DE68914022T2

DE68914022T2 - Aprotinin-Analoge und Verfahren zu ihrer Herstellung.

Info

Publication number: DE68914022T2
Application number: DE68914022T
Authority: DE
Inventors: Kjeld Norris; Lars Christian Petersen
Original assignee: Novo Nordisk AS
Current assignee: Novo Nordisk AS
Priority date: 1988-04-26
Filing date: 1989-04-25
Publication date: 1994-07-07
Anticipated expiration: 2009-04-26
Also published as: EP0339942A3; FI905275A0; ATE103295T1; DK225488D0; JP2810743B2; ZA893075B; NO302950B1; DE68914022D1; AU3560389A; IE64230B1; AU619553B2; ES2061983T3; US5373090A; FI93964B; WO1989010374A1; NO904622D0; JPH03504009A; IE891334L; FI93964C; EP0339942B1

Description

GEBIET DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung betrifft neue Aprotinin-Analoge und ein Verfahren zu ihrer Herstellung.

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

In der gesamten vorliegenden Beschreibung bezieht sich der Ausdruck natürlich auftretende Aminosäure (oder Aminosäurerest) auf eine der α-Aminosauren, die unten zusammen mit den Symbolen aufgelistet sind, die verwendet werden, um die einzelnen Aminosäurereste zu bezeichnen:
Asp Asparaginsäure
Thr Threonin
Ser Serin
Glu Glutaminsäure
Pro Prolin
Gly Glycin
Ala Alanin
Cys Cystein
Val Valin
Met Methionin
Ile Isoleucin
Leu Leucin
Tyr Tyrosin
Phe Phenylalanin
His Histidin
Lys Lysin
Arg Arginin
Trp Tryptophan
Gln Glutamin
Asn Asparagin
Alle Aminosäuren (oder Aminosäurereste), die in der vorliegenden Beschreibung erwähnt sind, besitzen L-Konfiguration, mit Ausnahme von Glycin, das kein chirales Zentrum besitzt.
Aprotinin (Rinderpancreas-Trypsininhibitor, BBTI) ist ein Polypeptid, das in mehreren Rinderorganen und -geweben vorhanden ist, wie etwa Lymphknoten, Pankreas, Lunge, Ohrspeicheldrüse, Milz und Leber. Es ist ein Einzelketten-Polypeptid, das aus 58 Aminosäureresten besteht, quervernetzt durch drei Disulfidbrücken, in der folgenden Sequenz:
Die drei Disuifidbrücken liegen zwischen Cys(5)-Cys(55), Cys(14)-Cys(38) bzw. Cys(30)-Cys(51).
Aprotinin inhibiert verschiedene Serinproteasen, wie etwa Trypsin, Chymotrypsin, Plasmin und Kallikrein, und es wird zur Behandlung von akuter Pankreatitis, verschiedenen Zuständen von Schocksyndromen, hyperfibrinolytischer Hämorrhagie und Myocardinfarzierung verwendet. Verabreichung von Aprotinin in hohen Dosen verringert signifikant den Blutverlust in Verbindung mit Herzchirugie.
Aprotinin wird aus verschiedenen Rinderorganen oder -geweben extrahiert, wie etwa Lunge, Pankreas und Ohrspeicheldrüsen. Extraktion aus tierischen Geweben ist ein mühseliges Verfahren und erfordert große Mengen des Rinderorgans oder -gewebes. Aprotinin kann auch durch rekombinante DNA-Technologie durch Insertion eines Gens, das für Aprotinin kodiert, in einem geeigneten Mikroorganismus hergestellt werden, der, wenn er in einem geeigneten Nährstoffmediuin kultiviert wird, das gewünschte Produkt produziert.
Produktion von Aprotinin-Analogen in E. coli ist beschrieben in der veröffentlichten EP-Patentannieldung Nr. 238,993 und Produktion von Aprotinin in Hefe ist beschrieben in der dänischen Patentanmeldung Nr. 4501/87.
Bestimmte Aprotinin-Analoge und -Derivate sind beschrieben worden, siehe z.B. Jering H. und Tschesche H., Eur. J. Biochem. 61 (1976), 453-463, die den Ersatz von Lys(15) durch Arg, Phe oder Trp beschreiben, oder U.S.-Patentschrift Nr. 4,595,674, die Aprotinin-Analoge beschreibt, in denen der Lysinrest in Position 15 im aktiven Zentrum des Aprotinins durch Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Met, Arg, L-α-Aminobuttersäure, L- Norvalin, L-Norleucin, Dehydroalanin oder L-Homoserin ersetzt worden ist. Die oben erwähnte EP Nr. 238,993 beschreibt auch Aprotinin-Analoge, bei denen Lys(15) durch Arg, Val, Ile, Leu, Phe, Gly, Ser, Trp, Tyr oder Ala ersetzt ist und/oder Met(52) durch Glu, Leu, Val, Thr oder Ser ersetzt ist.
Von den bekannten Aprotinin-Analogen wird behauptet, das sie modifizierte Wirkungen und Wirksamkeiten gegenüber verschiedenen Proteinasen besitzen. Zum Beispiel besitzt Aprotinin(15Val) eine relativ hohe Selektivität für Granulocyten- Elastase und eine Inhibitionswirkung auf Kollagenase, Aprotinin(15Ala) hat nur eine schwache inhibitorische Wirkung auf Elastase und Aprotinin(15Gly) hat eine herausragende Antitrypsin-Aktivität und inhibiert überraschenderweise Kallikrein.
