DE69007975T2

DE69007975T2 - Fusionsprotein bestehend aus gm-csf und il-3.

Info

Publication number: DE69007975T2
Application number: DE69007975T
Authority: DE
Inventors: David Cosman; Benson Curtis; Linda Park
Original assignee: Immunex Corp
Current assignee: Immunex Corp
Priority date: 1989-08-22
Filing date: 1990-08-14
Publication date: 1994-07-21
Anticipated expiration: 2010-08-15
Also published as: DK0489116T3; NO920703L; JP3115318B2; EP0489116B1; NO301888B1; WO1991002754A1; DE69007975D1; JPH05500806A; ES2055445T3; AU6424090A; NO920703D0; DD297188A5; EP0489116A1; AU632372B2; ATE103932T1; FI920764A0

Description

Querverweis auf verwandte Anmeldungen

Diese Anmeldung ist eine "continuation-in-part" US-Anmeldung mit der Nr. 397,146, die am 22. August 1989 eingereicht worden ist, und nun anhängig ist.

Hintergrund der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft im allgemeinen Analoge von GM-CSF- und IL-3-Proteinen und betrifft insbesondere die Konstruktion von GM-CSF und IL-3 enthaltenden Fusionsproteinen.
Die Differenzierung und Proliferation von hämatopoetischen Zellen wird durch sekretierte Glycoproteine, die insgesamt als Kolonie-stimulierende Faktoren (CSFs) bekannt sind, reguliert. Bei Menschen beinhalten diese Proteine den Granulozyten-Makrophagen-CSF (GM-CSF), der die Erzeugung von Granulozyten und Makrophagen von normalem Knochenmark fördert und der scheinbar auch die Aktivität von reifen, differenzierten Granulozyten und Makrophagen reguliert. IL-3 (auch bekannt als Multi-CSF) stimuliert auch die Bildung eines breiten Spektrums von hämatopoetischen Zellen, einschließlich Granulozyten, Makrophagen, Eosinophilen, Mastzellen, Megakaryozyten und erythroiden Zellen. Somit weisen GM-CSP und IL-3 eine beträchtliche Überlappung in ihrem breiten Spektrum von biologischen Aktivitäten auf. Andere CSFs weisen einen eingeschränkteren Aktivitätsbereich auf, wobei Makrophagen-CSF (M-CSF) fast ausschließlich die Makrophagen-Koloniebildung stimuliert und Granulozyten-CSF (G-CSF) vor allem Granulocytenkolonien stimuliert. Obwohl GM-CSF und IL-3 unterschiedliche Aminosäuresequenzen aufweisen, zeigen präklinische Studien, daß sie zur Behandlung von verschiedenen Zellmangeln und zur Verstärkung der Immunantwort auf infektiöse Pathogene und zur Unterstützung bei der Wiederherstellung von normalen Blutzellpopulationen nach viraler Infektion oder Bestrahlung oder Chemotherapie-induzierter hämatopoetischer Zellsuppression verwendbar sind. Die GM-CSF und IL-3 codierenden Gene sind auf dem gleichen Chromosom in der Maus und im Menschen lokalisiert und die Expression der Gene ist in einigen Zellen, wie aktivierten T-Lymphozyten, miteinander verknüpft (Kelso et al., J. Immunol. 136:1718, 1986; Yang et al., Blood 71:958, 1988; Barlow et al., EMBO J. 6:617, 1987).
Kurzzeit-Experimente haben gezeigt, daß die gleichzeitige Kombination von GM-CSF und IL-3 bei der Erhöhung der Zyklusration und der Anzahl von hämatopoetischen Vorläuferzellen im Mark in Lactoferrin-behandelten Mäusen in vivo wirksamer war als entweder GM-CSF oder IL-3 alleine (Broxmeyer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:3871, 1987) Klinische Studien haben gezeigt, daß die aufeinanderfolgende Verabreichung von rekombinantem menschlichem IL-3 und rekombinantem menschlichem GM-CSF zur Erhöhung der weißen Blutzellzahlen in normalen Cynomolgusaffen wirksamer war als entweder GM-CSF oder IL-3 alleine (Krumwieh et al., Behring Inst. Mitt. 83:250, 1988; Donahue et al., Science 241:1820, 1988).
Die biologischen Aktivitäten von GM-CSF und IL-3 werden durch Bindung an spezifische Zelloberflächenrezeptoren, die auf Primärzellen und in vitro Zellinien exprimiert werden, übervermittelt. GM-CSF und IL-3 binden an ihren entsprechenden Rezeptor, was eine Weiterleitung eines biologischen Signals zu verschiedenen Immuneffektorzellen zur Folge hat. Frühere Untersuchungen der Eigenschaften und Verteilung des Rezeptors für IL-3 auf der menschlichen myeologenen Leukämiezellinie KG-1 und der menschlichen prä-B Zellinie JM-1 zeigen, daß eine Rezeptorunterklasse exisitiert, die auch GM-CSF bindet (Park et al., J. Biol. Chem. 264:5420, 1989). Diese Untersuchungen zeigten, daß menschliches GM-CSF zur fast vollständigen Inhibierung der Bindung von ¹²&sup5;I-IL-3 an KG-1 Zellen befähigt ist und umgekehrt, daß IL-3 im wesentlichen zur Inhibierung der Bindung von ¹²&sup5;I-GM-CSF an die gleichen Zellen befähigt ist. Diese direkte Konkurrenz zwischen GM-CSF und IL-3 für einen einzelnen Zelloberflächenrezeptor zeigt, daß ein einzelner Rezeptor zur Bindung von sowohl GM-CSF als auch IL-3 befähigt ist. Obwohl es noch nicht eindeutig ist, ob die Heterogenität in der IL-3- und GM-CSF-Bindung auf der Existenz eines Rezeptormoleküls beruht, das unterschiedlich ist zu dem, das IL-3 alleine oder GM-CSF alleine bindet, oder ob IL-3- und GM-CSF- Rezeptoren als Multiuntereinheitenkomplexe existieren, die aus unterschiedlichen Verhältnissen von IL-3 und GM-CSF bindenden Proteinen zusammengesetzt sind, wird (werden) der (die) Rezeptor(en) hier als GM-CSF/IL-3-Rezeptor bezeichnet.

Zusammenfassung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft ein fusioniertes GM-CSF und IL-3 enthaltendes Protein. Die Fusionsproteine weisen eine Formel auf, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus
R&sub1;-R&sub2;, R&sub2;-R&sub1;, R&sub1;-L-R&sub2; und R&sub2;-L-R&sub1;
worin R&sub1; GM-CSF ist, R&sub2; IL-3 ist und L eine Linkerpeptidsequenz ist. In bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung sind GM-CSF und IL-3 über eine Linkersequenz, die nicht die Faltung von entweder GM-CSF- oder IL-3-Domänen stört, miteinander verknüpft.
Die erfindungsgemäßen Fusionsproteine weisen eine größere biologische Aktivität auf als GM-CSF oder IL-3 alleine oder in Kombination und bezogen auf IL-3 weisen sie eine signifikant höhere Bindungsaffinität zu Zellinien auf, die GM- CSF/IL-3-Rezeptoren haben, verglichen mit Zellinien mit nur IL-3- oder GM-CSF-Rezeptoren.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Figur 1 beschreibt eine Nukleotidsequenz und eine korrespondierende Aminosäuresequenz von einem menschlichen GM-CSF/IL- 3-Fusionsprotein. Der C-Terminus des menschlichen GM-CSF (Aminosäuren 1-127) ist mit dem N-Terminus des menschlichen IL-3 (Aminosäuren 139-271) über eine Linkersequenz (Aminosäuren 128-138) verknüpft.
Figur 2 beschreibt eine Nukleotidsequenz und eine korrespondierende Aminosäuresequenz eines menschlichen IL-3/GM-CSF- Fusionsproteins. Der C-Terminus des menschlichen IL-3 (Aminosäuren 1-133) ist mit dem N-Terminus des menschlichen GM-CSF (Aminosäuren 149-275) über eine Linkersequenz (Aminosäuren 134-148) verknüpft.
Figuren 3A-3D sind graphische Darstellungen, die zeigen, daß das GM-CSF/IL-3-Fusionsprotein ( ) die BFU-E (Figur 3A), CFU-GM (Figuren 3B und 3C) und CFU-GEMM (Figur 3D)-Koloniebildung bezogen auf IL-3 ( ) oder GM-CSF ( ) alleine oder auf IL-3 und GM-CSF in Kombination (Δ) erhöht.

