JPH05502025A

JPH05502025A - 第８：ｃ因子活性を有するタンパク質複合体およびその製法

Info

Publication number: JPH05502025A
Application number: JP3500068A
Authority: JP
Inventors: チャプマン，バーバラ; バーク，ラエ　リン; ラスムッセン，ミレラ　エスバン; ミッケルセン，ヤン　メーラー
Original assignee: ノボ　ノルディスク　アクティーゼルスカブ; カイロン　コーポレイション
Priority date: 1989-11-17
Filing date: 1990-11-15
Publication date: 1993-04-15
Anticipated expiration: 2014-03-08
Also published as: PL167083B1; CA2135744A1; EP0670332A2; JP2865861B2; KR927003812A; ES2112255T3; EP0500734A1; ATE163194T1; NO943949D0; HUT70457A; JPH11130800A; YU78194A; JPH0856656A; NZ236094A; NO921946D0; GR3026176T3; FI944903L; SK130194A3; DE69032043D1; PT95923B

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】３０、請求の範囲第２７項に記載のＤＮＡ組成物を含む宿主哺乳動物細胞。

３１、ヒト第■：Ｃ因子Ｍｒ８０にタンパク質と相同のボリを含み：ヒト第■：Ｃ因子のＡドメインと相同のアミノ酸配列を有する第一の領域、およびヒト第■：Ｃ因子のＢドメインのＮ末端配列、Ｎ結合グリコジル化部位５個以下を有する約３〜４０個のペプチドのポリペプチドスペーサー、およびヒト第■：Ｃ因子のＢドメインのＣ末端配列からなる第二の領域からなる前記ポリペプチド。

３２、前記第一の領域のアミノ酸配列のアミノ酸の約５％以下が第■：Ｃ因子Ａドメインの天然産生アミノ酸配列と異なる請求の範囲第３１項に記載のポリペプチド。

３３、第一のポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドのアミノ酸配列がヒト第■：Ｃ因子のアミノ酸１〜７５９のアミノ酸配列と同しである請求の範囲第３１項に記載のポリペプチド。

３４、ヒト第■；Ｃ因子のＢ鎖のＮ末端配列のアミノ酸がＳｅｒ−Ｐｈｅ−５ｅｒ−Ｇｉｎ−Ａｓｎ−５ｅｒ−Ａｒｇ−旧５−Ｐｒｏ−５ｅｒ−Ｔｈｒ−八ｒｇ −Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ｔｈｒからなる請求の範囲第３１項に記載のポリペプチド。

３５、ポリペプチドスペーサーのアミノ酸配列がＰｒｏ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒである請求の範囲第３１項に記載のポリペプチド。

３６６ＢドメインのＣ末端配列がＰｒｏ−Ｐｒｏ−シａｌ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｈ４ｓ−Ｇｌｎ−Ａｒｇである請求の範囲第３１項に記載のポリペプチド。

浄書（内容に変更なし）明　細　書第■：Ｃ因子活性を有するタンパク質複合体およびその製法技術分野本発明は第■：Ｃ因子活性を有するタンパク質複合体および適当なポリヌクレオチド構築物の発現による前記複合体の製法に関する。タンパク質複合体は古典的（Ａ型）血友病の治療に有効である。

発明の背景血友病ＡはＸ染色体関連の遺伝性疾患であり、男性１万人につき１〜２人が苦しんでいる。この疾患は第■：Ｃ因子の不足の不存在により起こされる。第■：Ｃ因子は非常に大きな塘タンパク質（天然Ｍｒ３３０に一３６０Ｋ）であり、非常に低濃度で血漿中に存在する。これは可溶性フィブリノーゲンを不溶性フィブリンに変え凝血を形成し傷付いた組織からの血液損失を妨げるタンパク質分解カスケードにおける必須要素である。血流において、これは第■：Ｒ囚子（“フォノ　ウィレブランド因子”）との非共有結合会合で見出され、安定化キャリヤータンパク質として作用する。第■：Ｃ因子はトロンビン、プラスミン、プロテアーゼＣおよび他のセリンプロテアーゼによる分解を非常に受けやすい。これは一般に、血漿または血漿生成物から、Ｍｒ９２におよびＭｒ８０に〜７７にの主要種類を含むＭｒ１６０に〜４０にの範囲の関連ポリペプチド系列として単離される。この複合体パターンは活性第■：Ｃ因子の構造の分析を非常に困難にしている。

第■：Ｃ因子および関連ポリペプチドは、エフ、ロンドブラット（Ｆ、Ｒｏｔｂｌａｔ）ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９８５）２４　：　４２９４〜４３００：ジイ、Ｘ、’７エアール（Ｇ、　Ａ、　Ｖｅｈａｒ）　ら、Ｎａｔｕｒｅ（１９８４）３１２＋３３７−３４２ニジエイ、ジエイ、トゥール（Ｊ、Ｊ、Ｔｏｏｌｅ）　ら、Ｎａ　ｔｕｒｅ（１９８４）３１２：３４２−３４７；およびエム、ニー、テユレット（Ｍ、Ａ、Ｔｒｕｅｔｔ）ら、ＤＮＡ　（１９８５）　４　：　３３３−３４９により記載されている。イー。

オル（Ｅ、０ｒｒ）ら、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　ｏｆ　Ｃｌｏｔｔｉｎｇ　Ｆａｃｔｏｒｓ。

ｐ、５４．５３２１は、第■：Ｃ因子の高度グリコジル化領域に対する“スペーサー”機能を報告した。配列は、ジェイ、ジェイ。

トウールら、前出：ダブリュ、アイ、ランド（Ｗ、　Ｉ、　Ｗｏｏｄ）　ら、Ｎａｔｕｒｅ（１９８４）３１２：３３０−３３６；およびエム、ニー、テユレノトら、前出により報告された。標準長さのタンパク質は１つの配列（１）の３回の繰り返しと二番目の配列（Ｉｌｆｆ）の２つの繰り返しを含む。第三の高度にグリコジル化された配列（ＩＩ）は、二番目と三番目の繰り返しＩの間に存在し、明らかにタンパク質分解を受けてＭｒ９２にとＭｒ８０にポリペプチドを形成する。最初の２つの繰り返しＩはＡドメインを形成し、三番目の繰返しＩと２つの繰り返し■はＣドメインを形成する。

配列■はＢドメインを形成する。したがって、標準長さのタンパク質は構造１＋　Ｉｚ　ＩＩ　Ｉ３　Ｉ［［１ｎ［ｚ　（Ａ　Ｂ−Ｃ）を有し、一方Ｍｒ９２におよびＭ　ｒ　８０　Ｋポリペプチド（ＡおよびＣ）はそれぞれ構造１．−１．およびＩ□−■１ｍｚを有する。シイ、フルヒャ−（Ｃ，Ｆｕｌｃｈｅｒ）ら、Ｊ、Ｃｌ１ｎＩｎｖｅｓｔ（１９８５）　７６　：　１１７４２４は、第■：Ｃ因子との抗体−エピトープデータに基づいて、Ｍｒ９２におよびＭｒ８０にポリペプチドの両方とも第■：Ｃ因子機能に対し必要であることを示唆している。

第■：Ｃ因子は血友病の治療のために濃縮された形で血液から歴史的に単離されてきた。しかしながらＨＩＶおよび他の血液生産性疾患の遺伝に関する心配により第■：Ｃ因子の代わりの供給を用意する活動が刺激されてきた。天然第■：Ｃ因子に伴なう遺伝的ウィルス性疾患について心配することなく第■：Ｃ因子活性を有する組成物を供給することができることは非常に興味深いことである。

標準長さの組換体ヒト第■：Ｃ因子が製造されてきたが、精製および特性決定することが困難であり、そしてタンパク質分解のために不安定である。臨床的用途のための標準長さの分子の有効な組換体生産はこの時点では不確かである。

アール、エル、プルツケ（Ｒ，Ｌ、Ｂｕｒｋｅ）ら、Ｊ、Ｂｉｏｌｃｈｅｍ（１９８６）２６１　：１２５７４−７８は、Ｍｒ９２におよびＭｒ８０にポリペプチドをコードするポリヌクレオチドで同時に感染された細胞から活性第■：Ｃ因子複合体を発現することを記載している。得られたタンパク質は同し条件下で発現したクローン化した標準長さの第■：Ｃ因子のものと同じ活性を示した。オーノルドファング（０，Ｎｏｒｄｆａｎｇ）　ら、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅ＋＊（１９８Ｂ）２６３：１１１５−１８はＭｒ９２にタンパク質およびＭｒ８０にタンパクｔ（それぞれＦ■−ＨＣおよび−ＬＣ）の別々の製剤からの活性■：Ｃ因子複合体のインビトロアシセンブリ−を記載した。成功したアッセンブリーは二価金属イオン（特にＭｎおよびＣａ）およびチオールを必要とするが、しかしわずかに少量のＦ■−ＨＣが活性なＦ■：Ｃへ複合化されうるだけであった。

発明の開示ここにおいて我々は高い安定性と第■：Ｃ因子活性を有する組換体タンパク質複合体を発現する向上した方法を発明した。Ｍｒ９２にポリペプチド（Ｆ■−ＨＣ）およびＭｒ８０にポリペプチド（Ｆ■−ＬＣ）が同じ宿主細胞中にて別々のプロモーターの調節下に２つの別々のポリペプチドとして発現される。各ポリペプチドは、シグナル配列の分解を伴なって細胞外へ空間への輸送を指図するシグナル配列を用いて発現されるのが好ましい。本発明の第一の見地によれば、Ｆ■− ＨＣはＣ末端延長部を有する融合タンパク質として発現されうる。延長部はＢドメインＮ末端配列（これはトロンビンによる分解を許す）と相同のポリペプチド配列、アミノ酸３〜１００個のポリペプチドスペーサーおよびＣ末端Ｂドメイン配列と相同の配列からなる。Ｆ■−ＨＣのＣ末端延長の結果、真核生物宿主細胞における発現時に活性ポリペプチドが高い収率となる。本発明の第二の見地において、Ｆ■−ＨＣは、いかなるＣ末端延長部を有することなく正しいＣ末端を有する真正な形で発現され、この場合さらに分解する危険性を含む後のトロンビン分解を避ける。Ｆ■−ＬＣはシグナルペプチドを用いてＬＣポリペプチドとして発現されるのが好ましい。Ｆ■−ＬＣポリペプチドはプロセッシングされ正しいＮ末端アミノ酸残基および正しいグリコジル化を有して効率的に分泌される。適当な宿主細胞中でＦ■−ＨＣおよびＦ■−ＬＣをコードするポリヌクレオチドで同時トランスフェクションすると第■：Ｃ因子活性を有する組換体タンパク質複合体が高収率が得られる。

ここで使用される用語ポリヌクレオチドとは、−末鎖もしくは二本鎖（ＳＳもしくはｄｓ）でもよいＤＮＡもしくはＲＮＡの配列またはＤＮＡ−ＲＮＡヘテロ二重鎖に関するものである。

ここで使用される用語「シグナルペプチド」とは、ポリペプチド発現の間にシグナルペプチダーゼにより認識されそして作用されるペプチド配列に関するものである。シグナルペプチドはシグナルペプチダーゼ分解に対するペプチド部位をコードし、そして接続するポリペプチドを細胞外の基質へ導びく分泌経路へ輸送させる。

用語「Ａドメイン」は、Ｍｒ９２にタンパク質サブユニ・ントを構成するヒト第 ■：Ｃ因子の当該部分に関する。Ａドメインは約７４０〜７６０１個のアミノ酸を含み、天然ヒト第■：Ｃ因子のＮ末端に見出される。Ａドメインポリペプチドはアミノ酸１０個通常はアミノ酸１個から少なくともアミノ酸約６２０個通常は少なくともアミノ酸約６７５個さらに通常は少な（ともアミノ酸約７４０個まで延長するであろう。ポリペプチドはＡドメインの少なくとも約８５％（ウッドら、前出）、さらに通常は少なくとも約９０％、好ましくは約１００％を含み、そして場合によりＢドメインのＮ末端の一部を含んでもよく、一般にはアミノ酸約１４０５を越えない。特に興味があるのは、Ａｒｇ７４０−３ｅｒ７４１に血栓崩壊分解部位に対する完全配列を有するＮ末端鎖である。

用語「Ｂドメイン」は、細胞内分解により一般に除去されそしてたとえばＣＯ３７およびＣＨＯのような哺乳動物細胞中で発現された場合直皮にグリコジル化される天然ヒト第■：Ｃ因子の当該部分に関する。ＢドメインはトロンビンによるＢドメインからＡドメインの分解を許すＮ末端配列を含む。

Ｂドメインはまた哺乳動物細胞のゴルジ装置に位置する酵素によりＡ−Ｂ前駆体からＣドメインを分解させるＣ末端プロセッシング部位を有する。Ｎ末端およびＣ末端配列の配列は以下の実施例において説明される。「Ｂドメインのほとんどのタンパク質」が欠ける本発明の複合体は、Ｎ末端およびＣ末端を除いてＢドメインのほとんどすべてを欠いている。

用語「Ｃドメイン」は標準長さのタンパク質のＣ末端を構成し細胞内部で分解して第■：Ｃ因子のし鎖を形成する天然ヒト第■：Ｃ因子の当該タンパク質に関する。Ｉ、鎖は第■：Ｃ因子ポリペプチドのＣ末端のアミノ酸配列とほとんど同し、一般的には第■：Ｃ因子Ｍｒ８０ＫｔＪｆの少なくとも約８０％さらに一般的には少なくとも約９０％のアミノ酸配列を存し、特にアミノ酸１５７０、一般的にはアミノ酸１６００．＃にアミノ酸ｌ６２５、より特にアミノ酸１６４０、好ましくは約アミノ酸１６４９、±１０アミノ酸より特に士アミノ酸で開始し少なくとも約アミノ酸２３００、一般的には２３１０、±１０アミノ酸、好ましくは２３２５、±５アミノ酸、より好ましくは末端アミノ酸（２３３２）で開始するものである。

一般的には、Ｌ鎖はＣｌ−Ｃ２ドメイン、好ましくはＡ３−Ｃｌ−Ｃ２ドメインの少なくとも約８５％、さらに一般的には少なくとも９５％を有するであろう。

ここで使用される用語「同時−発現」は、同じ宿主細胞中におけるＡドメインポリペプチドとＣドメインポリペプチドの同時発現に関する。ＡおよびＣドメインをコードするポリヌクレオチド配列は同一または異なった発現カセットまたはプラスミド上にある。ＡおよびＣドメインの同時発現は正しい折りたたみを生じることになり、その結果より高い活性と分泌効率を有するＡ−Ｃ複合体を提供する。

ここで使用する用語「細胞増殖培地」とは、宿主細胞を培養するのに適するいずれかの培地に関するものであり、実際に細胞「増殖」を生ずるか否かにかかわらず組換体生成物の発現を得るために通する培地を含む。細胞増殖培地は一般に水溶液中に栄養素および代謝可能なエネルギー源を含む。所望により、細胞増殖培地はまた本発明の組換体ポリペプチドの発現を引き起す化合物をも含む。このような誘因化合物の選択は発現を調節するために選択されたプロモーターにしたがう。他の代表的添加物は選択化合物（すなわち、形質転換された宿主細胞だけが培地中で生き残ることを確実にするために培地へ添加される薬品または他の化学品）および血清たとえばウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含む。「血清不含有培地」は、血清中に存在する必須の微量因子を血清の形で添加される必要のない程度まで供給された溶液である。市販されているものから入手可能な多くの適当な細胞増殖培地がある。