Die veröffentlichte EP-Patentanmeldung Nr. 307 592 beschreibt Aprotinin-Analoge, die in einer oder mehreren der Positionen 15, 16, 17, 18, 34, 39 und 52 substituiert sind. In Position 17 ist die Aininosäure vorzugsweise Leu, Arg, Ile oder Val.
C.B. Marks et al., Science 235, 1987, S. 1370-1373, beschreiben Mutanten von Aprotinin, die in den Positionen 14 und 38 durch Ala oder Thr substituiert sind. Es wird berichtet, daß diese Substanzen in E. coli exprimiert und richtig gefaltet wurden.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Es ist der Zweck der vorliegenden Erfindung, neue Aprotinin- Analoge zur Verfügung zu stellen, die eine spezifischere inhibitorische Wirkung gegenüber bestimmten Serinproteasen besitzen, wie etwa Elastase, Kallikrein, t-PA, Urokinase und Gerinnungsfaktoren, wie etwa Thrombin.
Die vorliegende Erfindung beruht auf der überraschenden Tatsache, daß der Ersatz von Arg in Position 17 von Aprotinin(3- 58;42Ser) durch Ala oder von Arg in Position 17 durch Ala und von Ile in Position 19 von Aprotinin(3-58;42Ser) durch Glu zu einem beträchtlichen Anstieg in der Inhibition von Humanplasma-Kallikrein führt. Dies ist sogar noch ausgeprägter bei Ersatz von Lys in Position 15 durch Arg und von Arg in Position 17 durch Ala in Aprotinin(3-58;42Ser).
Demgemäß betrifft die vorliegende Erfindung Aprotinin-Analoge mit der Formel I
in der X&sub1; Arg- Pro, Pro oder Wasserstoff bedeutet; X&sub2; und X&sub3; unabhängig voneinander irgendein natürlich auftretender Aminosäurerest sind; X&sub5; Lys, Arg, Val, Thr, Ile, Leu, Phe, Gly, Ser, Met, Trp, Tyr oder Ala ist; X&sub6; Ala oder Gly ist; X&sub8; Ile, Leu, Met, Val oder Phe ist; X&sub9; irgendein natürlich auftretender Aminosäurerest ist; X&sub1;&sub1; irgendein natürlich auftretender Aminosäurerest ist; X&sub1;&sub2; Lys, Arg oder Ser ist; und X&sub7; Ala oder Gly ist, vorausgesetzt, daß wenigstens einer von X&sub2;-X&sub6; und X&sub8;-X&sub1;&sub2; verschieden ist von dem entsprechenden Aminosäurerest in nativem Aprotinin.
In der oben erwähnten dänischen Patentanmeldung Nr. 4501/87 werden Aprotinin-Analoge mit bestimmten Aminosäurerest-Substitutionen und/oder -Deletionen beschrieben. Das Ziel dieser Aminosäurerest-Substitutionen und/oder -Deletionen ist, proteolytische Spaltung an bestimmten basischen Aminosäureresten während der Produktion des Aprotinin-Analogs in Hefe zu verhindern. Insbesondere können die Aminosäurereste 1 und 2 weggelassen werden und einer der basischen Aminosäurereste an der zweibasigen Sequenz 41-42 kann durch einen anderen Aminosäurerest ersetzt werden. Es ist gezeigt worden, daß solche Aprotinin-Analoge in hohen Ausbeuten in Hefe produziert werden und dieselben Merkmale wie natives Aprotinin zeigen.
Um hohe Produktion in Hefe sicherzustellen, können die vorliegenden Aprotinin-Analoge in einer ähnlichen Art und Weise weiter modifiziert werden. Demgemäß betrifft die vorliegende Erfindung weiterhin Aprotinin-Analoge mit der Formel II
in der X&sub1; Pro oder Wasserstoff bedeutet; X&sub2; und X&sub3; unabhängig voneinander irgendein natürlich auftretender Aminosäurerest sind; X&sub5; Lys, Arg, Val, Thr, Ile, Leu, Phe, Gly, Ser, Met, Trp, Tyr oder Ala ist; X&sub6; Ala oder Gly ist; X&sub7; irgendein natürlich auftretender Aminosäurerest ist; X&sub8; Ile, Leu, Met, Val oder Phe ist; X&sub9; irgendein natürlich auftretender Aminosäurerest ist; X&sub1;&sub1; irgendein natürlich auftretender Aminosäurerest ist; X&sub1;&sub2; Lys, Arg oder Ser ist; vorausgesetzt, daß wenigstens einer der Aminosäurereste X&sub2; bis X&sub9; verschieden ist von dem entsprechenden Aminosäurerest in nativem Aprotinin.
Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Herstellung der obigen Aprotinin-Analoge durch Kultivierung eines Hefestamms zur Verfügung gestellt, der einen replizierbaren Expressionsvektor enthält, der ein Gen enthält, das die Aprotinin-Analoge kodiert, in einem geeigneten Nährstoffmedium, gefolgt von der Gewinnung des gewünschten Produktes aus dem Kulturmedium.

KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN

Die vorliegende Erfindung wird weiter durch Bezugnahme auf die beiliegenden Zeichnungen veranschaulicht, in denen:
Fig. 1 ein synthetisches Gen zeigt, das Aprotinin(3- 58; 42Ser) kodiert;
Fig. 2 die Konstruktion des Plasmids pKFN 306 veranschaulicht;
Fig. 3 die Konstruktion des Plasmids pKFN 504 veranschaulicht;
Fig. 4 die Konstruktion des Plasinids pMT 636 veranschaulicht;
Fig. 5A die Inhibition von Plasma-Kallikrein durch natives Aprotinin und durch die Aprotinin-Analoge KFN 396 und KFN 399 veranschaulicht; und
Fig. 5B die Inhibition von Plasma-Kallikrein durch natives Aprotinin und durch die Aprotinin-Analoge KFN 396, KFN 772 und KFN 773 veranschaulicht.

DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER GEGENWÄRTIG BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN

Gemäß einem engeren Aspekt können die vorliegenden Aprotinin- Analoge durch die folgende Formel (III) dargestellt werden:
in der X&sub1;, X&sub5;, X&sub6;, X&sub7;, X&sub8;, X&sub9;, X&sub1;&sub1; und X&sub1;&sub2; sind, wie oben für Formel (I) definiert, wobei wenigstens einer der Aminosäurereste X&sub5; bis X&sub9;, vorzugsweise X&sub6; bis X&sub9;, verschieden ist von dem entsprechenden Aminosäurerest in nativem Aprotinin.
Gemäß einem noch engeren Aspekt können die Aprotinin-Analoge durch die folgende Formel (IV) dargestellt werden:
in der X&sub1;, X&sub6;, X&sub7;, X&sub8;, X&sub9;, X&sub1;&sub1; und X&sub1;&sub2; sind, wie oben für Formel (I) definiert, wobei wenigstens einer der Aminosäurereste X&sub6; bis X&sub9; verschieden ist von dem entsprechenden Aminosäurerest in nativem Aprotinin.
In der durch Formel I oder II oben dargestellten Sequenz ist X&sub1; vorzugsweise Wasserstoff; ist X&sub2; vorzugsweise Gly; ist X&sub3; vorzugsweise Pro; ist X&sub5; vorzugsweise Lys oder Arg; ist X&sub6; vorzugsweise Ala; ist X&sub5; vorzugsweise Ala; ist X&sub8; vorzugsweise Ile; ist X&sub9; vorzugsweise Ile; ist X&sub1;&sub1; vorzugsweise Lys; und ist X&sub1;&sub2; vorzugsweise Arg oder Ser.
Beispiele für bevorzugte Aprotinin-Analoge gemäß der vorliegenden Erfindung sind Aprotinin(3-58; 17Ala + 42Ser), in dem die ersten zwei Aminosäurereste von nativem Aprotinin fehlen und in dem Arg in Position 17 durch Ala ersetzt ist und Arg in Position 42 durch Ser ersetzt ist; Aprotinin(3-58; 17 Ala + 19Glu + 42Ser), in dem die ersten zwei Aminosäurereste von nativem Aprotinin fehlen und in dem Arg in Position 17 durch Ala ersetzt ist, Ile in Position 19 durch Glu ersetzt ist und Arg in Position 42 durch Ser ersetzt ist; und Aprotinin(3-58; 15Arg + 17Ala + 42Ser), in dem die ersten zwei Aminosäurereste von nativem Aprotinin fehlen und in dem Lys in Position 15 durch Arg ersetzt ist, Arg in Position 17 durch Ala ersetzt ist bzw. Arg in Position 42 durch Ser ersetzt ist.
Weitere Beispiele von Aprotinin-Analogen gemäß der vorliegenden Erfindung sind:
Aprotinin(3-58; 17Ala)
Aprotinin(3-58; 17Ala + 19Glu)
Aprotinin(3-58; 15Arg + 17 Ala)
Aprotinin(17Ala + 42Ser)
Aprotinin(15Arg + 17Ala + 42Ser)
Aprotinin(17Ala)
Aprotinin(17Ala + 19Glu)
Aprotinin(15Arg + 17Ala)
Für Sekretionszwecke wird die DNA-Sequenz, die das gewünschte Aprotinin-Analog kodiert, mit einer DNA-Sequenz verknüpft, die eine Signal- und Leader-Peptidsequenz kodiert. Die Signal- und Leader-Peptide werden von dem transformierten Mikroorganismus während der Sekretion des exprimierten Proteinproduktes aus den Zellen abgespalten, was ein einfacheres Isolationsverfahren des gewünschten Produktes sicherstellt. Ein gut geeignetes Leader-Peptidsystem für Hefe ist die Hefe-MFα1-Leadersequenz oder ein Teil derselben (Kurjan, J. und Herskowitz, I., Cell 30 (1982) 933-943). Jede Signal- und Leader-Sequenz, die für Sekretion in Hefe sorgt kann jedoch verwendet werden und es ist nicht daran gedacht, die vorliegende Erfindung auf ein spezifisches Sekretionssystem zu beschränken.
Für Expressionszwecke ist eine Promotor-Sequenz flußaufwärts zur DNA-Sequenz für das gewünschte Proteinprodukt angeordnet. Vorzugsweise wird ein Promotor von einem Gen, das natürlicherweise im Hefe-Wirtsorganismus vorhanden ist, verwendet, z.B. der Promotor des TPI-(Triosephosphat-Isomerase)-Gens. Der DNA- Sequenz für das gewünschte Produkt wird eine Transkriptionsterminator-Sequenz folgen, vorzugsweise eine Terminator-Sequenz von einem Gen, das natürlicherweise im Hefe-Wirtsorganismus vorhanden ist, z.B. der Terminator des TPI-Gens oder des MFα1-Gens.
Die DNA-Sequenz, die das gewünschte Aprotinin-Analog kodiert, verknüpft mit geeigneten Promotor-, Signal-, Leader- und Terminator-Sequenzen, wird in einen Expressionsvektor für die Expression des Aprotinin-Analogs in Hefe inseriert.
Der Expressionsvektor kann ein Plasmid sein, das zur unabhängigen Replikation in Hefe in der Lage ist oder zur Integration in das Hefe-Chromosom in der Lage ist. Das Plasmid kann vorzugsweise gegen Plasmidverlust durch den Wirtsmikroorganismus durch Einbau eines Gens stabilisiert werden, das wesentlich ist für die Lebensfähigkeit oder das normale Wachstum der Wirtszellen, z.B. ein Gen, das für Zellteilung, Zellwand-Biosynthese, Proteinsynthese, etc. kodiert.