Ausführliche Beschreibung der Erfindung

Definitionen

Der Begriff "GM-CSF" betrifft Proteine mit Aminosäuresequenzen, die im wesentlichen ähnlich zu den Aminosäuresequenzen des nativen menschlichen Granuolcyten-Makrophagen-Koloniestimulierenden Faktors (z.B. ATCC 53157) sind und die eine derartige biologische Aktivität aufweisen, die zur Bindung an GM-CSF-Rezeptoren, zur Weiterleitung eines durch die Bindung an GM-CSF-Rezeptoren initiierten biologischen Signals oder zur Kreuzreaktion mit gegen GM-CSF gerichteten Anti-GM- CSF-Antikörpern befähigt sind. Solche Sequenzen sind beispielsweise bei Anderson et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:6250, 1985) beschrieben. Der Begriff "GM-CSF" beinhaltet auch Analoge von GM-CSF-Molekülen, die mindestens eine gemeinsame biologische Aktivität mit nativen menschlichen GM- CSF aufweisen. Exemplarische Analoge von GM-CSF sind in EP- A-212 914 beschrieben, worin GM-CSF-Analoge mit inaktivierten KEX2-Protease-Spaltstellen beschrieben sind, so daß die Expression von GM-CSF in Wirtsorganismen der Hefe erhöht wird, und in WO-89/03881 beschrieben, worin GM-CSF-Analoge mit verschiedenen eliminierten Glycosylierungsstellen beschrieben sind. Andere hier beschriebene GM-CSF-Analoge können auch zur Konstruktion von Fusionsproteinen mit IL-3 verwendet werden. Ferner ist für einen Mutagenese-Fachmann ersichtlich, daß andere Analoge, die noch nicht beschrieben oder noch nicht entdeckt worden sind, zur Konstruktion von hier beschriebenen GM-CSF/IL-3-Fusionsproteinen verwendet werden können. Eine DNA-Sequenz, die ein besonders bevorzugtes GM-CSF-Protein mit entfernten möglichen Glycosylierungsstellen codiert, ist bei der "American Type Culture Collection" unter der Hinterlegungsnummer ATCC 67231 (GM- CSF[Leu²³Asp²&sup7;Glu³&sup9;]) hinterlegt worden. Die hier verwendete Nomenklatur zur Bestimmung von Aminosäuresequenzen bezeichnet Aminosäuren, die von der nativen Form abweichen, in Klammern unmittelbar gefolgt von dem Proteinname und bezeichnet die Arten, mit denen das Protein assoziiert ist, unmittelbar gefolgt von dem Proteinnamen. Somit betrifft huGM-CSF[Leu²³Asp²&sup7;Glu²&sup9;] einen menschlichen GM-CSF, in dem die Aminosäure 23 in einen Leucinrest, die Aminosäure 27 in einen Asparaginrest und die Aminosäure 29 in einen Glutaminsäurerest abgeändert worden sind.
Der Begriff "IL-3" betrifft Proteine mit Aminosäuresequenzen, die im wesentlichen ähnlich zu den Aminosäuresequenzen von nativem menschlichem Interleukin-3 sind und die eine derartige biologische Aktivität aufweisen, daß sie zur Bindung an IL-3-Rezeptoren oder zur Weiterleitung eines durch die Bindung an IL-3-Rezeptoren initiierten biologischen Signals oder zur Kreuzreaktion mit gegen IL-3 gerichteten Anti-IL-3-Antikörpern befähigt sind. Solche Sequenzen sind beispielsweise in EP-A-275 598 und EP-A-282 185 beschrieben. Der Begriff "IL-3" beinhaltet auch Analoge von IL-3-Molekülen, die mindestens eine gemeinsame biologische Aktivität mit nativem IL-3 aufweisen. Exemplarische Analoge von IL-3 sind auch in EP-A-282,185 beschrieben. Besonders bevorzugte Formen von IL-3, die mit GM-CSF gemäß der vorliegenden Erfindung fusioniert werden können, beinhalten huIL- 3[Pro&sup8;Asp¹&sup5;Asp&sup7;&sup0;], huIL-3[Ser&sup8;Asp¹&sup5;Asp&sup7;&sup0;] und huIL-3[Ser&sup8;]. Eine DNA-Sequenz, die ein anderes für den Einbau in hier beschriebene Fusionsproteine geeignetes IL-3-Protein codiert, ist bei ATCC unter der Hinterlegungsnummer ATCC 67747 hinterlegt worden.
Wie hier verwendet, betrifft der Begriff "Fusionsprotein" eine Fusion vom C-Terminus zum- N-Terminus von GM-CSF und IL- 3. Die erfindungsgemäßen Fusionsproteine beinhalten Konstrukte, in denen der C-terminale Teil von GM-CSF an den N- terminalen Teil von IL-3 fusioniert ist und auch Konstrukte, in denen der C-terminale Teil von IL-3 an den N-terminalen Teil von GM-CSF fusioniert ist. Insbesondere weisen die erfindungsgemäßen Fusionsproteine eine Formel auf, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus
R&sub1;-R&sub2;, R&sub2;-R&sub1;, R&sub1;-L-R&sub2; und R&sub2;-L-R&sub1;
worin R&sub1; GM-CSF ist, R&sub2; IL-3 ist und L eine Linkerpeptidsequenz ist. GM-CSF wird so mit IL-3 verknüpft, daß ein einzelnes Protein erzeugt wird, das die biologische Aktivität von GM-CSF und IL-3 beibehält. Spezifische Fusionsproteinkonstrukte sind durch Auflistung der GM-CSF- und IL-3-Domänen in dem Fusionsprotein in der Reihenfolge ihres Auftretens bezeichnet (mit der zuerst bestimmten N-terminalen Domane gefolgt von der C-terminalen Domäne). Somit bezieht sich GM-CSF/IL-3 auf ein Fusionsprotein, das GM-CSF gefolgt von IL-3 enthält (d.h. der C-Terminus von GM-CSF ist mit dem N-Terminus von IL-3 verknüpft). Außer anderweitig bestimmt, beziehen sich die Begriffe GM-CSF/IL-3 und IL-3/GM-CSF auf Fusionsproteine mit einer zusätzlichen Linkersequenz. In ähnlicher Weise bezieht sich huGM-CSF [Leu²³Asp²&sup7;Glu³&sup9;] /huIL-3[Pro&sup8;Asp¹&sup5;Asp&sup7;&sup0;] auf ein Fusionsprotein, in dem die N-terminale Region des Fusionskonstrukts huGM-CSF[Leu²³Asp²&sup7;Glu³&sup9;] ist und die C-terminale Region huIL-3[Pro&sup8;Asp¹&sup5;Asp&sup7;&sup0;] ist.
Der Begriff "im wesentlichen identisch", wenn er zur Definition von entweder Aminosäure- oder Nucleinsäuresequenzen verwendet wird, bedeutet, daß eine bestimmte Grundsequenz, beispielsweise eine mutierte Sequenz, im wesentlichen die volle Länge aufweist und sich von den Sequenzen in Figuren 1 oder 2 durch eine oder mehrere Substitutionen, Deletionen oder Additionen unterscheidet, deren Endeffekt die Beibehaltung der biologischen Aktivität des Proteins ist, wenn es von einem GM-CSF/IL-3- oder IL-3/GM-CSF-Fusionsprotein stammt. Andererseits sind analoge DNA-Sequenzen zu den hier offenbarten spezifischen DNA-Sequenzen "im wesentlichen identisch", wenn (a) die analoge DNA-Sequenz von im wesentlichen den gesamten codierenden Regionen der nativen GM-CSF- und IL-3-Genen von Säugern stammt oder wenn (b) die analoge DNA-Sequenz in der Länge mit DNA-Sequenzen vergleichbar ist und zur Hybridisierung gegen diese DNA-Sequenzen unter (a) moderaten stringenten Bedingungen befähigt ist und die biologisch aktive GM-CSF- oder IL-3-Moleküle codieren, oder wenn (c) DNA-Sequenzen, die als Folge des genetischen Codes degeneriert sind, für in (a) oder (b) definierte analoge DNA-Sequenzen codieren und die biologisch aktive GM-CSF- oder IL-3-Moleküle codieren. Im wesentlichen identische analoge Proteine sind von größer als etwa 80% mit der korrespondierenden Sequenz des nativen Proteins gleich. Sequenzen mit geringeren Gleichheitsgraden, aber vergleichbarer biologischer Aktivität, werden als Äquivalente betrachtet. Bei der Definition von Nucleinsäuresequenzen werden alle Nucleinsäuregrundsequenzen, die zur Codierung von im wesentlichen gleichen Aminosäuresequenzen befähigt sind, als im wesentlichen gleich, bezogen auf die Nucleinsäuresequenz, betrachtet.
Die prozentuale Übereinstimmung kann beispielsweise durch Vergleich der Sequenzinformatian mit dem GAP-Computerprogramm, Version 6.0, erhältlich von der Genetikcomputergruppe der Universität Wisconsin (UWGCG) bestimmt werden. Das GAP- Programm verwendet die Übereinstimmungsmethode von Needleman und Wunsch (J. Mol. Biol. 48:443, 1970), überarbeitet von Smith und Waterman (Adv. Appl. Math. 2:482, 1981). Kurz erläutert definiert das GAP-Programm die Ähnlichkeit als die Anzahl von übereinstimmenden Symbolen (d.h. Nucleotide oder Aminosäuren), die gleich sind, geteilt durch die gesamte Anzahl von Symbolen in der kürzeren der zwei Sequenzen. Die bevorzugten Ausschlußparameter für das GAP-Programm beinhalten: (1) eine einheitliche Vergleichsmatrix (enthaltend einen Wert für 1 für Identität und 0 für keine Identität) für Nucleotide und die gewichtete Vergleichsmatrix von Gribskov und Burgess, Nucl. Acids Res. 14:6745, 1986, wie von Schwartz und Dayhoff, Hrsg., Atlas of Protein Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation, Seiten 353-358, 1979, beschrieben, (2) einen Penalty von 3,0 für jede Lücke und einen zusätzlichen Penalty von 0,10 für jedes Symbol in jeder Lücke, und (3) keinen Penalty für die endständigen Lücken.
Der hier verwendete Begriff "rekombinant" bedeutet, daß ein Protein aus rekombinanten (z.B. mikrobiellen oder Säuger) Expressionssystemen stammt. "Mikrobiell" bezieht sich auf rekombinante Proteine, die in bakteriellen oder Pilz-(z.B. Hefe) Expressionsystemen hergestellt werden. Als Produkt definiert "rekombinant mikrobiell" ein in einem mikrobiellen Expressionssystem erzeugtes Protein, das im wesentlichen frei von nativen endogenen Stoffen ist. Ein in den meisten bakteriellen Kulturen, z.B. E. coli, exprimiertes Protein ist frei von Glycan. Ein in Hefe exprimiertes Protein kann ein Glycosylierungsmuster aufweisen, das zu dem von Säugerzellen exprimierten Proteinen unterschiedlich ist.
Der in der Beschreibung verwendete Begriff "biologisch aktiv" bedeutet, daß ein bestimmtes Molekül eine ausreichende Ähnlichkeit in der Aminosäuresequenz mit den hier offenbarten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung zeigt, um zur Bindung an den GM-CSF-Rezeptor, IL-3-Rezeptor oder GM- CSF/IL-3-Rezeptor (siehe z.B. Park et al., J. Biol. Chem. 264:5420, 1989), zur Weiterleitung eines GM-CSF- und/oder IL-3-Stimulus zu einer Zelle oder zur Kreuzreaktion mit gegen GM-CSF oder IL-3 gerichteten Antikörpern befähigt zu sein.
Der Begriff "DNA-Sequenz" bezieht sich auf ein DNA-Polymer in Form eines separaten Fragments oder eines Bestandteils eines größeren DNA-Konstrukts. Vorzugsweise sind die DNA-Sequenzen in einer Menge oder einer Konzentration vorhanden, die die Identifizierung, Manipulation und Gewinnung der Sequenz und deren Nucleotidsequenzbestandteile durch biochemische Standardmethoden, beispielsweise unter Verwendung eines Clonierungsvektors, ermöglichen. Solche Sequenzen werden vorzugsweise in Form eines offenen Leserasters bereitgestellt, das nicht durch interne nicht-translatierten Sequenzen oder Introns, die typischerweise in eukaryotischen Genen vorhanden sind, unterbrochen ist. Genomische DNA, die die relevanten Sequenzen enthält, kann auch verwendet werden. Sequenzen von nicht-translatierter DNA können 5' oder 3' vom offenen Leseraster vorhanden sein, wo sie nicht die Manipulation oder Expression der codierenden Regionen stören.
Der Begriff "Nucleotidsequenz" bezieht sich auf ein Heteropolymer von Desoxyribonucleotiden. DNA-Sequenzen, die die erfindungsgemäß bereitgestellten Proteine codieren, können aus cDNA-Fragmenten und kurzen Oligonucleotidlinkern oder aus einer Reihe von Oligonucleotiden zusammengefügt werden, um ein synthetisches Gen bereitzustellen, das zur Expression in einer rekombination Transkriptionseinheit befähigt ist.
Der Begriff "rekombinanter Expressionsvektor" bezieht sich auf ein entweder zur Amplifikation oder zur Expression von DNA verwendetes replizierbares DNA-Konstrukt, das die erfindungsgemäßen Fusionsproteine codiert und eine Transkriptionseinheit enthält, die (1) ein genetisches Element oder Elemente mit einer regulatorischen Rolle bei der Genexpression, beispielsweise Promotoren oder Enhancer, (2) eine Struktur- oder codierende Sequenz, die in mRNA transkribiert und in ein Protein translatiert wird, und (3) geeignete Transkriptions- und Translationsintiations- und Terminationssequenzen umfaßt. Strukturelemente, die in Hefe-Expressionssystemen verwendet werden sollen, beinhalten vorzugsweise eine Signalsequenz, die die extrazelluläre Sekretion des translatierten Proteins von einer Wirtszelle ermöglicht. In einer anderen Ausführungsform, wo das rekombinante Protein ohne Signal- oder Transportsequenz exprimiert wird, kann auch ein N-terminaler Methioninrest enthalten sein. Dieser Rest kann gegebenenfalls nachfolgend von dem exprimierten rekombinanten Protein zur Bereitstellung des Endprodukts abgespalten werden. Der Begriff "rekombinantes mikrobielles Expressionssystem" bedeutet eine im wesentlichen homogene Monokultur von geeigneten Wirtsorganismen, beispielsweise Bakterien wie E. coli oder Hefe wie S. cerevisiae, die eine rekombinante Transkriptionseinheit stabil in die chromosomale DNA integriert haben oder die rekombinante Transkriptionseinheit als Bestandteil eines residenten Plasmids tragen. Im allgemeinen sind die System-konstituierenden Zellen die Nachkommen eines einzelnen Stammtransformanten. Die hier definierten rekombinanten Expressionssysteme exprimieren nach der Induktion der regulatorischen Elemente, die mit der zu exprimierenden DNA-Sequenz oder zu exprimierenden synthetischen Gens verknüpft sind, ein heterologes Protein.

Konstruktion von CDNA-Sequenzen, die GM-CSF und IL-3 enthaltende Fusionsproteine codieren

Eine DNA-Sequenz, die ein Fusionsprotein codiert, wird unter Verwendung von rekombinanten DNA-Techniken zur Zusammenfügung separater DNA-Fragmente, die GM-CSF und IL-3 codieren, in einen geeigneten Expressionvektor konstruiert. Das 3'- Ende eines GM-CSF codierenden DNA-Fragments wird an das 5'- Ende des IL-3 codierenden DNA-Fragments ligiert, wobei die Leseraster der Sequenzen in Phase sind, um eine mRNA-Translation der Sequenzen in ein einzelnes biologisch aktives Fusionsprotein zu ermöglichen. Das resultierende Protein ist huGM-CSF[Leu²³Asp²&sup7;Glu³&sup9;]/huIL-3[Pro&sup8;Asp¹&sup5;Asp&sup7;&sup0;]. In einer anderen Ausführungsform kann das 3'-Ende eines IL-3 codierenden DNA-Fragments an das 5'-Ende des GM-CSF codierenden DNA-Fragments ligiert werden, wobei die Leseraster der Sequenzen in Phase sind, um eine mRNA-Translation der Sequenzen in ein einzelnes biologisch aktives Fusionsprotein zu ermöglichen, wobei das Protein huIL-3[Pro&sup8;Asp¹&sup5;Asp&sup7;&sup0;]/GM- CSF[Leu²³Asp²&sup7;Glu³&sup9;] erhalten wird. Die für die Transkription von DNA in mRNA verantwortlichen regulatorischen Elemente werden auf der ersten der zwei DNA-Sequenzen beibehalten, während die Bindungssignale oder Stopcodons, die ein Durchlesen der zweiten DNA-Sequenz verhindern würden, eliminiert werden. Umgekehrt werden die regulatorischen Elemente von der zweiten DNA-Sequenz entfernt, während die für die Beendigung der Translation benötigten Stopcodons beibehalten werden.
In bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung werden Mittel für die Verknüpfung der GM-CSF- und IL-3-Domänen, vorzugsweise über eine Linkersequenz, bereitgestellt. Die Linkersequenz trennt die GM-CSF- und IL-3-Domänen über eine ausreichende Distanz, um sicher zu stellen, daß jede Domäne sich richtig in ihre Sekundär- und Tertiärstrukturen faltet. Geeignete Linkersequenzen (1) nehmen eine flexible ausgestreckte Konfirmation an, (2) zeigen keine Neigung zur Entwicklung einer geordneten Sekundärstruktur, die mit den funktionalen GM-CSF- und IL-3-Domänen in Wechselwirkung treten könnten, und (3) weisen einen minimalen hydrophoben oder geladenen Charakter auf, der eine Wechselwirkung mit den funktionalen Proteindomänen fördern könnte. Typische Oberflächen-Aminosäuren in flexiblen Proteinregionen beinhalten Gly, Asn und Ser. Praktisch jede Permutation der Gly, Asn und Ser enthaltenden Aminosäuresequenzen würde erwartungsgemäß die vorstehenden Kriterien für eine Linkersequenz erfüllen. Andere fast neutrale Aminosäuren, wie Thr und Ala, können auch in der Linkersequenz verwendet werden.
Die Länge der Linkersequenz kann ohne signifikanten Einfluß auf die biologische Aktivität des Fusionsproteins variiert werden. Beispielsweise können die GM-CSF- und IL-3-Proteine direkt ohne eine Linkersequenz fusioniert werden. Linkersequenzen sind nicht nötig, wo die zu fusionierenden Proteine keine essentiellen N- oder C-terminale Aminosäureregionen aufweisen, die zur Trennung der funktionellen Domänen und zur Verhinderung sterischer Einflüsse verwendet werden können. In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kann der C-Terminus von GM-CSF direkt mit dem N- Terminus von IL-3 fusioniert werden. GM-CSF hat 6 Aminosäuren nach dem C-terminalen Cysteinrest, der an der Disulfidbindung beteiligt ist und der für die richtige Faltung des Proteins essentiell ist. IL-3 hat 15 Aminosäuren nach dem N- terminalen Cysteinrest. Somit können die kombinierten terminalen Bereiche eine ausreichende Trennung bereitstellen, um die Verwendung einer Linkersequenz unnötig zu machen.
Im allgemeinen werden die zwei Proteindomänen durch eine Distanz getrennt, die ungefähr gleich zu der Größe der kleinen Einheit von GM-CSF oder IL-3 ist (d.h. ungefähr 0,38 nm, bestimmt durch Analogie mit ähnlichen 4-Helixhormonen). In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird eine Linkersequenz mit einer Länge von etwa 11 Aminosäuren verwendet, um eine geeignete Trennung der funktionellen Proteindomänen bereit zu stellen, obwohl längere Linkersequenzen auch verwendet werden können. Die Länge der GM-CSF und IL-3 trennenden Linkersequenzen ist 1 bis 500 Aminosäuren oder mehr, vorzugsweise 1 bis 100 Aminosäuren. In den am meisten bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung beträgt die Linkersequenz etwa 1-20 Aminosäuren. In hier offenbarten spezifischen Ausführungsformen beträgt die Linkersequenz etwa 5 bis etwa 15 Aminosäuren und vorteilhafterweise etwa 10 bis etwa 15 Aminosäuren. Für GM-CSF- und IL-3 Linker verwendbare Aminosäuresequenzen beeinhalten beispielsweise (Gly&sub4;Ser)&sub3; und Gly&sub4;SerGly&sub5;Ser.
Die Linkersequenz wird in das Fusionsproteinkonstrukt durch bekannte, nachstehend beschriebene Standardmethoden der Mutagenese eingebaut.