用語「ポリペプチドスペーサー」はアミノ酸約３〜約１゜Ｏのポリペプチド配列に関し、これはヒト第■：Ｃ因子Ｂドメインと一般には相同でな（、そしてＮ− 結合グリコシル化の滞在的部位を５個より少なく有するものである。好ましくはこのような部位が２個以下である。現在、Ｂドメインのグリコジル化の大きな寸法および高程度がＭｒ９２にポリペプチドの効果的発現を妨害すると信しられている。また、ＡドメインはＢドメインの不存在下で一定の塩基に正しく折り込まれずこのためＡドメインのわずかなパーセントだけが正しく折り込まれそして発現されるとも信じられている。

本発明の第一の見地によるポリペプチドスペーサーはＡドメインに対しＣ末端延長部を提供し、明らかにポリペプチドを安定化しそして活性形での分泌を向上する。すなわち、軽くグリコジル化された（または全くされない）ポリペプチドを使用することで標準長さの第■：Ｃ因子の発現を遮る同しサイズ問題にＡドメイン−スペーサー構築物が遭遇することを妨げるであろう。現時点で好ましいスペーサーは、ヒト■ｇＨ鎖ヒンジ特にヒトｒｇＡ１から由来するものである。このスペーサーは免疫原性エピトープを添加することなく　（ヒトに投与した場合）、フレキシブルな延長部をもたらす。本発明の第二の見地によれば、Ｂドメインが完全に除かれたＭｒ９２にポリペプチドをＭｒ８０に鎖と一緒に同時発現した場合非常に高くそして有効な凝固活性が得られうる。

ここで使用されうる用語“相同パとは２つのポリヌクレオ千ドまたは２つのポリペプチドの間が同一であるかまたはほとんど相似であることを意味する。一般的には、鎖における通常１０％以下、さらに通常５％以下、好ましくは約１％以下のアミノ酸数が第■：Ｃ因子ＡおよびＣドメインに天然に存在するアミノ酸と異なる。特に、約５％以下、さらに通常約１％以下が非伝統的置換基である。伝統的置換基には次のようなものが含まれる：Ｇｌｙ　＋１Ａｌａ；　Ｌｙｓ　−Ａｒｇ；Ｖａｌ−工１ｅ　＝　Ｌａｕ；　Ａｓｎ　”　Ｇｌｎ；　ａｎｄＡｓｐ　−Ｇｌｕ；　Ｐｈｅ　−Ｔｒｐ　−Ｔｙｒ。

非伝統的変化は、前記アミノ酸の１つを異なった基からのアミノ酸で置換すること（たとえばＧｌｕに対しＡｓｎを置換すること）または前記アミノ酸のいずれかに対しＣｙｓ。

Ｍｅｔ、ＨｉｓまたばＰｒｏを置換することである。

本発明タンパク質複合体の用語「十分量」とは、天然ヒト第■：Ｃ因子で治療可能な疾患を有する患者の治療に効果を及ぼずことのできるタンパク質の量に関する。一般に、本発明のタンパク質複合体は天然ヒト第■：Ｃ因子とほぼ同し活性であり、そして同様の量で投与されうる。本発明タンパク質複合体の比活性は以下に記載のように当該技術で公知の手段により（たとえば市販されているコアテスト分析（Ｃｏａ　ｔｅｓ　ｔａｓｓａｙ）を用いて）測定される。

用語「有効濃度」とは、適当な形質転換条件下で宿主細胞を形質転換しうる発現力セントの濃度に関する。

ＤＮＡ構築物は一般に本発明ポリペプチドの発現に使用されうる。ポリヌクレオチド構築物の各々は転写の５’　−３’一方向に、転写開始および翻訳開始領域、シグナルペプチド配列をコードする配列からなる領域をコードする構造遺伝子および第■：Ｃ因子ＨまたはＬ鎖をコードする配列と、それに続く翻訳および転写終結配列を有する。たとえばこれらの特定要素の選択は当該技術の知識の範囲内である。

開始領域は転写および翻訳の開始に関連する多数の異なった配列からなる。これらの配列はエンハンサ−配列、ＲＮＡポリメラーゼ結合部位、ＲＮＡキャッピング部位、リポソーム結合および翻訳開始部位等を含む。転写開始領域は第■：Ｃ因子と結合する天然領域であるか、またはより高度の転写効率を提供する代わりの配列である。配列は哺乳類ウィルスまたは宿主細胞の遺伝子もしくは異なった哺乳動物宿主からの遺伝子から得られ、これらは宿主細胞中で活性である。多数の転写開始領域が単離され哺乳動物宿主細胞中で操作可能であることを示す。これらの領域には、ＳＶ４０初期プロモーターおよび後期プロモーター領域、アデノウィルス主要後期プロモーター領域、アクチンプロモーター領域、サイトメガコウィルスＭｒ７２に即時型初期タンパク質プロモーター領域、メタロチオネインプロモーター等が含まれる。

終結領域には３′−非翻訳配列、ポリアデニル化シグナル配列等が含まれる。終結領域は第■二Ｃ因子天然ｃＤＮＡの３′非翻訳配列から得られるか、または５ ′−開始領域を得た同じ構造遺伝子または異なった構造遺伝子から得られうる。

３′−領域は開始領域のように転写レベルに対し必須であるというわけではなく、このためその選択は特定の選択より便利さの問題である。

構造遺伝子には代表的にはプロセッシングおよび成熟のために小胞体の内腔ヘポリペプチドを同かわせるシグナルペプチドをコードするリーダー配列が含まれる。場合によりエンドペプチダーゼにより翻訳後プロセッシングされるプロペプチドをコードする追加の配列が含まれてもよく、ここでエンドペプチダーゼはペプチド結合を分解し、プロペプチドを除去して成熟ポリペプチドを生ずる。シグナルペプチドは天然産生のものでよく、Ｎ末端ペプチドに対しては特にそうであり、またはポリペプチドのプロセッシングおよび成熟をもたらすいずれのシグナルペプチドでもよい。

様々なシグナルペプチドが文献に報告されており、たとえば組織プラスミノーゲンアクチベーター、免疫グロブリンＨ鎖およびＬ鎖、ウィルス膜糖タンパク質たとえば単純ヘルペスウィルス糖タンパクｔｇＢおよびｇＤ、α１−抗トリプシン等が含まれる。α１−抗トリプシンシグナルペプチドは、正しいＮ末端を有するペプチドの高いレベルの発現のためにＦ■−ＬＣポリペプチドの分泌に現在のところ必要である。

成熟タンパク質およびシグナルペプチドをコードするＤＮＡ配列はリーディングフレームにあるように結合されなければならない。使いやすい制限部位が利用できる場合、付着末端またはプラントエンドを正しく結合してもよい。しかしながら、はとんどはアダプターを使用してここでコード配列の一部を合成アダプター中に再形成し截断構造遺伝子および／または截断シグナル配列をアダプターを介して結合し、これにより正しいリーディングフレームにあるようにする。シグナル配列および構造遺伝子の部分的制限地図を作り、制限部位特に独特の制限部位を同定してもよく、これを用いて適当なアダプターにより正しいリーディングフレームに２つの配列を一緒に連結する。これに代わり、独特の制雇部位をシグナル配列と成熟ポリペプチドコード配列の接合部にインビトロ突然変異誘発により挿入してもよい。

翻訳開始および停止シグナルは、翻訳開始のための開始コドンおよび翻訳終結のための１つ以上の停止コドンを備える構造遺伝子の一部であるのが普通である。

開始コドンはシグナル配列の第一のコドンであろう。停止コドンは終結領域の一部として適当に加えられるかまたは完全な終結領域を準備するための転写終結領域へ連結するための都合の良い３′末端を提供するためにコード領域へ加えられる。

様々な発現力セント、（転写および翻訳開始領域核酸配列、ポリペプチドの１つをコードする構造遺伝子核酸配列および開始領域の転写および翻訳対照物、およびｍＲＮＡを翻訳終結のプロセッシングを調節する転写および翻訳終結領域）は特定のヌクレオチド配列を同定するが、これを常法により結合してもよい。通常、得られた配列は制限部位を含むかまたは成分部位を含むように修飾され、次いで相補的オーバーハングまたは付着末端が存在する場所でアニールする。修飾はしばしば所望の付着末端を提供するためのリンカ−の導入により非コード領域にある。宿主細胞が必要な結合をもたらすとはいえ、宿主細胞導入前に末端を結合するのが一般的である。

発現カセットを特定の目的で様々な他の配列と連結してもよい。分泌される環タンパク質の量の増幅が所望の場合、Ｆ■：Ｃの発現力セントを適当な処置により遺伝子のコピー数の自然増加が選択される遺伝子に連結される。このような遺伝子にはヒトメタロチオネイン遺伝子およびマウスジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子が含まれる。これらの遺伝子はこれら自体の転写および翻訳調節配列を有するカセントに置かれる。重金属イオンＣたとえばカドミウム）またはメトトレキセートの濃度増加に耐性の細胞クローンを選択することにより、興味ある遺伝子（発現力セント）が宿主細胞中で同時増殖する。

対象となる発現カ七ソトは宿主細胞において機能する複製システムからなるベクターの一部であり、この複製システムは宿主細胞への発現カセットの安定なエピソーム維持または取込みをもたらす。ベクターは、ＤＮＡ構築物およびベクターを欠失するこれらの宿主細胞からＤＮＡ構築物およびベクターを含む哺乳動物宿主細胞を選択するための選択マーカーからなる。

広い範囲の複製システムが利用可能であり一般には哺乳動物宿主細胞に感染するウィルスから由来するものである。代表的複製システムにはサルウィルス（Ｓｉｍｉａｎ　ｖｉｒｕｓ）４０　、アデノウィルス、ウシ乳頭ウィルス、ポリオーマウィルス、エプスタインバールウィルス等からの複製システムが含まれる。

原核細胞宿主細胞におけるベクターの増殖を可能にする選択マーカーは、生物致死剤特に抗生物質に対する耐性、または原栄養株宿主を提供するための栄養要求変異株の相補性を含む。マーカーとして興味深い特定遺伝子はカナマイシン耐性遺伝子（ＮＰＴＩＩ）、クロラムフェニコール耐性遺伝子（ＣＡＴ）　、ベニシリナーゼ（β−ラクタマーゼ）等を含む。

ベクターは通常環状であり、ベクターへの発現カセットの段階的または完全な物としての挿入を許す１つ以上の制限部位を有する。しばしば、ベクターは細菌性複製および選択システムを含み、これはそれぞれの手作業工程の後でのクローニングを考慮している。この方法では、各段階における比較的多量の構築物を調製し、単離し、精製し、正しい結合が起こっていることを証明するために試験し、そして次工程に使用する。

調節配列および複製システムが機能する様々な哺乳動物宿主細胞を使用することができる。このような細胞にはＣＯ３７細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、マウス腎細胞、ハムスター腎細胞、ＨｅＬａ細胞ＨｅｐＧ２細胞等が含まれる。

所望ポリペプチドの発現カセットは１つの核酸鎖に一緒に連結するかまたは別々の核酸分子に準備される。発現カセ、ットは異なったベクターの一部または同じベクターの一部でよい。特定のベクターの状況において構築のいずれの方法も好ましいとはいえ、主には便宜性の点である。

発現ベクターは複製欠失レトロウィルスでもよい。ニス。

エフ　、：Ｌ　−（Ｓ、Ｆ、ＹＬＩ）　ら、Ｐｒｏｃ　Ｎａｔ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ（１９８６）８３：３１９４−９８には自己不活性（“ＳＩＮ”）レトロウィルス遺伝子トランスファーベクターの構築について記載されている。

ＳＩＮヘクターは３’　ＬＴＲの０３　ｉＪＩ域からのプロモーターおよびエンハンサ−配列を欠失することにより作られる。５′ＬＴＲにおける官能性Ｕ３領域は適当にパッケージした細胞系における組換体ウィルス性ゲノムの発現を許す。しかしながら、そのゲノムＲＮＡの発現およびｃＤＮＡへの逆転写時に、本来のプロウィルスの５’　ＬＴＲのＵ　３６Ｎ域が欠失しそして３’　ＬＴＲのＵ　３９Ｍ域が置換される。したがって、ＳＩＮベクターが組込むと、非官能性３ ’ＬＴＲＵ３？ｉＮ域が官能性５’ＬＴＲＵ３領域に代わり、そしてウィルスが標準長さのゲノム転写物を発現できなくなる。

発現力セントを常法により宿主細胞へ導入する。ＤＥＡＥ−デキストランの存在下にリン酸カルシウム沈でんＤＮＡまたはＤＮＡを形質転換に使用するのが好ましい。ポリヌクレオチドトランスフエクシゴンに特に有用な合成脂質はＮ−（１ −（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル）−Ｎ、Ｎ。

Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド′であり、これは名称リポフエクチン（Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ）登録商標（ＢＲＬ、ガイサースブルグ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ）、ＭＤ）として市販されており、ビイ、エル。

フェルガナー（Ｐ、Ｌ、Ｆｅｌｇｎｅｒ）ら、Ｐｒｏｃ　Ｎａｔ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ（１９８７）８４　：　７４１３により記載されている。ウィルスが関連する場合、トランスフエクシゴンまたは形質導入を使用してもよい。宿主細胞を形質転換する特定の方法は本発明にとって重要ではなく、はとんど発現カセットが複製システムに結合するかどうかおよび複製システムならびに関連する遺伝子の性質による。

形質転換／トランスフェクシゴン細胞を適当な普通培地で増殖する。２つのＦ■ ：Ｃ１Ｊｉの複合体として生成物が得られ、培地または細胞溶解物を単離し、第 ■：Ｃ因子活性複合体を抽出し精製する。抽出および精製のために様々な手段が利用でき、たとえばアフィニティクロマトグラフィ、イオン交換クロマトグラフィ、疎水クロマトグラフィ、電気泳動、溶媒−溶媒抽出、選択的沈降、等である。生成物を単離する特定の方法は本発明で特に重要というわけではなく、変性および不活化を最小限にし高純度活性生成物の単離を最大にするために選択される。

組成物は、Ｃｏａｔｅｓｔ法における組成物が活動産生なくとも０．０２Ｕ／ｄ、通常は少なくとも約０．２、さらに通常少なくとも約０．５Ｕ／ｄの活動度を有するように＄備される。

問題となる生成物は、抗体特にＦ■−ＬＣに対するモノクローナル抗体を用いたアフィニティクロマトグラフィ、電気泳動、抽出、ＨＰＬＣ等により精製されうる。

問題となる方法は第■：Ｃ因子活性を有するＨ鎖およびＬ鎖の複合体の製造を提供する。実験の章で記載したように状態調節した培地により製造が明らかになり、これはＣｏａｔｅｓｔ分析において第■：Ｃ因子活性少なくとも約５０、通常は約７０ｍＵ／ｍ、さらに通常約３００ｍ１Ｊ／−を有する。

本発明により作られる第■：Ｃ因子活性の複合体は、抗体製造のための免疫原として、アフィニティクロマトグラフィによるフォンウィレブランド因子の単離のため、第■二ｃ因子に対する診断分析のため、および血友病患者その他の血液凝固疾患を有する患者の治療に対する様々な用途を有する。

問題となるタンパク質複合体を、生理学的に許容されうる担体たとえば水、食塩水、リン酸緩衝化食塩水、およびクエン酸緩衝化食塩水中で、約１０〜２００Ｕ／ｄの濃度範囲にて投与することができる。投与方法および量については米国特許第３６３１０１．８号；第３６５２５３０号および第４０６９２１６号を参照せよ。他の通常の添加剤もまた含まれる。