Beispiel 1

Aprotinin(3-58; 17Ala + 42Ser) (KFN396)

Eine Sequenz, die Aprotinin(3-58; 42Ser) kodiert, wurde aus einer Anzahl von Oligonukleotiden durch Ligation konstruiert.
Die Oligonukleotide wurden auf einem automatischen DNA-Synthesizer unter Verwendung von Phosphoramidit-Chemie auf einem Träger aus Glas mit kontrollierter Porengröße synthetisiert (S. L. Beaucage und M. H. Caruthers (1981) Tetrahedron Letters 22, 1859-1869).
Die folgenden 10 Oligonukleotide wurden synthetisiert: Duplex Duplex
5 Duplizes A - E wurden aus den obigen 10 Oligonukleotiden gebildet, wie in Fig. 1 und 2 dargestellt.
20 pMol von jedem der Diplizes A - E wurden aus den entsprechenden Paaren von 5'-phosphorylierten Oligonukleotiden I - X gebildet durch Erhitzen für 5 min bei 90ºC, gefolgt von Abkühlen auf Raumtemperatur über einen Zeitraum von 75 Minuten. Die 5 Duplizes wurden vermischt und mit T4-Ligase behandelt. Die synthetische Sequenz wurde als eine 176 bp-Bande nach Elektrophorese der Ligationsmischung auf einem 2%igen Agarosegel isoliert.
Die synthetische Sequenz wurde an ein 330 bp langes EcoRI- HgaI-Fragment aus Plasmid pKFN9, das für die MFα1-Signal- und -Leader-Sequenz(1-85) kodiert, und an das große EcoRI-XbaI- Fragment aus pUC19 ligiert. Die Konstruktion von pKFN9, das eine Hga-I-Stelle unmittelbar nach der MFα1-Leader-Sequenz enthält ist in der europäischen Patentanmeldung Nr. 0 214 826 beschrieben.
Die Ligationsmischung wurde verwendet, um einen kompetenten E. coli-Stamm (r&supmin;, m&spplus;) , selektionierend auf Ampicillinresistenz, zu transformieren. Sequenzierung eines ³²P-XbaI-EcoRI-Fragmentes (Maxam, A. und Gilbert, W. (1980) Methods Enzymol. 65, 499-560) zeigte, daß Plasmide aus resultierenden Kolonien die richtige DNA-Sequenz für Aprotinin(3-58; 42Ser) enthielten.
Ein Plasmid pKFN306 wurde für die weitere Verwendung ausgewählt. Die Konstruktion von Plasmid pKFN306 ist in Fig. 2 veranschaulicht.
Um Ala in Position 17 einzuführen, wurden die folgenden Oligonukleotide, wie oben beschrieben, synthetisiert:
Die Oligonukleotide waren 5'-O-phosphoryliert durch Behandlung mit ATP und T4-Kinase.
Eine durch Anelierung der 5'-phosphorylierten Oligonukleotide Ia und IIa gebildete Duplex wurde an das 352 bp lange EcoRI- PflMI-Fragment und das 3 kbp lange EcoRI-StyI-Fragment, beide aus pKFN306, ligiert. pKFN306 kodiert den S.cerevisiae-Reifungsfaktor-α1-Signal-Leader(1-85), verknüpft mit dem synthetischen Aprotinin(3-58; 42Ser)-Gen.
Die Ligationsmischung wurde verwendet, um einen kompetenten E. coli-Stamm (r-, m&spplus;), selektionierend aus Ampicillinresistenz zu transformieren. Sequenzierung eines ³²P-XbaI-EcoRI-Fragments (Maxam, A. und Gilbert, W. (1980) Methods Enzymol. 65, 499- 560) zeigte, daß Plasmide aus den resultierenden Kolonien die richtige DNA-Sequenz für Aprotinin(3-58; 17Ala + 42Ser) enthielten.
Ein Plasmid, pKFN501, wurde für weitere Verwendung ausgewählt. Die Konstruktion von Plasmid pKFN501 ist in Fig. 3 veranschaulicht.
pKFN501 wurde mit EcoRI und XbaI geschnitten und das 0,5 kb lange Fragment wurde an das 9,5 kb lange NcoI-XbaI-Fragment aus pMT636 und das 1,4 kb lange NcoI-EcoRI-Fragment aus pMT636 ligiert, was zu Plasmid pKFN504 führte, siehe Fig. 3. Plasmid pMT636 wurde aus pMT608 nach Deletion des LEU-2-Gens und aus pMT479 konstruiert, siehe Fig. 4. pMT608 ist in der europäischen Patentanmeldung Nr. 195691 beschrieben. pMT479 ist in der europäischen Patentanmeldung Nr. 163529 beschrieben. pMT479 enthält das Schizo. pombe-TPI-Gen (POT), den S. cerevisiae-Triosephosphat-Isomerase-Promotor und -Terminator, TPIp und TPIT (Alber, T. und Kawasaki, G. (1982) J.Mol.Appl.Gen. 1, 419-434). Plasmid pKFN504 enthält die folgende Sequenz:
TPIp-MFα1-Signal-Leader(1-85)-Aprotinin(3-58;17Ala + 42Ser)- TPIT, wobei MFα1 die S. cerevisiae-Reifungsfaktor-Alpha-1-Kodierungssequenz ist (Kurjan, J. und Herskowitz, I. (1982) Cell 30, 933-943), Signal-Leader(1-85) bedeutet, daß die Sequenz die ersten 85 Aminosäurereste der MFα1-Signal-Leader-Sequenz enthält, und Aprotinin(3-58; 17Ala + 42Ser) die synthetische Sequenz ist, die ein Aprotinin-Derivat kodiert, dem die ersten zwei Aminosäurereste am N-Terminus fehlen und bei dem die Aminosäurereste 17 und 42 durch einen Ala- bzw. einen Ser-Rest ersetzt sind.
