DE69018357T2

DE69018357T2 - Mutein von HST-1 und seine Herstellung.

Info

Publication number: DE69018357T2
Application number: DE69018357T
Authority: DE
Inventors: Koichi Igarashi; Yoshio Kozai; Hiromi Sakamoto; Masaaki Terada; Teruhiko Yoshida
Original assignee: National Cancer Center Japan; Takeda Chemical Industries Ltd
Current assignee: Takeda Pharmaceutical Co Ltd; National Cancer Center Japan
Priority date: 1989-10-06
Filing date: 1990-10-05
Publication date: 1995-09-21
Anticipated expiration: 2010-10-06
Also published as: EP0421455A1; DE69018357D1; US5639862A; CA2027075C; ATE120799T1; CA2027075A1; EP0421455B1

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Mutein vom Auslassungstyp des Heparin-bindenden sekretorischen Transformierungsfaktors (nachstehend auch hst-1 abgekürzt) und auf ein Verfahren zu seiner Herstellung.
hst-1 wird auch als HSTF1 [M. Yoshida et al.: Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, 4861-4864 (1988)] bezeichnet.
Das hst-1-Gen ist ein aus menschlichem Magenkrebsgewebe isoliertes Transformierungsgen [H. Sakamoto et al.: Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83, 3997 (1986)]. Von seinem Genprodukt ist gefunden worden, daß es dem Fibroblastenwachstumsfaktor (FGF), einem Zellwachstumsfaktor, in der Struktur und den Bioaktivitäten ähnlich ist [T. Yoshida et al.: Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 7305 (1987); K. Miyagawa et al.: Oncogene, 3, 383 (1988)]. Ferner ist das hst-1-Gen sowohl aus einem Dickdarmkrebs, Hepatom und Karposi-Sarkom bei AIDS-Patienten als auch aus Magenkrebs isoliert worden [T. Koda et al. Jpn. J. Cancer Res. (Gann) 78, 325 (1987); H. Nakagawa et al.: Jpn. J. Cancer Res. (Gann), 78, 651 (1987); Y. Yuasa et al.: Jpn. J. Cancer Res. (Gann), 78, 1036 (1987); P. Delli Bovi et al. : Cell, 50, 729 (1987)]. Von diesem Gen wird angenommen, daß es zusammen mit dem basischen FGF-Gen, dem sauren FGF-Gen, int-2-Gen usw. die FGF-Genfamilie bildet. Das vorstehend beschriebene, aus dem Karposi-Sarkom isolierte Gen wird K-FGF genannt. Da das hst-1-Gen wie vorstehend angegeben ein Transformierungsgen ist, das als Zellwachstumsfaktor wirkt, besitzt sein Genprodukt wie FGF die Fähigkeit zur Verwendung als vorbeugender oder therapeutischer Wirkstoff wie etwa als Mittel gegen Trauma.
Die Basensequenz des hst-1-Gens ist bereits bekannt [M. Taira et al.: Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 2980 (1987); T. Yoshida et al.: Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 7305 (1987)]. Diese Berichte geben die aus dieser Basensequenz abgeleiteten Aminosäurebestandteile an.
Die natürlichen Mengen hst-1 werden jedoch als äußerst klein angesehen und es liegt kein Bericht des Erhaltens von hst-1 aus lebendem Material vor.
Andererseits gibt es einige Berichte der Herstellung von hst-1 durch Gentechnologie [P. Delli Bovi et al.: Cell, 50, 729 (1987); K. Miyagawa et al.: Oncogene, 3, 383 (1988)], aber eine Massenproduktion ist selbst in diesen Fällen sehr schwierig.
Wie zuvor angegeben bleibt vieles, was die Natur und die biologischen Aktivitäten von hst-1 angeht, im Dunkeln. hst-1 hat jedoch die Fähigkeit zur Verwendung als Pharmazeutikum oder Reagenz.
Wie zuvor angegeben ist hst-1 noch nicht massenproduziert worden.
Vor diesem Hintergrund versuchten die Erfinder hst-1 so abzuändern, daß es ohne nachteiligen Einfluß auf seine Aktivitäten mittels Gentechnologie mikrobiologisch massenproduzierbar wird, in der Erwartung, daß diese Abänderung sowohl zu einer hst-1- Stabilisierung, erhöhten Zellwachstumssaktivität je Molekül und Verstärkung unbekannter biologischer Aktivitäten als auch zur Erhöhung der vorstehend beschriebenen Zellproduktivität führt.
Die Erfinder untersuchten die Zunahme der Zellproduktivität und -aktivität von hst-1-Mutein und der Anderungen bei den biologischen Aktivitäten durch Herstellen eines hst-1-Muteingens mit einer teilweisen Auslassung durch die Technik der rekombinanten DNA und seines Exprimierens in Mikroorganismen und entdeckten ein Mutein das den vorstehend beschriebenen Zwecken dient. Die Erfinder führten auf der Grundlage dieses Befundes weitere Untersuchungen durch und entwickelten die vorliegende Erfindung.
Demgemäß umfaßt die vorliegende Erfindung:
(1) Ein Mutein vom Auslassungstyp des Heparin-bindenden, sekretorischen Transformierungsfaktors (hst-1),
(2) rekombinante DNA mit einer Basensequenz, die das Mutein aus (1) vorstehend kodiert,
(3) ein die rekombinante DNA aus (2) vorstehend enthaltender Vektor,
(4) eine den Vektor aus (3) vorstehend tragende Transformante,
(5) ein Verfahren zum Herstellen des Muteins aus (1) vorstehend durch Kultivierung der Transformanten aus (4) vorstehend in einem Kulturmedium.
Das hst-1, das als Grundlage für das Mutein vom Auslassungstyp der vorliegenden Erfindung dient, ist ein die in Fig. 1 dargestellten 175 aufeinanderfolgenden Aminosäuren umfassendes Protein.
In der Literatur [M. Taira et al.: Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 2980-2984 (1987)] wird hst-1 als 206 Aminosäuren umfassend angesehen, deren Sequenz in Fig. 2 dargestellt wird. In Molecular and Cellular Biology, 8, 2933-2941 (1988), zeigen jedoch Delli-Bovi et al., daß wenn hst-1 in Affen-COS-1-Zellen exprimiert wird (das gewünschte Produkt wird K-FGF genannt), dem sich daraus ergebenden Produkt 30 oder 31 N-terminale Aminosäuren fehlen. Es wird deshalb als höchst logisch erachtet, zu erkennen, daß reifes hst-1 eine Aminosäuresequenz besitzt, die sich aus der Entfernung von 31 N-terminalen Aminosäuren aus der vorgenannten, 206 Aminosäuren umfassenden Sequenz (in Fig. 1 dargestellt) ergibt.
Dem Mutein vom Auslassungstyp des Heparin-bindenden, sekretorischen Transformierungsfaktors (hst-1) der vorliegenden Erfindung fehlt wenigstens ein Aminosäurebestandteil der durch die Amino- Säuresequenz von Fig. 1 dargestellten Reste 1 bis 47 des N- Terminus von hst-1 und es besitzt hst-1-Aktivität.
Dem Mutein vom Auslassungstyp fehlen vorzugsweise 1 bis 47 fortlaufende Aminosäurerestbestandteile von hst-1.
Es ist bevorzugter, daß dem Mutein vom Auslassungstyp 1 bis 43 Aminosäurerestbestandteile von hst-1 fehlen. Am bevorzugtesten fehlen dem Mutein vom Auslassungstyp 1 bis 27 fortlaufende Aminosäurerestbestandteile von hst-1.
Die genaue chemische Struktur der hst-1-Muteine vom Auslassungstyp der vorliegenden Erfindung hängt von einer Anzahl Faktoren ab. Zum Beispiel können derartige Muteine als ein saures oder basisches Salz oder in neutraler Form erhalten werden. Weiterhin können die Muteine mit Zuckerstruktureinheiten oder durch andere Einheiten, wie etwa Lipide, Acetylgruppen und so weiter, derivatisiert sein. Obschon derartige Änderungen einschließlich der genauen Auslassungen die Bioaktivität der Muteine der Anmelder beeinflussen können, sind alle derartigen hst-1-Muteine vom Auslassungstyp, die ihre biologische Aktivität behalten, weiter im Umfang der vorliegenden Erfindung eingeschlossen.
Die biologischen Aktivitäten der hst-1-Auslassungsmuteine können durch das Verfahren von Sasada et al. [Sasada et al., Mol. Cell Biol., 8, 588 (1988)] durch Messen der [³H]-Thymidinaufnahme als Index der Induktion der DNA-Synthese in Maus-BALB/c3T3-Zellen, durch das MTT-Verfahren von Tada et al. [Tada et al., Journal of Immunological Methods, 93, 157 (1986)] durch Messen der Stimulation des Wachstums von Gefäßendotheliumszellen oder durch das Verfahren von Auerbach [Auerbach, Developmental Biology, 41 , 391 (1974)] durch Messen der Angiogenese auf der Chorioallantoismembran des Hühnerembryos bestimmt werden.
Ein Expressionsvektor, der DNA mit einer Basensequenz enthält, die das Mutein der vorliegenden Erfindung kodiert, kann zum Beispiel durch:
(1) Abtrennen der RNA, die das hst-1-Protein kodiert,
(2) Synthetisieren einsträngiger komplementärer DNA (cDNA) und anschließend doppelsträngiger DNA aus der abgetrennten RNA,
(3) Inserieren der komplementären DNA in ein Plasmid,
(4) Transformieren eines Wirts mit dem erhaltenen rekombinanten Plasmid,
(5) Kultivieren der sich daraus ergebenden Transformanten und Isolieren des die gewünschte DNA enthaltenden Plasmids daraus durch ein geeignetes Verfahren, z.B. das Koloniehybridisierungsverfahren mittels einer DNA-Sonde,
(6) Abspalten der gewünschten klonierten DNA aus dem Plasmid,
(7) Hervorrufen der gewünschten Auslassung bei der klonierten DNA,
(8) Kuppeln eines das gewünschte ATG-Kodon enthaltenden Oligonucleotids und
(9) Ligieren der DNA an einen Träger an einer Stelle stromabwärts von einem darin vorliegenden Promotor
hergestellt werden.
RNA, die für hst-1 kodiert, kann aus verschiedenen menschlichen Krebszellen, wie etwa den durch das menschliche hst-1-Gen induzierten von Magenkrebs, Dickdarmkrebs, Hepatom, Kaposi-Sarkom, menschlichem Keimzellentumor und der NIH3T3-Transformanten, erhalten werden.
Beispiele des Verfahrens zum Herstellen von RNA aus menschlichem Krebs schließt das Guanidinthiocyanatverfahren [J. M. Chirgwin et al.: Biochemistry, 18, 5294 (1979)] ein.
Eine cDNA-Bank kann durch Synthetisieren einer cDNA mittels der auf diese Weise als Matrize erhaltenen RNA, ihr Inserieren in zum Beispiel den -Phagenvektor gt10 [Huynh, T.V. et al.: DNA Cloning, A Practical Approach, IRL Press, Oxford, S. 49 (1985)] gemäß zum Beispiel dem Verfahren von Watson und Jackson [Watson, C. J. und Jackson, J. F.: DNA Cloning, A Practical Approach, IRL Press, Oxford, S. 79 (1985)] und sein Infizieren mit Escherichia coli, z.B. C600 oder Hf1A [Huynh, T. V. et al.: dasselbe wie vorstehend] hergestellt werden.
Aus der auf diese Weise erhaltenen cDNA-Bank werden gewünschte Phagenklone mittels an sich bekannter Verfahren, wie etwa das Plaquehybridisierungsverfahren [Maniatis et al.: Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, S. 320 (1982)] und das DNA-Basensequenzierungsverfahren [Proc. Natl.. Acad. Sci. USA, 74, 560 (1977); Nucleic Acids Research, 9, 309 (1981)], selektiert.
Es ist auch vorteilhaft, die Phagenklone zu sammeln, Phagen-DNA zum Beispiel durch das Verfahren von Davis et al. [Davis et al.: Advanced Bacterial Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, (1980)]zu extrahieren, seine cDNA-Struktureinheit mittels eines Restriktionsenzyms abzutrennen und sie vor Gebrauch in ein Plasmid wie etwa pUC13 erneut zu inserieren.
Das klonierte, DNA beherbergende Plasmid mit einer Basensequenz, die für den vorstehend beschriebenen hst-1 kodiert, wird nach Wunsch mit oder ohne Spaltung mittels eines Restriktionsenzyms verwendet.
Das klonierte Gen kann an einen zur Expression in einer Stelle stromabwärts des darin befindlichen Promotors geeigneten Träger (Vektor) unter Liefern eines Expressionsvektors ligiert werden.
