DE69230206T2

DE69230206T2 - Rekombinante derivate des menschlichen faktors viii

Info

Publication number: DE69230206T2
Application number: DE69230206T
Authority: DE
Inventors: Annelie Almstedt; Eva Hellstroem; Peter Lind; Catherine Ljung; Helena Sandberg; Jack Spira; Mona Sydow-Baeckman; Helena Wiman
Original assignee: Pharmacia and Upjohn AB
Current assignee: Swedish Orphan Biovitrum AB
Priority date: 1991-03-15
Filing date: 1992-03-11
Publication date: 2000-05-18
Anticipated expiration: 2012-03-12
Also published as: EP0533862A1; WO1992016557A1; JP2655752B2; AU1351392A; SE9100799L; FI925131A0; AU650730B2; NO924395D0; SE468050B; NO924395L; PT100245A; EP0533862B1; JPH05507420A; AR247590A1; ZA921882B; IE920814A1; FI107539B; ES2137182T3; DE69230206D1; NO308174B1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft DNA-Sequenzen, die für biologisch aktive rekombinante human-Faktor VIII-Derivate kodieren, rekombinante Expressionsvektoren, die derartige DNA-Sequenzen enthalten, Wirtszellen, die mit solchen rekombinanten Expressionsvektoren transformiert sind, und Verfahren zur Herstellung der rekombinanten human = Faktor VIII-Derivate. Die Erfindung umfaßt auch human-Faktor VIII-Derivate, die zwei durch eine Metallionenbrücke verbundene Polypeptide umfassen.

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Klassische Haemophilie oder Haemophilie A ist die häufigste der vererblichen Bluterkrankheiten. Sie wird verursacht durch eine X-chromosomal gekoppelte Defizienz von Blutgerinnungsfaktor VIII und betrifft fast ausschließlich Männer, mit einer Häufigkeit von zwischen ein bis zwei Individuen pro 10.000. Der X-chromosomale Defekt wird von weiblichen Trägern, die selbst nicht an der Bluterkrankheit erkrankt sind, übertragen. Die klinische Manifestation von Haemophilie A besteht in einer abnormalen Blutungsneigung und vor Einführung der Behandlung mit Faktor VIII-Konzentraten betrug die mittlere Lebensdauer einer Person mit schwerer Haemophilie weniger als 20 Jahre. Die Verwendung von Faktor VIII-Konzentraten aus Plasma hat die Situation für die Haemophiliepatienten erheblich verbessert. Die mittlere Lebensdauer ist erheblich gestiegen, was den meisten von ihnen ermöglicht, ein mehr oder weniger normales Leben zu führen. Es gab jedoch bestimmte Probleme mit den aus Plasma stammenden Konzentraten und deren Verwendung, wovon das schwerwiegendste die Übertragung von Viren war. Bisher haben Viren, die AIDS, Hepatitis B und Hepatitis non A non B verursachen, die Population schwer getroffen. Obwohl vor kurzem verschiedene Virus- Inaktivierungsmethoden und neue hoch gereinigte Faktor VIII-Konzentrate entwickelt wurden, können keine Garantien bezüglich der Abwesenheit einer Viruskontamination abgegeben werden. Aufgrund der begrenzten Verfügbarkeit von Humanplasma- Rohmaterial sind die Faktor VIII-Konzentrate auch ziemlich teuer.
Ein aus rekombinantem Material abgeleitetes Faktor VIII-Produkt würde vermutlich die Probleme in Zusammenhang mit der Verwendung von aus Plasma abgeleiteten Faktor VIII-Konzentraten für die Behandlung von Haemophilie A zu einem hohen Grad lösen, und eine Reihe von Gruppen arbeiten derzeit an der Entwicklung eines derartigen Produkts. Bei der Entwicklung eines rekombinaten Faktors VIII wurden jedoch gewisse Schwierigkeiten angetroffen, beispielsweise das Problem Produktionsniveaus in ausreichend hohen Ausbeuten zu erreichen, insbesondere im Hinblick auf das Vollängenmolekül.
Es ist gezeigt worden, daß Faktor VIII in frischem Plasma, das in der Gegenwart von Proteaseinhibitoren präpariert wurde, ein Molekulargewicht von 280 kDa aufweist und aus zwei Polypeptidketten von 200 kDa bzw. 80 kDa zusammengesetzt ist (Andersson, L-O. et al. (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 2979-2983). Diese Ketten werden durch Metallionenbrücken zusammengehalten. Mehr oder weniger proteolytisch abgebaute Formen des Faktor VIII-Moleküls können in Faktor VIII-Material, das aus kommerziellen Konzentraten gereinigt wurde, als aktive Fragmente gefunden werden (Andersson, LG. et al., aa0.; Andersson, L-O. et al. (1985) EP 0 197 901). Die fragmentierte Form von Faktor VIII mit Molekulargewichten von 260 kDa bis herab zu 170 kDa besteht aus einer schweren Kette mit einem Molekulargewicht im Bereich von 180 kDa bis herab zu 90 kDa, wobei alle Varianten identische Aminotermini aufweisen, in Kombination mit einer 80 kDa leichten Kette. Der Amino-terminale Bereich der schweren Kette ist identisch zu dem des einzelkettigen Faktor VIII-Polypeptids, welcher aus den Nukleotidsequenzdaten der Faktor VIII-cDNA abgeleitet werden kann (Woods, W.l. et a). (1984) Nature 312, 330-336; Vehar, G. A. et al. (1984) Nature 312, 337-342).
Die kleinste aktive Form von Faktor VIII mit einem Molekulargewicht von 170 kDa, die aus einer 90 kDa und einer 80 kDa Kette besteht, kann mit Thrombin in gleichem Ausmaß wie die Formen mit höherem Molekulargewicht aktiviert werden, und stellt somit eine nicht-aktivierte Form dar. Es ist auch gezeigt worden, daß es in vivo vollständige biologische Aktivität hat, wie in Haemophilie-Hunden untersucht (Brinkhous, K. M. et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 8752-8756). Die haemostatische Wirksamkeit der 170 kDa Form ist somit gleich wie die der Faktor VIII-Formen mit hohem Molekulargewicht.
Die Tatsache, daß der mittlere, zwischen den Aminosäuren Arg-740 und Glu-1649 liegende stark glykosilierte Bereich der Faktor VIII-Polypeptidkette für eine vollständige biologische Aktivität nicht notwendig zu sein scheint, hat mehrere Forscher zu dem Versuch veranlaßt, rekombinante Faktor VIII-Derivate herzustellen, denen dieser Bereich fehlt. Dies wurde erreicht durch entweder vollständige oder partielle Deletion eines Teils der für den mittleren, stark glykosilierten Bereich von Faktor VIII kodierenden cDNA.
Beispielsweise berichteten J. J. Toole et al. über die Konstruktion und Expression von Faktor VIII, dem die Aminosäuren 982 bis 1562, bzw. 760 bis 1639 fehlen (Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1986) 83, 5939-5942). D. L. Eaton et al. berichteten über die Konstruktion und Expression von Faktor VIII, dem die Aminosäuren 797 bis 1562 fehlen (Biochemistry (1986) 25, 8343-8347). R. J. Kaufmann beschrieb die Expression von Faktor VIII, dem die Aminosäuren 741 bis 1646 fehlen (PCT Anmeldung Nr. WO 87/04187). N. Sarver et al. berichteten über die Konstruktion und Expression von Faktor VIII, dem die Aminosäuren 747 bis 1560 fehlen (DNA (1987) 6, 553-564). M. Pasek berichtete über die Konstruktion und Expression von Faktor VIII, dem die Aminosäuren 745 bis 1562, bzw. die Aminosäuren 741 bis 1648 fehlen (PCT Anmeldung Nr. 88/00831). K.-D. Lagner berichtete über die Konstruktion und Expression von Faktor VIII, dem die Aminosäuren 816 bis 1598, bzw. die Aminosäuren 741 bis 1689 fehlen (Behring Inst. Mitt. (1988) Nr. 82, 16-25, EP 295 597). P. Meulien et al. berichteten über die Konstruktion und Expression von Faktor VIII, dem die Aminosäuren 868 bis 1562, bzw. die Aminosäuren 771 bis 1666 fehlen (Pcotein Engineering (1988) 2(4), 301 - 306, EP 0 303 540 A1). Bei der Expression dieser Deletionsformen von Faktor VIII cDNA in Säugerzellen ist das Produktionsniveau in Vergleich zu Vollängen-Faktor VIII typischerweise 10 Mal höher.
Weiterhin wurden Versuche unternommen, die 90 kDa und 80 kDa Ketten separat von zwei verschiedenen cDNA-Derivaten in der gleichen Zelle zu exprimieren (Burke, R. L. et al. (1986), J. Biol. Chem. 261, 12574 - 12578, Pavirani, A. et al., (1987) Biochem. Biophys. Res. Comm., 145, 234-240). In diesem System hat die in vivo Rekonstitution jedoch anscheinend eine begrenzte Effizienz, bezogen auf gewonnene Faktor VIII:C Aktivität.
Diese Erfindung beschreibt Faktor VIII-cDNA-Deletionsmoleküle, die für rekombinante Faktor VIII-Derivate kodieren, und die, was Molekulargewicht und andere biochemische Merkmale betrifft, einer früher aus Plasma stammenden Faktor VIII-Form entsprechen, welche in kommerziellen Konzentraten in beträchtlichen Mengen vorhanden ist (Andersson, L-O. et al. (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 2979-2983). Es ist wahrscheinlich, daß diese neuen Faktor VIII-cDNA-Deletionsderivate ausreichend hohe Ausbeuten an rekombinantem Faktor VIII-Protein ergeben, um in einem industriellen Verfahren für eine pharmazeutische Herstellung von rekombinantem Faktor VIII verwendet zu werden.

