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EP1002083A1 - Aprotininvarianten mit verbesserten eigenschaften und bikunine von aprotininvarianten - Google Patents

Aprotininvarianten mit verbesserten eigenschaften und bikunine von aprotininvarianten

Info

Publication number
EP1002083A1
EP1002083A1 EP98930775A EP98930775A EP1002083A1 EP 1002083 A1 EP1002083 A1 EP 1002083A1 EP 98930775 A EP98930775 A EP 98930775A EP 98930775 A EP98930775 A EP 98930775A EP 1002083 A1 EP1002083 A1 EP 1002083A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
arg
ala
thr
leu
cys
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP98930775A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Werner Schröder
Heiner Apeler
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Bayer AG
Original Assignee
Bayer AG
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Bayer AG filed Critical Bayer AG
Publication of EP1002083A1 publication Critical patent/EP1002083A1/de
Withdrawn legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/81—Protease inhibitors
    • C07K14/8107—Endopeptidase (E.C. 3.4.21-99) inhibitors
    • C07K14/811—Serine protease (E.C. 3.4.21) inhibitors
    • C07K14/8114—Kunitz type inhibitors
    • C07K14/8117—Bovine/basic pancreatic trypsin inhibitor (BPTI, aprotinin)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P41/00—Drugs used in surgical methods, e.g. surgery adjuvants for preventing adhesion or for vitreum substitution
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/02—Antithrombotic agents; Anticoagulants; Platelet aggregation inhibitors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide

Definitions

  • the present invention relates to aprotinin variants and bikunins of aprotinin variants with improved enzyme-inhibitory, immunological and pharmacokinetic properties and their production.
  • Aprotinin also known as a bovine pancreatic trypsin inhibitor (BPTI) belongs to the Kunitz-type serine protease inhibitor family.
  • the spectrum of inhibitable serine proteases includes e.g. Trypsin, Chymotrypsin, Plasmin, and Plasma-Kallikrein (W. Gebhard, H. Tschesche and H. Fritz, Proteinase Inhibitors, Barrett and Salvesen (eds.), Elsevier Science Publ. BV 375 - 387, 1986).
  • Aprotinin is a single chain, 58 amino acid polypeptide with the following sequence:
  • Trasylol ® natural aprotinin is originally used for the treatment of pancreatitis. Trasylol is used today in cardiac surgery - 2 -
  • potent inhibitors can be generated in this way, e.g. inhibit pancreatic or leukocyte elastase.
  • inhibitory properties of aprotinin and the variants produced by exchange in position 15 are also determined by further amino acid residues in the contact region between the target protease to be inhibited and the inhibitor molecule. These include, above all, the additional amino acid residues in positions 14, 16, 17, 18, 19, 34, 38 and 39. Variants of aprotinin with improved properties by exchanging one or more of these amino acid residues in the region of the contact region were u. a. Described by way of example in the following patent applications: WO 89/01968, WO 89/10374, EP 307 592, EP 683 229, DE 19 62 998.2, WO 94/01461.
  • aprotinin and its variants could be improved by amino acid exchanges, which determine the physicochemical properties of the substance. So it was possible to significantly lower the kidney binding by lowering the positive net charge of the molecule.
  • Such variants have been described in patent application WO 92/06111.
  • N-terminally modified aprotinin variants have been described in patent application EP 419 878.
  • Bikunins are protease inhibitors, e.g. the inter-alpha-trypsin inhibitor, which contain two Kunitz domains which are separated by a spacer from several amino acids (J.-P.Salier, TIBS 15; 435-439, 1990). As a rule, however, only one of the two Kunitz domains is inhibitory.
  • aprotinin variants each containing only one of the features mentioned, have been described in the patent applications cited above.
  • the aprotinin variants according to the invention now combine in their molecular structure two or three of the features mentioned above or represent protease inhibitors from several Kunitz domains.
  • the amino acid sequences are shown by way of example for some variants or bikunins in FIGS. 1 and 2.
  • the aprotinin variants according to the invention are not limited to the examples mentioned in FIGS. 1 and 2.
  • the aprotinin variants according to the invention also include variants with the N-terminal extension Ala (-2) - Gln (-1), with the natural amino acid residue proline in position 2, with the exchange of other amino acids which carry a positive charge against neutral or negatively charged ones Amino acid residues, or with the exchange of other neutral amino acids for negatively charged amino acid residues, as well as with amino acid exchanges in the spacer, which ensure individual activity of the individual Kunitz domains, as well as connections that result from cleavage of the Kex protease in the leader.
  • the selection of exchanges of amino acid residues in the aprotinin variant follows the principle of producing a substance which has a reduced positive net charge at physiological pH, preferably in the range from +2 to -2.
  • the changes mentioned in the amino acid sequence including the N-terminal extensions or shortenings or deletions can be used in any combination with one another.
  • the aprotinin variants according to the invention thus include all compounds which have a combination of the abovementioned features and have a positive net charge which is reduced at a physiological pH.
  • the amino acids in the spacer can be combinations of natural amino acids that ensure the alignment of the individual domains so that they are individually active.
  • the aprotinin variants for the linkage are described inter alia in EP 307 592, WO 92/06111, EP 419 878, WO 89/01968, WO 89/10374, EP 0307592, EP 683 229, DE 196 29 982. - 5 -
  • the present invention relates to aprotinin variants with a net charge of +3 to -3 at pH 7, wherein in the binding region the amino acid residue is 10 Ser, the amino acid residue is 13 Ile, Phe or Leu, the amino acid residue is 15 Arg, the amino acid residue is 17 Tyr, Leu or Arg and the amino acid residue is 19 Thr or Lys.
  • aprotinin variants with a net charge of +2 to -2 are preferred, those with +1 to -1 being particularly preferred.
  • Aprotinin variants can have an altered N-terminal and / or C-terminal sequence. This means aprotinin variants with an N-terminal extension or shortening or with deleted amino acids in the N-terminus. - 6 -
  • X 2 is Pro or a bond
  • X 13 is Ile
  • Phe or Leu
  • X 17 is Tyr Leu or Arg
  • X 24 is Asp or Asn
  • X 31 is Glu or Gin is X 39 Arg or Leu
  • X 46 Lys or Leu is or polyethylene glycol derivatives thereof.
  • DesPro2-Ser10-lle13-Arg15-Tyr17-Thr19-Asp24-Thr26-Glu31-Asn41-Glu53-aprotinin DesPro2-Ser10-lle13-Arg15-Thr19-Asp24-Thr26-Glu31-Asn41-Glu53-aprotinin are particularly preferred , DesPro2-Ser10-lle13-Arg15-Tyr17-Thr19-Asp24-Thr26-Glu31-Leu39-Asn41-Glu53-Aprotinin, DesPro2-Ser10-lle13-Arg15-Thr19-Asp24-Thr26-Glu31 -Leu39-Asn41 -Glu53-Aprotinin , DesPro2-Ser10-Phe13-Arg15-Tyr17-Thr19-Asp24-Thr26-Glu31-Asn41-Glu53-Aprotinin, DesPro2-Ser10-Phe13-Arg15-T
  • aprotinin variants mentioned above are suitable for inhibiting plasma kallikrein, plasmin and factor Xa.
  • the invention further relates to bikunins comprising two aprotinin variants linked by a spacer with several amino acid residues, one of the arpotinin variants a) being an aprotinin variant in which the amino acid residue is 13, Ile, Phe or Leu, the amino acid residue 15 is Arg, Val or Leu, the amino acid residue 17 is Tyr, Leu or Ala, the amino acid residue 19 is Thr or Lys, the amino acid residue 39 is Arg or Leu, and the amino acid residue 46 is Leu or Lys, or b) is an aprotinin variant according to the invention defined above. - 7 -
  • the spacer preferably has 10 to 40, in particular 10 to 20, amino acid residues. Sequences with 13 amino acid residues are particularly preferred as spacers, in particular the following sequences: Asn-Ala-Asn-Arg-Ile-Ile-Lys-Thr-Thr-Leu-Gln-Gln-Glu, Asn-Ala-Asn-Arg-Leu -Leu-Lys-Thr-Thr-Leu-Gln-Gln-Glu and Gln-Ala-Gln-Arg-lle-lle-Lys-Thr-Thr-Leu-Gln-Gln-Glu.
  • bikunins can have an altered N-terminal sequence. This means Bikunine with an N-terminal extension or shortening or with deleted amino acids in the N-terminus. These bikunines can also contain exchanges and extensions or shortenings of the preferred spacer sequences.
  • the Bikunine are suitable for the inhibition of plasma kallikrein, factor Xa, plasmin and elastase.
  • This invention also relates to medicaments containing one or more of these aprotinin variants or bikunins.
  • novel protease inhibitors described are suitable for the treatment of disease states in which - also as a result of complex surgical processes such as e.g. in cardiac surgery or joint replacement or in transplantation medicine, in artificial organs - the plasmatic enzyme systems are activated by extensive or intensive contact with foreign surfaces and / or by cellular components of the blood.
  • the inhibitors reduce blood loss during operations that are associated with an increased risk of bleeding (e.g. heart operations, bone and joint surgery). They can also be used to treat thromboembolic conditions such as those that may occur after surgery, in hypercoagulable blood conditions, after accidents or after thrombolysis treatment. They are suitable for therapy for shock, polytrauma, sepsis, disseminated intravascular coagulation (DIC), multi-organ failure (MOF), for unstable angina, for heart attack, stroke, embolism and deep vein thrombosis, for reocclusion, perfusion damage, thrombosis and bleeding after the To prevent thrombolysis. You can use rheumatic like inflammatory diseases involving the kallikrein system - 9 -
  • Joint diseases and asthma can be used. They prevent invasive tumor growth and metastasis by inhibiting fibrinolysis. They are also suitable for pain and edema therapy, e.g. in traumatic brain injury, by inhibiting tissue and plasma kallikrein. By inhibiting the intrinsic and extrinsic blood coagulation pathways, they can be used to prevent activation of hemostasis in dialysis treatment.
  • the invention further relates to DNA sequences which code for one of the aprotinin variants or bikunins according to the invention, microorganisms which contain such a DNA sequence, and a method for producing the aprotinin variants and bikunins according to the invention using the microorganisms.
  • Figures 1 and 2 show the preferred aprotinin variants and bikunins of aprotinin variants of the present invention.
  • the bold amino acid residues represent mutations of natural aprotinin.
  • D represents a deleted amino acid residue.
  • the spacers of the bikunins are amino acid residues 59 to 71.
  • the genetic information ie a corresponding DNA sequence, which codes the aprotinin variants and bikunins according to the invention, is introduced into a suitable microbial expression organism for the synthesis of the aprotinin variant in each case using conventional molecular biological methods.
  • the recombinant microorganism is fermented; the heterologous genetic information is expressed by choosing suitable conditions.
  • the expressed aprotinin variant or the bikunin is then obtained from the culture broth.
  • Suitable host organisms for the production of the aprotinin variants and bikunins according to the invention can be bacteria, yeasts or fungi. Expression can be carried out intracellularly or extracellularly using suitable secretion systems.
  • the aprotin variant or the bikunin can be processed correctly or fused to peptides or proteins.
  • Enzymes The enzymes used (restriction endonucleases, alkaline phosphatase from calf intestine, T4 polynucleotide kinase and T4 DNA ligase) were obtained from Boehringer Mannheim and GIBCO / BRL and used according to the manufacturers' instructions.
  • Oligonucleotides for 'site directed mutagenesis' experiments and primers for PCR and sequencing reactions were produced using the '380 A DNA Synthesizer' from Applied Biosystems.
  • the mutagenesis experiments were carried out by a method by Deng and Nickoloff (Deng et al., Anal. Biochem. 200, 81-88, 1992) using a kit from Pharmacia Biotech ('Unique Site Elimination Mutagenesis'). All vector constructions and mutagenesis experiments - 11 -
  • yeast cells e.g. strain JC34.4D (MAT ⁇ , ura3-52, suc2) were dissolved in 10 ml YEPD (2% glucose; 2% peptone; 1% Difco
  • Yeast extract Yeast extract
  • the cells were washed with 5 ml of solution A (1 M sorbitol; 10 mM bicin pH 8.35; 3% ethylene glycol), resuspended in 0.2 ml of solution A and stored at -70 ° C.
  • Plasmid DNA (5 ⁇ g) and Carrier DNA (50 ⁇ g DNA from herring sperm) were added to the frozen cells. The cells were then thawed by shaking at 37 ° C for 5 min. After adding 1.5 ml of solution B (40% PEG 1000; 200 mM
  • Feeding was started after a fermentation time of 7 hours.
  • Samples were taken from the fermenter at regular intervals and cell growth was determined by measuring the optical density at 700 nm. In addition, the concentration of the protease inhibitors in the supernatant was determined by activity measurement.
  • the pH was lowered to 3.0 by adding 50% (w / v) citric acid and the fermenter was heated to 70 ° C. for 10 min.
  • the cells were then separated by centrifugation at 7500 x g and the supernatant was released for protein purification.
  • the sequence analyzes were carried out using a Model 473A protein sequencer from Applied Biosystems (Forster City, U.S.A.). The standard sequencing program was used. The sequencer, the various sequencing programs and the PTH detection system are described in detail in the operating manual (User's manual protein sequencing System model 473A (1989) Applied Biosystems Forster City, CA 94404, U.S.A.).
  • the reagents for operating the sequencer and the HPLC column for PTH detection were obtained from Applied Biosystems.
  • HPLC analyzes were carried out with an HP1090 HPLC system from Hewlett Packard (D-Waldbronn).
  • An RP-18 HPLC column 250 mm x 4.6 mm, 5 ⁇ - - 15 -
  • Model 270A-HT capillary electrophoresis was from Applied Biosystems (Forster City, CA 94404, U.S.A.). The samples were usually injected hydrodynamically over different time intervals.
  • the capillary column used 50 ⁇ m x 72 cm was from Applied Biosystems.
  • the amino acid analyzes were carried out with an amino acid analyzer LC3000 from Eppendorf Biotronik (D-Maintal). A slightly modified standard separation program from Biotronik was used. The separation programs and the function of the analyzer are described in detail in the device manual.
  • the molecular weights were determined using a MALDI I system from Kratos / Shimadzu (D-Duisburg).
  • the SDS electrophoresis was carried out with an electrophoresis system from Pharmacia (D-Freiburg).
  • the kinetic data were determined using the microplate reader from SLT (D-Crailsheim). The microtiter plates were washed with a washing machine from Dynatec (D-Denkendorf).
  • Enzymes and substrates were from Calbiochem (D-Bad Soden). All other chemicals and reagents were from Merck (D-Darmstadt) or Sigma (D-Deisenhofen). 96 well plates were purchased from Greiner.
  • the rabbit polyclonal anti-aprotinin antibodies were raised in the rabbit by immunization with aprotinin.
  • the human polyclonal anti-aprotinin antibodies come from patients treated with aprotinin. - 16 -
  • N-terminal sequence analysis 1-3 nmol of protease inhibitor dissolved in water was loaded onto a sequencer sheet which had been preincubated with Polybren ® . The protein was sequenced using the almost normal sequencer cycle. The PTH amino acids were identified by online HPLC using a 50 pmol PTH standard.
  • Amino acid analysis 200 ⁇ g protein were dissolved in 200 ⁇ l 6N HCl and hydrolyzed at 166 ° C. for 1 h. Approximately 1 nmol of the sample was placed on the amino acid analyzer. The amount of amino acid was determined using a 5 nmol standard. Cysteine was determined after performic acid oxidation of the protein (C.H.W. Hirs, Methods Enzymol. 11, 59-62) as described above.
  • SDS gel electrophoresis was carried out according to the conditions of Laemmli. 10 ⁇ g of the protease inhibitor were analyzed with a 10-20% SDS gel and visualized by means of silver staining (Merril et.al.). (U.K. Laemmli, Nature 227, 680-685 (1970). And C.R.Merril, M.LDunau, D.Goldman, Anal.Biochem. 110: 201-207 (1981)).
  • Capillary electrophoresis 8 ng of the protease inhibitor were examined by capillary electrophoresis on a glass column (length 72 cm, inner diameter 50 ⁇ m). Conditions: current 65 ⁇ A, column temperature 30 ° C, 100 mM phosphate buffer pH 3.0, detection 210 nm, application under pressure for 1 s.
