren H und I). Sogar in Spur 8 wird nicht die gesamte α-Kette vermutlich wegen der Resistenz gegenüber den Faktoren H und I gespalten.

Daher kann die Mutation der Reste 752–754 und der Reste 758–760 ein C3 Molekül erzeugen, dass noch durch C3 Konvertasen gespalten werden kann, aber partiell gegenüber den Wirkungen der Faktoren H und I resistent ist. In Anbetracht der anderen veröffentlichten Daten kommt dies wahrscheinlich zustande, da die Mutationen eine Region modifiziert haben, die bei der Wechselwirkung mit Faktor H beteiligt ist und so zu einer verringerten Affinität für Faktor H geführt hat.
Beispiel 8: Eine Stelle von C3, die zur Modifizierung der Wechselwirkung von C3i mit Faktor B mutiert werden kann
8.1 Wechselwirkung
Die vorhergehenden Beispiele haben gezeigt, dass die Mutationen in C3 die Wechselwirkungen mit den Faktoren H und I modulieren können. Um andere Stellen in C3 zu finden, die mit dem Faktor B wechselwirken könnten, wurden die bekannten Sequenzen der C3 Moleküle von unterschiedlichen Spe zies, wie auch mit verfügbaren Sequenzen für C4 und anderen homologen Proteinen verglichen. Es wurde eine Region identifiziert, die den Resten 1427–1433 von humanem C3 entspricht, die bei spezifischen Funktionen von C3 und C4 beteiligt sein könnten. Dies könnte die Wechselwirkung mit Faktor B (oder dessen Homolog C2 im Fall von C4) sein, aber nicht notwendigerweise, da andere potentielle Funktionen die Thiolesterbildung, Umwandlung zu C3b (oder C4b), die Wechselwirkung mit dem Substrat C3 und/oder C5 bei der Konvertaseaktivität und die Wechselwirkung mit Faktor I und dessen Cofaktoren umfassen. Daher werden ausgewählte Reste zu den entsprechenden Resten (basierend auf Sequenzvergleichen) mutiert, die in anderen homologen Proteinen gefunden werden, in diesem Fall humanem C5. Daher wird der Rest 1427 von einem Arg zu einem Gln Rest, der Rest 1431 von Lys zu Asp und der Rest 1433 von Glu zu Gln verändert. Die entstehende Mutante ist gegenüber einer Spaltung durch C3 Konvertase (CVFBb) empfindlich und das C3b Produkt ist durch die Faktoren H und I spaltbar. Jedoch unterstützt diese Mutante die Umwandlung von Faktor B zu Bb plus Ba, die von der Bindung des Faktors B an C3i (oder C3b) abhängt. Daher ist der Beweis erbracht, dass die Mutation dieser Region die Wechselwirkung mit Faktor B verringert. Während dies für die Erzeugung einer superaktiven C3 Konvertase unerwünscht ist, liefert dies einen Hinweis, dass andere Modifikationen in dieser Region von C3 auch die Wechselwirkung mit dem Faktor B verändern und einige hiervon möglicherweise die Affinität erhöhen. Als Konsequenz können solche Mutationen auch die Stabilität und Aktivität des bimolekularen Konvertaseenzyms C3bBb (oder C3iBb) erhöhen.
8.2 Methoden
Die in Tabelle 1 gezeigten Vergleiche erläutern, warum angenommen wurde, dass diese Region ein Kandidat für eine Mutagenese ist. Es wurde angenommen, dass Eigenschaften von bestimmten Resten in C3 und C4 gut konserviert sind, aber in anderen Proteinen deutlich unterschiedlich sind. Die Reste 1427, 1431 und 1433 werden ausgewählt, da ihre geladene Natur Gruppen anzeigen könnte, die in Protein-Protein-Wechselwirkungen beteiligt sein könnten. Die Veränderungen werden gemäß den Resten in humanem C5 ausgeführt, da diese sehr unterschiedliche elektrostatische Eigenschaften zeigen, aber innerhalb des Zusammenhangs von einigen anderen konservierten Resten liegen, die eine ähnliche lokale Struktur anzeigen.