以下に示す例は当該技術において通常の知識のある者に対するさらに進んだ室内を提供するものであり、いずれにしても本発明を制限するものではない。

実施例以下に示す例は当該技術において普通の知識を有する実施者に対する案内として１！備されたもので、いかなる方法でも本発明を制限するように構成されるものではない。

例１（発現プラスミドの調製）（Ａ）ＰＳＶ７ｄ発現カセットを哺乳動物細胞発現ベクターｐｓＶ７ｄ　（２４２３ｂｐ）を用いて調製した。

プラスミドｐＳＶ７ｄ　（トウレフトら、前出）を以下のように構築した。ＳＶ４０オリジンまたは複製物および初期プロモーターを含む４００ｂｐ　ＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩ［［７ラグ／ンｌ−ｔ−ｐｓＶｇｔ　Ｔ　（ボールヘルグ、カリフォルニア、スタッフォードユニバーシティから入手）から切り取りそして精製した。ＳＶ４０ポリＡ添加部位を含む２４０ｂｐ　ＳＶ４０　Ｂｃｆｆｉｌ／ＢａｍＨＩフラグメントをｐｓＶ／ＤＨＦＲ（スブラ７　二（Ｓｕｂｒａｍａｎｉ）ら、Ｍｏ１ｅｃ　ａｎｄ　Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏ１０９８１）１　：　８５４−８６４）から切り取り精製した。以下のリンカ−を介してフラグメントを融合した：このリンカ−はすべての３つのリーディングフレームにおいて５つの制限部位とならびに停止コドンを含む。得られた複製のＳＶ４０オリジン、ＳＶ４０初期プロモーター、停止コドンを有するポリリンカーおよびＳＶ４０ポリアデニル化部位を含む６７０ｂｐフラグメントをｐＭＬ、約１．５Ｋｂ欠失を有するｐＢＲ３２２誘導体（ラスキー（Ｌｕｓｋｙ）およびボ・ノチャン（Ｂｏｔｃｈａｎ）、Ｃｅ１ｌ（１９８４）３６　：　３９１）のＢａｍＨ１部位へクローン化してｐｓＶ６を得た。ＰＳＶ６のｐＭＬ配列におけるＥｃｏＲＩおよびＥｃｏＲＶ部位をＥｃ　ｏＲＩおよびＥｃｏＲＶで消化することにより排除し、Ｂａ１３１ヌクレアーゼで処理して各末端において約２００ｂｐを除去し、最後に再連結するとｐＳＶ７ａが得られる。Ｂａｆ３１再切断部はまた、ＥｃｏＲＶ部位からほぼ２００ｂｐｉｉｌｆれているＳ　Ｖ　４０　ｅＪｆ域を側面に有する１つのＢ　ａ　ｍ　ＨＩ制限部位を削除した。第二のＳ　Ｖ　４０　？ｉＩ域を側面に有するＢａｍ８１部位を削除するために、ｐＳＶ７ａをＮｒｕＩで消化し、これを複製の起点から上流のｐＭＬ配列においてカットする。これをプラントエンド連結により再度環化してｐＳＶ７ｂが得られた。

ｐＳＶ７ｃおよびｐｓＶ７ｄは連続したポリリンカー置換を表わす。第一に、ｐｓＶ７ｂを５ｔｕｌおよびＸｂａｌで消化した。次いで、以下のリンカ−をベクターへ連結してｐＳＶ７ｃを得た：その後、ｐｓＶ７ｃをＢｇｊ２１１およびＸｂａＩで消化し、次いで以下のリンカ−と連結してｐｓＶ７ｄを得た：（Ｂ）ｐｓＶＦ８−９２ｐｓＶＦ８−９２はＭｒ９２Ｋ　Ｆ■−ＨＣｌ（に対する発現プラスミドである。ポリリンカーｐｓＶ７ｄにおけるＢａｍＨ１部位から出発して、ｐＳＶＦ８− ９２は、第■：Ｃ因子ｃＤＮＡのヌクレオチド−３０〜＋１４をコードするＢａｍＨＩから５ａｃｌまでの４９ｂｐ合成リンカーーアダプター分子（翻訳開始部位の最初のＡから数える；配列を以下の（Ｄ）に示す）、以下に記載するＰＳＶＦ８−２００に含まれる第■：Ｃ因子ＤＮＡからのＨｉｎｄＩＩ［フラグメントまでの２２６７ｂｐ　５ａｃＩ（ヌクレオチド＋２２８１まで）およびＨｉｎｄＩ［［からＢａｍＨＩまでのｐＳＶ７ｄからなる。

（Ｃ）ｐＳＶＦ８−８０ｐＳＶＦ８−８０はＭｒ８０Ｋ　Ｆ■−ＬＣ鎖に対する発現プラスミドである。

ポリリンカーｐ　ＳＶ７　ｄにおける５ａＡ１部位から出発して、ｐｓＶＦ８− ８０は、ヌクレオチド−９８〜±１０３（出発コドンと比較して）であってＢｇｆｆｉ■部位で終結する組織プラスミノーゲンアクチベーターｃＤＮＡの２０１ｂｐフラグメント（ｔ　ＰＡ配列はニス、ジエイ。

エフ、デギ＋　７　（Ｓ、Ｊ、Ｆ、Ｄｅｇａｎ）ら、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ　（１９８６）２１５１：６９７２−６９８５）に記載されている）と、インビトロ突然変異誘発（ヅラー（Ｚｏｌｌｅｒ）およびスミス（Ｓｍｉｔｈ）、Ｍｅｔｈ　Ｅｎｚｙｑｌ（１９８３）　１００：４６８）　（ｐＦ８ＧＭ７）を介した第■：Ｃ因子ｃＤＮＡのヌクレオチド５０２８に作り出されたＢｃｌ　ｒ部位からヌクレオチド７４９２にある３′非翻訳領域におけるＢｃｊ２　ｒ部位にわたる第■：Ｃ因子の２４６４ｂｐ　Ｂｃｆｌフラグメントに連結した第■：Ｃ因子のヌクレオチド＋５００２〜＋５０３１をコードする２９ｂｐの合成りｃｆｆｉｌＩ−Ｂｃｆ［リンカ−アダプターと、およびｃＤＮＡクローニングから生ずるＢｇ２■部位から合成Ｐｓｔ１部位にわたるｔＰＡ３’非翻訳配列の４００ｂｐフラグメントと、それに続くベクターＭＬ３ｍｐ９（ヴイエイラ（Ｖｉｅｉｒａ）およびメリック（Ｍｅｓｓｉｎｇ）、Ｇｅｎｅ（１９８２）１９：２５９）からのポリリンカーと次いでｐｓｖ７．：ｔとからなる。

（Ｄ）ｐＳＶＦ８−２００ベクターｐＳＶＦ８−２００は標準長さの第■：Ｃ因子ｃＤＮＡに対する発現プラスミドである。プラスミドｐｓＶＦ８−２００　（）ウレットらに記載）は完全な第■：Ｃ因子ｃＤＮＡ］−Ｆと３′非翻訳配列をｐＳＶＦ８−９２について上記で記載したのと同じ５′非翻訳配列とともに含むものであり、以下のように調製した。

プラスミドＰＳＶ７ｄをＢａｍＨＩで消化してＳＶ４０初期プロモーターの下流のポリリンカー領域において切断した。

５′非翻訳領域の最後の３０ｂｐとヒト第■：Ｃ因子コード配列の最初の１５ｂｐをコードする以下の４９ｂｐＢ　ａｍＨｌ−５ａｃｌリンカ−アダプターを化学的に合成しｐＳＶ７ｄに連結した。

この連結されたプラスミドを次いで５ａｃＩで消化して過剰のリンカ−を除去しそして５ａｆＩで消化して５ａｃＩ突出部を作った。

フラグメント１、ヒト第■：Ｃ因子の５′コード領域を含むｐＦ８−１０２からの２．９ＫＳａｃｌフラグメントおよびフラグメント２、因子の３′コード領域を含むｐＦ８−６．５からの６．５ＫＳａｃＩ−３ａｆｆｌフラグメントおよびリンカ−アダプターを含むｐｓＶ７ｄ修飾ヘクターを一緒に連結した（トウレットら、前出参照）。この連結混合物を用いて大腸菌（Ｅ、ｃｏ　ｌ　１）ＨＢＩＯＩを形質転換し、アンピシリン耐性によりコロニーを選択した。

プローブとしてＢａｍＨｌ−３ａ　ｃ　Ｉ　５’アダプターまたは２．９ＫＳａｃＩフラグメントを用いてコロニーフィルターハイブリダイゼーションにより３００個の形質転換体をスクリーンした。両方のプローブで陽性のコロニーを制限マツピングにより分析した。プラスミドｐＳＶＦ８−２００はヒト第■：Ｃ因子遺伝子の完全コード領域およびＳＶ４０初期プロモーターに対し転写方向で正しく融合した５′非翻訳領域を含むものであるが、これが得られた。

（Ｅ）ＣＯ３７細胞のトランスフェクションおよび培養上記したプラスミドを、１４時間プラスミドＤＮＡ５０μｇ１５ｘＢｓ細胞を用いて、クロロキニンジホスフェートを用いた処理（ルスマン（Ｌｕｔｈ層ａｎ）およびマグヌ、７ソン（Ｍａｇｎｕｓｓｏｎ）、ＮｕｃＡｃｉｄ　Ｒｅｓ　（１９８３）１１：１２９５ −］、３０８）と合わせてリン酸カルシウム共沈法（ファンデルニブ（Ｖａｎ　ｄｅｒ　Ｅｂ）およびグラハム（Ｇｒａｈａｍ）　、Ｍｅｔｈ　Ｅｎｚｙｎ＋ｏｌ（１９８０）６５：８２８−３９）を用いてＣＯ５７細胞（グズマン（Ｇｕｚｍａｎ）　、Ｃｅ１ｌ（１９８１）２３：１７５）へトランスフェクションした。細胞もまたツムバイラツク（Ｓｏｎ＋ｐａｙｒａｃ）およびダンナ（Ｄａｎｎａ）、Ｐｒｏｃ　Ｎａｔ　Ａｃａｄ　５ｃｉＵＳＡ（１９８１）７８；７５７５ −７８のＤＥＡＥ−デキストラン法によりトランスフェクションした。

１０％ウシ胎児血清、１００　Ｕ／ｄペニシリン、１００μｇ／ｒｄストレプトマイシン、２９２μｇ／ｄグルタミンおよび１１０μｇ／戚ピルビン酸ナトリウムを供給した。ダルヘノコ変性イーグル培地にてＣＯ３７細胞を培養した。トランスフェクション後８８時間での血清含有培地の４８時間採集からサンプルを得た。

（Ｆ）分析トランスフェクション後一定間隔をおいて、培地を細胞から除き、アリコートを −７０“Ｃで貯蔵した。標準的凝結分析（ハープイスティ（Ｈａｒｄｉｓｔｙ）ら、Ｔｈｒｏｎ＋ｂ　ｅｔ　ＤｉａｔｈｅｓｉｓＨａｅｍｏｌｏｇ（１９６２）７２：２１５）において、サンプルを第■：Ｃ因子欠失血漿の延長された部分的トロンボプラスチン時間を減少しうる能力について試験した。外因的に供給された第■：Ｃ因子の濃度の線状関数として活性化第Ｘ因子（Ｘａ）の発生を測定するものであるより特異的コアテスト分析（ローゼン（Ｒｏｓｅｎ）　ら、Ｔｈｒｏｍｂ　ａｒｉｄ　ｈａｅｍｏｓｔａｓｉｓ（１９８５）５４：８１８−８２３）　を用いて凝結分析の結果を確かめた。免疫学的反応性第■：Ｃ因子タンパク質の培地における濃度を、Ｍｒ９２にポリペプチドを検出するために引き出された放射線免疫検定法（ＲＩＡ）およびＭｒ８０にポリペプチド（ノルドファング（Ｎｏｒｄｆａｎｇ）ら、Ｔｈｒｏｍｂ　ａｎｄ　Ｈａｅｔａｏｓｔａｓｉｓ（Ｌ９８５）５３：３４６）に対し特異的な酵素連結イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）により測定した。

第１表に示すように、Ｍｒ９２にポリペプチドまたはＭｒ８０にポリペプチド単独の発現は、個々のタンパク質の各々が状態調節された培地において高いレベルで存在したとしても何らの検出可能な活性を作らなかった。細胞をｐ　ＳＶＦ　８−９２およびｐＳＶＦ８−８０プラスミドで同時トランスフェクションした場合、培地は凝結活性約２０１１ＩＬＪ／ＩＲ１を含有していた。完全第■：Ｃ因子タンパク質をコードするプラスミドｐｓＶＦ８−２００でトランスフェクションした細胞により同じ相対レベルの凝結活性が分泌された。

ｐＳＶＦ８−９２およびｐｓＶＦ８−８０単独テトランスフエクシヨンしたものからの状態調節した培地を一緒に混合する（第１表に略記したように幾つかの異なった状態を用いる）と、何らの活性も測定されなかった。

これらの結果は、第四：Ｃ因子のアミノおよびカルボキシル末端ドメインの複合体が本来的凝結活性を保持し、内部ドメインは別々の鎖からの活性複合体の活性またはアッセンブリーのいずれに対しても必須ではないことを示している。

第１表：状態調節されたＣ０Ｓ７細胞培地における組喚体第■：Ｃ囚子活性の分析ａプラスミドは同じ細胞へ同時トランスフェクションされたｂプラスミドは別々の細胞へトランスフェクションされ、４８時間後に上清液を混合した様々な混合条件をテストし、たとえば１０ｍＭ　ＣａＣｊ！、の存在または不存在下に３７°Ｃｌ２Ｏ°Ｃまたは４°Ｃにて２時間までの様々な時間予備インキュベーションする等を行なった。この表における値は得られたデータの代表的なものである。

第１表において、凝結時間と活性を以下のようにして得た二指示されたプラスミドでトランスフェクションされたまたは偽物でトランスフェクションされたＣＯ３７細胞の増殖により状態調節された培地７５μ２のアリコートを、一段階分析により第四：Ｃ因子欠失血漿の延長された部分的トロンボプラスチン時間を減少する能力として分析した。簡単に言えば、プレートリン（Ｐｌａｔｅｌｉｎ）　（ジェネラル　ダイアグノスティクスＧｅｎｅｒａｌ　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）　７５ｍを３７°Ｃで３分間インキュベートし、続いて第四：Ｃ因子欠失血漿７５μｌ十試験サンプル７５μｌをさらに添加し３７°Ｃでさらに５分間インキュベーションした。予め温めた０、０２５Ｍ　ＣａＣｆ２のアリコート７５μｌを加え、凝結時間をベクトンーデイキンソンフィブロメーターで測定した。ＣＯ５７１ｆｉ胞培地中で希釈した通常のヒト血漿を標準物として使用した。活性１ ’ｍＵを第■：Ｃ因子タンパク質約１ｏｏｐｇに相当すると仮定する（ファイ　（Ｆａｙ）ら、Ｐｒｏｃ　Ｎａｔ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　［ＪＳＡ（１９８２）７９ニア２００）。

第１表において、Ｃｏａｔｅｓｔ分析（カビ（Ｋａｂｉ））を用いて第四：Ｃ因子の濃度の直線状関数として活性化第Ｘ因子（Ｘａ）の発生を測定した。第Ｘａ因子の濃度を、第Ｘａ因子に対する合成ペプチド基質からのクロモゲンバラニトロアニリンのタンパク質分解により測定する。５０ｍＭ　トリス−ＨＣｌ、ｐＨ７，３，０，２％ＢＳＡで希釈した普通のヒト血漿を標準物として使用した。

第１表におけるＲＩＡ分析のために、精製したイヌ第四：Ｃ因子阻害ＩｇＧを０．１　Ｍ炭酸すｌ−１，１ウム緩衝液ｐＨ９，８中３゜５μｇ／ｄの濃度で９６凹部ポリスチレンミクロタイタープレート上の各凹所へ塗布し、−晩３７°Ｃでインキュベーションした。プレートをＱ、ＩＭ　ＮａＣ１，０，０５％トウイーン登録商標２０で３回洗浄し、続いて両方とも０．０５　Ｍイミダプール、０．１Ｍ　Ｎａ（、ｊ２．１％ウシ胎児血清アルブミン、０．０５％トウイーン登録商標２０、ｐＨ１，３で希釈された試験培地サンプルおよびヨウ素化第四：Ｃ因子Ｍｒ９２にタンパク質の混合物でインキュベーションした。第■：Ｃ因子Ｍｒ９２にタンパク質を血漿から単離し、５ＤＳ−ＰＡＧＥおよび銀汚染法により推定されたように５０％以上が均質であった。室温で１６時間インキュベーション後、プレートを洗いそして個々の凹部における１２５■の量をガンマ計測器で測定した。凝結活性０．５単位／ｌａｇの比活性を有する中程度に精製された市販の第四：Ｃ因子製剤（第■因子、ノルディスク（ＮＯＲＤＩＳＫ））を標準物として使用した。この標準物をＷＨＯ第三国際第■：Ｃ因子標準物に対し基準化した。我々はこの中程度に精製した標準物をＭｒ９２ＫＲＩＡ活性／第■：Ｃ因子凝結活性比１を含むように定義した。