  • Reverse phase chromatography 5 nmol of the protease inhibitor was chromatographed on a Bakerbond RP-18 HPLC column (5 ⁇ material, 4.6 mm ⁇ 250 mm, 30 nm (300 angstroms) pore size). An acetonitrile / TFA gradient was used as eluent. Conditions: flow 0.7 ml / min, column temperature 40 ° C., detection 210 nm, solvent A: 0.1% TFA, solvent B: 0.1% TFA / 60% acetonitrile; Gradient: 0 min. 0% B, 10 min. 0% B, 70 min. 100% B, 80 min. 0% B. - 17 -
  • Molecular weight determination 1 ⁇ g of the protease inhibitor was analyzed using the MALDI technique. Sinapic acid was used as the matrix. The standard proteins for mass calibration were melittin (2847 Da), bovine insulin (5734 Da), cytochrome C (12327 Da) and myoglobin (16951 Da).
  • Protein content The protein content of the samples was determined using amino acid analysis or by measuring the OD280 nm.
  • Trypsin inhibition test (titrimetric): The trypsin-inhibitory activity of the protease inhibitors in the fermentation broths was determined via the trypsin-catalyzed hydrolysis of N ⁇ -benzoyl-L-arginine ethyl ester (BAEE). The number of carboxyl groups released in the reaction, which are determined by an alkali titration, is a measure of the tryptic inhibitory activity of the inhibitors.
  • BAEE N ⁇ -benzoyl-L-arginine ethyl ester
  • Determination of the cross-reaction of the protease inhibitors with polyclonal rabbits or human anti-aprotinin antibodies 0.5-10 ng protease inhibitor or aprotinin dissolved in the coupling buffer were bound to a microtiter plate at 4 ° C. overnight. The wells were washed 4 times with 300 ⁇ l washing buffer and then 100 ⁇ l of the blocking solution was added. The plate was covered and incubated at 37 ° C for one hour.
  • the polyclonal rabbit anti-aprotinin antibody (0.2 ⁇ g / ml in 1% BSA in PBS buffer) or the polyclonal human antibody (20 ⁇ g / ml in 1% HSA in PBS buffer) was added .
  • the plate was covered, incubated at 37 ° C for one hour and then washed as described above.
  • 100 ⁇ l of biotinylated anti-rabbit or anti-human antibody 25 ⁇ l + 10 ml of 1% BSA or 1% HSA in PBS buffer were then added and incubated at 37 ° C. for one hour.
  • the plate was washed as described above and then 100 ul streptavidin-peroxidase complex (50 ul + 10 ml 1% BSA or 1% HSA in PBS buffer) was added to each well. The plate was covered and incubated at 37 ° C for one hour and then washed as described above. - 18 -
  • the substrate reaction was carried out with TMB substrate + peroxidase solution (1 + 1; 100 ⁇ l per well). After 10 min, the reaction was stopped with 100 ⁇ l / well of 2 M phosphoric acid and the absorption was measured at 450 nm (reference 570 nm).
  • Coupling buffer 15 mM Na 2 CO 3 , 35 mM NaHCO 3 , pH 9.6
  • Sample buffer The samples were dissolved in a suitable concentration in 1% BSA or HSA in PBS buffer pH 7.
  • Blocking buffer 3% (w / v) BSA or HSA in PBS.
  • the substrates were chromozyme PL for plasmin, HD-Pro-Phe-Arg-pNA for factor XI, S-2444 for trypsin, Suc-Phe-Leu-Phe-pNA for chymotrypsin, Bz-III-Glu-Gly-Arg-pNA for FXa, HD-Val-Leu-Arg-pNA for urinary kallikrein and HD-Pro-Phe-Arg-pNA.
  • Example 1 Preparation of a yeast expression vector for the secretion of recombinant Ser10-Ile13-Arg15-Tyr17-Thr19-Asp24-Thr26-Glu31-Asn41-Glu53-aprotinin
  • a Ser10-Arg15-Ala17-Asp24-Thr26-Glu31-Asn41-Glu53-aprotinin gene was used as a starting material for the production of the Ser10-Ile13-Arg15-Tyr17-Thr19-Asp24-Thr26-Glu31-Asn41-Glu53-aprotinin gene modified pYES2 vector (plU28.11.L).
  • the GAL1 promoter present on the vector pYES2 (Invitrogen) and the f1 ori are replaced in this vector by the MF ⁇ 1 promoter.
  • the vector plU28.11.L was digested with EcoRI and partially with Xbal and then filled in with Klenow polymerase and dNTPs.
  • the vector resulting from this cloning (plU17.4.M) was subjected to a double-strand mutagenesis reaction using the Mutagenesis Primer A using the USE method (Pharmacia Biotech), the restriction being able to be carried out using Xhol, since the mutagenesis resulted in the singular Xhol interface in the aprotinin gene is removed.
  • the mutagenesis primer A had the following sequence:
  • This primer generates the mutations Ile13, Tyr17 and Thr19 in the Ser10-Arg15-Ala17-Asp24-Thr26-Glu31-Asn41-Glu53-aprotinin gene.
  • the clones were analyzed by restriction digestion with the enzymes Xbal and Xhol. The desired sequence was also confirmed by DNA sequencing of the clone pIU2.7.M.
  • Yeast cells (JC34.4D) were transformed with the vector plU2.7.M.
  • the expression vector plU2.7.M no longer contains any ⁇ -factor per sequence, so that the processing of the Ser10-Ile13-Arg15-Tyr17-Thr19-Asp24-Thr26-Glu31-Asn41-Glu53-aprotinin takes place exclusively and independently of the signal peptidase is from the cleavage by the Kexll protease.
  • Example 2 Preparation of a yeast expression vector for the secretion of recombinant Ser10-Ile13-Arg15-Tyr17-Thr19-Asp24-Thr26-Glu31-Leu39-Asn41-Glu53-aprotinin
  • a Ser10-Arg15-Ala17-Asp24-Thr26-Glu31-Asn41-Glu53-aprotinin gene was used as the starting material for the production of the Ser10-Ile13-Arg15-Tyr17-Thr19-Asp24-Thr26-Glu31-Leu39-Asn41-Glu53-Aprotinin gene in the vector plU17.4.M (see example 1).
  • the vector plU17.4.M was subjected to a double-strand mutagenesis reaction with the mutagenesis primers A (see Example 1) and B using the USE method (Pharmacia Biotech), the restriction being able to be carried out with Xhol, since - 20 -
  • mutagenesis with primer A removes the unique Xhol site in the aprotinin gene.
  • the mutagenesis primer B had the following sequence:
  • Primer A generates the mutations Ile13, Tyr17 and Thr19 and primer B the mutation Leu39 in the Ser10-Arg15-Ala17-Asp24-Thr26-Glu31-Asn41-Glu53-aprotinin gene.
  • the clones were analyzed by restriction digestion with the enzymes Xbal and Xhol. The desired sequence was also confirmed by DNA sequencing of the clone pES8.4.O.
  • Yeast cells (JC34.4D) were transformed with the vector pES8.4.O.
  • Example 3 Preparation of a yeast expression vector for the secretion of recombinant He13-Arg15-Tyr17-Thr19-Leu39-Leu46-aprotinin with the natural N-terminal sequence 'Arg-Pro-Asp'
  • the MF ⁇ 1 promoter with the ⁇ factor was first used pre-sequence and the 5 ° end of the aprotinin gene (up to the recognition sequence of the restriction enzyme Xhol) were amplified by PCR and cloned.
  • the primers used had the following sequences:
  • Primer C (the EcoRV recognition sequence is underlined): 5 'GGG .
  • AI CTATTGATAAGATTTAAAGGTATTTGACAAG 3 '.
  • the PCR mixture contained 200 ng pA202 plasmid DNA, 0.2 ⁇ M primer C, 0.2 ⁇ M primer D, 200 ⁇ M dNTPs, 1 x PCR reaction buffer 11 (Stratagene, Opti- Prime® ) and 2.5 U Taq DNA polymerase (Perkin bucket) in a total volume of 50 ⁇ l.
  • the " cycle " conditions were: 1 min at 94 ° C, 30 cycles of 1 min each at 94 ° C, 1 min at 50 ° C and 2 min at 72 ° C and a subsequent 5 min incubation at 72 ° C.
  • the PCR mixture was diluted 1: 5 and ligated with the vector pCRH (Invitrogen). E. coli DH5 ⁇ cells were transformed with the ligation mixture. Positive clones were identified after restriction digestion with the enzyme EcoRI and several clones were sequenced. The clone plU20. 11.L was used for further work.
  • the E. coli / yeast swing vector pYES2 (Invitrogen) was used to construct a yeast secretion vector in which the Ile13-Arg15-Tyr17-Thr19-Leu39-Leu46-aprotinin sequence was directly linked to the yeast alpha-factor pre-sequence is.
  • the vector pYES2 was cut with the restriction enzymes Sspl and BamHI, dephosphorylated and gel-cleaned.
  • the GAL1 promoter present on the vector pYES2 and the f1 ori are removed in the process. An approx.
  • 1030 bp DNA fragment was cut out of the vector plU20.11.L with EcoRV and Xhol, purified by agarose gel electrophoresis and together with an approx. 180 bp Xhol and BamHI fragment from the vector pEM24.3.L in Vector pYES2 clipped with Sspl and BamHI.
  • E. coli DH5 ⁇ cells were transformed. After a restriction digest, positive clones were identified with the enzyme Xhol and sequenced. Yeast cells (JC34.4D) were transformed with the vector pEM1.4.L resulting from this cloning.
  • Example 4 Preparation of a yeast expression vector for the secretion of recombinant DesPro2-Ill13-Arg15-Tyr17-Thr19-Leu39-Leu46 spacer-Arg15-Ala17-bikunin
  • Tyr17-Thr19-Leu39-Leu46-Spacer-Arg15-Ala17-Bikunin genes served one DesPro2-He13-Arg15-Tyr-17-Thr19-Leu-39-Leu46 gene, one Arg15-Ala17 gene and two - 22 -
  • Each aprotinin variant gene was coupled to one of the spacer oligonucleotides by means of a PCR reaction and ligated into a PCR cloning vector.
  • Spacer oligonucleotide 2 5 'GGA AGA TTG TAT GAG AAC CTG CGG TGG TGC TAA CGC TAA CAG AAT TAT GAA GAC TAC TTT GCA ACA AGA AAA GCC AGA TTT CTG TC 3'
  • the PCR mixture contained 570 ng pEM30.3.L plasmid DNA (coding for DesPro (2) - Ile (13) -Arg (15) -Tyr (17) -Thr (19) -Leu (39) -Leu (46 ) -Protinin), 20 pmol primer E (primer E binds in the ⁇ -factor leader and has the following sequence: 5 'AACGGGTTATTGTTTATA 3'), 60 pmol spacer oligonucleotide 1, 200 ⁇ M dNTP, 1x PCR reaction buffer II (Perkin Elmer), 2 mM MgCI 2 and 2.5 U Taq DNA polymerase (Perkin Elmer) in a total volume of 100 ⁇ l.
  • the Oycle ' conditions were: 3 min at 95 ° C, 25 cycles of 1 min each at 94 ° C, 1 min at 55 ° C and 1 min at 72 ° C and a subsequent 5 min incubation at 72 ° C.
  • the PCR mixture was diluted 1: 5 and ligated with the vector pCRII (invitrogen). With the ligation approach, E. coli DH5 ⁇ cells were transformed. Positive clones were identified via "blue-white screening" and after restriction digestion with the enzymes Xhol and BamHI. The clone pEM22.5.L contained the desired sequence and was used for further work.
  • Reaction conditions Heat test batch without Klenow fragment for 3 min at 95 ° C. After adding the Klenow fragment, the mixture was incubated at room temperature for 30 min. The mixture was heated to 70 ° C. and 2.5 U Taq DNA polymerase and 20 pmol reverse primer M13 were added.
  • the cycle conditions were: 3 min at 95 ° C, 30 cycles of 1 min each at 94 ° C, 1 min at 45 ° C and 1 min at 72 ° C and a subsequent 5 min incubation at 72 ° C.
  • Approximately 150 ng of the PCR fragment were ligated with the vector pCRH (Invitrogen). With the ligation approach, E. coli DH5 ⁇ cells were transformed. After a restriction digest, positive clones were identified with the enzyme EcoRI and sequenced. The clone pEM12.6.L contained the desired sequence and was used for the further work.
  • a 182 bp DNA fragment was cut out of the vector pEM22.5.L with Hind III and BspMI and a 240 bp DNA fragment with BamHI and BspMI from the vector pEM 12.6.L, purified by agarose gel electrophoresis and overnight ligated with T4 DNA ligase.
  • the ligation product was cloned into the vector pUC 19 via the restriction sites Hind III and BamHI.
  • the resulting clone (pEM16.6.L) had the desired sequence.
  • coli / yeast swing vector pA202 was used for the construction of a yeast secretion vector in which the DesPro2-Ile13-Arg15-Tyr17-Thr19-Leu39-Leu46-Spacer-Arg15-Ala17-Bikunin sequence with the yeast alpha factor pre -pro- linked.
  • the vector pA202 carries an ampicillin resistance gene (bla) and a URA3 gene as selectable marker genes for E. coli and yeast.
  • Col E1 the Col E1 and the 2 ⁇ origin of replication (ori).
  • the REP3 locus is also in this region.
  • a 1200 bp EcoRI-Hindlll fragment carries the MF ⁇ 1 promoter and the N-terminal pre-pro sequence of the yeast alpha factor precursor protein (Kurjan and Herskowitz, Cell 30, 933-943, 1982).
  • Yeast vector cloning A 422 bp fragment is cut out of the clone pEM16.6.L with the restriction enzymes HindIII and BamHI. This is purified on an agarose gel and also cloned into the vector pA202 cut with HindIII and BamHI. The resulting clone pEM21.6.L is used for the transformation of yeast cells (JC34.4D).
  • E. coli / yeast swing vectors with different promoters such as the constitutive GAPDH or the inducible GAL10 promoter can be produced in a similar manner and also lead to the secretion of the DesPro2-Ile13-Arg15-Tyr17-Thr19-Leu39-Leu46-spacer-Arg15-Ala17-bikunin.
  • swing vectors with other origins of yeast replication e.g. use the chromosomally autonomously replicating segment (ars).
  • Suitable selectable marker genes are, in addition to the URA3 gene, those genes which help an auxotrophic yeast mutant to prototrophy, such as e.g. the LEU2, HIS3 or TRP1 genes. In addition, genes whose products are resistant to various antibiotics, such as e.g. mediate the aminoglycoside G418.
  • yeasts such as After transformation with suitable vectors, the methylotrophic yeasts Pichia pastoris or Hansenula polymorpha are also able to produce DesPro2-Ile13-Arg15-Tyr17-Thr19-Leu39-Leu46-Spacer-Arg15-Ala17-Bikunin.
  • a recombinant Saccharomyces cerevisae expression strain was used for the fermentation (see: Methods for Carrying Out the Invention). - 25 -
  • Example 6 Cleaning of aprotinin variants without a net charge at neutral pH and of bikunins
  • the cell-free supernatant is adjusted to pH 3 by adding concentrated citric acid.
  • the solution must be suitably diluted with purified water to achieve a conductivity of less than 8 mS / cm.
  • the solution is then applied to a cation exchange column which has previously been equilibrated with an acid buffer. Unbound material is removed by washing extensively with start buffer.
  • the product is eluted using a salt gradient.
  • the fractions obtained are examined for their product content by means of reverse phase high pressure liquid chromatography (RP-HPLC) and a biological activity test which determines the protease inhibition. Fractions containing the product are pooled and applied directly to a preparative RP-HPLC column.
  • RP-HPLC reverse phase high pressure liquid chromatography
  • the column was previously equilibrated with an acid buffer. Unbound protein is removed by washing the column with start buffer. The product is eluted using an organic solvent gradient. As already described above, the fractions are examined again for the product content and those fractions which contain product are combined. Depending on the purity of the product, it may be necessary to purify the pooled fractions on a second RP-HPLC column. The conditions are essentially the same as previously described. The product solution obtained is diluted with water for injections and filled into suitable portions and freeze-dried. - 26 -
  • the contents of the fermenter were adjusted to pH 3 with concentrated citric acid and heated to 70 ° C. for 10 minutes.
  • the cells were then removed by centrifugation (15 minutes, 7500 ⁇ g, Heraeus centrifuge) and the supernatant obtained was filtered (8 ⁇ m to 0.2 ⁇ m, Millipore, Germany). At this stage, the supernatant can be stored by freezing at -18 ° C until further use.
  • the solution was then applied by addition of purified water to a conductivity of less than 8 mS / cm and applied to an SP-Sepharose ® FF column (Pharmacia, Sweden). The column had previously been equilibrated with 50 mM citrate-NaOH buffer, pH 3.
