JPH11130800A - 第ｖｉｉｉ：ｃ因子タンパク質を含む組成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 第VIII：Ｃ因子タンパク質を含む組成物の提
供 【解決手段】 第VIII：Ｃ因子タンパク質を含む組成物
であって、該タンパク質は、ヒト第VIII：Ｃ因子凝固活
性を有し、そしてヒト第VIII：Ｃ因子のＡドメインに相
同なアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド、およびヒ
ト第VIII：Ｃ因子のＣドメインに相同なアミノ酸配列を
含む第２のポリペプチドから本質的になる、タンパク質
複合体から本質的になる、組成物。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は第VIII：Ｃ因子活性
を有するタンパク質複合体および適当なポリヌクレオチ
ド構築物の発現による前記複合体の製法に関する。タン
パク質複合体は古典的（Ａ型）血友病の治療に有効であ
る。

【０００２】

【従来の技術】血友病ＡはＸ染色体関連の遺伝性疾患で
あり、男性１万人につき１〜２人が苦しんでいる。この
疾患は第VIII：Ｃ因子の不足の不存在により起こされ
る。第VIII：Ｃ因子は非常に大きな糖タンパク質（天然
Ｍｒ３３０Ｋ−３６０Ｋ）であり、非常に低濃度で血漿
中に存在する。これは可溶性フィブリノーゲンを不溶性
フィブリンに変え凝血を形成し傷付いた組織からの血液
損失を妨げるタンパク質分解カスケードにおける必須要
素である。血流において、これは第VIII：Ｒ因子（“フ
ォン ウィレブランド因子”）との非共有結合会合で見
出され、安定化キャリヤータンパク質として作用する。
第VIII：Ｃ因子はトロンビン、プラスミン、プロテアー
ゼＣおよび他のセリンプロテアーゼによる分解を非常に
受けやすい。これは一般に、血漿または血漿生成物か
ら、Ｍｒ９２ＫおよびＭｒ８０Ｋ〜７７Ｋの主要種類を
含むＭｒ１６０Ｋ〜４０Ｋの範囲の関連ポリペプチド系
列として単離される。この複合体パターンは活性第VII
I：Ｃ因子の構造の分析を非常に困難にしている。

【０００３】第VIII：Ｃ因子および関連ポリペプチド
は、エフ．ロットブラット（F.Rotblat）ら、Biochemis
try(1985)24:4294〜4300；ジイ．エー．フェアール（G.
A.Vehar）ら、Nature(1984)312:337-342：ジェイ．ジェ
イ．トゥール（J.J.Toole）ら、Nature(1984)312:342-3
47；およびエム．エー．テュレット（M.A.Truett）ら、
DNA(1985)4:333-349により記載されている。イー．オル
（E.Orr）ら、Molecular Genetics of Clotting Factor
s，p.54.s321は、第VIII：Ｃ因子の高度グリコシル化領
域に対する“スペーサー”機能を報告した。配列は、ジ
ェイ．ジェイ．トゥールら、前出：ダブリュ．アイ．ウ
ッド（W.I,Wood）ら、Nature(1984)312:330-336；およ
びエム．エー．テュレットら、前出により報告された。
標準長さのタンパク質は１つの配列（Ｉ）の３回の繰り
返しと二番目の配列（III）の２つの繰り返しを含む。
第三の高度にグリコシル化された配列（II）は、二番目
と三番目の繰り返しＩの間に存在し、明らかにタンパク
質分解を受けてＭｒ９２ＫとＭｒ８０Ｋポリペプチドを
形成する。最初の２つの繰り返しＩはＡドメインを形成
し、三番目の繰返しＩと２つの繰り返しIIIはＣドメイ
ンを形成する。配列IIはＢドメインを形成する。したが
って、標準長さのタンパク質は構造Ｉ₁−Ｉ₂−II−Ｉ₃
−III₁−III₂（Ａ−Ｂ−Ｃ）を有し、一方Ｍｒ９２Ｋお
よびＭｒ８０Ｋポリペプチド（ＡおよびＣ）はそれぞれ
構造Ｉ₁−Ｉ₂およびＩ₃−III₁−III₂を有する。シイ．
フルヒャー（C.Fulcher）ら、J.Clin Invest(1985)76:1
17-124は、第VIII：Ｃ因子との抗体−エピトープデータ
に基づいて、Ｍｒ９２ＫおよびＭｒ８０Ｋポリペプチド
の両方とも第VIII：Ｃ因子機能に対し必要であることを
示唆している。

【０００４】第VIII：Ｃ因子は血友病の治療のために濃
縮された形で血液から歴史的に単離されてきた。しかし
ながらＨＩＶおよび他の血液生産性疾患の遺伝に関する
心配により第VIII：Ｃ因子の代わりの供給を用意する活
動が刺激されてきた。天然第VIII：Ｃ因子に伴なう遺伝
的ウィルス性疾患について心配することなく第VIII：Ｃ
因子活性を有する組成物を供給することができることは
非常に興味深いことである。

【０００５】標準長さの組換体ヒト第VIII：Ｃ因子が製
造されてきたが、精製および特性決定することが困難で
あり、そしてタンパク質分解のために不安定である。臨
床的用途のための標準長さの分子の有効な組換体生産は
この時点では不確かである。

【０００６】アール．エル．ブルッケ（R.L.Burke）
ら、J.Biolchem(1986)261:12574-78は、Ｍｒ９２Ｋおよ
びＭｒ８０Ｋポリペプチドをコードするポリヌクレオチ
ドで同時に感染された細胞から活性第VIII：Ｃ因子複合
体を発現することを記載している。得られたタンパク質
は同じ条件下で発現したクローン化した標準長さの第VI
II：Ｃ因子のものと同じ活性を示した。オーノルドファ
ング（O.Nordfang）ら、J.Biol.Chem(1988)263:1115-18
はＭｒ９２Ｋタンパク質およびＭｒ８０Ｋタンパク質
（それぞれＦVIII−ＨＣおよび−ＬＣ）の別々の製剤か
らの活性VIII：Ｃ因子複合体のインビトロアッセンブリ
ーを記載した。成功したアッセンブリーは二価金属イオ
ン（特にＭｎおよびＣａ）およびチオールを必要とする
が、しかしわずかに少量のＦVIII−ＨＣが活性なＦVII
I：Ｃへ複合化されうるだけであった。

【０００７】

【課題を解決するための手段】ここにおいて我々は高い
安定性と第VIII：Ｃ因子活性を有する組換体タンパク質
複合体を発現する向上した方法を発明した。Ｍｒ９２Ｋ
ポリペプチド（ＦVIII−ＨＣ）およびＭｒ８０Ｋポリペ
プチド（ＦVIII−ＬＣ）が同じ宿主細胞中にて別々のプ
ロモーターの調節下に２つの別々のポリペプチドとして
発現される。各ポリペプチドは、シグナル配列の分解を
伴なって細胞外へ空間への輸送を指図するシグナル配列
を用いて発現されるのが好ましい。本発明の第一の見地
によれば、ＦVIII−ＨＣはＣ末端延長部を有する融合タ
ンパク質として発現されうる。延長部はＢドメインＮ末
端配列（これはトロンビンによる分解を許す）と相同の
ポリペプチド配列、アミノ酸３〜１００個のポリペプチ
ドスペーサーおよびＣ末端Ｂドメイン配列と相同の配列
からなる。ＦVIII−ＨＣのＣ末端延長の結果、真核生物
宿主細胞における発現時に活性ポリペプチドが高い収率
となる。本発明の第二の見地において、ＦVIII−ＨＣ
は、いかなるＣ末端延長部を有することなく正しいＣ末
端を有する真正な形で発現され、この場合さらに分解す
る危険性を含む後のトロンビン分解を避ける。ＦVIII−
ＬＣはシグナルペプチドを用いてＬＣポリペプチドとし
て発現されるのが好ましい。ＦVIII−ＬＣポリペプチド
はプロセッシングされ正しいＮ末端アミノ酸残基および
正しいグリコシル化を有して効率的に分泌される。適当
な宿主細胞中でＦVIII−ＨＣおよびＦVIII−ＬＣをコー
ドするポリヌクレオチドで同時トランスフェクションす
ると第VIII：Ｃ因子活性を有する組換体タンパク質複合
体が高収率で得られる。

【０００８】

【発明の実施の形態】ここで使用される用語ポリヌクレ
オチドとは、一本鎖もしくは二本鎖（ｓｓもしくはｄ
ｓ）でもよいＤＮＡもしくはＲＮＡの配列またはＤＮＡ
−ＲＮＡヘテロニ重鎖に関するものである。

【０００９】ここで使用される用語「シグナルペプチ
ド」とは、ポリペプチド発現の間にシグナルペプチダー
ゼにより認識されそして作用されるペプチド配列に関す
るものである。シグナルペプチドはシグナルペプチダー
ゼ分解に対するペプチド部位をコードし、そして接続す
るポリペプチドを細胞外の基質へ導びく分泌経路へ輸送
させる。

【００１０】用語「Ａドメイン」は、Ｍｒ９２Ｋタンパ
ク質サブユニットを構成するヒト第VIII：Ｃ因子の当該
部分に関する。Ａドメインは約７４０〜７６０個のアミ
ノ酸を含み、天然ヒト第VIII：Ｃ因子のＮ末端に見出さ
れる。Ａドメインポリペプチドはアミノ酸１０個通常は
アミノ酸１個から少なくともアミノ酸約６２０個通常は
少なくともアミノ酸約６７５個さらに通常は少なくとも
アミノ酸約７４０個まで延長するであろう。ポリペプチ
ドはＡドメインの少なくとも約８５％（ウッドら、前
出）、さらに通常は少なくとも約９０％、好ましくは約
１００％を含み、そして場合によりＢドメインのＮ末端
の一部を含んでもよく、一般にはアミノ酸約１４０５を
越えない。特に興味があるのは、Ａｒｇ７４０−Ｓｅｒ
７４１に血栓崩壊分解部位に対する完全配列を有するＮ
末端鎖である。

【００１１】用語「Ｂドメイン」は、細胞内分解により
一般に除去されそしてたとえばＣＯＳ７およびＣＨＯの
ような哺乳動物細胞中で発現された場合高度にグリコシ
ル化される天然ヒト第VIII：Ｃ因子の当該部分に関す
る。ＢドメインはトロンビンによるＢドメインからＡド
メインの分解を許すＮ末端配列を含む。Ｂドメインはま
た哺乳動物細胞のゴルジ装置に位置する酵素によりＡ−
Ｂ前駆体からＣドメインを分解させるＣ末端プロセッシ
ング部位を有する。Ｎ末端およびＣ末端配列の配列は以
下の実施例において説明される。「Ｂドメインのほとん
どのタンパク質」が欠ける本発明の複合体は、Ｎ末端お
よびＣ末端を除いてＢドメインのほとんどすべてを欠い
ている。

【００１２】用語「Ｃドメイン」は標準長さのタンパク
質のＣ末端を構成し細胞内部で分解して第VIII：Ｃ因子
のＬ鎖を形成する天然ヒト第VIII：Ｃ因子の当該タンパ
ク質に関する。Ｌ鎖は第VIII：Ｃ因子ポリペプチドのＣ
末端のアミノ酸配列とほとんど同じ、一般的には第VII
I：Ｃ因子Ｍｒ８０Ｋ鎖の少なくとも約８０％さらに一
般的には少なくとも約９０％のアミノ酸配列を有し、特
にアミノ酸１５７０、一般的にはアミノ酸１６００、特
にアミノ酸１６２５、より特にアミノ酸１６４０、好ま
しくは約アミノ酸１６４９、±１０アミノ酸より特に±
アミノ酸で開始し少なくとも約アミノ酸２３００、一般
的には２３１０、±１０アミノ酸、好ましくは２３２
５、±５アミノ酸、より好ましくは末端アミノ酸（２３
３２）で開始するものである。一般的には、Ｌ鎖はＣ１
−Ｃ２ドメイン、好ましくはＡ３−Ｃ１−Ｃ２ドメイン
の少なくとも約８５％、さらに一般的には少なくとも９
５％を有するであろう。

【００１３】ここで使用される用語「同時−発現」は、
同じ宿主細胞中におけるＡドメインポリペプチドとＣド
メインポリペプチドの同時発現に関する。ＡおよびＣド
メインをコードするポリヌクレオチド配列は同一または
異なった発現カセットまたはプラスミド上にある。Ａお
よびＣドメインの同時発現は正しい折りたたみを生じる
ことになり、その結果より高い活性と分泌効率を有する
Ａ−Ｃ複合体を提供する。

【００１４】ここで使用する用語「細胞増殖培地」と
は、宿主細胞を培養するのに適するいずれかの培地に関
するものであり、実際に細胞「増殖」を生ずるか否かに
かかわらず組換体生成物の発現を得るために適する培地
を含む。細胞増殖培地は一般に水溶液中に栄養素および
代謝可能なエネルギー源を含む。所望により、細胞増殖
培地はまた本発明の組換体ポリペプチドの発現を引き起
す化合物をも含む。このような誘因化合物の選択は発現
を調節するために選択されたプロモーターにしたがう。
他の代表的添加物は選択化合物（すなわち、形質転換さ
れた宿主細胞だけが培地中で生き残ることを確実にする
ために培地へ添加される薬品または他の化学品）および
血清たとえばウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含む。「血清不
含有培地」は、血清中に存在する必須の徴量因子を血清
の形で添加される必要のない程度まで供給された溶液で
ある。市販されているものから入手可能な多くの適当な
細胞増殖培地がある。