Die Verfahren der Mutagenese, Expression und Analyse der C3 Spaltungsreaktionen werden ausgeführt, wie dies in den vorhergehenden Beispielen (Beispiele 1–4) beschrieben ist. Das mutagene Oligonukleotid wird mit der folgenden Sequenz synthetisiert: TGGTGTTGAC CAATACATCT CCGAC-TATCA GCTGGACAA.
Test für den Umsatz von Faktor B
Das exprimierte Produkt wird aus dem Medium der COS Zellen durch Affinitätsreinigung auf einer Säule aus Clone-3-Sepharose gereinigt, wie dies in Beispiel 9 beschrieben ist. Dieses Verfahren führt zu einer beträchtlichen Umwandlung der gespaltenen Thiolesterform C3i. Das Wildtyp C3 wird durch dasselbe Verfahren isoliert, Verdünnungen des Wildtyp C3 (1/5, 1/25 und 1/125) werden auf einem SDS-PAGE Gel (reduzierende Bedingungen) zusammen mit dem mutierten C3 gefahren und eine Silberfärbung zeigt an, dass die Mutante in einer Konzentration vorkommt, die etwa weniger als 1/25 aber viel mehr als die 1/125 Verdünnung des Wildtyps beträgt. Es werden dieselben Verdünnungen im Test für den Umsatz des Faktors B verwendet. 5 μl dieser C3's werden mit 25 μl an CFD-G für 3 Stunden bei 37°C inkubiert, worin 5 μg/ml Faktor D und etwa 1,6 μg/ml an ¹²⁵I-markiertem Faktor B (etwa 1000–2000 Zerfälle pro Minute/μl) enthalten sind. Die Proben werden dann durch SDS-PAGE (reduzierende Bedingungen) mit einer Autoradiographie des getrockneten Gels analysiert. Die Ergebnisse sind in 7 gezeigt.
8.3 Ergebnisse
Wie in 7 gezeigt, tritt eine deutliche Spaltung von Faktor B sogar bei der 1/125 Verdünnung des Wildtyp C3 (C3i) auf. Im Gegensatz dazu wird keine signifikante Spaltung in Gegenwart des mutierten C3 sogar unverdünnt beobachtet, was eine höhere Konzentration als die 1/125 Probe des Wildtyps sein sollte.
Diese Mutante scheint daher eine gestörte Fähigkeit zur Unterstützung der Spaltung durch den Faktor B zu haben, am wahrscheinlichsten durch die Verringerung der Bindungsaffinität für den Faktor B. Daher ist dies eine Region von C3, die mutiert werden kann, um die Wechselwirkung zwischen C3i (oder C3b) und dem Faktor B und wahrscheinlich auch die Stabilität der Konvertase (C3iBb oder C3bBb) zu modulieren.
Beispiel 9: Reinigung der exprimierten mutierten C3 Moleküle
9.1 Einführung
Dieses Beispiel zeigt, wie die mutierten C3 Moleküle aus einem Expressionsmedium isoliert werden können, wie dem Kulturmedium der transfizierten eukaryontischen Zellen. Man erhält die C3 Moleküle durch eine einfache Affinitätsreinigung und einer ausreichenden Reinheit für funktionelle Tests und für die Konjugation an einen Antikörper durch das in Beispiel 10 beschriebene Verfahren. Obwohl die Elution von einem Antikörper von der Hydrolyse eines beträchtlichen Teils des internen Thiolesters begleitet wird, ist das C3i Produkt immer noch ein geeigneter Vorläufer für die Erzeugung einer aktiven C3 Konvertase, wie auch zur Herstellung von C3i-Antikörperkonjugaten. Dieser Ansatz dürfte auch als Teil der für die in vivo Verwendung erforderlichen Präparation brauchbar sein.