  • Unbound protein was removed by intensive washing with the same buffer.
  • the product was then eluted using a salt gradient (1 M NaCl).
  • the fractions obtained were examined for the product content by means of reverse phase high pressure liquid chromatography (RP-HPLC, C4) and by testing the protease inhibition activity.
  • the protein was taken up in 150 mM NaCl / 50 mM phosphate buffer pH 7.3 and chromatographed on a Superdex 30. The fractions obtained were examined again for the product content using the methods described above and those containing product were combined.
  • Material from 10 l fermentations was purified by the following procedure. After the fermentation was complete, the contents of the fermenter were adjusted to pH 3 with concentrated citric acid and heated to 70 ° C. for 10 minutes. The cells were then removed by centrifugation (15 minutes, 7500 xg, Heraeus centrifuge) and the supernatant obtained was filtered (8 ⁇ m to 0.2 ⁇ m, Millipore, Germany). At this stage, the supernatant can be stored by freezing at -18 ° C until further use. The solution was then applied by addition of purified water to a conductivity of less than 8 mS / cm and applied to an SP-Sepharose ® FF column (Pharmacia, Sweden).
  • the column had previously been equilibrated with 50 mM citrate-NaOH buffer, pH 3. Unbound protein was removed by intensive washing with the same buffer. The product was then eluted using a salt gradient (1 M NaCl). The obtained fractions were chromatographed after adjusting to less than 8 mS / cm with a Sepharose ® HP. The column had previously been equilibrated with 20 mM Hepes-NaOH buffer, pH 6. Unbound protein was removed by intensive washing with the same buffer. The product was then eluted using a salt gradient (1 M NaCl).
  • the product solution was then applied directly to the first RP-HPLC column (Source 15 RPC, Pharmacia, Sweden), which had previously been equilibrated with 0.1% trifluoroacetic acid / water. Unbound protein was removed by intensive washing with the same buffer. The product was eluted using a linear acetonitrile gradient (0-70%). The fractions obtained were again checked for product content using the methods described above, and those containing product were combined and lyophilized.
  • the protein was chromatographed on a Source S30 using a pH 6 Hepes / NaCl gradient. The fractions obtained were examined again for the product content using the methods described above and those containing the product were combined and lyophilized.
  • Example 7 Determination of the Ki value of human plasmin with Ser10-Ile13-Arg15-Tyr17-Thr19-Asp24-Thr26-Glu31 -Asn41 -Glu53-aprotinin
  • the enzyme / inhibitor solution was preincubated for 4 h at room temperature, then 180 ⁇ l of each solution was added to the well of a microtiter plate and 20 ⁇ l of substrate solution were added. The change in absorption was measured at 405 nm for 10 min. The speed of the enzyme reactions was determined and the Ki value calculated therefrom by the method of Bieth (Biochemical Medicine 32: 387-97 (1984) or Meth. In Enzym. 248: 59-84 (1995)).
  • Substrate solution 1x10 3 M Chromozym PL in assay buffer - 29 -
  • Assay buffer 0.2 M tris (hydroxymethyl) aminomethane
  • the kinetic constants of the complexation with the enzymes kallikrein, factor Xa, trypsin and chymotrypsin were determined using the same procedure.
  • the substrates were HD-Pro-Phe-Arg-pNA for plasma kallikrein, S-2444 for trypsin, Suc-Phe-Leu-Phe-pNA for chymotrypsin and Bz-III-Glu-Gly-Arg-pNA for FXa.
  • the kinetic constants of the bikunins, the single domains of the bikunins and the PEG conjugates were determined using the same method.
  • Example 8 Results of the protein chemical characterization of Ser10-Ile13-Arg 15-Tyr17-Thr19-Asp24-Thr26-Glu31 -Asn41 -Glu53-aprotinin
  • protease inhibitor Ser10-lle13-Arg 15-Tyr17-Thr19-Asp24-Thr26-Glu31 -Asn41 - Glu53-aprotinin was produced by secretion using a genetically modified yeast organism. It was purified from the yeast supernatant to homogeneity by various chromatographic methods. The identity of the inhibitor with the cloned sequence is shown in the protein analysis below.
  • N-terminal sequence analysis The protease inhibitor was completely sequenced over 58 steps. The following list shows the particular protein sequence that is identical to the cloned sequence: 1
  • Amino acid analysis represents an important quantitative parameter for the characterization of a protein. In addition to the protein content, the number of individual amino acids is determined if the primary structure is known. The amino acid analysis of Ser10-Ile13-Arg15-Tyr17-Thr19-Asp24-Thr26-Glu31-Asn41-Glu53-aprotinin is in good agreement with the theoretical values from the primary structure (Tab. 1).
  • Cysteine was determined after performic acid oxidation.
  • Reverse phase chromatography In HPLC chromatography of proteins on chemically bound reverse phases, the hydrophobic interaction of the proteins leads to binding to the phase used. The proteins are displaced by organic solvents (mobile phase) according to the strength of their binding to the stationary phase. For this reason, this method is one - 31 -
  • protease inhibitor Ser10-Ill13-Arg15-Tyr17-Thr19-Asp24-Thr26-Glu31 -Asn41 -Glu53-aprotinin eluted as a slender peak from an RP-18 phase.
  • CE Chromatography Capillary electrophoresis allows the separation of peptides and proteins based on their charge in the electric field. The quality of the separation depends on the buffer, the pH value, the temperature and the additives used. So-called “fused silica” columns with an inner diameter of 50 to 100 ⁇ m are used as capillaries. The protease inhibitor Ser10-Ile13-Arg15-Tyr17-Thr19-Asp24-Thr26-Glu31-Asn41-Glu53-aprotinin was separated on a "fused silica" column in an electric field. The electropherogram shows a slender peak.
  • Molecular weight determination The molecular weight of Ser10-Ile13-Arg15-Tyr17-Thr19-Asp24-Thr26-Glu31-Asn41-Glu53-aprotinin was determined using the MALDI technique to 6425Dalton. The molecular weight determined is in good agreement with the theoretical value of 6408 daltons within the scope of the accuracy of the measurement method. Sinapic acid was used as the matrix.
  • SDS gel electrophoresis Ser10-Ile13-Arg15-Tyr17-Thr19-Asp24-Thr26-Glu31-Asn41-Glu53-aprotinin was analyzed by SDS electrophoresis under reducing and non-reducing conditions. The gels show a band in the range of approximately 6.5 kD.
  • Example 9 Determination of the Ki values for the complexation of enzymes with Ser10-Ile13-Arg15-Tyr17-Thr19-Asp24-Thr26-Glu31-Asn41 -Glu53-aprotinin
  • the inhibitory constants of Ser10-ile13-Arg15-Tyr17-Thr19-Asp24-Thr26-Glu31-Asn41-Glu53-aprotinin were determined for various enzymes.
  • the Ki values are shown in Table 2. - 32 -
  • Example 10 Interaction of the protease inhibitors with polyclonal rabbits or human anti-aprotinin antibodies
  • protease inhibitors were examined for their cross-reactivity with polyclonal rabbits or human anti-aprotinin antibodies. It was found that the different protease inhibitor variants show only a very weak cross-reactivity towards the polyclonal rabbits or human anti-aprotinin antisera used.
  • Example 11 Determination of the Ki value of human urinary kallikrein with DesPro2-Ile13-Arg 15-Tyr17-Thr19-Leu39-Leu46 spacer-Arg 15-Ala17-bikunin
  • the Ki value was determined using human urinary kallikrein as described in Example 7.
  • the inhibitor concentration used was 1.1 ⁇ g / ⁇ l. 33 -
  • Assay buffer 0.05 M tris- (hydroxymethyl) aminomethane, 0.1 M NaCl, 0.05% Tween ® -20; pH 7.5; 1 ml benzyl alcohol / l.
  • the kinetic constants of the complexation with the enzymes kallikrein, factor Xa, chymotrypsin and plasmin were determined using the same procedure.
  • the substrates were HD-Pro-Phe-Arg-pNA for plasma kallikrein, Suc-Phe-Leu-Phe-pNA for chymotrypsin, Bz-III-Glu-Gly-Arg-pNA for FXa and Chromozym PL for plasmin.
  • Example 12 Results of the protein chemical characterization of DesPro2-Ile13-Arg 15-Tyr17-Thr19-Leu39-Leu46 spacer-Arg 15-Ala17-bikunin
  • the protease inhibitor DesPro2-lle13-Arg 15-Tyr17-Thr19-Leu39-Leu46-Spacer-Arg15-Ala17-Bikunin was produced by secretion using a genetically modified yeast organism. It was purified from the yeast supernatant to homogeneity by various chromatographic methods. The identity of the inhibitor with the cloned sequence is shown in the protein analysis below.
  • the protease inhibitor was completely sequenced.
  • the sequencing was carried out N-terminally, via fragments of the bikunin which were isolated from the culture supernatant and via cyanogen bromide.
  • the following list shows the specific protein sequences of the fragments: N-terminal sequencing (underlined), fragment of bikunin from the culture supernatant of the yeast fermentation (bold), bromine cyanogen fragment (italic).
  • the sequence found is identical to the cloned sequence. - 34 -
  • Amino acid analysis represents an important quantitative parameter for the characterization of a protein. In addition to the protein content, the number of individual amino acids is determined if the primary structure is known. The amino acid analysis of DesPro2-lle13-Arg 15-Tyr17-Thr19-Leu39-Leu46-Spacer-Arg15-Ala17-Bikunin is in good agreement with the theoretical values from the primary structure (Table 3).
  • Cysteine and methionine were determined after performic acid oxidation (Met as methionine sulfone).
  • Reverse phase chromatography In HPLC chromatography of proteins on chemically bound reverse phases, the hydrophobic interaction of the proteins leads to binding to the phase used. The proteins are displaced by organic solvents (mobile phase) according to the strength of their binding to the stationary phase. For this reason, this method is a good criterion for assessing the purity of a protein. DesPro2-Ile13-Arg15-Tyr17-Thr19-Leu39-Leu46-Spacer-Arg15-Ala17-Bikunin eluted as a clean peak from the RP-18 phase.
  • Example 13 Determination of the Ki values for the complexation of enzymes with DesPro2-III13-Arg 15-Tyr17-Thr19-Leu39-Leu46 spacer-Arg 15-Ala17-bikunin
  • Table 4 Inhibitory constants of the complexation of DesPro2-lle13-Arg15-Tyr17-Thr19-Leu39-Leu46-Spacer-Arg15-Ala17-Bikunin with the enzymes urinary kallikrein, factor Xa, bovine chymotrypsin, plasma kallikrein and plasmin.
  • Example 14 Results of the protein chemical characterization of Thr-Thr-Leu-Gln-Gln-Glu-Lys-DesArg 1 -Arg 15-Ala17-aprotinin
  • protease inhibitor Thr-Thr-Leu-Gln-Gln-Glu-Lys-DesArg1-Arg15-Ala17-aprotinin was isolated from the yeast supernatant along with other cleavage products of bikunin by various chromatographic methods.
  • Reverse phase chromatography In HPLC chromatography of proteins on chemically bound reverse phases, the hydrophobic interaction of the proteins leads to binding to the phase used. The proteins are displaced by organic solvents (mobile phase) according to the strength of their binding to the stationary phase. For this reason, this method is a good criterion for assessing the purity of a protein. Thr-Thr-Leu-Gln-Gln-Glu-Lys-DesArg1-Arg15-Ala17-aprotinin eluted as a clean peak from the RP-18 phase.
  • Molecular weight determination The molecular weight of Thr-Thr-Leu-Gln-Glu-Glu-Lys-DesArg1-Arg15-Ala17-aprotinin was determined using the MALDI technique as Na + -lon to 7154 daltons. The molecular weight determined is in good agreement with the theoretical value of the Na + ion of 7150 daltons within the scope of the accuracy of the measurement method. Sinapic acid was used as the matrix. - 38 -
  • Aprotinin was analyzed by SDS electrophoresis under reducing and non-reducing conditions.
  • the gels show a band in the range of approx. 7kD.
  • Example 15 Determination of the Ki values for the complexation of enzymes with Thr-Thr-Leu-Gln-Gln-Glu-Lys-DesArg1-Arg15-Ala17-aprotinin
  • the inhibitory constants of Thr-Thr-Leu-Gln-Gln-Glu-Lys-DesArg1-Arg15-Ala17-aprotinin were determined for various enzymes.
  • the Ki values are shown in Table 5.
  • Table 5 Inhibitory constants of the complexation of Thr-Thr-Leu-Gln-Gln-Glu-Lys-DesArg1-Arg15-Ala17-aprotinin with the enzymes urinary kallikrein, factor Xa, chymotrypsin, plasma kallikrein and plasmin.
  • Chymotrypsin 1x10 "8 - 39 -
  • Example 16 Results of the protein chemical characterization of Asp (-3) -Lys (- 2) -Arg (-1) -DesPro2-Ile13-Arg15-Tyr17-Thr19-Leu39-Leu46-aprotinin-Asn59-Ala60-Asn61
  • the protease inhibitor Asp (-3) -Lys (-2) -Arg (-1) -DesPro2-Ill13-Arg15-Tyr17-Thr19-Leu39-Leu46-aprotinin-Asn59-Ala60-Asn61 was obtained from the yeast supernatant along with other cleavage products of bikunin different chromatographic methods isolated.
  • the protease inhibitor corresponds to the front part of the bikunin. It contains the LKunitz domain. It was cleaned to homogeneity. Belonging to Bikunin is shown in the following protein analysis tests.
  • Reverse phase chromatography In HPLC chromatography of proteins on chemically bound reverse phases, the hydrophobic interaction of the proteins leads to binding to the phase used. The proteins are displaced by organic solvents (mobile phase) according to the strength of their binding to the stationary phase. For this reason, this method is a good criterion for assessing the purity of a protein.
  • the protease inhibitor Asp (-3) -Lys (-2) -Arg (-1) -DesPro2-Ill13-Arg15-Tyr17-Thr19-Leu39-Leu46-aprotinin-Asn59-Ala60-Asn61 eluted as a clean peak from the RP-18 - phase. - 40 -
  • Capillary electrophoresis The protease inhibitor Asp (-3) -Lys (-2) -Arg (-1) -DesPro2-lle13-Arg15-Tyr17-Thr19-Leu39-Leu46-aprotinin-Asn59-Ala60-Asn61 was analyzed using capillary electrophoresis. The inhibitor shows a slim peak at approx. 12 min.
  • Example 17 Determination of the Ki values for the complexation of enzymes with Asp (- 3) -Lys (-2) -Arg (-1) -DesPro2-Ile13-Arg15-Tyr17-Thr19-Leu39-Leu46-Aprotinin-Asn59- Ala60-Asn61
  • the inhibitory constants of Asp (-3) -Lys (-2) -Arg (-1) -DesPro2-Ile13-Arg15-Tyr17-Thr19-Leu39-Leu46-aprotinin-Asn59-Ala60-Asn61 were determined for various enzymes.
  • the Ki values are shown in Table 6.
  • Table 6 Inhibitory constants of the complexation of Asp (-3) -Lys (-2) -Arg (-1) - DesPro2-Ile13-Arg15-Tyr17-Thr19-Leu39-Leu46-aprotinin-Asn59-Ala60-Asn61 with the enzymes Factor Xa, plasma kallikrein and plasmin.
  • Example 18 Synthesis and purification of Ser10-Ile13-Arg15-Tyr17-Thr19-Asp24-Thr26-Glu31-Asn41-Glu53-aprotinin-PEG-5000
  • the SC-PEG-5000 (succinimidyl carbonate, polyethylene glycol monomethyl ether-5000; average molecular weight 5 kD) was obtained from Calbiochem, D-Bad Soden.
  • Example 19 Results of the protein chemical characterization of PEG-Ser10-He13-Arg15-Tyr17-Thr19-Asp24-Thr26-Glu31-Asn41-Glu53-aprotinin
  • protease inhibitor PEG-Ser10-Ile13-Arg15-Tyr17-Thr19-Asp24-Thr26-Glu31-Asn41-Glu53-aprotinin was separated from the starting products after the reaction by gel filtration and used for characterization.
  • Example 20 Determination of the Ki values for the complexation of enzymes with PEG-Ser10-Ile13-Arg15-Tyr17-Thr19-Asp24-Thr26-Glu31-Asn41-Glu53-aprotinin
  • Table 7 Inhibitory constants of the complexation of PEG-Ser10-Ile13-Arg15-Tyr17-Thr19-Asp24-Thr26-Glu31-Asn41-Glu53-aprotinin with the enzymes factor Xa, plasma kallikrein and plasmin.