【００１５】用語「ポリペプチドスペーサー」はアミノ
酸約３〜約１００のポリペプチド配列に関し、これはヒ
ト第VIII：Ｃ因子Ｂドメインと一般には相同でなく、そ
してＮ−結合グリコシル化の滞在的部位を５個より少な
く有するものである。好ましくはこのような部位が２個
以下である。現在、Ｂドメインのグリコシル化の大きな
寸法および高程度がＭｒ９２Ｋポリペプチドの効果的発
現を妨害すると信じられている。また、ＡドメインはＢ
ドメインの不存在下で一定の塩基に正しく折り込まれず
このためＡドメインのわずかなパーセントだけが正しく
折り込まれそして発現されるとも信じられている。

【００１６】本発明の第一の見地によるポリペプチドス
ペーサーはＡドメインに対しＣ末端延長部を提供し、明
らかにポリペプチドを安定化しそして活性形での分泌を
向上する。すなわち、軽くグリコシル化された（または
全くされない）ポリペプチドを使用することで標準長さ
の第VIII：Ｃ因子の発現を遮る同じサイズ問題にＡドメ
イン−スペーサー構築物が遭遇することを妨げるであろ
う。現時点で好ましいスぺーサーは、ヒトＩｇＨ鎖ヒン
ジ特にヒトＩｇＡ１から由来するものである。このスペ
ーサーは免疫原性エピトープを添加することなく（ヒト
に投与した場合）、フレキシブルな延長部をもたらす。
本発明の第二の見地によれば、Ｂドメインが完全に除か
れたＭｒ９２ＫポリペプチドをＭｒ８０Ｋ鎖と一緒に同
時発現した場合非常に高くそして有効な凝固活性が得ら
れうる。

【００１７】ここで使用されうる用語“相同”とは２つ
のポリヌクレオチドまたは２つのポリペプチドの間が同
一であるかまたはほとんど相似であることを意味する。
一般的には、鎖における通常１０％以下、さらに通常５
％以下、好ましくは約１％以下のアミノ酸数が第VIII：
Ｃ因子ＡおよびＣドメインに天然に存在するアミノ酸と
異なる。特に、約５％以下、さらに通常約１％以下が非
伝統的置換基である。伝統的置換基には次のようなもの
が含まれる：

【００１８】

【化１】 非伝統的変化は、前記アミノ酸の１つを異なった基から
のアミノ酸で置換すること（たとえばＧｌｕに対しＡｓ
ｎを置換すること）または前記アミノ酸のいずれかに対
しＣｙｓ，Ｍｅｔ，ＨｉｓまたはＰｒｏを置換すること
である。

【００１９】本発明タンパク質複合体の用語「十分量」
とは、天然ヒト第VIII：Ｃ因子で治療可能な疾患を有す
る患者の治療に効果を及ぼすことのできるタンパク質の
量に関する。一般に、本発明のタンパク質複合体は天然
ヒト第VIII：Ｃ因子とほぼ同じ活性であり、そして同様
の量で投与されうる。本発明タンパク質複合体の比活性
は以下に記載のように当該技術で公知の手段により（た
とえば市販されているコアテスト分析（Coatest assa
y）を用いて）測定される。

【００２０】用語「有効濃度」とは、適当な形質転換条
件下で宿主細胞を形質転換しうる発現カセットの濃度に
関する。

【００２１】ＤＮＡ構築物は一般に本発明ポリペプチド
の発現に使用されうる。ポリヌクレオチド構築物の各々
は転写の５’−３’−方向に、転写開始および翻訳開始
領域、シグナルペプチド配列をコードする配列からなる
領域をコードする構造遺伝子および第VIII：Ｃ因子Ｈま
たはＬ鎖をコードする配列と、それに続く翻訳および転
写終結配列を有する。たとえばこれらの特定要素の選択
は当該技術の知識の範囲内である。

【００２２】開始領域は転写および翻訳の開始に関連す
る多数の異なった配列からなる。これらの配列はエンハ
ンサー配列、ＲＮＡポリメラーゼ結合部位、ＲＮＡキャ
ッピング部位、リボソーム結合および翻訳開始部位等を
含む。転写開始領域は第VIII：Ｃ因子と結合する天然領
域であるか、またはより高度の転写効率を提供する代わ
りの配列である。配列は哺乳類ウィルスまたは宿主細胞
の遺伝子もしくは異なった哺乳動物宿主からの遺伝子か
ら得られ、これらは宿主細胞中で活性である。多数の転
写開始領域が単離され哺乳動物宿主細胞中で操作可能で
あることを示す。これらの領域には、ＳＶ４０初期プロ
モーターおよび後期プロモーター領域、アデノウィルス
主要後期プロモーター領域、アクチンプロモーター領
域、サイトメガロウィルスＭｒ７２Ｋ即時型初期タンパ
ク質プロモーター領域、メタロチオネインプロモーター
等が含まれる。

【００２３】終結領域には３’−非翻訳配列、ポリアデ
ニル化シグナル配列等が含まれる。終結領域は第VIII：
Ｃ因子天然ｃＤＮＡの３’非翻訳配列から得られるか、
または５’−開始領域を得た同じ構造遺伝子または異な
った構造遺伝子から得られうる。３’−領域は開始領域
のように転写レベルに対し必須であるというわけではな
く、このためその選択は特定の選択より便利さの問題で
ある。

【００２４】構造遺伝子には代表的にはプロセッシング
および成熱のために小胞体の内腔ヘポリペプチドを向か
わせるシグナルペプチドをコードするリーダー配列が含
まれる。場合によりエンドペプチダーゼにより翻訳後プ
ロセッシングされるプロペプチドをコードする追加の配
列が含まれてもよく、ここでエンドペプチダーゼはペプ
チド結合を分解し、プロペプチドを除去して成熟ポリペ
プチドを生ずる。シグナルペプチドは天然産生のもので
よく、Ｎ末端ペプチドに対しては特にそうであり、また
はポリペプチドのプロセッシングおよび成熟をもたらす
いずれのシグナルペプチドでもよい。

【００２５】様々なシグナルペプチドが文献に報告され
ており、たとえば組織プラスミノーゲンアクチベータ
ー、免疫グロブリンＨ鎖およびＬ鎖、ウィルス膜糖タン
パク質たとえば単純ヘルペスウィルス糖タンパク質ｇＢ
およびｇＤ、α₁−抗トリプシン等が含まれる。α₁−抗
トリプシンシグナルペプチドは、正しいＮ末端を有する
ペプチドの高いレベルの発現のためにＦVIII−ＬＣポリ
ペプチドの分泌に現在のところ必要である。

【００２６】成熱タンパク質およびシグナルペプチドを
コードするＤＮＡ配列はリーディングフレームにあるよ
うに結合されなければならない。使いやすい制限部位が
利用できる場合、付着末端またはブラントエンドを正し
く結合してもよい。しかしながら、ほとんどはアダプタ
ーを使用してここでコード配列の一部を合成アダプター
中に再形成し切断構造遺伝子および／または切断シグナ
ル配列をアダプターを介して結合し、これにより正しい
リーディングフレームにあるようにする。シグナル配列
および構造遺伝子の部分的制限地図を作り、制限部位特
に独特の制限部位を同定してもよく、これを用いて適当
なアダプターにより正しいリーディングフレームに２つ
の配列を一緒に連結する。これに代わり、独特の制限部
位をシグナル配列と成熱ポリペプチドコード配列の接合
部にインビトロ突然変異誘発により挿入してもよい。

【００２７】翻訳開始および停止シグナルは、翻訳開始
のための開始コドンおよび翻訳終結のための１つ以上の
停止コドンを備える構造遺伝子の一部であるのが普通で
ある。開始コドンはシグナル配列の第一のコドンであろ
う。停止コドンは終結領域の一部として適当に加えられ
るかまたは完全な終結領域を準備するための転写終結領
域へ連結するための都合の良い３’末端を提供するため
にコード領域へ加えられる。

【００２８】様々な発現カセット、（転写および翻訳開
始領域核酸配列、ポリペプチドの１つをコードする構造
遺伝子核酸配列および開始領域の転写および翻訳対照
物、およびｍＲＮＡを翻訳終結のプロセッシングを調節
する転写および翻訳終結領域）は特定のヌクレオチド配
列を同定するが、これを常法により結合してもよい。通
常、得られた配列は制限部位を含むかまたは成分部位を
含むように修飾され、次いで相補的オーバーハングまた
は付着末端が存在する場所でアニールする。修飾はしば
しば所望の付着末端を提供するためのリンカーの導入に
より非コード領域にある。宿主細胞が必要な結合をもた
らすとはいえ、宿主細胞導入前に末端を結合するのが一
般的である。

【００２９】発現カセットを特定の目的で様々な他の配
列と連結してもよい。分泌される糖タンパク質の量の増
幅が所望の場合、ＦVIII：Ｃの発現カセットを適当な処
置により遺伝子のコピー数の自然増加が選択される遺伝
子に連結される。このような遺伝子にはヒトメタロチオ
ネイン遺伝子およびマウスジヒドロ葉酸レダクターゼ遺
伝子が含まれる。これらの遺伝子はこれら自体の転写お
よび翻訳調節配列を有するカセットに置かれる。重金属
イオンＣたとえばカドミウム）またはメトトレキセート
の濃度増加に耐性の細胞クローンを選択することによ
り、興味ある遺伝子（発現カセット）が宿主細胞中で同
時増殖する。

【００３０】対象となる発現カセットは宿主細胞におい
て機能する複製システムからなるベクターの一部であ
り、この複製システムは宿主細胞への発現カセットの安
定なエピソーム維持または取込みをもたらす。ベクター
は、ＤＮＡ構築物およびベクターを欠失するこれらの宿
主細胞からＤＮＡ構築物およびベクターを含む哺乳動物
宿主細胞を選択するための選択マーカーからなる。

【００３１】広い範囲の複製システムが利用可能であり
一般には哺乳動物宿主細胞に感染するウィルスから由来
するものである。代表的複製システムにはサルウィルス
（Simian virus）40、アデノウィルス、ウシ乳頭ウィル
ス、ポリオーマウィルス、エプスタインバールウィルス
等からの複製システムが含まれる。

【００３２】原核細胞宿主細胞におけるベクターの増殖
を可能にする選択マーカーは、生物致死剤特に抗生物質
に対する耐性、または原栄養株宿主を提供するための栄
養要求変異株の相補性を含む。マーカーとして興味深い
特定遺伝子はカナマイシン耐性遺伝子（ＮＰＴＩＩ）、
クロラムフェニコール耐性遺伝子（ＣＡＴ）、ペニシリ
ナーゼ（β−ラクタマーゼ）等を含む。

【００３３】ベクターは通常環状であり、ベクターへの
発現カセットの段階的または完全な物としての挿入を許
す１つ以上の制限部位を有する。しばしば、ベクターは
細菌性複製および選択システムを含み、これはそれぞれ
の手作業工程の後でのクローニングを考慮している。こ
の方法では、各段階における比較的多量の構築物を調製
し、単離し、精製し、正しい結合が起こっていることを
証明するために試験し、そして次工程に使用する。

【００３４】調節配列および複製システムが機能する様
々な哺乳動物宿主細胞を使用することができる。このよ
うな細胞にはＣＯＳ７細胞、チャイニーズハムスター卵
巣（ＣＨＯ）細胞、マウス腎細胞、ハムスター腎細胞、
ＨｅＬａ細胞ＨｅｐＧ２細胞等が含まれる。

【００３５】所望ポリペプチドの発現カセットは１つの
核酸鎖に一緒に連結するかまたは別々の核酸分子に準備
される。発現カセットは異なったベクターの一部または
同じベクターの一部でよい。特定のベクターの状況にお
いて構築のいずれの方法も好ましいとはいえ、主には便
宜性の点である。

【００３６】発現ベクターは複製欠失レトロウィルスで
もよい。エス．エフ．ユー（S.F.Yu）ら、Proc Nat Aca
d Sci USA(1986)83:3194-98には自己不活性（”ＳＩ
Ｎ”）レトロウィルス遺伝子トランスファーベクターの
構築について記載されている。ＳＩＮベクターは３’Ｌ
ＴＲのＵ３領域からのプロモーターおよびエンハンサー
配列を欠失することにより作られる。５’ＬＴＲにおけ
る官能性Ｕ３領域は適当にパッケージした細胞系におけ
る組換体ウィルス性ゲノムの発現を許す。しかしなが
ら、そのゲノムＲＮＡの発現およびｃＤＮＡへの逆転写
時に、本来のプロウィルスの５’ＬＴＲのＵ３領域が欠
失しそして３’ＬＴＲのＵ３領域が置換される。したが
って、ＳＩＮベクターが組込むと、非官能性３’ＬＴＲ
Ｕ３領域が官能性５’ＬＴＲ Ｕ３領域に代わり、そし
てウィルスが標準長さのゲノム転写物を発現できなくな
る。