Zum Herstellen des Muteins der vorliegenden Erfindung wird außer der herkömmlichen rekombinanten DNA-Technologie die ortsgerichtete Mutagenese angewendet. Diese, für den Fachmann offensichtliche Technik wird von R. F. Lather und J. P. Lecoq in Genetic Engineering, Academic Press, S. 31-50 (1983), beschrieben. Die Oligonucleotid-gerichtete Mutagenese wird von M. Smith und S. Gillam in Genetic Engineering, Principle and Methodology, Plenum Press, Bd. 3, S. 1-32 (1981), beschrieben.
Ein Strukturgen, welches das Mutein der vorliegenden Erfindung kodiert, kann zum Beispiel durch
(a) Hybridisieren einzelsträngiger DNA, die einen einzelnen Strang des Strukturgens von hst-1 umfaßt, mit einem mutagenen Oligonucleotidstarter,
(b) Verlängern des Starters mittels DNA-Polymerase unter Bilden eines mutierten Heteroduplex und
(c) Replizieren dieses mutierten Heteroduplex
hergestellt werden.
Die Größe des Oligonucleotidstarters hängt von den zur stabilen Hybridisierung des Starters mit der zu mutierenden Genregion notwendigen Bedingungen und den Einschränkungen des gegenwärtig verfügbaren Oligonucleotidsyntheseverfahrens ab. Die beim Entwickeln des Oligonucleotids für die Oligonucleotid-gerichtete Mutagenese in Betracht zu ziehenden Faktoren (z.B. Gesamtgröße, Größe des Oligonucleotids, ein fehlangepaßtes Nucleotid ausgenommen) werden von M. Smith und S. Gillam (vorstehend angeführt) beschrieben. Im allgemeinen sollte die Gesamtlänge des Oligonucleotids derart sein, daß die stabile und eindeutige Hybridisierung an der Mutagenesestelle optimiert wird, wobei die Verlängerungen zwischen der Mutagenesestelle und den 5'- und 3'-Termini genügend Länge besitzen, um ein Mutageneseeditieren durch die Exonukleaseaktivität der DNA-Polymerase zu vermeiden. Das zur Mutagenese verwendete Oligonucleotid gemäß der vorliegenden Erfindung enthält normalerweise 12 bis 24 Basen, vorzugsweise etwa 14 bis 20 Basen, bevorzugter etwa 14 bis 18 Basen, die wenigstens 3 3'-terminale Basen des auszutauschenden Kodons enthalten.
Das folgende Verfahren steht zum Herstellen eines Mutanten-hst- 1-Gens zum Zweck des Erhaltens eines Muteins zur Verfügung, dem ein Aminosäurebestandteil von hst-1 fehlt.
Wenn eine Auslassung in dem Aminoterminus hervorgerufen wird, wird das Kodon für das Gen, das für den Carboxyl-Terminus der zu entfernenden Aminosäuresequenz kodiert, durch ortsgerichtete Mutagenese gegen das Met-kodierende ATG-Kodon ausgetauscht, und eine geeignete Restriktionsenzym-Erkennungsstelle wird auf der 5'-terminalen Seite des ATG-Kodons zum Erleichtern der Promotorligierung geschaffen, oder ein Oligonucleotid mit ATG wird unter Leserrahmen-Justierung mit einem Gen lisiert, das eine durch ein Restriktionsenzym verursachte Auslassung im Aminoterminus aufweist.
Es ist anzumerken, daß wenn das hst-1-Mutein vom Auslassungstyp der vorliegenden Erfindung durch ortsgerichtete Mutagenese hergestellt wird, eine Anzahl Mutationen in der DNA-Sequenz ausgelöst werden kann; d.h. das der Aminosäure entsprechende DNA-Kodon umfaßt eine Degeneration.
Wenn zum Beispiel ein für das vorliegende Mutein kodierendes Gen zum Zweck des Erhaltens eines Muteins hergestellt wird, in welchem ein Aminosäurebestandteil, der kein Cystein ist, durch eine andere Aminosäure ersetzt worden ist, wird ein Oligonucleotidstarter wie im Fall von Cystein zum Ändern des Kodons verwendet.
Es ist jedoch anzumerken, daß der Aufbau des Oligonukleotidstarters in Abhängigkeit, welche Aminosäure ausgetauscht wird, schwankt.
Der Starter wird mit einem einzelsträngigen Phagen, wie etwa M13, der klonierte Einzelstrang des hst-1-Gens [Yanisch-Perror, C., Vieira, J. Messing: Gene, 33, 103-119 (1985); Messing, J.: Methods in Enzymology, 101, 20-78 (1983)], fd [R. Herrmann et al.: Molecular and General Genetics, 177, 231 (1980)] oder Φ x 174 [M. Smith und S. Gillam: Genetic Engineering, Plenum Press, Bd. 3, S. 1-32 (1981)] hybridisiert. Es wird erkannt, daß der Phage entweder die Sinn- oder anti-Sinnkette des Gens tragen kann. Wenn der Phage die anti-Sinnkette trägt, muß der Starter aufgrund der Kodondegeneration nicht mit der Sinnkettenregion identisch sein, die das zu mutierende Mutein enthält, und es kann ein Widerspruch zu dem Kodon bestehen, welches das Triplett bestimmt, das für eine andere Aminosäure kodiert. Wenn der Phage die Sinnkette trägt, muß der Starter in ähnlicher Weise nicht zu der Sinnkettenregion komplementär sein, die das zu mutierende Kodon enthält, außer bei dem entsprechende Widerspruch zu dem Triplett, das ein Paar mit dem zu entfernenden Kodon bildet. Die Hybridisierungsbedingungen werden von M. Smith und S. Gillam (vorstehend angeführt) beschrieben. Die Temperatur beträgt normalerweise 0 bis 70ºC, genauer 10 bis 50ºC. Nach der Hybridisierung wird der Starter auf der Phagen-DNA durch Reaktion mit Escherichia coli-DNA-Polymerase I, T4-DNA-Polymerase, reverse Transkriptase oder eine andere geeignete DNA-Polymerase verlängert. Die sich daraus ergebende dsDNA wird durch Behandlung mit einer DNA-Ligase wie etwa T4-DNA-Ligase in cyclisierte dsDNA überführt. Ein die einzelsträngige Region enthaltendes DNA- Molekül kann durch eine S1-Endonukleasebehandlung aufgebrochen werden.
Der sich daraus ergebende mutagene Heteroduplex wird zum Transformieren eines infizierbaren Wirtsorganismus oder -zelle verwendet. Bei der Vermehrung des Heteroduplex durch den Wirt werden aus beiden Ketten Nachkommen geliefert. Auf die Vermehrung folgend wird das Mutantengen aus einem Nachkommen der Mutantenkette isoliert und in einen geeigneten Vektor inseriert. Dieser Vektor wird zum Transformieren eines geeigneten Wirtsorganismus oder -zelle verwendet.
Die das mutierte Gen tragende Phagen-DNA wird anschließend isoliert und in ein Plasmid eingebaut.
Beispiele des Plasmids, in das DNA integriert wird, schließen aus Escherichia coli stammende Plasmide, wie etwa pBR322 [Gene, 2, 95 (1977)], pBR325 [Gene, 4, 121 (1978)], pUC12 [Gene, 19, 259 (1982)] und pUC13 [Gene, 19, 259 (1982)] und aus Bacillus subtilis stammende Plasmide, wie etwa pUB110 [Biochemical and Biophysical Research Communication, 112, 678 (1983)] ein, aber jedes andere Plasmid kann verwendet werden, so lange es vermehrbar und im Wirt haltbar ist.
Beispiele des Verfahrens der Inserierung in das Plasmid schließen das von T. Maniatis et al. in Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, S. 239 (1982), beschriebene Verfahren ein.
Das klonierte Gen kann an jeden Träger (Vektor), der zu seiner Expression an einer Stelle stromabwärts von dem darin bestehenden Promoter geeignet ist, unter Liefern eines Expressionsvektors ligiert werden.
Beispielsträger (Vektor) für die Herstellung des rekombinanten Vektors schließen aus Escherichia coli stammende Plasmide, wie etwa pBR322 [Gene, 2, 95 (1977)], pBR325 [Gene, 4, 121 (1978)], pUC12 [Gene, 19, 259 (1982)] und pUC13 [Gene, 19, 259 (1982)], von Bacillus subtilis stammende Plasmide, wie etwa pUB110 [Biochemical and Biophysical Research Communication, 112, 6678 (1983)], pTP5 und pC194, von Hefe stammende Plasmide (z.B. pSH19, pSH15), Bakteriophagen, wie etwa λ-Phage, und tierische Viren, wie etwa ein Retrovirus und Vaccinia-Virus, ein.
Das vorstehend beschriebene Gen kann ein Translationsstartkodon ATG an seinem 5'-Terminus und ein Translationsabbruchkodon TAA, TGA oder TAG an seinem 3'-Terminus besitzen. Zum Exprimieren des Gens wird daran stromaufwärts ein Promoter ligiert. Jeder Promotor kann bei der vorliegenden Erfindung verwendet werden, so lange er zu dem zur Genexpression verwendeten Wirt paßt.
Beispiele bevorzugbarer Promotoren schließen den trp-Promotor, lac-Promotor, rec-A-Promotor, λpL-Promotor, lpp-Promotor und T7- Promotor, wenn der Transformationswirt ein Bakterium der Gattung Escherichia ist; den SPO1-Promotor, SPO2-Promotor und penP- Promotor, wenn der Transformationswirt ein Bakterium der Gattung Bacillus ist, und den PHO5-Promotor, PGK-Promotor, GAP-Promotor und ADH-Promotor ein, wenn der Transformationswirt eine Hefe ist, wobei einer Kombination eines Bakteriums der Gattung Escherichia als Wirt und dem trp-Promotor oder T7-Promotor besonderer Vorzug gegebenen wird.
Wenn der Wirt eine tierische Zelle ist, schließen Beispiele bevorzugbarer Promotoren einen von SV40 stammenden Promotor und einen Retrovirus-Promotor ein, wobei einem von SV40 stammenden Promotor besonderer Vorzug gegeben wird.
Der auf diese Weise aufgebaute DNA-haltige Vektor wird zum Herstellen einer Transformanten verwendet.
Beispielswirte schließen Bakterien der Gattung Escherichia, Bakterien der Gattung Bacillus, Hefen und tierische Zellen ein.
Beispielsbakterien der vorstehend beschriebenen Gattung Escherichia schließen die Escherichia coli-Stämme K12DH1 [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 60, 160 (1968)], M103 [Nucleic Äcids Research, 9, 309 (1981)], JA221 [Journal of Molecular Biology, 120, 517 (1978)], HB101 [Journal of Molecular Biology, 41, 459 (1969) und C600 [Genetics, 39, 440 (1954)] ein.
Beispielsbakterien der vorstehend beschriebenen Gattung Bacillus schließen die Bacillus subtilis-Stämme MI114 [Gene, 24, 255 (1983)] und 207-21 [Journal of Biochemistry, 95, 87 (1984)] ein.
Beispiele der vorstehend beschriebenen Hefen schließen die Saccharomyces cerevisiae-Stämme AH22R&supmin;, NA87-11A und DKD-5D ein.
Die vorstehend beschriebene Tierzelle ist vorzugsweise eine eingeführte Zellinie. Beispiele derartiger Zellen schließen Affen-COS7-Zellen [Cell, 23, 157 (1981)], Vero, CHO-Zellen des chinesischen Hamsters, Maus-L-Zellen und menschliche FL-Zellen ein.
Die vorstehend beschriebenen Bakterien der Gattung Escherichia werden gemäß zum Beispiel den in Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69, 2110 (1972), und Gene, 17, 107 (1982), beschriebenen Verfahren transformiert.
Ein Bakterium der Gattung Bacillus wird gemäß zum Beispiel dem in Molecular and General Genetics, 168, 111 (1979), beschriebenen Verfahren transformiert.
Eine Hefe wird geinäß zum Beispiel dem in Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, 1929 (1978), beschriebenen Verfahren transformiert.
Eine tierische Zelle wird gemäß zum Beispiel dem in Virology, 52, 456 (1973), beschriebenen Verfahren transformiert.
Eine mit einem Vektor, der eine cDNA enthält, die für das vorliegende Mutein kodiert, transformierte Transformante wird auf diese Weise erhalten.
Wenn eine Transformante kultiviert wird, deren Wirt ein Bakterium der Gattung Escherichia oder Bacillus ist, ist es angebracht, ein flüssiges Medium, das mit Kohlenstoffquellen, Stickstoffquellen und anorganischen und anderen für das Wachstum der Transformanten wesentlichen Substanzen formuliert ist, zu verwenden. Beispielskohlenstoffquellen schließen Glucose, Dextrin, lösliche Stärke und Sucrose ein. Beispielsstickstoffquellen schließen anorganische oder organische Substanzen, wie etwa Ammoniumsalze, Nitrate, Maisquellwasser, Pepton, Casein, Fleischextrakte, Sojabohnenmehl und Kartoffelextrakte ein. Anorganische Beispielsubstanzen schließen Calciumchlorid, Natriumdihydrogenphosphat und Magnesiumchlorid ein. Hefeextrakte, Vitamine, Wachstumsförderer und andere Substanzen können ebenfalls zugesetzt werden.