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Abstract

The invention relates to aprotinin variants with a net charge of +3 to -3 at pH 7. In the binding site, the amino acid radical 10 is Ser, the amino acid radical 13 is Ile, Phe or Leu, the amino acid radical 15 is Arg, the amino acid radical 17 is Tyr, Leu or Arg, and the amino acid radical 19 is Thr or Lys. The invention also relates to bikunins, comprising two aprotinin variants linked by a spacer with several amino acid radicals. One of said aprotinin variants is a) an aprotinin variant wherein the amino acid radical 13 is Ile, Phe or Leu, the amino acid radical 15 is Arg, Val or Leu, the amino acid radical 17 is Tyr, Leu or Ala, the amino acid radical 19 is Thr or Lys, the amino acid radical 39 is Arg or Leu, and the amino acid radical 46 is Leu or Lys; or b) an inventive aprotinin variant as defined above. The invention also relates to medicaments containing one or several of said aprotinin variants or bikunins, DNA sequences which give the coding for one of said aprotinin variants or bikunins, micro-organisms containing a DNA sequence of this type, and a method for producing said aprotinin variants and bikunins using micro-organisms.

Description

- 1 -
Aprotininvarianten mit verbesserten Eigenschaften und Bikunine von
Aprotininvarianten
Die vorliegende Erfindung betrifft Aprotininvarianten und Bikunine von Aprotininvarianten mit verbesserten enzyminhibitorischen, immunologischen und pharmakokinetischen Eigenschaften und deren Herstellung.
Aprotinin, das auch als boviner pankreatorischer Trypsin-Inhibitor (BPTI) bezeichnet wird, gehört zur Familie der Serinproteasen-Inhibitoren vom Kunitz-Typ. Das Spektrum der inhibierbaren Serinproteasen umfaßt z.B. Trypsin, Chymotrypsin, Plasmin, und Plasma-Kallikrein (W. Gebhard, H. Tschesche und H. Fritz, Proteinase Inhibitors, Barrett and Salvesen (eds.), Elsevier Science Publ. BV 375 - 387, 1986).
Aprotinin ist ein einkettiges Polypeptid mit 58 Aminosäuren mit der folgenden Sequenz:
Arg Pro Asp Phe Cys Leu Glu Pro Pro Tyr Thr Gly Pro Cys Lys Ala Arg Ile Ile Arg Tyr Phe Tyr Asn Ala Lys Ala Gly Leu Cys Gin Thr Phe Val Tyr Gly Gly Cys Arg Ala Lys Arg Asn Asn Phe Lys Ser Ala Glu Asp Cys Met Arg Thr Cys Gly Gly Ala.
Die dreidimensoniale Struktur des Proteins wurde mit Hilfe von Röntgenstrukturanalyse und NMR-Spektroskopie aufgeklärt (Wlodawer et al. J. Mol. Biol. 198 (3), 469 - 480, 1987; Wagner et al., J. Mol. Biol. 196 (1), 227 - 231 , 1987; Berndt et al., Biochemistry 32 (17), 4564 - 4570, 1993).
Unter dem Handelsnamen Trasylol® wird natürliches Aprotinin ursprünglich für die Behandlung von Pankreatitis eingesetzt. Trasylol wird heute in der Herzchirurgie - 2 -
verwendet, nachdem klinische Studien gezeigt haben, daß eine Behandlung mit Aprotinin den Transfusionsbedarf bei derartigen Operationen signifikant verringert und zur Reduktion von Nachblutungen führt (D.Royston, J.Cardiothorac. Vasc.Anesth. 6; 76-100, 1992).
Es konnte gezeigt werden, daß der Austausch der die Hemmspezifität festlegenden Aminosäure in Position 15 zu wertvollen Aprotininvarianten mit verbesserten Inhibitoreigenschaften führt (DE-PS 3339693). Je nach der eingeführten Aminosäure können auf diese Weise potente Inhibitoren erzeugt werden, die z.B. die Elastase aus Pankreas oder aus Leukozyten hemmen.
Ferner ließ sich zeigen, daß die Hemmeigenschaften von Aprotinin und der durch Austausch in der Position 15 erzeugten Varianten auch durch weitere Aminosäurereste in der Kontaktregion zwischen der zu hemmenden Zielprotease und dem Inhibitormolekül bestimmt wird. Dazu gehören vor allem die zusätzlichen Aminosäurereste in den Positionen 14, 16, 17, 18, 19, 34, 38 und 39. Aprotininvarianten mit verbesserten Eigenschaften durch Austausch einer oder mehrerer dieser Aminosäurereste im Bereich der Kontaktregion wurden u. a. in folgenden Patentanmeldungen beispielhaft beschrieben: WO 89/01968, WO 89/10374, EP 307 592, EP 683 229, DE 19 62 998.2, WO 94/01461.
Interessanterweise konnten die pharmakokinetischen Eigenschaften von Aprotinin und seinen Varianten verbessert werden durch Aminosäureaustausche, die die physikochemischen Eigenschaften der Substanz festlegen. So gelang es, durch Senkung der positiven Nettoladung des Moleküls die Nierenbindung signifikant zu senken. Solche Varianten wurden in der Patentanmeldung WO 92/06111 beschrieben.
Aus Gründen der besseren technischen Herstellbarkeit ist es günstig, in bestimmten
Fällen eine Modifikation am N-terminalen Ende des Inhibitormoleküls vorzunehmen. Solche Modifikationen können N-terminale Verkürzungen oder Verlängerungen oder - 3 -
Deletionen von einer oder mehreren Aminosäuren sein. N-terminal modifizierte Aprotininvarianten wurden in der Patentanmeldung EP 419 878 beschrieben.
Bikunine sind Proteaseinhibitoren, z.B. der Inter-alpha-Trypsininhibitor, die zwei Kunitzdomänen enthalten, die durch einen Spacer von mehreren Aminosäuren getrennt sind (J.-P.Salier, TIBS 15; 435-439, 1990). In der Regel ist dabei aber nur eine der beiden Kunitzdomänen inhibitorisch aktiv.
Erfindungsgemäße Aprotininvarianten und Bikunine von Aprotininvarianten
Die in der vorliegenden Patentanmeldung beanspruchten Aprotininvarianten und Bikunine zeichnen sich durch folgende Merkmale aus:
1. Austausch von einer oder von mehreren Aminosäuren im aktiven Zentrum des Moleküls zur Verbesserung der Aktivitätseigenschaften EP 307 592.
2. Austausch von Aminosäuren zur Senkung der positiven Nettoladung mit dem Ziel, die immunologischen und pharmakokinetischen Eigenschaften zu verbessern (WO 92/06111).
3. Modifikation der N-terminalen Aminosäuresequenz aus Gründen der technischen Herstellbarkeit EP 419 878.
4. Austausch von einer oder von mehreren Aminosäuren im aktiven Zentrum des Moleküls zur Änderung der Spezifität.
5. Verknüpfung von Aprotininvarianten mit unterschiedlichen Spezifitäten und Aktivitätseigenschaften unter Verwendung eines Spacers aus Aminosäuren, um das Hemmspektrum zu erweitern, durch die verknüpften Kunitzdomänen.
6. Einsatz der Bikunine als Pro-Drugs, da nach der Spaltung in der Spacerregion durch eine Protease, die Einzeldomänen als aktive Kunitzinhibitoren freigesetzt werden.
7. Aprotininvarianten und Bikunine, deren in vivo Halbwertszeit nach der Konjugation mit aktivierten Polyethylenglykol verlängert wird. - 4 -
Aprotininvarianten, die jeweils nur eines der genannten Merkmale enthalten, wurden in den oben zitierten Patentanmeldungen beschrieben. Die erfindungsgemäßen Aprotininvarianten vereinigen in ihrer Molekülstruktur nun zwei oder drei der oben genannten Merkmale bzw. stellen Proteaseinhibitoren aus mehreren Kunitzdomänen dar. Die Aminosäuresequenzen sind beispielhaft für einige Varianten bzw. Bikunine in den Figuren 1 und 2 dargestellt.
Die erfindungsgemäßen Aprotininvarianten beschränken sich jedoch nicht auf die in den Figuren 1 und 2 genannten Beispiele. Zu den erfindungsgemäßen Aprotininvarianten gehören auch Varianten mit der N-terminalen Verlängerung Ala(-2)- Gln(-1), mit dem natürlichen Aminosäurerest Prolin in Position 2, mit dem Austausch anderer Aminosäuren, die eine positive Ladung tragen gegen neutrale oder negativ geladene Aminosäurereste, oder mit dem Austausch anderer neutraler Aminosäuren gegen negativ geladene Aminosäurereste sowie mit Aminosäureaustausche im Spacer, die eine individuelle Aktivität der einzelnen Kunitzdomänen gewährleisten sowie Verbindung, die durch Spaltung der Kex-Protease im Leader entstehen. Die Auswahl der Austausche von Aminosäurereste in der Aprotininvariante folgt dabei dem Prinzip, eine Substanz zu erzeugen, die bei physiologischem pH-Wert eine reduzierte positive Nettoladung besitzt, bevorzugt im Bereich von +2 bis -2. Die genannten Änderungen in der Aminosäuresequenz einschließlich der N-terminalen Verlängerungen oder Verkürzungen oder Deletionen können in beliebiger Kombination miteinander genutzt werden. Zu den erfindungsgemäßen Aprotininvarianten gehören somit alle Verbindungen, die eine Kombination der oben genannten Merkmale aufweisen und eine, bei physiologischem pH-Wert reduzierte positive Nettoladung besitzen.
Die Aminosäuren im Spacer können Kombinationen aus natürlichen Aminosäuren sein, die die Ausrichtung der Einzeldomänen so gewährleisten, daß diese individuell aktiv sind. Die Aprotininvarianten für die Verknüpfung sind unter anderem beschrieben in EP 307 592, WO 92/06111, EP 419 878, WO 89/01968, WO 89/10374, EP 0307592, EP 683 229, DE 196 29 982. - 5 -
Überraschenderweise zeigte sich, daß die Kombination von zwei oder drei der genannten Merkmale nicht nur zum Erhalt, sondern teilweise sogar zur Verstärkung oder Änderung der Ausprägung der Einzelmerkmale gegenüber früher beschriebenen Varianten führt. Darüber hinaus konnten signifikante neue Substanzeigenschaften erzeugt werden, die sich z.B. auf die immunologischen, die pharmakokinetischen und die Oberflächenbindungseigenschaften beziehen. Die neuen Einzelvarianten zeigen eine deutlich verringerte Reaktion mit polyklonalen humanen und Kaninchen- Antiseren, die unter Verwendung von Aprotinin erzeugt wurden. Weiter wurde gefunden, daß die neuen Varianten ein verringertes immunogenes Verhalten im Vergleich zum Aprotinin besitzen. Die enzymkinetischen Hemmkonstanten (Ki-Werte) sind überraschenderweise trotz der großen Zahl an Veränderungen im Molekülkörper gegenüber früheren Varianten des Moleküls verbessert oder die Spezifität geändert worden. Bei den Bikuninen konnte überraschenderweise die individuelle Aktivität der Einzeldomänen beobachtet werden, wobei die Hemmkonstanten gegenüber den untersuchten Enzymen im Vergleich mit den Einzeldomänen leicht abgeschwächt wurden. Nach der enzymatischen Spaltung im Spacer entfalten die erzeugten Kunitzinhibitoren wieder ihre volle Aktivität oder werden in ihrer Aktivität unerwartet gesteigert.
Die vorliegende Erfindung betrifft Aprotininvarianten mit einer Nettoladung von +3 bis -3 bei pH 7, wobei in der Bindungsregion der Aminosäurerest 10 Ser ist, der Aminosäurerest 13 Ile, Phe oder Leu ist, der Aminosäurerest 15 Arg ist, der Aminosäurerest 17 Tyr, Leu oder Arg ist und der Aminosäurerest 19 Thr oder Lys ist. Bevorzugt sind solche Aprotininvarianten mit einer Nettoladung von +2 bis -2, besonders bevorzugt solche mit +1 bis -1.
Aprotininvarianten können eine veränderte N-terminale und/oder C-terminale Sequenz besitzen. Damit sind Aprotininvarianten mit einer N-terminalen Verlängerung oder Verkürzung oder mit deletierten Aminosäuren im N-Terminus gemeint. - 6 -
Bevorzugt sind Aprotininvarianten mit der Formel
Arg X2 Asp Phe Cys Leu Glu Pro Pro Ser Thr Gly X13 Cys Arg Ala X17 Ile Thr Arg Tyr Phe Tyr X24 Ala Thr Ala Gly Leu Cys X31 Thr Phe Val Tyr Gly Gly Cys X39 Ala Asn Arg Asn Asn Phe X46 Ser Ala Glu Asp Cys Met Glu Thr Cys Gly Gly Ala
worin X2 Pro oder eine Bindung ist, X13 Ile, Phe oder Leu ist, X17 Tyr Leu oder Arg ist, X24 Asp oder Asn ist, X31 Glu oder Gin ist X39 Arg oder Leu ist, X46 Lys oder Leu ist oder Polyethylenglykolderivate derselben.
Besonders bevorzugt sind die Aprotininvarianten DesPro2-Ser10-lle13-Arg15-Tyr17- Thr19-Asp24-Thr26-Glu31-Asn41-Glu53-Aprotinin, DesPro2-Ser10-lle13-Arg15-Thr19- Asp24-Thr26-Glu31-Asn41-Glu53-Aprotinin, DesPro2-Ser10-lle13-Arg15-Tyr17-Thr19- Asp24-Thr26-Glu31-Leu39-Asn41-Glu53-Aprotinin, DesPro2-Ser10-lle13-Arg15- Thr19-Asp24-Thr26-Glu31 -Leu39-Asn41 -Glu53-Aprotinin, DesPro2-Ser10-Phe13- Arg15-Tyr17-Thr19-Asp24-Thr26-Glu31-Asn41-Glu53-Aprotinin, DesPro2-Ser10- Leu13-Arg15-Tyr17-Thr19-Asp24-Thr26-Glu31-Asn41-Glu53-Aprotinin, DesPro2- Ser10-lle13-Arg15-Tyr17-Thr19-Asp24-Thr26-Asn41-Glu53-Aprotinin, PEG-DesPro2- Ser10-lle13-Arg15-Tyr17-Thr19-Asp24-Thr26-Asn41-Glu53-Aprotinin, DesPro2-Ser10- He13-Arg15-Tyr17-Thr19-Thr26-Asn41-Glu53-Aprotinin. Diese besonders bevorzugten Aprotininvarianten können auch die Aminosäure Prolin in der Position 2 tragen.
Die vorgehend genannten Aprotininvarianten eignen sich zur Hemmung von Plasmakallikrein, Plasmin und Faktor Xa.
Die Erfindung betrifft weiterhin Bikunine, umfassend zwei durch einen Spacer mit mehreren Aminosäureresten verknüpfte Aprotininvarianten, wobei eine der Arpotininvarianten a) eine Aprotininvariante ist, in der der Aminosäurerest 13, Ile, Phe oder Leu ist, der Aminosäurerest 15 Arg, Val oder Leu ist, der Aminosäurerest 17 Tyr, Leu oder Ala ist, der Aminosäurerest 19 Thr oder Lys ist, der Aminosäurerest 39 Arg oder Leu ist, und der Aminosäurerest 46 Leu oder Lys ist, oder b) eine vorstehend definierte, erfindungsgemäße Aprotininvariante ist. - 7 -
Der Spacer weist bevorzugt 10 bis 40, insbesondere 10 bis 20 Aminosäurereste auf. Als Spacer sind besonders bevorzugt Sequenzen mit 13 Aminosäureresten, insbesondere die folgenden Sequenzen: Asn-Ala-Asn-Arg-Ile-Ile-Lys-Thr-Thr-Leu-Gln-Gln-Glu, Asn-Ala-Asn-Arg-Leu-Leu-Lys- Thr-Thr-Leu-Gln-Gln-Glu und Gln-Ala-Gln-Arg-lle-lle-Lys-Thr-Thr-Leu-Gln-Gln-Glu.
Zusätzlich können diese Bikunine eine veränderte N-terminale Sequenz besitzen. Damit sind Bikunine mit einer N-terminalen Verlängerung oder Verkürzung oder mit deletierten Aminosäuren im N-Terminus gemeint. Weiter können diese Bikunine Austausche und Verlängerungen oder Verkürzungen der bevorzugten Spacersequenzen enthalten.