【００３７】発現カセットを常法により宿主細胞へ導入
する。ＤＥＡＥ−デキストランの存在下にリン酸カルシ
ウム沈殿ＤＮＡまたはＤＮＡを形質転換に使用するのが
好ましい。ポリヌクレオチドトランスフェクションに特
に有用な合成脂質はＮ−〔１−（２，３−ジオレイルオ
キシ）プロピル〕−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウ
ムクロリドであり、これは名称リポフェクチン（Lipofe
ctin）登録商標（BRL．ガイサースブルク（Gaithersbur
g）、MD）として市販されており、ピィ．エル．フェル
ガナー（P.L.Felgner）ら、Proc Nat Acad Sci USA(198
7)84:7413により記載されている。ウィルスが関連する
場合、トランスフェクションまたは形質導入を使用して
もよい。宿主細胞を形質転換する特定の方法は本発明に
とって重要ではなく、ほとんど発現カセットが複製シス
テムに結合するかどうかおよび複製システムならびに関
連する遺伝子の性質による。

【００３８】形質転換／トランスフェクション細胞を適
当な普通培地で増殖する。２つのＦVIII：Ｃ鎖の複合体
として生成物が得られ、培地または細胞溶解物を単離
し、第VIII：Ｃ因子活性複合体を抽出し精製する。抽出
および精製のために様々な手段が利用でき、たとえばア
フィニティクロマトグラフィ、イオン交換クロマトグラ
フィ、疎水クロマトグラフィ、電気泳動、溶媒−溶媒抽
出、選択的沈降、等である。生成物を単離する特定の方
法は本発明で特に重要というわけではなく、変性および
不活化を最小限にし高純度活性生成物の単離を最大にす
るために選択される。

【００３９】組成物は、Ｃｏａｔｅｓｔ法における組成
物が活動度少なくとも０．０２Ｕ／ml、通常は少なくと
も約０．２、さらに通常少なくとも約０．５Ｕ／mlの活
動度を有するように準備される。問題となる生成物は、
抗体特にＦVIII−ＬＣに対するモノクローナル抗体を用
いたアフィニティクロマトグラフィ、電気泳動、抽出、
ＨＰＬＣ等により精製されうる。

【００４０】問題となる方法は第VIII：Ｃ因子活性を有
するＨ鎖およびＬ鎖の複合体の製造を提供する。実験の
章で記載したように状態調節した培地により製造が明ら
かになり、これはＣｏａｔｅｓｔ分析において第VIII：
Ｃ因子活性少なくとも約５０、通常は約７０mU／ml、さ
らに通常約３００mU／mlを有する。

【００４１】本発明により作られる第VIII：Ｃ因子活性
の複合体は、抗体製造のための免疫原として、アフィニ
ティクロマトグラフィによるフォンウィレブランド因子
の単離のため、第VIII：Ｃ因子に対する診断分析のた
め、および血友病患者その他の血液凝固疾患を有する患
者の治療に対する様々な用途を有する。問題となるタン
パク質複合体を、生理学的に許容されうる担体たとえば
水、食塩水、リン酸緩衝化食塩水、およびクエン酸緩衝
化食塩水中で、約１０〜２００Ｕ／mlの濃度範囲にて投
与することができる。投与方法および量については米国
特許第3631018号；第3652530号および第4069216号を参
照せよ。他の通常の添加剤もまた含まれる。

【００４２】以下に示す例は当該技術において通常の知
識のある者に対するさらに進んだ案内を提供するもので
あり、いずれにしても本発明を制限するものではない。

【００４３】

【実施例】以下に示す例は当該技術において普通の知識
を有する実施者に対する案内として準備されたもので、
いかなる方法でも本発明を制限するように構成されるも
のではない。

【００４４】例１．（発現プラスミドの調製） （Ａ）ｐＳＶ７ｄ 発現カセットを哺乳動物細胞発現ベクターｐＳＶ７ｄ
（２４２３bp）を用いて調製した。

【００４５】プラスミドｐＳＶ７ｄ（トゥレットら、前
出）を以下のように構築した。ＳＶ４０オリジンまたは
複製物および初期プロモーターを含む４００bp Ｂａｍ
ＨＩ／ＨｉｎｄIIIフラグメントをｐＳＶｇｔＩ（ポー
ルベルク、カリフォルニア、スタンフオードユニバーシ
ティから入手）から切り取りそして精製した。ＳＶ４０
ポリＡ添加部位を含む２４０bp ＳＶ４０ ＢｃｌＩ／
ＢａｍＨＩフラグメントをｐＳＶ／ＤＨＦＲ（スブラマ
ニ（Subramani）ら、Molec andCell Biol(1981)1:854-8
64）から切り取り精製した。以下のリンカーを介してフ
ラグメントを融合した：

【００４６】

【化２】 このリンカーはすべての３つのリーディングフレームに
おいて５つの制限部位とならびに停止コドンを含む。得
られた複製のＳＶ４０オリジン、ＳＶ４０初期プロモー
ター、停止コドンを有するポリリンカーおよびＳＶ４０
ポリアデニル化部位を含む６７０bpフラグメントをｐＭ
Ｌ、約１．５Kb欠失を有するｐＢＲ３２２誘導体（ラス
キー（Lusky）およびボッチャン（Botchan）、Cell(198
4)36:391）のＢａｍＨＩ部位ヘクローン化してｐＳＶ６
を得た。ｐＳＶ６のｐＭＬ配列におけるＥｃｏＲＩおよ
びＥｃｏＲＶ部位をＥｃｏＲＩおよびＥｃｏＲＶで消化
することにより排除し、Ｂａｌ３１ヌクレアーゼで処理
して各末端において約２００bpを除去し、最後に再連結
するとｐＳＶ７ａが得られる。Ｂａｌ３１再切断部はま
た、ＥｃｏＲＶ部位からほぼ２００bp離れているＳＶ４
０領域を側面に有する１つのＢａｍＨＩ制限部位を削除
した。第二のＳＶ４０領域を側面に有するＢａｍＨＩ部
位を削除するために、ｐＳＶ７ａをＮｒｕＩで消化し、
これを複製の起点から上流のｐＭＬ配列においてカット
する。これをブラントエンド連結により再度環化してｐ
ＳＶ７ｂが得られた。

【００４７】ｐＳＶ７ｃおよびｐＳＶ７ｄは連続したポ
リリンカー置換を表わす。第一に、ｐＳＶ７ｂをＳｔｕ
ＩおよびＸｂａＩで消化した。次いで、以下のリンカー
をベクターへ連結してｐＳＶ７ｃを得た：

【００４８】

【化３】 その後、ｐＳＶ７ｃをＢｇｌIIおよびＸｂａＩで消化
し、次いで以下のリンカーと連結してｐＳＶ７ｄを得
た：

【００４９】

【化４】

【００５０】（Ｂ）ｐＳＶＦ８−９２ ｐＳＶＦ８−９２はＭｒ９２Ｋ ＦVIII−ＨＣ鎖に対す
る発現プラスミドである。ポリリンカーｐＳＶ７ｄにお
けるＢａｍＨＩ部位から出発して、ｐＳＶＦ８−９２
は、第VIII：Ｃ因子ｃＤＮＡのヌクレオチド−３０〜＋
１４をコードするＢａｍＨＩからＳａｃＩまでの４９bp
合成リンカー−アダプター分子（翻訳開始部位の最初の
Ａから数える；配列を以下の（Ｄ）に示す）、以下に記
載するｐＳＶＦ８−２００に含まれる第VIII：Ｃ因子Ｄ
ＮＡからのＨｉｎｄIIIフラグメントまでの２２６７bp
ＳａｃＩ（ヌクレオチド＋２２８１まで）およびＨｉ
ｎｄIIIからＢａｍＨＩまでのｐＳＶ７ｄからなる。

【００５１】（Ｃ）ｐＳＶＦ８−８０ ｐＳＶＦ８−８０はＭｒ８０Ｋ ＦVIII−ＬＣ鎖に対す
る発現プラスミドである。ポリリンカーｐＳＶ７ｄにお
けるＳａｌＩ部位から出発して、ｐＳＶＦ８−８０は、
ヌクレオチド−９８〜＋１０３（出発コドンと比較し
て）であってＢｇｌII部位で終結する組織プラスミノー
ゲンアクチベーターｃＤＮＡの２０１bpフラグメント
（ｔＰＡ配列はエス．ジェイ．エフ．デギャン（S.J.F.
Degan）ら、J.Biol.Chem(1986)261:6972-6985）に記載
されている）と、インビトロ突然変異誘発（ゾラー（Zo
ller）およびスミス（Smith）、Meth Enzymol(1983)10
0:468)(pF8GM7)を介した第VIII：Ｃ因子ｃＤＮＡのヌク
レオチド５０２８に作り出されたＢｃｌＩ部位からヌク
レオチド７４９２にある３’非翻訳領域におけるＢｃｌ
Ｉ部位にわたる第VIII：Ｃ因子の２４６４bp ＢｃｌＩ
フラグメントに連結した第VIII：Ｃ因子のヌクレオチド
＋５００２〜＋５０３１をコードする２９bpの合成Ｂｃ
ｌII−ＢｃｌＩリンカーアダプターと、およびｃＤＮＡ
クローニングから生ずるＢｇｌII部位から合成ＰｓｔＩ
部位にわたるｔＰＡ３’非翻訳配列の４００bpフラグメ
ントと、それに続くベクターＭ１３ｍｐ９（ヴイエイラ
（Vieira）およびメシング（Messing）、Gene(1982)19:
259）からのポリリンカーと次いでｐＳＶ７ｄとからな
る。

【００５２】（Ｄ）ｐＳＶＦ８−２００ ベクターｐＳＶＦ８−２００は標準長さの第VIII：Ｃ因
子ｃＤＮＡに対する発現プラスミドである。プラスミド
ｐＳＶＦ８−２００（トゥレットらに記載）は完全な第
VIII：Ｃ因子ｃＤＮＡコードと３’非翻訳配列をｐＳＶ
Ｆ８−９２について上記で記載したのと同じ５’非翻訳
配列とともに含むものであり、以下のように調製した。

【００５３】プラスミドｐＳＶ７ｄをＢａｍＨＩで消化
してＳＶ４０初期プロモーターの下流のポリリンカー領
域において切断した。５’非翻訳領域の最後の３０bpと
ヒト第VIII：Ｃ因子コード配列の最初の１５bpをコード
する以下の４９bpＢａｍＨＩ−ＳａｃＩリンカーアダプ
ターを化学的に合成しｐＳＶ７ｄに連結した。

【００５４】

【化５】 この連結されたプラスミドを次いでＳａｃＩで消化して
過剰のリンカーを除去しそしてＳａｌＩで消化してＳａ
ｃＩ突出部を作った。

【００５５】フラグメント１、ヒト第VIII：Ｃ因子の
５’コード領域を含むｐＦ８−１０２からの２．９ＫＳ
ａｃＩフラグメントおよびフラグメント２、因子の３’
コード領域を含むｐＦ８−６．５からの６．５ＫＳａｃ
Ｉ−ＳａｌＩフラグメントおよびリンカーアダプターを
含むｐＳＶ７ｄ修飾ベクターを一緒に連結した（トゥレ
ットら、前出参照）。この連結混合物を用いて大腸菌
（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＨＢ１０１を形質転換し、アンピシリ
ン耐性によりコロニーを選択した。

【００５６】プローブとしてＢａｍＨＩ−ＳａｃＩ５’
アダプターまたは２．９ＫＳａｃＩフラグメントを用い
てコロニーフィルターハイブリダイゼーションにより３
００個の形質転換体をスクリーンした。両方のプローブ
で陽性のコロニーを制限マッピングにより分析した。プ
ラスミドｐＳＶＦ８−２００はヒト第VIII：Ｃ因子遺伝
子の完全コード領域およびＳＶ４０初期プロモーターに
対し転写方向で正しく融合した５’非翻訳領域を含むも
のであるが、これが得られた。

【００５７】（Ｅ）ＣＯＳ７細胞のトランスフェクショ
ンおよび培養 上記したプラスミドを、１４時間プラスミドＤＮＡ５０
μｇ／５×１０⁵細胞を用いて、クロロキニンジホスフ
ェートを用いた処理（ルスマン（Luthman）およびマグ
ヌッソン（Magnusson）、NucAcid Res(1983)11:1295-13
08）と合わせてリン酸カルシウム共沈法（ファンデルエ
ブ（Van der Eb）およびグラハム（Graham）、Meth Enz
ymol(1980)65:828-39）を用いてＣＯＳ７細胞（グズマ
ン（Guzman）、Cell(1981)23:175）ヘトランスフェクシ
ョンした。細胞もまたソムパイラック（Sompayrac）お
よびダンナ（Danna）、Proc Nat AcadSci USA(1981)78;
7575-78のDEAE−デキストラン法によりトランスフェク
ションした。

【００５８】１０％ウシ胎児血清、１００Ｕ／mlペニシ
リン、１００μｇ／mlストレプトマイシン、２９２μｇ
／mlグルタミンおよび１１０μｇ／mlピルピン酸ナトリ
ウムを供給した。ダルベッコ変性イーグル培地にてＣＯ
Ｓ７細胞を培養した。トランスフェクション後８８時間
での血清含有培地の４８時間採集からサンプルを得た。