Proteine und Analoge

Die vorliegende Erfindung stellt ein menschlichen GM-CSF und menschlichen IL-3 enthaltendes Fusionsprotein bereit. Derivate der erfindungsgemäßen Fusionsproteine beinhalten auch verschiedene strukturelle Formen des Primärproteins, die die biologische Aktivität beibehalten. Aufgrund des Vorhandenseins von ionisierbaren Amino- und Carboxylgruppen kann beispielsweise ein Fusionsprotein in Form von sauren oder basischen Salzen oder in neutraler Form vorliegen. Bestimmte Aminosäurereste können auch durch Oxidation oder Reduktion modifiziert werden.
Die primäre Aminosäurestruktur kann durch Bildung kovalenter oder Aggregat-Konjugaten mit anderen chemischen Resten wie Glycosylgruppen, Lipiden, Phosphatgruppen, Acetylgruppen und dergleichen oder durch Bildung von Aminosäure-Sequenzmutanten modifiziert werden. Kovalente Derivate werden durch Verknüpfung bestimmter funktioneller Gruppen mit Aminosäure- Seitenketten oder an den N- oder C-Termini hergestellt. Andere Derivate des Fusionsproteins, innerhalb dem Schutzbereich der vorliegenden Erfindung, beinhalten kovalente oder Agregat-Konjugate des Fusionsproteins mit anderen Proteinen oder Polypeptiden, wie durch Synthese in rekombinanten Kulturen als N- oder C-terminale Fusionen. Beispielsweise kann das konjugierte Peptid eine Signal- (oder "Leader"-) Polypeptidsequenz an der N-terminalen Region des Proteins sein, die kotranslational oder posttranslational die Überführung des Proteins von seiner Syntheseseite in seine Funktionsseite innerhalb oder außerhalb der Zellmembran oder -wand (z.B. das α-Faktor-Signal der Hefe) lenkt. Peptide können auch zur Erleichterung der Reinigung oder Identifizierung von GM-CSF/IL-3-Fusionsproteinen (z.B. Poly-His) hinzugefügt werden. Die Aminosäuresequenz des Fusionsproteins kann auch mit dem Peptid Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys (DYKDDDDK) (Hopp et al., Bio/Technology 6:1204, 1988) verküpft werden. Die letztere Sequenz ist hoch-antigen und stellt ein Epitop bereit, das reversibel an einen spezifischen monoklonalen Antikörper gebunden wird, wobei ein schneller Test und eine leichte Reinigung des exprimierten rekombinanten Proteins ermöglicht wird. Diese Sequenz wird auch spezifisch durch Rinderschleimhaut-Enterokinase bei dem Rest, der unmittelbar dem Paar Asp-Lys folgt, gespalten. Fusionsproteine mit diesem Cap-Peptid können auch resistent gegen intrazellulären Abbau in E. coli sein.
Die Fusionsproteinderivate können auch als Immunogene, Reagentien in Rezeptor-basierenden Immuntests, oder als Bindungsmittel für Affinitätsreinigungsverfahren von bindenden Liganden verwendet werden. Die Derivate können auch durch quervernetzende Mittel wie M-Maleimidobenzoylsuccinimidester und N-Hydroxysuccinimid bei den Cystein- und Lysinresten erhalten werden. Die Fusionsproteine können auch kovalent über ihre reaktiven Seitengruppen an verschiedene unlösliche Substrate wie Cyanogenbromid-aktivierte, Bisoxiran-aktivierte, Carbonyldiimidazol-aktivierte oder Tosyl-aktivierte Agarosestrukturen oder durch Adsorbtion an Polyolefinoberflächen (mit oder ohne Glutaraldehyd-Quervernetzung) gebunden werden.
Die vorliegende Erfindung beinhaltet auch Proteine mit oder ohne assoziierte native Glycosylierungsmuster. Die Expression von Fusionsprotein-codierenden DNAs in Bakterien wie E. coli stellt nicht-glycosylierte Moleküle bereit. Funktionelle mutierte Analoge mit inaktivierten N-Glycosylierungsstellen können durch Oligonucleotidsynthese und Ligierung oder durch ortsspezifische Mutagenesetechniken hergestellt werden. Diese analogen Proteine können in einer homogenen, reduzierten Kohlehydratform in guten Ausbeuten unter Verwendung von Hefeexpressionssystemen hergestellt werden. N-Glycosylierungsstellen in eukaryotischen Proteinen sind durch das Aminosäuretriplet Asn-A&sub1;-Z, worin A&sub1; irgendeine Aminosäure außer Pro ist und Z Ser oder Thr ist, gekennzeichnet. In dieser Sequenz stellt Asparagin eine Seitenkettenaminogruppe für die kovalente Bindung von Kohlehydraten bereit. Eine solche Stelle kann durch Substitution einer anderen Aminosäure für Asn oder für den Rest Z, durch Deletion von Asn oder Z oder durch Einfügen einer nicht-Z-Aminosäure zwischen A&sub1; und Z oder einer Aminosäure, die anders als Asn ist, zwischen Asn und A&sub1; eliminiert werden. Beispiele menschlicher GM-CSF-Analoge, in denen die Glycosylierungsstellen entfernt worden sind, beinhalten huGM- CSF[Leu²³Asp²&sup7;Glu³&sup9;], huGM-CSF[Leu²³], huGM-CSF[Leu²³Asp²&sup7;], huGM-CSF[Glu³&sup9;], huGM-CSF[Asp²&sup7;Glu³&sup9;], huGM-CSF[Leu²³Glu³&sup9;] und huGM-CSF[Asp²&sup7;]. Beispiele menschlicher IL-3-Analoge, in denen die Glycosylierungsstellen entfernt worden sind, beinhalten huIL-3[Pro&sup8;Asp¹&sup5;Asp&sup7;&sup0;], huIL-3[Asp&sup7;&sup0;], huIL- 3[Asp¹&sup5;Asp&sup7;&sup0;], huIL- [Pro&sup8;Asp¹&sup5;], huIL-3[Pro&sup8;Asp&sup7;&sup0;] und huIL-3[Asp¹&sup5;].
Derivate und Analoge können auch durch Mutationen des Fusionsproteins erhalten werden. Ein hier beschriebenes Derivat oder Analoges ist ein Polypeptid, in dem die GM-CSF- und IL- 3-Domänen im wesentlichen homolog zu den GM-CSF- und IL-3- Domänen mit voller Länge der in Figuren 1 und 2 offenbarten Sequenzen sind, aber das ein Unterschied der Aminosäuresequenz aufweist, die auf eine Deletion, Insertion oder Subsitution zurückführbar ist.
Bioäquivalente Analoge der Fusionsproteine können beispielsweise durch Ausführen verschiedener Substitutionen der Reste oder Sequenzen konstruiert werden. Beispielsweise können Cysteinreste deletiert oder durch andere Aminosäuren ersetzt werden, um die Bildung von nicht korrekten intramolekularen Disulfidbrücken nach der Renaturierung zu verhindern. Andere Ansätze für die Mutagenese führen die Modifizierung von benachbarten dibasischen Aminosäureresten zur Erhöhung der Expression in Hefesystemen, in denen eine KEX2-Proteaseaktivität vorhanden ist, ein. Im allgemeinen sollten die Substitutionen konservativ gemacht werden; d.h. die am meisten bevorzugten Aminosäuren für die Substitution sind solche mit physikochemischen Eigenschaften, die denen der zu ersetzenden Reste gleichen. In ähnlicher Weise, wenn eine Deletions- oder Insertionsstrategie gewählt wird, sollte die mögliche Wirkung der Deletion oder Insertion auf die biologische Aktivität in Betracht gezogen werden.
Mutationen in den für die Expression von Analogen konstruierten Nucleotidsequenzen müssen natürlich die Leserasterphase der codierenden Sequenzen beibehalten und bilden vorzugsweise keine komplementären Regionen, die zur Erzeugung von sekundären mRNA-Strukturen wie Schleifen ("loops") oder Haarnadeln ("hairpins"), die die Translation der GM-CSF/IL- 3-Rezeptor mRNA gegenteilig beinflußen würden, hybridisieren könnten. Obwohl eine Mutationsstelle vorbestimmt sein kann, ist es nicht nötig, daß die Mutationsart selbst vorbestimmt ist. Beispielsweise, um auf beste Eigenschaften von Mutanten bei einer gegebenen Stelle zu selektieren, kann eine Zufallsmutagenese bei dem Zielcodon durchgeführt werden und die exprimierten Mutanten können auf die gewünschte Aktivität abgesucht werden.
Nicht alle Mutationen in Nucleotidsequenzen, die die GM-CSF und IL-3 enthaltenden Fusionsproteine codieren, werden in ein Endprodukt exprimiert, beispielsweise können Nucleotidsubstitutionen zur Erhöhung der Expression, vor allem zur Vermeidung von Sekundärstrukturschleifen in der transkribierten mRNA (siehe EP-A-75 444) oder zur Bereitstellung von Codons, die leichter durch den ausgewählten Wirt translatiert werden, z.B. die gut bekannten bevorzugten E. coli Codons für die E. coli Expression, hergestellt werden.
Mutationen können bei bestimmten Loci durch Synthese von Oligonucleotiden eingeführt werden, die eine mutierte Sequenz, flankiert von Restriktionsstellen die Ligierung mit Fragmenten der nativen Sequenz ermöglichen, enthalten. Nach der Ligierung codiert die resultierende rekonstruierte Sequenz ein Analoges mit der gewünschten Aminosäureinsertion, -substitution oder -deletion.
In einer anderen Ausführungsform können Oligonucleotid-gerichtete ortsspezifische Mutageneseverfahren zur Bereitstellung eines geänderten Gens mit bestimmten Codons, die gemäß der benötigten Substitution, Deletion oder Insertion abgeändert sind, verwendet werden. Exemplarische Methoden zur Herstellung der vorstehend aufgeführten Änderungen sind von Walder et al. (Gene 42:133, 1986), Bauer et al. (Gene 37:73, 1985), Craik (BioTechniques, January 1985, 12-19), Smith et al. (Genetic Engineering: Principles and Methods, Plenum Press, 1981) und in den US-Patenten 4,518,584 und 4,737,462 beschrieben.

