DE69032043T2

DE69032043T2 - Proteinkomplexe mit faktor viii:c-aktivität und deren herstellung

Info

Publication number: DE69032043T2
Application number: DE69032043T
Authority: DE
Inventors: Rae Burke; Barbara Chapman; Jan Mikkelsen; Mirella Rasmussen
Original assignee: Novo Nordisk AS; Chiron Corp
Current assignee: Novo Nordisk AS; Novartis Vaccines and Diagnostics Inc
Priority date: 1989-11-17
Filing date: 1990-11-15
Publication date: 1998-06-04
Anticipated expiration: 2010-11-16
Also published as: JP2771129B2; EP0670332A2; EP0670332A3; FI922204A0; KR927003812A; JPH0856656A; ZA909167B; YU78194A; IL111304A0; PT95923A; JPH05502025A; NO921946D0; PT95923B; CA2135744A1; DE69032043D1; IL96368A0; HUT70457A; PL287807A1; NZ236094A; SK130194A3

Description

TECHNISCHES GEBIET

Die Erfindung betrifft Proteinkomplexe, welche Faktor VIII:C-Aktivität besitzen, und Verfahren zur Herstellung dieser Komplexe durch Expression geeigneter Polynucleotidkonstrukte. Die Proteinkomplexe sind bei der Behandlung der klassischen Hämophilie (Typ A) von Nutzen.

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Die Hämophilie A ist eine X-chromosomal gebundene Erbkrankheit, die 1-2 von 10.000 Männern betrifft. Die Erkrankung wird durch eine Abwesenheit oder eine Defizienz von Faktor VIII:C verursacht. Faktor VIII:C ist ein sehr großes Glykoprotein (natives Mr 330 K - 360 K), welches im Plasma in extrem niedrigen Konzentrationen vorhanden ist. Es ist ein notwendiges Element in der proteolytischen Kaskade, welche lösliches Fibrinogen in unlösliches Fibrin umwandelt, wodurch ein Blutgerinsel gebildet wird, welches Blutverlust von traumatisiertem Gewebe verhindert. Es wird im Blutstrom in nichtkovalenter Assoziation mit dem Faktor VIII:R ("von Willebrand-Faktor") gefunden, der als ein stabilisierendes Trägerprotein wirkt. Faktor VIII:C ist gegenüber einer Spaltung durch Thrombin, Plasmin, Protease C und anderen Serinproteasen sehr empfindlich. Es wird im allgemeinen aus Plasma oder Plasmaprodukten als eine Reihe verwandter Polypeptide isoliert, die im Bereich von Mr 160 K-40 K liegen, mit überwiegenden Arten von Mr 92 K und Mr 80 K-77 K. Dieses Komplexmuster hat die Analyse der Struktur des aktiven Faktors VIII:C sehr schwierig gemacht.
Faktor VIII:C und die verwandten Polypeptide wurden von F. Rotblat et al, Biochemistry (1985) 24:4294-4300; G.A. Vehar et al, Nature (1984) 312: 337-342; J.J. Tooleet et al, Nature (1984) 312: 342-347; und M.A. Truett et al, DNA (1985) 4:333-349 beschrieben. E. Orr et al, Molecular Genetics of Clotting Factors, Seite 54, 5321, berichteten von einer "Spacer"-Funktion der stark glykosilierten Region des Faktors VIII:C. Die Sequenz wurde von J.J. Toole et al, supra; W.I. Wood et al, Nature (1984) 312:330-336; und M.A. Truett et al, supra beschrieben. Das Vollängeprotein enthält drei Wiederholungen einer Sequenz (I) und zwei Wiederholungen einer zweiten Sequenz (III). Eine dritte stark glykosilierte Sequenz (II) ist zwischen den zweiten und dritten I-Wiederholungen vorhanden und wird offensichtlich proteolytisch gespalten, um die Mr 92 K und Mr 80 K-Polypeptide zu bilden. Die ersten beiden I-Wiederholungen bilden die A- Domäne, während die dritte I-Wiederholung und die zwei III-Wiederholungen die C-Domäne bilden. Die II-Sequenz bildet die B-Domäne. Somit hat das Vollängeprotein die Struktur I&sub1;-I&sub2;- II-I3-III&sub1;-III&sub2; (A-B-C), während die Mr 92 K und Mr 80 K-Polypeptide (A und C) die Strukturen I&sub1;-I&sub2; bzw. I&sub3;-III&sub1;-III&sub2; besitzen. C. Fulcher et al, J Clin Invest (1985) 76: 117-124 haben vorgeschlagen, daß basierend auf Antikörper-Epitop-Daten mit Faktor VIII:C sowohl die Mr 92 K als auch die Mr 80 K-Polypeptide ftir die Faktor VIII:C-Funktion notwendig sind.
Historisch gesehen wurde Faktor VIII:C aus Blut in konzentrierter Form zur therapeutischen Behandlung von Hämophilie isoliert. Jedoch haben Bedenken, welche die Übertragung von HIV und andere blutübertragene Krankheiten betreffen, die Aktivität stimuliert, eine alternative Versorgung mit Faktor VIII:C bereitzustellen. Es ist von wesentlichem Interesse, in der Lage zu sein, Zusammensetzungen bereitzustellen, die Faktor VIII:C-Aktivität besitzen, ohne daß es dabei Bedenken bezüglich der Übertragung viraler Krankheiten, die mit natürlichem Faktor VIII:C assoziiert sind, gibt.
Obwohl Vollänge-rekombinanter humaner Faktor VIII:C hergestellt wurde, ist er schwierig zu reinigen und zu charakterisieren und ist aufgrund von Proteolyse instabil. Effiziente rekombinante Herstellung des Vollängemoleküls zur klinischen Verwendung ist augenblicklich zweifelhaft.
EP-A-0 232 112 beschreibt die rekombinante Herstellung eines Proteinkomplexes, welcher humaner Faktor VIII:C-Aktivität besitzt, und dem Teile oder die vollständige B-Domäne des humanen Faktors VIII:C fehlt.
R.L. Burke et al, 3 Biol Chem (1986) 261:12574-78 beschrieben die Expression eines aktiven Faktor VIII:C-Komplexes aus Zellen, die gleichzeitig mit Polynucleotiden transfiziert wurden, die für die Mr 92 K und Mr 80 K-Polypeptide codieren. Das erhaltene Protein zeigte eine Aktivität, die der des donierten Vollängefaktors VIII:C, der unter ähnlichen Bedingungen exprimiert wurde, gleich war. O. Nordfang et al, J Biol Chem (1988) 263:1115-18 beschrieben die in vitro-Assoziation aktiver Faktor VIII:C-Komplexe aus getrennten Präparationen von Mr 92 K-Protein und Mr 80 K-Protein (FVIII-HC bzw. -LC). Eine erfolgreiche Assoziation erforderte divalente Metallionen (insbesondere Mn und Ca) und Thiole, jedoch konnte lediglich eine kleine Menge von FVIII-HC in aktives FVIII:C komplexiert werden.

BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Von den Erfindern wurde nun ein verbessertes Verfahren zur Expression rekombinanter Proteinkomplexe mit hoher Stabilität und Faktor VIII:C-Aktivität gefünden Das Mr 92 K-Polypeptid (FVIII-HC) und das Mr 80 K-Polypeptid (FVIII-LC) wurden als zwei getrennte Polypeptide unter der Kontrolle getrennter Promotoren in der gleichen Wirtszelle exprimiert. Jedes Polypeptid wird vorzugsweise unter Verwendung einer Signalsequenz exprimiert, welche den Export in den extrazellulären Raum mit Spaltung der Signalsequenz steuert. FVIII-HC kann gemäß eines ersten Aspekts der Erfindung als ein Fusionsprotein exprimiert werden, welches eine C-terminale Extension besitzt. Die Extension umfaßt eine Polypeptidsequenz, die zu der N- terminalen Sequenz der B-Domäne homolog ist (welche die Spaltung durch Thrombin ermöglichen kann), einen Polypeptid-Spacer mit 3 bis 100 Aminosäuren und eine Sequenz, die homolog zu der C-terminalen Sequenz der B-Domane ist. Eine C-terminale Extension von FVIII-HC führt zu einer hohen Ausbeute aktiven Polypeptides nach Expression in eukaryotischen Wirtszellen. FVIII-HC kann gemäß eines zweiten Aspektes der Erfindung ohne jegliche C-terminale Exten sion in der authentischen Form mit dem korrekten C-Terminus exprimiert werden. In diesem Fall wird eine weitere Thrombinspaltung, die in sich das Risiko einer weiteren Degradation trägt, vermieden. FVIII-LC wird vorzugsweise als ein LC-Polypeptid unter Verwendung eines Signalpeptids exprimiert. Das FVIII-LC-Polypeptid wird in effizienter Weise mit dem korrekten N- terminalen Aminosaurerest prozessiert und sekretiert und korrekt glykosiliert. Die Cotransfektion geeigneter Wirtszellen mit Polynucleotiden, die mit FVIII-HC und FVIII-LC codieren, führt zu rekombinanten Proteinkomplexen, die Faktor VIII:C-Aktivität in hoher Ausbeute besitzen.
Der Begriff "Polynucleotid", so wie er hier verwendet wird, betrifft DNA- oder RNA- Sequenzen, die einzel- oder doppelsträngig (ss oder ds) sein können oder ein DNA-RNA-Heteroduplex. In den meisten Fällen bedeutet hier Polynucleotid dsDNA.
Der Begriff "Signalpeptid", so wie er hier verwendet wird, bezieht sich auf eine Peptidsequenz, die während der Expression des Polypeptides von Signalpeptidase erkannt wird und auf welches Signalpeptidase wirkt. Signalpeptide codieren für Peptidstellen zur Signalpeptidasespaltung und bewirken, daß das gebundene Polypeptid in den Sekretionspfad transportiert wird, der zum extrazellulären Medium führt.
Der Begriff "A-Domäne" bezieht sich auf den Teil des menschlichen Faktors VIII:C, der die Mr 92 K-Proteinuntereinheit bildet. Die A-Domäne enthält von etwa 740 bis etwa 760 Aminosäuren und wird am N-Terminus des nativen humanen Faktors VIII:C gefunden. Das A-Domäne-Polypeptid erstreckt sich von Aminosäure 10, üblicherweise Aminosäure 1, bis wenigstens Aminosäure 620, üblicherweise bis wenigstens Aminosäure 675, am üblichsten bis wenigstens etwa Aminosäure 740. Das Polypeptid wird wenigstens etwa 85% der A-Domäne einschließen (Wood et al, supra), üblichererweise wenigstens 90%, vorzugsweise etwa 100% und kann optional einen Teil des N-Terminus der B-Domäne einschließen, der typischerweise nicht über etwa Aminosäure 1405 hinausgeht. Von besonderem Interesse ist eine N-terminale Kette, die die gesamte Sequenz der thrombolytischen Spaltstelle an Arg&sub7;&sub4;&sub0;-Ser&sub7;&sub4;&sub1; besitzt.
Der Begriff "B-Domäne" bezieht sich auf den Teil des nativen humanen Faktors VIII:C. der im allgemeinen durch intrazelluläre Spaltung entfernt wird, und der, wenn er in Säugerzellen, wie z.B. COS7 und CHO exprimiert wird, stark glykosiliert ist. Die B-Domäne enthält eine N- terminale Sequenz, die die Spaltung der A-Domäne von der B-Domäne durch Thrombin erlaubt. Die B-Domäne hat ebenfalls eine C-terminale Prozessierungsstelle, welche die Spaltung der C- Domäne vom A-B-Vorläufer durch ein Enzym erlaubt, welches im Golgi-Apparat der Säugerzelle lokalisiert ist. Die Sequenzen des N-Terminus und C-terminale Sequenzen sind unten in den Beispielen gezeigt. Den erfindungsgemäßen Komplexen, denen "ein wesentlicher Teil der B- Domäne" fehlt, fehlt im wesentlichen die vollständige B-Domäne mit Ausnahme der N-terminalen und C-terminalen Sequenzen.
Der Begriff "C-Domäne" bezieht sich auf den Teil des nativen humanen Faktors VIII:C, welcher den C-Terminus des Vollängeproteins bildet, und wird intrazellulär gespalten, um die Faktor VIII:C-leichte Kette zu bilden. Die leichte Kette wird eine Aminosäuresequenz besitzen, die im wesentlichen die gleiche ist wie die Aminosäuresequenz des C-Terminus eines Faktor VIII.C-Polypeptides, üblicherweise wenigstens etwa 80%, mehr üblichererweise wenigstens etwa 90% der Faktor VIIIC Mr 80 K-Kette, insbesondere beginnend mit Arninosäure 1570, üblicherweise Aminosäure 1600, im besonderen Aminosäure 1625, in mehr bevorzugter Weise Aminosäure 1640, vorzugsweise etwa an Aminosäure 1649 ±10 Aminosäuren, in mehr bevorzugter Weise ±1 Aminosäure, und sich bis wenigstens etwa Aminosäure 2300, üblicherweise 2310, ±10 Aminosäuren, vorzugsweise 2325 ±5 Aminosäuren, mehr bevorzugt bis zu der terminalen Aminosäure (2332) erstrecken. Üblicherweise wird die leichte Kette wenigstens etwa 85%, gewöhnlicher wenigstens 95% der C1-C2-Domänen vorzugsweise der A3-C1-C2-Domänen besitzen.
Der Begriff "Coexpression", so wie er hier verwendet wird, bezieht sich auf die gleichzeitige Expression eines A-Domäne-Polypeptides und eines C-Domäne-Polypeptides innerhalb der gleichen Wirtszelle. Die Polynucleotidsequenzen, die für die A- und C-Domänen codieren, können auf der gleichen oder auf verschiedenen Expressionskassetten oder -plasmiden sein. Die Coexpression der A- und C-Domänen ermöglicht es, daß die korrekte Faltung stattfindet, welche wiederum zu einem A-C-Komplex führt, der eine höhere Aktivität und Effizienz der Sekretion besitzt.
Der Begriff "Zellwachstumsmedium", so wie er hier verwendet wird, bezieht sich auf jedes Medium, das für das Kultivieren von Wirtszellen geeignet ist und schließt Medien ein, die für den Erhalt einer Expression von rekombinanten Proteinen geeignet ist, egal ob tatsächlich "Wachstum" stattfindet oder nicht. Zellwachstumsmedien schließen im allgemeinen mehr Stoffe und eine metabolisierbare Energiequelle in einer wässrigen Lösung ein. Falls gewünscht, können Zellkulturmedien außerdem eine Verbindung einschließen, welche die Expression des erfindungsgemäßen rekombinanten Polypeptides einschließen. Die Auswahl einer derartigen induzierenden Verbindung hängt von dem zur Kontrolle der Expression ausgewählten Promotor ab. Andere typische Zusätze schließen Selektionsverbindungen (d.h. Medikamente oder andere Chemikalien, die dem Medium zugegeben werden, um sicherzustellen, daß lediglich transformierte Wirtszellen im Medium überleben) und Serum, wie z.B. fötales Rinderserum (FBS), ein. "Serumfreies Medium" ist eine Lösung, die zu einem solchen Ausmaß supplementiert wurde, daß die notwendigen Spurenfaktoren, die im Serum vorhanden sind, nicht in Form von Serum zugegeben werden müssen. Viele geeignete Zellkulturmedien sind von kommerziellen Quellen erhältlich.
Der Begriff "Polypeptid-Spacer" bezieht sich auf eine Polypeptidsequenz von etwa 3 bis etwa 100 Aminosäuren, die im allgemeinen der humanen Faktor VIII:C-B-Domäne nicht homolog ist, und die weniger als 5 mögliche N-gebundene Glykosilierungsstellen trägt. Vorzugsweise besitzt diese Polypeptidsequenz zwei oder weniger derartige Stellen. Augenblicklich nimmt man an, daß die große Größe und das große Ausmaß der Glykosilierung der B-Domäne eine effiziente Expression des Mr 92 K-Polypeptids verhindert. Es wird ebenso angenommen, daß die A- Domäne nicht in korrekter Weise auf konsistenter Basis in Abwesenheit der B-Domäne gefaltet werden kann, so daß lediglich ein geringer Prozentsatz der A-Domäne korrekt gefaltet ist und exprimiert wird.
Der Polypeptid-Spacer gemäß des ersten Aspektes der Erfindung stellt eine C-terminale Extension der A-Domäne bereit und stabilisiert offensichtlich das Polypeptid und verbessert die Sekretion in aktiver Form. Somit kann es sein, daß die Verwendung eines Polypeptides, das schwach (oder garnicht) glykosiliert ist, verhindert, daß beim A-Domäne-Spacerkonstrukt die gleichen Größenprobleme auffauchen, die die Expression des Vollängefaktors VIII:C verhindern. Der augenblicklich bevorzugte Spacer wird von einem menschlichen Ig-schwere-Kette-Verbindungsteil, insbesondere vom humanen IgA1, abgeleitet. Dieser Spacer stellt eine flexible Extension bereit, ohne daß ein immunogenes Epitop zugefügt wird (bei Verabreichung an Menschen). Gemäß des zweiten Aspektes der Erfindung kann eine sehr hohe und nützliche Koagulationsaktivität erhalten werden, wenn das Mr 92 K-Polypeptid, in dem die B-Domäne vollständig entfernt wurde, zusammen mit der Mr 80 K-Kette coexprimiert wird.
Der Begriff "Homologie" so wie er hier verwendet wird, bedeutet Identität oder wesentliche Annlichkeit zwischen zwei Polynucleotiden oder zwei Polypeptiden. Die Homologie wird auf der Basis der Nucleotid- oder Aminosäuresequenz des Polynucleotides oder des Polypeptides bestimmt. Allgemein ausgedrückt werden sich üblicherweise nicht mehr als 10, gewöhnlich nicht mehr als 5 Zahlen-%, vorzugsweise nicht mehr als etwa 1 Zahlen-% der Aminosäuren in den Ketten von den Aminosäuren unterscheiden, die natürlicherweise in den Faktor VIII: C-A- und -C-Domänen vorhanden sind. Insbesondere werden nicht mehr als etwa 5%, gewöhnlich nicht mehr als etwa 1% nichtkonservative Substitutionen sein. Konservative Substitutionen schließen ein:
Gly E> Ala; Lys E> Arg;
Val E> Ile E> Leu; Asn E> Gln; und
Asp E> Glu; Phe E> Trp E> Tyr.
Nichtkonservative Austausche sind im allgemeinen Substitutionen einer der obigen Aminosäuren durch eine Aminosaure einer anderen Gruppe (z.B. Substitution von Asn für Glu) oder Substitution von Cys, Met, His oder Pro für eine der obigen Aminosäuren.
Der Begriff "ausreichende Menge" von erfindungsgemäßem Proteinkomplex bezieht sich auf die Proteinmenge, die in der Lage ist, eine therapeutische Behandlung eines Patienten zu bewirken, der eine Erkrankung hat, die mit nativem humanem Faktor VIII:C behandelbar ist. Im allgemeinen ist der erfindungsgemäße Proteinkomplex im wesentlichen genauso aktiv wie nativer humaner Faktor VIII:C und kann in ähnlichen Mengen verabreicht werden. Die spezifische Aktivität des erfindungsgemäßen Proteinkomplexes kann mit Mitteln bestimmt werden, die dem Fachmann bekannt sind, wie unten beschrieben (z.B. durch Verwendung des kommerziell erhältlichen Coatest-Assays).
Der Begriff "effektive Konzentration" bezieht sich auf eine Konzentration der Expressionskassette, die in der Lage ist, eine Wirtszelle unter geeigneten Transformationsbedingungen zu transformieren.
DNA-Konstrukte werden im allgemeinen für die Expression der erfindungsgemäßen Polypeptide verwendet. Jedes der Polynucleotidkonstrukte wird in 5'-3'-Richtung der Transkription besitzen: eine Transkriptionsinitiations- und translationsinitiationssregion, eine codierende Region eines Strukturgenes, umfassend eine Sequenz, die für die Signalpeptidsequenz codiert, und eine Sequenz, die für die Faktor VIII:C-schweien oder -leichten-Ketten codiert, gefolgt von Translations- und Transkriptionsterminationssequenzen. Die Auswahl von derartigen spezifischen Elementen ist dem Fachmann bekannt.
Die Initiationsregion kann eine Anzahl unterschiedlicher Sequenzen umfassen, die im Zusammenhang mit der Initiation der Transkription und der Translation stehen. Diese Sequenzen schließen Enhancersequenzen, RNA-Polymerase-Bindungsstelle, RNA-Cappingstelle, ribosomale Bindungs- und translationelle Initiationsstellen und dgl. ein. Die transkriptionelle Initiationsregion kann die natürliche Region sein, die in Verbindung mit Faktor VTII:C vorkommt, oder kann eine alternative Sequenz sein, um eine höhere Transkriptionseffizienz zu erreichen. Die Sequenzen können von Säugerviren oder Genen der Wirtszelle oder Genen eines verschiedenen Säugerwirts, die in der Wirtszelle aktiv sind, erhalten werden. Es wurde eine Vielzahl von Transkriptionsinitiationsregionen isoliert und gezeigt, daß sie in Säugerwirtszellen fünktionell sind. Diese Regionen schließen die SV40-frühe Promotor- und -späte Promotorregionen, die Adenovirushaupt-späte Promotorregion, die Actin-Promotorregion, die Cytomegalovirus Mr 72 K-sehr-frühe Protein-Promotorregion, den Metallothioneinpromotor und dgl. ein.
Die Terminationsregion kann 3'-nichttranslatierte Sequenzen, eine Polyadenylierungssignalsequenz und dgl. einschließen. Die Terminationsregion kann von der natürlichen 3'-nichttranslatierten Sequenz des Faktors VIII:C-CDNA erhalten werden, oder kann von dem gleichen Strukturgen, von dem die 5'-Initiationsregion erhalten wurde, oder von einem verschiedenen Strukturgen stammen. Die 3'-Region ist in Bezug auf den Transkriptionsspiegel nicht so wesentlich wie die Inititiationsregion, so daß ihre Auswahl mehr eine Frage des Beliebens als eine Frage einer spezifischen Auswahl ist.
Die Strukurgene schließen typischerweise eine Leadersequenz ein, die für das Signalpeptid codiert, welches das Polypeptid in das Lumen des endoplasmatischen Reticulums zur Prozessierung und zur Reifung dirigiert. Optional eingeschlossen sind zusätzliche Sequenzen, die für Propeptide codieren, die posttranslational durch Endopeptidasen prozessiert werden, wobei die Endopeptidasen eine Peptidbindung spalten, das Propeptid entfernen, um das reife Polypeptid zu bilden. Das Signalpeptid kann das natürlicherweise vorkommende sein, insbesondere für das N- terminale Peptid oder kann jegliches Signalpeptid sein, welches zur Prozessierung und Reifung der Polypeptide führt.
Es wurden verschiedene Signalpeptide in der Literatur beschrieben, die Sequenzen einschließen, wie die des Gewebeplasminogenaktivators, der schweren und leichten Immunoglobulinketten, viraler Membranglycoproteine, wie z.B. die Herpes Simplex Virus Glycoproteine gB und gD, α&sub1;-Antitrypsin und dgl. Das α&sub1;-Antitrypsin-Signalpeptid wird augenblicklich zur Sekretion des FVIII-LC-Polypeptides aufgrund des hohen Expressionsspiegels eines Peptides mit korrektem N-Terminus bevorzugt.
Die DNA-Sequenzen, die für das reife Protein und das Signalpeptid codieren, müssen so miteinander verbunden werden, daß sie im Leserahmen liegen. Wenn geeignete Restriktionsstellen verfügbar sind, können die cohäsiven oder glatten Enden korrekt verbunden werden. Jedoch werden meistens Adaptoren verwendet werden, bei denen Teile der codierenden Sequenz im synthetischen Adaptor neu erzeugt werden, so daß das verkürzte Strukturgen und/oder die verkürzte Signalsequenz über den Adaptor verbunden werden, so daß sie sich im korrekten Leserahmen befinden. Die Signalsequenz und das Strukturgen können teilweise restriktionskartiert sein, um Restriktionsstellen zu identifizieren, insbesondere einmal vorkommende Restriktionsstellen, die verwendet werden können, um die beiden Sequenzen im korrekten Leserahmen mittels eines geeigneten Adaptors zu verbinden. Alternativ können nur einmal vorkommende Restriktionsstellen an der Verbindung der Signalsequenz mit der für das reife Polypeptid codierenden Sequenz durch in vitro-Mutagenese insertiert werden.
Die Translationsstart- und stopsignale werden normalerweise Teile des Strukturgenes sein, und das Initiationscodon für den Translationsstart und ein oder mehrere Stopcodons für die Translationstermination bereitstellen. Die Initiationscodons werden die ersten Codons der Signalsequenzen sein. Die Stopcodons können nach Bedarf als Teil der Terminationsregion zugegeben werden, oder der codierenden Region zugegeben werden, um ein geeignetes 3'-Ende zur Bindung der Transkriptions-Terminationsregion bereitzustellen, um eine vollständige Terminationsregion zu haben.
Die verschiedenen Regionen der Expressionskassette (die Nucleinsäuresequenzen für Transkriptions- und Translationsinitiationsregion, die Nucleinsäuresequenz des Strukturgenes, die für eines der Polypeptide codiert, und die unter der transkriptionellen und translationellen Kontrolle der Initiationsregion stehen und eine Transkriptions- und Translationsterminationsregion, die die Prozessierung der mRNA und der Translationstermination kontrolliert), die die spezielle Nucleotidsequenz identifizieren, können unter Verwendung konventioneller Verfahren verbunden werden. Üblicherweise werden die erhaltenen Sequenzen Restriktionsenzym-Erkennungsstellen enthalten, oder so modifiziert sein, daß sie derartige Restriktionsenzym-Erkennungsstellen enthalten, die dann aneinander binden können, wenn komplementäre Überhänge oder cohäsive Enden vorhanden sind. Die Modifikation wird häufig in den nichtcodierten Regionen durch Einführen von Linkern erfolgen, um die erwünschten cohäsiven Enden zu erhalten. Die Enden werden üblicherweise vor der Einführung in die Wirtszelle ligiert werden, obwohl die notwendige Ligation auch von der Wirtszelle durchgeführt werden kann.
Die Expressionskassetten können mit einer großen Verschiedenheit anderer Sequenzen für besondere Zwecke verbunden werden. Wird eine Amplifikation der Menge des sekretierten Glykoproteins erwünscht, kann die Expressionskassette für FVIII:C in Tandem mit einem Gen verbunden werden, dessen spontaner Anstieg der Genkopiezahl durch geeignete Behandlung selektiert werden kann. Derartige Gene schließen das menschliche Metallothionein-Gen und das Maus-Dihydrofolat-Reduktasegen ein. Diese Gene werden in Kassetten plaziert, die ihre eigenen transkriptionellen und translationellen Regulationssequenzen besitzen. Durch Selektion von Zellclonen, die gegenüber steigenden Konzentrationen von Schwermetallionen (z.B. Cadmium) oder Methotrexat resistent sind, kann das interessierende Gen (die Bxpressionskassette) in der Wirtszelle coamplifiziert werden.
Die Expressionskassetten, die Gegenstand dieser Erfindung sind, können Teil eines Vektors sein, der ein Replikationssystem umfaßt, das in der Wirtszelle fünktional ist, wobei dieses Replikationssystem zu einer stabilen episomalen Aufrechterhaltung oder einer Integration der Expressionskassette in das Wirtsgenom führen kann. Der Vektor wird ebenso einen Selektionsmarker zur Selektion von Säugerwirtszellen, die das DNA-Konstrukt und den Vektor enthalten, im Unterschied zu den Wirtszellen, denen das DNA-Konstrukt und der Vektor fehlt, umfassen.
Eine große Verschiedenheit von Replikationssystemen sind verfügbar, typischerweise von Viren abgeleitet, die Säugerwirtszellen infizieren. Illustrierende Replikationssysteme schließen das Replikationssystem aus dem Simian Virus 40, Adenovirus, Rinderpapilloma-Virus, Polyoma- Virus, Epstein Barr-Virus und dgl. ein.
Selektionsmarker, die das Propagieren des Vektors in einer prokaryonten Wirtszelle ermöglichen, können Resistenz gegenüber einem Biocid, insbesondere gegenüber einem Antibiotikum, oder Komplementation einer Auxotrophie zum Erzeugen eines prototrophen Wirts einschließen. Besondere Gene von Interesse als Marker schließen das Kanamycin-Resistenzgen (NPTII), das Chloramphenicol-Resistenzgen (CAT), Penicillinase (β-Lactamase) oder dgl. ein.
Der Vektor wird üblicherweise zirkulär sein und wird eine oder mehrere Restriktionsstellen besitzen, die die Insertion der Expressionskassette entweder stufenweise oder als vollständige Ganzheit in den Vektor erlauben. Oft wird der Vektor ebenfalls ein bakterielles Replikations- und Selektionssystem einschließen, die das Clonieren nach jedem der Manipulationsschritte erlaubt. Auf diese Weise werden relativ große Mengen der Konstrukte bei jeder Stufe präpariert, isoliert, gereinigt, getestet, um sicherzustellen, daß die korrekte Verbindung stattgefunden hat, und dann für die nächste Stufe verwendet.
Es können verschiedene Säugewirtszellen verwendet werden, in denen die regulatorischen Sequenzen und Replikationssysteme funktional sind. Derartige Zellen schließen CO57- Zellen, Eierstockzellen des chinesischen Hamsters (Chinese hamster ovary (CHO)-Zellen), Mäusenierenzellen, Hamsternierenzellen, HeLa-Zellen, HepG2-Zellen oder dgl. ein
Die Expressionskassetten der gewünschten Polypeptide können miteinander in einer Nucleotidkette verbunden werden oder können in Form von getrennten Nucleinsäuremolekülen bereitgestellt werden. Die Expressionskassetten können Teile verschiedener Vektoren oder des gleichen Vektors sein. Das ist in erster Linie eine Frage des eigenen Beliebens, obwohl in manchen Situationen mit bestimmten Vektoren eine oder die andere Konstruktionsweise vorzuziehen sein mag.
Der Expressionsvektor kann ein Replikations-defizientes Retrovirus sein. S.-F. Yu et al, Proc Nat Acad Sci USA (1986) 83:3 194-98 beschrieben die Konstruktion von selbst-inaktivierenden ("SIN") retroviralen Gentransfervektoren. SIN-Vektoren werden durch Deletion der Promotor- und Enhancersequenzen aus der U3-Region des 3'-LTR erzeugt. Eine fünktionelle U3-Region im 5'-LTR ermöglicht die Expression des rekombinanten viralen Genomes in geeigneten Verpacküngszelllinien. Jedoch wird nach Expression der genomischen RNA und der reversen Transkription in CDNA die U3-Region des 5'-LTR des ursprünglichen Provirus deletiert, und durch die U3-Region des 3'-LTR ersetzt. Wenn somit der SIN-Vektor integriert wird, dann ersetzt die nichtfünktionelle 3'-LTR-U3-Region die fünktionelle 5'-LTR-U3-Region, was dazu führt, daß das Virus nicht in der Lage ist, das Vollänge-genomische Transkript zu exprimieren.
Die Expressionskassetten werden in die Wirtszelle durch konventionelle Verfahren eingeführt. Günstigerweise kann für die Transformation Calciumphosphat-präzipitierte DNA oder DNA in Gegenwart von DEAE-Dextran verwendet werden. Ein synthetisches Lipid, das in besonderer Weise für Polynucleotidtransfektion nützlich ist, ist N-[1-(2,3-Dioleyloxy)propyl]- N,N,N-trimethylammoniumchlorid, das kommerziell unter dem Namen Lipofectin (verfügbar von BRL, Gaithersburg, MD) verfügbar ist und von P.L. Felgner et al, Proc Nat Acad Sci USA (1987) 84:7413 beschrieben wurde. Sind Viren beteiligt, können Transfektion oder Transduktion angewandt werden. Die besondere Weise, auf die die Wirtszelle transformiert wird, ist für diese Erfindung nicht kritisch und hängt im wesentlichen davon ab, ob die Expressionskassetten an ein Replikationssystem gebunden sind, und hängt im wesentlichen auch von der Art des Replikationssystems und der assoziierten Gene ab.
Die transformierten/transfizierten Zellen werden dann in einem geeigneten Nährmedium kultiviert. Das Produkt wird als Komplex der beiden FVIII:C-Ketten erhalten, so daß das Medium oder das Zellysat isoliert werden kann und der Faktor VIII:C-aktive Komplex extrahiert und gereinigt werden kann. Zur Extraktion und Reinigung sind verschiedene Mittel verfügbar, wie z.B. Affinitätschromatographie, Ionenaustauschchromatographie, hydrophobe Chromatographie, Elektrophorese, Lösungsmittel-Lösungsmittelextraktion, selektive Fällung und dgl. Die besondere Art und Weise, auf die das Produkt isoliert wird, ist für die Erfindung nicht kritisch und wird so ausgewählt, daß die Denaturierung oder Inaktivierung minimiert wird und die Isolierung eines hochreinen aktiven Produktes maximiert wird.
Es werden Zusammensetzungen bereitgestellt, bei denen die Zusammensetzung im Coatest-Assay wenigstens 0,02 E/ml Aktivität hat, üblicherweise wenigstens 0,2, gewöhnlicher wenigstens etwa 0,5 E/ml Aktivität. Das erfindungsgemäße Produkt kann durch Affinitätschromatographie unter Verwendung von Antikörpern, insbesondere unter Verwendung von monoclonalen Antikörpern, die gegen FVIII-LC gerichtet sind, Elektrophorese, Extraktion, HPLC usw. gereinigt werden.
Das erfindungsgemäße Verfahren führt zur Produktion eines Komplexes aus schweren und leichten Ketten, der Faktor VIII:C-Aktivität besitzt. Die Produktion wird durch konditionierte Medien, wie in dem Experimenteteil beschrieben, nachgewiesen. Das konditionierte Medium wird wenigstens 50, üblicherweise wenigstens 70 mE/ml, gewöhnlicher wenigstens 300 mE/ml Faktor VIII:C-Aktivität im Coatest-Assay haben.
Die erfindungsgemäß hergestellten Komplexe mit Faktor VIII:C-Aktivitäten haben eine Vielzahl von Verwendungen als Immunogene zur Herstellung von Antikörpern zur Isolation von von Willebrand-Faktor durch Affinitätschromatographie, in diagnostischen Assays für Faktor VIII:C und zur Behandlung von Hämophiliepatienten und anderen Wirten, die Blutgerinnungsstörungen haben. Die erfindungsgemäßen Proteinkomplexe können in physiologisch annehmbaren Trägern, wie z.B. Wasser, Kochsalzlösung, Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung, und Citrat-gepufferte Kochsalzlösung in Konzentrationen im Bereich von etwa 10-200 E/ml verabreicht werden. Siehe U.S. Patente Nrn. 3 631 018; 3 652 530 und 4 069 216 für Verfahren zur Verabreichung und im Hinblick auf die Mengen. Andere konventionelle Zusätze können ebenso eingeschlossen werden.
Die unten dargestellten Beispiele dienen dem durchschnittlichen Fachmann als weiterer Hinweis und sollen nicht als Beschränkung der Erfindung auf jegliche Weise betrachtet werden.