【００５９】（Ｆ）分析 トランスフェクション後一定間隔をおいて、培地を細胞
から除き、アリコートを−７０℃で貯蔵した。標準的凝
結分析（ハーディスティ（Hardisty）ら、Thromb et Di
athesis Haemolog(1962)72:215）において、サンプルを
第VIII：Ｃ因子欠失血漿の延長された部分的トロンボプ
ラスチン時間を減少しうる能力について試験した。外因
的に供給された第VIII：Ｃ因子の濃度の線状関数として
活性化第Ｘ因子（Ｘａ）の発生を測定するものであるよ
り特異的コアテスト分析、（ローゼン（Rosen）ら、Thr
omb and haemostasis(1985)54:818-823）を用いて凝結
分析の結果を確かめた。免疫学的反応性第VIII：Ｃ因子
タンパク質の培地における濃度を、Ｍｒ９２Ｋポリペプ
チドを検出するために引き出された放射線免疫検定法
（ＲＩＡ）およびＭｒ８０Ｋポリペプチド（ノルドファ
ング（Nordfang）ら、Thromb and Haemostasis(1985)5
3:346）に対し特異的な酵素連結イムノソルベントアッ
セイ（ＥＬＩＳＡ）により測定した。

【００６０】第１表に示すように、Ｍｒ９２Ｋポリペプ
チドまたはＭｒ８０Ｋポリペプチド単独の発現は、個々
のタンパク質の各々が状態調節された培地において高い
レベルで存在したとしても何らの検出可能な活性を作ら
なかった。細胞をｐＳＶＦ８−９２およびｐＳＶＦ８−
８０プラスミドで同時トランスフェクションした場合、
培地は凝結活性約２０ｍＵ／mlを含有していた。完全第
VIII：Ｃ因子タンパク質をコードするプラスミドｐＳＶ
Ｆ８−２００でトランスフェクションした細胞により同
じ相対レベルの凝結活性が分泌された。

【００６１】ｐＳＶＦ８−９２およびｐＳＶＦ８−８０
単独でトランスフェクションしたものからの状態調節し
た培地を一緒に混合する（第１表に略記したように幾つ
かの異なった状態を用いる）と、何の活性も測定されな
かった。

【００６２】これらの結果は、第VIII：Ｃ因子のアミノ
およびカルボキシル末端ドメインの複合体が本来的凝結
活性を保持し、内部ドメインは別々の鎖からの活性複合
体の活性またはアッセンブリーのいずれに対しても必須
ではないことを示している。

【００６３】

【表１】 ａプラスミドは同じ細胞へ同時トランスフェクションさ
れた ｂプラスミドは別々の細胞へトランスフェクションさ
れ、48時間後に上清液を混合した。

【００６４】様々な混合条件をテストし、たとえば10mM
CaCl₂の存在または不存在下に37℃、20℃または４℃に
て２時間までの様々な時間予備インキュベーションする
等を行なった。この表における値は得られたデータの代
表的なものである。

【００６５】第１表において、凝結時間と活性を以下の
ようにして得た：指示されたプラスミドでトランスフェ
クションされたまたは偽物でトランスフェクションされ
たＣＯＳ７細胞の増殖により状態調節された培地７５μ
ｌのアリコートを、一段階分析により第VIII：Ｃ因子欠
失血漿の延長された部分的トロンボプラスチン時間を減
少する能力として分析した。簡単に言えば、プレートリ
ン（Platelin）（ジェネラル ダイアグノスティクス
General Diagnostics）７５mlを３７℃で３分間インキ
ュベートし、続いて第VIII：Ｃ因子欠失血漿７５μｌ＋
試験サンプル７５μｌをさらに添加し３７℃でさらに５
分間インキュベーションした。予め温めた０．０２５Ｍ
ＣａＣｌ₂のアリコート７５μｌを加え、凝結時間を
ベクトン−デイキンソン フィブロメーターで測定し
た。ＣＯＳ７細胞培地中で希釈した通常のヒト血漿を標
準物として使用した。活性１mUを第VIII：Ｃ因子タンパ
ク質約１００pgに相当すると仮定する（ファイ（Fay）
ら、Proc Nat Acad Sci USA(1982)79:7200）。

【００６６】第１表において、Ｃｏａｔｅｓｔ分析（カ
ビ（Ｋａｂｉ））を用いて第VIII：Ｃ因子の濃度の直線
状関数として活性化第Ｘ因子（Ｘａ）の発生を測定し
た。第Ｘａ因子の濃度を、第Ｘａ因子に対する合成ペプ
チド基質からのクロモゲンパラニトロアニリンのタンパ
ク質分解により測定する。５０mM トリス−ＨＣｌ、pH
７．３、０．２％ＢＳＡで希釈した普通のヒト血漿を標
準物として使用した。

【００６７】第１表におけるＲＩＡ分析のために、精製
したイヌ第VIII：Ｃ因子阻害ＩｇＧを0．１Ｍ炭酸ナト
リウム緩衝液pH９．８中３．５μｇ／mlの濃度で９６凹
部ポリスチレンミクロタイタープレート上の各凹所へ塗
布し、一晩３７℃でインキュベーションした。プレート
を０．１Ｍ ＮａＣｌ、０．０５％トゥイーン登録商標
２０で３回洗浄し、続いて両方とも０．０５Ｍイミダゾ
ール、０．１Ｍ ＮａＣ１、１％ウシ胎児血清アルブミ
ン、０．０５％トゥイーン登録商標２０、pH７．３で希
釈された試験培地サンプルおよびヨウ素化第VIII：Ｃ因
子Ｍｒ９２Ｋタンパク質の混合物でインキュベーション
した。第VIII：Ｃ因子Ｍｒ９２Ｋタンパク質を血漿から
単離し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび銀染色法により推定さ
れたように５０％以上が均質であった。室温で１６時間
インキュベーション後、プレートを洗いそして個々の凹
部における¹²⁵Ｉの量をガンマ計測器で測定した。凝結
活性０．５単位／mgの比活性を有する中程度に精製され
た市販の第VIII：Ｃ因子製剤（第VIII因子、ノルディス
ク（ＮＯＲＤＩＳＫ））を標準物として使用した。この
標準物をＷＨＯ第三国際第VIII：Ｃ因子標準物に対し基
準化した。我々はこの中程度に精製した標準物をＭｒ９
２ＫＲＩＡ活性／第VIII：Ｃ因子凝結活性比１を含むよ
うに定義した。

【００６８】第１表のＥＬＩＳＡ分析のために、精製さ
れたヒト第VIII：Ｃ因子−阻害ＩｇＧを０．１Ｍ炭酸ナ
トリウム、pH９．８中に濃度４．５μｇ／mlで９６凹部
ＰＶＣミクロタイター板の凹部へ塗布し、一晩３７℃で
インキュベートした。凹部を上述のように洗浄し、０．
１Ｍイミダゾール、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、１％ＢＳ
Ａ、０．０５％トゥイーン２０、pH７．３で希釈された
ヒト阻害ＩｇＧのペルオキシダーゼ抱合体Ｆ（ａｂ'）₂
フラグメントを添加して室温で１６時間最後にインキュ
ベーションした。ｏ−フェニレンジアミン溶液で色が発
現した。普通のヒト血清を標準物として使用した。

【００６９】観察された凝結活性が第VIII：Ｃ因子によ
るものであることを証明するために、第VIII：Ｃ因子に
特異的な抗体による阻害に対する凝結の感受性を測定し
た。分析の前に、状態調節した培地のアリコートを、普
通のヒト血清の希釈物の存在下にまたは第VIII：Ｃ因子
に対する阻害抗体の高い力価を発現した血友病患者から
の血清の希釈物の存在下に、３７℃で２時間予備インキ
ュベートした。第２表で示されるように、完全分子なら
びにＭｒ９２Ｋ−８０Ｋ複合体の活性は阻害血清により
特異的に減少した。Ｍｒ８０Ｋ種に結合する３つの異な
った阻害モノクローナル抗体を用いて同じ結果が得られ
た。阻害血清を用いて第VIII：Ｃ因子活性の阻害を以下
のように研究した：指示されたＣＯＳ７細胞状態調節化
培地１６０μｌを、ヒト第VIII：Ｃ因子阻害血清の１０
０倍希釈物２０μｌ（ベセスダ力価１５００単位）また
はプールした普通のヒト血清の同様希釈物または緩衝液
単独（５０mMイミダゾール、０．１Ｍ ＮａＣｌ、１０
０μｇ／ml ＢＳＡ pH７．３）を用いて３７℃で２時
間インキュベートした。次いでこれらのサンプルを上記
で概略した残留凝結活性について分析した。

【００７０】

【表２】

【００７１】モノクローナル抗体を用いて阻害実験を以
下のように繰り返した：状態調節した培地１００μｌ
を、ハイブリテッヒ（Ｈｙ−ｂｒｉｔｅｃｈ）からの抗
−第VIII：Ｃ因子モノクローナル抗体の１μｇ／μｌ溶
液１０μｌ（ベセスダ力価１４，０００単位）または緩
衝液のいずれかを用いて３７℃で２時間インキュベート
し次いで上述のように分析した。結果を第３表に示す。

【００７２】

【表３】

【００７３】二本鎖複合体の存在をより明らかにするた
めに、Ｍｒ８０Ｋタンパク質に特異的なＭＡｂカラム上
を通過させることにより活性種を部分的にＣＯＳ７細胞
培地から精製した。第４表に示すように、施こされた活
性の約６５％がカラムにより保持されこの結合物質の５
０％が活性形で溶出し最初の培地中５倍以上の濃度で溶
出した。すなわち、Ｍｒ８０Ｋ種にだけ特異的な抗体を
用いてアフィニティクロマトグラフィにより活性複合体
を単離することができる。セファロースＣＬ４Ｂに結合
した抗−８０Ｋモノクローナル抗体（５６ＩｇＧ）（ノ
ルデュファング（Nordfang）ら、Thromb Haemostasis(1
985)53:346）１００μｇを、全活性度６．２mU（ｐＳＶ
Ｆ８−９２およびｐＳＶＦ８−８０プラスミドで同時ト
ランスフェクションしたＣＯＳ７細胞から得られたＣｏ
ａｔｅｓｔ分析により測定）を含む培地１．４mlで２０
℃にて一晩インキュベートした。インキュベーション
後、スラリーをカラムヘかけ、流出するフラクションを
集めた。カラムを緩衝液Ａ（５０mMイミダゾール、０．
１Ｍ ＮａＣｌ、０．１％ナトリウムインシュリン、
０．２％ＮａＮ₃、pH７．３）３００μｌで洗浄し、次
いで緩衝液Ｂ（２．５Ｍ ＮａＣｌ、５０％エチレング
リコール、０．５Ｍイミダゾール、０．１Ｍ ＣａＣ１
₂、０．１％ナトリウムインシュリン、０．２％Ｎａ
Ｎ₃、pH７．３）３００μｌで溶出した。

【００７４】

【表４】

【００７５】ここで報告された結果より、９１８個のア
ミノ酸を含むかまたは完全なタンパク質の全体の約４０
％を含むリンカー（“Ｂ”）領域の発現は第VIII：Ｃ因
子活性にとって必要ではないということがわかる。個々
のＭｒ９２ＫおよびＭｒ８０Ｋ領域の同時発現の結果、
第VIII：Ｃ因子をコードする領域全体の発現から得られ
るものと匹敵する第VIII：Ｃ因子活性のレベルが得られ
る。これらのタンパク質はインビボで集まってカルシウ
ム橋により結合された活性複合体を形成する。この集合
体はＢ領域の存在を必要とせずそしてトランスに発現し
た二本の鎖に対し有効に生ずる。

【００７６】上記結果から、第VIII：Ｃ因子活性は各々
がそれ自身のシグナル配列を有する独立して発現したＮ
末端フラグメントおよびＣ末端フラグメントを直接作る
ことにより達成されうることが明らかである。したがっ
て、第VIII：Ｃ因子は、大きな前駆体をクローン化する
必要がなくそして第VIII：Ｃ因子活性をコードする配列
として使用されるので、より有効に得られうる。したが
って、標準長さの第VIII：Ｃ因子タンパク質の適正な成
熟に対する能力が欠けているかもしれない第VIII：Ｃ因
子の発現に細胞を使用しうる。

【００７７】例２．ｐＳＶＦ８−９２構築物を用いたＣ
ＯＳ７細胞におけるＭｒ９２Ｋタンパク質の発現は作ら
れたＭｒ８０Ｋタンパク質の量と比較して低かった。Ｍ
ｒ９２Ｋタンパク質は明らかにゴルジ経路中に保持され
および／または分解され、有効にプロセッシングされま
たは輸送されない。したがって、構築物をＭｒ９２Ｋタ
ンパク質のレベルを増加する試みで修飾した。以下の型
の修飾を行なった：第VIII：Ｃ因子遺伝子の５’非翻訳
配列における変化；異種５’非翻訳およびリーダー配列
の含有；および３’非翻訳配列における変化。これらの
構築を以下に要約する。