Bevorzugt sind Bikunine aus der Gruppe mit der Formel Arg X2 Asp Phe Cys Leu Glu Pro Pro X10 Thr Gly X13 Cys X15 Ala X17 Ile X19 Arg Tyr Phe Tyr X24 Ala X26 Ala Gly Leu Cys X31 Thr Phe Val Tyr Gly Gly Cys X39 Ala X41 Arg Asn Asn Phe X46 Ser Ala Glu Asp Cys Met X53 Thr Cys Gly Gly Ala Asn Ala Asn Arg X63 X64 Lys Thr Thr Leu Gin Gin Glu X72 Pro Asp Phe Cys Leu Glu Pro Pro X81 Thr Gly X84 Cys Arg Ala X88 Ile X90 Arg Tyr Phe Tyr X95 Ala X97 Ala Gly Leu Cys X102 Thr Phe Val Tyr Gly Gly Cys X110 Ala X112 Arg Asn Asn Phe Lys Ser Ala Glu Asp Cys Met X124 Thr Cys Gly Gly Ala, wobei X2 Pro oder eine Bindung ist, X10 Ser oder Tyr ist, X13 Ile oder Pro ist, X15 Arg, Val oder Lys ist, X17 Tyr, Arg oder Ala ist, X19 Thr oder Ile ist, X24 Asp oder Asn ist, X26 Thr oder Lys ist, X31 Glu oder Gin ist, X39 Arg oder Leu ist, X41 Asn oder Lys ist, X46 Lys oder Leu ist, X53 Glu oder Arg ist, X63 und X64 jeweils Ile oder Leu ist, X72 Arg oder Lys ist, X81 Tyr oder Ser ist, X84 Pro oder Ile ist, X88 Ala oder Tyr ist, X90 Ile oder Thr ist, X95 Asn oder Asp ist, X97 Lys oder Thr ist, X102 Gin oder Glu ist, X110 Arg oder Leu ist, X112 Lys oder Asn ist und X124 Arg oder Glu ist.
Besonders bevorzugt sind die Bikunine DesPro2-Ser10-lle13-Arg15-Tyr17-Thr19-
Asp24-Thr26-Glu31-Asn41-Glu53-Arg86-Ala88-Bikunin, DesPro2-Ser10-lle13-Arg15- Thr19-Asp24-Thr26-Glu31-Asn41-Glu53-Arg86-Ala88-Bikunin, DesPro2-Arg15-Ala17- - 8 -
Ser81-Ile84-Arg86-Tyr88-Thr90-Asp95-Thr97-Glu102-Asn112-Glu124-Bikunin, DesPro2-lle13-Arg15-Tyr17-Thr19-Leu39-Leu46-Arg86-Ala88-Bikunin, DesPro2- Ser10-lle13-Arg15-Tyr17-Thr19-Asp24-Thr26-Glu31 -Asn41 -Glu53-Ser81 -Arg86- Ala88-Asp95-Thr97-Glu102-Asn112-Glu124-Bikunin, DesPro2-Ser10-Val15-Asp24- Thr26-Glu31-Asn41-Glu53-Ser81-Arg86-Ala88-Asp95-Thr97-Glu102-Asn112-Glu124- Bikunin. Diese besonders bevorzugten Bikunine können auch die Aminosäure Prolin in der Position 2 tragen.
Die Bikunine eignen sich zur Hemmung von Plasmakallikrein, Faktor Xa, Plasmin und Elastase.
Diese Erfindung betrifft auch Arzneimittel enthaltend eine oder mehrere dieser Aprotininvarianten oder Bikunine.
Die beschriebenen neuartigen Proteaseinhibitoren eignen sich für die Behandlung von Krankheitszuständen, bei denen es - auch infolge komplexer chirugischer Verfahren wie z.B. in der Herzchirugie oder beim Gelenksersatz oder in der Transplantationsmedizin, bei künstlichen Organen - zu einer Aktivierung der plasmatischen Enzymsysteme durch ausgedehnten oder intensiven Fremdoberflächenkontakt und/oder durch zelluläre Bestandteile des Blutes kommt.
Die Inhibitoren reduzieren den Blutverlust bei Operationen, die mit einem erhöhten Blutungsrisiko (z.B. Herzoperationen, Knochen- und Gelenkschirugie) verbunden sind. Weiter sind sie zur Therapie thromboembolischer Krankheitszustände, wie sie z.B. nach Operationen, bei hyperkoagulablen Zuständen des Blutes, nach Unfällen oder nach der Thrombolysebehandlung auftreten können, einsetzbar. Sie eignen sich zur Therapie bei Schock, Polytrauma, Sepsis, disseminierter intravasaler Gerinnung (DIC), Multi-Organversagen (MOF), bei instabiler Angina, bei Herzinfarkt, Stroke, Embolie und tiefen Venenthrombosen, um Reokklusionen, Perfusionschäden, Thrombosen und Blutungen nach der Thrombolyse zu verhindern. Sie können bei entzündlichen Erkrankungen mit Beteiligung des Kallikreinsystems wie rheumatische - 9 -
Gelenkserkrankungen und Asthma eingesetzt werden. Sie verhindern das invasive Tumorwachstum und die Metastasierung durch Hemmung der Fibrinolyse. Sie eignen sich auch zur Schmerz- und Ödemtherapie, z.B. bei Schädel-Hirntrauma, durch die Hemmung der Gewebe- und des plasmatischen Kallikreins. Durch die Hemmung des intrinsischen und des extrinsinschen Blutgerinnungsweges können sie zur Verhinderung der Aktivierung der Hämostase bei der Dialysebehandlung verwendet werden.
Die Erfindung betrifft weiterhin DNA Sequenzen, die für eine der erfindungsgemäßen Aprotininvarianten oder Bikunine codieren, Mikroorganismen, die eine solche DNA- Sequenz enthalten, und ein Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemäßen Aprotininvarianten und Bikunine unter Verwendung der Mikroorganismen.
Figurenbeschreibung
Figur 1 und 2 zeigen die bevorzugten Aprotininvarianten und Bikunine von Aprotininvarianten der vorliegenden Erfindung. Die fettgedruckten Aminosäurereste stellen Mutationen des natürlichen Aprotinins dar. D stellt einen deletierten Aminosäurerest dar. Die Spacer der Bikunine sind die Aminosäurereste 59 bis 71.
Herstellung der erfindungsgemäßen Aprotininvarianten
Für die Herstellung der erfindungsgemäßen Aprotininvarianten und Bikunine ist es günstig, gentechnische Verfahren einzusetzen. Hierzu wird mit gängigen molekularbiologischen Methoden in einen geeigneten mikrobiellen Expressionsorganismus die genetische Information, d. h. eine entsprechende DNA- Sequenz, die die erfindungsgemäßen Aprotininvarianten und Bikunine codiert, für die Synthese der jeweils betrachteten Aprotininvariante eingeführt. Der rekombinante Mikroorganismus wird fermentiert; durch Wahl geeigneter Bedingungen wird die heterologe Erbinformation zur Expression gebracht. Die exprimierte Aprotininvariante bzw. das Bikunin wird im Anschluß aus der Kulturbrühe gewonnen. - 10 -
Geeignete Wirtsorganismen für die Produktion der erfindungsgemäßen Aprotininvarianten und Bikunine können Bakterien, Hefen oder Pilze sein. Die Expression kann intrazellulär oder unter Verwendung geeigneter Sekretionssysteme extrazellulär erfolgen. Die Aprotinvariante bzw. das Bikunin kann korrekt prozessiert oder fusioniert an Peptide oder Proteine erfolgen.
Geeignete Systeme zur Expression von Aprotininvarianten wurden in den Patentanmeldungen EP 683 229, WO 89/02463, WO 90/10075 und in verschiedenen weiteren der oben bereits genannten Patentanmeldungen beschrieben.
Methoden zur Durchführung der Erfindung
Enzyme: Die verwendeten Enzyme (Restriktionsendonucleasen, Alkalische Phosphatase aus Kälberdarm, T4 Polynucleotidkinase und T4 DNA Ligase) wurden von den Firmen Boehringer Mannheim und GIBCO/BRL bezogen und nach Vorschriften der Hersteller eingesetzt.
Molekularbiologische Techniken: Routinemäßige Klonierungsarbeiten wie z.B. die Isolation von Plasmid-DNA aus E. coli (sog. Miniprep) und die Transformation von E. coli mit Plasmid-DNA wurden nach Sambrook et al. (Molecular Cloning, Cold Spring Harbor, 1989) durchgeführt. Als Wirtsorganismus für Transformationen wurde der E. coli Stamm DH5α_(GIBCO/BRL) eingesetzt. Zur Isolation größerer Mengen Plasmid- DNA wurden Qiagen-tips (Qiagen) verwendet. Die Extraktion von DNA-Fragmenten aus Agarosegelen wurde mit Hilfe von Jetsorb nach Angaben des Herstellers (Genomed) durchgeführt.
Oligonukleotide für 'site directed mutagenesis'-Experimente und Primer für PCR- und Sequenzierungs-Reaktionen wurden mit dem '380 A DNA Synthesizer' der Firma Applied Biosystems hergestellt. Die Mutageneseversuche wurden nach einem Verfahren von Deng und Nickoloff durchgeführt (Deng et al., Anal. Biochem. 200, 81 - 88, 1992) unter Verwendung eines Kits der Firma Pharmacia Biotech ('Unique Site Elimination Mutagenesis'). Alle Vektorkonstruktionen und Mutageneseexperimente - 11 -
wurden durch Taq Cycle-DNA-Sequenzierung mit fluoreszenzmarkierten Terminatoren auf einem 'ABI 373 A Sequencer' (Applied Biosystems) bestätigt.
Transformation von Saccharomyces cerevisiae: Hefezellen, z.B. der Stamm JC34.4D (MATα, ura3-52, suc2) wurden in 10 ml YEPD (2 % Glucose; 2 % Pepton; 1 % Difco
Hefeextrakt) angezogen und bei einer O.D. 600nm von 0,6 bis 0,8 geerntet. Die Zellen wurden mit 5 ml Lösung A (1 M Sorbitol; 10 mM Bicin pH 8,35; 3 % Ethylenglycol) gewaschen, in 0,2 ml Lösung A resuspendiert und bei -70 °C gelagert.
Plasmid DNA (5 μg) und Carrier DNA (50 μg DNA aus Herringssperma) wurden zu den gefrorenen Zellen gegeben. Die Zellen wurden anschließend durch Schütteln für 5 min bei 37 °C aufgetaut. Nach Zugabe von 1 ,5 ml Lösung B (40 % PEG 1000; 200 mM
Bicin pH 8,35) wurden die Zellen für 60 min bei 30 °C inkubiert, mit 1 ,5 ml Lösung C
(0,15 M NaCI; 10 mM Bicin pH 8,35) gewaschen und in 100 μl Lösung C resuspendiert. Die Ausplattierung erfolgte auf einem Selektivmedium mit 2 % Agar. Transformanden wurden nach einer Inkubation von 3 Tagen bei 30 °C erhalten.
Nährmedien für die Fermentation
1. SD2-Medium:
Bacto Yeast Nitrogen Base 6,7 g/ι
Glukose * 20 g/ι
KH2PO4 6,7 g/ι, pH 6,0
2. SC5-Medium:
Glukose * 20 g/ι
Difco Hefeextrakt 20 g/ι
KH2PO4 6,7 g/ι
(NH4)2SO4 2,0 g/ι
MgSO4 x 7 H2O 1 ,0 g/ι
Spurenelementlösung SL4 1,0 ml/l, pH 6,0
Spurenelementlösung SL4:
Titriplex III 5 g/ι FeSO4 x 7 H2O 2 g/i 12
ZnSO4 x 7 H2O 0,1 g/
MnCI2 x 4 H2O 0,03 g/
H3BO3 0,3 g/
CoCI2 x 6 H2O 0,2 g/
CuCI2 x 2 H2O 0,01 g/
NiCI2 x 6 H2O 0,02 g/
Na2MoO4 x 2 H2O 0,03 g/ getrennt autoklavieren
Fermentermedium:
Glukose * 2,0 g/l
Sojapepton 25,0 g/l
KH2PO4 1 ,4 g/l
MgSO4 x 7H2O 1 ,0 g/l
Thiaminchlorid 5,1 mg/l
Inosit 20 mg/l
Spurenelementlösung 3 ml/l
Vitaminlösung 3 ml/l
(NH4)2SO4 3,8 g/l pH 5,!
Fütterlösung:
Glukose * 530 g/l
(NH4)2SO4 5,0 g/l
KH2PO4 2,9 g/l
MgSO4 x 7H2O 3,8 g/l
Thiaminchlorid 13 mg/l
Inosit 70 mg/l
Spurenelementlösung 6,8 ml/l
Vitaminlösung 6,8 ml/l
Sourenelementlösunα:
FeCI3 x 6 H2O 13,5 g/
ZnCI2 x 4 H2O 2,0 g/
H3BO3 0,5 g/
CoCI2 x 6 H2O 2,0 g/
CuSO4 x 5 H2O 1,9 g/
Na2MoO4 x 2 H2O 2,0 g/
CaCI2 x 2 H2O 1 ,0 g/
HCI konz. 100 m = getrennt autoklavieren 13
Vitaminlösung:
Riboflavin 0,42 g/l
Ca-Pantothenat 5,9 g/l
Nicotinsäure 6,1 g/l
Pyridoxinhydrochlorid 1 ,7 g/l
Biotin 0,06 g/l
Folsäure 0,04 g/l
Herstellung von Arbeitskonserven
Mit einer Stammkonserve wurden 200 ml SD2-Medium in einem 1 I-Erlenmeyerkolben 1%ig beimpft. Die Kultur wurde 72 Stunden bei 28 °C auf dem Schüttler (260 Upm) inkubiert. Danach wurden je 2 ml in Konservengefäße abgefüllt und in Flüssigstickstoff eingefroren.
Fermentation im Schüttelkolben
Als Vorkultur wurden 200 ml SD2-Medium in einem 1 I Kolben 1%ig mit einer Arbeitskonserve beimpft und 72 Stunden bei 28 °C auf dem Schüttler (260 Upm) fermentiert. Mit der Vorkultur wurden Hauptkulturen (200 ml SC-Medium in 1 I-Kolben) 1%ig beimpft und 72 - 96 Stunden auf dem Schüttler bei 28 °C inkubiert.
Fermentation in 10 I-Bioreaktoren
Als Vorkultur wurden 200 ml SD2-Medium in einem 1 I Kolben 1%ig mit einer Arbeitskonserve beimpft und 72 Stunden bei 28 °C auf dem Schüttler (260 Upm) fermentiert. Die Hauptkultur im 10 I-Fermenter wurde als fed-batch Fermentation über 96 Stunden durchgeführt. Als Nährmedium wurde Fermentermedium verwendet, das Startvolumen betrug 7 I. Der Fermenter wurde mit 200 ml Vorkultur beimpft.
Fermentationsbedingungen:
Temperatur: 28 °C Rührerdrehzahl: 500 Upm Belüftung: 10 l/min - 14 -
pH: 5,5
Kopfraumdruck: 200 mbar
Nach 7 Stunden Fermentationszeit wurde die Fütterung gestartet. Die Fütterrate wurde über den Respiratorischen Quotienten (RQ) gesteuert (RQ = gebildetes CO2 / verbrauchter Sauerstoff). Stieg der RQ auf Werte > 1,15 an, wurde die Fütterrate verringert, sank er auf werte < 1,05 wurde die Fütterrate erhöht.
In regelmäßigen Abständen wurden Proben aus dem Fermenter entnommen und das Zellwachstum durch Messung der optischen Dichte bei 700 nm bestimmt. Außerdem wurde die Konzentration der Proteaseinhibitoren im Überstand durch Aktivitätsmessung ermittelt.
Bei Fermentationsende wurde der pH Wert durch Zugabe von 50 % (w/v) Zitronensäure auf 3,0 abgesenkt und der Fermenter für 10 min auf 70 °C erhitzt. Die Zellen wurden anschließend durch Zentrifugation bei 7500 x g abgetrennt und der Überstand zur Proteinreinigung abgegeben.