Es ist erwünscht, daß der pH des Mediums etwa 6 bis 8 beträgt.
Beispiele zur Kultivierung eines Bakteriums der Gattung Escherichia bevorzugter Medien schließen ein Glucose und Casaminosäure enthaltendes M9-Medium [Miller: Journal of Experiments in Molecular Genetics, 431-433, Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1972)] ein. Zum Erhöhen der Promotorwirksamkeit kann nach Wunsch ein Mittel wie etwa 3β-Indolylacrylsäure zugesetzt werden.
Wenn der Wirt ein Bakterium der Gattung Escherichia ist, wird die Kultivierung normalerweise 3 bis 24 Stunden bei 15 bis 43ºC nötigenfalls unter Belüften und Rühren durchgeführt.
Wenn der Wirt ein Bakterium der Gattung Bacillus ist, wird die Kultivierung normalerweise 6 bis 24 Stunden bei 30 bis 40ºC nötigenfalls unter Belüften und Rühren durchgeführt.
Wenn eine Transformante kultiviert wird, deren Wirt eine Hefe ist, schließen verwendbare Beispielsmedien Burkholders Minimal- medium [Bostian, K. L. et al.: Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 4505 (1980)] ein. Es ist bevorzugt, das Medium auf einen pH von 5 bis 8 einzustellen. Die Kultivierung wird normalerweise 24 bis 72 Stunden bei 20 bis 35ºC nötigenfalls unter Belüften und Rühren durchgeführt.
Wenn eine Transformante kultiviert wird, deren Wirt eine tierische Zelle ist, schließen verwendbare Beispielsmedien MEM- Medium [Science, 122, 501 (1952)], DMEM-Medium [Virology, 8, 396 (1959)], RPMI1640-Medium [Journal of the American Medical Association, 199, 519 (1967)] und 199-Medium [Proceedings of the Society for the Biological Medicine, 73, 1 (1950)] ein. Das Medium kann mit 5 bis 20% fetalem Rinderserum formuliert werden. Es ist bevorzugt, daß der pH etwa 6 bis 8 beträgt. Die Kultivierung wird normalerweise 15 bis 60 Stunden bei 30 bis 40ºC nötigenfalls unter Belüftung und Rühren durchgeführt.
Das vorliegende Mutein kann aus der vorstehend beschriebenen Kultur durch zum Beispiel das folgende Verfahren abgetrennt und gereinigt werden.
Verfahren zum Extrahieren des vorliegenden Muteins aus kultivierten Bakterien- oder anderen Zellen schließen dasjenige ein, bei dem durch ein bekanntes Verfahren nach der Kultivierung gesammelte Bakterien- oder andere Zellen in einem Puffer suspendiert werden, der ein Proteindenaturierungsmittel wie etwa Guanidinchlorid enthält. Dies wird von der extrazellulären Elution des gewünschten Proteins und einem Verfahren, durch das Bakterien- oder andere Zellen durch eine French-Presse, Ultrabeschallung, Lysozymbehandlung und/oder Gefrieren-Auftauen aufgebrochen werden und anschließend unter Liefern eines hst-1- Muteins vom Auslassungstyp zentrifugiert werden, gefolgt, wobei dem Verfahren, das Lysozym und Ultrabeschallung in Kombination verwendet, der Vorzug gegeben wird.
Beim Reinigen des vorliegenden Muteins aus dem auf diese Weise erhaltenen Überstand können an sich bekannte Trenn/Reinigungsverfahren in Kombination durchgeführt werden. Derartige Verfahren schließen die auf der Löslichkeit beruhenden, wie etwa Aussalzen und Lösungsmittelfällung, die auf Molekulargewichtsunterschieden beruhenden, wie etwa Dialyse, Ultrafiltration, Gelfiltration und SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese, die auf elektrischen Ladungsunterschieden beruhenden, wie etwa Ionenaustauschchromatographie, die auf einer besonderen Affinität beruhenden, wie etwa Affinitätschromatographie, die auf Hydrophobieunterschieden beruhenden, wie etwa Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie, und die auf Unterschieden im isoelektrischen Punkt beruhenden, wie etwa isoelektrisches Fokussieren, ein.
Insbesondere können verunreinigende Aminosäuren, saure Proteine und andere mitvermischte Substanzen durch Anwenden einer Ionenaustauschchromatographie mittels DEAE-Cellulose oder einer anderen Substanz als Träger auf den vorstehend beschriebenen Überstand entfernt werden. Es ist zum Beispiel wirkungsvoll, den Überstand auf eine DEAE-Cellulosesäule aufzubringen, die mit einem Puffer wie etwa fast neutralem Tris äquilibriert ist, und die ausfließenden Fraktionen zu sammeln. Es ist ferner möglich, das vorliegende Mutein durch Trägerabsorption durch Anwenden der Ionenaustauschchromatographie mittels CM-Cellulose oder einem anderen Träger auf den vorstehenden beschriebenen Überstand und sein Eluieren mit einer Salzlösung zu reinigen.
Das vorliegende Mutein kann direkt durch Säulenchromatographie mittels eines sauren Harzes wie etwa CM Sephadex aus dem Bakterienzellenextrakt gereinigt werden. Zum Beispiel ist eine wirksame Reinigung durch Aufbringen des Überstands auf eine mit einem schwachsauren Puffer (z.B. Phosphatpuffer) äquilibrierte CM-Cellulose-Säule möglich. Das vorliegende Mutein kann durch Waschen der Säule mit demselben Puffer wie vorstehend und anschließend Eluieren der Säule mit einem ein Salz (z.B. NaCl) enthaltenden Puffer eluiert werden. Die sich daraus ergebenden Eluate können nach der Dialyse lyophilisiert werden.
Es ist vorteilhaft, zum Reinigen des vorliegenden Muteins auf das im Escherichia coli-Extrakt vorhandene Mutein die Affinitätschromatographie mittels Heparin-Sepharose als Träger anzuwenden. zum Beispiel kann das vorliegende Mutein durch Aufbringen des vorstehend beschriebenen Eluats auf eine Heparin-Sepharose-Säule, die mit einem fast neutralen Puffer wie etwa Tris oder Phosphatpuffer äquilibriert ist, gründliches Waschen der Säule und anschließend Ausführen einer linearen Gradientenelution mit NaCl usw. gereinigt werden.
Besonders für die Hochleistungsflüssigkeitschromatographie entwickelte Heparin-Säulen (z.B. Shodex AF-pak HR 894, hergestellt von Showa Denko, KK) dienen diesem Zweck gut.
Wie die vorstehend beschriebene Heparin-Sepharose-Säule macht es diese Heparin-Säule möglich, das vorliegende Mutein als nahezu einheitliche authentische Zubereitung durch Aufbringen der Probe auf die mit einem fast neutralen Puffer äquilibrierte Säule, gründliches Waschen der Probe und anschließend Durchführen einer Elution mit einem linearen NaCl-Dichtegradienten usw. zu isolieren.
Die auf diese Weise erhaltene authentische Zubereitung kann dialysiert und zu einem trockenen Pulver lyophilisiert werden. Ferner ist es bevorzugt, sie in Anwesenheit von als Träger zum Verhindern einer Absorption der authentischen Zubereitung an den Behälter zugesetztem Serumalbumin usw. aufzubewahren.
Ebenfalls bevorzugt ist die Anwesenheit einer Spurenmenge eines Reduktionsmittels während der Reinigung oder Aufbewahrung, das dem Verhindern der Oxidation der authentischen Zubereitung gut dienlich ist. Beispiele des Reduktionsmittels schließen β-Mercaptoethanol, Dithiothreit und Glutathion ein.
Ein im wesentlichen reines Mutein von hst-1 vom Auslassungstyp, das im wesentlichen frei von Pyrogen und Endotoxin ist, wird auf diese Weise erhalten. Das im wesentlichen reine Mutein von hst-1 vom Auslassungstyp der vorliegenden Erfindung besitzt vorzugsweise einen Proteingehalt von nicht weniger als 95% (Gew. /Gew.), bevorzugter nicht weniger als 98% (Gew./Gew.). Dieses Polypeptid kann Met an seinem N-Terminus besitzen.
Die Aktivität des sich daraus ergebenden Muteins von hst-1 vom Auslassungstyp kann auf der Grundlage der wachstumsfördernden Wirkung von BALBA/c3T3-Zellen und anderen Indices bestimmt werden.
Die Transfizierung oder Transformation mit der DNA der vorliegenden Erfindung gestattet die Massenproduktion des Muteins von hst-1 vom Auslassungstyp selbst in verschiedenen Zellarten, die im wesentlichen nur eine sehr geringe Menge Mutein von hst-1 vom Auslassungstyp synthetisieren können oder zu seinem Synthetisieren völlig unfähig sind, unter wirksamer Induktion des Muteins von hst-1 vom Auslassungstyp.
Da ein Expressionsplasmid, welches das Gen enthält, welches für das Mutein von hst-1 vom Auslassungstyp der vorliegenden Erfindung kodiert, wenn es in verschiedene Zellen eingeführt wird, sie zum Produzieren des Muteins von hst-1 vom Auslassungstyp befähigt, gestattet es die Produktion des Muteins von hst-1 vom Auslassungstyp in großen Mengen.
Da das auf diese Weise hergestellte Mutein von hst-1 vom Auslassungstyp wachstumsfördernde Wirkungen auf Gefäßendotheliums- und andere Zellen besitzt, Angiogenese-fördernde Wirkungen besitzt und in der Toxizität niedrig ist, kann es als therapeutischer Wirkstoff, wie etwa als Heilungsförderer für Verbrennungen, Wunden, chirurgische Verletzungen usw. verwendet werden. Es kann auch als Reagenz zum Fördern der Zellkultivierung verwendet werden.
Wenn das Mutein von hst-1 vom Auslassungstyp der vorliegenden Erfindung als Pharmazeutikum verwendet wird, kann es sicher oral oder parenteral, einzeln in Form eines losen Pulvers oder in Kombination mit einem pharmakologisch annehmbaren Träger, Hilfsstoff oder Verdünnungsmittel in Form einer pharmazeutischen Zusammensetzung (z.B. Injektionen, Tabletten, Kapseln, Lösungen, Salben) an warmblütige Säuger (z.B. Menschen, Mäuse, Ratten, Hamster, Kaninchen, Hunde, Katzen) verabreicht werden.
Eine Injektion wird gemäß einem Standardverfahren unter Verwenden physiologischer Kochsalzlösung oder einer wäßrigen, Glucose oder andere Hilfsstoffe enthaltenden Lösung hergestellt. Andere pharmazeutische Zusammensetzungen, wie etwa Tabletten und Kapseln, können ebenfalls gemäß Standardverfahren hergestellt werden. Beim Herstellen von Injektionen, Lösungen, Tabletten, Kapseln usw. als pharmazeutische Zusammensetzungen wird das Verfahren unter aseptischen Bedingungen durchgeführt.
Wenn das Mutein von hst-1 vom Auslassungstyp der vorliegenden Erfindung als Pharmazeutikum wie vorstehend beschrieben verwendet wird, wird es zum Beispiel einem vorstehend angeführten warmblütigen Tier in einer mit Hinsicht auf den Verabreichungsweg, die Symptome und andere Aspekte geeigneten Dosis verabreicht, die aus dem Bereich von etwa 1 ng bis 100 ug/kg Körpergewicht täglich ausgewählt ist.
Wenn das Mutein von hst-1 vom Auslassungstyp der vorliegenden Erfindung als Reagenz zur Förderung der Zellkultivierung verwendet wird, ist es bevorzugt, es dem Medium so zuzusetzen, daß seine Endkonzentration 0,01 bis 10 ug, bevorzugter 0,1 bis 10 ug je Liter Medium wird.
Da das vorliegende Mutein starke heilungsfördernde Aktivitäten auf geschädigtes lebendes Gewebe besitzt, kann es gut als therapeutisches Arzneimittel, wie etwa als Heilungsförderer für Verbrennungen, Wunden usw. dienen.
Da das vorliegende Mutein eine ausgezeichnete, das Zellwachstum fördernde Aktivität besitzt und unter sauren Bedingungen stabil ist, kann das vorliegende Mutein als therapeutisches Arzneimittel zum Behandeln von Ulzera wie etwa Ulzera des Magen-Darm- Trakts verwendet werden.