【００７８】（Ａ）５’−非翻訳領域修飾 プラスミドｐＳＶＦ８−９２Ｂ。このプラスミドはｐＳ
ＶＦ８−９２の誘導体であり、この中でｐＳＶＦ８−９
２の５’非翻訳配列の３０bpをヒト第VIII：Ｃ因子ｃＤ
ＮＡ（ヌクレオチド１〜１７１；トゥレットらの第８図
参照）の完全な５’非翻訳領域で置換し、Ｇ−Ｃ尾部を
欠失（部位特異的突然変異誘発）し、そして３つの塩基
が出発ＡＴＧ（＋１７２位、第８図、トゥレットら、前
出）において以下に示すように変化して、真核生物細胞
における有効なメッセージ翻訳のためのコザック（Koza
k）の好ましい配列と一致する： 第VIII:Ｃ因子： ＧＴＣＡＴＧ ＣＡＡ コザック コンセンサス ＡＣＣＡＴＧ Ｇ この変化はシグナルペプチドの二番目のアミノ酸をＧｌ
ｎからＧｌｕへ変化させることである。

【００７９】プラスミドｐＳＶＦ８−９２Ｅ。このプラ
スミドはｐＳＶ７ｄ５’から第VIII：Ｃ因子配列の誘導
されるポリリンカーをＳａｌＩ部位を除いて除去し、そ
して５’非翻訳領域におけるＡＴＧコドン（トゥレット
ら、前出による４１位）をインビトロ突然変異誘発によ
りＡＴＴへ変えるｐＳＶＦ８−９２Ｂの誘導体である。

【００８０】（Ｂ）異種５’配列プラスミドｐＳＶＦ８
−９２Ｇ、ＨおよびＩの添加。

【００８１】これらのプラスミドはｐＳＶＦ８−９２Ｂ
の誘導体であり、５’非翻訳領域ならびに天然第VIII：
Ｃ因子シグナル配列をヒト組織プラスミノーゲンアクチ
ベーター（ｔＰＡ）ｃＤＮＡからの類似領域で置換する
ものである。ｐＳＶＦ８−９２Ｇにおいて、ｔＰＡプレ
−プロ領域の最初の３５個のアミノ酸（シグナルおよび
プロー配列）を、Ｍｒ９２Ｋタンパク質の最初のアミノ
酸（アラニン）を置換したセリンを用いて第VIII：Ｃ因
子Ｍｒ９２Ｋを成熟するために結合する。ｐＳＶＦ８−
９２ＨにおいてｔＰＡプレ−プロ領域の最初のアミノ酸
３２個を結合して第VIII：Ｃ因子Ｍｒ９２Ｋタンパク質
を成熟する。ｐＳＶＦ８−９２Ｉにおいて、ｔＰＡプレ
−プロ領域の最初のアミノ酸２３個を結合して第VIII：
Ｃ因子Ｍｒ９２Ｋタンパク質を成熱する。ｔＰＡ配列は
ｐＳＶＦ８−８０に記載されたものと同じである。

【００８２】プラスミドｐＳＶＦ８−９２Ｊ。このプラ
スミドは、ｔＰＡ５’領域が単純ヘルペスウィルス（Ｈ
ＳＶ−１）ｇＤ５’非翻訳配列７５bpおよびＨＳＶ−１
ｇＤシグナル配列７５bpで置換されているｐＳＶＦ８−
９２Ｇの誘導体である。ｐＳＶＦ８−９２ＪもまたＡｌ
ａ→Ｓｅｒ置換が欠失している（アール．ジェイ．ワト
ソン（R.J.Watson）ら、Science(1982)218:381-384）。

【００８３】（Ｃ）３’非翻訳領域変化 プラスミドｐＳＶＦ８−９２Ｃ。このプラスミドは、Ｍ
ｒ９２Ｋコード領域がヒト第VIII：Ｃ因子ｃＤＮＡの翻
訳ストップコドンおよび天然３’非翻訳配列に直接融合
したｐＳＶＦ８−９２Ｂの変形である。

【００８４】プラスミドｐＳＶＦ８−９２Ｌ。このプラ
スミドは、ｐＳＶＦ８−９２Ｃの３’非翻訳配列をｐＳ
ＶＦ８−８０の３’非翻訳領域で置換したｐＳＶＦ８−
９２Ｃの誘導体である。

【００８５】（Ｄ）結果 上記各Ａ−Ｃのプラスミドの各々を、例１に記載のｐＳ
ＶＦ８−８０および例１（Ｆ）に記載のような第VIII：
Ｃ因子活性を試験するための培地とともにＣＯＳ７細胞
へトランスフェクションした。

【００８６】最初に試験したｐＳＶＦ８−９２Ｂは、ｐ
ＳＶＦ８−９２より２〜８倍良い活性レベルを示した。
残りのプラスミドのうち、ｐＳＶＦ８−９２Ｅが最も良
くｐＳＶＦ８−９２Ｂよりも１．６５倍良好であること
が明らかであった。ｐＳＶＦ８−９２ＪおよびＩもまた
ｐＳＶＦ８−９２より実質的により高い発現レベルであ
り、ｐＳＶＦ８−９２Ｅと近似している。ｐＳＶＦ８−
９２Ｇの発現レベルはｐＳＶＦ８−９２とほぼ同じで、
一方ｐＳＶＦ８−９２ＨのそれはｐＳＶＦ８−９２より
かなり低かった。ｐＳＶＦ８−９２ＣとｐＳＶＦ８−９
２Ｌの発現レベルはｐＳＶＦ８−９２Ｅのそれと等しい
ようである。

【００８７】例３．本例はＭｒ９２Ｋ鎖とＢドメインの
部分からなるポリペプチドを作る構築物の調製について
記載する。これらの誘導体は、より安定でありそして／
またはＬ鎖との活性複合体を効率良く組立てるＨ鎖を発
生させる目的で作られる。第VIII：Ｃ因子の血漿由来製
剤中および標準長さの組換体第VIII：Ｃ因子を発現する
細胞からの細胞溶解物および状態調節した培地中で観察
された分子種を模倣するように誘導体を選択する。ほぼ
同じサイズのポリペプチドが標準長さのトロンビン分解
により多分生じるであろう。

【００８８】（Ａ）pＳＶＦ８−９２Ｓ：このプラスミ
ドは９８２個のアミノ酸Ｈ鎖をコードするものであり、
Ｂドメインコード領域の最初のＳａｃＩ部位で分解する
ことにより標準長さのｃＤＮＡプラスミドｐＳＶＦ８−
３０２から調製された。オリゴヌクレオチドアダプター
を用いて、翻訳ストップコドンが付きそしてコード配列
を第一のＢｃｌＩ部位で開始する天然ヒト第VIII：Ｃ因
子非翻訳配列へ融合した。このプラスミドは天然ヒト第
VIII：Ｃ因子の最初の９７８個のアミノ酸とカルボキシ
末端での４個の置換アミノ酸残基をコードする。

【００８９】（Ｂ）ｐＳＶＦ８−１６０：このプラスミ
ドは１３２３個のアミノ酸Ｈ鎖を提供し、ｐＳＶＦ８−
２００と同じであるがしかしｐＳＶＦ８−９２Ｅの５’
非翻訳領域を有する標準長さのクローン（ｐＳＶＦ８−
３０３と命名）から調製された。ｐＳＶＦ８−３０３を
ＥｃｏＲＶとＳａｍＩで分解し、ブラントエンドを一緒
に連結してｐＳＶＦ８−１６０を形成した。このプラス
ミドは第VIII：Ｃ因子の最初の１３１５個のアミノ酸を
コードする。ベクターpＳＶ７ｄａポリリンカーの融合
の結果８個の置換アミノ酸がカルボキシ末端で加わる。

【００９０】（Ｃ）ｐＳＶＦ８−１７９０：このプラス
ミドは１４１６個のアミノ酸Ｈ鎖を提供し、これもまた
ｐＳＶＦ８−３０３から調製された。ｐＳＶＦ８−３０
３をＢｇｌIIで部分的に消化し、その結果得られる６８
１１bpフラグメントをゲル単離し、端部を一緒に連結し
てｐＳＶＦ８−１７０を形成した。このプラスミドは第
VIII：Ｃ因子の最初のアミノ酸１４０５個をコードし、
ベクターｐＳＶ７ｄのポリリンカーの融合のために１１
個のアミノ酸のカルボキシ延長部を有する。

【００９１】（Ｄ）ｐＳＶＦ８−１２０：このプラスミ
ドは１１０７個のアミノ酸Ｈ鎖を提供し、ｐＳＶＦ８−
３０３から調製された。プラスミドｐＳＶＦ８−３０３
をＡｐａＩで消化し、付着端をＴ４ポリメラーゼで満た
した。得られた分子をさらにＳａｍＩで消化し、ＤＮＡ
自体が連結しそして大腸菌ＨＢ１０１中で増殖した。こ
のプラスミドは第VIII：Ｃ因子のアミノ末端からの１１
０２個のアミノ酸とｐＳＶ７ｄポリリンカーによりコー
ドされるカルボキシ末端での追加の５個のアミノ酸をコ
ードする。

【００９２】（Ｅ）結果 各部Ａ−Ｄのプラスミドの各々を、例１に記載のｐＳＶ
Ｆ８−８０および例１に記載の第VIII：Ｃ因子活性につ
いて試験された培地とともにＣＯＳ７細胞へトランスフ
ェクションした。

【００９３】これらのプラスミドのすべてはｐＳＶＦ８
−９２Ｅのものと比較してかなり低い発現レベルを示し
た。しかしながら、興味深いことに、ｐＳＶＦ８−１６
０およびｐＳＶＦ８−１７０についてのＲＩＡ対Ｃｏａ
ｔｅｓｔ活性の比は約１．８であり、ｐＳＶＦ８−９２
Ｅについては７．２である。この結果はこれらのより長
いＨ鎖誘導体がより高い比活性を有し、すなわちこれら
がＭｒ９２Ｋ分子自体より一層効率良く活性なサブユニ
ット複合体を組立てるということを示唆している。ま
た、コアテスト活性に対する凝結活性の比は、Ｍｒ９２
Ｋが２．３であり完全な分子が１．３５であるのに比べ
て約１．７でＨ鎖が長くなると低くなり、このことはこ
れらのより長いポリペプチドがＭｒ９２Ｋ＋Ｍｒ８０Ｋ
複合体のものほど活性化されないということを示す。

【００９４】例４．本例は第VIII：Ｃ因子Ｍｒ９２Ｋ−
８０Ｋ鎖複合体を作る安定なＣＨＯ細胞系の調製につい
て記載する。

【００９５】（Ａ）プラスミドの調製 選択可能なマーカーをコードするネズミＤＨＦＲｃＤＮ
Ａを有するプラスミドｐＡｄ−ＤＨＦＲを、アデノウィ
ルス−２からの主要後期プロモーター（Ａｄ−ＭＬＰ、
マップ単位１６−２７．３）をハツカネズミＤＨＦＲｃ
ＤＮＡ（ジェン．エイチ ヌクバーグ（J.H.Nunberg）
ら、Cell(1980)19:355-64）の５’非翻訳配列と融合す
ることにより構築した。小さなｔ抗原遺伝子のイントロ
ンを含みそしてＳＶ４０初期領域転写終結領域を有する
初期転写単位の一部をコードするＳＶ４０ＤＮＡをｐＳ
Ｖ２−ネオ（サウザーン（Southern）およびベルグ（Be
rg）、J.Mol.Appl Gen(1982)1:327-41））から得、DHFR
cDNAの３’非翻訳端へ融合した。これらの三つの片を
ｐＢＲ３２２ヘサブクローンしてプラスミドｐＡｄ−Ｄ
ＨＦＲを得た。

【００９６】（Ｂ）ＣＨＯ細胞のトランスフェクション
および培養 ジヒドロフルオレートレダクターゼに対する非官能性遺
伝子を有するＣＨＯ−ＤＵＫＸ−Ｂ１１細胞（ウルラウ
ブ（Urlaub）およびカシン（Chasin）、Proc Nat Acad
Sci USA(1980)77:4216-4220）を、３つのプラスミド：
ｐＳＶＦ８−９２Ｃ、ｐＳＶＦ８−９２ＥまたはｐＳＶ
Ｆ８−８０、およびｐＡｄ−ＤＨＦＲのリン酸カルシウ
ム共沈を用い続いてグラハムおよびファンデルエブ（前
出）の方法およびウィグラー（Wigler）ら、Cell(1978)
14:725-731およびルイス（Lewis）ら、Somatic Cell Ge
net(1980)6:333-347に記載の変法にしたがってトランス
フェクションした。共沈物には各プラスミド１０μｇま
でが含まれていた。ヒポキサンチンおよびチミジンが欠
失した培地におけるＤＨＦＲ（陽性）表現型の発現につ
いて細胞を選択した。

【００９７】ＤＨＦＲ陽性クローンを単離しそして第VI
II：Ｃ因子活性を生ずるものを同定後、得られた細胞系
をメトトレキセート中で増殖してＤＨＦＲ遺伝子を増幅
し第VIII：Ｃ遺伝子を同時増幅した。濃度０．０２５〜
０．２μＭのメトトレキセートを含む培地に細胞を被覆
することにより選択を行なった。メトトレキセート耐性
クローンを再び第VIII：Ｃ因子活性について分析した。

【００９８】（Ｃ）分析法 これらＤＨＦＲ陽性クローンからの状態調節した培地
を、ノルドファンガ（Nordfang）ら、Thromb Haemostas
(1985)53:346-50の方法により第VIII：Ｃ因子Ｌ鎖免疫
反応性についてＥＬＩＳＡにより分析した。第VIII：Ｃ
因子Ｈ鎖免疫反応性は、アール．エル．ブルッケ（R.L.
Burke）ら、J.Biol Chem(1986)261:12574-78に記載され
たラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）を用いて評価した。
９２Ｋおよび８０ＫＭｒ糖タンパク質の同時発現により
形成される活性第VIII：Ｃ因子複合体を実施例１に記載
のＣＯＡＴＥＳＴ分析により測定した。