9.2 Methode
Affinitätsreinigung auf Clone-3-Sepharose
Clone-3 ist ein monoklonaler Rattenantikörper, der für C3 und dessen Derivate spezifisch ist, einschließlich C3b und C3i (P. J. Lachmann et al., 1980, J. Immunol. 41: 503–515). Andere monoklonale Antikörper gegen C3 sind verfügbar und wurden in einigen Fällen erfolgreich verwendet, um C3 aus kleinen Mengen an Humanplasma zu isolieren (A. W. Dodds, 1993, Methods Enzymol. 223: 46–61) und dürften daher auch zur Isolierung von Molekülen anwendbar sein, die ex vivo exprimiert werden. Die IgG Fraktion wird mittels Cyanogenbromid an Sepharose CL-4B gekuppelt (Methodik findet man in Harrison und Lachmann, 1986, Handbook of Experimental Immunology, 4. Ausgabe, Herausgeber Weir, Herzensberg, Blackwell und Herzensberg, Blackwell, Oxford). Die Kulturüberstände werden entweder direkt durch eine Säule dieses Harzes gegeben (rezirkuliert) oder zuerst durch Fällung mit 25% (G/V) N₂SO₄ und einer erneuten Auflösung und Dialyse in PBS mit 5 mM NaN₃ konzentriert. Die Säule wird dann nacheinander gewaschen mit (i) PBS, 5 mM NaN₃ und (ii) PBS, worin 1 M NaCl enthalten ist. Gebundenes C3 eluiert mit 50 mM Na-Boratpuffer mit pH 10,5 und wird sofort durch die Sammlung von 0,9 ml Fraktionen in 0,1 ml 1 M Tris/HCl und pH 7 neutralisiert. Das Material wird dann in PBS und 5 mM NaN₃ dialysiert.
Herstellung von C3, das einen "His-Tag" trägt
Ein "His-Tag" ist ein Stück an Histidinresten, das eine Affinität für Säulen zeigt, die Nickelionen tragen. Dieses Verfahren wurde verwendet, um bei der Isolierung von exprimierten Proteinen zu helfen. Es wurde angenommen, dass dies zur Isolierung des exprimierten mutierten C3 Molekülen brauchbar sein könnte und so wurde die Insertionsmutagenese verwendet, um ein Plasmid zu erzeugen, das C3 mit einem Schwanz von 6 Histidinresten am Carboxyterminus kodiert (unmittelbar carboxyterminal zum Rest 1663). Die Lage für den His-Tag wird so ausgewählt, um die Wechselwirkung mit der Synthese, der Faltung, der Prozessierung und der Disulfidbindungsbildung von naszentem C3 zu minimieren. Der Rest 1661 ist ein Cysteinrest, der bei einer Disulfidbindung zu einem Rest beteiligt ist, der früher in der Sequenz vorkommt (vermutlich Cys 1537, K. Dolmer und L. Sottrup-Jensen, 1993, FEBS-Lett 315: 85–90) und daher scheint es klug zu sein, die Insertion hinter diesem Strukturmerkmal zu machen. Die Mutation wird mittels der "gapped-Plasmidtechnik", die in Beispiel 1 verwendet wird, mittels des mutagenen Oligonukleotids eingeführt, das mit der folgenden Sequenz synthetisiert wird: TGGGTGCCCC AACCATCATC ATCATCATCA TTGACCACAC CCCC.
Der Einbau der korrekten Sequenz wird durch DNA Sequenzierung bestätigt. Diese DNA Sequenz kann dann in einen Expressionsvektor transferiert werden. Nach der Transfektion der eukaryontischen Zellen sollte es möglich sein, das exprimierte C3 durch Affinität für eine Nickelionen tragende Säule oder durch jede andere Matrix mit einer spezifischen Affinität für den "His-Tag" zu isolieren.
9.3 Ergebnisse
Es wurden viele mutierte C3 auf der Clone-3-Sepharose gereinigt, einschließlich derjenigen, die in den CHO Zellen exprimiert werden, die in den Beispielen 1 und 2 beschrieben wurden. Die Produkte behalten die Fähigkeit zur Unterstützung der Spaltung des Faktors B durch den Faktor D. Dasselbe Verfahren wird zur Isolierung der Mutante verwendet, die in Beispiel B2 beschrieben ist und in COS Zellen exprimiert wird. Eine Silberfärbung der SDS-PAGE Gele zeigt, dass die isolierten Produkte nicht zu 100% sauber sind, scheinen aber zu 50% oder mehr sauber zu sein. Dies resultiert aus den Ausgangsmaterialien, die im allgemeinen weniger als 10 μg/ml C3 in 10% (V/V) fetalem Kälberserum plus anderer zellulärer Proteine enthalten. Zusätzlich werden die C3's während der Isolierung nicht abgebaut und die endogene Aktivität der Faktoren H und I scheint entfernt worden zu sein.