VERWENDETE DEFINITIONEN

In den folgenden Abschnitten ist der Begriff "Faktor VIII-Deletionsderivat" definiert als eine oder mehrere Polypeptidketten mit Faktor VIII:C Aktivität, welche von dem Faktor VIII Vollängen-Polypeptid-Faktor mit 2332 Aminosäuren abgeleitet sind durch Deletion eines Segments, umfassend die Aminosäuren 741 bis 1648, und Ersetzen des Segments durch ein Linkersegment, das aus mindestens drei basischen Aminosäuren, d. h. ausgewählt aus Lysin und Arginin, besteht. Der Begriff "Faktor VIII:RE" ist definiert als eine vom Vollängen-Faktor VIII abgeleitete Polypeptidkette, der die Aminosäuren 741 bis 1648 fehlen. Der Begriff "Faktor VIII:QD" ist definiert als eine vom Vollängen- Faktor VIII abgeleitete Polypeptidkette, der die Aminosäuren 745 bis 1562 fehlen. Der Begriff NFaktor VIII:R3" ist definiert als ein Polypeptid, dem die Aminosäuren 741 bis 1648 fehlen, wobei das Segment durch zwei Argininreste ersetzt ist. Der Begriff "Faktor VIII:R4" ist definiert als ein Polypeptid, dem die Aminosäuren 741 bis 1648 fehlen, wobei das Segment durch drei Argininreste ersetzt ist. Der Begriff "Faktor VIII:R5" ist definiert als ein Polypeptid, dem die Aminosäuren 741 bis 1648 fehlen, wobei das Segment durch vier Argininreste ersetzt ist.

BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung betrifft Techniken zur Herstellung von Proteinen mit Faktor VIII:C-Aktivität. Genauer ausgedrückt stellt die vorliegende Erfindung modifizierte, von der Vollängen-Faktor VIII-cDNA abgeleitete Faktor VIII-cDNA-Sequenzen bereit, die bei Expression in Tierzeilen ein hohes Produktionsniveau von Proteinen mit Faktor VIII:C- Aktivität, welche im wesentlichen aus zwei Polypeptidketten mit Molekulargewichten von 90 kDa bzw. 80 kDa bestehen, ergeben.
Demgemäß stellt die vorliegende Erfindung eine DNA-Sequenz bereit, kodierend für ein biologisch aktives rekombinantes human-Faktor VIII-Derivat, umfassend ein erstes DNA-Segment, das für die 90 kDa Kette von human-Faktor VIII kodiert, und ein zweites DNA-Segment, das für die 80 kDa Kette von human-Faktor VIII kodiert, wobei die Segmente durch ein DNA-Linkersegment miteinander verbunden sind, das für ein Linkerpeptid von mindestens 2 Aminosäureresten, ausgewählt aus Lysin und Arginin, kodiert.
Obwohl die Länge des von dem DNA-Linkersegment kodierten Linkerpeptids nicht kritisch ist, ist es bevorzugt, daß es nicht mehr als etwa 10 Aminosäurereste enthält.
Es ist besonders bevorzugt, daß das Linkerpeptid von 2, 3 oder 4 Aminosäureresten, insbesondere 3 oder 4 Aminosäureresten gebildet ist. Es ist insbesondere bevorzugt, daß der Aminosäurerest, der Glu-1649 voransteht, durch Arginin gebildet ist.
Gemäß der vorliegenden Erfindung ist es bevorzugt, daß alle Aminosäurereste, die das Linkerpeptid bilden, Argininreste sind.
Es ist zu bemerken, daß das Linkerpeptid aus basischen Aminosäuren nämlich Lysin- und/oder Argininresten aufgebaut ist. Unter diesen sind zwei Argininreste bevorzugt.
Die Erfindung betrifft auch einen rekombinanten Expressionsvektor, der eine Transkriptionseinheit, umfassend die DNA-Sequenz wie vorstehend ausgeführt, und weiterhin einen Promotor und eine Polyadenylierungs-Signalsequenz, enthält.
Die Erfindung betrifft auch Wirtszellen tierischen Ursprungs, die mit dem rekombinanten Expressionsvektor, wie vorstehend definiert, transformiert sind.
Zusätzlich betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines biologisch aktiven rekombinanten human-Faktor VIII-Derivats wie vorstehend beschrieben, wobei das Verfahren umfaßt das Kultivieren einer Tierzellinie, die mit einem rekombinanten Expressionsvektor wie vorstehend definiert transformiert ist, in einem Nährmedium, welches Expression und Sekretion eines human-Faktor VIII-Derivats ermöglicht, das aus der 90 kDa Domäne und, über eine Metallionenbindung mit ihr verbunden, der 80 kDa Domäne zusammengesetzt ist, wobei das exprimierte Derivat danach aus dem Kulturmedium gewonnen wird.
Schließlich stellt die Erfindung ein human-Faktor VIII-Derivat bereit, umfassend die 90 kDa Kette und, gegebenenfalls über das Linkerpeptid oder einen Teil davon, über eine Metallionenbindung mit ihr verbunden, die 80 kDa Kette von human-Faktor VIII.
Um ein Protein mit Faktor VIII:C-Aktivität zu erhalten, das aus den obigen Polypeptidketten besteht, muß die während der Translation in vivo erzeugte Polypeptid- Einzelkette entweder durch post-translationelle Prozessierung während des Biosyntheseverfahrens in der produzierenden Zelle oder durch proteolytische Prozessierung in vitro, oder durch beides, gespalten werden. Da ein aus zwei Polypeptidketten mit Molekulargewichten von 200 kDa und 80 kDa bestehendes Protein mit Faktor VIII:C-Aktivität aus human-Plasma isoliert werden kann, wird angenommen, daß auf der Einzelkette des primären Translationsprodukts für den Vollängen-Faktor VIII eine geeignete Spaltstelle für Prozessierungsenzyme vorhanden ist. Eine in vivo wichtige Prozessierungsstelle befindet sich höchstwahrscheinlich an der Carboxyterminalen Seite von Arg-1648. Während der proteolytischen Reifung ergibt die Spaltung bei Arg-1648 ein Faktor VIII-Protein, das aus den obigen Ketten mit Molekulargewichten von 200 kDa und 80 kDa besteht. Da Arg-1648 anscheinend an einer Grenze zwischen Strukturdomänen im Faktor VIll-Molekül lokalisiert ist, kann es ein sterisch zugängliches Ziel für das Prozessierungsenzym oder die Prozessierungsenzyme sein. Eine andere Prozessierungsstelle kann an Arg-740 vorliegen, die eine Überführung der 200 kDa Kette in eine 90 kDa Kette in vitro ergeben würde, somit die in kommerziellen Konzentraten von human-Faktor VIII aus Plasma vorhandene 90 kDa und 80 kDa Form ergeben würde. Erfindungsgemäß wurde festgestellt, daß für die Herstellung von Faktor VIII-Deletionsderivaten, die entweder in vivo oder in vitro zu Proteinen prozessiert werden können, die aus zwei Polypeptidketten mit Molekulargewichten von 90 kDa und 80 kDa bestehen, die 908 Aminosäuren-Polypeptidkette, die im Vollängen-Faktor VIII- Protein Arg-740 und Glu-1649 verbindet, durch mindestens drei basische Aminosäurereste, d. h. Lysin- oder Argininreste oder beides, ersetzt werden kann.
Bevorzugt sollte die Aminosäure an der Amino-terminalen Seite von Glu-1649 ein Argininrest sein.
Die Herstellung von aus zwei Polypeptidketten wie vorstehend ausgeführt bestehenden Faktor VIII-Proteinen in geeigneten Wirtszellen bei hohen Gehalten erfordert den Zusammenbau der cDNAs der Faktor VIII-Deletionsderivate zu effizienten Transkriptionseinheiten, zusammen mit geeigneten Regulationselementen in einem Klonierungsvektor, der nach dem Fachmann bekannten Methoden in E. coli propagiert werden kann. Effiziente Transkriptions-Regulationselemente könnten von Viren abgeleitet werden, die Tierzellen als deren natürlichen Wirte haben, oder von der chromosomalen DNA von Tierzellen. Bevorzugt können Promotor-Enhancer- Kombinationen verwendet werden, die von Simian Virus 40, Adeno-Virus, BK Polyoma- Virus, humanem Zytomegalie-Virus oder dem langen Terminal Repeat von Rous Sarkom-Virus abgeleitet sind, oder Promotor-Enhancer-Kombinationen, umfassend jene von in Tierzellen konstitutiv stark transkribierten Genen wie beta-Actin oder GRP78. Um stabil hohe Gehalte der von den Faktor VIII cDNAs transkribierten mRNA zu erhalten, sollte die Transkriptionseinheit in ihrem 3'-gelegenen Bereich eine für eine Transkriptionsterminations-Polyadenylierungssequenz kodierende DNA-Region enthalten. Bevorzugt ist diese Sequenz aus der frühen Transkriptionsregion von Simian Virus 40, dem beta-Globin-Gen aus Kaninchen oder dem humanen Gewebe- Plasminogen-Aktivator-Gen abgeleitet.
Die derart zu effizienten Transkriptionseinheiten zusammengesetzten Faktor VIII cDNAs werden dann zur Expression der verschiedenen Faktor VIII-Proteine in einen geeigneten Wirtsorganismus eingebracht. Bevorzugt sollte dieser Organismus eine von einem Wirbeltier abstammende Tierzellinie sein, um korrekte Faltung, Bildung von Disulfidbrücken, Asparagin-gekoppelte Glykosilierung und andere post-translationelle Modifikationen sowie Sekretion in das Kulturmedium zu gewährleisten. Beispiele anderer post-translationeller Modifikationen sind Tyrosin O-Sulfatierung und proteolytische Prozessierung der wachsenden Polypeptidkette, die für die Bildung der zweikettigen 90 kDa und 80 kDa Faktor VIII-Moleküle essentiell ist. Beispiele von Zellinien, die verwendet werden können, sind Affen COS-Zellen, Maus L-Zellen, Maus C127-Zellen, Hamster BHK-21-Zellen, humane embryonale Nieren-293-Zellen und vorzugsweise CHO-Zellen.