【００９９】（Ｄ）活性９２Ｋ−８０ＫＭｒ複合体を発
現するＣＨＯ系 第５表に、トランスフェクションに使用した３つのプラ
スミドすべての産生物を同時に発現する４つの独立した
ＣＨＯ細胞系を示す。第５表に示した第VIII：Ｃ因子活
性値は初期に観察されたものである。安定な細胞系によ
る糖タンパク質の発現は通常Ｔ−７５フラスコ培地中通
過後に向上する。この例は１０−Ｃ２系で見られ、最終
的に状態調節した培地１mlにつき第VIII：Ｃ因子活性２
００mUが得られた（第６表）。これらの安定な細胞系の
クローニングは、第VIII：Ｃ因子の独立して発現したＨ
およびＬ鎖が活性複合体を組立てチャイニーズハムスタ
ー卵巣細胞により分泌されうることを説明する。

【０１００】

【表５】

【０１０１】３つのプラスミドがＣＨＯ細胞の染色体へ
吸収されることは、第VIII：Ｃ因子発現を損失すること
なく多くの経路で第５表の細胞系が増殖しうるという事
実により示される。第VIII：Ｃ因子糖タンパク質の発現
がメトトレキセート選択により同時増殖しうる場合測定
することが必要であった。これら４つの細胞系のすべて
をメトトレキセートの幾つかの濃度における選択下に置
いた。耐性コロニー（増幅したＤＨＦＲ遺伝子）がａｃ
ｈ系について得られ、これらを第VIII：Ｃ因子活性につ
いてスクリーニングした。第VIII：Ｃ因子の発現はメト
トレキセート耐性１１−Ｄ５および１１−Ｄ６クローン
においては失なわれるかまたは変化しなかった。１０−
Ｃ２および８−Ｃ１から導かれるメトトレキセート耐性
クローンの間では第VIII：Ｃ因子の発現が変化する（第
６表参照）。

【０１０２】２２のメトトレキセート耐性８−Ｃ１クロ
ーンを検査し、そのうち１０についてのデータを第６表
に報告する。第VIII：Ｃ因子増幅の量がクローン間で変
化し、このことはサブユニット遺伝子のいずれか１つが
ＤＨＦＲカセットで同時増殖されるか、または両方とも
が増幅されるか、またはいずれもされないことを示唆す
る。これら４つの可能性としてクローン８Ｃ１−Ａ２、
８Ｃ１−Ｃ２および８Ｃ１−Ｃ５を記載する。同様に、
３０の１０−Ｃ２のメトトレキセート選択誘導体を評価
し、そのうち２０についてのデータもまた第６表に示
す。これらもまた活性スペクトルを有する。４つの異な
った同時−増幅の可能性の例としてクローン１０Ｃ２−
Ａ２、１０Ｃ２−Ｄ２、１０Ｃ２−Ｂ５および１０Ｃ２
−Ｃ６を記載する。

【０１０３】

【表６】

【０１０４】第６表に記載したＣＨＯ系の間では活性第
VIII：Ｃ因子複合体０．５Ｕ／mlを作るものがあり、こ
の値は普通のヒト血漿において見出される濃度の１／２
である。第VIII：Ｃ因子物質の分析および精製のため
に、第VIII：Ｃ因子ポリペプチドを発現するＣＨＯ細胞
系を実験室規模での発酵により増殖し組織培養液１〜２
Ｌを調製した。この物質の分析により、非増幅系からの
免疫反応性第VIII：Ｃ因子の約１０％〜２０％がＣＯＡ
ＴＥＳＴにおいて活性であることがわかる。増幅系にお
いて、活性物質の割合は全免疫反応性生成物の２％〜５
％まで低下する。このことは第VIII：Ｃ因子のＨ鎖およ
びＬ鎖のフラクションだけが集まって活性複合体を組立
てることを意味する。残りは遊離したサブユニットとし
てまたは分解した形で存在する。

【０１０５】プラスミドｐＳＶＦ８−９２およびｐＳＶ
Ｆ８−８０は１９８６年１月２４日付でアメリカンタイ
プカルチュアコレクション（ＡＴＣＣ）に寄託されそし
てそれぞれＡＴＣＣ受入れ番号４０２２２および４０２
２３が与えられた。プラスミドｐＳＶＦ８−２００は１
９８５年７月１７日にＡＴＣＣに寄託されＡＴＣＣ受入
れ番号４０１９０が与えられた。

【０１０６】例５．本例は第VIII：Ｃ因子Ｌ鎖糖タンパ
ク質のアミノ末端アミノ酸を修正するためのプラスミド
ｐＳＶＦ８−８０の修飾について記載する。工学技術の
結果、８０ＫＭｒ糖タンパク質の独立した分泌に必要な
シグナルペプチド（例１）を提供するものはヒト血漿第
VIII：Ｃ因子Ｌ鎖の普通のアミノ末端残基をＳｅｒで置
換したものである。ｔＰＡプレ−プロペプチド配列を変
化する目的で新規プラスミドを作り、そのため第VIII：
Ｃ因子Ｌ鎖はタンパク質分解プロセッシング後の突然変
異Ｓｅｒ残基の代わりにそのアミノ末端にＧｌｕ残基を
有するであろう。

【０１０７】第VIII：Ｃ因子Ｌ鎖は、ゴルジ装置にある
プロテアーゼにより分泌する前すなわち細胞内で標準長
さの第VIII：Ｃ因子前駆体から分解されると考えられて
いる。この分解はアミノ酸残基１６４８と１６４９（Ａ
ｒｇ−Ｇｌｕ）の間で生じる。ポリアクリルアミトゲル
においてＬ鎖はそれぞれ１つまたは２つのＮ−結合オリ
ゴ糖を有するポリペプチドを表わす７７および８０ＫＭ
ｒバンドの二重線として表われる。Ｌ鎖の独立した分泌
は第VIII：Ｃ因子ｃＤＮＡのＬ鎖コード領域をｔＰＡの
ｃＤＮＡへ融合することにより達成された。しかしなが
ら、ｔＰＡシグナルペプチドを供給する方法において、
第VIII：Ｃ因子Ｌ鎖のアミノ末端は天然グルタミン酸残
基からセリンヘ突然変異を起こした。この突然変異誘発
組換体Ｌ鎖は標準長さの組換体第VIII：Ｃ因子から由来
する鎖と同じ分子特性を示すが、以下のような予備的証
拠もある：１）第VIII：Ｃ因子前駆体から分解した鎖と
同じ方法で代わりにグリコシル化されないかもしれな
い、２）イオン交換およびｖＷＦセファロースクロマト
グラフィにより精製する間に異なった挙動を示すかもし
れない、３）真正Ｌ鎖と抗原性が異なるかもしれない。

【０１０８】ｔＰＡプレ−プロペプチド配列は突然変異
ポリペプチドを放出するために３つのタンパク質分解を
必要とする。以下にｔＰＡ−第VIII：Ｃ因子８０Ｋ融合
物の領域においてｐＳＶＦ８−８０のタンパク質コード
配列の翻訳を示す：

【０１０９】

【化６】

【０１１０】シグナルペプチダーゼ分解は、星印で示し
たようにＳｅｒ（−１３位）またはＡｌａ（−８位）の
いずれかのカルボキシ部位で生ずると考えられてきた。
二番目の分解は多分Ａｒｇ（−４位、上記◎で示した）
のカルボキシ部位で生じる。三番目のプロセッシング事
象はＡｒｇ−Ｓｅｒ結合でのタンパク質分解でありＧｌ
ｙ−Ａｌａ−Ａｒｇのトリペプチドを放出しそして成熟
ｔＰＡまたは第VIII：Ｃ因子Ｌ鎖ポリペプチドにおける
Ｓｅｒ（１位）アミノ末端をそのままにする。

【０１１１】（Ａ）プラスミドの調製 （１）ｐＳＶＦ９−８０ＫＧ：Ｓｅｒコドン（１位）を
特定部位突然変異誘発によりＧｌｕコドン（１位）へ変
えた。これは最初の２つのタンパク質分解プロセッシン
グ現象が正常に生ずる努力が行なわれ、そしてＡｒｇ−
Ｇｌｕプロテアーゼが代わりの内容においてジペプチド
を認識し分解するかどうか、すなわちｔＰＡトリペプチ
ドが第VIII：Ｃ因子Ｂドメインに対し置換される場所を
試験する。tＰＡ−８０Ｋ鎖融合領域を以下に示す。そ
の他の点ではこのプラスミドはｐＳＶＦ８−８０と同一
である。

【０１１２】

【化７】

【０１１３】（２）ｐＳＶＦ８−８０Ｓ インビトロ突然変異誘発によりｐＳＶＦ８−８０から１
２個のコドンを欠失し、そしてＳｅｒ（１位）コドンを
Ｇｌｕに対するコドンヘ変化させた。これは推定された
ｔＰＡシグナルペプチドのＳｅｒ２３（星印で示す）の
後でＧｌｕ第VIII：Ｃ因子Ｌ鎖残基を置く。Ｓｅｒ２３
のカルボキシ側におけるシグナルペプチダーゼによる分
解により非突然変異株第VIII：Ｃ因子Ｌ鎖を放出する。
ｐＳＶＦ８−８０ＳのｔＰＡ−８０Ｋ鎖融合領域を以下
に示す。その他の点ではこのプラスミドはｐＳＶＦ８−
８０と同一である。

【０１１４】

【化８】

【０１１５】（３）ｐＳＶＦ８−８０Ｒ ｔＰＡプロートリペプチドを除去するためにｐＳＶＦ８
−８０の３つのコドンの欠失をインビトロ突然変異誘発
により行ない、そしてＳｅｒ（１位）コドンをＧｌｕに
対する１つへ変化させた。これを以下に示すｐＳＶＦ８
−８０ＲのｔＰＡ−８０Ｋ鎖融合領域上に◎で印を付け
たｔＰＡプロ−ペプチドのＡｒｇ３２の後にＧｌｕを置
く。

【０１１６】

【化９】

【０１１７】この構築は、二塩基特性を有するゴルジ体
にあるプロテアーゼによる分解によりＧｌｕアミノ末端
を有する第VIII：Ｃ因子Ｌ鎖を放出するという希望で行
なわれた。

【０１１８】（４）ｐＳＶＦ８−８０Ａ ｐＳＶＦ８−８０の７つのコドンを部位特異的突然変異
誘発により欠失させ、Ｓｅｒ（１位）コドンを推定上の
ｔＰＡシグナルペプチドコード配列のコドン２８（Ａｌ
ａ）（以下の星印により示される）の後でＧｌｕコドン
に代えた。Ａｌａ２８のカルボキシ側におけるシグナル
ペプチダーゼによる分解で非突然変異誘発第VIII：Ｃ因
子Ｌ鎖を放出する。ｔＰＡ−８０Ｋ鎖融合領域を以下に
示す。その他の点では、このプラスミドはｐＳＶＦ８−
８０と同一である。

【０１１９】

【化１０】

【０１２０】（Ｂ）発現およびタンパク質配列分析 （１）ＣＯＳ７細胞へのトランスフェクション ＣＯＳ７細胞を例１に記載したＤＥＡＥ−デキストラン
法を用いてトランスフェクションし、状態調節した培地
をＬＣ−ＥＬＩＳＡにより分析した。ｐＳＶＦ８−８０
の４つの誘導体すべてはＬＣ−ＥＬＩＳＡにおいて反応
性であり様々な抗−第VIII：Ｃ因子Ｌ鎖抗体で生合成的
に放射能標識化した後免疫沈降されうる８０ＫＭｒ糖タ
ンパク質をコードする。ｐＳＶ／８−８０Ｒを除いて、
すべての誘導体がｐＳＶＦ８−８０として８０Ｋ糖タン
パク質のほぼ同じ量を分泌するようになる。ｐＳＶＦ８
−８０Ｒでトランスフェクションした細胞からの８０Ｋ
糖タンパク質の分泌は非常に少なく、通常は他のプラス
ミドから作られるものの２５％未満である。これに加
え、この第VIII：Ｃ因子Ｌ鎖の出現はゲル電気泳動で異
なり、ここではバンドは常に拡散する。

【０１２１】（２）ＣＨＯ細胞における発現 これらプラスミドの各々を例４に記載したｐＡｄ−ＤＨ
ＦＲを用いてＤＵＫＸ−ＢｌｌＣＨＯ細胞へ導入した。
Ｌ鎖の各タイプの製造のために永久細胞系を確立した。
ＣＨＯ細胞における８０ＫＭｒ糖タンパク質の発現は、
分泌される糖タンパク質の量およびゲル電気泳動上の８
０Ｋバンドの出現に関し、ＣＯＳ７細胞における発現と
非常に類似している。ｐＳＶＦ８−８０Ｒでトランスフ
ェクトされたＣＨＯ系は、この物質を分析しない程低い
レベルの８０Ｋ糖タンパク質を作った。