Expression von rekombinanten GM-CSF und IL-3 enthaltenden Fusionsproteinen

Die vorliegende Erfindung stellt rekombinante Expressionsvektoren bereit, die synthetische oder von cDNA stammende DNA-Fragmente umfassen, die menschliche GM-CSF und IL-3 oder bioäquivalente Analoge enthaltende Fusionsproteine codieren, funktionell verknüpft mit geeigneten transkriptionalen oder translationalen regulatorischen Elementen, die von Säuger-, mikrobiellen, viralen oder Insektengenen stammen. Solche regulatorischen Elemente beinhalten einen transkriptionalen Promotor, eine fakultative Operatorsequenz für die Transkriptionskontrolle, eine Sequenz, die geeignete mRNA-ribosomale Bindungsstellen codiert, und Sequenzen, die die Termination der Transkription und Translation, wie nachstehend detailliert beschrieben, kontrolliert. Die Fähigkeit zur Replikation in einem Wirt, gewöhnlicherweise durch einen Replikationsursprung übertragen, und eines Selektionsgens zur Erleichterung der Erkennung von Transformanten können zusätzlich eingebaut werden. DNA-Bereiche sind funktional verknüpft, wenn sie hinsichtlich für jede andere Region einen funktionellen Bezug aufweisen. Beispielsweise ist eine DNA für ein Signalpeptid ("sekretorischer Leader") funktionell mit einer DNA für ein Polypeptid verknüpft, wenn sie als ein Vorläufer exprimiert wird, der an der Sekretion des Polypeptids teilnimmt; ein Promotor ist mit einer codierenden Sequenz funktionell verknüpft, wenn er die Transkription der Sequenz kontrolliert; oder eine ribosomale Bindungsstelle ist mit einer codierenden Sequenz funktionell verknüpft, wenn sie so positioniert ist, daß die Translation ermöglicht wird. Im allgemeinen bedeutet funktionell verknüpft "angrenzend" und, im Falle von sekretorischen Signalsequenzen, "angrenzend und im Leseraster".
Aufgrund der Degeneration des Codes kann eine beträchtliche Variation in den Nucleotidsequenzen, die die gleiche Aminosäuresequenz codieren, auftreten; exemplarische DNA-Ausführungsformen sind solche, die den in Figuren 1 oder 2 gezeigten Nucleotidsequenzen entsprechen. Andere Ausführungsformen beinhalten Sequenzen, die eine vergleichbare Länge aufweisen und zur Hybridisierung mit den Sequenzen von Figuren 1 oder 2 unter moderaten stringenten Bedingungen (50ºC, 2 x SSC) befähigt sind und die biologisch aktive Fusionsproteine codieren.
Transformierte Wirtszellen sind Zellen, die mit den unter Verwendung von rekombinanten DNA-Techniken konstruierten Fusionsproteinvektoren transformiert oder transfiziert worden sind. Transformierte Wirtszellen exprimieren gewöhnlicherweise das gewünschte Fusionsprotein, aber für die Zwecke der Klonierung oder Amplifizierung von DNA transformierte Wirtszellen müssen das Protein nicht exprimieren. Exprimierte Fusionsproteine werden im allgemeinen in den Kulturüberstand sekretiert. Geeignete Wirtszellen für die Expression eines Fusionsproteins beinhalten Prokaryonten, Hefe oder höhere eukaryotische Zellen unter der Kontrolle von geeigneten Promotoren. Prokaryonten enthalten Gram-negative oder Gram-positive Organismen, beispielsweise E. coli oder Bacili. Höhere eukaryotische Zellen beinhalten etablierte Zellinien einer Säugerherkunft wie nachstehend beschrieben. Zellfreie Translationssysteme können auch verwendet werden, um Fusionsproteine unter Verwendung von aus den erfindungsgemäßen DNA-Konstrukten stammenden RNAs hergestellt zu werden. Geeignete Klonierungs- und Expressionsvektoren für die Verwendung in zellulären Wirten von Bakterien, Pilzen, Hefen und Säugern sind in Pouwels et al. (Cloning Vectors: A Laboratoy Manual, Elsevier, New York, 1985) beschrieben, dessen relevanter Offenbarungsgehalt hier durch Bezugnahme enthalten ist.
Prokaryotische Expressionswirte können für die Expression eines Fusionsproteins verwendet werden, das keine extensive proteolytische und Disulfid-Prozessierung benötigt. Prokaryotische Expressionsvektoren umfassen im allgemeinen einen oder mehrere phenotypische selektierbare Marker, beispielsweise ein Gen, das eine Antibiotikaresistenz-verleihende oder eine autotrophe Anforderung-bereitstellende Proteine codiert, und einen Replikationsursprung, der von dem Wirt erkannt wird, um die Amplifizierung in dem Wirt zu gewährleisten. Geeignete prokaryotische Wirte für die Transformation beinhalten E. coli, Bacillus subtilis, Salmonella typhimurium und verschiedene Arten innerhalb der Gattung Pseudomonas, Streptomyces und Staphyolococcus, obwohl andere auch nach Wahl verwendet werden können.
Geeignete Expressionsvektoren für die bakterielle Verwendung können einen selektierbaren Marker und einen bakteriellen Replikationsursprung, die von im Handel erhältlichen Plasmiden abstammen, die genetische Elemente des bekannten Klonierungsvektors pBR322 (ATCC37017) enthalten, umfassen. Solche im Handel erhältlichen Vektoren beinhalten beispielsweise pKK223-3 (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Schweden) und pGEM1 (Promega Biotec, Madison, WI, USA). Diese pBR322 "Rückgrat"-Abschnitte werden mit einem geeigneten Promotor und der zu exprimierenden Struktursequenz kombiniert. E. coli wird typischerweise mit Derivaten von pBR322, einem von einer E. coli-Art abstammenden Plasmid (Bolivar et al., Gene 2:95, 1977), transformiert. pBR322 enthält Gene für Ampicillin- und Tetracyclinresistenz und stellt somit einfache Mittel für die Identifizierung der transformierten Zellen bereit.
Üblicherweise in rekombinanten mikrobiellen Expressionsvektoren verwendete Promotoren beinhalten die b-Lactamase (Penicillinase) und das Lactose-Promotorsystem (Chang et al., Nature 275:615, 1978 und Goeddel et al., Nature 281:544, 1979), das Tryptophan (trp)-Promotorsystem (Goeddel et al., Nucl. Acids Res. 8:4057,1980 und EP-A-36,776) und den tac-Promotor (Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory, Seite 412, 1982). Ein speziell verwendbares Expressionssystem verwendet den Phage λ-PL-Promotor und den cI857ts-thermoinduzierbaren Repressor. Von der "American Type Culture Collection" erhältliche Plasmidvektoren, die Derivate des λ-PL-Promotors einbauen, beinhalten das Plasmid pHUB2, das im E. coli-Stamm JMB9 (ATCC 37092) resident ist, und pPLc28, das in E. coli RR1 (ATCC 53082) resident ist.
Rekombinante Fusionsproteine können auch in Hefewirtszellen, vorzugsweise von Saccharomyces-Arten, wie S. cervisiae, exprimiert werden. Hefen anderer Gattungen wie Pichia oder Kluyveromyces können auch verwendet werden. Hefevektoren enthalten im allgemeinen einen Replikationsursprung aus dem 2m-Hefeplasmid oder eine autonom replizierende Sequenz (ARS), einen Promotor, eine das Fusionsprotein codierende DNA, Sequenzen für die Polyadenylierung und der Transkriptiontermination und ein Selektionsgen. Vorzugsweise werden Hefevektoren einen Replikationsursprung und einen selektierbaren Marker enthalten, die die Transformation von sowohl Hefe als auch E. coli ermöglicht, z.B. das Ampicillinresistenzgen von E. coli und S. cervisiae trp1-Gen, das einen Selektionsmarker für einen mutierten Hefestamm, dem die Fähigkeit zum Wachstum in Tryptophan fehlt, und einen Promotor, der aus einem hochexprimierten Hefegen stammt, um die Transkription einer Struktursequenz stromabwärts zu induzieren, bereitstellt. Das Vorhandensein der trp1-Läsion in dem Hefewirtszellgenoms stellt dann eine wirksame Umgebung zum Nachweis der Transformation durch Wachstum in Abwesenheit von Tryptophan bereit.
Geeignete Promotorsequenzen in Hefevektoren beinhalten die Promotoren von Metallthionin, 3-Phosphoglyceratkinase (Hitzeman et al., J. Biol. Chem. 255:2073, 1980) oder andere glycolytische Enzyme (Hess et al., J. Adv. Enzyme Reg. 7:149, 1968 und Holland et al., Biochem. 17:4900, 1978), wie Enolase, Glyceraldehyd-3-Phosphatdehydrogenase, Hexokinase, Pyruvatdecarboxylase, Phosphofructokinase, Glucose-6-Phosphatisomerase, 3-Phosphoglyceratmutase, Pyruvatkinase, Triosephosphatisomerase, Phosphoglukoseisomerase und Glucokinase. Geeignete Vektoren und Promotoren zur Verwendung bei der Hefeexpression werden ferner in R. Hitzeman et al., EP- A-73 657 beschrieben.
Bevorzugte Hefevektoren können unter Verwendung von DNA-Sequenzen aus pBR322 für die Selektion und Replikation in E. coli (Ampr-Gen und Replikationsursprung) und aus Hefe-DNA- Sequenzen, die einen Glukose-repressierbaren ADH2-Promotor und ein α-Faktor-Sekretionssignal umfassen, zusammengefügt werden. Der ADH2-Promotor wurde von Russell et al. (J. Biol. Chem. 258:2674, 1982) und Beier et all (Nature 300:724, 1982) beschrieben. Das Hefe-α-Faktorsignal, das die Sekretion von heterologen Proteinen steuert, kann zwischen dem Promotor und dem zu exprimierenden Strukturgen insertiert werden; siehe z.B. Kurjan et al., Cell 30:933, 1982 und Bitter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:5330, 1984. Die Signalsequenzen können modifiziert werden, um nahe am 3'- Ende eine oder mehrere geeignete Restriktionsstellen zur Erleichterung der Fusion der Signalsequenz mit fremden Genen zu enthalten.
Geeignete Hefe-Transformationsverfahren sind dem Fachmann bekannt: eine exemplarische Technik ist von Hinnen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75:1929, 1978 beschrieben, worin für Trp&spplus;-Transformanten in einem selektiven Medium, das aus 0,67% Hefestickstoffbase, 0,5% Casaminosäuren, 2% Glukose, 10 ug/ml Adenin und 20 ug/ml Uracil besteht, selektiert wird.
Wirtsstämme, die durch ADH2-Promotor enthaltende Vektoren transformiert worden sind, können für die Expression in einem Vollmedium, das aus 1% Hefeextrakt, 2% Pepton und 1% Glukose, versetzt mit 80 ug/ml Adenin und 80 ug/ml Uracil, besteht, gezüchtet werden. Die Derepression des ADH2-Promotors findet nach dem Verbrauch der Glukose im Medium statt. Die Hefe-Rohüberstände werden durch Filtration geerntet und bei 4ºC vor der weiteren Reinigung gehalten.
Verschiedene Säuger- oder Insekten-Zellkultursysteme können auch zur Expression rekombinanter Proteine verwendet werden. Baculovirussysteme zur Herstellung von heterologen Proteinen in Insektenzellen werden von Luckow und Summers, Bio/Technology 6:47 (1988) beschrieben. Beispiele von geeigneten Säugerwirtszellinien beinhalten die COS-7-Linien von Affennierenzellen, beschrieben von Gluzman (Cell 23:175, 1981) und andere, zur Expression eines geeigneten Vektors befähigte Zellinien, die beispielsweise L-Zellen, C127, 3T3, Ovarien des chinesischen Hamsters (CHO), HeLa- und BHK-Zellinien beinhalten. Säugerexpressionsvektoren können nichttranskribierte Elemente wie einen Replikationsursprung, einen geeigneten Promotor und Enhancer, die mit dem zu exprimierenden Gen verknüpft sind, und andere 5'- oder 3'- flankierende nicht-translatierte Sequenzen und 5' oder 3' nicht-tranlatierte Sequenzen, wie notwendige ribosomale Bindungsstellen, eine Polyadenylierungsstelle, Donor- und Akzeptorstellen für die Spaltung ("splicing") und transkriptionale Terminationssequenzen, umfassen.
Die transkriptionalen und translationalen Kontrollsequenzen in den zu verwendenden Expressionsvektoren bei der Transformation von Vertebratenzellen können auch durch virale Quellen bereitgestellt werden. Beispielsweise stammen üblicherweise verwendete Promotoren und Enhancer von Polyoma, Adenovirus 2, Simianvirus 40 (SV40) und dem menschlichem Cytomegalovirus. Die von dem SV40 viralen Genom stammenden DNA-Sequenzen, beispielsweise der SV40-Ursprung, die frühen und späten Promotoren, Enhancer, Spalt("Splice")stellen und Polyadenylierungsstellen, können zur Bereitstellung der anderen genetischen Elemente, die für die Expression einer heterologen DNA-Sequenz benötigt werden, verwendet werden. Die frühen und späten Promotoren sind besonders geeignet, weil beide leicht aus dem Virus als ein Fragment, das auch den SV40 viralen Replikationsursprung enthält (Fiers et al., Nature 273:113, 1978), erhalten werden. Kleinere oder größere SV40-Fragmente können auch verwendet werden, mit der Maßgabe, daß die etwa 250 bp-Sequenz enthalten ist, die von der HindIII-Stelle bis zur BglI-Stelle, die in dem viralen Replikationsursprung lokalisiert sind, geht, reicht. Exemplarische Vektoren können, wie bei Okayama und Berg (Mol. Cell. Biol. 3:280, 1983) beschrieben, konstruiert werden.
Ein verwendbares System für eine stabile hohe Expression von Rezeptor cDNAs von Säugern in C127-Brustepithelialzellen der Maus kann im wesentlichen, wie bei Cosman et al. (Mol. Immunol. 23:935, 1986) beschrieben, konstruiert werden.
Besonders bevorzugte eukaryotische Vektoren für die Expression von GM-CSF/IL-3 DNA beinhalten pIXY321 und pIXY344, die beide Hefe-Expressionsvektoren sind, die von pBC102.K22 (ATCC 67,255) stammen, und DNA-Sequenzen von pBR322 zur Selektion und Replikation in E. coli (Apr-Gen und Replikationsursprung) und Hefe, wie nachstehend in den Beispielen 1 und 7 beschrieben, enthalten.
Gereinigte Säuger-Fusionsproteine oder Analoge werden durch Züchtung geeigneter Wirt-/Vektorsysteme zur Expression der rekombinanten Translationsprodukte der erfindungsgemäßen DNAs hergestellt, die anschließend aus den Kulturmedien oder Zellextrakten gereinigt werden.
Beispielsweise können die Überstände aus Systemen, die rekombinante Proteine in die Kulturmedien sekretieren, zuerst unter Verwendung eines im Handel erhältlichen Proteinkonzentrationsfilters, beispielsweise eine Amicon oder Millipore Pellicon Ultrafiltrationseinheit, konzentriert werden. Nach dem Konzentrationsschritt kann das Konzentrat auf eine geeignete Trennmatrix aufgebracht werden. Beispielsweise kann eine geeignete Affinitätsmatrix einen GM-CSF- oder IL-3-Rezeptor oder Lectin oder ein an einen geeigneten Träger gebundenes Antikörpermolekül enthalten. In einer anderen Ausführungsform kann ein Anionenaustauscherharz verwendet werden, beispielsweise eine Matrix oder ein Substrat mit gebundenen Diethylaminoethyl(DEAE)-Gruppen. Die Matrizes können Acrylamid, Agarose, Dextran, Cellulose oder andere Typen, die üblicherweise bei der Proteinreinigung verwendet werden, sein. In einer anderen Ausführungsform kann ein Kationenaustauscherschritt verwendet werden. Geeignete Kationenaustauscher beinhalten verschiedene unlösliche Matrizes, die Sulfopropyl- oder Carboxymethylgruppen enthalten. Sulfopropyl-Gruppen sind bevorzugt.
Schließlich können eine oder mehrere Hochleistungsflussigkeitschromatographie (RP-HPLC) -Schritte mit Umkehrphase unter Verwendung hydrophober RP-HPLC-Medien, z.B. Silikagel mit gebundenen Methyl- oder anderen aliphatischen Gruppen, zur weiteren Reinigung einer Fusionsproteinzusammensetzung verwendet werden. Einige oder alle der vorstehenden Reinigungsschritte, in verschiedenen Kombinationen, können auch zur Bereitstellung eines homogenen rekombinanten Proteins verwendet werden.
Ein rekombinantes in einer Bakterienkultur erzeugtes Protein wird gewöhnlicherweise durch eine erste Extraktion aus dem Zellniederschlag und anschließend durch einen oder mehrere Konzentrations-Aussalzungs-, wässrige Austausch- oder Größenausschlußchromatographieschritte isoliert. Schließlich kann eine Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) für die letzten Reinigungsschritte verwendet werden. Mikrobielle für die Expression der rekombinanten Fusionsproteine verwendete Zellen können durch eine geeignete Methode, dem "Gefrier-Auftauzyklus", Schallbehandlung, mechanischem Aufschluß, oder unter Verwendung von zellysierenden Mitteln aufgeschlossen werden.
Die Fermentation von Hefe, die die Fusionsproteine als ein sekretiertes Protein exprimiert, vereinfacht in großem Ausmaß die Reinigung. Ein sekretiertes rekombinantes Protein, das aus einer großindustriellen Fermentation resultiert, kann mit Methoden, die zu denen bei Urdal et al. (J. Chromatog. 296:171, 1984) beschriebenen analog sind, gereinigt werden. Diese Referenz beschreibt zwei sequenzielle HPLC- Schritte mit Umkehrphase für die Reinigung von rekombinanten GM-CSF der Maus auf einer präparativen HPLC-Säule.
In einer rekombinanten Kultur synthetisiertes Fusionsprotein ist durch das Vorhandensein von nicht-menschlichen Zellkomponenten, einschließlich Proteinen, in Mengen und von einer Eigenschaft gekennzeichnet, die von den verwendeten Reiningungsschritten zur Gewinnung des Fusionsproteins aus der Kultur abhängen. Die Komponenten sind gewöhnlicherweise von Hefe-, prokaryotischem oder nicht-menschlichem höheren eukaryotischen Ursprung und sind vorzugsweise in unschädlichen verunreinigenden Mengen in der Größenordnung von weniger als etwa 5%, bestimmt durch Abtastdensitometrie oder Chromatographie vorhanden. Ferner ermöglicht die rekombinante Zellkultur die Herstellung des Fusionsproteins ohne Proteine, die normalerweise mit GM-CSF oder IL-3 assoziiert sind, wie sie in der Natur in ihren entsprechenden Ursprungsarten, z.B. in Zellen, Zellabsonderungen oder Körperflüssigkeiten, gefunden werden.
Fusionsprotein-Zusammensetzungen werden zur Verabreichung durch Mischen des Fusionsproteins mit dem gewünschten Reinheitsgrad mit physiologisch verträglichen Trägern hergestellt. Solche Träger sind bei den verwendeten Dosierungen und Konzentrationen nicht-toxisch für die Empfänger. Gewöhnlicherweise erfordert die Präparation solcher Zusammensetzungen die Kombination des Fusionsproteins mit Puffern, Antioxidationsmitteln, wie Ascorbinsäure, Polypeptiden niederen Molekulargewichts (weniger als etwa zehn Reste), Proteinen, Aminosäuren, Kohlenhydrate einschließlich Glukose, Saccharose oder Dextrinen, Chelatierungsmitteln wie EDTA, Glutathion oder anderen Stabilisierungsmitteln oder Exzipientien.
Fusionsprotein-Zusammensetzungen können zur Erhöhung der Proliferation, der Differenzierung und funktionellen Aktivierung von hämatopoetischen Vorläuferzellen wie Knochenmarkszellen, verwendet werden. Insbesondere können die Fusionsproteine enthaltenden Zusammensetzungen zur Erhöhung der peripheren Blut-Leukozytenzahl und zur Erhöhung der zirkulierenden Granulozytenzahl in myelounterdrückten Patienten verwendet werden. Zur Erreichung dieses Ergebnisses wird eine therapeutisch wirksame Menge einer Fusionsprotein-Zusammensetzung einem Säuger, vorzugsweise einem Menschen, in Verbindung mit einem pharmazeutischen Träger oder Verdünnungsmittel verabreicht.
Die folgenden Beispiele werden zur weiteren Erläuterung bereitgestellt und bedeuten keine Einschränkung.