Die Transkriptionseinheiten, welche die Faktor VIII cDNAs kodieren, können auf mehrere unterschiedliche Wege in eine Tierzellinie eingebracht werden. Beispielsweise können Rekombinaten der vorstehenden Transkriptionseinheiten geschaffen werden und Vektoren, die auf verschiedenen tierischen Viren basieren. Beispiele dafür sind Vektoren, die auf Baculo-Virus, Vaccinia-Virus, Adeno-Virus und bevorzugt Rinder- Papilloma-Virus basieren.
Die Transkriptionseinheiten, welche die Faktor VllfcDNAs kodieren, können auch zusammen mit einem anderen rekombinanten Gen in Tierzellen eingebracht werden, das in diesen Zellen als ein dominanter Selektionsmarker wirken kann, um die Isolation spezifischer Zellklone, welche die rekombinante DNA in ihr Genom integriert haben, zu erleichtern. Beispiele dieser Art von dominanten selektierbaren Markergenen sind Tn5 Aminoglykosidphosphotransferase, die Resistenz gegenüber Geneticin (G418) vermittelt, Hygromycinphosphotransferase, die Resistenz gegenüber Hygromycin vermittelt, und Puromycinacetyltransferase, die Resistenz gegenüber Puromycin vermittelt. Die Transkriptionseinheit, die für einen derartigen Selektionsmarker kodiert, kann entweder auf dem gleichen Vektor vorhanden sein, wie die für die Faktor VIIIcDNA kodierende, oder sie kann von einem separaten Vektor kodiert werden, der gleichzeitig eingebracht wird und in das Genom der Wirtszelle integriert wird, was häufig eine enge physikalische Kopplung zwischen den verschiedenen Transkriptionseinheiten zur Folge hat.
Andere Arten selektierbarer Markergene, welche zusammen mit den Faktor VIII cDNAs verwendet werden können, beruhen auf verschiedenen Transkriptionseinheiten, welche für Dihydrofolatreduktase (dhfr) kodieren. Nach dem Einbringen dieses Typs von Gen in Zellen, denen eine endogene dhfr-Aktivität fehlt, bevorzugt in CHO-Zellen (DUKX-B11, DG-44), wird es diesen ein Wachstum in Nukleosid-freien Medien ermöglichen. Ein Beispiel für ein derartiges Medium ist Ham's F12 ohne Hypoxanthin, Thymidin und Glycin. Diese dhfr-Gene können zusammen mit den Faktor VIII-cDNA Transkriptionseinheiten in CHO-Zellen des obigen Typs eingebracht werden, entweder auf dem gleichen Vektor gekoppelt oder auf verschiedenen Vektoren, wodurch dhfrpositive Zellinien, die rekombinantes Faktor VIII-Protein produzieren, erzeugt werden.
Wenn die obigen Zellinien in der Gegenwart des cytotoxischen dhfr-inhibitors Methotrexat angezogen werden, werden neue, gegenüber Methotrexat resistente Zellinien entstehen. Diese Zellinien können aufgrund der ampliiazierten Anzahl von gekoppelten dhfr- und Faktor VIII-Transkriptionseinheiten rekombinantes Faktor VIII- Protein in einer höheren Rate produzieren. Wenn diese Zellinien in steigenden Methotrexat-Konzentrationen (1-10.000 nM) propagiert werden, können neue Zellinien erhalten werden, die Faktor VIII-Protein in einer sehr hohen Rate produzieren.
Die obigen, Faktor VIII-Protein produzierenden Zellinien können in großem Maßstab angezogen werden, entweder in Suspensionskultur oder auf verschiedenen festen Trägern. Beispiele dieser Träger sind auf Dextran- oder Collagen-Matrices basierende Mikroträger oder feste Träger in Form von Hohlfasern oder verschiedene Keramikmaterialien. Bei der Anzucht in Suspensionskultur oder auf Mikroträgern kann die Kultivierung der obigen Zellinien entweder als eine Chargenkultur oder eine Perfusionskultur mit kontinuierlicher Produktion von konditioniertem Medium über längere Zeiträume durchgeführt werden. Somit sind die obigen Zellinien erfindungsgemäß gut geeignet zur Entwicklung eines industriellen Verfahrens zur Herstellung von rekombinantem Faktor VIII, der dem authentischen aus zwei Polypeptidketten (90 kDa und 80 kDa) bestehenden Faktor VIII, welcher aus human- Plasma isoliert werden kann, entspricht.
Das rekombinante Faktor VIII-Protein, welches sich in dem Medium der CHO-Zellen des obigen Typs anreichert, kann durch eine Reihe von biochemischen Methoden konzentriert und gereinigt werden, umfassend Methoden, die Unterschiede hinsichtlich der Größe, Ladung, Hydrophobie, Löslichkeit, spezifischen Affinität etc. zwischen dem rekombinanten Faktor VIII-Protein und anderen Substanzen im Zellkulturmedium ausnützen.
Ein Beispiel einer derartigen Reinigung ist die Adsorption des rekombinanten Faktor VIII-Proteins an einen monoklonalen Antikörper, der auf einem festen Träger immobilisiert ist. Nach Desorption kann das Faktor VIII-Protein mittels einer Reihe chromatographischer Techniken, die auf den oben genannten Eigenschaften basieren, weiter gereinigt werden.
Die in dieser Erfindung beschriebenen rekombinanten Proteine mit Faktor VIII-Aktivität können zu pharmazeutischen Präparaten zur therapeutischen Verwendung formuliert werden. Die gereinigten Faktor VIII-Proteine können in herkömmlichen physiologisch kompatiblen wässrigen Pufferlösungen aufgelöst werden, zu denen gegebenenfalls pharmazeutische Hilfssubstanzen zugegeben werden können, um pharmazeutische Präparate bereitzustellen.
Die vorliegende Erfindung wird nachstehend durch die sie nicht einschränkenden Beispiele ausführlicher beschrieben. Diese Beschreibung spezifischer erfindungsgemäßer Ausführungsformen erfolgt in Verbindung mit den beigefügten Zeichnungen, worin:
Fig. 1 eine schematische Darstellung der Beziehung zwischen Vollängen-Faktor VIII und Faktor VIII:R3, Faktor VIII:R4 bzw. Faktor VIII:R5 ist. Die Primärstruktur des Bereichs zwischen dem C-Terminus der 90 kDa Kette (Arg-740) und dem N-Terminus der 80 kDa Kette (Glu 1649) ist gezeigt.
Fig. 2 eine Abbildung des Plasmids pKGE491 ist, welches die Faktor VIII:R3-cDNA unter Transkriptionskontrolle des Promotors von humanem Zytomegalie-Virus- enthält.
Fig. 3 eine Abbildung des Plasmids pKGE674 ist, welches die Faktor VIII:R4-cDNA unter Transkriptionskontrolle des human-GRP78-Promotors enthält, und eine zusätzliche, für die Maus-Dihydrofolatreduktase kodierende Transkriptionseinheit unter Transkriptionskontrolle des langen Terminal Repeat von Maus-Brusttumor-Virus.
Fig. 4 eine Abbildung des Plasmids pKGE672 ist, welches die Faktor VIII:R5-cDNA unter Transkriptionskontrolle des human-GRP78-Promotors enthält, und die Maus- Dihydrofolatreduktase, in ähnlicher Weise wie in dem in Fig. 3 abgebildeten Vektor.
Fig. 5 eine Abbildung des Plasmids pKGE327 ist, welches nur die Maus- Dihydrofolatreduktase-cDNA-Transkriptionseinheit (vgl. Fig. 3) enthält.
Fig. 6 eine Abbildung eines Immunblots von Faktor VIII:R3, Faktor VIII:R4, Faktor VIII:R5 und Faktor VIiI aus Plasma nach Polyacrylamidgelelektrophorese in der Gegenwart von Natriumdodecylsulfat ist. Spur A: Faktor VIII aus Plasma. Spur B: Faktor VIII:R3. Spur C: Faktor VIII:R4. Spur D: Faktor VIII:R5, Spur St: vorgefärbter BRL- Molekulargewichtsstandard, hoher Bereich, von Bethesda Research Laboratories.
Fig. 7 ein Diagramm der Veränderungen in der Faktor VIII-Aktivität von rekombinantem Faktor VIII:R5 nach Inkubation mit humanem α-Thrombin zeigt.
Fig. 8 Veränderungen im Muster von SDS-PAGE und Immunblot von rekombinantem Faktor VIII:R5 nach Inkubation mit humanem α-Thrombin zeigt (0,01 NIH-Units Thrombin /1 IU Faktor VIII:C).