Eine Reinigung mittels des "His-Tags" umfasst mildere Elutionsbedingungen von einer Säule, die Nickelionen trägt. Beispielsweise wird EDTA verwendet. Die Anwendung dieses Verfahrens auf C3 sollte daher die Isolierung ohne Zerstörung der internen Thiolesterbindung erlauben.
Beispiel 10: Konjugation von C3i an einen Antikörper und die Verwendung, die C3 Konvertaseaktivität gegen eine bestimmte Zelle zu richten
10.1 Einführung
Ein Aspekt der Erfindung ist, dass stabile C3 Konvertasen, die von mutierten C3 Molekülen stammen, eine erhöhte C3 Konversion verursachen, die, wenn sie an eine bestimmte Zielstelle lokalisiert wird, den Komplement-abhängigen Angriff dieses Ziels fördert. Der bevorzugte Ansatz zur Zielrichtung der Reaktion ist es, das mutierte C3 Molekül entweder als C3i oder C3b Derivat an einen Antikörper zu kuppeln, der für ein bestimmtes Ziel spezifisch ist. In diesem Beispiel wird eine Arbeitsvorschrift zur Bildung solcher Konjugate gegeben, die auf mutierte C3i oder C3b Moleküle anwendbar ist und auf Material angewendet werden kann, das aus einem Expressionssystem affinitätsgereinigt ist, sogar wenn der Thiolester von C3 im Verfahren zerstört wurde. Wenn man C3i an einen Antikörper bindet, der spezifisch an Schaferythrocyten bindet, wird gezeigt, dass das Konjugat C3i an die Erythrocytenoberfläche so fixiert, dass eine Konvertase, nämlich C3iBbP gebildet werden kann, die die Lyse dieser Zellen initiiert, wenn andere Komplementkomponenten in Form eines normalen Meerschweinchenserums bereitgestellt werden (in EDTA, um die de-novo Bildung von C3 Konvertasen zu verhindern). Daher kann die Konjugation an einen Antikörper verwendet werden, um ein C3i Molekül zum Ziel zu führen und einen Komplementabhängigen Angriff eines bestimmten Zelltyps auszulösen. Dieses Beispiel verwendet den Wildtyp C3i aus Humanplasma, das eine C3 Konvertase in vitro bildet. In vivo werden Wildtyp C3i und C3b durch die Faktoren H und I abgebaut. Daher wäre ein mutiertes C3, das gemäß den Anleitungen dieses Patents konstruiert wird, das gegenüber den Faktoren H und I resistent ist und daher eine stabile C3 Konvertase bildet, in einem physiologischen Zusammenhang vorteilhaft.
10.2 Methode
(i) Erzeugung und Reinigung eines C3i-Antikörperkonjugats
Der verwendete Antikörper ist die IgG Fraktion, die aus einem polyklonalen Kaninchen-anti-Schaf Erythrocytenantiserum isoliert wurde. 1,1 mg werden mit 75 nmol an SPDP in Konjugationspuffer bei pH 7,5 (20 mM KH₂PO₄, 60 mM Na₂HPO₄, 0,12 M NaCl) für 2 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Das PDP-IgG wird durch Gelfiltration auf einer Superose-6 Säule (Pharmacia) gereinigt (in einem Phosphatpuffer, pH 7,4, der 0,5 M NaCl enthält). Die Reduktion einer Probe mit Dithiothreit wird verwendet, um abzuschätzen, dass 4 PDP Gruppen pro IgG Molekül gekuppelt sind. C3i wird durch die Behandlung von gereinigtem C3 mit 0,1 M Methylamin bei pH 7,2 (2, Stunden bei 37°C) hergestellt. Es wird überschüssiges Methylamin durch Gelfiltration entfernt, wonach eine Dialyse in Konjugationspuffer erfolgt. 18 nmol an C3i werden mit 1,7 nmol an PDP-IgG in 1,26 ml Konjugationspuffer gemischt und für 1 Tag bei Raumtemperatur inkubiert, wonach 1,5 Tage bei 4°C folgen. Die 8 zeigt ein Coomassie Blue gefärbtes SDS-PAGE Gel des Konjugationsgemisches, das das Auftreten einer Spezies mit etwa 350 kDa zeigt, die weder in PDP-IgG noch C3i vorhanden war. Diese Spezies wird partiell durch Gelfiltration auf der Superose-6 Säule in einem Phosphatpuffer bei pH 7,4 gereinigt, der 0,5 M NaCl enthält, und dann in PBS dialysiert. Sie eluiert vor C3 in einem Volumen, von dem ein Molekulargewicht von 300–400 kDa durch die Kalibrierung mit globulären Molekulargewichtsstandards abgeschätzt werden kann. Die Konzentrationen des Konjugats, des freien Antikörpers und des ungekuppelten C3 werden aus einem mit Coomassie gefärbten SDS-PAGE Gel abgeschätzt (nicht-reduzierende Bedingungen). Eine zweidimensionale SDS-PAGE (erste Dimension nicht reduziert, zwei Dimension reduziert) ergibt ein Muster, das mit einem 1 : 1 Konjugat zwischen IgG und C3i übereinstimmt.