Materialien für die proteinchemische Analytik
Die Sequenzanalysen wurden mit einem Proteinsequenzer Model 473A der Firma Applied Biosystems (Forster City, U.S.A.) durchgeführt. Das Standardsequenzierungsprogramm wurde verwendet. Der Sequenzer, die verschiedenen Sequenzierungsprogramme sowie das PTH-Detektionssystem sind im Detail im Bedienungshandbuch beschrieben (User's manual protein sequencing System model 473A (1989) Applied Biosystems Forster City, CA 94404, U.S.A.).
Die Reagenzien für den Betrieb des Sequenzers und die HPLC-Säule für die PTH- Detektion wurden von Applied Biosystems bezogen.
Die HPLC-Analysen wurden mit einem HP1090 HPLC-System von Hewlett Packard (D- Waldbronn) durchgeführt. Eine RP-18-HPLC-Säule (250 mm x 4,6 mm, 5μ- - 15 -
Material, 30 nm (300 Angström) Porendurchmesser) von Backerbond (D- Groß Gerau) wurde für die Trennung verwendet.
Die Kapillarelektrophorese Modell 270A-HT war von Applied Biosystems (Forster City, CA 94404, U.S.A.). Die Proben wurden in der Regel hydrodynamisch über verschiedene Zeitintervalle injiziert. Die verwendete Kapillarsäule (50 μm x 72 cm) war von Applied Biosystems.
Die Aminosäureanalysen wurden mit einem Aminosäureanalysator LC3000 von Eppendorf Biotronik (D- Maintal) durchgeführt. Ein leicht modifiziertes Standardtrennprogramm von Biotronik wurde benutzt. Die Trennprogramme und die Funktion des Analysators sind ausführlich im Handbuch des Gerätes beschrieben.
Die Molekulargewichte wurden mit einem MALDI I System von Kratos/Shimadzu (D- Duisburg) bestimmt. Die SDS-Elektrophoresen wurden durchgeführt mit einem Elektrophoresesystem von Pharmacia (D- Freiburg).
Die Bestimmung der kinetischen Daten wurden mit dem Mikrotiterplattenreader von SLT (D- Crailsheim) durchgeführt. Das Waschen der Mikrotiterplatten wurde mit einem Waschgerät von Dynatec (D- Denkendorf) durchgeführt.
Enzyme und Substrate waren von Calbiochem (D- Bad Soden). Alle anderen Chemikalien und Reagenzien waren von Merck (D- Darmstadt) oder Sigma (D- Deisenhofen). 96 Well Platten wurden von Greiner bezogen.
Die polyklonalen Kaninchen anti-Aprotininantikörper wurden im Kaninchen durch Immunisierung mit Aprotinin erzeugt. Die humanen polyklonalen anti- Aprotininantikörper stammen von Patienten, die mit Aprotinin behandelt wurden. - 16 -
Proteinchemische Analytik
N-terminale Sequenzanalyse: 1-3 nmol in Wasser gelöster Proteaseinhibitor wurden auf ein Sequenzersheet, das mit Polybren® vorinkubiert war, geladen. Das Protein wurde mit dem fast normal Sequenzerzyklus sequenziert. Die PTH-Aminosäuren wurden mittels Online-HPLC mit Hilfe eines 50 pmol PTH-Standards identifiziert.
Aminosäureanalyse: 200 μg Protein wurden in 200 μl 6 N HCI gelöst und 1 h bei 166 °C hydrolysiert. Cirka 1 nmol der Probe wurde auf den Aminosäureanalysator gegeben. Die Menge an Aminosäure wurde über einen 5 nmol Standard ermittelt. Cystein wurde nach der Perameisensäureoxidation des Proteins (C.H.W. Hirs, Methods Enzymol.11, 59-62), wie oben beschrieben, bestimmt.
SDS-Gelelektrophorese: Die SDS-Gelelektrophorese wurde nach den Bedingungen von Laemmli durchgeführt. 10 μg des Proteaseinhibitors wurden mit einem 10 - 20%- igen SDS-Gel analysiert und mittels Silberfärbung (Merril et.al.) sichtbar gemacht. (U.K.Laemmli, Nature 227, 680-685 (1970). und C.R.Merril, M.LDunau, D.Goldman, Anal.Biochem. 110: 201-207 (1981)).
Kapillarelektrophorese: 8 ng des Proteaseinhibitors wurden mittels Kapillarelektrophorese an einer Glassäule (Länge 72 cm, Innendurchmesser 50 μm) untersucht. Bedingungen: Stromstärke 65 μA, Säulentemperatur 30 °C, 100 mM Phosphatpuffer pH 3,0, Detektion 210 nm, Aufgabe unter Druck 1 s.
Reverse Phase Chromatographie: 5 nmol des Proteaseinhibitors wurden an einer Bakerbond RP-18-HPLC-Säule (5 μ-Material, 4,6 mm x 250 mm, 30 nm (300 Angström) Porengröße) chromatographiert. Als Eluent wurde ein Acetonitril/TFA- Gradient verwendet. Bedingungen: Fluß 0,7 ml/min, Säulentemperatur 40 °C, Detektion 210 nm, Lösungsmittel A: 0,1 % TFA, Lösungsmittel B: 0,1 % TFA/60 % Acetonitril; Gradient: 0 min. 0 % B, 10 min. 0 % B, 70 min. 100 % B, 80 min. 0 % B. - 17 -
Molekulargewichtsbestimmunα: 1 μg des Proteaseinhibitors wurde mit der MALDI- Technik analysiert. Als Matrix wurde Sinapinsäure verwendet. Die Standardproteine für die Massenkalibrierung waren Melittin (2847 Da), Rinderinsulin (5734 Da), Cytochrom C (12327 Da) und Myoglobin (16951 Da).
Proteingehalt: Der Proteingehalt der Proben wurde mit der Aminosäureanalyse oder durch Messung der OD280 nm bestimmt.
Trypsin-Hemmtest (titrimetrisch): Die Trypsin-inhibitorische Aktivität der Protease- inhibitoren in den Fermentationsbrühen wurde über die Trypsin-katalysierte Hydrolyse von Nα-benzoyl-L-argininäthylester (BAEE) bestimmt. Die Anzahl, der bei der Reaktion frei werdenden Carboxylgruppen, die durch eine Alkalititration bestimmt werden, stellt ein Maß für die tryptische Hemmaktivität der Inhibitoren dar.
Bestimmung der Kreuzreaktion der Proteaseinhibitoren mit polyklonalen Kaninchen bzw. humanen Anti-Aprotininantikörpern: 0,5 - 10 ng Proteaseinhibitor bzw. Aprotinin gelöst im Kupplungspuffer wurden über Nacht bei 4 °C an eine Mikrotiterplatte gebunden. Die Wells wurden 4 mal mit je 300 μl Waschpuffer gewaschen und dann 100 μl der Blockierungslösung zugesetzt. Die Platte wurde abgedeckt und eine Stunde bei 37 °C inkubiert. Nach dem Waschen wie oben beschrieben wurde der polyklonale Kaninchen Anti-Aprotininantikörper (0,2 μg/ml in 1 % BSA in PBS-Puffer) bzw. der polyklonale humane Antikörper (20 μg/ml in 1 % HSA in PBS-Puffer) hinzugegeben. Die Platte wurde abgedeckt, eine Stunde bei 37 °C inkubiert und dann gewaschen wie oben beschrieben. Nun wurden 100 μl biotinylierter anti-Kaninchen bzw. anti-human Antikörper (25 μl + 10 ml 1 % BSA bzw. 1 % HSA in PBS-Puffer) hinzugegeben und eine Stunde bei 37 °C inkubiert. Die Platte wurde gewaschen wie oben beschrieben und dann 100 μl Streptavidin- Peroxidasekomplex (50 μl + 10 ml 1 % BSA bzw. 1 % HSA in PBS-Puffer) zu jedem Well gegeben. Die Platte wurde abgedeckt und eine Stunde bei 37 °C inkubiert und dann, wie oben beschrieben, gewaschen. - 18 -
Die Substratreaktion wurde mit TMB-Substrat + Peroxidaselösung (1+1 ; 100 μl pro Well) durchgeführt. Die Reaktion wurde nach 10 min mit 100 μl/Well 2 M Phosphorsäure gestoppt und die Absorption bei 450 nm gemessen (Referenz 570 nm).
Lösungen:
1. Kupplungspuffer: 15 mM Na2CO3, 35 mM NaHCO3, pH 9,6
2. Probenpuffer: Die Proben wurden in einer geeigneten Konzentration in 1 % BSA bzw. HSA in PBS-Puffer pH 7 gelöst.
3. Waschlösung: 0,1 % (v/v) Tween®-20 in PBS
4. Blockierungspuffer: 3 % (w/v) BSA bzw. HSA in PBS.
Bestimmung der inhibitorischen Konstanten: Die Bestimmung der inhibitorischen Konstanten mit verschiedenen Enzymen wurde nach Bieth durchgeführt (J.G.Bieth Methods in Enzymology 248: 59-84 (1995)).
Die Substrate waren Chromozym PL für Plasmin, HD-Pro-Phe-Arg-pNA für Faktor XI, S-2444 für Trypsin, Suc-Phe-Leu-Phe-pNA für Chymotrypsin, Bz-lle-Glu-Gly-Arg-pNA für FXa ,HD-Val-Leu-Arg-pNA für Harnkallikrein und HD-Pro-Phe-Arg-pNA.
Beispiele
Beispiel 1 : Herstellung eines Hefe-Expressionsvektors zur Sekretion von rekombinantem Ser10-Ile13-Arg15-Tyr17-Thr19-Asp24-Thr26-Glu31-Asn41-Glu53- Aprotinin
Als Ausgangsmaterial für die Herstellung des Ser10-Ile13-Arg15-Tyr17-Thr19-Asp24- Thr26-Glu31-Asn41-Glu53-Aprotinin Gens diente ein Ser10-Arg15-Ala17-Asp24- Thr26-Glu31-Asn41-Glu53-Aprotinin Gen in einem modifizierten pYES2 Vektor (plU28.11.L). Der auf dem Vektor pYES2 (Invitrogen) vorhandene GAL1 Promotor und der f1 ori sind in diesem Vektor durch den MFα1 Promotor ersetzt. Zur Entfernung der - 19 -
Xhol Schnittstelle in der 'Multiplen Cloning Site' am 3'-Ende der Aprotinin Variante wurde der Vektor plU28.11.L mit EcoRI und partial mit Xbal verdaut und anschließend mit Klenow Polymerase und dNTPs aufgefüllt. Der aus dieser Klonierung resultierende Vektor (plU17.4.M) wurde mit dem Mutagenese Primer A einer Doppelstrang- Mutagenese-Reaktion nach dem U.S.E.-Verfahren (Pharmacia Biotech) unterzogen, wobei die Restriktion mit Xhol durchgeführt werden konnte, da durch die Mutagenese die singuläre Xhol Schnittstelle im Aprotinin Gen entfernt wird. Der Mutagenese Primer A hatte folgende Sequenz:
δ' CCAGATTTCTGCCTCGAACAACCACCATCTACTGGTATTTGTAGAGCTTACATT
ACTAGATACTTCTACGAT 3*.
Dieser Primer generiert die Mutationen Ile13, Tyr17 und Thr19 im Ser10-Arg15-Ala17- Asp24-Thr26-Glu31-Asn41-Glu53-Aprotinin Gen. Die Analyse der Klone erfolgte durch einen Restriktionsverdau mit den Enzymen Xbal und Xhol. Die gewünschte Sequenz wurde außerdem durch DNA-Sequenzierung des Klons pIU2.7.M bestätigt. Hefezellen (JC34.4D) wurden mit dem Vektor plU2.7.M transformiert. Der Expressionsvektor plU2.7.M enthält keine α-Faktor pro-Sequenz mehr, so daß die Prozessierung des Ser10-Ile13-Arg15-Tyr17-Thr19-Asp24-Thr26-Glu31-Asn41-Glu53-Aprotinins ausschließlich durch die Signalpeptidase erfolgt und unabhängig wird von der Spaltung durch die Kexll Protease.
Beispiel 2: Herstellung eines Hefe-Expressionsvektors zur Sekretion von rekombinantem Ser10-Ile13-Arg15-Tyr17-Thr19-Asp24-Thr26-Glu31-Leu39-Asn41- Glu53-Aprotinin
Als Ausgangsmaterial für die Herstellung des Ser10-Ile13-Arg15-Tyr17-Thr19-Asp24- Thr26-Glu31-Leu39-Asn41-Glu53-Aprotinin Gens diente ein Ser10-Arg15-Ala17- Asp24-Thr26-Glu31-Asn41-Glu53-Aprotinin Gen in dem Vektor plU17.4.M (s. Beispiel 1). Der Vektor plU17.4.M wurde mit den Mutagenese Primern A (s. Beispiel 1) und B einer Doppelstrang-Mutagenese-Reaktion nach dem U.S.E.-Verfahren (Pharmacia Biotech) unterzogen, wobei die Restriktion mit Xhol durchgeführt werden konnte, da - 20 -
durch die Mutagenese mit dem Primer A die singuläre Xhol Schnittstelle im Aprotinin Gen entfernt wird. Der Mutagenese-Primer B hatte folgende Sequenz:
5' TACGGCGGCTGCTTGGCTAACCGTAAC 3'.
Der Primer A generiert die Mutationen Ile13, Tyr17 und Thr19 der Primer B die Mutation Leu39 im Ser10-Arg15-Ala17-Asp24-Thr26-Glu31-Asn41-Glu53-Aprotinin Gen. Die Analyse der Klone erfolgte durch einen Restriktionsverdau mit den Enzymen Xbal und Xhol. Die gewünschte Sequenz wurde außerdem durch DNA-Sequenzierung des Klons pES8.4.O bestätigt. Hefezellen (JC34.4D) wurden mit dem Vektor pES8.4.O transformiert.
Beispiel 3: Herstellung eines Hefe-Expressionsvektors zur Sekretion von rekombi- nantem He13-Arg15-Tyr17-Thr19-Leu39-Leu46-Aprotinin mit der natürlichen N- terminalen Sequenz 'Arg-Pro-Asp'
Zur Herstellung eines Hefe-Expressionsvektors, der die Sekretion von Ile13-Arg15- Tyr17-Thr19-Leu39-Leu46-Aprotinin mit der natürlichen N-terminalen Sequenz 'Arg- Pro-Asp' erlaubt, wurde zunächst der MFα1 Promotor mit der α-Faktor pre-Sequenz und dem 5°-Ende des Aprotinin Gens (bis zur Erkennungssequenz des Restriktionsenzyms Xhol) über PCR amplifiziert und kloniert. Die verwendeten Primer hatten folgende Sequenzen:
Primer C (die EcoRV Erkennungssequenz ist unterstrichen): 5' GGG.AI CTATTGATAAGATTTAAAGGTATTTGACAAG 3'.
Primer D (die Xhol Erkennungssequenz ist unterstrichen):
5' GGGCTCGAGGCAGAAATCTGGTCTAGCCAAAGCAGAAGAAGCAGCGAACAA
GACAGCAGTGAAAATAGATGGGAATCTCATTCTTTTAATCGTTTATATT 3M - 21 -
Der PCR-Ansatz enthielt 200 ng pA202 Plasmid DNA, 0,2 μM Primer C, 0,2 μM Primer D, 200 μM dNTPs, 1 x PCR Reaktionspuffer 11 (Stratagene, Opti-Prime®) und 2,5 U Taq DNA Polymerase (Perkin Eimer) in einem Gesamtvolumen von 50 μl. Die "Cycle'- Bedingungen waren: 1 min bei 94 °C, 30 Zyklen mit jeweils 1 min bei 94 °C, 1 min bei 50 °C und 2 min bei 72 °C und eine anschließende 5 min Inkubation bei 72 °C. Der PCR-Ansatz wurde 1 :5 verdünnt und mit dem Vektor pCRH (Invitrogen) ligiert. Mit dem Ligationsansatz wurden E. coli DH5α Zellen transformiert. Positive Klone wurden nach einem Restriktionsverdau mit dem Enzym EcoRI identifiziert und mehrere Klone sequenziert. Der Klon plU20.11.L wurde für die weiteren Arbeiten eingesetzt.