Kurze Erläuterung der Zeichnungen:

Fig. 1 zeigt die Aminosäuresequenz von reifem hst-1.
Fig. 2 zeigt die aus der hst-1-Kodierungsregion, die eine Leader-Sequenz besitzt, welche den offen Leserahmen von hst-1-cDNA darstellt, abgeleitete Aminosäuresequenz.
Fig. 3 zeigt die Aminosäuresequenz von in Beispiel 1 erhaltenem hst-1-Mutein N27.
Fig. 4 zeigt das Aufbauschema des in Beispiel 1 erhaltenen Plasmids pTB1051.
Fig. 5 zeigt ein in Beispiel 1 erhaltenes Elutionsmuster.
Fig. 6 zeigt eine in Beispiel 1 erhaltene SDS-PAGE.
Fig. 7 zeigt ein weiteres in Beispiel 1 erhaltenes Elutionsmuster.
Fig. 8 zeigt eine weiteres in Beispiel 1 erhaltenes Muster bei der SDS-PAGE.
Fig. 9 zeigt die in Beispiel 2 erhaltenen Ergebnisse der das Zellwachstum fördernden Wirkung des hst-1-Muteins N27 auf menschliche Gefäßendotheliumszellen.
Fig. 10 die in Beispiel 6 erhaltenen Ergebnisse der Bestimmung der die DNA-Synthese induzierenden Aktivität auf Maus-BALB/c3T3- Zellen.
Fig. 11 zeigt die in Beispiel 7 erhaltenen Ergebnisse der das Zellwachstum fördernden Aktivität.
Fig. 12 zeigt die in Beispiel 10 unter sauren Bedingungen erhaltene Restaktivität.
Fig. 13 zeigt die in Beispiel 10 erhaltenen Ergebnisse der Wirkung von hst-1-Mutein N27 auf das Binden von radiomarkiertem rhbFGF.
Die in der vorliegenden Beschreibung und den angefügten Zeichnungen verwendeten Abkürzungen für Basen und Aminosäuren beruhen auf den von der IUPAC-IUB-Kommission für biochemische Nomenklatur angegebenen Abkürzungen oder denen, die gemeinhin auf den betreffenden Gebieten verwendet werden. Beispiele werden nachstehend angegeben. Es ist anzumerken, daß wenn eine Möglichkeit besteht, daß ein optisches Isomer in einer Aminosäure vorliegt, es so lange nicht anders angegeben ein L-Körper ist.
DNA: Deoxyribonukleinsäure
cDNA: komplementäre Deoxyribonukleinsäure
A: Adenin
T: Thymin
G: Guanin
C: Cytosin
RNA: Ribonukleinsäure
dATP: Deoxyadenosintriphosphat
dTTP: Deoxythymidintriphosphat
dGTP: Deoxyguanosintriphosphat
dCTP: Deoxycytidintriphosphat
ATP: Adenosintriphosphat
Tdr: Thymidin
EDTA: Ethylendiamintetraessigsäure
SDS: Natriumdodecylsulfat
Gly: Glycin
Ala: Alanin
Val: Valin
Leu: Leucin
Ile: Isoleucin
Ser: Serin
Thr: Threonin
Cys: Cystein
Met: Methionin
Glu: Glutaminsäure
Asp: Asparaginsäure
Lys: Lysin
Arg: Arginin
His: Histidin
Phe: Phenylalanin
Tyr: Tyrosin
Trp: Tryptophan
Pro: Prolin
Asn: Asparagin
Gln: Glutamin
Die in den nachstehend angegebenen Beispielen erhaltene Transformante ist beim Fermentationsinstitut, Osaka, Japan, und auch beim Fermentationsforschungsinstitut, Amt für industrielle Wissenschaft und Technologie, Ministerium für internationalen Handel und Industrie, Japan, unter dem Budapester Vertrag hinterlegt worden. Die Zugangsnummern und Zugangsdaten werden in der folgenden Tabelle 1 aufgeführt. Tabelle 1 Transformante Beispiel September Oktober
Das in dem folgenden Beispiel 1 erhaltene Mutein ist ein Mutein, dem die N-terminalen Aminosäuren Nr. 1 bis 27 fehlen, und es wird als hst-1-Mutein N27 bezeichnet. Die Aminosäuresequenz von hst-1-Mutein N27 wird in Fig. 3 dargestellt.
Die vorliegende Erfindung wird nachstehend in größerer Einzelheit mittels der folgenden Beispiele beschrieben, aber die Erfindung wird durch sie keinesfalls eingeschränkt.