BEISPIELE

Beispiel 1

Synthese von cDNAs, die GM-CSF/IL-3 Fusionsproteine codieren

A. Isolierung von huIL-3 codierender cDNA.

Periphere Blut- Lymphozyten wurden aus von Vollblut hergestellten Leukozytenfilm durch Ficoll-Hypaque-Dichtezentrifugation isoliert (Portland Red Cross, Portland, Oregon, USA). T-Zellen wurden durch Rosettenbildung mit 2-Aminoethylthiobromiumbromid behandelten roten Blutzellen vom Schaf isoliert. Die Zellen wurden in 175 cm² Kolbenen mit 5 x 106 Zellen/ml für 18 Stunden in 100 RPMI, 10% fötalem Kälberserum, 50 uM β-Mercaptoethanol, 1% Phytohemaglutinin (PHA) und 10 ng/ml Phorbol-12-Myristat-13-acetat (PMA) gezüchtet. RNA wurde durch die Guanidinium-CsCL-Methode extrahiert und poly A&spplus;-RNA wurde durch die Oligo-dT-Cellulosechromatographie hergestellt (Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, 1982). cDNA wurde aus poly A&spplus;-RNA im wesentlichen wie bei Gubler und Hoffmann, Gene 25:263-269 (1983), beschrieben hergestellt. Die cDNA wurde mit DNA-Polymerase I doppelsträngig gemacht, mit T4-DNA-Polymerase mit glatten Enden versehen, mit EcoR1-Methylase zum Schutz von EcoR1-Spaltstellen innerhalb der cDNA methyliert und mit EcoR1-Linkern ligiert. Diese Konstrukte wurden mit EcoR1 zur Entfernung aller, außer einer Kopie der Linker an jedem Ende der cDNA, abgebaut, mit EcoR1-gespaltenen und dephosphorylierten Armen des Phagen λgt10 ligiert (Huynh et al., DNA Cloning: A Practical Approach, Glover, Hrsg., IRL Press, S. 49-78) und in λ-Phageneextrakte (Stratagene, San Diego, CA, USA) nach der Anleitung des Herstellers verpackt. 500.000 Rekombinante wurden auf E. coli-Stamm C600hf1&supmin; plattiert und durch Standardplaque-Hybridisierungstechniken mit den folgenden Sonden abgesucht.
Zwei Oligonucleotide wurden mit zu ausgewählten 5'- und 3'- Sequenzen des huIL-3 Gens komplementären Sequenzen synthetisiert. Die zu einer, einen Teil der huIL-3 Signalsequenz codierenden Sequenz komplentären 5'-Sonde zeigte die Sequenz 5'-GAGTTGGAGCAGGAGCAGGAC-3'. Die einer Aminosäuren 123-130 des reifen Proteins codierende Region entsprechenden 3'- Sonde zeigte die Sequenz 5'-GATCGCGAGGCTCAAAGTCGT-3'. Die Synthesemethode war eine standardisierte automatische Triestermethode, im wesentlichen ähnlich zu der in Sood et al., Nucl. Acids Res. 4:2557 (1977) und Hirose et al., Tet. Lett. 28:2449 (1978) beschriebenen. Nach der Synthese wurden die Oligonucleotide deblockiert und durch präparative Gelelektrophorese gereinigt. Für die Verwendung als Sonden zum Absuchen wurden die Oligonucleotide terminal mit ³²P-ATP und T4-Polynucleotidkinase unter Verwendung von Techniken, die ähnlich zu denen in Maniatis et al. beschrieben sind, radioaktiv markiert. Der für das Absuchen der Genbank verwendete E. coli-Stamm war C600hlf&supmin; (Huynh et al., 1985, supra).
Dreizehn positive Plaques wurden gereinigt und nochmals mit zwei Hybridisierungssonden getestet. Elf Clone hybridisierten mit beiden Oligonucleotiden. Die cDNA-Insertionen aus einigen positiven rekombinanten Phagen wurden in ein EcoR1- gespaltenes Derivat (pGEMBL18) des Standard-Clonierungsvektors pBR322, das einen Polylinker mit einer einzigen EcoR1- Spaltstelle, einer BamH1-Spaltstelle und verschiedene andere einzeln vorkommende Spaltstellen enthält, subcloniert. Ein beispielhafter Vektor dieses Typs, pGEMBL, ist von Dente et al., Nucl. Acids Res. 11:1645 (1983) beschrieben, in dem die Promotoren für SP6- und T7-Polymerasen die multiplen Clonierungsstellen flankieren. Die Nucleotidsequenzen der selektierten Clone wurden durch das Kettenabbruchverfahren bestimmt. Insbesondere der teilweise EcoR1-Abbau der GT10:IL3-Clone 2, 3, 4 und 5 ergab Fragmente, die eine Länge von 850 bp bis 1000 bp zeigten, und die einzeln in die EcoR1-Stelle des pGEMBL18 subcloniert wurden. Die Insertionen der pGEMBL:rhuIL-3-Subclone wurden mit einem Universalstarter, der benachbart zu der multiplen Clonierungsstelle von pGEMBL18 bindet, und mit synthetischen von der huIL-3- Sequenz stammenden Oligonucleotidstartern sequenziert.

B. Modifizierung der von huIL-3 cDNA codierten N-Glyosylierungsstellen und Zusammenfügen des Expressionsvektors für rhuIL-3 (Pro&sup8;Asp¹&sup5;Asp&sup7;&sup0;).