BEISPIELE

Die unten dargestellten Beispiele dienen dem durchschnittlichen Fachmann als weiterer Hinweis und sollen nicht als Beschränkung der Erfindung auf jegliche Weise betrachtet werden.

Beispiel 1

(Herstellung der Expressionsplasmide)

(A) pSV7d:

Die Expressionskassetten wurden unter Verwendung des Säugerzellexpressionsvektors pSV7d (2423 bp) hergestellt.
Das Plasmid pSV7d (siehe Truett et al, supra) wurde wie folgt konstruiert: Das 400 bp BamHI/HindIII-Fragment, welches den SV40-Replikationsursprung und den frühen Promotor enthält, wurde aus pSVgtI (erhalten von Paul Berg, Stanford University, California) ausgeschnitten und gereinigt. Das 240 bp SV40 Bc1I/BamHI-Fragment, welches die SV40 polyA-Additionsstelle enthält, wurde aus pSV2/DHFR (Subramani et al., Molec. and Cell Biol. (1981) 1: 854-864) ausgeschnitten und gereinigt. Die Fragmente wurden über folgenden Linker füsioniert:
Dieser Linker enthält fünf Restriktionsstellen, sowie Stopcodons in allen drei Leserahmen. Das entstehende 670 bp-Fragment, welches den SV40-Replikationsursprung, den SV40-frühen Promotor, den Polylinker mit Stopcodons und die SV40-Polyadenylierungsstelle enthält, wurde in die BamHI-Erkennungsstelle von pML, ein pBR22-Derivat, dem etwa 1,5 Kb deletiert sind (Lusky und Botchan, Cell (1984) 36:391) cloniert, um pSV6 zu ergeben. Die EcoRI und EcoRV-Erkennungsstellen in der pML-Sequenz von pSV6 wurden durch Verdauen mit EcoRI und EcoRV eliminiert, mit Bal31-Nudease behandelt, um etwa 200 bp an jedem Ende zu entfernen und letztlich religiert, um pSV7a zu erhalten. Die Bal31-Resektion entfernte ebenso eine BamHI-Restriktionsstelle, welche die SV40-Region flankiert, etwa 200 bp von der EcoRV- Erkennungsstelle entfernt. Um die zweite BamHI-Erkennungsstelle, welche die SV40-Region flankiert, zu entfernen, wurde pSV7a mit NruI verdaut, welches in der pML-Sequenz stromaufwärts des Replikationsursprungs schneidet. Dieses wurde durch Ligation der glatten Enden rezirkularisiert, um pSV7b zu ergeben.
pSV7c und pSV7d stellen sukzessive Polylinkerersetzungen dar. Zuerst wurde pSV7b mit StuI und XbaI gespalten. Dann wurde der folgende Linker in den Vektor ligiert, um pSV7c zu ergeben:
Danach wurde pSV7c mit BGlII und XbaI gespalten und dann mit dem folgenden Linker ligiert, um pSV7d zu ergeben:

(B) pSVF8-92:

pSVF8-92 ist ein Expressionsplasmid für die Mr 92 K FVIII-HC-Kette. Ausgehend von der BamHI-Erkennungsstelle in dem Polylinker pSV7d, besteht pSVFB-92 aus einem 49 bp synthetischen Linkeradaptormolekül von BamHI bis SacI, codierend für Nucleotide -30 bis +14 der Faktor-VIII:C-CDNA (Nummerierung ausgehend vom ersten A der Translationsstartstelle; die Sequenz ist unten in (D) gezeigt), einem 2267 bp SacI bis HINDIII-Fragment von der Faktor VIII:C-DNA, enthalten in pSVFB-200, unten beschrieben (bis zu Nucleotid +2281), und pSV7d von HindIII bis BamHI.

(C) pSVF8-80:

pSVF8-80 ist ein Expressionsplasmid für die Mr 80 K FVIII-LC-Kette. Ausgehend von der SalI-Erkennungsstelle in dem Polylinker pSV7d, besteht pSVF8-80 aus einem 201 bp-Fragment einer Gewebeplasminogenaktivator-cDNA von Nucleotiden -98 bis +103 (relativ zum Startcodon) das in einer BglII-Erkennungsstelle endet (tPA-Sequenzen sind in S.J.F. Degan et al, J Biol Chem (1986) 261: 6972-6985 gegeben), einem 29 bp synthetischen BglII- bis BclI- Linker-Adaptor, der für die Nudeotide +5002 bis +5031 des Faktors-VIII:C codiert, ligiert an ein 2464 bp BclI-Fragment des Faktors VIII:C, das sich von einer BclI-Erkennungsstehe, die an Nucleotid 5028 der Faktor VIII:C-CDNA durch in vitro-Mutagenese (Zoller and Smith, Meth Enzymol (1983)100:468) (PF8GM7) erzeugt wurde, bis zu einer BclI-Erkennungsstelle in der 3'-nichttranslatierten Region an Nucleotid 7492 erstreckt, und einem 400 bp Fragment der tPA 3'-nichttranslatierten Sequenz, die sich von einer BglII-Erkennungsstelle bis zu einer synthetischen PstI-Erkennungsstelle erstreckt, die durch das cDNA-Clonieren erzeugt wurde, gefolgt von dem Polylinker aus dem Vektor M13mp9 (Vieira and Messing, Gene (1982)19:259) und dann pSV7d.

(D) pSVF8-200

Der Vektor pSVF8-200 ist ein Expressionsplasmid für die Vollängefaktor VIII-C cDNA. Das Plasmid pSVF8-200 (beschrieben in Truett et al), welches die vollständige Faktor VIII:C cDNA-codierenden und 3'-nichttranslatierenden Sequenzen enthält, und bei dem die 5'- nichttranslatierten Sequenzen die gleichen sind, wie oben für pSVF8-92 beschrieben, wurde wie folgt hergestellt.
Plasmid pSV7d wurde mit BamHI gespalten, um in der Polylinkerregion stromabwärts des SV40-frühen Promotors zu spalten. Der folgende 49 bp BamHI-SacI-Linker-Adaptor, der für die letzten 30 bp der 5'-nichttranslatierten Region und die ersten 15 bp der humanen Faktor VIII:C-codierenden Sequenz codiert, wurde chemisch synthetisiert und an pSV7d ligiert.
Dieses ligierte Plasmid wurde im folgenden mit SacI gespalten, um einen Überschuß an Linker zu entfernen und dann mit SalI gespalten, um einen SalI-Überhang zu erzeugen.
Fragment 1, das 2,9 K SacI-Fragment aus pF8-102, welches die 5'-codierende Region des humanen Faktors VIII:C enthält, und Fragment 2, das 6,5 K SacI-SalI-Fragment aus pF8- 6,5, welches die 3'-codierende Region des Faktors enthält und pSV7d, modifizierter Vektor, welcher den Linker-Adaptor enthält, wurden miteinander ligiert (siehe Truett et al, oben). Dieses Ligationsgemisch wurde dann verwendet, um E. coli HB101 zu transformieren, und Kolonien wurden über die Ampicillinresistenz selektioniert.
Es wurden 300 Transformanten durch Koloniefilterhybridisierung unter Verwendung des BamHI-SacI 5'-Adaptors oder des 2,9 K SacI-Fragmentes als Sonden durchgemustert. Die Kolonien, die mit beiden Proben positiv waren, wurden dann durch Restriktionskartierung untersucht. Plasmid pSVF8-200, welches die vollständige codierende Region des menschlichen Faktor VIII:C-Genes und eine 5'-nichttranslatierte Region, die korrekt in transkriptioneller Orientierung an den SV40-frühen Promotor füsioniert war, enthält, wurde erhalten.

(E) Transfektion und Kultur von COS7-Zellen:

Die oben beschriebenen Plasmide wurden in COS7-Zellen (Guzman, Cell (1981) 23:175) unter Verwendung des Calciumphosphat-Copräzipitationsverfahrens (van der Eb and Graham, Meth Enzymol (1980) 65:828-39) verbunden mit einer Chlorochindiphosphatbehandlung (Luthman und Magnusson, Nuc Acids Res (1983) 11:1295-1308) unter Verwendung von 50 µg Plasmid DNA pro 5x10&sup5; Zellen während 14 Stunden transfiziert. Die Zellen können ebenso durch das DEAE-Dextran-Verfahren von Sompayrac and Danna, Proc Nat Acad Sci USA (1981) 78:7575-78, transfiziert werden.
Die COS7-Zellen wurden in Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium, das mit 10% fötalem Kälberserum, 100 E/ml Penicillin, 100 µg/ml Streptomycin, 292 µg/ml Glutamin und 110 µg/ml Natriumpyruvat suppiementiert war, kultiviert. Proben wurden von einer während 48 Stunden durchgeführten Sammlung von Serum-enthaltendem Medium 88 Stunden nach der Transfektion erhalten.