BEISPIEL 1

Es wurden ein Reihe Faktor VIII-cDNA Deletionsderivate konstruiert, die für Polypeptidketten kodieren, welchen die gesamte B-Domäne fehlt, aber die eine unterschiedliche Anzahl von basischen Aminosäuren enthalten, die den Carboxy- Terminus der schweren Kette mit dem Amino-Terminus der leichten Kette verbinden. Diese Faktor VIII-Deletionsderivate unterliegen in vivo einer proteolytischen Prozessierung des primären Translationsprodukts in zwei Polypeptidketten. In den nachstehend angegebenen Beispielen bezieht sich die Nomenklatur für die Aminosäuren auf die im Vollängen-Faktor VIII-Molekül ohne das Signalpeptid gegebenen Positionen.

Mutagenese von Faktor VIII-cDNA zur Erzeugung der Faktor VIII:R3 Deletion.

Ein Kpnl-Pstl Restriktionsfragment mit 627 Basenpaaren, erhalten aus der cDNA eines Faktor VIII-Deletionsderivats (Faktor VIII:RE, M. Pasek, PCT Anmeldung Nr. WO 88/00831, ATCC 53517), das für die Aminosäuren Leu 587 bis Ala 1702 von Vollängen- Faktor VIII kodiert, wobei Arg 740 und Glu 1649 über eine direkte Bindung verknüpft sind, wurde nach Standardverfahren in den Bakteriophagen-Vektor M13mp19 (Yanisch- Perron, C. et al. (1985), Gene 33, 103-119) eingebracht. Oligonukleotid-gerichtete Mutagenes (Nakamaye, K. and Eckstein, F. (1986), Nucleic Acids. Res. 14, 9679 - 9688) wurde auf einzelsträngigem, aus dem obigen rekombinanten Bakteriophagen hergestellten DNA-Templat ausgeführt. 10 ug gereinigte zirkuläre einzelsträngige Phagen-DNA wurden annealt an 8 pMol eines 5'-phosphorylierten Oligonukleotids mit der Sequenz:
5'-AACAATGCCATTGAACCAAGAAGAAGAGAAATAACTCGTACTACTCTTCAG-3'
Der zweite zirkuläre DNA-Strang wurde an dem entstandenen Templat synthetisiert durch Zugabe von allen vier Desoxynukleotiden, dCTPαS, 12 Units des Klenow- Fragments von DNA-Polymerase I und 12 Units T4 DNA-Ligase. Nach Inkubation über Nacht bei 16ºC wurde das Reaktionsgemisch durch Filtration durch Nitrocellulose in der Gegenwart von 500 mM NaCl an Doppelstrang-DNA angereichert. Ein Fünftel der gereinigten Doppelstrang-DNA wurde durch Inkubation mit 5 Units des Restriktionsenzyms Ncil genickt (Einführung von Einzelstrangbrüchen) und mit 50 Units Exonuklease III derart behandelt, daß der Templatstrang der Phagen-DNA partiell entfernt wurde. Der entstandene partielle Doppelstrang wurde erneut doppelsträngig gemacht durch Behandlung mit 3 Units DNA-Polymerase I und 2 Units T4 DNA-Ligase in der Gegenwart aller vier Desoxynukleotidtriphosphate während 3 Stunden bei 16ºC. Ein Viertel des entstandenen Gemisches wurde zur Transformation von 300 ul kompetenter E. coli TG1 verwendet. Von den entstandenen mutagenisierten Phagenklonen wurden zehn einer Didesoxy-DNA-Sequenzierung (Sanger, F. et al. (1977), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 5463-5467) unterzogen. Einer der sequenzierten Phagenklone enthielt ein Insert mit der erwarteten, durch den vorstehenden mutagenen Primer vorgegebenen Nukleotidsequenz. Das Phageninsert besteht somit aus einem Kpnl-Pstl Fragment von 630 Basenpaaren der Faktor VIIIcDNA, das für eine Fusion zwischen Arg 740 und Glu 1649 über zwei zusätzliche Arg- Reste kodiert (Faktor VIII:R3).

Konstruktion eines für Faktor VIII:R3 kodierenden Säuper-Expressionsvektors

Das für die Faktor VIII:R3-Fusion wie vorstehend ausgeführt kodierende Kpnl-Pstl Fragment von 630 Basenpaaren wurde aus der doppelsträngigen replikativen Form der M13mp19 Phagen-DNA ausgeschnitten und in den Vektor pKGE431 eingebracht.
Dieser Vektor besteht aus einem Kpnl-Sphl Fragment von 2046 Basenpaaren aus der Faktor VIII:RE-cDNA (M. Pasek, PCT Anmeldung Nr. WO 88/00831, ATCC 53517), das für die Aminosäuren Leu 587 bis Met 2176 des Faktor VIII-Proteins kodiert, in pUC19.
Das für die Faktor VIII:R3-Fusion wie vorstehend ausgeführt kodierende 630 Basenpaar- Fragment wurde in pKGE431 eingebracht, der vollständig mit Kpnl gespalten worden war und partiell mit Pstl gespalten worden war. Der entstandene Vektor pKGE490 enthält ein für die Aminosäuren Leu 587 bis Met 2176 von Faktor VIII:R3 kodierendes Kpnl-Sphl Insert von 2052 Basenpaaren. pKGE490 wurde mit Kpnl und Apal verdaut, und das entsprechende, für Leu 587 bis Ala 2047 des Faktor VIII:R3-Proteins kodierende 1665 Basenpaar-Fragment wurde mit dem großen Fragment des Vektors pKGE347, der mit Kpnl und Apal verdaut worden war, ligiert. Der Vektor pKGE347, der auf dem E. coli Klonierungsvektor p8r327 basiert, besteht aus dem human-Zytomegalie- Virus Enhancer/Promotor, kodiert auf einem 741 Basenpaar-DNA-Segment (Nukleotid- Positionen -671 bis +71, Boshart, M. et al. (1985), Cell 41, 521-530), stromaufwärts der Faktor VI11:QD-cDNA, mit der SV40 t-Antigen Intron- und Polyadenylierungssequenz im · 3'-gelegenen Bereich. Der entstandene Vektor (pKGE491), der in Fig. 2 dargestellt ist, enthält die vollständige Faktor VIII:R3-cDNA und ist identisch zu pKGE347, außer in Bezug auf das unterschiedliche Faktor VIII-Deletionsderivat, welches kodiert wird.