S. cerevisiae-Stamm MT663 (E2-7B XE11-36 a/a, ΔtpiΔtpi, pep 4- 3/pep 4-3) wurde auf YPGaL (1% Bacto-Hefeextrakt, 2% Bacto- Pepton, 2% Galactose, 1% Lactat) auf eine optische Dichte bei 600 nm von 0,6 gezüchtet.
100 ml Kultur wurden durch Zentrifugation geerntet, mit 10 ml Wasser gewaschen, erneut zentrifugiert und erneut suspendiert in 10 ml (1,2 M Sorbit, 25 mM Na&sub2;EDTA pH 8,0, 6,7 mg/ml Dithiotreit). Die Suspension wurde bei 30ºC für 15 Minuten inkubiert, zentrifugiert und die Zellen erneut supendiert in 10 ml (1,2 M Sorbit, 10mM Na&sub2;EDTA, 0,1 M Natriumcitrat pH = 5,8, 2 mg Novozym 234). Die Suspension wurde bei 30ºC für 30 Minuten inkubiert, die Zellen durch Zentrifugation gesammelt, in 10 ml 1,2 M Sorbit und 10 ml CAS (1,2 M Sorbit, 10 mM CaCl&sub2;, 10 mM Tris HCl (Tris = Tris(hydroxymethyl)-aminomethan) pH = 7,5) gewaschen und erneut suspendiert in 2 ml CAS. Zur Transformation wurden 0,1 ml erneut in CAS suspendierte Zellen mit ungefähr 1 ug Plasmid pKFN504 vermischt und bei Raumtemperatur für 15 Minuten stehengelassen. 1 ml (20% Polyethylenglykol 4000, 10 mM CaCl&sub2;, 10 mM Tris HCl, pH = 7,5) wurde zugegeben und die Mischung für weitere 30 Minuten bei Raumtemperatur stehengelassen. Die Mischung wurde zentrifugiert und der Pellet erneut suspendiert in 0,1 ml SOS (1,2 M Sorbit, 33 Vol.-% YPD, 6,7 mM CaCl&sub2;, 14 ug/ml Leucin) und bei 30ºC für 2 Stunden inkubiert. Die Suspension wurde dann zentrifugiert und der Pellet erneut suspendiert in 0,5 ml 1,2 M Sorbit. 6 ml Top-Agar (das SC-Medium von Sherman et al., (Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, 1981), das 1,2 M Sorbit plus 2,5% Agar enthält) bei 52ºC wurden zugegeben und die Suspension oben auf Platten gegossen, die dasselbe mit Agar verfestigte, Sorbit enthaltende Medium enthielten. Transformante Kolonien wurden nach 3 Tagen bei 30ºC abgenommen, erneut isoliert und verwendet, um Flüssigkulturen zu starten. Ein solcher Transformant, KFN396, wurde zur weiteren Charakterisierung ausgewählt.
Hefestamm KFN396 wurde auf YPD-Medium gezüchtet (1% Hefeextrakt, 2% Pepton (von Difco Laboratories) und 2% Glucose). Eine 1 Liter-Kultur des Stammes wurde bei 30ºC auf eine optische Dichte bei 600 nm von 13 gerüttelt. Nach Zentrifugation wurde der Überstand durch FPLC-Ionenaustauschchromatographie gereinigt. Der Hefeüberstand wurde durch eine 0,22 um-Filtereinheit Millex GV filtriert und 1 ml wurden aufgebracht auf eine MonoS-Kationenaustauschsäule (0,5 x 5 cm), die mit 20 mM Bicine, pH 8,7, äquilibriert worden war. Nach dem Waschen mit Äquilibrationspuffer wurde die Säule mit einem linearen NaCl- Gradienten (0-1 M) in Äquilibrationspuffer eluiert. Trypsininhibitor-Aktivität wurde in den eluierten Fraktionen durch spektrophotometrischen Test und außerdem durch Absorptionsintegration bei 280 nm aus Aprotinin
quantifiziert.
Die Ausbeute betrug etwa 4,3 mg/Liter an Aprotinin(3-58; 17Ala + 42Ser).
Für Aminosäureanalyse wurde der Hefeüberstand (7 ml) mit 0,1 M NaOH auf pH 8,7 eingestellt und filtriert (0,22 um). Der Ablauf aus einer Q-Sepharose-Anionenaustauschsäule (1 x 4 cm), äquilibriert mit 20 mM Bicine, pH 8,7, wurde auf eine MonoS- Kationenaustauschsäule (0,5 x 5 cm) aufgebracht. Die Kationenaustauschchromatographie wurde durchgeführt, wie oben beschrieben. Die Konzentration des gradienteneluierten Aprotinin(3-58) wurde erreicht durch Rechromatographie auf MonoS und Elution mit steilem NaCl-Gradienten. Die gesammelten Fraktionen wurden weiter konzentriert durch Vakuumzentrifugation auf etwa 100 ul und aufgebracht auf eine RP-HPLC-Säule (Vydac C4, 4,6 x 250 mm), Elution wurde durchgeführt mit einem CH&sub3;CN-Gradienten in 0,1% TFA. Die gesammelten Fraktionen wurden auf etwa 100ul durch Vakuumzentrifugation konzentriert und Proben wurden für Aminosäureanalyse abgenommen.
Die Aminosäureanalyse erscheint aus der folgenden Tabelle 1. Aus dieser Tabelle wird deutlich, daß das Produkt die erwartere Aminosäurezusammensetzung besitzt. Tabelle 1 Aminosäure theoretisch Aprotinin (3-58; 17Ala + 42Ser)(gefunden) insgesamt