(F) Assays

Zu spezifischen Zeitintervallen nach der Transfektion wurde Medium von den Zellen entfernt, und Aliquots wurden bei -70ºC gelagert. Proben wurden im Hinblick auf ihre Fähigkeit getestet, die verlängerte teilweise Thromboplastinzeit von Faktor VIII:C-defizientem Plasma in einem Standardgerinnungsassay (Hardisty et al, Thromb et Diathesis Haemolog (1962) 72: 215) zu verringern. Der spezifischere Coatest-Assay (Rosen et al, Thromb and haemostasis (1985) 54:818-823), der die Bildung von aktiviertem Faktor X (Xa) als lineare Funktion der Konzentration von exogen zugefügtem Faktor VIII:C mißt, wurde verwendet, um die Ergebnisse des Koagulationsassays zu verifizieren. Die Konzentration an immunologisch reaktivem Faktor VIII:C-Protein im Medium wurde durch die Anwendung eines Radioimunassays (RIA), der entwickelt wurde, um das Mr 92 K Polypeptid nachzuweisen, und durch einen Enzym-gebundenen Immunosorbensassay (ELISA), der spezifisch für das Mr 80 K Polypeptid ist (Nordfang et al, Thromb and Haemostasis (1985) 53:346), bestimmt.
Wie in Tabelle 1 gezeigt, erzeugte die Expression des Mr 92 K-Polypeptides oder des Mr 80 K-Polypeptides alleine keine nachweisbare Aktivität, obwohl hohe Spiegel eines jeden der individuellen Proteine in konditioniertem Medium vorhanden waren. Wurden die Zellen mit pSVF8-92- und pSVF8-80-Plasmiden cotransfiziert, enthielt das Medium etwa 20 mE/ml an Koagulationsaktivität. Der gleiche relative Spiegel der Koagulationsaktivität wurde von Zellen sekretiert, die mit dem Plasmid pSVF8-200, welches das vollständige Faktor VIII:C-Protein codieren, transfiziert waren.
Wurden konditionierte Medien von Zellen, die mit pSVFB-92 transfiziert wurden, mit konditionierten Medien von Zellen, die mit pSVFB-80 transfiziert wurden, zusammengemischt (unter Verwendung mehrerer verschiedener Bedingungen, wie in Tabelle 1 ausgeführt), so war keine Aktivität meßbar.
Diese Ergebnisse zeigen, daß ein Komplex aus den Amino- und Carboxyl-terminalen Domänen von Faktor VIII:C intrinsische Koagulationsaktivität beibehält, und daß die innere Domäne weder für die Aktivität noch für die Bildung eines aktiven Komplexes aus getrennten Ketten essentiell ist. TABELLE 1: Assay für rekombinante Faktor VIII:C-Aktivität in konditionierten COS7- Zellmedien
a Plasmide wurden in die gleichen Zellen cotransfiziert
b Plasmide wurden in getrennte Zellen transfiziert, und die Überstände wurden 48 Stunden später gemischt
Eine Verschiedenheit von Mischungsbedingungen wurde ausgetestet, einschließlich einer Präinkubation für verschiedene Zeiten bis zu 2 Stunden bei 37ºC, 20ºC oder 4ºC in Gegenwart oder Abwesenheit von 10 mM CaCl&sub2;. Der Wert, der in dieser Tabelle dargestellt wird, ist für die erhaltenen Daten repräsentativ.
In Tabelle 1 wurden die Koagulationszeit und die Aktivität wie folgt erhalten: 75 µl der Aliquots der Medien, die durch das Wachstum von COS7-Zellen, die mit den angegebenen Plasmiden transfiziert waren oder nichttransfiziert waren, konditioniert waren, wurden im Hinblick auf ihre Fähigkeit getestet, die verlängerte teilweise Thromboplastinzeit von Faktor VIII:C-defizientem Plasma im Einstufen-Assay zu vermindern. Kurz gesagt, wurden 75 µl Platelin (von General Diagnostics) während 3 Minuten bei 37ºC inkübiert, gefolgt von der Addition von 75 µl Faktor VIII:C-defizientem Plasma plus 75 µl der Testprobe während einer weiteren 5-minütigen Inkubation bei 37ºC. Ein 75 µl Aliquot vorgewärmtes 0,025 M CaCl&sub2; wurde zugegeben, und die Gerinnungszeit wurde mit einem Becton-Dickinson-Fibrometer gemessen. Normales menschliches Plasma, das im COS7-Zellmedium verdünnt wurde, wurde als Standard verwendet. Es wird angenommen, daß eine Aktivität von 1 mE etwa 100 pg Faktor VIII:C-Protein entspricht (Fay et al, Proc Nat Acad Sci USA (1982) 79:7200).
In Tabelle 1 wurde der Coatest-Assay (Kabi) verwendet, um die Bildung von aktiviertem Faktor X (Xa) als lineare Funktion der Konzentration von Faktor VIII:C zu messen. Die Konzentration an Faktor Xa wird durch die proteolytische Spaltung des chromogenen para-Nitroanilin von einem synthetischen Peptidsubstrat für Faktor Xa gemessen. Normales menschliches Plasma, das in 50 mM Tris-HCl, pH 7,3, 0,2% BSA verdünnt wurde, wurde als Standard verwendet.
Für den RIA-Assay in Tabelle 1 wurden die Vertiefüngen einer Polystyrol-Mikrotiterplatte mit 96 Vertiefüngen mit gereinigtem Hundefaktor VIII:C-inhibitorischem IgG in einer Konzentration von 3,5 µg/ml in 0,1 M Natriumcarbonatpuffer, pH 9,8, durch Übernachtinkubation bei 37ºC beschichtet. Die Platten wurden dreimal mit 0,1 M NaCl, 0,05% Tween: 20 gewaschen, gefolgt von Inkubation mit einem Gemisch an Testmediumproben und iodiertem FVIII:C Mr 92 K-Protein, die beide in 0,05 M Imidazol, 0,1 M NaCl, 1% Rinderserumalbumin, 0,05% Tween 20, pH 7,3, verdünnt waren. Das FVIII:C Mr 92 K-Protein wurde aus Plasma isoliert, und war zu mehr als 50% homogen, wie durch SDS-PAGE und Silberfärbung abgeschätzt wurde. Nach einer 16-stündigen Inkubation bei Raumtemperatur wurden die Platten gewaschen, und die Menge an ¹²&sup5;I in den einzelnen Vertiefungen wurde in einem gamma-Zähler gemessen. Eine intermediäre gereinigte kommerzielle Faktor VIII:C-Präparation (Faktor VIII, NORDISK) mit einer spezifischen Aktivität von 0,5 Einheiten Koagulationsaktivität pro mg wurde als Standard verwendet. Dieser Standard wurde gegen den Dritten Internationalen Faktor VIII:C-Standard der Weltgesundheitsorganisation kalibriert. Der intermediäre gereinigte Standard wurde so definiert, daß er ein Mr 92 K RIA-Aktivität/Faktor VIII: C-Koagulationsaktivitätsverhältnis von 1 enthielt.
Für den ELISA-Assay in Tabelle 1 wurden die Vertiefüngen einer PVC-Mikrotiterplatte mit 96 Vertiefüngen mit gereinigtem humanem Faktor VIII:C-inhibitorischem IgG in einer Konzentration von 4,5 µg/ml in 0,1 M Natriumcarbonat, pH 9,8, durch Übernachtinkubation bei 37ºC beschichtet. Die Vertiefungen wurden wie oben gewaschen und Peroxidase-konjugierte F(ab')&sub2;-Fragmente des humanen inhibitorischen IgG, verdünnt in 0,1 M Imidazol, 0,15 M NaCl, 1% BSA, 0,05% Tween 20, pH 7,3, wurden zu einer Endinkubation von 16 Stunden während Raumtemperatur zugegeben. Die Farbe wurde mit o-Phenylendiaminlösung entwickelt Normales menschliches Serum wurde als Standard verwendet.
Um zu verifizieren, daß die beobachtete Koagulationsaktivität auf Faktor VIII:C zurückzuführen war, wurde die Sensitivität der Koagulation gegenüber der Inhibition durch Antikörper, die spezifisch für Faktor VIII:C sind, bestimmt. Vor dem Assay wurden Aliquots von konditionierten Medien während 2 Stunden bei 37ºC in Gegenwart von Verdünnungen normalen menschlichen Serums oder von Serum eines Hämophiliepatienten, der einen hohen Titer an inhibitorischen Antikörpern gegenüber Faktor VIII:C entwickelt hatte, vorinkubiert. Wie in Tabelle 2 gezeigt, war die Aktivität des vollständigen Moleküls, wie auch die des Mr 92 K-80 K- Komplexes, spezifisch durch das inhibitorische Serum vermindert. Die gleichen Ergebnisse wurden unter Verwendung dreier verschiedener inhibitorischer monoclonaler Antikörper erhalten, die an die Mr 80 K-Arten binden. Die Inhibition von Faktor VIII:C-Aktivität unter Verwendung von inhibitorischem Serum wurde wie folgt untersucht: 160 µl des angegebenen COS7-zellkonditionierten Zellmediums wurden mit 20 µl einer 100-fachen Verdünnung humanen Faktor VIII:C-inhibitorischen Serums (Bethesda Titer 1500 Einheiten) oder einer ähnlichen Verdünnung von gesammeltem normalem menschlichem Serum, oder mit Puffer allein (50 mM Imidazol, 0,1 M NaCl, 100 µg/ml BSA, pH 7,3) während 2 Stunden bei 37ºC inkubiert. Diese Proben wurden dann im Hinblick auf eine zurückbleibende Koagulationsaktivität, wie oben beschrieben, untersucht. TABELLE 2: Koagulationsinhibitionsassay
Das Inhibitionsexperiment wurde unter Verwendung von monoclonalen Antikörpern wie folgt wiederholt: 100 µl konditioniertes Medium wurden während 2 Stunden bei 37ºC mit entweder 10 µl einer 1 µg/µl Lösung an Antifaktor VIII:C-monoclonalem Antikörper von Hybritech (Bethesda Titer 14.000 Einheiten) oder Puffer inkübiert und dann wie oben ausgetestet. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 gezeigt. TABELLE 3 Koagulationsinhibitionsassay
Um deutlicher die Existenz eines Zweikettenkomplexes zu zeigen, wurde die aktive Spezies aus dem COS7-Zellmedium durch Passage über eine MAb-Säule, die spezifisch für den Mr 80 K-Teil ist, teilweise gereinigt. Wie in Tabelle 4 gezeigt, wurden etwa 65% der aufgetragenen Aktivität von der Säule zurückgehalten, und 50% dieses gebundenen Materials wurde in aktiver Form und in 5-fach größerer Konzentration als in dem Ausgangsmedium eluiert. Somit kann ein aktiver Komplex durch Affinitätschromatographie unter Verwendung eines Antikörpers, der für lediglich die Mr 80 K-Spezies spezifisch ist, isoliert werden. 100 µg eines Anti-80 K monoclonalen Antikörpers (56 IgG) (Nordfang et al, Thromb Haemostasis (1985) 53:346) an Sepharose CL4B gekoppelt, wurden über Nacht bei 20ºC mit 1,4 ml Medium inkubiert, das eine Gesamtaktivität von 6,2 mE enthielt (gemessen durch den Coatest-Assay, erhalten von COS7-Zellen, die mit pSVF8-92- und pSVF8-80-Plasmiden cotransfiziert wurden). Nach der Inkubation wurde die Aufschlämmung in eine Säule geladen, und die Durchflußfraktion wurde gesammelt. Die Säule wurde mit 300 µl Puffer A (50 mM Imidazol, 0,1 M NaCl, 0,1% Natriuminsulin, 0,2% NaN&sub3;, pH 7,3) gewaschen und dann mit 300 µl Puffer B (2,5 M NaCl, 50% Ethylenglykol, 0,5 M Imidazol, 0,1 M CaCl&sub2;, 0,1% Natriuminsulin, 0,2% NaN&sub3;, pH 7,3) eluiert. TABELLE 4: Teilweise Reinigung von Mr 92 K-80 K-koagulaionsaktivem Komplex
Die hier dargestellten Ergebnisse zeigen, daß die Expression der Linker("B")-Region, welche 918 Aminosauren oder etwa 40% der Gesamtmenge für das intakte Protein enthält, für Faktor VIII:C-Aktivität nicht benötigt wird. Coexpression von individuellen Mr 92 K- und Mr 80 K-Regionen führt zu einem Faktor VIII:C-Aktivitätsspiegel, der dem vergleichbar ist, der aus der Expression der Gesamtfaktor VIII:C-codierenden Region erhalten wird. Diese Proteine assoziieren in vivo unter Bildung eines aktiven Komplexes, der durch eine Calciumbrücke verbunden ist. Die Assoziation benötigt die Gegenwart der B-Region nicht und findet in effizienter Weise für die beiden in trans exprimierten Ketten statt.
Aus den obigen Ergebnissen ist es offensichtlich, daß Faktor VIII:C-Aktivität durch direkte Herstellung eines N-terminalen Fragmentes und eines C-terminalen Fragmentes, die unabhängig exprimiert werden und jeweils ihre eigene Signalsequenz haben, erhalten werden kann. Somit kann Faktor VIII:C effizienter erhalten werden, da der größere Precursor nicht cloniert und als codierende Sequenz für die Faktor VIII:C-Aktivität verwendet werden muß. Somit können Zellen für die Expression von Faktor VIII:C verwendet werden, die in Bezug auf die Fähigkeit zur korrekten Reifung des Vollängefaktor VIII:C-Proteins effizient sind.

Beispiel 2

Die Expression des Mr 92 K-Proteins in COS7-Zellen unter Verwendung der pSVF8-92- Konstruktion war im Vergleich zu der Menge des hergestellten Mr 80 K-Proteins niedrig. Das Mr 92 K-Protein wird offensichtlich im Golgi-Pfad zurückgehalten und/oder degradiert und wird nicht effizient prozessiert oder exportiert. In entsprechender Weise wurde die Konstruktion in einem Versuch, den Spiegel von Mr 92 K-Protein zu erhöhen, modifiziert. Modifikationen des folgenden Typs wurden durchgeführt: Veränderungen in der 5'-nichttranslatierten Sequenz des Faktor VIII:C-Genes; Einschluß von heterologen 5'-nichttranslatierten und Leadersequenzen; und Veränderungen in den 3'-nichttranslatierten Sequenzen. Diese Konstrukte sind unten zusammengefaßt.

(A) Modifikationen der 5'-nichttranslatierten Region

Plasmid pSVF8-92B.