Mutagenese von Faktor VIII-cDNA zur Erzeugung der Faktor VIII:R4 Deletion

Das Kpnl-Pst Fragment von 630 Basenpaaren, das wie vorstehend ausgeführt für einen Teil der Faktor VIII:R3-cDNA kodiert, wurde in den Vektor pUCl9, der mit den gleichen Enzymen geöffnet worden war, eingebracht. Der entstandene Vektor, bezeichnet als pKGE657, wurde danach einer Positions-gerichteten (site directed) Mutagenese durch überlappende Extension unter Verwendung der Polymerasekettenreaktion (Ho, S. N. et al. (1989), Gene 77, 51-59; Saiki, R. K, et al. (1988), Science 239, 487-491) unterzogen. Im ersten Teil der Mutagenesereaktion wurden zwei parallele Experimente angesetzt. Iri Experiment Nummer Eins wurden 100 ng des Plasmids pKGE657 mit jeweils 1 uM der folgenden zwei Primer gemischt:
5'-ATTGAACCAAGAAGAAGAAGAGAAATAACTCGTACT-3'
5'-GATAACAATTTCACACA-3'
In einem endgültigen Reaktionsvolumen von 100 ul wurden dazu 50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl pH 8,3, 1,5 mM MgCl&sub2;, 0,01% Gelatine, jeweils 200 uM der vier Desoxynukleotide und 2,5 Units Taq-Polymerase zugegeben. Die Proben wurden 25 Zyklen von 1-minütiger Denaturierung bei 94ºC, 2-minütigem Annealing bei 50ºC und 3- minütiger Extendierung bei 72ºC unterzogen, unter Verwendung eines DNA Thermal Cycler gemäß den Herstellerangaben (Perkin Eimer Cetus). Eine Analyse der Reaktionsprodukte mittels Agarose-Gelelektrophorese und Ethidiumbromid-Anfärbung nach Standardverfahren deutete auf die Bildung eines einzigen amplifizierten DNA- Produkts mit der Länge von 240 Basenpaaren hin. In Experiment Nummer Zwei wurde die Polymerasekettenreaktion in einer identischen Weise durchgeführt, unter Verwendung der folgenden zwei Primer:
5'-AGTACGAGTTATTTCTCTTCTTCTTCTTGGTTCAAT-3'
5'-GTAACGCCAGGGTTTTCC-3'
Eine Analyse der Reaktionsprodukte mittels Agarose-Gelelektrophorese deutete auf die Bildung eines einzigen amplifizierten DNA-Produkts mit der Länge von 550 Basenpaaren hin. Im zweiten Teil der Mutagenese wurden jeweils 10 ul der Produktgemische aus den zwei vorstehenden parallelen Experimenten in einer dritten Polymerasekettenreaktion in einem Gesamtvolumen von 100 ul kombiniert, unter identischen Bedingungen wie oben, außer daß nur die folgenden zwei Primer verwendet wurden:
5'-G TAAC G C CAG G G TTTTC C-3'
5'-GATAACAATTTCACACA-3'
Eine Analyse des Reaktionsgemisches mittels Agarose-Gelelektrophorese deutete auf die Bildung eines einzigen amplifizierten DNA-Produkts mit der Länge von 750 Basenpaaren hin. Dieses DNA-Fragment wurde mit Kpnl und Pstl verdaut und in den Vektor pUC19 eingebracht, der mit den gleichen Enzymen geöffnet worden war. Mehrere der entstandenen Plasmide wurden einer DNA-Sequenzierung unter Verwendung des Didesoxy-Kettenabbruch-Verfahrens (Sanger F. et al., siehe oben) unterzogen, und ein Plasmid mit dem erwarteten 633 Basenpaar-Kpnl-Pst Fragment mit korrekter Sequenz wurde als pKGE658 bezeichnet. Dieses Plasmidinsert besteht somit aus einem Faktor VIII:R4-cDNA-Fragment, das für eine Fusion zwischen Arg 740 und Glu 1649 über drei zusätzliche Arg-Reste kodiert.

Konstruktion eines für Faktor VIII:R4 kodierenden Säucer-Expressionsvektors

Das Kpnl-Pstl Fragment von 633 Basenpaaren, das für einen Teil der Faktor VIII:R4- cDNA kodiert, wurde aus dem Vektor pKGE658 ausgeschnitten und in den Vektor pKGE490 eingebracht, der vollständig mit Kpnl gespalten worden war und partiell mit Pstl gespalten worden war. Der entstandene Vektor pKGE673 enthält ein für die Aminosäuren Leu 587 bis Met 2176 von Faktor VIII:R4 kodierendes Kpnl-Sphl Insert von 2055 Basenpaaren. Ein Kpnl-Apa1 Fragment von1668 Basenpaaren, das für Leu 587 bis Ala 2047 von Faktor VIII:R4 kodiert, wurde aus pKGE673 ausgeschnitten und auf das große Fragment des Vektors pKGE601, der mit den gleichen Enzymen geöffnet worden war, transferiert. Der Vektor pKGE601, der auf dem E. coli Klonierungsvektor pML2 basiert, besteht aus dem human-GRP78 Enhancer/Promotor, kodiert auf einem 443 Basenpaar-DNA-Fragment (Nukleotid-Positionen 2 bis 445, Ting, J. & Lee, A. S. (1988), DNA 7(4), 275-286), stromaufwärts der Faktor VIII:R5-cDNA mit der SV40 t- Antigen Intron- und Polyadenylierungssequenz im 3'-gelegenen Bereich. Stromabwärts von diesem Bereich angeordnet befindet sich eine für die Maus-DihydrofolatreduktasecDNA kodierende Transkriptionseinheit unter Kontrolle des langen Terminal Repeat von Maus-Brusttumor-Virus, und unter Verwendung des gleichen SV40 3'-Kontrollelements wie oben. Der entstandene Vektor pKGE674 ist in Fig. 3 dargestellt.

Mutagenese von Faktor VIII-cDNA zur Erzeugung der Faktor VIII:R5 Deletion

Der Vektor pKGE657 wurde einer Positions-gerichteten Mutagenese durch überlappende Extension unter Verwendung der Polymerasekettenreaktion unterzogen, in einer zu dem vorstehenden Beispiel in bezug auf Faktor VIII:R4 analogen Weise. In der ersten der zwei parallelen Reaktionen wurden als Primer die folgenden verwendet:
5'-ATTGAACCAAGAAGAAGAAGAAGAGAAATAACTCGTACT-3'
5'-GATAACAATTTCACACA-3'
Analyse der Reaktionsprodukte mittels Agarose-Gelelektrophorese, wie im vorstehenden Beispiel, deutete auf die Bildung eines Reaktionsprodukts von 240 Basenpaaren hin. In der zweiten der zwei parallelen Reaktionen wurden die folgenden Primer verwendet:
5'-AGTACGAGTTATTTCTCTTCTTCTTCTTCTTGGTTCAAT-3'
5'-GTAACGCCAGGGTTTTCC-3'
Analyse der Reaktionsprodukte mittels Agarose-Gelelektrophorese deutete auf ein Reaktionsprodukt von 550 Basenpaaren hin. Der zweite Teil des Mutagenese- Experiments, analog zum obigen Beispiel, ergab ein amplifiziertes DNA-Produkt von 760 Basenpaaren. Nach Verdau dieser DNA mit Kpnl und Pstl wurde sie in pKGE490 eingebracht, der vollständig mit Kpnl gespalten worden war und partiell mit Pstl gespalten worden war.
Ein Plasmid mit dem erwarteten Kpnl-Pst Fragment von 636 Basenpaaren mit korrekter Sequenz, wie durch das Didesoxy-Kettenabbruch-Verfahren (Sanger F. et al., siehe oben) ermittelt, wurde als pKGE659 bezeichnet und enthält insgesamt ein Kpnl-Sphl Insert von 2058 Basenpaaren, welches aus einem Faktor VIII:R5-cDNA-Fragment, das für eine Fusion zwischen Arg 740 und Glu 1649 über vier zusätzliche Arg-Reste kodiert, besteht.

Konstruktion eines für Faktor VIII:R5 kodierenden Säuger-Exnressionsvektors

Ein Kpnl-Apal Fragment von1668 Basenpaaren, das für Leu 587 bis Ala 2047 von Faktor VIII:R5 kodiert, wurde aus pKGE659 ausgeschnitten und auf das große Fragment des Vektors pKGE601, der mit den gleichen Enzymen geöffnet worden war, transferiert, in einer ähnlichen Weise wie vorstehend für den Faktor VIII:R4 Expressionsvektor pKGE674 beschrieben. Der entstandene, für Faktor VIII:R5 kodierende Vektor (pKGE672) ist in Fig. 4 dargestellt.