(ii) Demonstration, dass das C3 Antikörperkonjugat verwendet werden kann, um eine Konvertaseaktivität gegen eine bestimmte Zelle zu richten
20 μl Verdünnungen des Konjugats (0 (kein Konjugat), 1/100, 1/50, 1/10) werden mit 100 μl an etwa 1% (V/V) Schaferythrocyten (vorgewaschen in CFD) für 1 Stunde bei 37°C inkubiert. Paralelle Inkubationen werden mit äquivalenten Mengen an PDP-IgG (kein C3) und C3 alleine ausgeführt. Die Zellen werden dann viermal in CFD gewaschen und auf 100 μl in CFD-G resuspendiert. 50 μl hiervon werden mit 150 μl H₂O, gefolgt von der Zugabe von 800 μl CFD lysiert, worin 10 mM EDTA und 2% (V/V) NGPS enthalten sind. Die anderen 50 μl der Konjugat-beschichteten Zellen werden für 15 Minuten bei 37°C mit 50 μl an CFD-G inkubiert, worin 190 μg/ml Faktor B, 2 μg/ml Faktor D, 20 μg/ml Properdin und 0,6 mM NiCl₂ enthalten sind, wonach eine Lyse mit 900 μl CFD erfolgt, worin 10 mM EDTA und 2% (V/V) NGPS erfolgt. Nach 30 Minuten bei 37°C werden die Zellen durch Zentrifugation (200 × g, etwa 3 Minuten) pelletiert und die optische Absorption des Überstands wird bei 412 nm gemessen. Mittels der H₂O-behandelten Proben als 100% Lyse und eines Puffers, dem die Zellen fehlen, wird die prozentuale Lyse berechnet, wie sie in 9 gezeigt ist. Das Konjugat bildet eine Dosis-abhängige Lyse, während weder das PDP-IgG noch das C3i alleine eine Lyse hervorrufen, die signifikant über der liegt, die in Abwesenheit einer der Behandlungen beobachtet wird.
10.3 Zusammenfassung der Ergebnisse
Das verwendete Verfahren war bezüglich der Kupplung von C3i an IgG erfolgreich, wie dies gezeigt wird durch:

1. Bildung einer Bande mit einer ungefähren Größe (etwa 350 kDa) für ein 1 : 1 C3 : IgG Konjugat, wie dies durch SDS-PAGE in 8 gezeigt ist.
2. Zweidimensionale SDS-PAGE (erste Dimension nicht-reduzierend, zweite Dimension reduzierend) zeigt, dass diese Spezies sowohl IgG als auch C3i enthält.
3. Die Elutionscharakteristik dieser Spezies auf Gelfiltration stimmt erneut mit einem Molekül von etwa 350 kDa überein.
4. Das Konjugat zeigt eine hämolytische Aktivität, die weder von PDP-IgG noch von C3i gezeigt wird (9).

Der Hämolysetest (9) zeigt ferner, dass

1. Der spezifische anti-Schaferythrocytenantikörper das C3i zur Zielzellmembran (Schaferythrocyt) gebracht hat und es vor dem Wegwaschen bewahrt hat (im Gegensatz zu freiem C3i).