Beispiel 1

a) Aufbau des Expressionsplasmids

Das plasmid pKOc5 [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 2980-2984 (1987)], welches eine menschliche hst-1-cDNA beherbergt, wurde mit HindIII gespalten und durch eine Klenow-Fragment-Reaktion mit E. coli-DNA-Polymerase I stumpf gemacht. Nachdem das Fragment durch eine T4-Ligase-Reaktion mit einem BamHI-Linker ligiert worden war, wurde es mit BamHI-Sty I unter Liefern eines 0,49 kb-DNA-Fragments gespalten. Die synthetischen Oligonucleotide 5'TATGCCGGTGGCAGCGCAGCC3' und 5'CTTGGGCTGCGCTGCCACCGGCA3' wurden mit dem vorstehend erhaltenen 0,49 kb-DNA-Fragment an der 5'-terminalen Seite unter Liefern eines 0,51 kb-NdeI-BamHI-DNA- Fragments (das ein Startkodon ATG und das menschliche hst-1- cDNA-Nucleotid Nr. 413 bis 916 enthielt) ligiert, das anschließend in den E. coli-Expressionsvektor pET3c, der den T7-Phagen- Φ10-Promotor [Gene, 56, 125-135 (1987)] enthielt, zwischen die NdeI-BamHI-Stellen unter Liefern von pTB1051 (Fig. 4) inseriert wurde.