第１表のＥＬＩＳＡ分析のために、精製されたヒト第四：Ｃ因子−阻害ＩｇＧを０．１Ｍ炭酸ナトリウム、ｐＨ９，８中に濃度４．５μｇ／ｄで９６凹部ＰＶＣミクロタイター板の凹部へ塗布し、−晩３７°Ｃでインキュベートした。凹部を上述のように洗浄し、０．１　Ｍイミダゾール、０．１５Ｍ　ＮａＣｊ２．１％ＢＳＡ、０．０５％トウイーン２０、ｐＨ７，３で希釈されたヒト阻害ＩｇＧのペルオキシダーゼ抱合体Ｆ　（ａｂ’　）、フラグメントを添加して室温で１６時間最後にインキュベーションした。０−フェニレンジアミン溶液で色が発現した。普通のヒト血清を標準物として使用した。

観察された凝結活性が第四：Ｃ因子によるものであることを証明するために、第 ■：Ｃ因子に特異的な抗体による阻害に対する凝結の感受性を測定した。分析の前に、状態調節した培地のアリコートを、普通のヒト血清の希釈物の存在下にまたは第■：Ｃ因子に対する阻害抗体の高い力価を発現した血友病患者からの血清の希釈物の存在下に、３７°Ｃで２時間予備インキュベートした。第２表で示されるように、完全分子ならびにＭｒ９２に−８０に複合体の活性は阻害血清により特異的に減少した。Ｍｒ８０に種に結合する３つの異なった阻害モノクコ−ナル抗体を用いて同じ結果が得られた。阻害血清を用いて第■：Ｃ因子活性の阻害を以下のように研究した二指示されたＣＯ３７細胞状Ｂ調節化培地１６０ｕＪｌ ’を、ヒト第■：Ｃ因子阻害血清の１００倍希釈物２０μｉ！、（ヘセスダ力価１５００単位）またはプールした普通のヒト血清の同様希釈物または緩衝液単独（５０ｍＭイミダゾール、０．１　ＭＮａＣｌ、１００μｇ／ｍ　ＢＳＡ　ｐＨ７，３）を用いて３７°Ｃで２時間インキュベートした。次いでこれらのサンプルを上記で概略した残留凝結活性について分析した。

第２表：凝結阻害分析モノクローナル抗体を用いて阻害実験を以下のように繰り返した：状Ｂ調節した培地１００ｕｊ２を、ハイブリテッヒ（Ｈｙ−ｂｒｉｔｅｃｈ）からの抗−第■ ：Ｃ因子モノクローナル抗体の１μｇ／μ２溶液１ｏｕｌ　（ベセスダ力価　１４．０００単位）または緩衝液のいずれかを用いて３７°Ｃで２時間インキュベートし次いで上述のように分析した。結果を第３表に示す。

第３表　凝結阻害分析二本鎖複合体の存在をより明らかにするために、Ｍｒ８０にタンパク質に特異的なＭＡｂカラム上を通過させることにより活性種を部分的にＣＯ３７細胞培地から精製した。第４表に示すように、施こされた活性の約６５％がカラムにより保持されこの結合物質の５０％が活性形で溶出し最初の培地中５倍以上の濃度で溶出した。すなわち、Ｍｒ８０に種にだけ特異的な抗体を用いてアフィニティクロマトグラフィにより活性複合体を単離することができる。セファロースＣＬ４Ｂに結合した抗−８０にモノクローナル抗体（５６Ｉｇ（：、）ｃノルデュファング（Ｎｏｒｄｆａｎｇ）　ら、Ｔｈｒｏｎ＋ｂ　Ｈａｅｍｏｓｔａｓｉｓ（１９８５）５３：３４６）１００ｕ　ｇを、全活性度６．２ｍ［Ｊ　（ｐ　Ｓ　ＶＦ　８−９２およびｐＳＶＦ８−８０プラスミドで同時トランスフェクションしたＣＯ３７細胞から得られたＣｏａｔｅｓｔ分析により測定）を含む培地Ｌ　４　ｔｕｂで２０　’Ｃにて一晩インキュベートした。インキュヘーション後、スラリーをカラムへかけ、流出するフラクションを集めた。カラムを緩衝液Ａ（５０ｍＭイミダゾール、０．ＩＭ　ＮａＣｊ２．０．１％ナト’Ｊ　’ｙ　ムイ７　シュリン、０．２％ＮａＮ：＋　、ｐＨ７，３）３００μＡで洗浄し、次いで緩衝液Ｂ（２，５Ｍ　ＮａＣβ、５０％エチレングリコール、０．５Ｍイミダヅール、０．１　Ｍ　Ｃａ　Ｃｉ　ｚ　、０．１％ナトリウムインシュリン、０．２％ＮａＮ５　、ｐＨ７，３）３００μｆで７容出した。

第４表　Ｍｒ９２に−８０に凝結活性複合体の部分的精製ここで報告された結果より、９１８個のアミノ酸を含むかまたは完全なタンパク質の全体の約４０％を含むリンカ−（“Ｂ”）領域の発現は第■：Ｃ因子活性にとって必要ではないということがわかる。個々のＭｒ９２におよびＭｒ８０ＫＳＪｌ域の同時発現の結果、第■：Ｃ因子をコードする領域全体の発現から得られるものと匹敵する第■ ：Ｃ因子活性のレベルが得られる。これらのタンパク質はインビボで集まってカルシウム橋により結合された活性複合体を形成する。この集合体はＢ　’ｐＭ域の存在を必要とせずそしてトランスに発現した二本の鎖に対し有効に生ずる。

上記結果から、第■：Ｃ因子活性は各々がそれ自身のシグナル配列を有する独立して発現したＮ末端フラグメントおよびＣ末端フラグメントを直接作ることにより達成されうろことが明らかである。したがって、第■：Ｃ因子は、大きな前駆体をクローン化する必要がなくそして第■：Ｃ因子活性をコードする配列として使用されるので、より有効に得られうる。したがって、標準長さの第■：Ｃ因子タンパク質の適正な成熟に対する能力が欠けているかもしれない第■：Ｃ因子の発現に細胞を使用しうる。

例２ｐＳＶＦ８−９２構築物を用いたＣＯ３７細胞におけるＭｒ９２にタンパク質の発現は作られたＭｒ８０にタンパク質の量と比較して低かった。Ｍｒ９２にタンパク質は明らかにゴルジ経路中に保持されおよび／または分解され、有効にプロセンシングされまたは輸送されない。したがって、構築物をＭｒ９２にタンパク質のレベルを増加する試みで修飾した。

以下の型の修飾を行なった：第■：Ｃ因子遺伝子の５′非翻訳配列における変化；異種５′非翻訳およびリーダー配列の含有；および３′非翻訳配列における変化。これらの構築を以下に要約する。

（Ａ）５’−非翻訳領域修飾プラスミドｐｓＶＦ８〜９２Ｂ、このプラスミドはｐＳＶＦ　８．−９２　ノ、１体テアリ１．：：の中でｐＳＶＦＢ−９２の５’非非翻訳列の３０ｂｐをヒト第■：Ｃ因子ｃＤＮＡ（ヌクレオチド１〜１７１；トウレットらの第８図参照）の完全な５′非翻訳領域で置換し、Ｇ−Ｃ尾部を欠失（部位特異的突然変異誘発）し、そして３つの塩基が出発ＡＴＧ（＋１７２位、第８図、トウレットら、前出）において以下に示すように変化して、真核生物細胞における有効なメツセージ翻訳のためのコザソク（Ｋｏｚａｋ）の好ましい配列と一致する：第■：Ｃ因子：　ＧＴＣＡＴＧ　ＣＡＡコザック　コンセンサス　ＡＣＣＡＴＧ　Ｇこの変化はシグナルペプチドの二番目のアミノ酸をＧｉｎからＧｌｕへ変化させることである。

グラ：２．ミＦｐＳＶＦ８−９２Ｅ、　こ（ＤプラスミＦハｐ　Ｓ　Ｖ　７ｄ５ ’から第■：Ｃ因子配列の誘導されるポリリンカーを５ａｉｒ部位を除いて除去し、そして５′非翻訳領域におけるＡＴＧコドン（トウレットら、前出による４１位）をインビトロ突然変異誘発によりＡＴＴへ変えるｐＳＶＦＢ−９２Ｂの誘導体である。

（Ｂ）異種５′配列プラスミドｐｓＶＦ８−９２Ｇ、Ｈおよびｒの添加。これらのプラスミドはｐＳＶＦＢ−９２Ｂの誘導体であり、５′非翻訳領域ならびに天然第■：Ｃ因子シグナル配列をヒト組織プラスミノーゲンアクチヘータ−（ＬＰＡ）ｃＤＮＡからの類億領域で置換するものである。ｐｓＶＦ８−９２Ｇにおいて、ｔＰＡプレープロ領域の最初の３５個のアミノ酸（シグナルおよびブロー配列）を、Ｍ’ｒ　９２　Ｋタンパク質の最初のアミノ酸（アラニン）を置換したセリンを用いて第■：Ｃ因子Ｍｒ９２Ｋを成熟するために結合する。

ｐＳＶＦＢ−９２ＨにおいてｔＰＡプレ〜プロ領域の最初のアミノ酸３２個を結合して第■：Ｃ因子Ｍｒ９２にタンパク質を成熟する。ｐｓＶＦ８−９２　Ｉにおいて、ｔＰＡブレープロ領域の最初のアミノ酸２３個を結合して第■：Ｃ因子Ｍｒ９２にタンパク質を成熟する。ｔＰＡ配列はｐＳＶＦＢ−８０に記載されたものと同じである。

プラスミドｐＳＶＦ８−９２Ｊ、このプラスミドは、ｔｐＡ５’領域が単純ヘルペスウィルス（Ｈ３Ｖ−１）ｇＤ５’非翻訳配列７５ｂｐおよびＨ３Ｖ−１ｇＤシグナル配列７５ｂｐで置換されているｐＳＶＦＢ−９２Ｇの誘導体である。ｐＳＶＦＢ−９２ＪもまたＡｌａ−＊Ｓｅｔ置換が欠失している（アール、ジエイ、ワトソン（Ｒ，Ｊ、Ｗａｔｓｏｎ）ら、５ｃｉｅｎｃｅ（１９８２）２１８：３８１−３８４）。

（Ｃ）３’非翻訳領域変化プラスミドＰＳＶＦ８−９２Ｃ，このプラスミドは、Ｍｒ９２にコード領域がヒト第■：Ｃ因子ｃＤＮＡの翻訳ストップコドンおよび天然３′非翻訳配列に直接融合したｐｓＶＦ８−９２Ｂの変形である。

ブー７、Ｚ、ミｌ’ｐｓＶＦ８−９２Ｌ０このプラスミドは、ｐＳＶＦＢ−９２Ｃ（７）３’非非翻訳列をｐｓＶＦ８−８０（７）３’非上記各Ａ−Ｃのプラスミドの各々を、例１に記載のｐＳＶＦＢ−８０および例１　（Ｆ）に記載のような第■：Ｃ因子活性を試験するための培地とともにＣＯ３７細胞へトランスフェクションした。

最初に試験したｐＳＶＦＢ−９２Ｂは、ｐＳＶＦＢ−９２より２〜８倍良い活性レベルを示した。残りのプラスミドのうち、ｐｓＶＦ８−９２Ｅが最も良＜ｐｓＶＦ８−９２Ｂよりも１．６５倍良好であることが明らかであった。ｐＳＶＦＢ −９２Ｊおよび■もまたｐＳＶＦＢ−９２より実質的により高い発現レベルであり、ｐＳＶＦＢ−９２Ｅと近似している。

ｐＳＶＦＢ−９２Ｇの発現レベルはｐｓＶＦ８−９２とほぼ同じで、一方ｐＳＶＦ８−９２）（のそれはｐＳＶＦＢ−９２よりカナリ低カッタ。ｐｓｖＦｓ−９２ＣとｐＳＶＦＢ−９２Ｌの発現レベルはｐｓＶＦ８−９２Ｅのそれと等しいようである。

例３本例はＭｒ９２に鎖とＢドメインの部分からなるポリペプチドを作る構築物の調製について記載する。これらの誘導体は、より安定でありそして／またはＬ鎖との活性複合体を効率良く組立てるＨ鎖を発生させる目的で作られる。第■：Ｃ因子の血漿由来製剤中および標準長さの組換体第ｖｍ：ｃ因子を発現する細胞からの細胞溶解物および状Ｂ調節した培地中で観察された分子種を模倣するように誘導体を選択する。はぼ同じサイズのポリペプチドが標準長さのトロンビン分解により多分生じるであろう。

（Ａ）ｐＳＶＦＢ−９２Ｓ：こ（７）ブーｙスミドは９８２個（７）７’ミノ酸Ｈ鎖をコードするものであり、Ｂドメインコード領域の最初の５ａｃＩ部位で分解することにより標準長さのｃＤＮＡプラスミドｐＳＶＦ８−３０２から調製された。オリゴヌクレオチドアダプターを用いて、翻訳ストップコドンが付きそしてコード配列を第一のＢｃβ１部位で開始する天然ヒト第■：Ｃ因子非翻訳配列へ融合した。このプラスミドは天然ヒト第■：Ｃ因子の最初の９７８個のアミノ酸とカルボキシ末端での４個の置換アミノ酸残基をコードする。

（Ｂ）ｐＳＶＦＢ−１６０：このプラスミドは１３２３個のアミノ酸Ｈ鎖を提供し、ｐＳＶＦＢ−２００と同じであるがしかしｐＳＶＦＢ−９２Ｅの５′非翻訳領域を存する標準長さのクローン（ｐＳＶＦＢ−３０３と命名）から調製された。

ｐＳＶＦＢ−３０３をＥｃｏＲＶとＳａｍＩで分解し、プラントエンドを一緒に連結してｐＳＶＦＢ−１６０を形成した。

このプラスミドは第■：Ｃ因子の最初の１３１５個のアミノ酸をコードする。ベクターｐｓＶ７ｄ　ａポリリンカーの融合の結果８個の置換アミノ酸がカルボキシ末端で加わる。

（Ｃ）ｐＳＶＦＢ−１７９０：このプラスミドは１４１６個のアミノ酸Ｈ鎖を提供し、これもまたｐｓＶＦ８−３０３から調製された。ｐｓＶＦ８−３０３をＢｇＲＴＩで部分的に消化し、その結果得られる６８１１ｂｐフラグメントをゲル単離し、端部を一緒に連結してｐＳＶＦＢ−１７０を形成した。

このプラスミドは第■二Ｃ因子の最初のアミノ酸１４０５個をコードし、ベクターｐｓＶ７ｄのポリリンカーの融合のために１１個のアミノ酸のカルボキシ延長部を有する。

（Ｄ）ｐＳＶＦ８−１２０　：このプラスミドは１１０７個のアミノ酸Ｈ８Ｍを提供し、ｐｓＶＦ８−３０３から調製された。

プラスミドｐｓＶＦ８−３０３をＡｐａＩで消化し、付着端をＴ４ポリメラーゼで満たした。得られた分子をさらにＳａｍｌで消化し、ＤＮＡ自体が連結しそして大腸菌ＨＢＩＯＩ中で増殖した。このプラスミドは第■：Ｃ因子のアミノ末端からの１１０２個のアミノ酸とｐｓＶ７ｄポリリンカーによりコードされるカルボキシ末端での追加の５個のアミノ酸をコードする。