Dieses Plasmid ist ein Derivat von pSVF8-92, in welchem die 30 bp der 5'-nichttranslatierten Sequenz von pSVF8-92 ersetzt ist durch die vollständige 5'-nichttranslatierte Region der humanen Faktor VIII:C-CDNA (Nucleotide 1 bis 171; siehe Figur 8 von Truett et al, supra) mit einer Deletion der G-C-Schwänze (durch in vitro artspezifische Mutagenese) und die drei Basenaustausche, die unten am Start-ATG gezeigt sind (an Position +172, Figur 8, Truett et al, supra), um konform mit Kozaks bevorzugten Sequenzen für eine effiziente Messengertranslation in eukaryotischen Zellen zu sein:
Faktor VIII:C: GTCATG CAA
Kozak-Konsensus: ACCATG G
Dieser Wechsel ändert die zweite Aminosäure des Signalpeptids von Gln zu Glu.
Plasmid pSVF8-92E. Dieses Plasmid ist ein Derivat von pSVF8-92B, in dem der Polylinker, der von pSV7d 5' der Faktor VIII:C-Sequenzen abgeleitet wurde, entfernt wurde, mit der Ausnahme der SalI-Erkennungsstelle, und das ATG-Codon in der 5'-nichttranslatierten Region (an 41 nach Truett et al, supra) ist zu ATT durch in vitro-Mutagenese verändert.

(B) Addition heterologer 5'-Sequenzen

Plasmid pSVF8-92G, H, und I.

Diese Plasmide sind Derivate von pSVF8-92B, in denen die 5'-nichttranslatierte Region ebenso wie die natürlichen Faktor VIII:C-Signalsequenzen durch die analoge Region der humanen Gewebeplasminogenaktivator(tPA)-cDNA ersetzt sind. In pSVF8-92G sind die ersten 35 Aminosäuren (Signal- und Prosequenzen) der tPA-Prä-Pro-Region an reifem Faktor VIII:C Mr 92 K mit einem Serin, welches die erste Aminosäure (Alanin) des Mr 92 K-Proteins ersetzt, verbunden. In pSVF8-92H sind die ersten 32 Aminosäuren der TPA-Prä-Pro-Region mit reifem Faktor VIII:C Mr 92 K-Protein verbunden. In pSVF8-92I sind die ersten 23 Aminosäuren der tPA-Prä-Pro-Region an reifes Faktor VIII:C Mr 92 K-Protein gebunden. Die tPA-Sequenzen sind die gleichen wie die, welche für pSVF8-80 beschrieben wurden.
Plasmid pSVF8-92J. Dieses Plasmid ist ein Derivat von pSVF8-92G, in welchem die tPA 5'-Region durch 75 bp der Herpes Simplex Virus-1 (HSV-1) gD 5'-nichttranslatierten Sequenzen und 75 bp der HSV-1 gD Signalsequenz ersetzt ist. pSVF8-92J fehlt ebenso die Ala T Substitution (R.J. Watson et al, Science (1982) 218:381-384).

(C) Veränderungen der 3'-nichttranslatierten Region

Plasmid pSVF8-92C.

Dieses Plasmid ist eine Variation von pSVF8-92B, in welchem die Mr 92 K-codierende Region direkt an das Translationsstopcodon und natürliche 3'-nichttranslatierte Sequenzen der humanen Faktor VIII:C-cDNA fusioniert ist.
Plasmid pSVF8-92L. Dieses Plasmid ist ein Derivat von pSVF8-92C, in welchem die 3'- nichttranslatierte Region von pSVF8-92C durch die 3'-nichttranslatierte Region von pSVF8-80 ersetzt ist.

(D) Ergebnisse

Jedes der Plasmide der obigen Teile A-C wurde in COS7-Zellen zusammen mit pSVF8- 80 wie in Beispiel 1 transfiziert, und die Medien wurden im Hinblick auf Faktor VIII:C-Aktivität, wie in Beispiel 1 (F), getestet.
pSVF8-92B, das zuerst getestete, zeigte Aktivitätsspiegel, die von 2- bis 8-fach besser als pSVF8-92 reichten. Von den verbleibenden Plasmiden schien pSVF8-92E das beste zu sein, und war 1,65-fach besser als pSVF8-92B. pSVF8-92J und I erzeugten ebenfalls wesentlich höhere Expressionsspiegel als pSVF8-92 und waren nahe denen von pSVF8-92E. Der Expressionsspiegel von pSVF8-92G war ungefähr wie der von pSVF8-92, während der von pSVF8-92H wesentlich niedriger war als der von pSVF8-92. Die Expressionsspiegel sowohl von pSVF8-92C als auch pSVF8-92L scheinen denen von pSVF8-92E gleich zu sein.

Beispiel 3

Dieses Beispiel beschreibt die Herstellung von Konstrukten zur Herstellung von Polypeptiden, die aus der Mr 92 K-Kette und einem Teil der B-Domäne bestehen. Diese Derivate wurden in einem Ansatz hergestellt, eine schwere Kette zu entwickeln, die stabiler ist und/oder effizienter zu einem aktiven Komplex mit der leichten Kette zu assoziieren. Die Derivate wurden ausgewählt, um Molekülspezies nachzuahmen, die in von Plasma abgeleiteten Faktor VIII:C- Präparationen und in Zellysaten und konditionierten Medien von Zellen, die rekombinanten Vollängefaktor VIII:C exprimieren, beobachtet wurden. Polypeptide von etwa der gleichen Größe könnten möglicherweise durch Thrombinspaltung von Vollängefaktor VIII:C entstehen.
(A) pSVF8-92S: Dieses Plasmid codiert für eine 982 Aminosäuren lange schwere Kette und wurde, ausgehend von einem Vollänge-cDNA Plasmid pSVF8-302, durch Spaltung an der ersten SacI-Erkennungsstelle der codierenden Region der B-Domäne hergestellt. Ein Oligonucleotid-Adaptor wurde verwendet, um ein Translations-Stopcodon einzuführen, und die codierende Sequenz an die 3'-nichttranslatierte Sequenz des natürlichen humanen Faktors VIII:C, die an der ersten BalI-Stelle beginnt, zu fusionieren. Dieses Plasmid codiert für die ersten 978 Aminosäuren des nativen humanen Faktors VIII:C und für 4 substituierte Aminosäurereste am Carboxy-Terminus.
(B) pSVF8-160: Dieses Plasmid stellt eine 1323 Aminosäuren lange schwere Kette bereit und wurde ausgehend von einem Vollängeclon (mit pSVF8-303 bezeichnet), der pSVF8-200 ähnlich ist, jedoch die 5'-nichttranslatierte Region von pSVF8-92E besitzt, hergestellt. pSVF8- 303 wurde mit ECORV und SmaI gespalten, und die glatten Enden wurden miteinander ligiert, um pSVF8-160 zu bilden. Dieses Plasmid codiert für die ersten 1315 Aminosäuren des Faktors VIII:C. Acht substituierte Aminosäuren werden an das Carboxyl-Ende als Ergebnis der Fusion des Polylinkers des Vektors pSV7d zugefügt.
(C) pSVF8-1790: Dieses Plasmid stellt eine 1416 Aminosäuren lange schwere Kette bereit und wurde ebenfalls ausgehend von pSVF8-303 hergestellt. pSVF8-303 wurde partiell mit BglII gespalten, und das entstehende 6811 bp Fragment wurde über ein Gel isoliert, und die Enden wurden miteinander ligiert, um pSVF8-170 zu bilden. Dieses Plasmid codiert für die ersten 1405 Aminosäuren von Faktor VIII:C, und besitzt eine Carboxyl-Extension von 11 Aminosauren aufgrund der Fusion des Polylinkers des Vektors pSV7d.
(D) pSVF8-120: Dieses Plasmid stellt eine 1107 Aminosäuren schwere Kette bereit und wurde ausgehend von pSVF8-303 hergestellt. Das Plasmid pSVF8-303 wurde mit ApaI gespalten, und die cohäsiven Enden wurden mit T4-Polymerase aufgefüllt. Das entstehende Molekül wurde weiter mit SmaI gespalten, die DNA mit sich selbst ligiert und in E. coli HB101 propagiert. Dieses Plasmid codiert für 1102 Aminosäuren des Aminoterminus von Faktor VIII:C plus zusätzliche 5 Aminosäuren am Carboxyl-Terminus, die vom pSV7d-Polylinker codiert werden.

(E) Ergebnisse

Jedes der Plasmide von Teilen A-D wurde in COS7-Zellen zusammen mit pSVF8-80 wie in Beispiel 1 transflziert, und die Medien wurden wie in Beispiel 1 auf Faktor VIII:C-Aktivität getestet.
Alle diese Plasmide zeigten wesentlich reduzierte Expressionsspiegel, verglichen zu dem von pSVF8-92E. Interessanterweise ist jedoch das Verhältnis von RIA zu Coatest-Aktivität für pSVF8-160 und pSVF8-170 etwa 1,8, verglichen mit 7,2 für pSVF8-92E. Dieses Ergebnis legt nahe, daß diese längeren schwere-Kette-Derivate eine höhere spezifische Aktivität besitzen, d.h. daß sie effizienter in aktive Untereinheitenkomplexe assoziieren als das Mr 92 K-Molekül selbst. Ebenso ist das Verhältnis von Koagulationsaktivität zu Coatest-Aktivität für die längeren schweren Ketten mit etwa 1,7 niedriger, verglichen mit 2,3 für Mr 92 K und 1,35 für das vollständige Molekül, was nahelegt, daß diese längeren Polypeptide Komplexe bilden, die nicht so aktiviert sind, wie der Mr 92 K- + Mr 80 K-Komplex.

Beispiel 4

Dieses Beispiel beschreibt die Herstellung von stabilen CHO-Zellinien, die den Faktor VIII:C Mr 92 K-80 K-Kettenkomplex bilden.

(A) Herstellung eines Plasmides welches für einen selektierbaren Marker codiert

Das Plasmid pAD-DHFR, welches die murine DHFR cDNA trägt, wurde durch Fusion des Haupt-späten-Promotors des Adenovirus-2 (Ad-MLP, Karteneinheiten 16-27,3) an die 5'- nichttranslatierten Sequenzen der Mäuse-DHFR cDNA (J.H. Nunberg et al, Cell (1980)19:355- 64) konstruiert. SV40 DNA-codierende Teile der frühen Transkriptionseinheit, einschließlich des Introns des kleinen t Antigen-Genes, und die SV40-frühe-Region-Transkriptionsterminationsregion wurde von pSV2-neo (Southern und Berg, J Mol Appl Gen (1982) 1:327-41) erhalten und an das 3'-nichttranslatierte Ende der DHFR cDNA füsioniert. Diese drei Segmente wurden in pBR322 subcloniert, um Plasmid pAD-DHFR zu erhalten.

(B) Transfektion und Kultur von CHO-Zellen

CHO-DUKX-B11-Zellen, die nichtfunktionelle Gene für die Dihydrofolat-Reduktase (Urlaub und Chasin, Proc Nat Acad Sci USA (1980) 77:4216-4220) tragen, wurden mit einem Calciumphosphatcopräzipitat dreier Plasmide transflziert: pSVF8-92C, pSVF8-92E oder pSVF8-80 und pAd-DHFR unter Befolgung des Verfahrens von Graham und Van der Eb, supra, und der von Wigler et al, Cell (1978) L4:725-731 und Lewis et al, Somatic Cell Genet (1980) 6:333-347, beschriebenen Modifikationen. Copräzipitate enthielten bis zu 10 µg eines jeden Plasmids. Die Zellen wurden im Hinblick auf den DHFR (positiven) Phänotyp in einem Medium, dem Hypoxanthin und Thymidin fehlen, selektioniert.
Nach der Isolation von DHFR-positiven Clonen und der Identifikation von solchen, welche Faktor VIII:C-Aktivität produzieren, wurden die entstandenen Zellinien in Methotrexat kultiviert, um die DHFR-Gene zu amplifizieren und die Faktor VIII:C-Gene cozuamplifizieren. Diese Selektion wurde durch Ausplattieren der Zellen in Medium durchgeführt welches Methotrexat in Konzentrationen enthielt, die im Bereich von 0,025 bis 0,2 µM lagen. Methotrexatresistente Clone wurden erneut im Hinblick auf Faktor VIII:C-Aktivität untersucht.

(C) Assayverfahren

Konditionierte Medien von diesen DHFR-positiven Clonen wurden durch ELISA auf Faktor VIII:C-leichte Ketten-Immunoreaktivität durch das Verfahren von Nordfang et al, Thromb Haemostas (1985) 53:346-50 untersucht. Faktor VIII:C-schwere Ketten-Immunoreaktivität wurde durch einen Radioimmunoassay (RIA), beschrieben von R.L. Burke et al, J Biol Chem (1986) 261:12574-78, abgeschätzt. Aktive Faktor VIII:C-Komplexe, die durch Coexpression der 92 K und 80 K Mr-Glykoproteine gebildet wurden, wurden unter Verwendung des in Beispiel 1 beschriebenen COATEST-Assays gemessen.