【０１２２】３．精製およびアミノ酸配列分析 大規模ＣＯＳ７トランスフェクション（ｐＳＶＦ８−８
０ＫＧ）またはトランスフェクトされた（増幅した）Ｃ
ＨＯ細胞系（ｐＳＶＦ８−８０Ｋ細胞系１０Ｃ２Ｂ５；
ｐＳＶＦ８−８０Ａ、細胞系Ａ１Ｎ；ｐＳＶＦ８−８０
Ｓ、細胞系Ｓ１Ｒ）のいずれかからの状態調節した培地
を調製した。培地は１０％ＦＢＳを有するＤＭＥ Ｈ１
２であった。第VIII：Ｃ因子ＬＣを、イオン交換クロマ
トグラフィとそれに続くアフィニティクロマトグラフィ
からなる二段階法により配列決定のため精製した。イオ
ン交換クロマトグラフィを以下のように実施した：Ｓ−
ＦＦセファロースカラム（１５×０．８cm）を、０．０
２Ｍ ＭＥＳ、０．０５Ｍ ＮａＣｌ、０．０１Ｍ Ｃ
ａＣｌ₂、pH５．８、λ２０℃＝７．２mSで平衡化し
た。状態調節した培地（５００〜１３００ml）をpH５．
８まで調整後流速１００ｍｌ／ｈでカラムヘ施こした。
カラムを、１０カラム容量の０．０５Ｍイミダゾール、
０．０５Ｍ ＮａＣｌ、０．０１Ｍ ＣａＣｌ₂、pH
７．３５、λ２０℃＝８．８mSを用い流速２００ml／ｈ
で洗浄した。ＦVIII−ＬＣを０．１Ｍ ＣａＣｌ₂の添
加により洗浄緩衝液へ流速５０ml／ｈで溶出した。すべ
ての操作を４℃で行なった。

【０１２３】アフィニティクロマトグラフィを次のよう
に行なった：ネズミ科モノクローナル抗−ＦVIII−ＬＣ
抗体５６−ＩｇＧをＣＮＢｒ法によりセファロース４Ｂ
へ結合し密度２．５mg／mlゲルとした。ＦVIII−ＬＣ含
有溶出液を、室温にて一晩、ＦVIII−ＬＣｌ０００Ｕに
つきゲル１mlで免疫吸着によりインキュベートした。次
いでゲルをカラムにパックし、低塩分緩衝液（０．０５
Ｍイミダゾール、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．０１Ｍ
ＣａＣｌ₂、１０％グリセロール、０．０２％ＮａＮ₃、
pH７．３）２０カラム容量次いで高塩分緩衝液（０．０
５Ｍイミダゾール、１．０Ｍ ＮａＣｌ、１０％グリセ
ローリル、pH７．３）２０カラム容量で洗浄した。１時
間インキュベート後、０．０５Ｍイミダゾール、０．１
５Ｍ ＮａＣｌ、１０％グリセロール中１ＭＣａＣｌ₂
を用いて免疫吸着からＦVIII−ＬＣを溶出した。溶出液
をただちにセファデックスＧ−２５カラム中で０．０５
Ｍイミダゾール、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．０１ＭＣ
ａＣｌ₂、１０％グリセロール、０．０２％トゥイーン
８０、０．０２％ＮａＮ₃、pH７．３の溶液へ脱塩化
し、−８０℃で貯蔵した。Ｎ−末端配列分析をアプライ
トバイオシステム４７７Ａシークエンサーで行なった。

【０１２４】この分析の結果を第７表に示す。ｐＳＶＦ
８−８０ＫＧによりコード化される８０Ｋ糖タンパク質
はそのアミノ末端にトリペプチド延長部を有する。多分
これはｔＰＡプロトリペプチドＧｌｙ−Ａｌａ−Ａｒｇ
であり、これはＦVIII：ＣＢドメインを認識するＡｒｇ
−Ｇｌｕプロテアーゼによるプロセッシングができな
い。さらに、Ｎ末端配列は、ｔＰＡのシグナルペプチド
が実際にアミノ酸残基２２個の長さであり、シグナルペ
プチダーゼ分解がＰｒｏ２２のカルボキシ側で生ずるこ
とを明らかにする。それゆえ、Ｓｅｒ２３およびＡｌａ
２８の後でシグナルペプチダーゼ分解を内包するプラス
ミド構築物ｐＳＶＦ８−８０ＳおよびｐＳＶＦ８−８０
Ａはそれぞれ８０ＫＬ鎖において間違ったアミノ末端残
基を導入する。

【０１２５】

【表７】

【０１２６】本実施例の結果により、分泌されるポリペ
プチドが転写および翻訳に続いてどうやってプロセッシ
ングされるかを断言することの困難さが明らかである。
タンパク質配列の修飾はタンパク質分解プロセッシング
およびオリゴ糖追加についての予期せぬ配列を有し、そ
して分泌の総体的効率に影響を及ぼすことができる。

【０１２７】例６．本例は、ヒトα１−抗トリプシンの
シグナルペプチドを用いた真正ＦVIII−ＣＬ鎖の発現方
法について記載する。

【０１２８】Ａ．プラスミドの調製 １．ｐＳＶα１ＡＴ−Ｍｅｔ 成熟ヒトα１−抗トリプシンポリペプチドをコードする
ｃＤＮＡを、ヒト肝臓ｃＤＮＡクローンおよび合成オリ
ゴヌクレオチドのフラグメントを用いて組立てた；組立
物をＢａｍＨＩ−ＳａｌＩフラグメントとしてｐＢＲ３
２２へ連結してプラスミドｐＡＴ（Ｍｅｔ）を作った
（ローゼンベルグ（Rosenberg）ら、Nature(1984)、31
2:77-80）。合成オリゴヌクレオチドリンカー−アダプ
ターおよびシグナルペプチドをコードするｃＤＮＡクロ
ーンの一部を用いてシグナルペプチドコード配列を５’
端部におけるＥｃｏＲＩ制限部位とともにｐＡＴ（Ｍｅ
ｔ）のＢａｍＨＩ部位へ接続させる。得られた１２７１
bpＥｃｏＲＩ−ＳａｌＩフラグメントはヒトα１−抗ト
リプシンの翻訳配列をコードしており、これをｐＳＶ７
ｄ（例１に記載）のＥｃｏＲＩ−ＳａｌＩ部位へ連結し
てｐＳＶα１ＡＴ−Ｍｅｔとした。

【０１２９】２．ｐＳＶＦ８−８０ＡＴ プラスミドｐＳＶα１ＡＴ−ＭｅｔをＢａｍＨＩ部位で
開環し、これはシグナルペプチドと成熟α１−アンチト
リプシン配列のコドンの間の境界で起きる。この制限部
位の結合端をヤエナリ（mung bean）ヌクレアーゼで除
去してＧＡＧ（Ｇlｕ）コドンを放出し、そしてα１−
抗トリプシン配列をＳａｌＩで消化することにより欠失
した。ＦVIII：Ｃ８０Ｋのコード配列は付着のためにｐ
ＳＶＦ８−８０のコドン１および２のインビトロ突然変
異誘発により調製されＥｃｏＲＶ部位（これはＩｌｅコ
ドンとしてコドン２を保存する）を形成した。これによ
りＦVIII：ＣＬ鎖コード領域（コドン２で出発するＥｃ
ｏＲＶ−ＳａｌＩ配列として）が正しいリーディングフ
レームにてα１−抗トリプシンのコドン１に融合し、そ
して成熟ヒトα１−抗トリプシンのコード配列を置換す
る。

【０１３０】融合領域におけるｐＳＶＦ８−８０ＡＴの
コード配列は以下のように翻訳される。ｔＰＡプレ−プ
ロコード配列のためのα１−抗トリプシンシグナルペプ
チドコード配列の置換を除いて、このプラスミドはｐＳ
ＶＦ８−８０と同一である。

【０１３１】

【化１１】

【０１３２】Ｂ．発現およびアミノ酸配列分析 １．ＣＯＳ７細胞におけるｐＳＶＦ８−８０ＡＴの発現 ＣＯＳ７細胞をｐＳＶＦ８−８０ＡＴおよびＨ鎖発現プ
ラスミド、通常ｐＳＶＦ８−９２Ｃでトランスフェクシ
ョンした。状態調節した培地をＬＣ−ＥＬＩＳＡ、ＨＣ
−ＥＬＩＳＡおよびＣＯＡＴＥＳＴにより分析した。ト
ランスフェクトした細胞をまた放射性Ｍｅｔで標識化
し、生合成された放射性標識化ＦVIII：ＣＬ鎖を免疫沈
降させそしてポリアクリルアミドゲル電気泳動の後で可
視化した。プラスミドＳＶＦ８−８０ＡＴはＦVIII：Ｃ
Ｌ鎖の合成を示しこれは７７−８０ＫＭｒの二本鎖とし
て表われる。ＣＯＳ７細胞において作られた量はｐＳＶ
Ｆ８−８０についてと同じ量である。ｐＳＶＦ８−９２
Ｃまたは他のＦVIII：ＣＨ鎖プラスミドとの同時発現
は、ＣＯＡＴＥＳＴ分析において測定される活性ＦVII
I：Ｃ複合体の製造を導く。

【０１３３】２．精製およびアミノ酸配列分析 細胞密度を増加しそしてクロロキニンジホスフェート濃
度を低下させて、Ｔ−１７５フラスコ中ＣＯＳ７細胞の
トランスフェクションにより精製のための物質を調製し
た。トランスフェクションしてから６０時間後、状態調
節した培地を集めた：精製およびアミノ酸配列分析を例
５に記載のように行なった。アミノ末端配列分析の結果
（第８表）により、ｐＳＶＦ８−８０ＡＴによりコード
されるＦVIII：ＣＬ鎖が真正なヒト血漿ＦVIII：ＣＬ鎖
と同じアミノ末端配列を有することがわかる。

【０１３４】

【表８】

【０１３５】３．８０ＡＴＦVIII：ＣＬ鎖のインビトロ
アッセンブリー ８０ＡＴＦVIII：ＣＬ鎖のインビトロでの精製されたＦ
VIII：ＣＨ鎖との組換能力を第９表に示す実験で試験し
た。精製したＦVIII：ＣＬ鎖を、５０mM Mn²⁺および１
５０μＭβ−メルカプトエタノールを含む緩衝液中１７
Ｕ／mlで精製した組換体（標準長さのヒトＦVIII：Ｃか
ら）とともに３．７Ｕ／mlの濃度でインキュベートし
た。対照として、精製した組換体ＨおよびＬ鎖を同じ条
件下で再会合させ、作られた活性ＦVIII：Ｃの量をＣＯ
ＡＴＥＳＴにより分析した。これらの結果により８０Ａ
ＴＦVIII：ＣＬ鎖がインビトロで精製された組換体Ｈ鎖
と結合しうることがわかる。

【０１３６】

【表９】

【０１３７】例７．本例はＦVIII：ＣＨ鎖の向上した発
現のためのプラスミドについて記載する。メッセンジャ
ーＲＮＡの転写効率および安定性を向上するために、転
写開始の原因であるＤＮＡ配列および非コード配列にお
ける修飾を行なった。短かいペプチドが結合したＢドメ
インのセグメントからなるカルボキシ末端延長部により
Ｈ鎖糖タンパク質を修飾した。これはより効率的に細胞
から分泌され、組織培地においてより安定であり、そし
てＬ鎖とともにより効率良く組立てるＨ鎖を得るために
行なわれる。

【０１３８】Ａ．プラスミドの調製 １．ｐＣＭＶＦ８−９２／６Ｘ 第VIII：Ｃ因子９２ＫＭｒＨ鎖に対するメッセンジャー
ＲＮＡの転写レベルおよび安定性を向上する試みで、Ｓ
Ｖ４０初期転写開始領域を、ヒトサイトメガロウィルス
即時型領域（ボスハート（Boshart）ら、Cell(1985)4:5
21-530）により置換した。さらに、ＳＶ４０初期領域に
よりメッセンジャーＲＮＡへ寄与された５’非翻訳配列
を、その最初のイントロンを含むＨＣＭＶ １Ｅ１遺伝
子の５’非翻訳配列で置換した。このイントロンは、切
り出された転写物がより迅速なプロセッシングおよびよ
り安定なｍＲＮＡを導くという仮定に含まれる。発現ベ
クターはまたＣＯＳ７細胞における一時的発現を許す複
製のＳＶ４０開始点およびアンピシリン耐性について選
択することによるＤＮＡクローニングを許す細菌性β−
ラクタマーゼ遺伝子を有する。

【０１３９】プラスミドは、ＳＶ４０ポリアデニル化領
域を含むｐＳＶ７ｄ（例１に記載）の７００bpＳａｌＩ
−ＰｖｕＩフラグメント、ＳＶ４０の複製開始点とβ−
ラクタマーゼ遺伝子の残りを提供するｐＳＶＴ２（メイ
ヤー（Myers）ら、Cell(1981)25:373-84；リオ（Rio）
ら、Cell(1983)32:1277-40）の1400bpＰｖｕＩ−Ｅｃｏ
ＲＩ（クレノウポリメラーゼで満たされた）、ＳａｌＩ
部位がインビトロ突然変異誘発により１Ｅ１タンパク質
についての翻訳開始部位の近くに導入されたヒトサイト
メガロウィルス（夕ウネ（Towne）菌株）のプラスミド
サブクローンから由来する１７００bpＳｓｐＩ−Ｓａｌ
Ｉ、および第VIII：Ｃ因子９２ＫＭｒ糖タンパク質をコ
ードするｃＤＮＡを含むｐＳＶＦ８−９２Ｃ（例２に記
載）の４３００bpＳａｌＩ−ＳａｌＩフラグメントから
構築された。