（Ｅ）結果各部Ａ−Ｄのプラスミドの各々を、例１に記載のｐＳＶＦ８−８０および例１に記載の第■：Ｃ因子活性について試験された培地とともにＣＯ３７細胞へトランスフェクションした。

これらのプラスミドのすべてはｐＳＶＦ８−９２Ｅのものと比較してかなり低い発現レベルを示した。しかしながら、興味深イコトニ、ｐＳＶＦ８　Ｌ６０およびｐＳＶＦ８−１７０についてのＲｒＡ対ＣｏａｔｅｓＬ活性の比は約１．８テあり、ｐｓＶＦ８−９２Ｅについては７．２である。この結果はこれらのより長いＨ鎖誘導体がより高い比活性を有し、すなわちこれらがＭｒ９２に分子自体より一層効率良く活性なサブユニット複合体を組立てるということを示唆している。

また、コアテスト活性に対する凝結活性の比は、Ｍｒ９２Ｋが２．３であり完全な分子が１．３５であるのに比べて約１．７でＨｌ（が長くなると低くなり、このことはこれらのより長いポリペプチドがＭｒ９２に＋Ｍｒ８０に複合体のものほど活性化されないということを示す。

例４本例は第■：Ｃ因子Ｍｒ９２に−８０に鎖複合体を作る安定なＣＨＯ細胞細胞間製について記載する。

（Ａ）プラスミドの調製選択可能なマーカーをコードするネズミＤＨＦＲｃＤＮＡを有するプラスミドｐＡｄ−ＤＩＦＲを、アデノウィルス−２からの主要後期プロモーター（Ａｄ−ＭＬＰ、マツプ単位１６−２７．３　）をハッカネズミＤＨＦＲｃＤＮＡ（ジエン、エイチ　ヌクハーグ（Ｊ、Ｈ，Ｎｕｎｂｅｒｇ）ら、Ｃｅ１１（１９８０）１９　：　３５５−６４）の５′非翻訳配列と融合することにより構築した。小さなｔ抗原遺伝子のイントロンを含みそしてＳＶ４０初期領域転写終結領域を有する初期転写単位の一部をコードする５Ｖ４０ＤＮＡをｐｓＶ２−ネオ（サウザーン（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ）およびベルブ（Ｂｅｒｇ）、Ｊ、Ｍｏｌ　Ａｐｐｌ　Ｇｅｎ（１９８２）　１　：　３２７−４１）から得、ＤＨＦＲｃＤＮＡの３′非翻訳端へ融合した。これらの三つの片をｐＢＲ３２２へサブクローンしてプラスミドｐＡｄ−ＤＨＦＲを得た。

（Ｂ）ＣＨＯ細胞のトランスフェクションおよび培養ジヒドロフルオレ−ドレダクターゼに対する非官能性遺伝子を有するＣＨＯ−ＤＵＫＸ−Ｂ　１１細胞（ウルラウブ（Ｕｒｌａｕｂ）およびカシン（Ｃｈａｓｉｎ）、Ｐｒｏｃ　Ｎａｔ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ（１９８０）７７　：　４２１６−４２２０）を、３つのプラスミド：ｐＳＶＦ８−９２Ｃ。

ｐｓＶＦ８−９２ＥまたはｐＳＶＦ８−８０、およびｐ　Ａ、　ｄ−ＤＨＦＲのリン酸カルシウム共沈を用い続いてグラハムおよびファンデルニブ（前出）の方法およびウィグラー（Ｗｉｇｌｅｒ）ら、Ｃｅ１ｌ　（１９７８）　１４ニア２５−７３１およびルイス（Ｌｅｗｉｓ）　ら、Ｓｏｍａ　ｔ　ｉ　ｃＣｅｌｌ　Ｇｅｎｅｔ（１９８０）６：３３３−３４７に記載の変法にしたがってトランスフェクションした。共沈物には各プラスミド１０μｇ夷でか含まれていた。ヒボキサンチンおよびチミジンが欠失した培地におけるＤＨＦＲ（陽性）表現型の発現について細胞を選択した。

ＤＨＦＲ陽性クローンを単離しそして第■：Ｃ因子活性を生ずるものを同定後、得られた細胞系をメトトレキセート中で増殖してＤＨＦＲ遺伝子を増幅し第■：Ｃ遺伝子を同時増幅した。ｉ４度０．０２５〜０．２μＭのメトトレキセートを含む培地に細胞を被覆することにより選択を行なった。メトトレキセート耐性クローンを再び第■：Ｃ因子活性について分析した。

（Ｃ）分析法これらＤＨＦＲ陽性クローンからの状態調節した培地を、ノルドファンガ（Ｎｏｒｄｆａｎｇ）　ら、Ｔｈｒｏｍｂ　Ｈａｅｍｏｓｔａｓ（１９８５）５３：３４６−５０の方法により第■：Ｃ因子り鎖免疫反応性についてＥＬＩＳＡにより分析した。第■：Ｃ因子Ｈ鎖免疫反応性は、アール、エル、プルツケ（Ｒ，Ｌ、Ｂｕｒｋｅ）ら、Ｊ、Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｍ（１９８６）２６１　：１２５７４− ７８に記載されたラジオイムノアッセイ　（ＲＩＡ）を用いて評価した。９２におよび８０ＫＭｒｔ１タンパク質の同時発現により形成される活性第■；Ｃ因子複合体を実施例１に記載のＣｏＡＴＥＳＴ分析により測定した。

（Ｄ）活性９２に一８０ＫＭｒ複合体を発現するＣＨＯ系第５表に、トランスフェクションに使用した３つのプラスミドすべての産生物を同時に発現する４つの独立したＣＨＯ細胞細胞間す。第５表に示した第■：Ｃ因子活性値は初期に観察されたものである。安定な細胞系による糖タンパク質の発現は通常Ｔ−７５フラスコ培地中通過後に向上する。この例は１Ｏ−Ｃ２系で見られ、最終的に状態調節した培地１　ｔｔｌ。

につき第■：Ｃ因子活性２００ｍＵが得られた（第６表）、これらの安定な細胞系のクローニングは、第■：Ｃ因子の独立して発現したＨおよびＬ鎖が活性複合体を組立てチャイニーズハムスター卵巣細胞により分泌されうろことを説明する。

第５表：活性９２に−８０に複合体を産生ずるＣＨＯ細胞細胞間のプラスミドがＣＨＯ細胞の染色体へ吸収されることは、第■：Ｃ因子発現を損失することなく多くの経路で第５表の細胞系が増殖しうるという事実により示される。第■：Ｃ因子糖タンパク質の発現がメトトレキセート選択により同時増殖しうる場合測定することが必要であった。これら４つの細胞系のすべてをメトトレキセートの幾つかの濃度における選択下に置いた。耐性コロニー（増幅したＤＨＦＲ遺伝子）がａｃｈ系について得られ、これらを第■：Ｃ因子活性についてスクリーニングした。第■：Ｃ因子の発現はメトトレキセート耐性１ｌ−Ｄ５および１ｌ−Ｄ６クローンにおいては失なわれるかまたは変化しなかった。１Ｏ−Ｃ２および８−Ｃ１から導びかれるメトトレキセート耐性クローンの間では第■：Ｃ因子の発現が変化する（第６表参照）。

２２のメトトレキセート耐性８−Ｃ１クローンを検査し、そのうち１０についてのデータを第６表に報告する。第■：Ｃ因子増幅の量がクローン間で変化し、このことはサブユニット遺伝子のいずれか１つがＤＨＦＲ力セントで同時増殖されるか、または両方ともが増幅されるか、またはいずれもされないことを示唆する。これら４つの可能性としてクローン８Ｃ１−Ａ２．８ＣｉＣ２および８Ｃ１− Ｃ５を記載する。

同様に、３ｏの１Ｏ−Ｃ２のメトトレキセート選択誘導体を評価し、そのうち２０についてのデータもまた第６表に示す。

これらもまた活性スペクトルを有する。４つの異なった同時−増幅の可能性の例としてクローン１０Ｃ２−Ａ２、ｌ０Ｃ２−Ｄ２．１０Ｃ２−Ｂ５および１０Ｃ２−Ｃ６を記載する。

第６表第６表に記載したＣＨＯ系の間では活性第■：Ｃ因子複合体０．５Ｕ／ｒＲＩｌを作るものがあり、この値は普通のヒト血漿において見出される濃度の％である。第■：Ｃ因子物質の分析および精製のために、第■：Ｃ因子ポリペプチドを発現するＣＨＯ細胞系を実験室規模での発酵により増殖し組織培養液１〜２２を調製した。この物質の分析により、非増幅系からの免疫反応性筒■：Ｃ因子の約１０％〜２０％がＣ０ＡＴＥＳＴにおいて活性であることがわかる。増幅系において、活性′！＃質の割合は全免疫反応性生成物の２％〜５％まで低下する。このことは第■：Ｃ因子のＨｌＮおよびＬ鎖のフラクションだけが集まって活性複合体を組立てることを意味する。残りは遊離したサブユニットとしてまたは分解した形で存在する。

プラスミドｐＳＶＦ８−９２およびｐｓＶＦ８−８０は１９８６年１月２４日付でアメリカンタイプ力ルチュアコレクション（ＡＴＣＣ）に寄託されそしてそれぞれＡＴＣＣ受入れ番号４０２２２および４０２２３が与えられた。プラスミドｐｓＶＦ８−２００は１９８５年７月１７日にＡＴＣＣに寄託されＡＴＣＣ受入れ番号４０１９０が与えられた。

例５本例は第■：Ｃ因子り鎖垢タンパク質のアミノ末端アミノ酸を修正するためのプラスミドｐＳＶＦ８−８０の修飾について記載する。工学技術の結果、８０ＫＭｒ糖タンパク質の独−立した分泌に必要なシグナルペプチド（例１）を提供するものはヒト血漿筒■：Ｃ因子り鎖の普通のアミノ末端残基をＳｅｒで置換したものである。ｔＰＡブレープロペプチド配列を変化する目的で新規プラスミドを作り、そのため第■：Ｃ因子り鎖はタンパク質分解プロセッシング後の突然変異Ｓｅｒ残基の代わりにそのアミノ末端にＧｌｕ残基を有するであろう。

第■：Ｃ因子り鎖は、ゴルジ装置にあるプロテアーゼにより分泌する前すなわち細胞内で標準長さの第■：Ｃ因子前駆体から分解されると考えられている。この分解はアミノ酸残基１６４日と１６４９　（Ａｒｇ−Ｇｌｕ）の間で生じる。ポリアクリルアミドゲルにおいてＬ鎖はそれぞれ１つまたは２つのＮ−結合オリゴ糖を有するポリペプチドを表わす７７および８０ＫＭｒハンドの二重線として表われる。Ｌ鎖の独立した分泌は第■：Ｃ因子ｃＤＮＡのＬ鎖コード領域をｔＰＡのｃＤＮＡへ融合することにより達成された。しかしながら、ｔ、ＰＡシグナルペプチドを供給する方法において、第■：Ｃ因子Ｌｍのアミノ末端は天然グルタミン酸残基からセリンへ突然変異を起こした。この突然変異誘発組換体し鎖は標準長さの組換体第■：Ｃ因子から由来する鎖と同じ分子特性を示すが、以下のような予備的証拠もある：１）第■：Ｃ因子前駆体から分解した鎖と同じ方法で代わりにグリコジル化されないかもしれない、２）イオン交換およびｖ　Ｗ　Ｆセファロースクロマトグラフィにより精製する間に異なった挙動を示すかもしれない、３）真正り鎖と抗原性が異なるかもしれない。

ｔＰＡブレープロペプチド配列は突然変異ポリペプチドを放出するために３つのタンパク質分解を必要とする。以下にｔＰＡ−第■：Ｃ因子８０に融合物の領域においてｐ　５ＶＦ８−８０のタンパク質コード配列の翻訳を示す：廊トエ灸」遼：シグナルペプチダーゼ分解は、星印で示したように５ｅｔ（−１３位）またはＡｌａ（−８位）のいずれかのカルボキシ部位で生ずると考えられてきた。二番目の分解は多分Ａ、　ｒｇ（−４位、上記◎で示した）のカルボキシ部位で生じる。

三番目のプロセッシング事象はＡｒｇ−３ｅｒ結合でのクンバク譬分解でありＧｌｙ−Ａｌａ−Ａｒｇのトリペプチドを放出しそして成熟し′ＰＡまたは第■：Ｃ因子り鎖ポリペプチドにおける５ｅｒ（１位）アミン末端をそのままにする。

（Ａ）プラスミドの調製（１）ＰＳＶＦ９−８０ＫＣ；：Ｓｅｒコドン（１位）を特定部位突然変異誘発によりｃｉＵコドン（１位）へ変えた。これは最初の２つのタンパク質分解プロセッシング現象が正常に生ずる努力が行なわれ、そしてＡｒｇ−Ｇｌｕプロテアーゼが代わりの内容においてジペプチドを認識し分解するかどうか、すなわちｔＰＡトリペプチドが第■；Ｃ因子Ｂドメインに対し置換される場所を試験する。ｔｐＡ−ｓｏＫ鎖融合領域を以下に示す。その他の点ではこのプラスミドはｐＳＶＦ８−８０と同一である。

５ＶＦ８−８０ＫＧ：（２）ｐｓＶＦ８−８０３インビトロ突然変異誘発によりｐＳＶＦ８−８０から１２個のコドンを欠失し、そしてＳｅｒ　（１位）コドンをＧｌｕに対するコドンへ変化させた。これは推定されたｔＰＡシグナルペプチドの５ｅｒ２３　（星印で示す）の後でＧｌｕ第 ■：Ｃ因子り鎖残基を置＜、５ｅｒ２３のカルボキシ側におけるシグナルペプチダーゼによる分解により非突然変異株第■：Ｃ因子り鎮を放出する。ｐｓＶＦ８ −８０５のｔＰＡ−８０Ｋｉｌ融合領域を以下に示す。その他の点ではこのプラスミドはｐｓＶＦ８−８０と同一である。

飢穎困展・（３）ｐｓＶＦ８−８ＯＲｔＰＡブロートリペプチドを除去するためにｐＳＶＦ８−８０の３つのコドンの欠失をインビトロ突然変異誘発により行ない、そして５ｅｔ（１位）コドンをＧｌｕに対する１つへ変化させた。これを以下に示すｐＳＶＦ８−８ＯＲのＬＰＡ −８０に鎖融合領域上に◎で印を付けたＬＰＡプローペプチドのＡｒｇ３２の後にＧｌｕを置く。

居ハＴ旦ゴ■圧：この構築は、二塩基特性を有するゴルジ体にあるプロテアーゼによる分解によりＧｌｕアミノ末端を有する第■：Ｃ因子り鎖を放出するという希望で行なわれた。

（４）ｐＳＶＦ８−８０ＡｐＳＶＦ８−８０の７つのコドンを部位特異的突然変異誘発により欠失させ、５ｅｒ（１位）コドンを推定上のｔ、ＰＡシグナルペプチドコード配列のコドン２８（Ａｔａ）（以下の星印により示される）の後でＧｌｕコドンに代えた。Ａｌａ２８のカルボキシ側におけるシグナルペプチダーゼによる分解で非突然変異誘発第■：Ｃ囚子り鎖を放出する。ｔ　ＰＡ−８０ＫＳｆｆ融合領域を以下に示す、その他の点では、このプラスミＦはｐＳＶＦ８−８０と同一である。