Beispiel 2

Aprotinin(3-58; 17Ala + 19Glu + 42Ser) (KFN399)

Ein synthetisches Gen, das Aprotinin(3-58; 17Ala + 19Glu + 42Ser) kodiert, wurde konstruiert, wie in Beispiel 1 beschrieben. Die folgenden Oligonukleotide Ib und IIb wurden anstelle von Ia und IIa verwendet:
Das pUC19-abgeleitete Plasmid pKFN503 wurde in einer ähnlichen Art und Weise konstruiert wie pKFN501.
Unter Befolgung der Vorgehensweise von Beispiel 1 wurde ein Plasmid pKFN507 erhalten, das die folgende Konstruktion enthält
TPIp-MFα1-Signal-Leader(1-85)-Aprotinin(3-58; 17Ala + 19Glu + 42Ser) TPIT,
wobei Aprotinin(3-58; 17Ala + 19Glu + 42Ser) das synthetische Gen ist, das ein Aprotinin-Derivat kodiert, dem die ersten zwei Aminosäuresequenzen am N-Terminus fehlen und bei dem die Reste 17, 19 und 42 von nativem Aprotinin durch einen Alanin-, einen Glutaminsäure- bzw. einen Serinrest ersetzt sind.
Plasmid pKFN507 wurde in Hefestamm MT663 transformiert, wie oben beschrieben, und der Kultivierung des transformierten Stammes KFN399 ergab etwa 10 mg/Liter an Aprotinin(3-58; 17Ala + 19Glu +42Ser).
Die Aminosäureanalyse erscheint aus der folgenden Tabelle 2 und bestätigt die erwartete Aminosäurezusammensetzung. Tabelle 2 Aminosäure theoretisch Aprotinin (3-58; 17Ala + 19Glu + 42ser)(gefunden) insgesamt

Beispiel 3

Aprotinin(3-58; 15Arg + 17Ala + 42Ser) (KFN773).

Ein synthetisches Gen, das Aprotinin(3-58; 15Arg + 17Ala + 42Ser) kodiert, wurde konstruiert, wie in Beispiel 1 beschrieben. Die folgenden Oligonukleotide Ic und IIc wurden anstelle von Ia und IIa verwendet:
Das pUG19-abgeleitete Plasmid pKFN777 wurde in einer ähnlichen Art und Weise konstruiert wie pKFN501.
Unter Befolgung der Vorgehensweise von Beispiel 1 wurde ein Plasmid pKFN807 erhalten, das die folgende Konstruktion enthält
TPIp-MFα1-Signal-Leader(1-85)-Aprotinin(3-58; 15Arg + 17Ala + 42Ser)-TPIT,
wobei Aprotinin(3-58; 15Arg + 17Ala + 42Ser) das synthetische Gen ist, das ein Aprotinin-Derivat kodiert, dem die ersten zwei Aminosäurereste am N-Terminus fehlen und bei dem die Reste 15, 17 und 42 von nativem Aprotinin ersetzt sind durch einen Arginin-, einen Alanin- bzw. einen Serinrest.
Plasmid pKFN807 wurde in Hefestamm MT663 transformiert, wie oben beschrieben, und Kultivierung des transformierten Stammes KFN773 ergab etwa 8,5 mg/Liter an Aprotinin(3-58; 15Arg + 17Ala + 42Ser).
Die Aminosäureanalyse ist in Tabelle 3 dargestellt und bestätigt die erwartete Aminosäurezusammensetzung. Aminosäure theoretisch Aprotinin (3-58; 15Arg + 17Ala + 42ser)(gefunden) insgesamt
Der leicht gesenkte Gehalt an Ile, verglichen mit dem theoretischen Wert, kann höchstwahrscheinlich unvollständiger Hydrolyse von Ile(18)-Ile(19) zugeschrieben werden. Dies ist aus dem Stand der Technik gut bekannt.