【０１４０】２．ｐＳＶＦ８−９２ｔβ このプラスミドは、ヒト免疫グロブリンαＨ鎖のそれと
相同のペプチドヒンジペプチドにより連結した第VIII：
Ｃ因子前駆体の中心（Ｂ）ドメインのＮ末端およびＣ末
端アミノ酸残基からなるＣ末端延長部を有する９２ＫＭ
ｒ組換体Ｈ鎖をコードするｐＳＶＦ８−９２Ｃの誘導体
である。これはｐＳＶＦ８−９２Ｃからの４９００bpＨ
ｉｎｄIII−ＳａｌＩフラグメントからなり、１１０bp
ＨｉｎｄIII−ＳａｌＩ合成リンカー−アダプターをこ
れへ挿入する（以下に示す）。

【０１４１】

【化１２】

【０１４２】リンカー−アダプターは３４個の追加のア
ミノ酸残基からなるカルボキシ末端延長部およびＮ−連
結グリコシル化の１つの可能性ある基をコードする。Ｃ
末端ペプチドはＨ鎖の分子量をほぼ９６ＫＭｒまで上昇
させ、これがグリコシル化されている場合は約９９ＫＭ
ｒまで上昇させる。

【０１４３】Ｂ．ＦVIII：ＣＨ鎖抗原に対する分析およ
びＦVIII：Ｃ複合体形成 ＦVIII：ＣＬ鎖Ｈ鎖複合体の補因子活性を、カビビトラ
ム（Kabivitrum）からの市販されている試験キット（CO
ATEST）を用いて評価した。免疫反応性ＦVIII：ＣＬ鎖
をノルディスクゲントフテ（Nordisk Gentofte）からの
ＨＺ ＩｇＧコーティング抗体およびペルオキシダーゼ
抱合抗体を用いてＥＬＩＳＡにより測定した。ＦVIII：
ＣＨ鎖免疫反応性をノルディスクゲントフテで開発した
ＥＬＩＳＡを用いて定量化し、これは阻害患者からのヒ
トポリクローナル（Ｅ−ＩｇＧ）を使用する。

【０１４４】Ｃ．ｐＣＭＶＦ８−９２／６Ｘの一時的発
現 ＤＥＡＥ−デキストラン法を用いてｐＣＭＶＦ８−９２
／６Ｘプラスミドを様々なＦVIII：ＣＬ鎖プラスミド
（例５に記載）でＣＯＳ７細胞へ同時トランスフェクト
した。これらのトランスフェクションからの結果のサン
プルを第１０表に示す。データによれば、ＣＭＶ ｌＥ
１ プロモーター／エンハンサーおよび１Ｅ１遺伝子の
５’非翻訳配列を添加するとＦVIII：ＣＨ鎖発現におい
て２．５倍の向上（平均）が得られることがわかる。

【０１４５】

【表１０】

【０１４６】Ｄ．ｐＳＶＦ８−９２ｔβのＣＯＳ７細胞
における一時的発現 第１１表に、第VIII：Ｃ因子Ｌ鎖発現プラスミド（ｐＳ
ＶＦ８−８０ＡＴ、例６に記載）を用いたＣＯＳ７細胞
へのｐＳＶＦ８−９２ｔβ同時トランスフェクションの
結果を示す。９２ｔβＨ鎖は９２ＣＨ鎖より高いレベル
で分泌され、これはシグナルアミノ酸（Ｓｅｒ）カルボ
キシ末端延長部を有するＣＯＡＴＥＳＴ（ＣＯＡ）活性
のＥＬＩＳＡ反応性糖タンパク質との比（複合体形成の
測定値）は９２Ｃ鎖より９２ｔβ鎖についての方が大き
い。さらに、９２ｔβＨ鎖は血清不含有培地中で良く分
泌され安定であるようであり、タンパク質に対する活性
の比は１０％ＦＢＳ中とほとんど同じである。これらの
結果により、この３４個のアミノ酸カルボキシ末端延長
部が分泌を向上しそして組換体ＦVIII：ＣＨ鎖を安定化
することが明らかである。

【０１４７】

【表１１】

【０１４８】複製におけるＣＯＳ７細胞単層をＤＥＡＥ
−デキストラン中でＤＮＡへ暴露し、洗浄しそしてクロ
ロキニンジホスフェート含有培地で８時間処理した。細
胞を洗浄して薬品を除き、１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥ Ｈ
２１ ５mlで１２〜１６時間被覆し、次いでハナ バイ
オケミカルズ（Hana Biochemicals）からのHB CHO登録
商標でオーバーレイした。状態調節した培地を記載した
ようにＦVIII：Ｃ活性について分析した。 ａ Ｌ鎖に対し特異的なＥＬＩＳＡ分析による ｂ Ｈ鎖に対し特異的なＥＬＩＳＡ分析による。

【０１４９】理解を明らかにする目的で例を説明するこ
とにより前述の発明を詳細に記載したが、一定の変化お
よび修飾は添付の請求の範囲の範囲内で実施される。

【０１５０】例８．本例はＣ末端としてＡｒｇ７４０を
有するＦVIII：ＣＨ鎖の発現のための方法を記載する。

【０１５１】Ａ．プラスミドｐＣＭＶＦ８−９２Ｒの調
製 プラスミドｐＣＭＶＦ８−９２／６Ｘによりコードされ
るＦVIII：ＣＨ鎖はＣ末端延長部としてＳｅｒ７４１を
有する。Ｃ末端としてＡｒg７４０を有するＦVIII：Ｃ
Ｈ鎖を得るために、ｐＳＶＦ８−９２Ｃから由来するコ
ード配列の３’端部をコードするｐＣＭＶＦ８−９２／
６Ｘの１５８８bpＢａｍＨＩフラグメントを精製した。
このフラグメントをｍ１３ｍｐ１８にクローン化し、Ｓ
ｅｒ７４１残基をインビトロ突然変異誘発により翻訳ス
トップコドンヘ変える。ｐＣＭＶＦ８−９２Ｒ発現プラ
スミドを、オリジナルのベクターの５８４０bpＢａｍＨ
Ｉフラグメントヘ突然変異誘発化フラグメントをクロー
ニングすることにより組立てた。この方法によりＦVII
I：Ｃ３’非翻訳配列の６８０bpが欠失した。

【０１５２】Ｂ．ｐＣＭＶＦ８−９２ＲのＣＯＳ細胞に
おける一時的発現 ｐＣＭＶＦ８−９２Ｒプラスミドを、リン酸カルシウム
法（グラハムおよびファンデルエブ、Ｖｉｒｏｌ（１９
７３）５２：４５６−６７）を用いてＦVIII：ＣＬ鎖プ
ラスミド（ｐＳＶＦ８−８０ＡＴ）（例６に記載）でＣ
ＯＳ７細胞へ同時トランスフェクションした。培地をト
ランスフェクション後１８および４２時間で培地を変え
た。分析のための培地サンプルをトランスフェクション
後６６時間で集めた。これらの分析の結果を以下の第１
２表に示す。データによりｐＣＭＶＦ８−９２ＲがＦVI
IIＬＣの発現を提供するプラスミドで同時トランスフェ
クトするとＦVIII：Ｃ活性が生じたことがわかる。

【０１５３】

【表１２】

【０１５４】プラスミドｐＳＶＦ８−９２およびｐＳＶ
Ｆ８−８０を１９８６年１月２４日付でアメリカンタイ
プカルチュアコレクション（ＡＴＣＣ）に寄託し、ＡＴ
ＣＣ受入れ番号４０２２２および４０２２３がそれぞれ
与えられた。プラスミドｐＳＶＦ８−２００を１９８５
年７月１７日付でＡＴＣＣに寄託し、ＡＴＣＣ受入れ番
号４０１９０が与えられた。

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 バーバラ チャプマン アメリカ合衆国，カリフォルニア 94702, バークレー，カーネル アベニュ 1346 (72)発明者 ラエ リン バーク アメリカ合衆国，カリフォルニア 94117, サンフランシスコ，ウィラード ストリー ト 1447 (72)発明者 ミレラ エスバン ラスムッセン デンマーク国，デーコー−2100 コペンハ ーゲン，アビルトガールトスガテ 24 (72)発明者 ヤン メーラー ミッケルセン デンマーク国，デーコー−2820 ゲントフ テ，スネルレバイ 20

Claims (12)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 第VIII：Ｃ因子タンパク質を含む組成物
   であって、該タンパク質は、ヒト第VIII：Ｃ因子凝固活
   性を有し、そしてヒト第VIII：Ｃ因子のＡドメインに相
   同なアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド、およびヒ
   ト第VIII：Ｃ因子のＣドメインに相同なアミノ酸配列を
   含む第２のポリペプチドから本質的になる、タンパク質
   複合体から本質的になる、組成物。
2. 【請求項２】 請求項１に記載の組成物であって、前記
   第１のポリペプチドが、ヒト第VIII：Ｃ因子のアミノ酸
   １〜740のアミノ酸配列と同じであるアミノ酸配列を含
   み、および前記第２のポリペプチドが、ヒト第VIII：Ｃ
   因子のアミノ酸1649〜2322のアミノ酸配列と同じである
   アミノ酸配列を含む、組成物。
3. 【請求項３】 請求項１に記載の組成物であって、前記
   第１のポリペプチドがヒト第VIII：Ｃ因子のアミノ酸１
   〜740に相同なアミノ酸配列を有し、および前記第２の
   ポリペプチドがヒト第VIII：Ｃ因子のアミノ酸1649〜23
   22に相同なアミノ酸配列を有する、組成物。
4. 【請求項４】 第VIII：Ｃ因子タンパク質を含む組成物
   であって、該タンパク質は、ヒト第VIII：Ｃ因子凝固活
   性を有し、そしてヒト第VIII：Ｃ因子のＡドメインに相
   同なアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド、およびそ
   れにＣａ⁺⁺架橋されたヒト第VIII：Ｃ因子のＣドメイン
   に相同なアミノ酸配列を含む第２のポリペプチドから本
   質的になる、Ｃａ⁺⁺架橋されたタンパク質複合体から本
   質的になる、組成物。
5. 【請求項５】 請求項４に記載の組成物であって、前記
   第１のポリペプチドが、ヒト第VIII：Ｃ因子のアミノ酸
   １〜740のアミノ酸配列と同じであるアミノ酸配列を含
   み、および前記第２のポリペプチドがヒト第VIII：Ｃ因
   子のアミノ酸1649〜2322のアミノ酸配列と同じアミノ酸
   配列を含む、組成物。
6. 【請求項６】 請求項４に記載の組成物であって、前記
   第１のポリペプチドが、ヒト第VIII：Ｃ因子のアミノ酸
   １〜740に相同なアミノ酸配列を有し、および前記第２
   のポリペプチドが、ヒト第VIII：Ｃ因子のアミノ酸1649
   〜2322に相同なアミノ酸配列を有する、組成物。
7. 【請求項７】 ヒト第VIII：Ｃ因子Ｍｒ８０Ｋタンパク
   質と相同のポリペプチドを組合せた場合ヒト第VIII：Ｃ
   因子活性を有するポリペプチドであって、該ポリペプチ
   ドがＮ末端からＣ末端の方向に：ヒト第VIII：Ｃ因子の
   Ａドメインと相同のアミノ酸配列を有する第一の領域、
   並びにヒト第VIII：Ｃ因子のＢドメインのＮ末端配列、
   Ｎ結合グリコシル化部位５個未満を有する３〜４０個の
   ペプチドのポリペプチドスペーサー、およびヒト第VII
   I：Ｃ因子のＢドメインのＣ末端配列からなる第二の領
   域、を含んでなる、ポリペプチド。
8. 【請求項８】 前記第一の領域のアミノ酸配列のアミノ
   酸の約５％以下が第VIII：Ｃ因子Ａドメインの天然アミ
   ノ酸配列と異なる、請求項７に記載のポリペプチド。
9. 【請求項９】 第一のポリヌクレオチドによりコードさ
   れるポリペプチドのアミノ酸配列がヒト第VIII：Ｃ因子
   のアミノ酸１〜７５９のアミノ酸配列と同じである、請
   求項７に記載のポリペプチド。
10. 【請求項１０】 ヒト第VIII：Ｃ因子のＢドメインのＮ
    末端配列のアミノ酸がSer-Phe-Ser-Gln-Asn-Ser-Arg-Hi
    s-Pro-Ser-Thr-Arg-Gln-Lys-Gln-Phe-Asn-Ala-Thrを含
    んでなる、請求項７に記載のポリペプチド。
11. 【請求項１１】 ポリペプチドスペーサーのアミノ酸配
    列がPro-Pro-Thr-Pro-Pro-Thrを含んでなる、請求項７
    に記載のポリペプチド。
12. 【請求項１２】 ＢドメインのＣ末端配列がPro-Pro-Va
    l-Leu-Lys-Arg-His-Gln-Argを含んでなる、請求項７に
    記載のポリペプチド。