Ｆ易」旦ヨ■い：（Ｂ）発現およびタンパク質配列分析（１）ＣＯ３７細胞へのトランスフェクションＣＯ３７細胞を例１に記載したＤＥＡＥ−デキストラン法を用いてトランスフェクションし、状態調節した培地をＬＣ−ＥＬＩＳＡにより分析した。ｐｓＶＦ８−８０の４つの誘導体すべてはＬＣ−ＥＬ　Ｉ　ＳＡにおいて反応性であり様々な抗−第■：Ｃ因子り鎖抗体で生合成的に放射能標識化した後免疫沈降されうる８　０　ＫＭ　ｒ垢タンパク質をコードする。ｐＳＶ／８−８ＯＲを除いて、すべての誘導体がｐＳＶＦ８−８０として８０Ｋｍタンパク質のほぼ同じ量を分泌するようになる。ｐＳＶＦ８−８ＯＲでトランスフェクションした細胞からの８０　Ｋｌタンパク質の分泌は非常に少なく、通常は他のプラスミドから作られるものの２５％未満である。これに加え、この第■：Ｃ因子り鎖の出現はゲル電気泳動で異なり、ここではバンドは常に拡散する。

（２）ＣＨＯ細胞における発現これらプラスミドの各々を例４に記載したｐＡｄ−ＤＨＦＲを用いてＤＵＫＸ− Ｂ　１１　ＣＨＯ細胞へ導入した。Ｌ鎖の各タイプの製造のために永久細胞系を確立ｊ−た。ＣＨＯ細胞における８０ＫＭｒｌｉタンパク質の発現は、分泌される糖タンパク質の量およびゲル電気泳動上の８０にハンドの出現に関し、ＣＯ３７細胞における発現と非常に類（以している。ｐＳＶＦ８−８ＯＲでトランスフェクトされたＣＨＯ系は、この物質を分析しない程低いレベルの８０　Ｋｍタンパク質を作った。

３、　精製およびアミノ酸配列分析大規模ＣｏＳ７トランスフエクシゴン（ｐＳＶＦ８−８０ＫＧ）またはトランスフェクトされた（増幅した）ＣＨ○細胞系（ＰＳＶＦ８−８０に細胞系１０Ｃ２Ｂ５　；ｐＳＶＦ８−８０Ａ、細胞系ＡＩＮ；　ｐｓＶＦ８−８Ｏ３、細胞系５ＩＲ）のいずれかからの状態調節した培地を調製した。培地は１０％ＦＢＳを有するＤＭＥ　ＨＩ３であった。第■：Ｃ因子ＬＣを、イオン交換クロマトグラフィとそれに続くアフィニティクロマトグラフィからなる二段階法により配列決定のため精製した。イオン交換クロマトグラフィを以下のように実施した：　５− ＦＦセファロースカラム（１５Ｘ０．８ＣＩ＋１）を、０．０２Ｍ　ＭＥＳ、０．０５Ｍ　ＮａＣ１，０，ＯＩＭ　ＣａＣｆｆｚｐＨ５，８、λ２０°Ｃ＝７．２ｍＳで平衡化した。状態調節した培地（５００〜１３００Ｉｄｔ）をｐ）１５．８まで調整後流速１００ｄ／ｈでカラムへ施こした。カラムを、１０カラム容量の０、０５　Ｍイミダゾール、０．０５Ｍ　ＮａＣ１，０，０１ＭＣａ　ＣＥｚ　、ｐＨ７，３５，７２０°Ｃ＝　８．８６を用い流速２００ｄ／ｈで洗浄した。Ｆ■−ＬＣを０．１　Ｍ　Ｃａ　Ｃｌ　ｔの添加により洗浄緩衝液へ流速５０ｄ／ｈで溶出した。すべての操作を４　’Ｃで行なった。

アフィニティクロマトグラフィを次のように行なった：ネズミ科モノクローナル抗−Ｆ■−ＬＣ抗体５６−１ｇＧをＣＮＢｒ法によりセファロース４Ｂへ結合し密度２．５ｍｇ／ｒｎ１．ゲルとした。Ｆ■−ＬＣ含有溶出液を、室温にて一晩、Ｆ■−ＬＣｌｏｏＯＵにつきゲルｌｄで免疫吸着によりインキュベートした。

次いでゲルをカラムにパックし、低塩分緩衝液（０，０５Ｍイミダゾール、０．１５Ｍ　ＮａＣ１，，０，ＯＩ　ＭＣａＣｆｚ、１０％グリセロール、０．０２％ＮａＮ、、ｐＨ７，３）２０カラム容量次いで高塩分緩衝液（０，０５Ｍイミダゾール、１．０Ｍ　ＮａＣ１，１０％グリセロール、ｐＨ７，３）２０カラム容量で洗浄した。１時間インキュベート後、０．０５Ｍイミダゾール、０．１５Ｍ　ＮａＣ１，１０％グリセロール中ＩＭＣａＣｊ２．を用いて免疫吸着からＦ ■−ＬＣを溶出した。溶出液をただちにセファデンクスＧ−２５カラム中で０、０５　Ｍイミダゾール、０．１５Ｍ　ＮａＣｊ！、０．ＯＩＭＣａＣ！！、２．１０％グリセロール、０．０２％トウイーン８０．０．０２％Ｎ　ａ　Ｎｚ　、ｐＨ７，３の溶液へ脱塩化し、−８０°Ｃで貯蔵した。Ｎ−末端配列分析をアプライドバイオシステム４７７Ａシークエンサーで行なった。

この分析の結果を第７表に示す。ｐＳＶＦ８−８０ＫＧによりコード化される８　０　Ｋｍタンパク質はそのアミノ末端にトリペプチド延長部を有する。多分これはｔＰＡプロトリペプチドＧｌｙ−Ａｌａ−Ａｒｇであり、これはＦ■：ＣＢドメインを認識するＡ、ｒｇ−Ｇｌｕプロテアーゼによるプロセンシングができない。さらに、Ｎ末端配列は、ｔＰＡのシグナルペプチドが実際にアミノ酸残基２２個の長さであり、シグナルペプチダーゼ分解がＰｒｏ２２のカルボキシ側で生ずることを明らかにする。それゆえ、５ｅｒ２３およびＡ１ａ２Ｂの後でシグナルペプチダーゼ分解を内包するプラスミド構築物ｐＳＶＦ８−８Ｏ３およびｐＳＶＦ８−８０Ａはそれぞれ８０ＫＬ鎖において間違ったアミノ末端残基を導入する。

第７表；修飾したｔ、ＰＡブレープロ領域を有する８０に鎖のＮ末端配列本実施例の結果により、分泌されるポリペプチドが転写および翻訳に続いてどうやってプロセンシングされるかを断言することの困難さが明らかである。タンパク質配列の修飾はタンパク質分解プロセッシングおよびオリゴ垢追加についての予期せぬ配列を存し、そして分泌の総体的効率に影響を及ぼすことができる。

例６本例は、ヒトα１−抗トリプシンのシグナルペプチドを用いた真正Ｆ■−ＣＬ鎖の発現方法について記載する。

Ａ、プラスミドの調製１、ｐｓＶｃｒｌ−ＡＴ−Ｍｅｔ。

成熟ヒトαｌ−抗トリブシンポリペプチドをコードするｃＤＮＡを、ヒト肝Ｑ　ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａクローンおよび合成オリゴヌクレオチドのフラグメントを用いて組立てた；組立物をＢａｍＨＩ−３ａＪ２１フラグメントとしてρＢＲ３２２へ連結してプラスミドｐＡＴ　（Ｍｅ　Ｌ）を作った（ローゼンベルグ（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ）　ら、Ｎａ　ｔｕｒｅ　（１９８４）、３１２ニア７−８０）。合成オリゴヌクレオチドリンカー−アダプターおよびシグナルペプチドをコードするｃＤＮＡクローンの一部を用いてシグナルペプチドコード配列を５′端部におけるＥｃｏＲＩ制限部位とともにｐＡＴ　（Ｍｅ　ｔ）のＢａｍＨ１部位へ接続させる。得られた１２７１ｂｐＥｃｏＲＩ−３ａｆＩフラグメントはヒトα１− 抗トリプシンの翻訳配列をコードしており、これをｐＳＶ７ｄ（例１に記［）のＥｃ　ｏＲｌ−３ａ　ｉ　１部位へ連結してｐｓＶαｌＡＴ−Ｍｅ　ｔとした。

２、ｐＳＶＦ８−８０ＡＴプラスミドＰＳＶαｌＡＴ−ＭｅＬをＢａｍＨＩ部位で開環し、これはシグナルペプチドと成熟α１−アンチトリプシン配列のコドンの間の境界で起きる。この制限部位の結合端をヤエナリ（ｍｕｎｇ　ｂｅａｎ）ヌクレアーゼで除去してＧＡＧ（Ｇｌｕ）コドンを放出し、そしてα１−抗トリプシン配列をＳａｉ！、ｒで消化することにより欠失した。Ｆ■：ＣＢＯＫのコード配列は付着のためにｐＳＶＦ８−８０のコドン１および２のインビトロ突然変異誘発により調製されＥｃｏＲＶ部位（これは［Ｉｅコドンとしてコドン２を保存する）を形成した。これによりＦ■：ＣＬ鎖コード領域（コドン２で出発するＥｃｏＲＶ−３ａｊ２Ｉ配列として）が正しいリーディングフレームにてα１−抗トリプシンのコドン１に融合し、そして成熟ヒトαニー抗トリプシンのコード配列を置換する。

融合領域におけるｐＳＶＦ８−８０Ａ、Ｔのコード配列は以下のように翻訳される。ｔＰＡブレープロコード配列のためのα１−抗トリプシンシグナルペプチドコード配列の置換を除いて、このプラスミドはｐｓＶＦ８−８０と同一である。

戚凱虹靭紅（アミノ末端領域）Ｂ９発現およびアミノ酸配列分析１、ＣＯ３７細胞におけるｐＳＶＦ８−８０ＡＴの発現ＣＯ３７細胞をｐＳＶＦ８−８０ＡＴおよびＨ鎖発現プラスミド、通ｔｐｓＶＦ８−９２Ｃでトランスフェクションした。状態ｉＩ！節した培地をＬＣ−ＥＬ　Ｉ　ＳＡ、、ＨＣ−ＥＬ　ＩＳＡおよびＣ０ＡＴＥＳＴにより分析した。トランスフェクトした細胞をまた放射性Ｍｅｔで標識化し、生合成された放射性標識化Ｆ■：ＣＬ鎖を免疫沈降させそしてポリアクリルアミドゲル電気泳動の後で可視化した。プラスミド３ＶＦ８−８０ＡＴはＦ■：ＣＬ鎖の合成を示しこれは７７７７−８０Ｋの二本鎖として表われる。ＣＯ３７細胞において作られた量はｐＳＶＦ８−８０についてと同し量である。ｐＳＶＦ８−９２Ｃまたは他のＦ■：ＣＨ鎖プラスミドとの同時発現は、ＣｏＡＴＥＳＴ分析において測定される活性Ｆ■：Ｃ複合体の製造を導びく。

２、精製およびアミノ酸配列分析細胞密度を増加しそしてクロロキニンジホスフエー１度を低下させて、Ｔ−１７５フラスコ中ＣＯ３７細胞のトランスフェクションにより精製のための物質を調製した。トランスフェクションしてから６０時間後、状Ｂ　Ａｍ　ｉｎ　したＪ＠　ｔ＋！：を集めた；精製およびアミノ酸配列分析を例５に記載のように行なった。アミノ末端配列分析の結果（第８表）により、ｐＳＶＦ８−８０ＡＴによりコードされるＦ■：ＣＬ鎖力く真正なヒト血ｉＦ■：ＣＬ鎖と同しアミノ末端配列を有することがわかる。

第８表　α１−抗トリブシンシグナルペプチドを用し）で分泌された８０に鎖のＮ末端配列３、　８０ＡＴＦ■：Ｃｌ３頁のインビトロア・ノセンフ゛り一８０ＡＴＦ■：ＣＬＩＮのインビトロでの精製されたＦ■：ＣＨ鎖とのｍ換能力を第９表に示す実験で試験した。精製したＦ■：ＣＬ鎖を、５（ｌａＭ　Ｍｎ”および１５０μ Ｍβ−メルカプトエタノールを含む緩衝液中１７　Ｕ／ｄで精製した組換体（標準長さのヒトＦ■：Ｃから）とともに３．ＩＵ／ｄの濃度でインキュベートした。対照として、精製した組換体ＨおよびＬ鎖を同じ条件下で再会合させ、作られた活性Ｆ■：Ｃの量をＣ０ＡＴＥＳＴにより分析した。これらの結果により８０ＡＴＦ■：ＣＬ鎖がインビトロで精製された組換体Ｈ鎖と結合しうることかわかる。

第９表二組換体Ｆ■：０１．鎖とＨ鎖のインビトロでの例７本例はＦ■：ＣＨ鎖の向上した発現のためのプラスミドについて記載する。メツセンジャーＲＮＡの転写効率および安定性を向上するために、転写開始の原因であるＤＮＡ配列および非コード配列における修飾を行なった。短かいペプチドが結合したＢドメインのセグメントからなるカルボキシ末端延長部によりＨ鎖糖タンパク質を修飾した。これはより効率的に細胞から分泌され、組織培地においてより安定であり、そしてＬ鎖とともにより効率良く組立てるＨ鎖を得るために行なわれる。

Ａ、プラスミドの調製１、ｐＣＭＶＦ８−９２／６Ｘ第■：Ｃ因子９２ＫＭｒＨ鎖に対するメッセンジャーＲＮＡの転写レベルおよび安定性を向上する試みで、ＳＶ４０初期転写開始領域を、ヒトサイトメガロウィルス即時型領域（ポスハート（Ｂｏｓｈａｒｔ）ら、Ｃｅ１ｌ（１９８５）　４　：　５２１−５３０）により置換した。さらに、ＳＶ４０初期領域によりメンセンジャーＲＮＡへ寄与された５′非翻訳配列を、その最初のイントロンを含むＨＣＭＶ　ＩＥＩ遺伝子の５′非翻訳配列で置換した。このイントロンは、切り出された転写物がより迅速なプロセッシングおよびより安定なｍＲＮＡを導びくという仮定に含まれる。発現ベクターはまたＣＯ３７細胞における一時的発現を許す複製のＳＶ４０開始点およびアンピシリン耐性について選択することによるＤＮＡクローニングを許す細菌性β−ラクタマーゼ遺伝子を有する。

プラスミドは、ＳＶ４０ポリアデニル化領域を含むｐＳＶ７ｄ（例１に記載）の７００ｂｐＳａｆ　ｒ−Ｐｖｕ　Ｉ７ラグメント、ＳＶ４０の複製開始点とβ− ラクタマーゼ遺伝子の残りを提供するｐＳＶＴ２　（メイヤー（Ｍｙｅｒｓ）ら、Ｃｅ１ｌ（１９８１）２５　：　３７３−８４　；リオ（Ｒｉｏ）　ら、Ｃｅｌ　］　（１９８３）３２：１２７７−４０）　の１４００ｂｐＰｖｕ、　Ｉ− Ｅｃ　ｏＲｒ　（フレノウポリメラーゼで満たされた）、ＳａＩ！、１部位がインビトロ突然変異誘発によりＩＥ１タンパク質についての翻訳開始部位の近くに導入されたヒトサイトメガロウィルス（タウネ（Ｔｏｗｎｅ）菌株）のプラスミドサブクローンから由来する１　７００ｂｐＳｓｐ　ｌ−３ａＥ　Ｉ、および第四：Ｃ因子９２ＫＭｒ＄ｉｉタンパク質をコードするｃＤＮＡを含むｐｓＶＦ８ −９２Ｃ（例２に記載）の４３００ｂｐＳａｆｌ−５ａｆｒフラグメントから構築された。