Die zwei im natürlichen Protein (Asn¹&sup5; und Asn&sup7;&sup0;) vorhandenen Asparagin-verknüpften Glycosylierungsstellen wurden durch Änderung der Codons bei diesen Positionen zu Asparaginsäure-codierenden Codons abgeändert. Dies verhindert eine N-verknüpfte Glycosylierung (häufig Hyperglycosylierung) des von den Hefezellen sekretierten Proteins und ein homogeneres Produkt wurde erhalten. Diese Änderungen wurden wie nachstehend beschrieben nach der Subclonierung der huIL-3-cDNA in den Hefe-Expressionsvektor pIXY120 durchgeführt.
Der Hefe-Expressionsvektor pIXY120 ist im wesentlichen zu dem in EPA-A-243 153 beschriebenen pBC102-K22 identisch, mit der Ausnahme, daß das nachfolgende, multiple Clonierungsstellen enthaltende synthetische Oligonucleotid von der Asp718-Stelle (Aminosäure 79) nahe dem 3'-Ende des α-Faktor- Signalpeptids bis zu der in den 2u-Sequenzen enthaltenden Spe1-Stelle eingefügt wurde:
Zusätzlich wurde ein 514-bp DNA-Fragment, das aus dem einzelsträngigen, den Replikationsursprung und Zwischengen-Region enthaltenden Bakteriophagen f1 stammt, bei der Nru1- Stelle in die pBR322-DNA-Sequenzen eingefügt. Das Vorhandensein des f1-Replikationsursprungs ermöglicht die Erzeugung von einzelsträngigen Kopien des Vektors, wenn er in geeignete ("männliche") Stämme von E. coli transformiert wird und mit Bakteriophage f1 reinfiziert wird. Diese Fähigkeit erleichtert die DNA-Sequenzierung des Vektors und erlaubt die Möglichkeit der in vitro Mutagenese.
Der Hefeexpressionsvektor pIXY120 wurde mit den Restriktionsenzymen Asp718, das nahe dem 3'-Ende des α-Faktor-Signalpeptids (Nucleotid 237) spaltet, und BamH1, das in dem Polylinker spaltet, abgebaut. Das große Vektorfragment wurde gereinigt und mit den folgenden DNA-Fragmenten ligiert: (1) ein aus dem Plasmid GEMBL18:huIL-3 aus der Cla1-Stelle (Nucleotid 58 aus reifem huIL-3) stammenden huIL-3 cDNA- Fragment mit der BamH1-Stelle (3'-zu der huIL-3-cDNA in einem Polylinker) und (2) die nachfolgende Synthetische Oligoflucleotidlinkersequenz A:
Oligonucleotid A regeneriert die den C-Terminus des α-Faktor-Signalpeptids codierende Sequenz und wird im Leserahmen mit dem Octapeptid DYKDDDDK fusioniert, das selbst mit dem N-Terminus des reifem rhuIL-3 fusioniert ist. Diese Fusion mit dem rhuIL-3 Protein ermöglicht den Nachweis mit für das Octapeptid spezifischen Antikörpern und wurde anfänglich für die Kontrolle der Expression und Reinigung von rhuIL-3 verwendet. Dieses Oligonucleotid codiert auch eine Aminosäureänderung bei Position 15 (Asn¹&sup5; zu Asp¹&sup5;), um diese N-verknüpfte Glycosylierungsstelle zu ändern. Die unterstrichenen Nucleotide im Oligonucleotid A stellen die Änderungen bezüglich der Wildtyp-cDNA Sequenz dar. Nur die Änderungen von A nach G und C nach T bei den Nucleotiden 43 bzw. 45 (gezählt von dem Codon, das dem N-terminalen Alanin des reifen huIL-3 Moleküls entspricht) hat eine Aminosäureänderung (Asp¹&sup5;) zur Folge. Die anderen Basenänderungen führen übliche Restriktionsstellen (AhaII und PvuII) ohne Änderung der Aminosäuresequenz ein. Das resultierende Plasmid wurde pIXY139 bezeichnet und enthält eine rhuIL-3 cDNA mit einer verbliebenen N- verknüpften Glycosylierungskonsensussequenz (Asn&sup7;&sup0;).
Plasmid pIXY139 wurde zur Durchführung einer Oligonucleotidgerichteten Mutagenese verwendet, um die zweite N-verknüpfte Glycosylierungskonsensussequenz durch Änderung von Asn&sup7;&sup0; zu Asp&sup7;&sup0; zu entfernen. Die in vitro Mutagenese wurde mit einer Methode in ähnlicher Weise wie von Walder und Walder Gene 42:133 (1986) beschrieben durchgeführt. Der Hefevektor pIXY139 enthält den Replikationsursprung für den einzelsträngigen Bakteriophagen f1 und ist zur Erzeugung einzelsträngiger DNA befähigt, wenn er in einem geeigneten ("männlichen") Stamm von E. coli vorhanden ist und mit einem Helferphagen reinfiziert wird.
Einzelsträngige DNA wurde durch Transformation von E. coli Stamm JM107 erzeugt und mit dem Helferphagen IR1 reinfiziert. Einzelsträngige DNA wurde isoliert und an das nachfolgenden mutagene Oligonucleotid B, GTC AAG AGT TTA CAG GAC GCA TCA GCA AAT G angefügt, das einen Codonwechsel unter Substitution von Asp nach Asn bei Position 70 des reifen huIL-3 bereitstellt. Das Aneinanderfügen und die Hefetransformationsbedingungen wurden wie bei Walder und Walder, supra, beschrieben ausgeführt. Die Hefetransformanten wurden durch Wachstum auf eine Tryptophan fehlendem Medium selektiert, vereinigt und die DNA wurde wie bei Holm et al., Gene 42:169 (1986), beschrieben extrahiert. Diese DNA, die ein Gemisch aus Wildtyp- und mutierter Plasmid-DNA enthält, wurde zur Transformation von E. coli RR1 auf Ampicillinresistenz verwendet. Die resultierenden Kolonien wurden durch Hybridisierung mit radioaktiv markiertem Oligonucleotid B unter Verwendung von Standardtechniken abgesucht. Plasmide, die huIL-3 Asp&sup7;&sup0; codierende DNA umfassen, wurden durch Hybridisierung mit radioaktiv markiertem Oligonucleotid B unter stringenten Bedingungen nachgewiesen und durch Nucleotidsequenzierung bestätigt.
Das resultierende Hefe-Expressionsplasmid wurde pIXY138 bezeichnet und enthielt das huIL-3 Gen, das die Asp¹&sup5;Asp&sup7;&sup0; Aminosäureänderungen und das Octopaptid DYKDDDDK beim N-terminalen Ende codiert. Das endgültige Hefe-Expressionsplasmid ist mit pIXY138 identisch, mit der Ausnahme, daß die für das Octapeptid codierende Nucleotidsequenzen fehlen und somit das reife rhuIL-3 als Produkt erzeugt wurde.
Das endgültige Hefe-Expressionsplasmid wurde wie nachstehend beschrieben konstruiert. Der Hefe-Expressionsvektor pIXY120 wurde mit den Restriktionsenzymen Asp718 und BamH1 wie vorstehend beschrieben gespalten. Das große Vektorfragment wurde zusammen mit (1) einem huIL-3 cDNA-Fragment, das aus dem pIXY138 stammt, das von der Aha2-Stelle (die ein Nucleotid 19 des reifen huIL-3 spaltet) bis zur BamH1-Stelle 3' bezüglich der cDNA, reicht, und (2) mit dem nachfolgenden synthetischen Oligonucleotid C ligiert:
Das Oligonucleotid C regeneriert das 3'-Ende des α-Faktor- Signalpeptids von der Asp718-Stelle (die Aminosäuren Pro- Leu-Asp-Lys-Arg) und die N-terminalen sieben Aminosäuren von huIL-3 bis zur AhaII-Stelle. Das resultierende Plasmid wurde pIXY151 bezeichnet. Dieser Vektor ermöglicht eine Glukoseregulierte Expression und eine Sekretion von rhuIL-3 (Pro&sup8;Asp¹&sup5;Asp&sup7;&sup0;), wenn er in Hefe vorhanden ist.

C. Expressionvektor für modifizierte N-Glvcosylierungsstellen enthaltenden rhuGM-CSF (Leu²³Asp²&sup7;Glu³&sup9;).

Das menschliche GM-CSF codierende Wildtypgen, das auf dem Plasmid pHG23 vorhanden ist, wurde bei der American Type Culture Collection (ATCC), 12301, Parklawn Drive, Rockyville, Maryland 20852, USA unter der Hinterlegungsnummer 39900 hinterlegt. Das in einen Hefe-Expressionsvektor pYαfHuGM insertierte Wildtypgen wurde auch bei der ATCC unter der Hinterlegungsnummer 53157 hinterlegt. Zur Bereitstellung eines nicht-glycosylierten Analogon des menschlichen GM-CSF wurden Oligonucleotid-gerichtete ortsspezifische Mutageneseverfahren zur Eliminierung möglicher N-Glycosylierungsstellen, wie in der PCT-Veröffentlichung WO 89/03881, verwendet. Ein dieses Analoge codierende Plasmid, huGM-CSF (Leu²³Asp²&sup7;Glu³&sup9;) wurde bei der ATCC als Plasmid L207-3 in E. coli Stamm RR1 unter der Hinterlegungsnummer 67231 hinterlegt.

D. Konstruktion des Expressionsvektors für GM-CSF/IL-3 Fusionsprotein.

Zur Erzeugung eines Sekretionsvektors für die Expression eines fusionierten Konstrukts von mit durch eine Linkersequenz getrenntem menschlichem GM-CSF und menschlichem IL-3 wurde zuerst ein Vorläuferplasmid durch direkte Fusion von GM-CSF und IL-3 codierenden DNAs ohne Beachtung des Leserasters oder dazwischen liegenden Sequenzen konstruiert. Ein nicht-glycosyliertes menschliches GM-CSF codierendes cDNA-Fragment wurde aus dem Plasmid 1207-3 als ein 977 bp Restriktionsfragment (Sph1 bis Ssp1) herausgeschnitten. Die IL-3 cDNA wurde aus pIXY151 durch Spaltung mit Asp718 herausgeschnitten, die anschließend mit T4-Polymerasreaktion nach Maniatis et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, 1982, S. 118) mit glatten Enden versehen wurde und weiter mit Xhol zum Erhalt eines 803 bp Fragments gespalten wurde. Diese zwei Fragmente wurden danach direkt an ein mit Sphl und Xho1 gespaltenem pIXY151 Vektorfragment ligiert. Dieses Plasmid wurde GM/IL-3-Direktfusion bezeichnet.
Das GM/IL-3-Direktfusionsplasmid wurde als Matrize in der Oligonucleotid-gerichteten Mutagenese mit Methoden, die ähnlich zu denen von Walder und Walder, supra, beschriebenen sind, verwendet. Die nachfolgende Oligonucleotidsequenz wurde dann synthetisiert.
Dieses Oligonucleotid überlappt mit dem 3'-Ende von GM-CSF mit 13 bp, aber umfaßt nicht das Stoppcodon, enthält den Gly-Ser-Linker und überlappt mit dem 5'-Ende von IL-3 mit 13 bp. Die Linkersequenz war eine modifizierte Version des von Huston et al. (Proc. Natl. Acad. Sci USA 85:5879-5883, 1988) beschriebenen Linkers, aber war für eine Codonverwendung in Hefe nach Bennetzen et al. (J. Biol. Chem. 257:3026, 1982) optimiert.
Einzelsträngige Plasmid DNA wurde aus der GM/IL-3-Direktfusion mit R408 Helferphage (Stratagene) und den Methoden von Russel et al. (Gene 45:333-338, 1986) erzeugt. Oligonucleotid-gerichtete Mutagenese wurde anschließend durch Aneinanderfügen des vorstehenden Oligonucleotids mit der einzelsträngigen Plasmid-DNA und durch Transformation des Hefestamms XV2181 mit der aneindergefügten DNA, wie bei Walder and Walder, supra, beschrieben, ausgeführt. Der Hefevektor enthält den Replikationsursprung für den einzelsträngigen Bakteriophagen f1 und ist zur Förderung von einzelsträngiger DNA-Erzeugung befähigt, wenn er in einem geeigneten ("männlichen") Stamm von E. coli vorhanden ist und mit einem Helferphagen reinfiziert wird. Die Hefetransformanten wurden durch Wachstum auf Tryptophan-fehlendem Medium selektiert, vereinigt und die DNA wurde, wie bei Holm et al. (Gene 42:169, 1986) beschrieben, extrahiert. Diese DNA, die ein Gemisch aus mutierter und Wildtyp-Plasmid-DNA enthält, wurde zur Transformation von E. coli RR1 auf Ampicillinresistenz verwendet. Die resultierenden Kolonien wurden durch Hybridisierung mit radioaktiv markiertem Oligonucleotid unter Verwendung von Standardtechniken abgesucht. Plasmide, die GM- CSF/Linker/IL-3 codierende DNA umfasssen, wurden durch ihre Hybridisierung mit radioaktiv markiertem, Linker enthaltendem Oligonucleotid unter stringenten Bedingungen nachgewiesen und durch Nucleotidsequenzierung bestätigt.
Bei der Nucleotidsequenzierung wurde festgestellt, daß eine Mutation innerhalb der Linkerregion aufgetreten ist. Die Nucleotidsequenz TGGTGGATCTGG war entfernt (siehe Sequenz), was die Expression eines Proteins zur Folge hatte, in dem die Sequenz der Aminosäuren GlyGlyserGly entfernt war. Diese Mutation änderte nicht das Leseraster oder verhinderte die Expression eines biologisch aktiven Proteins. Das resultierende Plasmid wurde pIXY321 bezeichnet und exprimierte das Fusionsprotein huGM-CSF[Leu²³Asp²&sup7;Glu³&sup9;]/Gly4SerGly&sub5;Ser/huIL-3[Pro&sup8;Asp¹&sup5;Asp&sup7;&sup0;].

E. Expression und Reinigung von GM-CSF/IL-3-Fusionsprotein.

Der Wirtsstamm XV2181, ein diploider S. cerevisiae-Stamm, wurde durch Verbindung von XV617-1-3B [a, his6, leu2-1, trp1-1, ura 3, ste5], erhalten von der Universität Washington, Department of Genetics Yeast Strain Bank, Seattle, WA, USA, und X2181-1B[a, trp1-1, gal1, ade1, his2] erhalten von dem Yeast Genetic Stock Center, University of California, Berkeley, CA, USA, erzeugt. Der Wirtsstamm wurde mit dem Expressionsplasmid durch die Methode von Sherman et al., Laboratory Course Manual for Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, 1986, transformiert.
Die Plasmid pIXY321 (siehe 1D oben) enthaltende Hefe wurde auf bei 4ºC gelagerten YNB-trp-Agarplatten gehalten. Eine Vorkultur wurde durch Inokulation verschiedener isolierter rekombinanter Hefekolonien in einem Liter YNB-trp-Medium (6,7 g/l Hefe-Stickstoffbase, 5 g/l Casaminosäuren, 40 mg/l Adenin, 160 mg/l Uracil und 200 mg/l Tyrosin) gestartet und über Nacht in zwei 2-Liter Kolben bei 30ºC unter kräftigem Schütteln wachsengelassen. Am Morgen war die Kultur in der stationären Phase bei einem OD&sub6;&sub0;&sub0; von 2 bis 7 gesättigt. Die Fermenter (drei Maschinen mit 10 l Arbeitsvolumen), die zuvor gereinigt und sterilisiert worden waren, wurden bis zu 80% ihres Arbeitsvolumens mit SD-2-Medium (4,0 g/l Ammoniumsulfat, 3,2 g/l einbasisches Kaliumphosphat, 3,0 g/l Hefeextrakt, 1,0 g/l Zitronensäure, 0,1 g/l Natriumchlorid, 5 ml/l 2% Calciumchlorid, 2,5 ml/l Vitamin 101-Lösung, 0,5 ml/l einer Lösung von Spurenelementen, 0,5 ml/1 20% Magnesiumsulfat, 2,0 ml/l Glucose) gefüllt und bei 30ºC unter 500-600 Upm Schütteln und 10-16 lpm Belüftung gehalten. Das Inokulum wurde hinzugegeben. Nach zweistündigem Wachstum wurde eine Nährlösung von 50% Glucose mit einer Rate zugegeben, so daß 50 g/l über einen Zeitraum von 10-12 Stunden zugegeben wurden. Die Nährlösung wurde anschließend auf 50% Ethanol verschoben, das mit 30-40 ml/Std bis zum Ernten zugegeben wurde.
Die Gesamtdauer der Fermentation betrug ungefähr 20 Stunden, nach der die optische Dichte (600 nm) im Bereich von 30 bis 45 lag. Die Fermenter wurden anschließend auf 20ºC abgekühlt, der pH-Wert des Hefebiers wurde durch Zugabe von 5 M NaOH auf 8,0 eingestellt und das resultierende Material wurde durch ein mit einer 0,45 um Filterkassette ausgestattetes Millipore Pellicon Filtersystem gefiltert und in einem sterilem 10 l Kolben gesammelt.
Ein Liter des GM-CSF/IL-3-Fusionsprotein enthaltenden Hefeüberstands wurde auf 50 ml mit einer Amicon YM-10 Membran konzentriert. Das Konzentrat der Hefebrühe wurde anschließend weiter mit präparativer HPLC durch Auftragen auf eine mit 5 u C-18 Siliciumdioxid gepackten 1 cm x 25 cm Säule (Vydac, Separations Group, Hesperia, CA, USA), die mit 0,1% Trifluoressigsäure in Wasser (Lösungsmittel A) vor dem Auftragen des Hefekonzentrats equilibriert wurde, gereinigt. In einer anderen Ausführungsform kann die Rohhefebrühe direkt auf die C-18 Säule gepumpt werden. Nach dem Auftragen des Materials wurde die Säule mit Lösungsmittel A bis zur optischen Absorption der von dem Ausfluß erreichten Basislinienwerte gespült. Zu diesem Zeitpunkt wurde ein Gradient von 0,1% Trifluoressigsäure in Acetonitril (Lösungsmittel B) von 0% B bis 100% B bei einer Änderungsrate von 1-2% B pro Minute und einer Durchflußrate von 2 ml/min eingeführt. Die Fraktionen wurden in einminütigem Abstand gesammelt. Aliquote der Fraktionen wurden durch "dot blot" mit einem polyklonalem Antiserum von Kaninchen gegen IL-3 auf ihren Proteingehalt analysiert. GM-CSF-IL-3 eluierte in der Fraktion 50 bei ungefähr 50% Acetonitril.
Die HPLC-Fraktionen, die durch "dot blot" positiv für GM- CSF/IL-3-Fusionsprotein waren, wurden vereinigt und an SP- Sepharose in 20 mM β-Alanin bei pH 4 gebunden. Das Fusionsprotein wurde mit 0,5 M NaCl, 100 mM Tris-HCl, pH 8, eluiert. Die Fusionsprotein enthaltenden Fraktionen wurden durch SDS-PAGE nachgewiesen.
Die Proteine mit einem Molekulargewicht von 35000 enthaltenden Ionenaustauscherfraktionen wurden vereinigt, auf 100 ul konzentriert und weiter durch FPLC-Gelfiltration auf einer Superose 12-Säule gereinigt. Die Säule wurde mit PBS eluiert. Nur die gereinigtes 35.000 MW-Fusionsprotein enthaltende Fraktionen wurden durch SDS-PAGE nachgewiesen.
Die biologischen Aktivitäten (Einheit/mg) und Bindungsaffinitäten des im wesentlichen wie vorstehend beschrieben hergestelltem GM-CSF/IL-3 wurden, wie nachstehend in Beispielen 4 und 5 aufgeführt, bestimmt.