b) Expression von cDNA in E. coli

λ-phagen-DE3 [Studier, F. W. et al.: J. Mol. Biol., 189, 113-130 (1986)] mit dem RNA-Polymerase-Gen des T7-Phagen wurde mit dem E. coli-Stamm MM294 lysogeniert, gefolgt von der Einführung des Plasmids pLysS [Studier, F. W. et al.: J. Mol. Biol., 189, 113- 130 (1986)], welches das Lysozym-Gen des T7-Phagen beherbergt, unter Liefern des E. coli-Stamms MM294(DE3)/pLysS.
Das vorstehend in (a) erhaltene Plasmid pTB1051 wurde unter Liefern des E. coli-Stamms MM294(DE3)/pLysS,pTB1051 (IFO 14952, FERM Bp-2621) in diesen E. coli-Stamm MM294(DE3)/pLysS eingeführt. Dieser Stamm wurde in einem L-Medium, das 10 ug/ml Chloramphenicol und 35 ug/ml Ampicillin enthielt, kultiviert. Als der Klettwert etwa 120 erreichte, wurde Isopropyl-β-dithiogalactopyranosid (IPTG) zum Erreichen einer Endkonzentration von 0,4 mM zugesetzt, gefolgt von der Kultivierung über weitere 4 Stunden. Bakterienzellen wurden durch Zentrifugieren gesammelt, mit eisgekühlter, phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) gewaschen und erneut gesammelt und bis zum Gebrauch bei -20ºC gelagert.

c) Reinigung von rekombinantem hst-1-Mutein

Aus der 10-Liter-Kultur gesammelte Bakterienzellen wurden in 250 ml einer eisgekühlten Lösung suspendiert, die 10 mM Tris-HCl (pH 7,4), 10 mM EDTA, 0,5 M NaCl, 10% Sucrose und 1 mM PMSF enthielt, gefolgt von der Zugabe von Eiweißlysozym zum Erreichen einer Endkonzentration von 0,5 mg/ml. Nachdem man diese Suspension 1 Stunde unter Eiskühlung hatte stehen lassen, wurde sie 5 Minuten bei 37ºC inkubiert, gefolgt von der Ultrabeschallung (2 x 20 Sekunden) unter Eiskühlung und anschließend Zentrifugieren (SORVALL, 18 kUpm, 30 Minuten, 4ºC) unter Liefern eines Überstandes zu einem Bakterienzellenextrakt.
250 ml dieses Bakterienzellenextrakts ließ man zum Entfernen der Nukleinsäurebestandteile durch eine Säule (5 cm Durchm. x 5 cm) mit Q-Sepharose (Pharmacia) gehen, die mit einer Lösung von 20 mM Tris-HCl (pH 7,6) und 0,5 M NaCl äquilibriert war. Das aus der Säule Ausfließende und die Säulenwaschflüssigkeiten mit einer Lösung von 20 mM Tris-HCl (pH 7,6) und 0,5 M NaCl wurden vereinigt (die aus Q-Sepharose ausfließende Fraktion mit 450 ml). Diese Fraktion wurde auf einen Hochleistungsflüssigkeitschromatographen (Gilson Co.) aufgebracht, der mit einer Heparinsäule Shodex AF-pak HR-2094 (2 cm ID x 25 cm, hergestellt von Showa Denko, KK) ausgestattet war. Nach dem Waschen der Säule durch aufeinanderfolgende Zugaben einer 20 mM Tris-HCl-Lösung (pH 7,6) und einer Lösung von 20 mM Tris-HCl (pH 7,6) und 0,5 M NaCl wurde eine lineare Gradientenelution 180 Minuten an einem Dichtegradienten von 0,5 M bis 2 M NaCl in einem 20 mM Tris-HCl- Puffer (pH 7,6) bei einer Fließgeschwindigkeit von 6,0 ml/min ausgeführt.
Bei dem in Fig. 5 dargestellten Elutionsmuster zeigen die Ordinaten die Absorption bei OD&sub2;&sub8;&sub0; und dem NaCl-Konzentrationsgradienten, die Abszisse zeigt die Fraktionsnummer. Die Gradientenelution wurde zum Zeitpunkt 0 begonnen. Alle 0,75 Minuten wurde eine Fraktion abgenommen. Die Protein-spezifische Aktivität dieser Fraktionen und die quantitative hst-1-Muteingewinnung werden in Tabelle 2 dargestellt. Die SDS-PAGE-Muster (12,5% Polyacrylamidgel) entsprechender Fraktionen, die jeweils einen Peak zeigen, werden in Fig. 6 dargestellt. Tabelle 2 Proteingehalt (mg) hst-1-Aktivität (als mg bFGF) Rohextrakt aus Q-Sepharose ausfließende Fraktion Heparinsäule-Elutionsfraktion
- : nicht gemessen

d) Umkehrphasen-C4-HPLC

Etwa die Hälfte (300 ug Protein) der Elutionsfraktionen Nr. 56 aus der Heparin-HPLC-Säule wurde auf eine Umkehrphasen-C4-Säule (VYDAC) aufgebracht und mit einem linearen Gradienten von 0 bis 90% Acetonitril in Anwesenheit von 0,1% TFA bei einer Fließgeschwindigkeit von 1 ml/min während einer Abstufungszeit von 60 Minuten eluiert, das Elutionsmuster wurde anschließend untersucht (Fig. 7). Das SDS-PAGE-Muster (12,5% Polyacrylamidgel) der bei 36 bis 37 Minuten nachgewiesenen Peakfraktion wird zusammen mit dem der Elutionsfraktion Nr. 56 aus der Heparinsäule in Fig. 8 dargestellt.
In Fig. 8 zeigen 1 bis 5 die Muster des Molekulargewichtmarkers (50 ng), der aus der Heparin-HPLC-Säule eluierten Fraktion Nr. 56 (50 ng), der aus der Heparin-HPLC-Säule eluierten Fraktion Nr. 56 (100 ng), der aus der Umkehrphasen-HPLC-Elution (50 ng) eluierten Fraktion (50 ng) beziehungsweise der aus der Umkehrphasen-HPLC-Elution (50 ng) eluierten Fraktion (100 ng) in 12,5% Polyacrylamidgel. Von diesen Proteinen wurde gefunden, daß sie eine spezifische Aktivität von 0,43 bezogen auf die als 1,00 angenommene von rekombinantem menschlichem bFGF (rhbFGF) (europäische Patentveröffentlichung Nr. 237 966) besaßen. Änderungen bei der spezifischen Aktivität und der Ausbeute an hst-1-Mutein N27 beim Reinigungsverfahren werden in Tabelle 3 dargestellt, wobei die spezifische Aktivität von Rinderhypophysen-FGF (hergestellt von Takara Shuzo) als 1 angenommen wurde.
Auf diese Weise wurde hst-1-Mutein N27 erhalten, das die in Fig. 3 dargestellte Aminosäuresequenz besitzt. Tabelle 3 Proteingehalt (mg) spezifische Aktivität Ausbeute (%) roher Bakterienzellenextrakt aus Q-Sepharose ausfließende Fraktion Heparinsäulen-Elutionsfraktion

e) biologische Aktivitäten

Die hst-1-Muteinaktivität wurde gemäß dem Verfahren von Sasada et al. [Sasada et al. : Mol. Cell Biol., 8, 588-594 (1988) bestimmt, wobei die [³H]-Thymidinaufnahme als Index der Induktion der DNA-Synthese in Maus-BALB/c3T3-Zellen gemessen wurde. Die Ergebnisse werden vorstehend in Tabelle 2 dargestellt.

Beispiel 2 (Förderung des Wachstums von Gefäßendotheliumszellen)