２、　ｐｓＶＦ８−９２ｔ、β このプラスミドは、ヒト免疫グロブリンαＨｌｉのそれと相同のペプチドヒンジペプチドにより連結した第四：Ｃ因子前駆体の中心（Ｂ）　ドメインのＮ末端およびＣ末端アミノ酸残基からなるＣ末端延長部を有する９２ＫＭｒ組換体Ｈ鎖をコードするｐＳＶＦ８−９２Ｃの誘導体である。これはｐＳＶＦ８−９２Ｃからの４９００ｂｐＨｉｎｄｌｌＩ−３ａｉｌフラグメントからなり、１１０ｂｐＨｉｎｄＩ［ｌ−３ａｊ！Ｉ合成リンカーーアダプターをこれへ挿入する（以下に示す）。

リンカー−アダプターは３４個の追加のアミノ酸残基からなるカルボキシ末端延長部およびＮ一連結グリコシル化の１つの可能性ある基をコードする。Ｃ末端ペプチドはＨ鎖の分子量をほぼ９６ＫＭｒまで上昇させ、これがグリコジル化されている場合は約９９ＫＭｒまで上昇させる。

Ｂ、Ｆ■：ＣＨ鎖抗原に対する分析およびＦ■：Ｃ複合体形成Ｆ■：ＣＬ鎖Ｈ鎖複合体の補因子活性を、カビビトラム（Ｋａｂｉｖｉｔｒｕｍ）からの市販されている試験キット（ＣＯＡＴＥＳＴ）を用いて評価した。免疫反応性Ｆ■：ＣＬ鎖をノルディスクゲントフテ（Ｎｏｒｄｉｓｋ　Ｇｅｎｔｏｆｔｅ）からのＨ２ｒｇｃコーティング抗体およびペルオキシダーゼ抱合抗体を用いてＥＬＩＳＡにより測定した。Ｆ■：ＣＨ鎖免疫反応性をノルディスクゲントフテで開発したＥＬｒＳＡを用いて定量化し、これは阻害患者からのヒトポリクローナル（Ｅ−ｒｇＧ）を使用する。

Ｃ，ｐＣＭＶＦ８−９２／６Ｘの一時的発現ＤＥＡＥ−デキストラン法を用いてｐＣＭＶＦ８−９２／６Ｘプラスミドを様々なＦ■：ＣＬ鎖プラスミド（例５に記載）でＣＯ３７細胞へ同時トランスフェクトした。これらのトランスフェクシヨンからの結果のサンプルを第１０表に示す。データによれば、ＣＭＶ　ＩＥＩ　プロモーター／エンハンサ−およびＩＥＩ遺伝子の５′非翻訳配列を添加するとＦ■：ＣＨ鎖全発現おいて２．５倍の向上（平均）が得られることがわかる。

第１０表：ｐＣＭＶＦ８−９２／６Ｘ対ｐ　Ｓ　Ｖ　Ｆ　８−．９２　ＣのＣＯ３７細胞における発現ａ　ＣｏＡＴＥＳＴ分析ｂ　Ｈ鎖に対する放射線免疫検定法り、ｐｓＶＦ８−９２ｔβのＣＯ３７細胞における一時的発現第１１表に、第■：Ｃ因子Ｌｕｉ発現プラスミド（ｐｓＶＦ８−８０ＡＴ、例６に記！りを用いたＣＯ３７細胞へのｐｓＶＦ８−９２ｔβ同時トランスフエクシゴンの結果を示す。

９２ｔβＨ鎖は９２ＣＨ鎖より高いレベルで分泌され、これはシグナルアミノ酸（Ｓｅｒ）カルボキシ末端延長部を有するＣ０ＡＴＥＳＴ　（ＣＯＡ）活性のＥＬＩＳＡ反応性糖タンパク質との比（？ｊｉ［合体形成の測定値）は９２Ｃ鎖より９２Ｌβ鎖についての方が大きい、さらに、９２ｔβＨｇ４は血清不含有培地中で良く分泌され安定であるようであり、タンパク質に対する活性の比はＩＯ％ＦＢＳ中とほとんど同じである７これらの結果により、この３４個のアミノ酸カルボキシ末端延長部が分泌を向上しそしてＭｉ換体Ｆ■：ＣＨ鎖を安定化することが明らかである。

第１１表：ＣＯ３７細胞におけるｐＳＶＦ８−９２ｔβの発現複製におけるＣＯ３７細胞単層をＤＥＡＥ−デキストラン中でＤＮＡへ８ｎし、洗浄しそしてクロロキニンジホスフェート含を培地で８時間処理した。細胞を洗浄して薬品を除き、１０％ＦＢＳ含存ＤＭＦ自存　Ｈ２１５ｍｌでｆ２〜１６時間被覆し、次いでハナ　ハイオケミカルズ（Ｈａｎａ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）からのＨＢ　ＣＨＯ登録商標でオーバーレイした。状態調節した培地を記載したようにＦ■：Ｃ活性について分析した。

ａＬ鎖に対し特異的なＥＬｒＳＡ分析によるｂＨ鎖に対し特異的なＥＬＩＳＡ分析による理解を明らかにする目的で例を説明することにより前述の発明を詳細に記載したが、一定の変化および修飾は添付の請求の範囲の範囲内で実施される。

例日本例はＣ末端としてＡｒｇ７４０を有するＦ■：ｃＨ鎖の発現のための方法を記載する。

Ａ、プラスミドｐＣＭＶＦ８−９２Ｒの調製プラスミドｐＣＭＶＦ８−９２／６ＸによりコードされるＦ■：ＣＨ鎖はＣ末端延長部として５ｅｔ７４１を有する。

Ｃ末端としてＡｒｇ７４０を有するＦ■：ｃＨ鎖を得るために、ｐＳＶＦ８−９２Ｃから由来するコード配列の３′端部をコードするｐＣＭＶＦ８−９２／６Ｘの１５８８ｂｐＢａｍＨｌフラグメントを精製した。このフラグメントをｒｒ＋４３ｍｐ１８にクローン化し、５ｅｔ７４１残基をインビトロ突然変異誘発により翻訳ストップコドンへ変える。ｐＣＭＶＦ８−９２Ｒ発現プラスミドを、オリジナルのヘクターの５８４０ｂｐＢａｍ、ＨＩフラグメントへ突然変異誘発化フラグメントをクローニングすることにより組立てた。この方法によりＦ■：Ｃ３ ′非翻訳配列の６８０ｂｐが欠失した。

Ｂ、ｐＣＭＶＦ８−９２ＲのＣＯＳ細胞における一時的発現ｐＣＭＶＦ８−９２Ｒプラスミドを、ＩＪン酸カルシウム法（グラハムおよびファンデルニブ、Ｖｉｒｏｌ　（１９７３）５２：４５６−６７）を用いてＦ■：ＣＬ鎖プラスミド（ｐＳＶＦ８−８０ＡＴ）（例６に記＠）でｃＯ３７細胞へ同時トランスフェクションした。培地をトランスフェクション後１８および４２時間で培地を変えた。

分析のための培地サンプルをトランスフェクション後６６時間で集めた。これらの分析の結果を以下の第１２表に示す。データによりｐ’ＣＭＶＦ８−９２ＲがＦ■ＬＣの発現を提供するプラスミドで同時トランスフェクトするとＦ■：Ｃ活性が生じたことがわかる。

第１２表　ｐＣＭＶＦ８−９２ＲおよびｐＳＶＦ８−８０ＡＴの同時発現７”ラスミＦｐＳＶＦ８−９２ｈよびｐＳＶＦ８−８０を１９８６年１月２４日イ寸でアメリカンタイプ力ルチュアコレク’ｙヨ７　（ＡＴＣＣ）　に寄託し、ＡＴＣＣ受入れ番号４ｏ２２２および４０２２３がそれぞれ与えられた。プラスミドｐｓＶＦ８−２００を１９８５年７月１７日付でＡＴｃｃに寄託し、ＡＴＣＣ受入れ番号４０１９０が与えられた。

補正書の翻訳文提出書（特許法第１８４条の８）平成４年５月１８日２　発明の名称第■、Ｃ因子活性を有するタンパク譬複合体およびその製法３　特許出願人住所　デンマークｌｌ！、　２８８０　バクスハエルト。

ノボ　アレ（番地なし）５　補正書の提出年月日１９９１年１１月５日６　添付書類の目録補正書の翻訳文　１通浄書（内容に変更なし）請求の範囲１、　ヒト第■：Ｃ因子活性を有する組換体タンパク質複合体の製造方法であって、前記複合体がヒト第■：Ｃ因子のＡドメインと相同の第一のポリペプチドおよびヒト第■：Ｃ因子のＣドメインと相同性を有する第二のポリペプチドがらなり、しかしヒト第■：Ｃ因子のＢドメインのすべてまたはほとんどの部分を欠失するものであり、該方法が次の工程：細胞増殖培地中にて培養される真核生物形質転換宿主細胞において（ａＨｉ　）分泌を指図しうる第一のシグナル配列、および（１１）ヒト第■：Ｃ因子のＡドメインと相同のアミノ酸配列を有する第一の領域からなる第一のポリペプチドをコードする第一のポリヌクレオチド、および（ｂ）（ｉ）分泌を指図しうるヒトα１−抗トリプシンのシグナル配列、および（１１）ヒト第■：Ｃ因子のアミノ酸１６４９〜２３３２のアミノ酸配列と相同のアミノ酸配列を有する第二のポリペプチドをコードする第二のポリヌクレオチドを同時発現し：そして分泌された組換体タンパク質複合体を前記細胞培地から得る、ことからなる前記方法。

２、　前記アミノ酸配列のアミノ酸の数の約５％以下が第■：Ｃ因子ＡおよびＣドメインの天然産生アミノ酸配列と異なる請求の範囲第１項に記載の方法。

３、　第一のポリヌクレオチドによりコードされたポリペプチドのアミノ酸配列がヒト第■：Ｃ因子のアミノ酸１〜７４０のアミノ酸配列と同じである請求の範囲第１項に記載の方法。

４、　第一のポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドのアミノ酸配列がヒト第■：Ｃ因子のアミノ酸１〜１１０２のアミノ酸配列と同じである請求の範囲第１項に記載の方法。

５、　第一のポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドのアミノ酸配列がヒト第■：Ｃ因子のアミノ酸１〜１３１５のアミノ酸配列と同じである請求の範囲第１項に記載の方法。

６、　第一のポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドのアミノ酸配列がヒト第■：Ｃ因子のアミノ酸１〜１４０５のアミノ酸配列と同じである請求の範囲第１項に記載の方法。

７、　前記第一のポリペプチドがさらに、（ａ）ヒト第■：Ｃ因子のＢドメインのＮ末端配列；　（ｂ）Ｎ−結合グリコシル化部位５個以下を有する約３〜約１００のアミノ酸のポリペプチドスペーサー；および（Ｃ）ヒト第■：Ｃ因子のＢドメインのＣ末端配列とからなる第二の領域を含む請求の範囲第１項に記載の方法。

８、　ヒト第■；Ｃ因子のＢドメインのＮ末端配列のアミノ酸配列が５ｅｒ−Ｐｈｅ−５ｅｒ−Ｇ　ｌｎ−Ａｓｎ−５ｅｒ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−３ｅｒ− Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ａｓｎ−八Ｉａ−Ｔｈｒからなる請求の範囲第７項に記載の方法。

９、前記ポリペプチドスペーサーがヒ）ＩｇＨ８Ｊｆヒンジ頑域と相同のペプチドからなる請求の範囲第７項に記載の方法。

１０、ポリペプチドスペーサーのアミノ酸配列がＰｒｏ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒからなる請求の範囲第９項に記載の方法。

１１．３ドメインのＣ末端配列がＰｒｏ−Ｐｒｏ−シａｌ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ｇｌｎ−Ａｒｇからなる請求の範囲第７項に記載の方法。

１２、第一のポリヌクレオチドがさらに、（ａ）第一のポリペプチドの発現を増強する５′非翻訳ＤＮＡ配列であって、その際前記５′非翻訳配列は前記第一の領域に対し５′に位置し、そしてその際前記５′非翻訳ＤＮＡはヒト第■：Ｃ因子５′非翻訳ＤＮＡ、、ＳＶ４０を抗原５′非翻訳ＤＮＡ、およびヒトサイトメガロウィルスＩＥＩタンパク質５′非翻訳ＤＮＡからなる群から選択されるもの；または（ｂ）第一のポリペプチドの発現を強化する３′非翻訳ＤＮＡ配列であって、その際前記３′非翻訳配列が前記ポリペプチドコード領域に対し３′に位置し、その際前記３′非翻訳ＤＮＡはヒト第■：Ｃ因子３′非翻訳ＤＮＡ、ヒトＭｉ織プラスミノーゲンアクチベーター３′非翻訳ＤＮＡおよびＳＶ４０を抗原３′非翻訳ＤＮＡからなる群から選択されるものを含む請求の範囲第１項に記載の方法。

１３、＠記αＩ−抗トリブシンシグナル配列がＮ−Ｎｅｔ−Ｐｒｏ−５ｅｒ−５ｅｒ−Ｖａ　Ｉ　−５ｅｒ−Ｔｒｐ−Ｇ　Ｉ　ｙ−ｒｌｅ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａ　Ｉａ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ　−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ −Ｖａｌ−３ｅｒ−Ｌｅｕ−Ａｌａからなる請求の範囲第１１項に記載の方法。

１４、前記第二のポリヌクレオチドがさらに、（ａ）前記第二のポリペプチドの発現を増強する５′非翻訳ＤＮＡ配列であって、前記５′非翻訳配列が前記第二の領域に対し５′に位置し、その際前記５′非翻訳ＤＮＡはヒト第■：Ｃ因子５ ′非翻訳ＤＮＡ、ＳＶ４０　を抗原５′非翻訳ＤＮＡ、およびヒトサイトメガロウィルスＩＥ１タンパク譬５′非翻訳ＤＮＡからなる群から選択されるもの；または（ｂ）第二のポリペプチドの発現を強化する３′非翻訳ＤＮＡ配列であって、前記３′非翻訳配列が前記ポリペプチドコード領域に対し３′に位置し、その際前記３′非翻訳ＤＮＡはヒト第■：Ｃ因子３′非翻訳ＤＮＡ、ヒト組織プラスミノーゲンアクチベーター３′非翻訳ＤＮＡおよびＳＶ４０を一抗原３′非翻訳ＤＮＡからなる群から選択されるものを含む請求の範囲第１項に記載の方法。

１５、真核生物形質転換体宿主細胞が哺乳動物細胞である請求の範囲第１項に記載の方法。

１６、第一のポリヌクレオチドおよび第二のポリヌクレオチドが別々の発現プラスミド中にある請求の範囲第１項に記載の方法。

１７、第一のポリヌクレオチドおよび第二のポリヌクレオチドが別々の発現プラスミド中にある請求の範囲第７項に記載の方法。

１日、ヒト第■：Ｃ因子活性を有するがしかし請求の範囲第７項に記載の方法により調製されたヒト第■：Ｃ因子のＢドメインのすべてまたは一部を欠失するタンパク質複合体。

１９．請求の範囲第１８項に記載のタンパク質複合体および生理学的に許容されうる担体からなる薬剤組成物。

２０、個人における血液凝固活性を強化するために請求の範囲第１９項に記載のタンパク質複合体の十分量を個人に投与することからなる第四：Ｃ因子活性を必要とする個人を治療する方法。

２１、ヒト第四：Ｃ因子活性を有する組換体タンパク質複合体の発現を得るために真核生物宿主細胞を形質転換するためのＤＮＡ組成物であって、前記ＤＮＡ組成物が、第一の発現力セントであって、該第−の発現力セントがヒト第四：Ｃ因子のＡドメインと相同のアミノ酸配列を有する第一の領域からなる第一のポリペプチドの分泌を指図しうる第一のシグナル配列をコードする第一のポリヌクレオチドからなる発現カセット、および第二の発現カセットであって、第二の発現力セントが分泌を指図しうるヒトα１ −抗トリプシンのシグナル配列およびヒト第四：Ｃ因子のアミノ酸１６４９〜２３３２のアミノ酸と相同のアミノ酸配列を有する第二のポリペプチドをコードする第二のポリヌクレオチドからなる発現力セントとからなるものである前記ＤＮＡ組成物。