2. Das Konjugat behält die Aktivität des C3i dadurch, dass es immer noch zur Bildung einer C3 Konvertase durch die Umsetzung mit Properdin und den Faktoren B und D fähig ist.
3. Diese Konvertase kann den Komplement-abhängigen Angriff auf das Ziel auslösen, in diesem Fall durch die Aktivierung des lytischen Wegs (C5–9), um den Erythrocyten zu lysieren.

Zusätzliche Daten von anderen Laboratorien zeigen, dass der Cobragiftfaktor an einen Antikörper gekuppelt werden kann und dass diese Konjugate die Komplementaktivierung gegen einen bestimmten Zelltyp richten können (Vogel, 1988, Targeted. Diagn. Ther., 1: 191–224, B. Muller und W. Muller-Ruchholtz, 1987, Leuk. Res. 11: 461–468, C. J. Parker, V. F. White und R. J. Falk, 1986, Complement 3: 223–235, E. C. Petrella et al., 1987, J. Immunol. Methods 104: 159–172). Diese Daten unterstützen die Behauptung, dass C3, das so modifiziert wurde, dass es zur Bildung einer stabilen C3 Konvertase fähig ist, wie der Cobragiftfaktor, verwendet werden kann, um die Komplement-vermittelten Reaktionen auf ein Ziel zu richten, wie dies in der Erfindung beschrieben ist.
Beispiel 11: Demonstration, dass mutierte C3 Moleküle den Faktor B Umsatz in normalem Humanserum induzieren
11.1 Einführung
Ein Hauptzweck der hierin beschriebenen Erfindung ist der Verbrauch der Komplementaktivität aus biologischen Flüssigkeiten. Die Erfindung beschreibt Verfahren zur Herstellung von C3 Molekülen, die gegenüber der Herabregulierung durch die Faktoren H und I resistent sind. In diesem Zustand binden sie den Faktor B und erzeugen aktive C3 Konvertasen. Die Aktivität dieser Konvertasen wird durch den in Beispiel 6 verwendeten Test gezeigt. Eine solche Konvertase wird daher C3 verbrauchen. Falls die Konvertase instabil ist, wird sie ohne viel C3 Umsatz dissoziieren. Dies wird jedoch die Bindung von frischem Faktor B und dessen Umsatz zu Bb und Ba erlauben. Daher wird die Mutante C3 den Verbrauch fördern, was letztlich zur Untauglichkeit des alternativen Wegs und dessen Unfähigkeit zur Amplifizierung der Stimulierung des klassischen Wegs führt. Falls eine stabile C3 Konvertase gebildet wird, wird der Umsatz von Faktor B verringert, aber der Verbrauch von C3 wird erhöht. Beide Situationen können daher erwünscht sein. In diesem Beispiel wird gezeigt, dass mutierte C3 Moleküle, die modifiziert wurden, um sie gegenüber Faktor I resistent zu machen, aber ohne jede Modifizierung, um die Stabilität der Konvertase zu modifizieren, einen beschleunigten Umsatz von Faktor B in Humanserum fördern. Wildtyp C3 verursacht im Gegensatz dazu keinen signifikanten Umsatz, vermutlich nicht, da Wildtyp C3i schnell durch die Faktoren H und I abgebaut wird.
11.2 Verfahren
Die hergestellten Mutanten sind folgende:
Q1R2 Arg 1303 verändert zu Gln (Beispiel 2),
Q1Q2 Arg 1303 verändert zu Gln plus Arg 1320 verändert zu Gln (Beispiel 1),
E1Q2 Arg 1303 verändert zu Glu plus Arg 1320 verändert zu Gln (Beispiel 5).
Diese Mutanten werden alle in CHO Zellen exprimiert und dann durch Fällung mit Na₂SO₄, gefolgt von einer Affinitätsreinigung auf Clone-3-Sepharose gereinigt, wie dies in Beispiel B3 beschrieben ist. Wildytp C3 (R1R2) wird ähnlich isoliert. Gemäß SDS-PAGE mit Silberfärbung liegt die Konzentration von Q1 zwischen 1/5 und 1/25 der des Wildtyps und die Konzentration von Q1 Q2 beträgt etwa 1/5 der des Wildtyps und die Konzentration von E1Q2 beträgt zwischen 1/25 und 1/125 der des Wildtyps. Alle Präparationen enthalten vermutlich eine Mehrzahl an Molekülen (C3i) mit gespaltenem Thiolester.