BEISPIEL 2

Herstellung von Faktor VIII:R3 produzierenden Eierstockzellen aus chinesischem Hamster

In einer Zellkulturschale mit einem Durchmesser von 10 cm wurden 0,5 Millionen Dihydrofolatreduktase-defiziente Eierstockzellen aus chinesischem Hamster (Chinese Hamster Ovary Cells, CHO-DG44, erhalten von Dr. L A Chasin, Columbia University, New York) in Dulbeccos's Modified Eagles Medium/Ham's F12 (1 : 1), ergänzt mit 10% fötalem Kälberserum, angesät und bei 37ºC in einem 5% Kohlendioxid-Inkubator über Nacht inkubiert. Am nächsten Tag wurden die Zellen mit frischem Medium gewaschen und anschließend durch das Calciumphosphat-Verfahren gemäß Methoden aus dem bekannten Stand der Technik mit 10 ug eines 1 : 1 Gemisches des Faktor VIII:R3- Expressionsvektors pKGE491 und des Dihydrofolatreduktasevektors pKGE327 transfiziert. Der Vektor pKGE327 enthält eine im Uhrzeigersinn in den Vektor pML2 klonierte Transkriptionseinheit, die aus dem langen Terminal Repeat von Maus- Brusttumor-Virus stromaufwärts der Maus-Dihydrofolatreduktase-cDNA mit der SV40 t- Antigen- und Polyadenylierungssequenz im 3'-gelegenen Bereich besteht (Fig. 5). Am Tag drei wurde das Medium entfernt, die Zellen wurden gewaschen und in neue Kulturschalen aufgeteilt. Am Tag vier wurde die Selektion auf Dihydrofolatreduktasepositive Zellen begonnen durch Ersetzen des Mediums mit dem obigen Zeflkulturmedium ohne Hypoxanthin, Glycin und Thymidin, und ergänzt mit 10% gründlich dialysiertem fötalen Kälberserum. Das Medium wurde zweimal pro Wochew gewechselt und nach annähernd zwei Wochen konnten Kolonien von Dihydrofolatreduktase-positiven Zellen geerntet werden. Diese Kolonien wurden gepoolt und in 25 cm² Zellkulturflaschen weiter angezogen, und kurz vor dem Zusammenfließen wurde das Medium durch frisches Medium, enthaltend 3% fötales Kälberserum, ersetzt. Nach einem Zeitraum von 24 Stunden wurde die Faktors VIII:C-Aktivität im Kulturmedium unter Verwendung des synthetischen Substratverfahrens (Coatest Faktor VIII:C, KABI-Pharmacia) getestet, und ein Expressionsgehalt von 80 mU/ml wurde erhalten. Der Pool von Dihydrofolatreduktase-positiven Zellen machte während mehrwöchiger Kultivierung in Medium, das den Dihydrofolatreduktase-Inhibitor Methotrexat enthielt, eine Genamplifikation durch. Nach Selektion durch stufenweise Erhöhung der Methotrexat-Konzentration bis auf 500 nM wurde ein Pool resistenter Zellen erhalten, die in Rüttelflaschen Faktor VIII:C in einem Gehalt von 1,0 U/ml produzierten.

Herstellung von Faktor VIII:R4 produzierenden Eierstockzellen aus chinesischem Hamster

In einer ähnlichen Weise zu der obigen Transfektion des für Faktor VIII:R3 kodierenden Expressionsvektors wurden Eierstockzellen aus chinesischem Hamster mit dem für Faktor VIII:R4 kodierenden Expressionsvektor pKGE674 transfiziert. Diesmal wurde die Cotransfektion mit pKGE327 weggelassen, da eine für den Selektions- und Amplifikationsmarker Dihydrofolatreduktase kodierende Transkriptionseinheit auf diesem Vektor vorhanden ist. Nach Selektion in Medium ohne Hypoxanthin, Glycin und Thymidin, und das ähnlich wie oben mit 10% gründlich dialysiertem fötalen Kälberserum ergänzt war, wurde ein Pool von Zellklonen erhalten, die 400 mU/ml Faktor VIII:C- Aktivität, wie mit der Coatest-Methode ermittelt, erzeugten. Eine Selektion auf Genamplifikation durch mehnrvöchige Kultivierung in 20 nM Methotrexat ergab einen Pool von Zellen, die 500 mU/ml Faktor VIII:C produzierten. Weitere Selektion durch Kultivierung in 200 nM Methotrexat enthaltendem Medium ergab einen Pool von Zellen, die 980 mU/ml Faktor VIII:C produzierten. Bei Kultivierung in Rüttelflaschen produzierten diese Zellen 800 mU/ml Faktor VIII:C.

Herstellung von Faktor VIII:R5 produzierenden Eierstockzellen aus chinesischem Hamster

Ähnlich wie oben wurden Eierstockzellen aus chinesischem Hamster mit dem für Faktor VIII:R5 kodierenden Expressionsvektor pKGE672 transfiziert, der die Transkriptionseinheiten sowohl für Faktor VIfl:R5 als auch für Dihydrofolatreduktase auf dem gleichen Plasmid kodiert. Nach Selektion in Medium ohne Hypoxanthin, Glycin und Thymidin, und das mit 10% gründlich dialysiertem fötalen Kälberserum ergänzt war, wurde ein Pool von Zellklonen erhalten, die 110 mU/ml Faktor VIII:C-Aktivität, wie mit der Coatest-Methode ermittelt, produzierten. Selektion auf Genamplifikation durch mehrwöchige Kultivierung in 20 mM Methotrexat ergab einen Pool von resistenten Zellklonen, die in Rüttelflaschen 1,5 U/ml Faktor VIII:C produzierten.

BEISPIEL 3

Biochemische Charakterisierung von Faktor VIII:R3, Faktor VIII:R4 und Faktor VIII:R5