(D) CHO-Linien, welche aktive 92 K-80 K Mr-Komplexe exprimieren

In Tabelle 5 sind vier unabhängige CHO-Zellinien gezeigt, die gleichzeitig Produkte aller drei Plasmide, die für die Transfektion verwendet wurden, exprimieren. Die Faktor VIII: C-Aktivitätswerte, die in Tabelle 5 gezeigt sind, sind die initial beobachteten. Die Expression von Glykoproteinen durch stabile Zellinien wird in der Regel nach Passage in T-75-Flaschenkulturen verbessert. Als Beispiel hierfür kann die Linie 10-C2 gesehen werden, die letztlich 200 mE Faktor VIII:C-Aktivität pro ml konditioniertes Medium produzierte (Tabelle 6). Die Clonierung dieser stabilen Zellinien illustriert, daß die unabhängig exprimierten schweren und leichten Ketten von Faktor VIII:C in einen aktiven Komplex assoziieren können und von Eierstockzellen des chinesischen Hamsters sekretiert werden können. TABELLE 5: CHO-Zellinien, die aktive 92 K-80 K-Komplexe erzeugen
Daß die drei Plasmide in die Chromosomen der CHO-Zellen integriert wurden, wird von der Tatsache nahegelegt, daß die Zellinien der Tabelle 5 während vieler Passagen ohne Verlust von Faktor VIII:C-Expression kultiviert werden konnten. Es war dann notwendig, zu bestimmen, ob die Expression von Faktor VIII:C-Glykoproteinen durch Methotrexat-Selektion coamplifiziert werden konnte. Alle vier dieser Zellinien wurden mit mehreren Konzentrationen von Methotrexat selektioniert. Resistente Kolonien (amplitfizierte DHFR-Gene) wurden für jede Linie erhalten und wurden auf Faktor VIII:C-Aktivität durchgemustert. Die Expression von Faktor VIII:C ging in den Methotrexat-resistenten 11-D5- und 11-D6-Clonen verloren oder war unverändert. Die Expression von Faktor VIII:C variierte bei den Methotrexat-resistenten Clonen, die von 10-C2 und 8-C1 abgeleitet wurden (in Tabelle 6 gezeigt).
22 Methotrexat-resistente 8-C1-Clone wurden untersucht. Die Daten für 10 von diesen sind in Tabelle 6 gezeigt. Die Menge von Faktor VIII:C-Amplifikation variiert unter den Clonen, was darauf hinweist, daß entweder eines der Gene für die Untereinheit mit der DHFR-Kassette zusammen coamplifiziert wurde, oder beide von ihnen oder keine von ihnen. Es wird darauf hingewiesen, daß die Clone 8C1-A2, 8C1-C2 und 8C1-C5 Beispiele für diese vier Möglichkeiten darstellen. In ähnlicher Weise wurden 30 Methotrexat-selektionierte Derivate von 10-C2 ausgewertet. Die Daten für 20 von diesen sind ebenfalls in Tabelle 6 dargestellt. Diese enthalten ebenfalls ein Spektrum an Aktivität. Es wird darauf hingewiesen, daß die Clone 10C2-A2, 10C2- D2, 10C2-B5 und 10C2-C6 Beispiele für die vier verschiedenen Coamplifikationsmöglichkeiten darstellen. TABELLE 6
Unter den in Tabelle 6 beschriebenen CHO-Linien befindet sich eine (10C2-D2), die 0,5 E/ml aktiven Faktor VIII:C-Komplex bildet, was die Hälfte der Konzentration ist, die in normalem humanem Plasma gefünden wird. Zur Analyse und Reinigung von Faktor VIII:C-Material wurden CHO-Zellen, die Faktor VIII:C-Polypeptide exprimieren, in Laboratoriumsmaßstabfermentation kultiviert, um 1-2 1 Mengen an Gewebekulturflüssigkeit zu erzeugen. Die Untersuchung dieses Materials zeigte, daß etwa 10% bis 20% an immunreaktivem Faktor VIII:C von nichtamplifizierten Linien im COATEST aktiv sind. In amplifizierten Linien fällt der Prozentsatz an aktivem Material auf 2% bis 5% des gesamtimmunoreaktiven Produkts. Das bedeutet, daß lediglich eine Fraktion der schweren und leichten Ketten von FVIII:C zu aktiven Komplexen assoziiert. Der Rest kann als freie Untereinheiten oder in abgebauter Form vorkommen.
Plasmide pSVF8-92 und pSVF8-80 wurden bei der American Type Culture Collection (ATCC) am 24. Januar 1986 hinterlegt und erhielten die ATCC-Zugangsnummern 40222 bzw. 40223. Plasmid pSVF8-200 wurde bei der ATCC am 17. Juli 1985 hinterlegt und erhielt die ATCC-Zugangsnummer 40190.

Beispiel 5

Dieses Beispiel beschreibt die Modifikation des Plasmides pSVF8-80, um die Aminoterminale Aminosäure des FVIII:C-leichte Ketten Glykoproteins zu korrigieren. Als eine Folge der Manipulation, die das Signalpeptid bereitstellte, welches für eine unabhängige Sekretion des 80 K Mr-Glykoproteins (Beispiel 1) notwendig ist, ist die Substitution von Ser für den normalen Amino-terminalen Rest der humanen Plasma FVIII:C-leichte Ketten. Neue Plasmide wurden erzeugt in einem Ansatz die TPA-Prä-Pro-Peptidsequenz zu verändern, so daß die FVIII:C- leichte Kette nach dem proteolytischen Prozessieren anstelle des mutanten Ser-Restes den Glu- Rest am Aminoterminus besitzen wird.
Man nimmt an, daß die FVIII:C-leichte Kette vor der Sekretion von dem Vollänge FVIII:C-Precursor gespalten wird, d.h. intrazellulär durch eine Protease, die im Golgi-Apparat sitzt. Diese Spaltung findet zwischen Aminosäureresten 1648 und 1649 (Arg-Glu) statt. Auf Polyacrylamidgelen erscheinen die leichten Ketten als 77 und 80 K Mr Doubletbanden, die Polypeptide repräsentieren, die ein oder zwei N-gebundene Oligosaccharide besitzen. Die unabhängige Sekretion von leichten Ketten wurde durch Fusion der leichte Kette-codierenden Region der FVIII:C-CDNA an die CDNA von TPA erreicht. Im Verfahren zur Bereitstellung des TPA- Signalpeptides wurde jedoch der Aminoterminus der FVIII:C-leichten Kette vom nativen Glutaminsäurerest zu einem Serin mutiert. Obwohl diese mutante rekombinante leichte Kette molekulare Charakteristika zeigt, die denen der Kette, welche von Vollänge-rekombinantem FVIII:C ähnlich ist, gibt es präliminäre Hinweise, daß 1) sie nicht alternativ auf die gleiche Weise glykosiliert wird, wie die Kette, die vom FVIII:C-Precursor gespalten wird, 2) sie sich während der Reinigung durch Ionenaustausch und VWF-Sepharosechromatographie unterschiedlich verhält, und 3) sie antigenisch im Vergleich zu authentischer leichter Kette unterschiedlich ist.
Die tPA-Prä-Pro-Peptidsequenz benötigt drei proteolytische Spaltungen, um das reife Polypeptid freizusetzen. Unten ist die Transiation der Protein-codierenden Sequenz von pSVF8- 80 in die Region der tPA-FVIII:C 80 K-Fusion gezeigt: pSVF-80:
Es wurde angenommen, daß die Signalpeptidasespaltung an der Carboxystelle von entweder Ser (Position -13) oder Ala (Position -8), durch Sterne angegeben, jeweils stattfindet. Die zweite Spaltung findet wahrscheinlich an der Carboxystelle von Arg (Position -4, oben durch ein @ angegeben). Das dritte Prozessierungsereignis ist Proteolyse an der Arg-Ser-Bindung unter Freisetzung eines Gly-Ala-Arg-Tripeptides und Zurucklassen eines Ser-(Position 1)-Aminoterminus an den reifen TPA oder FVIII:C-leichte-Ketten-Polypeptiden.

(A) Herstellung von Plasmiden

(1) pSVFg-80KG:

Das Ser-Codon (Position 1) wurde durch ortsspezifische Mutagenese in ein Glu-Codon (Position 1) umgewandelt. Dies wurde im Zuge einer Anstrengung durchgeführt, die ersten beiden proteolytischen Prozessierungsereignisse normal stattfinden zu lassen, und zu testen, ob die Arg-Glu-Protease das Dipeptid in einem veränderten Kontext, d.h. wenn das tPA-Tripeptid für die FVIII:C-B-Domäne substituiert ist, erkennen und spalten könnte.
Die tPA-80 K-Kette-Fusionsregion ist unten gezeigt. Im übrigen ist dieses Plasmid mit pSVF8-80 identisch. pSVF8-80KG: (2) pSVF8-80S:
Zwölf Codons wurden von pSVF8-80 durch in vitro-Mutagenese deletiert, und das Ser (Position 1)-Codon wurde in ein Codon für Glu umgewandelt. Dieses platzierte den Glu FVIII:C-leichte Kette-Rest nach Ser23 des putativen tPA-Signalpeptids (durch einen Stern angegeben). Die Spaltung durch Signalpeptidase an der Carboxystelle des Ser23 setzt die nichtmutierte FVIII:C-leichte Kette ftei. Die TPA-80 K-Kette-Fusionsregion von pSVF8-80S ist unten gezeigt. Im übrigen ist das Plasmid mit pSVF8-80 identisch. pSVF8-80S:

(3) pSVF8-80R:

Eine Deletion von drei Codons von pSVF8-80 zur Entfernung des TPA-Protripeptides wurde durch in vitro-Mutagenese durchgeführt, und das Ser (Position 1)-Codon wurde in eines für Glu umgewandelt. Dies platziert einen Glu-Rest nach Arg32 des tPA-Propeptides, markiert mit @ an der tPA-80 K-Ketten-Fusionsregion von pSVF8-80R, wie unten gezeigt: pSVF8-80R:
Diese Konstruktion wurde in der Hoffnung gemacht, daß die Spaltung durch eine im Golgi vorkommende Protease mit dibasischer Spezifität FVIII:C-leichte Ketten mit Glu-Aminotermini &eisetzen würde.

(4) pSVF8-80A:

Sieben Codons von pSVF8-80 wurden durch ortsspezifische Mutagenese deletiert, wobei die DNA, welche für die putative tPA-Prosequenz codiert, entfernt wurde, und das Ser (in Position 1)-Codon durch ein Glu-Codon nach Codon 28 (Ala) der putativen tPA-Signalpeptid-codierenden Sequenz (unten durch einen Stern angegeben) ersetzt wurde. Spaltung durch Signalpeptidase an der Carboxystelle von Ala28 mit Freisetzung nichtmutanter FVIII:C-leichter Kette. Die tPA-80 K-Kette Fusionsregion ist unten gezeigt. Im übrigen ist dieses Plasmid mit pSVF8- 80 identisch. pSVF8-80A:

(B) Expression und Proteinsequenzanalyse

(1) Transfektion in COS7-Zellen:

COS7-Zellen wurden unter Verwendung des DEAE-Dextranverfahrens, das in Beispiel 1 beschrieben wurde, transfiziert, und konditionierte Medien wurde durch den LC-ELISA untersucht. Alle vier pSVF8-80 Derivate codieren für 80 K Mr-Glykoproteine, die in LC-ELISA reaktiv ist, und die nach biosynthetischer Radiomarkierung mit verschiedenen anti-FVIII:C- leichte Ketten-Antikörpern immunpräzipitiert werden können. Mit der Ausnahme von pSV/8- 80R führen alle diese Derivate zur Sekretion von etwa der gleichen Menge an 80 K- Glykoprotein wie pSVF8-80. Die Sekretion von 80 K-Glykoproteinen von Zellen, die mit pSVF8-80R transfiziert wurden, ist sehr gering, üblicherweise weniger als 25% der Produktion der anderen Plasmide. Außerdem ist das Aussehen dieser FVIII:C-leichten Kette bei Gelelektrophorese, wo die Banden immer diffüs sind, anders.

(2) Expression in CHO-Zellen:

Jedes dieser Plasmide wurde in DUKX-B11 CHO-Zellen mit pAd-DHFR, wie in Beispiel 4 beschrieben, eingeführt. Permanente Zellinien wurden zur Produktion eines jeden Types der leichten Kette etabliert. Die Expression der 80 K Mr-Glykoproteine in CHO-Zellen ist der Expression in COS7-Zellen in Bezug auf die Mengen an sekretiertem Glykoprotein und in Bezug auf das Erscheinen der 80 K-Banden bei Gelelektrophorese sehr ähnlich. CHO-Zellinien, die mit pSVF8-80R transfiziert wurden, produzieren einen so niedrigen Spiegel an 80 K-Glykoprotein, daß eine Analyse dieses Materials nicht vorgenommen wurde.

3. Reinigung und Aminosäuresequenzanalyse

Konditionierte Medien, entweder von COS7-Transfektionen (pSVF8-80KG) in großem Maßstab oder von transfizierten (amplifizierten) CHO-Zellinien (pSVF8-80K-Zeliinie 10C2B5; pSVF8-80A, Zellinie A1N; pSVF8-80S, Zellinie S1R) wurden hergestellt. Das Medium war DME H12 mit 10% FBS. FVIII-LC wurde für die Sequenzierung mittels eines Zweistufenverfahrens gereinigt, welches Ionenaustauschchromatographie, gefolgt von Affinitätschromatographie, umfaßt. Ionenaustauschchromatographie wurde wie folgt durchgeführt: Eine S-FF-Sepharosesäule (15 x 0,8 cm) wurde mit 0,02 M MES, 0,05 M NaCl, 0,01 M CaCl&sub2;, pH 5.8, lambda20ºC = 7,2 mS äquilibriert. Konditioniertes Medium (500-1300 ml) wurde auf die Säule nach dem Einstellen des pH-Wertes auf einen Wert von 5,8 mit einer Flußrate von 100 ml/h aufgetragen. Diese Säule wurde mit 10 Säulenvolumen 0,05 M Imidazol, 0,05 M NaCl, 0,01 M CaCl&sub2;, pH 7,35, lambda20ºC = 8,8 mS in einer Flußrate von 200 ml/h gewaschen. FVIII-LC wurde durch Zugabe von 0,1 M CaCl&sub2; zum Waschpuffer, Flußrate 50 ml/h, eluiert. Alle Arbeitsgänge wurden bei 4ºC durchgeführt.
Affinitätschromatographie wurde wie folgt durchgeführt: Der murine Anti-FVIII-LC- monoclonale Antikörper 56-IgG wurde an Sepharose 4B mittels des CNBr-Verfahrens zu einer Dichte von 2,5 mg/ml gekoppelt. Das FVIII-LC-enthaltende Eluat wurde mit dem Immunosorbens über Nacht bei Raumtemperatur inkübiert, 1 ml Gel je 1000 Einheiten FVIII-LC. Das Gel wurde dann in eine Säule gepackt und mit 20 Säulenvolumen eines Niedrigsalzpuffers gewaschen (0,05 M Imidazol, 0,15 M NaCl, 0,01 M CaCl&sub2;, 10% Glycerin, 0,02% NaN&sub3;, pH 7,3), gefolgt von 20 Säulenvolumen eines Hochsalzpuffers (0,05 M Imidazol, 1,0 M NaCl, 10% Glycerin, pH 7,3). FVIII-LC wurde vom Immunosorbens unter Verwendung von 1 M CaCl&sub2; in 0,05 M Imidazol, 0,15 M NaCl, 10% Glycerin nach einer Stunde Inkubation eluiert. Das Eluat wurde sofort auf einer Sephadex-G-25-Säule zu einer Lösung von 0,05 Imidazol, 0,15 M NaCl, 0,01 M CaCl&sub2;, 10% Glycerin, 0,02% Tween 80, 0,02% NaN&sub3;, pH 7,3, entsalzt und bei -80ºC gelagert. Die N-terminale Sequenzanalyse wurde mit einem Applied Biosystem 477A-Sequenziergerät durchgeführt.
Die Ergebnisse dieser Analyse sind in Tabelle 7 gezeigt. Das 80 K-Glykoprotein, das von pSVF8-80KG codiert wird, besitzt eine Tripeptidextension an seinem Aminoterminus. Vermutlich ist dies das tPA-Pro-Tripeptid Gly-Ala-Arg, welches von der Arg-Glu-Protease, die die FVIII:C-B-Domäne erkennt, nicht prozessiert werden kann. Weiterhin ergeben die N-terminalen Sequenzen, daß das Signalpeptid von tPA tatsächlich 22 Aminosäurereste lang ist, wobei die Signalpeptidasespaltung an der Carboxyseite von Pro22 stattfindet. Daher führen die Plasmidkonstruktionen pSVF8-80S und pSVF8-80A bei denen eine Signalpeptidasespaltung nach Ser 23 bzw. Ala 28 vorausgesagt wurde, zu nicht korrekten Amino-terminalen Resten der 80 K-leichten Ketten. TABELLE 7: N-terminale Sequenzen von 80 K-Ketten mit modifizierten tPA-Prä-Pro-Regionen
Die in diesem Beispiel gezeigten Ergebnisse zeigen die Schwierigkeiten beim Vorhersagen, wie ein sekretiertes Polypeptid nach Transkription und Translation prozessiert wird. Modifikationen der Proteinsequenz haben unerwartete Konsequenzen für proteolytisches Prozessieren und Oligosaccharidaddition und können die Gesamteffizienz der Sekretion beeinflussen.