10 μl dieser C3 Präparationen werden mit 10 μl einer Lösung aus 20% (V/V) normalem Humanserum in PBS, das 1 mM MgCl₂ und etwa 300 ng ¹²⁵I-markierten Faktor B (etwa 200 000 bis 300 000 Zerfälle pro Minute) enthält, für 1 Stunde bei 37°C inkubiert. 5 μl werden dann durch SDS-PAGE analysiert (reduzierende Bedingungen). Das getrocknete Gel wird dann einem Autoradiographiefilm ausgesetzt, um die Positionen der Banden anzuzeigen, die dem intakten Faktor B und dessen Spaltprodukten entsprechen. Diese werden dann ausgeschnitten und gezählt, um genau das Maß der Spaltung zu bestimmen. Der in Puffer alleine erhaltene Wert wird als Hintergrund abgezogen (umfasst nicht nur die Hintergrundspaltung, sondern auch Abbauprodukte und andere Verunreinigungen, die in der Präparation des radioaktiven Liganden vorkommen).
11.3 Ergebnisse
Das Ausmaß an Faktor B Spaltung ist im folgenden gezeigt:

1/25 Wildtyp: 1,49%

1/5 Wildtyp: 2,74%

Q1R2: 6,19

Q1Q2: 7,41%

E1Q2: 6,42%
Daher bilden die gegenüber Faktor I resistenten Mutanten alle größere Mengen an Faktor B Spaltung, als äquivalente Mengen des Wildtyps C3 (C3i). Mit größeren Dosen oder längeren Inkubationen sollte eine vollständige Unbrauchbarmachung des alternativen Wegs resultieren.
Die in den vorherigen Beispielen verwendeten Abkürzungen umfassen: CFD: Komplementfixierungsverdünnungsmittel (definiert in Harrison und Lachmann, 1986, Handbook of Experimental Immunology, 4. Ausgabe, Herausgeber Weir, Herzensberg, Blackwell und Herzensberg, Blackwell, Oxford), CFD-G: CFD, das 0,1% (G/V) Gelatine enthält, PBS: Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung, NGPS: Normales Meerschweinchenserum, SDS-PAGE: SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese, SPDP: N-Succinimidyl-3-[2-pyridyldithio)propionat.
Literaturstellen

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Claims

Modifiziertes humanes C3 Protein, das zur Bildung einer stabilen C3 Konvertase fähig ist, worin das modifizierte Protein aus der Gruppe ausgewählt ist, die besteht aus (a) einem C3 Protein, worin entweder Arg 1303, Arg 1320 oder beide durch eine andere Aminosäure ersetzt sind, (b) einem C3 Protein, das eine verringerte Empfindlichkeit gegenüber Faktor H und/oder Faktor I relativ zu nativer humaner C3 Konvertase aufweist, wobei das Protein ein oder mehrere Aminosäureaustausche relativ zu nativer humaner C3 Konvertase in der Region aufweist, die den Aminosäureresten 752–754 und/oder den Resten 758–780 der nativen humanen C3 Konvertase entspricht, und (c) ein C3 Protein, das Aminosäureaustausche relativ zu nativer humaner C3 Konvertase an den Aminosäuren eines C3 Proteins der Reste 1427, 1431 und/oder 1433 der nativen humanen C3 Konvertase aufweist.
Protein nach Anspruch 1, worin das Protein durch den Austausch von entweder Arg 1303 oder Arg 1320 oder beiden durch eine andere Aminosäure modifiziert ist.
Protein nach Anspruch 2, worin Arg 1303, Arg 1320 oder beide durch Glutamin, Tyrosin, Cystin, Tryptophan, Glutaminsäure oder Glycin ersetzt sind.
Protein nach Anspruch 3, worin Arg 1320 durch Glutamin ersetzt ist.
Protein nach Anspruch 3 oder 4, worin Arg 1303 durch Glutaminsäure, Glycin oder Glutamin ersetzt ist.