Der E. coli/Hefe Schaukelvektor pYES2 (Invitrogen) wurde für die Konstruktion eines Hefe-Sekretionsvektors verwendet, in dem die Ile13-Arg15-Tyr17-Thr19-Leu39-Leu46- Aprotinin-Sequenz direkt mit der Hefe Alpha-Faktor pre-Sequenz verknüpft ist. Zunächst wurde der Vektor pYES2 mit den Restriktionsenzymen Sspl und BamHI geschnitten, dephosphoryliert und gelgereinigt. Der auf dem Vektor pYES2 vorhandene GAL1 Promotor und der f1 ori werden hierbei entfernt. Ein ca. 1030 Bp großes DNA Fragment wurde mit EcoRV und Xhol aus dem Vektor plU20.11.L herausgeschnitten, über Agarosegel-Elektrophorese gereinigt und zusammen mit einem ca. 180 Bp großen Xhol und BamHI Fragment aus dem Vektor pEM24.3.L in den mit Sspl und BamHI geschnittenen Vektor pYES2 Moniert. Mit dem Ligationsansatz wurden E. coli DH5α Zellen transformiert. Positive Klone wurden nach einem Restriktionsverdau mit dem Enzym Xhol identifiziert und sequenziert. Hefezellen (JC34.4D) wurden mit dem aus dieser Klonierung resultierenden Vektor pEM1.4.L transformiert.
Beispiel 4: Herstellung eines Hefe-Expressionsvektors zur Sekretion von rekombi- nantem DesPro2-lle13-Arg15-Tyr17-Thr19-Leu39-Leu46-Spacer-Arg15-Ala17-Bikunin
Als Ausgangsmaterial für die Herstellung des rekombinanten DesPro2-lle13-Arg15-
Tyr17-Thr19-Leu39-Leu46-Spacer-Arg15-Ala17-Bikunin Gens diente ein DesPro2- He13-Arg15-Tyr-17-Thr19-Leu-39-Leu46-Gen, ein Arg15-Ala17-Gen und zwei - 22 -
Oligonukleotide, die den Spacer erzeugen. Jedes Aprotininvarianten-Gen wurde mittels einer PCR-Reaktion an eines der Spaceroligonukleotide gekoppelt und in einen PCR-Klonierungsvektor ligiert.
Spacer-Oligonukleotid 1 :
5' TCG AGA CAG AAA TCT GGC GTA TTA ATA ATT CTG TTA GCG TTA GCA CCA CCG CAG GTT CTC ATA CAA TCT TCC GC 3'
Spacer-Oligonukleotid 2: 5' GGA AGA TTG TAT GAG AAC CTG CGG TGG TGC TAA CGC TAA CAG AAT TAT GAA GAC TAC TTT GCA ACA AGA AAA GCC AGA TTT CTG TC 3'
Der PCR-Ansatz enthielt 570 ng pEM30.3.L Plasmid DNA (codierend für DesPro(2)- Ile(13)-Arg(15)-Tyr(17)-Thr(19)-Leu(39)-Leu(46)-Aprotinin), 20 pmol Primer E (Primer E bindet im α-Faktor Leader und hat folgende Sequenz: 5' AACGGGTTATTGTTTATA 3'), 60 pmol Spacer-Oligonukleotid 1 , 200 μM dNTP, 1x PCR Reaktionspuffer II (Perkin Eimer), 2 mM MgCI2 und 2,5 U Taq DNA Polymerase (Perkin Eimer) in einem Gesamtvolumen von 100 μl. Die Oycle'-Bedingungen waren: 3 min bei 95 °C, 25 Zyklen mit jeweils 1 min bei 94 °C, 1 min bei 55 °C und 1 min bei 72 °C und eine anschließende 5 min Inkubation bei 72 °C. Der PCR-Ansatz wurde 1 :5 verdünnt und mit dem Vektor pCRIl (invitrogen) ligiert. Mit dem Ligationsansatz wurden E. coli DH5α Zellen transformiert. Positive Klone wurden über "blue-white screening" und nach einem Restriktionsverdau mit den Enzymen Xhol und BamHI identifiziert. Der Klon pEM22.5.L enthielt die gewünschte Sequenz und wurde für die weiteren Arbeiten eingesetzt.
Der Verbindung des Spacer-Oligonukleotids 2 mit Arg15-Ala17-Aprotinin ging eine Primer Extensionreaktion voraus. Sie enthielt 60 pmol Spacer-Oligonukleotid 2, 200 μM dNTP, 2 U Klenow-Fragment, 20 ng pEM6.6.L Plasmid DNA und 2 mM MgCI2 in einem Gesamtvolumen von 100 μl. - 23 -
Reaktionsbedinαungen: Testansatz ohne Klenow-Fragment 3 min bei 95 °C erhitzen. Nach Zugabe des Klenow-Fragments wurde 30 min bei Raumtemperatur inkubiert. Es wurde auf 70 °C erhitzt und 2,5 U Taq DNA Polymerase sowie 20 pmol reverse Primer M13 zugegeben.
Die Oycle -Bedingungen waren: 3 min bei 95 °C, 30 Zyklen mit jeweils 1 min bei 94 °C, 1 min bei 45 °C und 1 min bei 72 °C und eine anschließende 5 min Inkubation bei 72 °C. Ca. 150 ng des PCR-Fragments wurden mit dem Vektor pCRH (Invitrogen) ligiert. Mit dem Ligationsansatz wurden E. coli DH5α Zellen transformiert. Positive Klone wurden nach einem Restriktionsverdau mit dem Enzym EcoRI identifiziert und sequenziert. Der Klon pEM12.6.L enthielt die gewünschte Sequenz und wurde für die weiteren Arbeiten eingesetzt.
Ein 182 Bp großes DNA-Fragment wurde mit Hind III und BspMI aus dem Vektor pEM22.5.L und ein 240 Bp großes DNA-Fragment mit BamHI und BspMI aus dem Vektor pEM 12.6.L herausgeschnitten, über Agarosegel-Elektrophorese gereinigt und über Nacht mit T4-DNA-Ligase ligiert. Das Ligationsprodukt wurde über die Restriktionsschnittstellen Hind III und BamHI in den Vektor pUC 19 kloniert. Der resultierende Klon (pEM16.6.L) hatte die gewünschte Sequenz. Der E. coli/Hefe Schaukelvektor pA202 wurde für die Konstruktion eines Hefe- Sekretionsvektors verwendet, in dem die DesPro2-lle13-Arg15-Tyr17-Thr19-Leu39- Leu46-Spacer-Arg15-Ala17-Bikunin Sequenz mit der Hefe Alpha-Faktor pre-pro- Sequenz verknüpft ist. Der Vektor pA202 trägt ein Ampicillin Resistenzgen (bla) und ein URA3 Gen als selektierbare Markergene für E. coli und Hefe.
Weitere essentielle Elemente des Vektors sind der Col E1 und der 2μ Ursprungspunkt der Replikation (ori). Der REP3 Locus befindet sich ebenfalls in dieser Region. Ein 1200 Bp großes EcoRI-Hindlll-Fragment trägt den MFα1 Promotor und die N-terminale pre-pro-Sequenz des Hefe Alpha-Faktor-Vorläuferproteins (Kurjan und Herskowitz, Cell 30, 933 - 943, 1982). - 24 -
Hefevektorklonierung: Aus dem Klon pEM16.6.L wird mit den Restriktionsenzymen Hindlll und BamHI ein 422 Bp großes Fragment herausgeschnitten. Dieses wird über ein Agarosegel gereinigt und ebenfalls in den mit Hindlll und BamHI geschnittenen Vektor pA202 kloniert. Der daraus resultierende Klon pEM21.6.L wird für die Transformation von Hefezellen (JC34.4D) verwendet.
Andere E. coli/Hefe Schaukelvektoren mit unterschiedlichen Promotoren wie z.B. der konstitutive GAPDH oder der induzierbare GAL10 Promotor können in ähnlicher Weise hergestellt werden und führen ebenfalls zur Sekretion des DesPro2-lle13-Arg15-Tyr17- Thr19-Leu39-Leu46-Spacer-Arg15-Ala17-Bikunins.
Daneben ist es selbstverständlich auch möglich, Schaukelvektoren mit anderen Hefe- Replikationsursprüngen wie z.B. das chromosomal autonom replizierende Segment (ars) einzusetzen.
Geeignete selektierbare Markergene sind neben dem URA3 Gen solche Gene, die einer auxotrophen Hefemutante zur Prototrophie verhelfen, wie z.B. die LEU2, HIS3 oder TRP1 Gene. Außerdem können selbstverständlich auch Gene eingesetzt werden, deren Produkte Resistenz gegenüber verschiedenen Antibiotika wie z.B. dem Aminoglykosid G418 vermitteln.
Andere Hefen wie z.B. die methylotrophen Hefen Pichia pastoris oder Hansenula polymorpha sind nach Transformation mit geeigneten Vektoren ebenfalls in der Lage, DesPro2-lle13-Arg15-Tyr17-Thr19-Leu39-Leu46-Spacer-Arg15-Ala17-Bikunin zu produzieren.
Beispiel 5: Fermentation von Saccharomyces cerevisiae
Ein rekombinanter Saccharomyces cerevisae Expressionsstamm wurde für die Fermentation verwendet (siehe: Methoden zur Durchführung der Erfindung). - 25 -
Beispiel 6: Reinigung von Aprotininvarianten ohne Nettoladung bei neutralem pH-Wert und von Bikuninen
I. Übersicht über geeignete Reinigungsverfahren Nach der Fermentation werden die Zellen durch Zentrifugation abgetrennt und der verbleibende Überstand wird filtriert, um zurückgebliebene Zellen zu entfernen.
Der zellfreie Überstand wird durch Zusatz von konzentrierter Zitronensäure auf pH 3 eingestellt. Die Lösung muß mit gereinigtem Wasser geeignet verdünnt werden, um eine Leitfähigkeit von weniger als 8 mS/cm einzustellen. Im Anschluß wird die Lösung auf eine Kationenaustauscher-Säule aufgetragen, die vorher mit einem sauren Puffer äquilibriert worden ist. Nicht gebundenes Material wird durch ausgiebiges Waschen mit Startpuffer entfernt. Das Produkt wird mit Hilfe eines Salzgradienten eluiert. Die erhaltenen Fraktionen werden mit Hilfe von Umkehrphasen- Hochdruckflüssigkeitschromatographie (RP-HPLC) und einem biologischen Aktivitätstest, der die Protease-Inhibition bestimmt, auf ihren Produktgehalt hin untersucht. Fraktionen, die das Produkt enthalten, werden vereinigt und direkt auf eine präparative RP-HPLC-Säule aufgetragen.
Die Säule wurde vorher mit einem sauren Puffer äquilibriert. Nicht gebundenes Protein wird durch Waschen der Säule mit Startpuffer entfernt. Das Produkt wird mit Hilfe eines organischen Lösungsmittel-Gradienten eluiert. Die Fraktionen werden, wie bereits oben beschrieben, erneut auf den Produktgehalt hin untersucht und diejenigen Fraktionen, die Produkt enthalten, werden vereinigt. In Abhängigkeit von der erreichten Reinheit des Produkts ist es möglicherweise notwendig, die vereinigten Fraktionen über eine zweite RP-HPLC Säule zu reinigen. Die Bedingungen sind im wesentlichen die gleichen, wie bereits beschrieben. Die erhaltene Produktlösung wird mit Wasser für Injektionszwecke verdünnt und in geeigneten Portionen abgefüllt und gefriergetrocknet. - 26 -
Andere Methoden für die Reinigung von Aprotinin-Derivaten ohne Nettoladung bei neutralem pH-Wert, die mit den oben beschriebenen Prozessen kombiniert werden können, sind Affinitätschromatographie an Sepharose®-immobilisiertem Trypsin und Gelpermeationschromatographie.
II. Reinigung von Ser10-Ile13-Arg15-Tyr17-Thr19-Asp24-Thr26-Glu31-Asn41-Glu53
Aprotinin
Material aus 10 I-Fermentationen wurde nach dem folgenden Verfahren gereinigt.
Nachdem die Fermentation abgeschlossen war, wurde der Fermenterinhalt mit konzentrierter Zitronensäure auf pH 3 eingestellt und für 10 Minuten auf 70 °C erhitzt. Anschließend wurden die Zellen durch Zentrifugation (15 Minuten, 7500 x g, Heraeus Zentrifuge) entfernt und der erhaltene Überstand filtriert (8 μm bis 0,2 μm, Millipore, Deutschland). Auf dieser Stufe kann der Überstand durch Einfrieren bei -18 °C bis zur weiteren Verwendung aufbewahrt werden. Die Lösung wurde anschließend durch Zusatz von gereinigtem Wasser auf eine Leitfähigkeit von weniger als 8 mS/cm verdünnt und auf eine SP-Sepharose® FF Säule (Pharmacia, Schweden) aufgetragen. Die Säule war vorher mit 50 mM Zitrat-NaOH Puffer, pH 3 äquilibriert worden. Nicht gebundenes Protein wurde durch intensives Waschen mit dem gleichen Puffer entfernt. Anschließend wurde das Produkt mit Hilfe eines Salzgradienten (1 M NaCI) eluiert. Die erhaltenen Fraktionen wurden mit Hilfe von Umkehrphasen- Hochdruckflüssigkeitschromatographie (RP-HPLC, C4) und durch Testen der Protease-Inhibitionsaktivität auf den Produktgehalt hin untersucht.
Diejenigen Fraktionen, die das gewünschte Produkt enthalten, wurden vereinigt. Anschließend wurde die Produktlösung direkt auf die erste RP-HPLC Säule (Source 15 RPC, Pharmacia, Schweden) aufgetragen, die vorher mit 0,1 % Trifluoressigsäure/Wasser äquilibiert worden war. Nicht gebundenes Protein wurde durch intensives Waschen mit dem gleichen Puffer entfernt. Das Produkt wurde mit Hilfe eines linearen Azetonitril-Gradienten (0 - 70 %) eluiert. Die erhaltenen Fraktionen wurden erneut auf den Produktgehalt hin mit den oben beschriebenen Methoden untersucht und diejenigen, die Produkt enthielten, wurden vereinigt und lyophilisiert. - 27 -
Für die abschließende Reinigung wurde das Protein in 150 mM NaCI/50 mM Phosphatpuffer pH 7,3 aufgenommen und an einer Superdex 30 chromatographiert. Die erhaltenen Fraktionen wurden erneut auf den Produktgehalt hin mit den oben beschriebenen Methoden untersucht und diejenigen, die Produkt enthielten, wurden vereinigt.
III. Reinigung von DesPro2-lle13-Arg15-Tyr17-Thr19-Leu39-Leu46-Spacer-Arg15- Ala17-Bikunin
Material aus 10 I-Fermentationen wurde nach dem folgenden Verfahren gereinigt. Nachdem die Fermentation abgeschlossen war, wurde der Fermenterinhalt mit konzentrierter Zitronensäure auf pH 3 eingestellt und für 10 Minuten auf 70 °C erhitzt. Anschließend wurden die Zellen durch Zentrifugation (15 Minuten, 7500 x g, Heraeus Zentrifuge) entfernt und der erhaltenen Überstand filtriert (8 μm bis 0.2 μm, Millipore, Deutschland). Auf dieser Stufe kann der Überstand durch Einfrieren bei -18 °C bis zur weiteren Verwendung aufbewahrt werden. Die Lösung wurde anschließend durch Zusatz von gereinigtem Wasser auf eine Leitfähigkeit von weniger als 8 mS/cm verdünnt und auf eine SP-Sepharose® FF Säule (Pharmacia, Schweden) aufgetragen. Die Säule war vorher mit 50 mM Zitrat-NaOH Puffer, pH 3 äquilibriert worden. Nicht gebundenes Protein wurde durch intensives Waschen mit dem gleichen Puffer entfernt. Anschließend wurde das Produkt mit Hilfe eines Salzgradienten (1 M NaCI) eluiert. Die erhaltenen Fraktionen wurden nach Einstellen auf weniger als 8 mS/cm mit einer Sepharose® HP chromatographiert. Die Säule war vorher mit 20 mM Hepes- NaOH Puffer, pH 6 äquilibriert worden. Nicht gebundenes Protein wurde durch intensives Waschen mit dem gleichen Puffer entfernt. Anschließend wurde das Produkt mit Hilfe eines Salzgradienten (1 M NaCI) eluiert.
Die erhaltenen Fraktionen wurden mit Hilfe von Umkehrphasen- Hochdruckflüssigkeitschromatographie (RP-HPLC, C4) und durch Testen der Protease-Inhibitionsaktivität auf den Produktgehalt hin untersucht. Diejenigen Fraktionen, die das gewünschte Produkt enthalten, wurden vereinigt. - 28 -
Anschließend wurde die Produktlösung direkt auf die erste RP-HPLC Säule (Source 15 RPC, Pharmacia, Schweden) aufgetragen, die vorher mit 0,1 % Trifluoressigsäure/Wasser äquilibiert worden war. Nicht gebundenes Protein wurde durch intensives Waschen mit dem gleichen Puffer entfernt. Das Produkt wurde mit Hilfe eines linearen Azetonitril-Gradienten (0 - 70 %) eluiert. Die erhaltenen Fraktionen wurden erneut auf den Produktgehalt hin mit den oben beschriebenen Methoden untersucht und diejenigen, die Produkt enthielten, wurden vereinigt und lyophilisiert.