２２、前記第一のポリヌクレオチドがさらに、ヒト第四：Ｃ因子のＢドメインのＮ末端配列、Ｎ結合グリコジル化部位５個未満を有するアミノ酸約３〜４０個のポリペプチドスペーサーおよびヒト第四：Ｃ因子の８ドメインのＣ末端シグナル配列からなる第二の領域を含む請求の範囲第２１項に記載のＤＮＡＭｉ成物。

２３、前記第一のカセットポリヌクレオチドがヒト第四：Ｃ因子アミノ酸１〜７４０のアミノ酸配列が少なくとも約９０％からなるポリペプチドをコードし、前記第二のカセットポリヌクレオチドがヒト第四：Ｃ因子アミノ酸１６４９〜２３３２のアミノ酸配列の少なくとも約９０％からなるポリペプチドを特徴とする請求の範囲第２１項に記載のＤＮＡ組成物。

２４、請求の範囲第２１項に記載のＤＮＡ組成物を含む宿主哺乳動物細胞。

２５、請求の範囲第２２項に記載のＤＮＡ組成物を含む宿主哺乳動物細胞。

２６、ヒト第四：Ｃ因子Ｍｒ８０にタンパク質と相同のポリペプチドを組合せた場合ヒト第四：Ｃ因子活性を存するポリペプチドであって、該ポリペプチドがＮ末端からＣ末端までを含み：ヒト第四：Ｃ因子のＡドメインと相同のアミノ酸配列を有する第一の領域、およびヒト第四：Ｃ因子のＢドメインのＮ末端配列、Ｎ結合グリコジル化部位５個以下を有する約３〜４０個のペプチドのポリペプチドスペーサー、およびヒト第四：Ｃ因子のＢドメインのＣ末端配列からなる第二の領域からなる前記ポリペプチド。

２７、前記第一の領域のアミノ酸配列のアミノ酸の約５％以下が第■：Ｃ因子Ａドメインの天然産生アミノ酸配列と異なる請求の範囲第２６項記載のポリペプチド。

２８、第一のポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドのアミノ酸配列がヒト第四：Ｃ因子のアミノ酸１〜７５９のアミノ酸配列と同じである請求の範囲第２６項に記載のポリペプチド。

２９、ヒト第四：Ｃ因子のＢ鎖のＮ末端配列のアミノ酸が５ｅｒ−Ｐｈａ−５ｅｒ−Ｇｌｎ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ　−Ｐｒｏ−５ｅｒ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ｇ　１ｎ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ｔｈｒからなる請求の範囲第２６項に記載のポリペプチド。

３０、ポリペプチドスペーサーのアミノ酸配列がＰｒｏ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒである請求の範囲第２６項に記載のポリペプチド。

３１、ＢドメインのＣ末端配列がＰｒｏ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ｇｌｎ−Ａｒｇである請求の範囲第２６項に記載のポリペプチド。

手続補正書（方式）％式％１、事件の表示ＰＣＴ／ＤＫ９０１００２９１、発明の名称第四：Ｃ因子活性を有するタンパク質複合体およびその製法３、補正をする者事件との関係　特許出願人名称　ノボノルディスクアクティーゼルスカプ住所　〒１０５東京都港区虎ノ門 −丁目８番１０号静光虎ノ門ビル　電話３５０４−０７２１５、補正命令の日付　〜、６、補正の対象明細書及び請求の範囲の翻訳文７、補正の内容明細書、請求の範囲の翻訳文の浄書（内容に変更なし）８、添付書類の目録明細書及び請求の範囲の翻訳文　各　ｌ　通手続補正書（方式）％式％１、　事件の表示ＰＣＴ／ＤＫ９０１０　Ｏ２９１、発明の名称第■：Ｃ因子活性を有するタンパク譬複合体およびその製法３、補正をする者事件との関係　特許出願人名称　ノボノルディスクアクティーゼルスヵブ住所　〒１０５東京都港区虎ノ門 −丁目８番１０号５、補正命令の日付６、　補正の対象特許法第１８４条の８の規定による補正書の翻訳文７、　補正の内容補正書の翻訳文の浄書（内容Ｑこ変更なし）８、　添付書類の目録浄書した補正書の翻訳文　１通国際調査報告国際調査報告

Claims

【特許請求の範囲】１．ヒト第ＶＩＩＩ：Ｃ因子活性を有する組換体タンパク質複合体の製造方法であって、前記複合体かヒト第ＶＩＩＩ：Ｃ因子のＡドメインと相同の第一のポリペプチドおよびヒト第ＶＩＩＩ：Ｃ因子のＣドメインと相同性を有する第二のポリペプチドからなり、しかしヒト第ＶＩＩＩ：Ｃ因子のＢドメインのすべてまたはほとんどの部分を欠失するものであり、該方法が次の工程：細胞増殖培地中にて培養される真核生物形質転換宿主細胞において（ａ）（ｉ）分泌を指図しうる第一のシグナル配列、および（ｉｉ）ヒト第ＶＩＩＩ：Ｃ因子のＡドメインと相同のアミノ酸配列を有する第一の領域からなる第一のポリペプチドをコードする第一のポリヌクレオチド、および（ｂ）（ｉ）分泌を指図しうる第二のシグナル配列、および（ｉｉ）ヒト第ＶＩＩＩ：Ｃ因子のＣドメインと相同のアミノ酸配列を有する第二のポリペプチドをコードする第二のポリヌクレオチドを同時発現し：そして分泌された組換体タンパク質複合体を前記細胞培地から得ることからなる前記方法。２．前記アミノ酸配列のアミノ酸の数の約５％以下が第ＶＩＩＩ：Ｃ因子ＡおよびＣドメインの天然産生アミノ酸配列と異なる請求の範囲第１項に記載の方法。３．第二のポリヌクレオチドによりコードされたポリペプチドのアミノ酸配列がヒト第ＶＩＩＩ：Ｃ因子のアミノ酸１６４９〜２３２２のアミノ酸配列と同じである請求の範囲第１項に記載の方法。４．第一のポリヌクレオチドによりコードされたポリペプチドのアミノ酸配列がヒト第ＶＩＩＩ：Ｃ因子のアミノ酸１〜７４０のアミノ酸配列と同じである請求の範囲第３項に記載の方法。５．第一のポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドのアミノ酸配列がヒト第ＶＩＩＩ：Ｃ因子のアミノ酸１〜１１０２のアミノ酸配列と同じである請求の範囲第３項に記載の方法。６．第一のポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドのアミノ酸配列がヒト第ＶＩＩＩ：Ｃ因子のアミノ酸１〜１３１５のアミノ酸配列と同じである請求の範囲第３項に記載の方法。７．第一のポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドのアミノ酸配列がヒト第ＶＩＩＩ：Ｃ因子のアミノ酸１〜１４０５のアミノ酸配列と同じである請求の範囲第３項に記載の方法。８．前記第一のポリペプチドがさらに、（ａ）ヒト第ＶＩＩＩ：Ｃ因子のＢドメインのＮ末端配列；（ｂ）Ｎ−結合グリコシル化部位５個以下を有する約３〜約１００のアミノ酸のポリペプチドスペーサー；および（Ｃ）ヒト第ＶＩＩＩ：Ｃ因子のＢドメインのＣ末端配列とからなる第二の領域を含む請求の範囲第１項に記載の方法。９．ヒト第ＶＩＩＩ：Ｃ因子のＢドメインのＮ末端配列のアミノ酸配列がＳｅｒ −Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ −Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ｔｈｒからなる請求の範囲第８項に記載の方法。１０．前記ポリペプチドスペーサーがヒトＩｇＨ鎖ヒンジ領域と相同のペプチドからなる請求の範囲第８項に記載の方法。１１．ポリペプチドスペーサーのアミノ酸配列がＰｒｏ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒからなる請求の範囲第１０項に記載の方法。１２．ＢドメインのＣ末端配列がＰｒｏ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ｇｌｎ−Ａｒｇからなる請求の範囲第８項に記載の方法。１３．第一のポリヌクレオチドがさらに、（ａ）第一のポリペプチドの発現を増強する５′非翻訳ＤＮＡ配列であって、その際前記５′非翻訳配列は前記第一の領域に対し５′に位置し、そしてその際前記５′非翻訳ＤＮＡはヒト第ＶＩＩＩ：Ｃ因子５′非翻訳ＤＮＡ、ＳＶ４０ｔ抗原５′非翻訳ＤＮＡ、およびヒトサイトメガロウイルス１Ｅ１タンパク質５′非翻訳ＤＮＡからなる群から選択されるもの；または（ｂ）第一のポリペプチドの発現を強化する３′非翻訳ＤＮＡ配列であって、その際前記３′非翻訳配列が前記ポリペプチドコード領域に対し３′に位置し、その際３′非翻訳ＤＮＡはヒト第ＶＩＩＩ：Ｃ因子３′非翻訳ＤＮＡ、ヒト組織プラスミノーゲンアクチベータ−３′非翻訳ＤＮＡおよびＳＶ４０ｔ抗原３′非翻訳ＤＮＡからなる群から選択されるものを含む請求の範囲第１項に記載の方法。１４．前記第二のシグナル配列がヒトα１−抗トリプシンのシグナル配列からなる請求の範囲第１項に記載の方法。１５．前記α１−抗トリプシンシグナル配列がＮ−Ｍｅｔ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ａｌａからなる請求の範囲第４項に記載の方法。１６．前記第二のポリヌクレオチドがさらに、（ａ）前記第二のポリペプチドの発現を増強する５′非翻訳ＤＮＡ配列であって、前記５′非翻訳配列が前記第二の領域に対し５′に位置し、その際前記５′非翻訳ＤＮＡはヒト第ＶＩＩＩ：Ｃ因子５′非翻訳ＤＮＡ、ＳＶ４０ｔ抗原５′非翻訳ＤＮＡ、およびヒトサイトメガロウイルス１Ｅ１タンパク質５′非翻訳ＤＮＡからなる群から選択されるもの；または（ｂ）前記第二のポリペプチドの発現を強化する３′非翻訳ＤＮＡ配列であって、前記３′非翻訳配列が前記ポリペプチドコード領域に対し３′に位置し、その際前記３′非翻訳ＤＮＡはヒト第ＶＩＩＩ：Ｃ因子３′非翻訳ＤＮＡ、ヒト組織プラスミノーゲンアクチベーター３′非翻訳ＤＮＡおよびＳＶ４０ｔ− 抗原３′非翻訳ＤＮＡからなる群から選択されるものを含む請求の範囲第１項に記載の方法。１７．真核生物形質転換体宿主細胞が哺乳動物細胞である請求の範囲第１項に記載の方法。１８．第一のポリヌクレオチドおよび第二のポリヌクレオチドが別々の発現プラスミド中にある請求の範囲第１項に記載の方法。１９．第一のポリヌクレオチドおよび第二のポリヌクレオチドが別々の発現プラスミド中にある請求の範囲第８項に記載の方法。２０．ヒト第ＶＩＩＩ：Ｃ因子活性を有する組換体タンパク質複合体を製造する方法であって、前記複合体をヒト第ＶＩＩＩ：Ｃ因子のＡドメインと相同の第一のポリペプチド、およびヒト第ＶＩＩＩ：Ｃ因子のＣドメインと相同の第二のポリペプチドからなり、しかしヒト第ＶＩＩＩ：Ｃ因子のＢドメインのすべてまたはほとんどの部分を欠失するものであり、該方法がヒト第ＶＩＩＩ：Ｃ因子活性を有する組換体タンパク質複合体の発現を得るために真核生物宿主細胞をＤＮＡ組成物で形質転換し、その際前記ＤＮＡ組成物は第一の発現カセットであって該第一の発現カセットがヒト第ＶＩＩＩ：Ｃ因子のＡドメインと相同のアミノ酸配列を有する第一の領域からなる第一のポリペプチドの分泌を指図しうる第一のシグナル配列をコードする第一のポリヌクレオチドからなる発現カセットおよび第二の発現カセットであって第二の発現カセットが分泌を指図しうる第二のシグナル配列およびヒト第ＶＩＩＩ：Ｃ因子のＣドメインと相同のアミノ酸配列を有する第二のポリペプチドをコードする第二のポリヌクレオチドからなる発現カセットとからなるものであり、形質転換宿主細胞を細胞増殖培地中で培養することにより組換体タンパク質複合体を同時発現し、前記細胞培地から分泌された組換体タンパク質複合体を得ることからなる請求の範囲第１項に記載の前記方法。２１．前記第一のポリヌクレオチドがさらに、ヒト第ＶＩＩＩ：Ｃ因子のＢドメインのＮ末端配列、Ｎ結合グリコシル化部位５個未満を有するアミノ酸約３〜４０個のポリペプチドスペーサーおよびヒト第ＶＩＩＩ：Ｃ因子のＢドメインのＣ末端シグナル配列からなる第二の領域を含む請求の範囲第２６項に記載の方法。２２．前記第一のカセットポリヌクレオチドがヒト第ＶＩＩＩ：Ｃ因子アミノ酸１〜７４０のアミノ酸配列が少なくとも約９０％からなるポリペプチドをコードし、前記第二のカセットポリヌクレオチドがヒト第ＶＩＩＩ：Ｃ因子アミノ酸１６４９〜２３３２のアミノ酸配列の少なくとも約９０％からなるポリペプチドをコードする請求の範囲第２６項に記載の方法。２３．組換体タンパク質複合体を細胞培地から単離し凍結乾燥のための通常の賦形剤と混合しそして凍結乾燥する請求の範囲第１項〜第１９項のいずれか１に記載のように作られたヒト第ＶＩＩＩ：Ｃ因子活性を有する組換体タンパク質複合体からなる治療製剤の調製方法。２９．請求の範囲第２６項に記載のＤＮＡ組成物を含む宿主哺乳動物細胞。３０．請求の範囲第２７項に記載のＤＮＡ組成物を含む宿主哺乳動物細胞。３１．ヒト第ＶＩＩＩ：Ｃ因子Ｍｒ８０Ｋタンパク質と相同のポリペプチドを組合せた場合ヒト第ＶＩＩＩ：Ｃ因子活性を有するポリペプチドであって、該ポリペプチドがＮ末端からＣ末端までを含み：ヒト第ＶＩＩＩ：Ｃ因子のＡドメインと相同のアミノ酸配列を有する第一の領域、およびヒト第ＶＩＩＩ：Ｃ因子のＢドメインのＮ末端配列、Ｎ結合グリコシル化部位５個以下を有する約３〜４０個のペプチドのポリペプチドスペーサー、およびヒト第ＶＩＩＩ：Ｃ因子のＢドメインのＣ末端配列からなる第二の領域からなる前記ポリペプチド。３２．前記第一の領域のアミノ酸配列のアミノ酸の約５％以下が第ＶＩＩＩ：Ｃ因子Ａドメインの天然産生アミノ酸配列と異なる請求の範囲第３１項に記載のポリペプチド。３３．第一のポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドのアミノ酸配列がヒト第ＶＩＩＩ：Ｃ因子のアミノ酸１〜７５９のアミノ酸配列と同じである請求の範囲第３１項に記載のポリペプチド。３４．ヒト第ＶＩＩＩ：Ｃ因子のＢ鎖のＮ末端配列のアミノ酸がＳｅｒ−Ｐｈｅ −Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ −Ａｇ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ｔｈｒからなる請求の範囲第３１項に記載のポリペプチド。３５．ポリペプチドスペーサーのアミノ酸配列がＰｒｏ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ　である請求の範囲第３１項に記載のポリペプチド。３６．ＢドメインのＣ末端配列がＰｒｏ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ｇｌｎ−Ａｒｇである請求の範囲第３１項に記載のポリペプチド。