Faktor VIII:R3, Faktor VlII:R4 und Faktor VIII:R5, die wie in Beispiel 2 beschrieben durch ihre entsprechenden amplifizierten CHO-DG44 Zellinien-Pools produziert worden waren, wurden auf ihre charakteristischen biochemischen Merkmale untersucht. Eine Reinigung des Materials aus Kulturmedium wurde durchgeführt durch Immunoaffinitäts- Chromatographie unter Verwendung monoklonaler, gegen Faktor VIII gerichteter Antikörper, gefolgt von einem Ionenaustausch-Chromatographieschritt. Die spezifische Aktivität des erhaltenen gereinigten Materials lag im Bereich von 3000 bis 4000 IU/A&sub2;&sub8;&sub0; und das Verhältnis von Faktor VIII-Aktivität / Faktor VIII-Antigen war nahezu 1 (Aktivität wurde mittels Coatest (KABI-Pharmacia) gemessen und Antigen wurde mittels eines ELISA-Tests unter Verwendung von monoklonalen, gegen die 80 kDa Kette gerichteten Antikörpern bestimmt).
Die gereinigten Faktor VIII:R3, Faktor VIII:R4 und Faktor VIII:R5 wurden einer SDS- Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) und Westernblot-Analyse unterzogen. Die SDS-PAGE wurde gemäß Laemmli (1970, Natur 227, 680-685) durchgeführt. Polyklonale anti-human-Faktor VIII-Antikörper aus Kaninchen, früher beschrieben (Andersson, L-O. et al. (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 2979-2983), wurden für die Westernblot-Analyse verwendet, die im wesentlichen ausgeführt wurde wie von Towbin, H. et al. (1979, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76, 4350-4354) beschrieben. Die Ergebnisse sind in Fig. 6 gezeigt. Spur A: Plasma-Faktor VIII, der eine 80 kDa leichte Kette und schwere Ketten im Bereich von 200 kDa bis 90 kDa enthält. Spur B: Faktor VIII:R3. Spur C: Faktor VIII:R4. Spur D: Faktor VIII:R5. Faktor VIII:R3 zeigt Banden bei 80 kDa, 90 kDs, 130 kDa und 170 kDa. Die 80 kOs und 90 kDa Banden wurden auf dem Gel in den gleichen Positionen gefunden wie die 80 kDa und 90 kDa Peptide, die den kleinsten biologisch aktiven Komplex von Plasma-Faktor VIII darstellen. Die 170 kDa Bande stellt vermutlich das nicht prozessierte primäre Translationsprodukt dar und die Bande bei 130 kDa eine nicht-korrekt prozessierte Form von Faktor VIII:R3. Somit wurden zusätzlich zu den 80 k0a und 90 kDa Ketten auch nicht-authentische Polypeptidketten erhalten. Faktor VIII:R4 und Faktor VIII:R5 zeigen Banden bei 80 kDa und 90 kDa. In diesen Materialien waren keine signifikanten Mengen an nicht prozessiertem primären Translationsprodukt (170 kDa Kette) vorhanden. Das bedeutet, daß in diesen Fällen die proteolytische in vivo Prozessierung des primären Translationsprodukts zu zwei Polypeptidketten effizient verlief. Somit wurde in beiden Fällen ein zweikettiges Molekül mit Peptidketten mit Molekulargewichten, entsprechend denjenigen, die in der kleinsten aktiven Form von Plasma-Faktor VIII vorhanden sind, erhalten. Weiterhin zeigte die Bestimmung der N-terminaien Sequenz von Faktor VIII:R5 mittels automatisiertem Edman-Abbau, daß die Amino-Termini der 90 kDa und 80 kOa Ketten zu denen von 90 kDa plus 80 kDa Faktor VIII aus Plasma identisch sind.
In den Fig. 7 und 8 sind die Aktivierungskurve und das SDS-PAGE / Westernblot Muster gezeigt, die erhalten wurden nach Inkubation von Faktor VIII:R5 mit Thrombin (0,01 U Thrombin pro 1 U Faktor VIII wurden zugegeben). Für einen unmittelbaren Test von Proben aus dem Reaktionsgemisch wurde ein einstufiges Gerinnungsverfahren (Mikaelsson, M. et al. (1983), Blood 62, 1006-1015) verwendet. Eine 17-fache Aktivierung wurde innerhalb von zwei Minuten erhalten, wonach Inaktivierung eintrat. Natriumdodecylsulfat wurde zu 0,02 g/ml zugegeben um die Reaktion in Proben zu stoppen, für Analyse durch SDS-PAGE I Westernblotting. Elektrophorese und Westernblot-Analyse wurden mit Proben durchgeführt, die während der Reaktion in Zeitintervallen entnomrüen worden waren, wie in bezug auf Fig. 6 beschrieben. Die erhaltenen Ergebnisse zeigten eine molekulare Veränderung von Faktor VIII-Peptiden, welche identisch war zu der von Plasma-Faktor VIII bei Inkubation mit Thrombin. Das 90 kDa Peptid wurde demnach durch Thrombin gespalten und es wurde ein 50 kDa plus ein 40 kDa Peptid gebildet. Das 80 kDa Peptid wurde gespalten und es wurde ein 70 kDa Peptid gebildet. Die Untersuchungen mit Thrombin zeigten, daß Faktor VIII:R5 sich bezüglich der Wechselwirkung mit diesem Enzym wie Plasma-Faktor VIII verhält. Diese Eigenschaft wird für biologische Aktivität in vivo als essentiell angesehen.
Die Wechselwirkung von Faktor VIILR5 mit humanem von Willebrandt-Faktor wurde unter Verwendung von Größenausschluß-Chromatographie über Sepharose CL-6B untersucht. Zehn (10) IU Faktor VIII:R5 wurden 20 Minuten bei 37ºC mit 30 U gereinigtem humanen von Willebrandt-Faktor inkubiert. Das Inkubationsgemisch wurde danach auf eine mit Sepharose CL-6B gepackte Säule aufgetragen. Das gesamte Material mit Faktor VIII-Aktivität eluierte im Hohlraumvolumen mit von Willebrandt- Faktor. Wenn Faktor VIII:R5 ohne Zugabe von von Willebrandt-Faktor auf die Säule aufgetragen wurde, eluierte Material mit Faktor VIII-Aktivität lediglich in den inneren Fraktionen an einer Position, an der auch die 90 kDa - 80 kDa Form von Plasma-Faktor VIII eluierte. Dieses Ergebnis zeigt, daß Faktor VIII:R5 die Fähigkeit zur Bindung an von Willebrandt-Faktor aufweist, was eine für eine gute in vivo Überlebensfähigkeit erforderliche Eigenschaft ist (Brinkhous, K. M. et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 8752-8756).
Die Faktor VIII-Derivate der vorliegenden Erfindung sind am 13. März 1991 bei der Deutschen Sammlung von Mikrorganismen und Zellkulturen hinterlegt worden. Demgemäß wurde Faktor VIII:R3 die Hinterlegungsnummer DSM 6415 zugeteilt, Faktor VIII:R4 wurde die Hinterlegungsnummer DSM 6417 zugeteilt und Faktor VIII:R5 wurde die Hinterlegungsnummer DSM 6416 zugeteilt.

Claims

1. DNA-Sequenz, kodierend für ein biologisch aktives rekombinantes human-Faktor VIII-Derivat, umfassend ein erstes DNA-Segment, das für die Aminosäuren 1 bis 740 von human-Faktor VIII kodiert, und ein zweites DNA-Segment, das für die Aminosäuren 1649 bis 2332 von human-Faktor VIII kodiert, wobei die Segmente durch ein DNA-Linkersegment, das für ein Linkerpeptid von mindestens 3 und bis zu etwa 10 Aminosäureresten, ausgewählt aus Lysin und Arginin, kodiert, miteinander verbunden sind.

2. DNA-Sequenz nach Anspruch 1, wobei das DNA-Linkersegment für 3 oder 4 Aminosäurereste kodiert.

3. DNA-Sequenz nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das DNA- Linkersegment für 3 oder 4 Aminosäurereste kodiert, wobei der Aminosäurerest, der Glu-1649 voransteht, Arginin ist.

4. DNA-Sequenz nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei alle Aminosäurereste des Linkers Arginin sind.

5. DNA-Sequenz nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das DNA- Linkersegment für 3 oder 4 durch Arginin gebildete Aminosäurereste kodiert.

6. Rekombinanter Expressionsvektor, enthaltend eine Transkriptionseinheit, umfassend die DNA-Sequenz nach einem der vorhergehenden Ansprüche, einen Transkriptionspromotor und eine Polyadenylierungssequenz.

7. Wirtszelle tierischen Ursprungs, die mit dem rekombinanten Expressionsvektor nach Anspruch 6 transformiert ist.

8. Verfahren zur Herstellung eines biologisch aktiven rekombinanten human-Faktor VIII-Derivats, welches durch eine DNA-Sequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 5 exprimiert wird, umfassend das Kultivieren einer Tierzellinie, die mit einem rekombinanten Expressionsvektor, enthaltend eine Transkriptionseinheit, umfassend die DNA-Sequenz, einen Transkriptionspromotor und eine Polyadenylierungssequenz, transformiert ist, in einem Nährmedium, welches Expression und Sekretion eines human-Faktor VIII-Derivats ermöglicht, das aus zwei Polypeptiden mit Molekulargewichten von 90 kDa bzw. 80 kDa zusammengesetzt ist, welche über eine Metallion-Bindung miteinander verbunden sind, und das Gewinnen des Derivats aus dem Kulturmedium.