Das in Beispiel 1 erhaltene hst-1-Mutein N27 wurde wie folgt auf die Wirkung auf das Zellwachstum getestet: Die bei diesem Test verwendeten Zellen waren aus der menschlichen Nabelschnur isolierte Venenendotheliumszellen (hierin nachstehend als HUVE- Zellen bezeichnet). Die Zellwachstumsrate wurde das nachstehend beschriebene MTT-Testverfahren mit einer geringen Abänderung gegenüber dem Verfahren von Tada et al. [Journal of Immunological Methods, 93, 157 (1986)] bestimmt. Subkultivierte HUVE- Zellen wurden mittels einer 0,125%igen Trypsinenzymlösung (hergestellt von Boehringer Mannheim Co.), die 0,002% EDTA (hergestellt von Dojin Kagaku K. K. Japan, 345-01882) enthielt, in einzelne Zellen dissoziiert. Die sich daraus ergebenden einzelnen Zellen wurden in einem HUVE-Zellkulturmedium, das GIT-Medium (hergestellt von Nippon Seiyaku, 398-00515) und 2,5% fetales Rinderserum (hergestellt von Whittaker Bioproduct Co.) enthielt, suspendiert. Nach Zählen der in dieser Suspension befindlichen Zellen mittels eines Coulter-Zellzählers (Coulter Co., Modell ZM) wurden die Zellen wie folgt kultiviert: eine Kulturplatte mit 96 Näpfchen (Nunc Co., F96) wurde mit einer 2 x 10³ HUVE- Zellen enthaltenden 100 ul-Portion der HUVE-Zellsuspension beimpft und bei 37ºC inkubiert (Hitachi Kohlendioxid-Stickstoff- gas-Kontrollinkubator Modell CH-16, 5% CO&sub2;, 7% O&sub2;). Am Tag nach der Inkubation wurden die nachstehend beschriebenen Proben mit HUVE-Zellmedium hergestellt. Eine 100 ul-Portion jeder Probe wurde den auf der Kulturplatte mit 96 Näpfchen kultivierten HUVE-Zellen zugesetzt. Die Testproben wurden mit 1) hst-1-Mutein N27 allein unter Erreichen einer Endkonzentration von 0,004 ng/ml bis 2,0 ng/ml hergestellt oder 2) das vorstehend beschriebene hst-1-Mutein N27 wurde in Kombination mit Heparin (hergestellt von Sigma Co.) zum Erreichen einer Endkonzentration von 5,0 ug/ml zugesetzt. Nachdem jede Probe zugesetzt worden war, wurde die Inkubation 3 weitere Tage fortgesetzt, als das Medium von der Kulturplatte entfernt wurde und 100 ul HUVE- Medium zugesetzt wurden, das 1,0 mg/ml MTT-Reagenz (hergestellt von Dojin Kagaku, 34101823) enthielt, gefolgt von 4 Stunden Inkubation bei 37ºC. 100 ul einer 10%igen wäßrigen SDS-Lösung (hergestellt von Wako Pure Chemical, 191-07145) wurden anschließend zugesetzt, gefolgt von 4 Stunden Inkubation bei 37ºC. Nach Abschluß der Reaktion wurde die das Reaktionsgemisch enthaltende Kulturplatte mit 96 Näpfchen geschüttelt und die Absorption des Reaktionsgemischs wurde bei einer Wellenlänge von 590 nm mittels eines Mikrotiterplatten-Absorptiometers (hergestellt von Titertech Co., MCC341) bestimmt. Die Ergebnisse werden in Fig. 9 dargestellt.
In Fig. 9 zeigt die Abszisse die Konzentration an dem Kulturmedium der Gefäßendotheliumszellen zugesetzten hst-1-Mutein N27 an, wobei die Ordinate die Absorption der Lösung des Reaktionsprodukts in SDS anzeigt, die nach der Reaktion mit MTT-Reagenz auf den Abschluß der Kultivierung folgend bei einer Wellenlänge von 590 nm bestimmt wurde, wobei die Absorption der Zellmenge entspricht. Die gefüllte Linie stellt die Ergebnisse dar, die erhalten wurden, als hst-1-Mutein N27 allein zugesetzt wurde, die gepunktete Linie stellt die Ergebnisse dar, die erhalten wurden, als hst-1-Mutein N27 zusammen mit 5,0 ug/ml Heparin zugesetzt wurde. Wie in Fig. 9 zu erkennen ist, zeigte im untersuchten Konzentrationsbereich hst-1-Mutein N27 allein keine das Zellwachstum fördernde Wirkung auf HUVE-Zellen, aber in Anwesenheit von 5,0 ug/ml Heparin förderte es ein derartiges Wachstum.

Beispiel 3 (CAM-Test)

Das in Beispiel 1 erhaltene hst-1-Mutein N27 wurde einem CAM- Test (Chorioallantoismembran) durch das Verfahren von Auerbach [Developmental Biology, 41, 391 (1974)] mit einer leichten Abänderung unterzogen. Nachdem ein befruchtetes Hühnerei 3 Tage bei 37ºC in einem Inkubator inkubiert worden war, wurde die Eierschale entfernt, gefolgt von 1 Woche Inkubation bei 37ºC (Napco Kohlendioxid-Inkubator 6300, 0% CO&sub2;, H&sub2;O-gesättigt). Auf eine Polypropylenscheibe mit einem Durchmesser von 6 mm wurden verschiedene Konzentrationen einer Lösung von hst-1-Mutein N27 (hergestellt durch Lösen von hst-1-Mutein N27 in einem 20 mM Tris-HCl, pH 7,4, und 1,0 M NaCl umfassenden Puffer) in einer Menge von 200 ng oder 50 ng getropft. Nachdem die Scheibe in einem Abzug luftgetrocknet worden war, wurde sie auf die Chorioallantoismembran eines Hühnerembryos (CAM) gelegt und 3 Tage bei 37ºC inkubiert und der Stand der Angiogenese wurde beobachtet. Ferner wurden jeweils 10 ug einer wäßrigen, hst-1-Mutein N27 enthaltenden Heparinlösung (hergestellt von Sigma Co.) und als Kontrolle eine Lösung, die kein hst-1-Mutein N27, aber dieselbe Menge Rinderserumalbumin (hergestellt von Sigma Co.) enthielt, auf eine weitere Scheibe getropft. Nachdem jede Scheibe in derselben Weise wie vorstehend luftgetrocknet worden war, wurde sie auf die Chorioallantoismembran eines Hühnerembryos gelegt und inkubiert. Die Ergebnisse werden in Tabelle 4 dargestellt. In Anwesenheit von 200 ng hst-1-Mutein N27 allein erfolgte Angiogenese. Wenn Heparin in Kombination verwendet wurde, erfolgte Angiogenese sowohl in Anwesenheit von 50 ng als auch 200 ng hst-1-Mutein N27 In Anwesenheit von Puffer allein oder Heparin allein erfolgte jedoch fast keine Angiogenese. Tabelle 4 Positive Wertverhältnisse beim CAM-Test (Zahl der positiven Proben/Zahl der gemessenen Proben) Menge hst-1-Mutein N27 oder Rinderserumalbumin (ng) Probe hst-1-Mutein Rinderserumalbumin Heparin

Beispiel 4 (Aminosäurezusammensetzung)

Das in Beispiel 1-d) erhaltene gereinigte hst-1-Mutein N27 (14 ug) wurde zur Hydrolyse in ein Glasreagenzröhrchen überführt. Nachdem die 200-fache Menge (Vol./Gew.) konstant siedende, 4% Thioglykolsäure enthaltende Salzsäure zugesetzt worden war, wurde dieses Reagenzröhrchen unter vermindertem Druck verschlossen, gefolgt von 24 Stunden Hydrolyse bei 110ºC. Nach der Hydrolyse wurde das Röhrchen geöffnet und die Salzsäure wurde unter vermindertem Druck abgedampft. Der Rückstand wurde in 0,02 N Salzsäure gelöst und der Aminosäurenanalyse mittels eines Hitachi 835 Hochleistungs-Aminosäureanalysators unterzogen. Weder Cystin noch Cystein waren in der Analyse enthalten. Die Reste jeder Aminosäure wurden gezählt. Die Ergebnisse werden in Tabelle 5 dargestellt.
Die Zahlen der in Tabelle 5 dargestellten Aminosäurereste stimmen mit der aus der Basensequenz seiner cDNA abgeleiteten Aminosäuresequenz des hst-1-Muteins N27 sehr gut überein. Tabelle 5 Zahl der Aminosäurereste je Molekül Aminosäure für hst-1-Mutein N27 gefundener Wert aus der Basensequenz der cDNA abgeleiteter theoretischer Wert des Aminosäuregehalts von hst-1-Mutein N27

Beispiel 5 (aminoterminale Aminosäuresequenz und carboxyterminale Aminosäurereste)

Eine 28 ug-Portion des in Beispiel 1-d) erhaltenen hst-1-Muteins N27 wurde der N-terminalen Aminosäuresequenzierung mittels eines Gasphasen-Proteinsequenzers (hergestellt von Applied Biosystems Inc., Model 470A) unterzogen. Die sich daraus ergebende Phenylthiohydantoinaminosäure (PTH-Aminosäure) wurde mittels eines von Varian hergestellten Hochleistungsflüssigkeitschromatographen identifiziert und mengenmäßig bestimmt. Die Ergebnisse werden in Tabelle 6 dargestellt. Wie aus diesen Ergebnissen offensichtlich ist, stimmt die aminoterminale Aminosäuresequenz des hst-1- Muteins N27 genau mit der erwarteten, aus der Basensequenz der DNA des Expressionsplasmid abgeleiteten Sequenz überein. Es wurde ferner gefunden, daß das aus dem Translationsstartkodon stammende Methionin entfernt worden ist.
Ferner wurden die Aminosäurereste am Carboxyl-Terminus durch das Hydrazinolyseverfahren untersucht. Wie erwartet wurde in der cDNA-Sequenz Leucin nachgewiesen. Tabelle 6 PTH-Aminosäure Cyclus Aminosäurerest

Beispiel 6 (die DNA-Synthese induzierende Aktivität gereinigten hst-1-Muteins N27)

Die die DNA-Synthese induzierende Aktivität des vorstehend in Beispiel 1-c) erhaltenen gereinigten hst-1-Muteins N27 bei Maus- BALB/c3T3-Zellen wurde durch das in Beispiel 1-e) beschriebene Verfahren bestimmt. Die Ergebnisse werden in Fig. 10 dargestellt.
In Fig. 10 stellt - -, - - und - Δ - die Ergebnisse für aus der Rinderhypophyse stammenden FGF, hst-1-Mutein N27 allein beziehungsweise hst-1-Mutein N27 in Kombination mit Heparin (50 ug/ml) dar. Aus Fig. 10 ist offensichtlich, daß hst-1-Mutein N27 eine derjenigen des aus der Rinderhypophyse stammenden FGF (hergestellt von Takara Shuzo) ähnliche Aktivität besitzt und keine Heparinabhängigkeit zeigt.