Beispiel 4

Biologische Aktivität von GM-CSF/IL-3-Fusionsprotein im Thymidin-Einbau-Test

Um den Wert der biologischen Aktivität zu bestimmen, wurde das wie in Beispiel 3 beschrieben hergestellte GM-CSF/IL-3 Fusionsprotein auf die Fähigkeit für die Stimulation der Proliferation von AML-193 Zellen in einem Thymidin-Einbau- Test untersucht. Die AML-193 Zellinie ist eine GM-CSF abhängige menschliche monozytenhaltige Leukämiezellinie, die ursprünglich von Santoli et al., (J. Immunol. 139:3348, 1987) beschrieben worden ist. Die Zellen wurden in "Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM)" mit 25 mM MEPES, 200 mM L- Glutamin, 5 ug/ml Insulin, 5 ug/ml Transferrin, 5 ng/ml Natriumselenit, 2,5% Hitze-inaktiviertes fötales Rinderserum, Antibiotika und 5 ng/ml gereinigtem rekombinantem menschlichen GM-CSF gezüchtet. Die Zellen wurden zweimal wöchentlich geteilt und in frisches Medium mit einer Dichte von 300.000/ml überführt.
Ein Thymidin-Einbau-Test wurde zur Untersuchung der Aufnahmefähigkeit von bekannten Wachstumsfaktoren und unbekannten Überständen für die Stimulierung der Proliferation von AML- 193 verwendet. Die AML-193 Zellen wurden durch Zentrifugation gewaschen und in dem Testmedium, das wie vorstehend aufgeführt aus IMDM außer dem fötalen Kälberserum und/oder GM-CSF zusammengesetzt war, resuspendiert. Reines GM-CSF, IL-3 oder GM-CSF/IL-3-Fusionsprotein wurden zu der ersten Vertiefung von einer Gewebekulturplatte mit flachen Boden und 96 Vertiefungen in einer Endkonzentration von 400 ng/ml in 50 ml Medium zugegeben. Diese Proben wurden anschließend seriel dreifach über die zusätzlichen elf Vertiefungen der Mikrotiterplatter verdünnt. 50 ul 3750 AML-193 Zellen enthaltendes Medium wurde zu jeder Vertiefung zugegeben und die Platten wurden bei 37ºC für 138 Stunden in einer völlig feuchten Atmosphäre von 6% CO&sub2; in der Luft inkubiert. Tritiiertes Thymidin (0,5 mCi/Vertiefung) wurde zu jeder Vertiefung für weitere sechs Stunden Inkubation zugegeben und die Proben wurden mit einem automatischen Probenernter geerntet und durch Flüssigscintillationsmessung gezählt. Eine Einheit der Aktivität wird als die Menge des Wachstumsfaktors definiert, der zur Stimulation des halbmaximalen Thymidineinbaus benötigt wird.
Eine gleichzeitige Titration von IL-3, GM-CSF oder GM- CSF/IL-3-Fusionsprotein bei identischen Konzentrationen ergab, daß das Fusionsprotein einen stärkeren Proliferations stimulus als jeder Faktor alleine oder IL-3 und GM-CSF in Kombination zeigte. Die spezifische Aktivität von IL-3, GM- CSF und GM-CSF/IL-3-Fusionsprotein ist in der nachstehenden Tabelle A gezeigt. Tabelle A Molekül Spezifische Aktivität
Die spezifische Aktivität von GM-CSF/IL-3 Fusionsprotein ist ungefähr 10fach höher als IL-3 oder GM-CSF alleine oder als GM-CSF und IL-3 in Kombination

Beispiel 5

Bindungsaktivität von GM-CSF/IL-3 Fusionsprotein im Gleichgewichtsbindungstest

Die Bindungsaffinitäten von menschlichem IL-3, GM-CSF und Fusionsprotein auf Rezeptoren von menschlichen Zellinien wurden durch Inhibierung von ¹²&sup5;I-markierter IL-3- oder GM- CSF-Bindung bestimmt.

A. Radioaktive Markierung von GM-CSF und IL-3.

Rekombinantes menschliches GM-CSF/IL-3-Fusionsprotein wurde in Hefezellen exprimiert und im wesentlichen wie vorstehend beschrieben gereinigt. Rekombinantes menschliches IL-3 und GM-CSF, die durch genetische Manipulation das Octapeptid DYKDDDDK enthalten, wurden in Hefe exprimiert und mit einem für das Octapeptid spezifischen monoklonalen Antikörper im wesentlichen wie in Hopp et al. (Bio/Technology 6:1204, 1988) gereinigt. Die gereinigten GM-CSF- und IL-3-Proteine wurden mit einem im Handel erhältlichen auf Enzymkügelchen basierendem Radioiodinierungsreagens (BioRad), im wesentlichen wie von Park et al. (J Biol. Chem. 261:4177, 1986) beschrieben, radioaktiv markiert. Kurz zusammengefaßt wurden 2-10 ug rekombinantes Protein in 50 ul 0,2 M Natriumphosphat, pH 7,2, mit 50 ul auf Enzymkügelchen basierendem Reagens, 2 mCi Natriumiodid in 20 ul 0,05 M Natriumphosphat pH 7 und 10 ul 2,5% β-D-Glucose kombiniert. Nach 10 Minuten bei 25ºC wurden nacheinander Natriumazid (10 ul 50 mM) und Natriummetabisulfit (10 ul 5 mg/ml) zugegeben und die Inkubation wurde für 5 Minuten bei 25ºC fortgeführt. Das Reaktionsgemisch wurde durch Gelfiltration auf Sephadex G-25 (Sigma) mit einem 2 ml Bettvolumen, equilibriert in 2,5 % (Gew./Vol.) Rinderserumalbumin (BSA), 0,2 % (Gew./Vol.) Natriumazid und 20 mM Hepes, pH 7,4 (Bindungsmedium) enthaltendem "Roswell Park Memorial Institute (RPMI)" 1640-Medium fraktioniert. Die Endvereinigungen von ¹²&sup5;I-IL-3 und ¹²&sup5;I-GM-CSF wurden zu einer Arbeitsstammlösung von 1 x 10&supmin;&sup7; M mit Bindungsmedium verdünnt und bis zu einem Monat bei 4ºC ohne nachweisbaren Verlust der Rezetorbindungsaktivität gelagert. Die Spezifische Aktivität der radioaktiv markierten Präparation von GM-CSF liegt routinemäßig im Bereich von 1-5 x 10¹&sup5; cpm/mmol. Die spezifische Aktivität von IL-3 liegt im Bereich von 3-6 x 10¹&sup5; cpm/mmol.

B. Bindungstests.

Die Bindungstests wurden mit JM-1, KG-1, HL-60 und AML-193 Zellen durchgeführt. JM-1, HL-60 und KG-1 Zellen wurden wie bei Park et al. (J. Biol.Chem. 264:5420, 1989) erhalten und hergestellt. AML-193 Zellen wurden, wie vorstehend in Beispiel 4 beschrieben, erhalten und hergestellt. Wie bei Park et al. (supra) beschrieben, bindet ¹²&sup5;I-GM-CSF weder an JM-1 Zellen noch inhibiert GM-CSF die Bindung von ¹²&sup5;I-IL-3 an JM-1 Zellen, was anzeigt, daß diese Zellen nur die zur Bindung von IL-3 befähigten Rezeptoren besitzen. Im Gegensatz dazu bindet ¹²&sup5;I-IL-3 weder an HL-60 Zellen noch inhibiert IL-3 die Bindung von ¹²&sup5;I-GM-CSF an HL-60 Zellen, was anzeigt, daß diese Zellen nur die zur Bindung von GM-CSF befähigten Rezeptoren besitzen. Im Gegensatz dazu binden sowohl KG-1 und AML-193 Zellen ¹²&sup5;I-GM-CSF und ¹²&sup5;I-IL-3 und zusätzlich sind sowohl IL-3 als auch GM-CSF zur teilweisen Konkurrenz einer spezifischen Bindung des heterologen radioaktiv markierten Liganden mit ungefähr gleichen Aufnahmefähigkeiten fähig. Dies legt nahe, daß diese Zellinien Rezeptoren, die nur IL-3 binden, Rezeptoren, die nur GM-CSF binden, und Rezeptoren, die sowohl GM-CSF als auch IL-3 binden, mit hoher Affinität besitzen.
Um die Bindungsaffinität (KI) von IL-3, GM-CSF und GM- CSF/IL-3-Fusionsprotein zu bestimmen, wurden Inhibierungstests durchgeführt, in denen die Fähigkeit von unterschiedlichen Konzentrationen dieser nicht-markierten Proteine zur Inhibierung der Bindung von ¹²&sup5;I-IL-3 an JM-1 Zellen, ¹²&sup5;I- GM-CSF an HL-60 Zellen und ¹²&sup5;I-IL-3 und ¹²&sup5;I-GM-CSF an KG-1 und AML-193 Zellen gemessen wurde. Die Tests wurden durch Inkubation der Zellen (3,3 x 10&sup7;/ml) mit 3 x 10&supmin;¹&sup0; M 125I- GM-CSF oder ¹²&sup5;I-IL-3 und unterschiedlichen Konzentrationen von nicht-markiertem IL-3, GM-CSF oder GM-CSF/IL-3-Fusionsprotein für 30-60 Minuten bei 37ºC durchgeführt. Die Bindung wurde unter Verwendung der Phthalat-Öltrennmethode, beschrieben von Dower et al. (J. Immunol. 132:751, 1984), im wesentlichen wie bei Park et al. (J Biol. Chem 261:4177, 1986) beschrieben, getestet. Die Daten wurden, wie bei Park et al. (Blood 74:56, 1989) beschrieben, analysiert. Die Bindungsaffinitäten wurden für IL-3, GM-CSF und GM-CSF/IL-3, wie nachstehend in Tabelle B gezeigt, bestimmt. Tabelle B KI-Werte (M&supmin;¹) markierter Ligand unmarkierter Konkurrent
Die zum Erhalt der Daten in Tabelle B verwendeten Experimente wurden mit unterschiedlichen Zellinien in unterschiedlichen Experimenten durchgeführt und zeigen demgemäß gewisse Abweichungen, was einen direkten Vergleich erschwert. Um einen direkten Vergleich dieser Daten zu ermöglichen, wurden die KI-Werte sowohl der Kontrollen als auch der Fusionsproteine auf den KI-Wert für die Kontrolle von einer Zellinie normalisiert. Die IL-3 Daten wurden auf einen KI = 1,8x10¹&sup0; M&supmin;¹ für JM-1 Zellen und Gm-CSF Daten wurden auf einen KI = 1,2x10¹&sup0; M&supmin;¹ für HL-60 Zellen normalisiert, um die in nachstehender Tabelle C aufgeführten Werte zu erhalten. Tabelle C normalisierte KI-Werte (M&supmin;¹) markierter Ligand unmarkierter Konkurrent
Ein Vergleich der normalisierten Daten zeigt, daß das GM- CSF/IL-3-Fusionsprotein und GM-CSF mit ungefähr der gleichen Affinität an die Rezeptoren für GM-CSF von HL-60, KG-1 und AML-193 Zellen bindet. Im Gegensatz dazu binden das GM- CSF/IL-3-Fusionsprotein und IL-3 mit unterschiedlichen Affinitäten: GM-CSF/IL-3-Fusionsprotein bindet mit niedriger Affinität an die Rezeptoren der JM-1 Zellen (die nur IL-3 Bindungsrezeptoren aufweisen) als IL-3; im Gegensatz dazu bindet das GM-CSF/IL-3-Fusionsprotein mit einer signifikant höheren Affinität an Rezeptoren der KG-1 und AML-193 Zellen (die beide GM-CSF/IL-3 Rezeptoren aufweisen) als IL-3. Unter Verwendung der JM-1 Zellinie als Standard für die normale Bindungsaffinität des GM-CSF/IL-3-Fusionsproteins an einen Rezeptor (d.h. für die Bindung an einen Rezeptor, der zur Bindung von nur einem einzelnen Liganden befähigt ist) bindet das GM-CSF/IL-3-Fusionsprotein an KG-1 Zellen mit einer 41,0fach höheren Bindungsaffinität und an AML-193 Zellen mit einer 11,1fach höheren Bindungsaffinität.
Ohne Festhalten an eine bestimmte Theorie wird angenommen, daß die höhere Bindungsaffinität von GM-CSF/IL-Fusionsproteinen an KG-1 und AML-193 Zellen mit dem Vorhandensein des GM-CSF/IL-3-Rezeptors in beiden Zellinien verbunden ist. Insbesondere kann die höhere Bindungsaffinität von GM- CSF/IL-3-Fusionsprotein an die AML-193 Zellinie die höhere biologische Aktivität des GM-CSF/IL-3-Fusionsproteins im Thymidin-Einbau-Test von Beispiel 4 erklären, in dem die AML-193 Zellinie verwendet wurde.