Beispiel 6

Dieses Beispiel beschreibt ein Verfahren zur Expression von authentischen FVIII:C- leichte Ketten unter Verwendung des Signalpeptids von humanem α1-Antitrypsin.

A. Herstellung von Plasmiden

1. pSVα1AT.Met

Eine cDNA, die für das reife humane α1-Antitrypsinpolypeptid codiert, wurde unter Verwendung von Fragmenten humaner Leber-cDNA-Clone und eines synthetischen Oligonucleotids zusammengesetzt; der Zusammenbau wurde als ein BamHI-SalI-Fragment in pBR322 ligiert, um Plasmid pAT(Met) (Rosenberg et al, Nature (1984) 312:77-80) herzustellen. Ein synthetischer Oligonucleotidlinker-Adaptor und Teil eines cDNA-Clones, der für das Signalpeptid codiert, wurden verwendet, um die Signalpeptid-codierende Sequenz, mit einer EcoRI-Restriktionsstelle am 5'-Ende, an die BamHI-Erkennungsstelle von pAT(Met) anzufügen. Das entstandene 1271 bp EcoRI-SalI-Fragment, welches für die translatierten Sequenzen von humanem α1-Antitrypsin codiert, wurde in die EcoRI-SalI-Erkennungsstellen von pSV7d (beschrieben in Beispiel 1) ligiert, um Plasmid pSVα1AT.Met zu ergeben.

2. pSVF8-80AT

Plasmid pSVα1AT.Met wurde an der BamHI-Erkennungsstelle, die an der Grenze zwischen den Codons für das Signalpeptid und reifen α1-Antitrypsinsequenzen liegt, geöffnet. Das cohäsive Ende dieser Restriktionsstelle wurde mit Mungobohnennuclease entfernt, so daß das GAG (Glu)-Codon zurückblieb, und die α1-Antitrypsinsequenz wurde durch Spaltung mit SalI deletiert. Die codierende Sequenz FVIII:C 80 K wurde für eine Verknüpfüng durch in vitro- Mutagenese der Codons 1 und 2 von pSVF8-80 unter Bildung einer EcoRV-Erkennungsstelle (welche Codon 2 als ein Ile-Codon beläßt) vorbereitet. Dies ermöglichte die Fusion von FVIII:C-leichter Kette-codierender Sequenz (als eine EcoRV-SalI-Sequenz, die an Codon 2 beginnt) im korrekten Leserahmen an Codon 1 von α1-Antitrypsin und den Ersatz der codierenden Sequenz von reifem humanem α1-Antitrypsin.
Die codierende Sequenz von pSVF8-80AT im Bereich der Fusion ist unten translatiert gezeigt. Mit Ausnahme der Substitution der α1-Antitrypsinsignalpeptid-codierenden Sequenz für die tPA-Prä-Pro-codierende Sequenz ist dieses Plasmid mit pSVF8-80 identisch. pSVF8-80AT (Amino-terminale Region):

B. Expression und Aminosäuresequenzanalyse

1. Expression von pSVF8-80AT in COS7-Zellen

COS7-Zellen wurden mit pSVF8-80AT und einem schwere-Ketten-Expressionsplasmid, gewöhnlicherweise pSVF8-92C, transfiziert. Konditionierte Medien wurden mittels LC-ELISA, HC-ELISA und COATEST getestet. Die transfizierten Zellen wurden ebenfalls mit radioaktivem Met markiert, so daß die biosynthetisch radiomarkierten FVIII:C-leichte Ketten immunpräzipitiert und nach Polyacrylamidgelelektrophorese visualisiert werden konnten. Plasmid SVF8-8OAT steuert die Synthese von FVIII:C-leichten Ketten, die als ein Doublet von 77-80 K Mr erscheinen. Die in COS7-Zellen produzierte Menge ist die gleiche wie für pSVF8-80. Die Coexpression mit pSVF8-92C oder einem anderen FVIII:C-schwere Ketten-Plasmid führt zur Bildung von aktiven FVIII:C-Komplexen, wie durch COATEST-Assay gemessen.

2. Reinigung und Aminosäuresequenzanalyse

Material zur Reinigung wurde durch Transfektion von COS7-Zellen in T-175-Flaschen bei Verwendung einer gesteigerten Zelldichte und einer verminderten Chloroquindiphosphat- Konzentration hergestellt. Konditionierte Medien wurden 60 Stunden nach der Transfektion gesammelt. Die Reinigung mit Aminosäuresequenzanalyse wurde, wie in Beispiel 5 beschrieben, durchgeführt. Die Ergebnisse der Amino-terminalen Sequenzanalyse (Tabelle 8) zeigen, daß die FVIII:C-leichte Kette, die von pSVF8-80AT codiert wird, die gleiche Amino-terminale Sequenz besitzt, wie authentische humane Plasma FVIII:C-leichte Kette. TABELLE 8: N-terminale Sequenz von 80 K-Ketten, die unter Verwendung des α1-Antitrypsinsignalpeptids sekretiert wurden.

3. In vitro-Assoziation von 80AT FVIII:C-leichten Ketten

Die Fähigkeit von 80 AT FVIII:C-leichten Ketten mit gereinigten FVIII:C-schweren Ketten in vitro zu rekombinieren, wurde in einem Experiment, das in Tabelle 9 gezeigt ist, getestet. Gereinigte FVIII:C-leichte Ketten wurden in Konzentrationen von 3,7 E/ml mit gereinigten rekombinanten (von Vollänge-humanem FVIII:C) schweren Ketten in einer Konzentration von 17 E/ml in Puffer, enthaltend 50 mM Mn&spplus;² und 150 µM β-Mercaptoethanol, inkubiert. Als Kontrolle ließ man gereinigte rekombinante schwere und leichte Ketten unter den gleichen Bedingungen reassoziieren, und die Menge an gebildetem aktivem FVIII:C wurde durch COATEST analysiert. Diese Ergebnisse legen den Schluß nahe, daß die 80AT FVIII:C-leichte Kette in vitro mit gereinigter rekombinanter schwerer Kette kombiniert werden kann. TABELLE 9: Kombination von rekombinanten FVIII:C-leichten Ketten mit schweren Ketten in vitro

Beispiel 7

Dieses Beispiel beschreibt Plasmide für eine verbesserte Expression der Faktor VIII:C- schweren Kette. Modifikationen in DNA-Sequenzen, die für die Initiation der Transkription verantwortlich sind, und Modifikationen in nichtcodierenden Sequenzen werden erzeugt, um die Effizienz der Transkription und die Stabilität der Messenger-RNA zu steigern. Das schwere Kette-Glykoprotein wird durch eine Carboxy-terminale Extension modifiziert, die aus Segmenten der B-Domäne, verbunden mit einem kurzen Peptid, zusammengesetzt ist. Dies wird durchgeführt, um eine schwere Kette zu erhalten, die von den Zellen effizienter sekretiert wird, im Gewebekülturmedium stabiler ist, und effizienter mit der leichten Kette assoziiert.

A. Herstellung von Plasmiden

1. pCMVFB-92/6x

In einer Anstrengung, den Transkriptionsspiegel und die Stabilität der Messenger-RNA für die Faktor VIII:C 92 K Mr-schwere Kette zu verbessern, wurde die SV40-frühe Transkriptionsinitiationsregion durch Sequenzen aus der humanen Cytomegalovirus-sehr-frühen-Region ersetzt (Boshart et al Cell (1985) 4:521-530). Zusätzlich wurden 5'-nichttranslatierte Sequenzen, die von der SV40-frühen Region der Messenger-RNA beigesteuert wurden, durch die 5'- nichttranslatierten Sequenzen des HCMV 1E1-Genes, einschließlich seines ersten Introns, ersetzt. Dieses Intron wird unter der Annahme eingeschlossen, daß gespleißte Transkripte zu einer schnelleren Prozessierung und einer stabileren mRNA führen. Der Expressionsvektor besitzt ebenfalls einen SV40-Replikationsursprung, um eine transiente Expression in COS7-Zellen zu ermöglichen und ein bakterielles β-Lactamasegen, um eine DNA-Clonierung durch Selektion auf Ampicillin-Resistenz zu ermöglichen.
Das Plasmid wurde aus einem 700 bp SalI-PvuI-Fragment von pSV7d (beschrieben in Beispiel 1), enthaltend die SV40-Polyadenylierungsregion, ein 1400 bp PvuI-EcoRI (mit Klenow-Polymerase aufgefülltes) Fragment von pSVT2 (Myers et al, Cell (1981) 25:373-84; Rio et al, Cell (1983) 32:1227-40), welches den SV40-Replikationsursprung und den Rest des β-Lactamasegenes bereitstellt, einem 1700 bp SspI-SalI-Fragment, welches von einem Plasmidsubclon des menschlichen humanen Cytomegalovirus (Towne strain) abgeleitet ist, und in welchem die SalI-Erkennungsstelle nahe der Translationsstartstelle des 1E1-Proteins durch in vitro-Mutagenese eingeführt worden war, und von einem 4300 bp SalI-SalI-Fragment aus pSVF8-92C (beschrieben in Beispiel 2), enthaltend die cDNA, welche für das Faktor VIII:C 92 K Mr-Glykoprotein codiert, konstruiert.

2. pSVF8-92tβ

Dieses Plasmid ist ein pSVF8-92C-Derivat, das für die 92 K Mr-rekombinante schwere Kette mit einer C-terminalen Extension, aufgebaut aus N-terminalen und C-terminalen Aminosaureresten der Zentral-(B)-Domäne des Faktors VIII:C-Precursors, gebunden durch ein Peptidgelenkpeptid verbunden ist, das homolog zu dem der menschlichen Immunoglobulin-α-schweren Kette ist, codiert. Es ist aus einem 4900 bp HINDIII-SalI-Fragment aus pSVF8-92C, in das ein 110 bp HindIII-SalI-synthetischer Linker-Adaptor (unten gezeigt) inseriert wurde, aufgebaut.
Der Linker-Adaptor codiert für eine Carboxy-terminale Extension von 34 zusätzlichen Arninosäureresten und für eine potentielle N-gebundene Glykosilierung. Das C-terminale Peptid sollte das Molekulargewicht der schweren Kette auf etwa 96 K Mr und für den Fall der Glykosilierung auf etwa 99 K Mr erhöhen.

B. Assay für FVIII:C-schwere Kettenantigen und FVIII:C-Komplexbildung

Die Cofaktoraktivität des FVIII:C-leichte Ketten/schwere Ketten-Komplexes wurde unter Verwendung eines von Kabivitrum (COATEST) kommerziell erhältlichen Testkits abgeschätzt. Immunoreaktive FVIII:C-leichte Kette wurde durch ELISA unter Verwendung von HZ IgG-Beschichtungsantikörper und Peroxidase-konjugierten Antikörpern von Nordisk Gentofte gemessen. Die FVIII:C-schwere Kettenimmunoreaktivität wurde unter Verwendung eines ELISA quantifiziert, der von Nordisk Gentofte entwickelt wurde, und welcher einen humanen polydonalen (Antikörper) aus einem Inhibitorpatienten (E-IgG) verwendet.

C. Transiente Expression von pCMVF8-92/6x

Das pCMVF8-92/6x-Plasmid wurde rnit verschiedenen FVIII:C-leichte Kettenplasmiden (in Beispiel 5 beschrieben) in COS7-Zellen unter Verwendung der DEAE-Dextran-Prozedur cotransfiziert. Ein Beispiel von Ergebnissen dieser Transfektionen ist in Tabelle 10 gezeigt. Die Daten legen den Schluß nahe, daß die Zugabe des CMV 1E1 Promotor/Enhancers und 5'-nichttranslatierter Sequenzen des 1E1-Genes eine 2,5-fache Verbesserung (im Durchschnitt) in FVIII:C-schwerer Ketteexpression ergeben. TABELLE 10: Expression von pCMVFB-92/6x gegenüber pSVF8-92C in COS7-Zellen
a COATEST-Assay
b Radioimmunassay für schwere Kette

D. Transiente Expression von pSVF8-92tβ in COS7-Zellen

In Tabelle 11 sind die Ergebnisse der Cotransfektion von pSVF8-92tβ mit einem Faktor VIII:C-leichte Kettenexpressionsplasmid (pSVF8-80AT, beschrieben in Beispiel 6) in COS7- Zellen gezeigt. Die 92tβ-schwere Kette wird in höheren Spiegeln sekretiert als die 92C-schwere Kette, die eine Einzelaminosäure (Ser) Carboxy-terminale Extension besitzt. Das Verhältnis von COATEST (COA)-Aktivität zu ELISA-reaktivem Glykoprotein (ein Maß der Komplexbildung) ist für die 92tβ-Ketten größer als für die 92C-Ketten. Außerdem wird die 92tβ-schwere Kette in serumfreiem Medium gut sekretiert und scheint stabil zu sein, mit einem Aktivitäts- zu Proteinverhältnis, das fast das gleiche ist wie in 10% FBS. Diese Ergebnisse zeigen, daß diese 34 Aminosäure Carboxy-terminale Extension die Sekretion verbessert und die rekombinante FVIII:C- schwere Kette stabilisiert.

TABELLE 11: Expression von pSVF8-92tβ COS7-Zellen

COS7-Zellmonolayer wurden in Doppelversuchen DNA in DEAE-Dextran ausgesetzt, gewaschen und während 8 Stunden mit Medium behandelt, welches Chlorquindiphosphat enthielt. Die Zellen wurden gewaschen, um Substanz zu entfernen, dann mit 5 ml DME H21, enthaltend 10% FBS, bedeckt. 12-16 Stunden und mit HB CHO von Hana Biologicals überschichtet. Konditionierte Medien wurden im Hinblick auf FVIII:C-Aktivität wie beschrieben untersucht.
a Durch einen leichte Ketten-spezifischen ELISA-Assay
b Durch einen schwere Ketten-spezifischen ELISA-Assay
Obwohl die oben beschriebene Erfindung zum Zwecke der klareren Verständlichkeit mit Hilfe von Beispielen im Detail beschrieben wurde, ist es dennoch offensichtlich, daß bestimmte Veränderungen und Modifikationen innerhalb des Schutzbereiches der beigefügten Patentansprüche durchgeführt werden können.

Beispiel 8

Dieses Beispiel beschreibt ein Verfahren zur Expression einer FVIII:C-schweren Kette, die Arg&sub7;&sub4;&sub0; als C-Terminus besitzt.