Protein nach Anspruch 1, das eine verringerte Empfindlichkeit gegenüber dem Faktor H und/oder dem Faktor I relativ zur nativen humanen C3 Konvertase aufweist, wobei das Protein einen oder mehrere Aminosäureaustausche relativ zu nativer humaner C3 Konvertase in der Region aufweist, die den Aminosäureresten 752–754 und/oder den Resten 758–780 der nativen humanen C3 Konvertase entspricht.
Protein nach Anspruch 6, worin ein oder mehrere Aminosäureaustausche Austausche von sauren Aminosäureresten zu neutralen Aminosäureresten sind.
Protein nach Anspruch 6 oder Anspruch 7, worin die Aminosäureaustausche Austausche von Asp-Glu-Asp zu Gly-Ser-Gly sind.
Protein nach Anspruch 1, das Aminosäureaustausche relativ zu nativer humaner C3 Konvertase an Aminosäureresten aufweist, die den Resten 1427, 1431 und/oder 1433 der nativen humanen C3 Konvertase entsprechen.
DNA Sequenz, die für ein Protein nach einem der Ansprüche 1 bis 9 kodiert.
DNA Konstrukt (beispielsweise ein Vektor), der eine DNA Sequenz nach der Definition von Anspruch 10 umfasst.
Protein nach einem der Ansprüche 1 bis 9 zur Verwendung in der Therapie.
Konjugat, das ein Protein nach einem der Ansprüche 1 bis 9 an einen spezifischen Bindungsrest gebunden aufweist.
Konjugat nach Anspruch 13, worin der spezifische Bindungsrest ein spezifisches Bindeprotein ist.
Konjugat nach Anspruch 14, worin das spezifische Bindeprotein ein Antikörper oder ein Antigen-bindendes Fragment hiervon ist.
Verwendung eines Proteins nach einem der Ansprüche 1 bis 9 oder eines Konjugats nach einem der Ansprüche 13 bis 15 zur Herstellung eines Arzneimittels zur Verwendung bei der Verringerung der Mengen an Komplementsystemprotein.
Verwendung nach Anspruch 16, worin das Arzneimittel zur Verwendung bei der Prävention einer Abstoßung von fremdem Material geeignet ist.
Verwendung nach Anspruch 16, worin das Arzneimittel zur Verwendung bei der Lokalisierung und/oder Amplifizierung der endogenen Komplementproteinumwandlung und Ablagerung an einer bestimmten Stelle geeignet ist.
Pharmazeutische Formulierung, die ein oder mehrere Proteine nach einem der Ansprüche 1 bis 9 oder ein Konjugat nach einem der Ansprüche 13 bis 15 zusammen mit einem oder mehreren pharmazeutisch annehmbaren Trägern oder Hilfsstoffen enthält.
Pharmazeutische Formulierung nach Anspruch 19, die zur Verwendung bei der Verringerung der Mengen an Komplementsystemprotein geeignet ist.
Pharmazeutische Formulierung nach Anspruch 20, die zur Verwendung bei der Prävention der Abstoßung von fremder Materie geeignet ist.
Pharmazeutische Formulierung nach Anspruch 19, die zur Verwendung bei der Lokalisierung und/oder Amplifizierung der Komplementproteinumwandlung und Ablagerung an einer bestimmten Stelle geeignet ist.
Pharmazeutische Formulierung nach Anspruch 22, die zur Verwendung bei der Verringerung der Mengen an Komplementsystemprotein geeignet ist.
Pharmazeutische Formulierung nach Anspruch 23, die zur Verwendung bei der Prävention der Abstoßung von fremder Materie geeignet ist.
Pharmazeutische Formulierung nach Anspruch 22, die zur Verwendung bei der Lokalisierung und/oder Amplifizierung der Komplementproteinumwandlung und Ablagerung an einer bestimmten Stelle geeignet ist.
Verfahren zur Verringerung des Komplemenfsystemproteins bei einem Säuger, das die Verabreichung eines Proteins nach einem der Ansprüche 1 bis 12 an den Säuger umfasst.
Verfahren nach Anspruch 25, worin das Protein in Form einer pharmazeutischen Formulierung nach der Definition von Anspruch 22 verabreicht wird.