Beispiel 4

Inhibition von Serinproteasen aus Plasma durch Aprotinin(3-58; 17Ala + 42Ser) (KFN396) und Aprotinin(3-58; 17Ala + 19Glu + 42Ser) (KFN399), Aprotinin(3-58; 15Arg +42Ser) (KFN772) und Aprotinin(3-58: 15Arg + 17Ala +42Ser) (KFN773).

Aprotinin(3-58; 17Ala +42Ser) (KFN396), Aprotinin(3-58; 17Ala + 19Glu + 42Ser) (KFN399) und Aprotinin(3-58; 15Arg + 17Ala + 42Ser) (KFN773) wurden gereinigt, wie oben beschrieben. Als natives Rinderpankreas-Aprotinin(1-58) wurde Charge H 5029-65 (67000 KIU/mg) von NOVO (Bagsvaerd, Dänemark) verwendet. Die Konzentration wurde unter Verwendung von E280nm = 8,3 und Mr = 6500 berechnet. Humanplasma-Kallikrein wurde erhalten von Sigma (St. Louis, MO), Rinderfaktor Xa wurde gemäß (H. Nobukazu et al. J. Biochem. 97 (1985) 1347-1355) gereinigt Humanfaktor IIa (Thrombin) war ein Geschenk von Dr. W. Lawson (New York State Dept. of Health, Albany, N.Y.), rekombinanter Humanfaktor VIIa stammte von NOVO (Bagsvaerd, Dänemark) und rekomhinantes Humanprotein Ca stammte von ZymoGenetics, Inc. (Seattle, WA). Substrat S 2302 (H-D-Pro-Phe-Arg-p-Nitroanilid), Substrat S2238 (H-D-Phe-Pip-Arg-p-Nitroanilid) und Substrat S2366 (Glu-Pro-Arg-p-Nitroanilid) stammten von Kabi (Stockholm, Schweden). Substrat FXa-1 (Methoxycarbonyl-DCH- Gly-Arg-p-Nitroanilid) stammte von NycoMed (Oslo, Norwegen). Die Experimente wurden durchgeführt in 100 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, 0,01% Tween80, pH 7,4 bei 25ºC.
Humanplasma-Kallikrein (3 nM) wurde in einer Mikrotiter-Vertiefung für 30 Minuten mit Aprotinin (0-20 nM) inkubiert. Substrat S 2302 (0,6 mM) wurde bis zu einem Endvolumen von 300 ul zugegeben und die Geschwindigkeit der Nitroanilinerzeugung wurde bei 405 nm mit Hilfe eines Mikro-ELISA -Autoreaders MR 580 von Dynatech Laboratories gemessen. Die Geschwindigkeit ist proportional zur Konzentration an freiem Enzym. Die Inhibition von Plasma-Kallikrein durch natives Aprotinin und die vier Analoge KFN396, KFN399, KFN772 und KFN773 ist dargestellt in Fig. 5A und 5B. Mit nativem Aprotinin wurde eine mäßige Inhibition beobachtet. Die Inhibition war stark erhöht durch die Analoge KFN396 und KFN399, die Ala in Position 17 enthalten (Fig. 5A)
Ein weiterer Anstieg der Inhibition wurde erhalten mit Arg in Position 15 (KFN772); und die stärkste Inhibition wurde beobachtet mit dem Analog (KFN773) mit der Substitution von sowohl Position 17 (Ala) als auch Position 15 (Arg) (Fig. 5B).
Die Analoge wurden auch getestet auf Inhibition der amidolytischen Aktivität der Serinproteasen: Rinderfaktor Xa, humaner Faktor IIa, humaner rekombinanter Faktor VIIa und humanes rekombinates Protein Ca. Die Experimente wurden im wesentlichen durchgeführt, wie für Plasma-Kallikrein beschrieben, es wurden nur geeignete Substrate verwendet. Schließlich wurden die Analoge auf eine Wirkung auf die Gerinnungsfaktoren von Humanplasma mit Hilfe zweier Gerinnungstests analysiert. Diese Tests, die Prothrombinzeit (PTT) und die aktivierte Thromboplastinzeit (APTT), wurden durchgeführt mit General Diagnostics -Reagenzien von Organon (Durham, NC) gemäß den vom Hersteller angegebenen Anweisungen. Die Ergebnisse der Inhibitionsexperimente sind in Tabelle 4 zusammengefaßt die das Inhibitionsprofil der vier Aprotinin-Analoge beschreibt. KFN 773 ist gekennzeichnet durch eine außergewöhnlich starke Inhibition von Humanplasma-Kallikrein, die zehnmal stärker ist als diejenige des Arg 15-Analogs (KFN 772). Ein umgekehrter Effekt wird beobachtet mit aktiviertem Protein C. In diesem Fall ist die relativ starke Inhibition, die durch Substitution von Lys 15 zu Arg erhalten wird, wird durch weitere Substitution von Arg 17 zu Ala abgeschwächt. Tabelle 4 Inhibitionsprofil von Aprotinin-Analogen Ki*) (nM); amidolytische Aktivität von Serinproteasen§ Gerinnungstests Produkt Plasma-Kallikrein natives Aprotinin - + - keine Inhibition bei 1,0 uM Aprotinin-Analog + verlängerte Gerinnungszeit bei 1,0 uM Aprotinin-Analog *) Inhibitions-Konstanten geschätzt mit der grafischen Dixon-Methode (M. Dixon, Biochem. J. 129 (1972) 197-202) § Substrate : Plasmakallikrein: S2302; FIIa: S2238; FVIIa: Substrat FXa-1; FXa: Substrat FXa-1; Prot. Ca: 52366.
Die in der vorstehenden Beschreibung, in den folgenden Ansprüchen und/oder in den beiliegenden Zeichnungen offenbarten Merkmale können, sowohl einzeln als auch in jeder ihrer Kombinationen, Gegenstand für die Verwirklichung der Erfindung in ihren verschiedenen Formen sein.