Beispiel 7 (das Zellwachstum fördernde Aktivität gereinigten hst-1-Muteins N27)

BALB/c3T3-Zellen wurden in DMEM-Medium (hergestellt von Flow Co.), das mit 5% FCS (hergestellt von MBA) ergänzt war, in einer Linbro-Schale (hergestellt von Flow Co.) eingeimpft. Am nächsten Tag wurde die Kulturbrühe durch mit 0,5% FCS ergänztes DMEM- Medium ersetzt; zur selben Zeit wurde eine Probe zugesetzt. Drei Tage später wurde eine Zählung angestellt. Die Ergebnisse werden in Fig. 11 dargestellt.
H In Fig. 11 stellen - - und ---0--- die Ergebnisse für hst-1- Mutein N27 allein beziehungsweise für hst-1-Mutein N27 in Kombination mit Heparin (50 ug/ml) dar. Aus Fig. 11 ist offensichtlich, daß das hst-1-Mutein N27 eine das Zellwachstum fördernde Aktivität besitzt und durch Heparinzusatz verstärkt wird.
Beispiel 8 (Stabilität unter sauren Bedingungen)
Das in Beispiel 1-c) erhaltene hst-1-Mutein N27 (1 ug/ml) und rhbFGF wurden jeweils bei 37ºC und pH 4,0 gehalten; die Restaktivität wurde regelmäßig durch das Verfahren des Beispiels 1-e) bestimmt. Die Ergebnisse werden in Fig. 12 dargestellt.
In Fig. 12 stellen - 0 - und - - - - die Ergebnisse für hst-1- Mutein N27 beziehungsweise bFGF dar; die Werte sind in % -Verhältnis ausgedrückt, wobei die zu Beginn der Inkubation erhaltene Aktivität als 100% angenommen wird. Diese Ergebnisse zeigen, daß das hst-1-Mutein N27 unter sauren Bedingungen eine größere Stabilität als bFGF behält.

Beispiel 9 (Transformierungsaktivität des hst-1-Muteins N27)

Als Maus-BALB/c3T3-A31-Zellen in Anwesenheit von 10 ng/ml hst-1- Mutein N27 kultiviert wurden, trat eine merkliche morphologische Veränderung wie die bei transformierten Zellen gefundene auf. Als ferner Heparin (25 ug/ml) zugesetzt wurde, trat eine ähnliche morphologische Änderung bei einer hst-1-Mutein N27-Konzentration von 1 ng/ml auf.
Es wurde ferner wie folgt gefunden, daß das hst-1-Mutein N27 eine kolonienbildende Aktivität besitzt: 0,3% Agarmedium, das 10³ BALB/c3T3-Zellen in Suspension besaß, wurde auf 0,5 ml 10% FCS- DMEM-Medium in einer Linbro-Schale geschichtet, das 0,5% Agar (Bactoagar, Difco Co.) enthielt. Etwa 2 Wochen nach der Inkubation in einem CO&sub2;-Inkubator auf die Zugabe von hst-1-Mutein N27 zu 100 bis 1000 ng/ml zum Agarmedium folgend wurde eine Koloniebildung in einer Häufigkeit von 0,5 bis 1 x 10&supmin;² beobachtet.

Beispiel 10 (Wirkung auf die bFGF-Rezeptorbindung)

Die Aminosäuresequenz von hst-1-Mutein N27 der vorliegenden Erfindung ist zu der von bFGF homolog. Es wurde bestimmt, ob hst-1-Mutein N27 die Bindung von bFGF an seinen Rezeptor hemmt. Ein bFGF-Rezeptorbindungsexperiment wurde gemäß dem in einem Bindungstest eines anderen Zellwachstumsfaktors (TGF-B) von Wakefield verwendeten Verfahren [Methods in Enzymology, 146, 167 (1987)] ausgeführt. Ratten-C6-Gliomzellen (von Dainippon Pharmaceutical erworben) wurden als Zielzellen verwendet. Der verwendete radiomarkierte bFGF war von Amersham Co. hergestellter iodmarkierter Rinder-bFGF. Als Kontrolle wurde durch das in der europäischen Patentveröffentlichung Nr. 237 966 beschriebene Verfahren erhaltener menschlicher bFGF (rhbFGF) verwendet. C6- Gliomzellen wurden auf einer Kulturplatte mit 24 Näpfchen kultiviert. Nachdem das Kulturmedium entfernt worden war, wurde ein Bindungsexperimentpuffer (Eagle MEM-Medium, 25 mM HEPES, pH 7,5, 0,15% Gelatine, 5,0 ug/ml Dextransulfat) zugesetzt. 1,7 kBq iodmarkierter bFGF und eine veränderliche Konzentration hst-1- Mutein N27 oder der Kontroll-rhbFGF wurden zum Erzielen einer Menge Reaktionsgemisch von 300 ul zugesetzt, gefolgt von 3 Stunden Reaktion bei 4ºC. Nach Abschluß der Reaktion wurde das Reaktionsgemisch entfernt und die Platte wurde mit Hankscher ausgeglichener Salzlösung gewaschen. Nach dem Löslichmachen der Zellmembran mit einer 0,5%igen Triton-X100-Lösung wurde die Radioaktivität darin mittels eines von Aloka hergestellten Gammastrahlenzählers bestimmt. Getrennt wurde die Radioaktivität in Anwesenheit von 4,0 ug/ml rhbFGF in großem Überschuß in dem Reaktionsgemisch bestimmt. Dieser Wert wurde als unspezifisch bindende Menge von dem vorstehend erhaltenen Radioaktivitätswert abgezogen, um die spezifisch bindende Menge zu berechnen. Diese Menge wurde zum Berechnen der rhbFGF-Konzentration durch die spezifische Radioaktivität der radiomarkierten Substanz geteilt. Getrennt davon wurden die an der Reaktion beteiligten Zellen mittels eines Zellzählers (Coulter-Zähler Modell ZM, Coulter Co.) gezählt. Aus diesen zwei Zahlenwerten wurde die je Zelle gebundene Menge rhbFGF berechnet. Die Ergebnisse werden in Fig. 13 dargestellt. In Fig. 13 zeigt die Abszisse die Konzentration des dem Reaktionsgemisch zugesetzten hst-1-Muteins N27 und die Konzentration des als Kontrolle in dem Bindungsversuch zugesetzten rhbFGF an. Die Ordinate zeigt die aus dem gefundenen Wert der Menge radiomarkierten rhbFGF nach Abschluß der Reaktion berechnete rhbFGF-Bindungsmenge je 10&sup6; an der Reaktion beteiligter Zellen (Femtomol = fMol) an, welche der Menge an den rhbFGF- Rezeptor gebundenem rhbFGF entspricht. Die ausgefüllte Linie zeigt die Ergebnisse für das hst-1-Mutein N27 und die gepunktete Linie zeigt die Ergebnisse für rhbFGF.
Wie aus Fig. 13 offensichtlich ist, zeigte das hst-1-Mutein N27 der vorliegenden Erfindung keine Wirkung auf das Binden von rhbFGF an seinen Rezeptor.

Claims

1. Mutein des Heparin-bindenden, sekretorischen Transformierungsfaktors (hst-1) vom Deletionstyp, dem wenigstens einer der Aminosäurebestandteile 1 bis 47 aus dem N-Terminus des durch die Aminosäuresequenz von Fig. 1 dargestellten hst-1 fehlt und der eine hst-1-Aktivität besitzt.

2. Mutein wie in Anspruch 1 beansprucht, in welchem dem N- Terminus von hst-1 1 bis 47 fortlaufende Reste von Aminosäurebestandteilen fehlen.

3. Mutein wie in Anspruch 1 beansprucht, in welchem dem N- Terminus von hst-1 1 bis 43 fortlaufende Reste von Aminosäurebestandteilen fehlen.

4. Mutein wie in Anspruch 1 beansprucht, in welchem dem Mutein wenigstens einer der Aminosäurebestandteile 1 bis 27 aus dem N- Terminus von hst-1 fehlen.

5. Mutein wie in Anspruch 1 beansprucht, in welchem dem N- Terminus von hst-1 1 bis 27 fortlaufenden Reste von Aminosäurebestandteilen fehlen.

6. Rekombinante DNA mit einer Basensequenz , die für ein Mutein vom Deletionsstyp des Anspruchs 1 kodiert.

7. Vektor, der eine rekombinante DNA des Anspruchs 6 enthält.

8. Transformante, die einen Vektor des Anspruchs 7 beherbergt.

9. Verfahren zum Herstellen eines Muteins des Anspruchs 1, welches das Kultivieren einer Transformanten des Anspruchs 8 umfaßt.