A. Herstellung von Plasmid PCMVFB-92R

Die FVJII:C-schwere Kette, die von dem Plasmid pCMVF-8-92/6x codiert wird, besitzt Ser&sub7;&sub4;&sub1; als C-terminale Extension. Um eine FVIII:C-schwere Kette mit Arg&sub7;&sub4;&sub0; als C-Terminus zu erhalten, wurde ein 1588 bp BamHI-Fragment aus pCMVFB-92/6x, welches für das 3'-Ende der codierenden Sequenz codiert, die von pSVF8-92C abgeleitet wurde, gereinigt. Dieses Fragment wurde in m13mp18 cloniert und der Ser&sub7;&sub4;&sub1;-Rest wurde durch in vitro-Mutagenese in ein Translations-Stopcodon umgewandelt. Das pCMVFB-92R-Expressionsplasmid wurde durch Clonierung des mutagenisierten BamHI-Fragmentes in das 5840 bp BamHI-Fragment des ursprünglichen Vektors konstruiert. Durch dieses Verfahren wurden 680 bp an FVIII:C 3'-nichttranslatierten Sequenzen deletiert.

B. Transiente Expression von pCMVFB-92R in COS7-Zellen

Das pCMVF8-92R-Plasmid wurde mit dem FVIII:C-leichte Kettenplasmid pSVF8-80AT (in Beispiel 6 beschrieben) in COS7-Zellen unter Verwendung der Calciumphosphat-Technik (Graham und van der Eb, Virol (1973) 52:456-67) cotransfiziert. Die Medien wurden nach 18 und 42 Stunden nach der Transfektion gewechselt. Medienproben für Assays wurden 66 Stunden nach der Tranfektion gesammelt. Die Ergebnisse dieser Assays sind in Tabelle 12 unten gezeigt. Die Daten zeigen, daß FVIII:C-Aktivität erzeugt wurde, wenn PCMVFB-92R mit einem Plasmid cotransfiziert wurde, welches für die Expression von FVIII-LC sorgt. TABELLE 12: Coexpression von pCMVFB-92R und pSVF8-80AT
Plasmide pSVF8-92 und pSVF8-80 wurden bei der American Type Culture Collection (ATCC) am 24. Januar 1986 hinterlegt und erhielten die ATCC-Zugangsnummern 40222 bzw. 40223. Plasmid pSVF8-200 wurde bei der ATCC am 17. Juli 1985 hinterlegt und erhielt die ATCC-Zugangsnummer 40190.

Claims

1. Verfahren zur Produktion eines rekombinanten Proteinkomplexes mit menschlicher Faktor VIII:C-Aktivität, wobei der Komplex ein erstes Polypeptid, das zu der A-Domäne des menschlichen Faktors VIII:C homolog ist, und ein zweites Polypeptid mit Homologie zu der C-Domäne des menschlichen Faktors VIII:C, aber ohne den gesamten oder einen wesentlichen Teil der B-Domäne des menschlichen Faktors VIII:C, umfaßt, dadurch gekennzeichnet, daß man:

in einer eukaryotischen transfomierten Wirtszelle, die in einem Zellwachstumsmedium gezüchtet wurde,

(a) ein erstes Polynucleotid, das (i) eine erste Signalsequenz, die die Sekretion steuern kann, und (ii) ein erstes Polypeptid mit einer ersten Region mit einer der A-Domäne des menschlichen Faktors VIII:C homologen Aminosäuresequenz codiert und

(b) ein zweites Polynucleotid, das (i) die Signalsequenz von menschlichem α1-Antitrypsin mit der Fähigkeit die Sekretion zu steuern, und (ii) ein zweites Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz, die der Aminosäuresequenz der Aminosäuren 1649-2332 des menschlichen Faktors VIII:C homolog ist, cqdiert, coexpremiert,

und den sezernierten rekombinanten Proteinkomplex aus dem Zellmedium erhält.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß nicht mehr als 5 Zahlen-% der Aminosäuren der Aminosäuresequenz sich von der natürlich vorkommenden Aminosäuresequenz der Faktor VIII:C A- und C-Domänen unterscheiden.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Aminosäuresequenz des von dem ersten Polynucleotid codierten Polypeptid die gleiche ist wie die Anminosäuresequenz der Aminosäuren 1-740 des menschlichen Faktors VIII:C.

4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Aminosäuresequenz des von dem ersten Polynucleotid codierten Polypeptid die gleiche ist wie die Aminosäuresequenz der Aminosäuren 1-1102 des menschlichen Faktors VIII:C.

5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Aminosäuresequenz des von dem ersten Polynucleotid codierten Polypeptid die gleiche ist wie die Aminosäuresequenz der Aminosäuren 1-1315 des menschlichen Faktors VIII:C.

6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Aminosäuresequenz des von dem ersten Polynucleotid codierten Polypeptid die gleiche ist wie die Aminosäuresequenz der Aminosäuren 1-1405 des menschlichen Faktors VIII:C.

7. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das erste Polypeptid weiterhin

eine zweite Region, umfassend (a) die N-terminale Sequenz der B-Domäne des menschlichen Faktors VIII:C, die die Aminosäuresequenz Ser-Phe-Ser-Gln-Asn-Ser-Arg-His-Pro-Ser- Thr-Arg-Gln-Lys-Gln-Phe-Asn-Ala oder eine Sequenz, die sich davon nur durch nicht mehr als 10 Zahlen-% unterscheidet; (b) einen Polypeptid-Spacer von etwa 3 bis etwa 100 Aminosäuren, der weniger als 5 N-verknüpfte Glykosilierungsstellen besitzt; und (c) die C-terminale Sequenz der B-Domäne des menschlichen Faktors VIII:C, die die Aminosäuresequenz Pro- Val-Leu-Lys-Arg-His-Gln-Arg oder eine Sequenz, die sich davon durch nicht mehr als 10 Zahlen-% unterscheidet, umfaßt, umfaßt.

8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Aminosäuresequenz der N-terminalen Sequenz der B-Domäne des menschlichen Faktors VIII:C Ser-Phe- Ser-Gln-Asn-Ser-Arg-His-Pro-Ser-Thr-Arg-Gln-Lys-Gln-Phe-Asn- Ala-Thr umfaßt.

9. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß der Polypeptid-Spacer ein der Gelenkregion der schweren Kette des menschlichen Igs homologes Peptid umfaßt.

10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß die Aminosäuresequenz des Polypeptid- Spacers Pro-Pro-Thr-Pro-Pro-Thr umfaßt.

11. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß die C-terminale Sequenz der B-Domäne Pro-Pro-Val-Leu-Lys-Arg-His-Gln-Arg umfaßt.

12. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das erste Polynucleotid weiterhin

(a) eine nichttranslatierte 5'-DNA-Sequenz, die die Expression des ersten Polypeptids erhöht, wobei die nichttranslatierte 5'-Sequenz 5' zur ersten Region positioniert ist, wobei die nichttranslatierte 5'-DNA aus der Gruppe bestehend aus nichttranslatierter 5'-DNA des menschlichen Faktors VIJI:C, nichttranslatierter 5'-DNA des SV40 t-Antigens und nichttranslatierter 5'-DNA des 1E1-Proteins des menschlichen Cytomegalieivirus ausgewählt ist; oder

(b) eine nichttranslatierte 3'-DNA-Sequenz, die die Expression des ersten Polypeptids erhöht, wobei die nichttranslatierte 3'-Sequenz 3' zu der das Polypeptid codierenden Region positioniert ist, wobei die nichttranslatierte 3'-DNA aus der Gruppe bestehend aus nichttranslatierter 3'-DNA des menschlichen Faktors VIII:C, nichttranslatierter 3'-DNA des menschlichen Gewebsplasminogen-Aktivators und nichttranslatierter 3'-DNA des SV40 t-Antigens ausgewählt ist, umfaßt.

13. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß die α1-Antitrypsin-Signalsequenz N- Met-Pro-Ser-Ser-Val-Ser-Trp-Gly-Ile-Leu-Leu-Leu-Ala-Gly-Leu- Cys-Cys-Leu-Val-Pro-Val-Ser-Leu-Ala umfaßt

14. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das zweite Polynucleotid weiter

(a) eine nichttranslatierte 5'-DNA-Sequenz, die die Expression des zweiten Polypeptids erhöht, wobei die nichttranslatierte 5'-Sequenz 5' zu der zweiten Region positioniert ist, wobei die nichttranslatierte 5'-DNA aus der Gruppe bestehend aus nichttranslatierter 5'-DNA des menschlichen Faktors VIII:C nichttranslatierter 5'-DNA des SV40 t-Antigens und nichttranslatierter 5'-DNA des 1E1-Proteins des menschlichen Cytomegalievirus ausgewählt ist; oder

(b) eine nichttranslatierte 3'-DNA-Sequenz, die die Expression des zweiten Polypeptids erhöht, wobei die nichttranslatierte 3'-Sequenz 3' zu der Polypeptid codierenden Region positioniert ist, wobei die nichttranslatierte 3'-DNA aus der Gruppe, bestehend aus nichttranslatierter 3'-DNA des menschlichen Faktors VIII:C, nichttranslatierter 3'-DNA des menschlichen Gewebsplasminogen-Aktivators und nichttranslatierter 3'-DNA des SV40 t-Antigens ausgewählt ist, umfaßt.

15. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die eukaryotische transformierte Wirtszelle eine Säugerzelle ist.

16. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das erste Polynucleotid und das zweite Polynucleotid sich auf separaten Expressionsplasmiden befinden.

17. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß das erste Polynucleotid und das zweite Polynucleotid sich auf getrennten Expressionsplasmiden befinden.

18. DNA-Zusammensetzung zur Transformation einer eukaryotischen Wirtszelle, um die Expression eines rekombinanten Proteinkomplexes mit menschlicher Faktor VIII:C-Aktivität zu erhalten, dadurch gekennzeichnet, daß die DNA- Zusammensetzung eine

erste Expressionskassette, die ein erstes Polynucleotid, das eine erste Signalsequenz, die die Sekretion eines ersten Polypeptids steuern kann, umfaßt, umfassend eine erste Region mit einer der A-Domäne des menschlichen Faktors VIII:C homologen Aminosäuresequenz; und

eine zweite Expressionskassette, die ein zweites Polynucleotid, das die Signalsequenz von menschlichem α 1-Antitrypsin mit der Fähigkeit die Sekretion zu steuern codiert, und ein zweites Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz, die der Aminosäuresequenz der Aminosäuren 1649-2332 des menschlichen Faktors VIII:C homolog ist, umfaßt,

umfaßt.

19. DNA-Zusammensetzung nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, daß das erste Polynucleotid weiterhin

eine zweite Region, die die N-terminale Sequenz der B- Domäne des menschlichen Faktors VIII:C umfaßt, die die Aminosäuresequenz Ser-Phe-Ser-Gln-Asn-Ser-Arg-His-Pro-Ser-Thr- Arg-Gln-Lys-Gln-Phe-Asn-Ala oder eine Sequenz, die sich davon nur um nicht mehr als 10 Zahlen-% unterscheidet, umfaßt;

einen Polypeptid-Spacer mit etwa 3 bis 40 Aminosäuren, der weniger als 5 N-verknüpfte Glykosilierungsstellen besitzt;

und die C-terminale Signalsequenz der B-Domäne des menschlichen Faktors VIII:C, die die Aminosäuresequenz Pro-Val-Leu- Lys-Arg-His-Gln-Arg oder eine Sequenz, die sich davon nur um nicht mehr als 10 Zahlen-% unterscheidet, umfaßt, umfaßt, wobei die zweite Region die B-Domäne des menschlichen Faktors VIII:C nicht in voller Länge umfaßt.

20. DNA-Zusammensetzung nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, daß die erste Polynucleotidkassette ein Polypeptid mit mindestens etwa 90% der Aminosäuresequenz der Aminosäuren 1-740 des menschlichen Faktors VIII:C codiert, und die zweite Polynucleotidkassette ein Polypeptid mit mindestens etwa 90% der Aminosäuresequenz der Aminosäuren 1649-2332 des menschlichen Faktors VIII:C codiert.

21. Säugerwirtszelle, enthaltend die DNA-Zusammensetzung nach Anspruch 18.

22. Säugerwirtszelle, enthaltend die DNA-Zusammensetzung nach Anspruch 19.

23. Polypeptid mit menschlicher Faktor VIII:C-Aktivität bei Kombination mit einem Polypeptid, das dem Mr 80 K-Protein des menschlichen Faktors VIII:C homolog ist, wobei das Polypeptid von N-terminal nach C-terminal umfaßt:

eine erste Region mit einer Aminosäuresequenz die der A- Domäne des menschlichen Faktors VIII:C homolog ist; und

eine zweite Region, umfassend die N-terminale Sequenz der B-Domäne des menschlichen Faktors VIII:C, umfassend die Aminosäuresequenz Ser-Phe-Ser-Gln-Asn-Ser-Arg-His-Pro-Ser- Thr-Arg-Gln-Lys-Gln-Phe-Asn-Ala oder eine Sequenz, die sich davon nur um nicht mehr als 10 Zahlen-% unterscheidet, einen Polypeptid-Spacer mit etwa 3-40 Aminosäuren mit weniger als 5 N-verknüpften Glykosilierungsstellen und die C-terminale Sequenz der B-Domäne des menschlichen Faktors VIII:C,

umfassend die Amnqsäuresequenz Pro-Val-Leu-Lys-Arg-His-Gln- Arg oder eine Sequenz, die sich davon nur um nicht mehr als 10 Zahlen-% unterscheidet, und wobei die zweite Region die B- Domäne des menschlichen Faktors VIII:C nicht in voller Länge umfaßt.

24. Polypeptid nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, daß nicht mehr als etwa 5 Zahlen-% der Aminosäuren der Aminosäuresequenz der ersten Region sich von der natürlich vorkommenden Aminosäuresequenz der Faktor VIII:C A-Domäne unterscheidet.

25. Polypeptid nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, daß die Aminosäuresequenz der ersten Region die gleiche ist wie die Aminosäuresequenz der Aminosäuren 1-759 des menschlichen Faktors VIII:C.

26. Polypeptid nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, daß die Aminosäuresequenz der N-terminalen Sequenz der B-Domäne des menschlichen Faktors VIII:C Ser-Phe- Ser-Gln-Asn-Ser-Arg-His-Pro-Ser-Thr-Arg-Gln-Lys-Gln-Phe-Asn- Ala-Thr umfaßt.

27. Polypeptid nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, daß die Aminosäuresequenz des Polypeptid- Spacers Pro-Pro-Thr-Pro-Pro-Thr umfaßt.

28. Polypeptid nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, daß die C-terminale Sequenz der B-Domäne Pro-Pro-Val-Leu-Lys-Arg-His-Gln-Arg umfaßt.