Beispiel 6

Wirkung von GM-CSF/IL-3 auf die Proliferation von menschlichem Knochenmark

Die biolgische Wirkung von GM-CSF/IL-3 auf die Proliferation von unfraktioniertem menschlichem Knochenmark wurde mit der von GM-CSF und IL-3, alleine, verglichen Nicht-haftende T- Zell-verarmte Kulturen mit niedriger Dichte von menschlichem Knochenmark wurden in Methylcellulose (BFU-E, CFU-GEMM, 40,000 Zellen pro Platte) oder Agar (CFU-GM, 40,000 Zellen pro Kultur), wie von Lu et al. (Blood 61:250, 1983) beschrieben, ausplattiert. Die Methylcellulose-Kulturen enthielten eine Einheit Erythropoietin pro Platte und die Berechnung von 48±2 BFU-E für den Hintergrund in Abwesenheit von Cytokin. Die Kulturen wurden in einer 5% O&sub2;, 5% CO&sub2;, 90% N&sub2;-Atmosphäre für 14 Tage inkubiert und mit einem Inversmikroskop gezählt. Diese Werte stellen die mittlere ±1 Standardabweichung von doppelten oder dreifachen Datenpunkten in einem von zwei repräsentativen Experimenten dar. Tabelle D Kolonien (Mean±S.D.) Cytokin Dosis (pg/ml) kein = Wert, gleich zur Mediumkontrolle p< 0.05 im Vergleich zur Mediumkontrolle Tabelle E Kolonien (Mean±S.D.) Cytokin Dosis (pg/ml) kein = Wert, gleich zur Mediumkontrolle p< 0.05 im Vergleich zur Mediumkontrolle
Die Tabellen D und E zeigen, daß GM-CSF plus IL-3 in der Steigerung der Proliferation von unfraktionierten menschlichen Knochenmarkszellen ungefähr zweifach stärker sind als entweder GM-CSF oder IL-3, alleine. Das GM-CSF/IL-3-Fusions protein ist hinsichtlich der Stärke zu einem Gemisch von GM- CSF und IL-3 equivalent und das Gemisch von GM-CSF und IL-3 zeigte eine ungefähr zweifache Steigerung im Vergleich mit GM-CSF oder IL-3, alleine.

Beispiel 7

Synthese von IL-3/GM-CSF-Fusionsprotein codierender cDNA

Eine cDNA, die ein N-terminales IL-3 und ein C-terminales GM-CSF umfassendes Fusionsproteine codiert, wurde wie folgt konstruiert. Der Hefe-Expressionsvektor pIXY120 (in Beispiel 1B beschrieben) wurde mit den Restriktionsenzymen Asp718, das nahe dem 3'-Ende des α-Faktor-Signalpeptids (Nucleotid 237) spaltet, und Nco1, das im Polylinker spaltet, abgebaut. Das große Vektorfragment wurde gereinigt und mit einem ungefähr 500 bp Asp718-Nco1-Fragment (GM-CSF (Leu²³Asp²&sup7;Glu³&sup9;) codierend) aus einem Teilabbau von L207-3 (ATCC 67231) zum Erhalt von pIXY273 ligiert. Ein 9 kb Asp718-Bgl2-Fragment von pIXY273 (noch die GM-CSF (Leu²³Asp²&sup7;Glu³&sup9;)cDNA enthaltend) wurde anschließend an ein menschlichen IL-3 (Pro&sup8;Asp¹&sup5;Asp&sup7;&sup0;) codierendes Asp718-Nru1-Fragment aus pIXY151 (in Beispiel 1B beschrieben) und an das folgende doppelsträngige Oligonucleotid ligiert:
Dieses Oligonucleotid überlappt mit dem 3'-Ende von IL-3 mit 8 bp, aber umfaßt nicht das Stopcodon, enthält den Gly-Ser- Linker und überlappt mit dem 5'-Ende von GM-CSF mit 10 bp. Der resultierend Vektor wurde pIXY344 bezeichnet und wurde zur Expression eines IL-3/GM-CSF- Fusionsproteins, im wesentlichen wie im vorstehenden Beispiel 3 beschrieben, verwendet.

Beispiel 8

Bindungsaktivität von IL-3/GM-CSF- Fusionsproteinen im Gleichgewichtsbindungstest

Die Bindungsaffinitäten von menschlichem IL-3, GM-CSF und IL-3/GM-CSF-Fusionsprotein (hergestellt wie in Beispiel 8 beschrieben) für Rezeptoren auf menschlichen Zellinien wurden durch Inhibierung der ¹²&sup5;I-markierten IL-3- oder GM-CSF- Bindung, wie in vorstehendem Beispiel 5 beschrieben, bestimmt.
Die Bindungstest wurden mit JM-1, HL-60 und KG-1 Zellen durchgeführt, die, wie bei Park et al. (J. Biol. Chem. 264:5420, 1989) beschrieben, erhalten und hergestellt wurden. JM-1 Zellen besitzen Rezeptoren, die zur Bindung von IL-3, aber nicht von GM-CSF befähigt sind. Im Gegensatz dazu besitzen HL-60 Zellen Rezeptoren, die zur Bindung von GM- CSF, aber nicht von IL-3 befähigt sind. KG-1 Zellen besitzen Rezeptoren für sowohl GM-CSF als auch IL-3.
Die Bindungsaffinitäten (KI) wurden für IL-3, GM-CSF und GM- CSF/IL-3, wie in nachstehender Tabelle F gezeigt, bestimmt. Tabelle F KI-Werte (M&supmin;¹) markierter Ligand unmarkierter Konkurrent N.D. = keine Daten erhältlich
Die vorstehenden Daten zeigen, daß das GM-CSF/IL-3- und das IL-3/GM-CSF-Fusionsprotein mit einer niedrigeren Affinität an JM-1 Zellen binden als mit der von IL-3 alleine. Im Gegensatz dazu binden das GM-CSF/IL-3- und IL-3/GM-CSF-Fusionsprotein mit einer signifikant höheren Affinität an KG-1 Zellen als mit der von IL-3 alleine. Der KI-Wert für sowohl GM-CSF/IL-3- als auch IL-3/GM-CSF-Fusionsprotein auf KG-1 Zellen ist 10-20fach höher als auf JM-1 Zellen. In ähnlicher Weise sind die für GM-CSF/IL-3 und IL-3/GM-CSF bestimmten KI-Werte auf HL-60 Zellen entsprechend.
Aufgrund der in Beispiel 4-6 (die eine Korrelation zwischen Bindungsaffinität und gesteigerter biologischer Aktivität zeigen) dargestellten Daten legen die vorstehenden Bindungsdaten nahe, daß das IL-3/GM-CSF-Fusionsprotein eine erhöhte biologische Aktivität aufweisen wird.

Claims

1. Fusioniertes Protein mit einer Formel ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus R&sub1;-R&sub2;, R&sub2;-R&sub1;, R&sub1;-L-R&sub2; und R&sub2;-L-R&sub1;, worin R&sub1; GM-CSF ist, R&sub2; IL-3 ist und L eine Linker-Peptidsequenz ist.

2. Fusioniertes Protein nach Anspruch 1, worin die Linkersequenz Aminosäuren, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Gly, Asn, Ser, Thr und Ala umfaßt.

3. Fusioniertes Protein nach Anspruch 2, worin die Länge der Linkersequenz 5 bis 15 Aminosäuren ist.

4. Fusioniertes Protein nach Anspruch 3, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus den in Figur 1 dargestellten Aminosäureresten 1-271 und den in Figur 2 dargestellten Aminosäureresten 1-275.

5. Fusioniertes Protein nach Anspruch 3, wobei das fusionierte Protein huGM-CSF[Leu²³Asp²&sup7;Glu³&sup9;]/Gly&sub4;SerGly&sub5;Ser/huIL-3[Pro&sup8;Asp¹&sup5;Asp&sup7;&sup0;] ist.

6. Fusioniertes Protein nach Anspruch 1, wobei der menschliche GM-CSF aus der Gruppe bestehend aus huGM-CSF, huGM-CSF[Leu²³Asp²&sup7;Glu³&sup9;], huGM-CSF[Leu²³], huGM-CSF [Leu²³-Asp²&sup7;], huGM-CSF[Glu³&sup9;], huGM-CSF[Asp²&sup7;Glu³&sup9;] ,huGM-CSF[Leu²³-Glu³&sup9;] und huGM-CSF[Asp²&sup7;] ausgewählt ist und das menschliche IL-3 aus der Gruppe bestehend aus huIL-3, huIL-3[Pro&sup8;Asp¹&sup5;Asp&sup7;&sup0;], huIL-3[Asp&sup7;&sup0;], huIL-3[Asp¹&sup5;Asp&sup7;&sup0;], huIL- 3[Pro&sup8;Asp¹&sup5;], huIL-3[Pro&sup8;Asp&sup7;&sup0;] und huIL-3[Asp¹&sup5;] ausgewählt ist.

7. DNA-Sequenz, codierend das Protein von Anspruch 1.

8. DNA-Sequenz, codierend das Protein von Anspruch 4.

9. DNA-Sequenz, codierend das Protein von Anspruch 5.

10. DNA-Sequenz, codierend das Protein von Anspruch 6.

11. DNA-Sequenz nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch die Degeneration des genetischen Codes der in Figur 1 oder in Figur 2 dargestellten DNA-Sequenzen.

12. Rekombinanter Expressionsvektor, umfassend eine DNA- Sequenz nach Anspruch 7.

13. Rekombinanter Expressionsvektor, umfassend eine DNA- Sequenz nach Anspruch 8.

14. Rekombinanter Expressionsvektor, umfassend eine DNA- Sequenz nach Anspruch 9.

15. Rekombinanter Expressionsvektor, umfassend eine DNA- Sequenz nach Anspruch 10.

16. Rekombinanter Expressionsvektor, umfassend eine DNA- Sequenz nach Anspruch 11.

17. Verfahren zur Herstellung eines GM-CSF und IL-3 umfassenden fusionierten Proteins, das den Schritt der Züchtung einer geeigneten, einen Vektor nach Anspruch 12 enthaltenden Wirtszelle unter expressionsfördernden Bedingungen umfaßt.

18. Verfahren zur Herstellung eines GM-CSF und IL-3 umfassenden fusionierten Proteins, das den Schritt der Züchtung einer geeigneten, einen Vektor nach Anspruch 13 enthaltenden Wirtszelle unter expressionsfördernden Bedingungen umfaßt.

19. Verfahren zur Herstellung eines GM-CSF und IL-3 umfassenden fusionierten Proteins, das den Schritt der Züchtung einer geeigneten, einen Vektor nach Anspruch 14 enthaltenden Wirtszelle unter expressionsfördernden Bedingungen umfaßt.

20. Verfahren zur Herstellung eines GM-CSF und IL-3 umfassenden fusionierten Proteins, das den Schritt der Züchtung einer geeigneten, einen Vektor nach Anspruch 15 enthaltenden Wirtszelle unter expressionsfördernden Bedingungen umfaßt.

21. Verfahren zur Herstellung eines GM-CSF und IL-3 umfassenden fusionierten Proteins, das den Schritt der Züchtung einer geeigneten, einen Vektor nach Anspruch 16 enthaltenden Wirtszelle unter expressionsfördernden Bedingungen umfaßt.

22. Zusammensetzung zur Regulierung von Immunantworten oder Antworten im Zusammenhang mit einer Entzündung in einem Säuger, umfassend eine wirksame Menge eines fusionierten Proteins nach Anspruch 1 und ein geeignetes Verdünnungsmittel oder einen geeigneten Träger.

23. Verwendung eines fusionierten Proteins nach einem der Ansprüche 1 bis 6 zur Herstellung eines Arzneimittels für die Regulierung von Immunantworten beim Menschen.

24. Verwendung eines fusionierten Proteins nach einem der Ansprüche 1 bis 6 zur Herstellung eines Arzneimittels, das zur parenteralen Verabreichung an einem Patienten für die Regulierung von Immunantworten geeignet ist.

25. Arzneimittel, das zur parenteralen Verabreichung an einem Patienten für die Regulierung von Immunantworten geeignet ist, umfassend eine wirksame Menge eines fusionierten Proteins nach Anspruch 1 im Gemisch mit einem geeigneten Verdünnungsmittel oder einem geeigneten Träger.