Claims

1. Aprotinin-Analoge mit der Formel I

in der X&sub1; Arg-Pro, Pro oder Wasserstoff bedeutet; X&sub2; und X&sub3; unabhängig voneinander irgendein natürlich auftretender Aminosäurerest sind; X&sub5; Lys, Arg, Val, Thr, Ile, Leu, Phe, Gly, Ser, Met, Trp, Tyr oder Ala ist; X&sub6; Ala oder Gly ist; X&sub8; Ile, Leu, Met, Val oder Phe ist; X&sub9; irgendein natürlich auftretender Aminosäurerest ist; X&sub1;&sub1; irgendein natürlich auftretender Aminosäurerest ist; oder X&sub1;&sub2; Lys, Arg oder Ser ist; und X&sub7; Ala oder Gly ist, vorausgesetzt daß wenigstens einer der Aminosäurereste X&sub2;-X&sub6; und X&sub8;-X&sub1;&sub2; verschieden ist von dem entsprechenden Aminosäurerest in nativem Aprotinin.

2. Aprotinin-Analoge mit der Formel II

in der X&sub1; Pro oder Wasserstoff bedeutet; X&sub2; und X&sub3; unabhängig voneinander irgendein natürlich auftretender Aminosäurerest sind; X&sub5; Lys, Arg, Val, Thr, Ile, Leu, Phe, Gly, Ser, Met, Trp, Tyr oder Ala ist; X&sub6; Ala oder Gly ist; X&sub7; irgendein natürlich auftretender Aminosäurerest ist; X&sub8; Ile, Leu, Met, Val oder Phe ist; X&sub9; irgendein natürlich auftretender Aminosäurerest ist; X&sub1;&sub1; irgendein natürlich auftretender Aminosäurerest ist; X&sub1;&sub2; Lys, Arg oder Ser ist; vorausgesetzt, daß wenigstens einer der Aminosäurereste X&sub2; bis X&sub9; verschieden ist von dem entsprechenden Aminosäurerest in nativem Aprotinin.

3. Aprotinin-Analoge nach Anspruch 1, wobei X&sub1; Wasserstoff ist.

4. Aprotinin-Analoge nach Anspruch 1, wobei X&sub1;&sub2; Lys oder Ser ist.

5. Aprotinin-Analoge nach Anspruch 1 oder 2, wobei X&sub2; Gly ist.

6. Aprotinin-Analoge nach Anspruch 1 oder 2, wobei X&sub3; Pro ist.

7. Aprotinin-Analoge nach Anspruch 1 oder 2, wobei X&sub5; Lys oder Arg ist.

8. Aprotinin-Analoge nach Anspruch 1 oder 2, wobei X&sub6; Ala ist.

9. Aprotinin-Analoge nach Anspruch 2, wobei X&sub7; Ala oder Gly ist.

10. Aprotinin-Analoge nach Anspruch 1 oder 2, wobei X&sub8; Ile ist.

11. Aprotinin-Analoge nach Anspruch 1 oder 2, wobei X&sub9; Ile ist.

12. Aprotinin-Analoge nach Anspruch 1 oder 2, wobei X&sub1;&sub1; Lys ist.

13. Aprotinin-Analoge nach Anspruch 1 oder 2, wobei X&sub1;&sub2; Ser ist.

14. Aprotinin-Analog nach Anspruch 1 mit der folgenden Struktur:

15. Aprotinin-Analog nach Anspruch 1 oder 2 mit der folgenden Struktur:

16. Aprotinin-Analog nach Anspruch 1 mit der folgenden Struktur:

17. Aprotinin-Analog nach Anspruch 1 oder 2 mit der folgenden Struktur:

18. Aprotinin-Analog nach Anspruch 1 mit der folgenden Struktur:

19. Aprotinin-Analog nach Anspruch 1 oder 2 mit der folgenden Struktur:

20. Aprotinin-Analog nach Anspruch 1 oder 2 mit der folgenden Struktur:

21. Aprotinin-Analog nach Anspruch 1 mit der folgenden Struktur:

22. Aprotinin-Analog nach Anspruch 1 oder 2 mit der folgenden Struktur:

23. Aprotinin-Analog nach Anspruch 1 mit der folgenden Struktur:

24. Verfahren zur Herstellung von Aprotinin-Analogen nach irgendeinem der Ansprüche 1-23, welches Kultivieren eines Hefestammes, der einen replizierbaren Expressionsvektor enthält, wobei der Vektor ein Gen umfaßt das für ein Aprotinin-Analog nach einem der Ansprüche 1-22 kodiert, und DNA-Sequenzen, die die Expression des Aprotinin-Analogs erlauben, in einem geeigneten Nährstoffmedium und Gewinnen der eprimierten Aprotinin-Analoge umfaßt.