Für die abschließende Reinigung wurde das Protein an einer Source S30 mit einem Hepes/NaCI-Gradienten pH 6 chromatographiert. Die erhaltenen Fraktionen wurde erneut auf den Produktgehalt hin mit den oben beschriebenen Methoden untersucht und diejenigen, die Produkt enthielten, wurden vereinigt und lyophilisiert.
Beispiel 7: Bestimmung des Ki-Wertes von humanem Plasmin mit Ser10-Ile13-Arg15- Tyr17-Thr19-Asp24-Thr26-Glu31 -Asn41 -Glu53-Aprotinin
1 U humanes Plasmin wurde auf 16 ml mit Puffer verdünnt (0,2 M Tris- (hydroxymethyl)-aminomethan, 0,01 M CaCI2, 0,05 % Tween®-20; pH 8; 1 ml Benzylalkohol/l). 200 μl dieser Enzymlösung wurden mit absteigenden Volumina Testpuffer versetzt (250, 240, 230, 220, 200, 180, 170, 150, 100, 50 μl) und dann steigende Mengen Inhibitor im Assaypuffer hinzugesetzt (10, 20, 30, 50, 70, 80, 100, 150, 200 und 250 μl; Konzentration 0,6 μg/μl).
Die Enzym/Inhibitor-Lösung wurde 4 h bei Raumtemperatur vorinkubiert, dann 180 μl von jeder Lösung in das Well einer Microtiterplatte gegeben und mit 20 μl Substratlösung versetzt. Die Änderung der Absorption wurde bei 405 nm für 10 min gemessen. Die Geschwindigkeit der Enzymreaktionen wurde bestimmt und der Ki- Wert daraus berechnet nach der Methode von Bieth (Biochemical Medicine 32: 387-97 (1984) oder Meth. in Enzym. 248: 59-84 (1995)).
Substrat Stock Lösung: 0,1 M in DMSO
Substrat Lösung: 1x103 M Chromozym PL in Assay-Puffer - 29 -
Assay Puffer: 0,2 M Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan,
0,01 M CaCI2, 0,05 % Tween®-20; pH 8; 1 ml Benzyl- alkohol/l.
Die kinetischen Konstanten der Komplexierung mit den Enzymen Kallikrein, Faktor Xa, Trypsin und Chymotrypsin wurden nach der gleichen Verfahrensweise bestimmt. Die Substrate waren HD-Pro-Phe-Arg-pNA für Plasmakallikrein, S-2444 für Trypsin, Suc- Phe-Leu-Phe-pNA für Chymotrypsin und Bz-lle-Glu-Gly-Arg-pNA für FXa .
Die kinetischen Konstanten der Bikunine, der Einzeldomänen der Bikunine und der PEG-Konjugate wurden nach dem gleichen Verfahren bestimmt.
Beispiel 8: Ergebnisse der proteinchemischen Charakterisierung von Ser10-Ile13- Arg 15-Tyr17-Thr19-Asp24-Thr26-Glu31 -Asn41 -Glu53-Aprotinin
Der Proteaseinhibitor Ser10-lle13-Arg 15-Tyr17-Thr19-Asp24-Thr26-Glu31 -Asn41 - Glu53-Aprotinin wurde mittels eines gentechnisch veränderten Hefeorganismus durch Sekretion hergestellt. Aus dem Hefeüberstand wurde er durch verschiedene chromatographische Verfahren bis zur Homogenität gereinigt. Die Identität des Inhibitors mit der klonierten Sequenz zeigen die nachfolgenden proteinanalytischen Untersuchungen.
N-terminale Sequenzanalyse: Der Proteaseinhibitor wurde vollständig über 58 Stufen sequenziert. Die folgende Liste zeigt die bestimmte Proteinsequenz, die identisch ist mit der klonierten Sequenz: 1
Arg-Pro-Asp-Phe-Cys-Leu-Glu-Pro-Pro-Ser-Thr-Gly-Ile-Cys-Arg-Ala-Tyr-Ile-Thr-Arg-
21
Tyr-Phe-Tyr-Asp-Ala-Thr-Ala-Gly-Leu-Cys-Glu-Thr-Phe-Val-Tyr-Gly-Gly-Cys-Arg- 40
Ala-Asn-Arg-Asn-Asn-Phe-Lys-Ser-Ala-Glu-Asp-Cys-Met-Glu-Thr-Cys-Gly-Gly-Ala 30
Aminosäureanalyse: Die Aminosäureanalyse stellt einen wichtigen quantitativen Parameter für die Charakterisierung eines Proteins dar. Neben dem Proteingehalt wird bei bekannter Primärstruktur die Anzahl der Einzelaminosäuren ermittelt. Die Aminosäureanalyse von Ser10-Ile13-Arg15-Tyr17-Thr19-Asp24-Thr26-Glu31-Asn41- Glu53-Aprotinin ist in guter Übereinstimmung mit den theoretischen Werten aus der Primärstruktur (Tab.1).
Tabelle 1 : Aminosäureanalyse von Ser10-Ile13-Arg15-Tyr17-Thr19-Asp24-Thr26- Glu31-Asn41-Glu53-Aprotinin. Die ganzen Zahlen sind auf Ala=6 bezogen.
Aminosäure ganze Zahlen theor. Zahlen
CysSO3H 4,85 Asp 5,98
Thr 3,96 4
Ser 1,54 2
Glu 4,16 4
Gly 5,99 6
Ala 6,00 6
Val 1,06 1
Met 0,25 1
Ile 1 ,82 2
Leu 1,99 2
Tyr 4,47 4
Phe 3,98 4
Lys 1 ,19 1
Arg 5,06 5 Pro 3,09 3
Cystein wurde nach der Perameisensäureoxidation bestimmt.
Reverse Phase Chromatographie: Bei der HPLC-Chromatographie von Proteinen an chemisch gebundene Umkehrphasen kommt es über eine hydrophobe Wechselwirkung der Proteine zu einer Bindung an die verwendete Phase. Die Proteine werden gemäß der Stärke ihrer Bindung an die stationäre Phase von organischen Lösungsmitteln (mobile Phase) verdrängt. Aus diesem Grund ist diese Methode ein - 31 -
gutes Kriterium für die Beurteilung der Reinheit eines Proteins. Der Proteaseinhibitor Ser10-lle13-Arg15-Tyr17-Thr19-Asp24-Thr26-Glu31 -Asn41 -Glu53-Aprotinin eluiert als schlanker Peak von einer RP-18-Phase.
CE-Chromatoαraphie: Die Kapillarelektrophorese erlaubt die Trennung von Peptiden und Proteinen aufgrund ihrer Ladung im elektrischen Feld. Die Güte der Trennung hängt dabei vom Puffer, dem pH-Wert, der Temperatur und den verwendeten Additiven ab. Als Kapillaren werden sogenannte "fused silica" Säulen mit einem Innendurchmesser von 50 bis 100 μm eingesetzt. Der Proteaseinhibitor Ser10-Ile13- Arg15-Tyr17-Thr19-Asp24-Thr26-Glu31-Asn41-Glu53-Aprotinin wurde an einer "fused silica" Säule im elektrischen Feld getrennt. Das Elektropherogramm zeigt einen schlanken Peak.
Molekulargewichtsbestimmung: Das Molekulargewicht von Ser10-Ile13-Arg15-Tyr17- Thr19-Asp24-Thr26-Glu31-Asn41-Glu53-Aprotinin wurde mit der MALDI-Technik zu 6425Dalton bestimmt. Das ermittelte Molekulargewicht ist dabei in guter Übereinstimmung mit dem theoretischen Wert von 6408 Dalton im Rahmen der Genauigkeit der Messmethode. Sinapinsäure wurde als Matrix eingesetzt.
SDS-Gelelektrophorese: Ser10-Ile13-Arg15-Tyr17-Thr19-Asp24-Thr26-Glu31-Asn41- Glu53-Aprotinin wurde mittels SDS-Elektrophorese unter reduzierenden und nicht reduzierenden Bedingungen analysiert. Die Gele zeigen eine Bande im Bereich von ca. 6,5 kD.
Beispiel 9: Bestimmung der Ki-Werte für die Komplexierung von Enzymen mit Ser10- Ile13-Arg15-Tyr17-Thr19-Asp24-Thr26-Glu31-Asn41 -Glu53-Aprotinin
Die inhibitorischen Konstanten von Ser10-ile13-Arg15-Tyr17-Thr19-Asp24-Thr26- Glu31-Asn41-Glu53-Aprotinin wurden für verschiedene Enzyme bestimmt. In der Tabelle 2 sind die Ki-Werte wiedergegeben. - 32 -
Tabelle 2: Inhibitorische Konstanten der Komplexierung von Ser10-Ile13-Arg15-Tyr17- Thr19-Asp24-Thr26-Glu31-Asn41-Glu53-Aprotinin mit den Enzymen Plasmakallikrein, Plasmin, Faktor Xa und Chymotrypsin
Enzym Ki-Wert [M]
Plasmakallikrein 1x10"10
Plasmin 6x10"9
Faktor Xa 5x10"9
Chymotrypsin 5x10'9
Beispiel 10: Wechselwirkung der Proteaseinhibitoren mit polyklonalen Kaninchen bzw. humanen Anti-Aprotininantikörpem
Die rekombinant hergestellten Proteaseinhibitoren wurden auf ihre Kreuzreaktivität mit polyklonalen Kaninchen bzw. humanen Anti-Aprotininantikörpern hin untersucht. Es wurde festgestellt, daß die verschiedenen Proteaseinhibitorvarianten nur eine sehr schwache Kreuzreaktivität gegenüber den verwendeten polyklonalen Kaninchen bzw. humanen Anti-Aprotinin Antiseren zeigen.
Beispiel 11 : Bestimmung des Ki-Wertes von humanem Harnkallikrein mit DesPro2- Ile13-Arg 15-Tyr17-Thr19-Leu39-Leu46-Spacer-Arg 15-Ala17-Bikunin
Die Bestimmung des Ki-Wertes mit humanem Harnkallikrein wurde wie im Beispiel 7 beschrieben durchgeführt. Die eingesetzte Inhibitorkonzentration betrug 1 ,1 μg/μl. 33 -
Substrat Stock Lösung: 0,1 M in DMSO
Substrat Lösung: 1 x10'3 M HD-Val-Leu-Arg-pNA in Assay-Puffer
Assay Puffer: 0,05 M Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan, 0,1 M NaCI, 0,05 % Tween®-20; pH 7,5; 1 ml Benzyl- alkohol/l.
Die kinetischen Konstanten der Komplexierung mit den Enzymen Kallikrein, Faktor Xa, Chymotrypsin und Plasmin wurden nach der gleichen Verfahrensweise bestimmt. Die Substrate waren HD-Pro-Phe-Arg-pNA für Plasmakallikrein, Suc-Phe- Leu-Phe-pNA für Chymotrypsin, Bz-lle-Glu-Gly-Arg-pNA für FXa und Chromozym PL für Plasmin.
Beispiel 12: Ergebnisse der proteinchemischen Charakterisierung von DesPro2- Ile13-Arg 15-Tyr17-Thr19-Leu39-Leu46-Spacer-Arg 15-Ala17-Bikunin
Der Proteaseinhibitor DesPro2-lle13-Arg 15-Tyr17-Thr19-Leu39-Leu46-Spacer- Arg15-Ala17-Bikunin wurde mittels eines gentechnisch veränderten Hefeorganismus durch Sekretion hergestellt. Aus dem Hefeüberstand wurde er durch verschiedene chromatographische Verfahren bis zur Homogenität gereinigt. Die Identität des Inhibitors mit der klonierten Sequenz zeigen die nachfolgenden proteinanalytischen Untersuchungen.
Sequenzanalyse: Der Proteaseinhibitor wurde vollständig sequenziert. Die Sequenzierung wurde N-terminal, über Bruchstücke des Bikunins, die aus dem Kulturüberstand isoliert wurden sowie über Bromcyanpeptide durchgeführt. Die folgende Liste zeigt die bestimmten Proteinsequenzen der Bruchstücke: N-terminale Sequenzierung (unterstrichen), Bruchstück des Bikunins aus dem Kulturüberstand der Hefefermentation (fett), Bromcyanfragment (kursiv). Die ermittelte Sequenz ist mit der klonierten Sequenz identisch. - 34 -
1 Arg-Asp-Phe-Cys-Leu-Glu-Pro-Pro-Tyr-Thr-Gly-Ile-Cys-Arα-Ala-Tyr-Ile-Thr-Arg-
Tyr-Phe-Tyr-Asn-Ala-Lys-Ala-Gly-Leu-Cvs-Gln-Thr-Phe-Val-Tyr-Gly-Gly-Cys-Leu-
Ala-Lys-Arg-Asn-Asn-Phe-Leu-Ser-Ala-Glu-Asp-Cys-Met-Arα-Thr-Cys-Gly-Gly-Ala-
Asn-Ala-Asn-Arg-Ile-Ile-Lys-Thr-Thr-Leu-Gln-Gln-Glu-Lvs-Pro-Asp-Phe-Cys-
Leu-Glu-Pro-Pro-Tyr-Thr-Gly-Pro-Cys-Arg-Ala-Ala-Ile-Ile-Arg-Tyr-Phe-Tyr-
Asn-Ala-Lys-Ala-Gly-Leu-Cys-Gln-Thr-Phe-Val-Tyr-Gly-Gly-Cys-Arg-Ala-Lys-
128 Arg-Asn-Asn-Phe-Lys-Ser-Ala-Glu-Asp-Cys-Met-Arg- Thr-Cys-Gly-Gly-Ala
Aminosäureanalyse: Die Aminosäureanalyse stellt einen wichtigen quantitativen Parameter für die Charakterisierung eines Proteins dar. Neben dem Proteingehalt wird bei bekannter Primärstruktur die Anzahl der Einzelaminosäuren ermittelt. Die Aminosäureanalyse von DesPro2-lle13-Arg 15-Tyr17-Thr19-Leu39-Leu46-Spacer- Arg15-Ala17-Bikunin ist in guter Übereinstimmung mit den theoretischen Werten aus der Primärstruktur (Tab.3).
Tabelle 3: Aminosäureanalyse von DesPro2-lle13-Arg15-Tyr17-Thr19-Leu39-Leu46- Spacer-Arg15-Ala17-Bikunin. Die ganzen Zahlen sind auf Arg=10 bezogen.
Aminosäure ganze Zahlen theor. Zahlen
CysSO3H 10,61 12
Asp 12,07 12
Thr 7,49 7
Ser 2,36 2
Glu 10,40 10
Gly 12,33 12 Ala 14,11 15 35 -
Val 2,20 2
Met 1 ,43 2
Ile 5,17 6
Leu 7,72 8
Tyr 9,03 9
Phe 7,94 8
Lys 7,56 7
Arg 10,00 10
Pro 5,62 6
Cystein und Methionin wurden nach der Perameisensäureoxidation bestimmt (Met als Methioninsulfon).
Reverse Phase Chromatographie: Bei der HPLC-Chromatographie von Proteinen an chemisch gebundene Umkehrphasen kommt es über eine hydrophobe Wechselwirkung der Proteine zu einer Bindung an die verwendete Phase. Die Proteine werden gemäß der Stärke ihrer Bindung an die stationäre Phase von organischen Lösungsmitteln (mobile Phase) verdrängt Aus diesem Grund ist diese Methode ein gutes Kriterium für die Beurteilung der Reinheit ein Protein. DesPro2- Ile13-Arg15-Tyr17-Thr19-Leu39-Leu46-Spacer-Arg15-Ala17-Bikunin eluiert als sauberer Peak von der RP-18-Phase.
Molekulargewichtsbestimmung: Das Molekulargewicht von DesPro2-lle13-Arg15- Tyr17-Thr19-Leu39-Leu46-Spacer-Arg15-Ala17-Bikunin wurde mit der MALDI- Technik zu 14314Dalton bestimmt. Das ermittelte Molekulargewicht ist dabei in guter Übereinstimmung mit dem theoretischen Wert von 14313 Dalton im Rahmen der Genauigkeit der Messmethode. Sinapinsäure wurde als Matrix eingesetzt.
SDS-Gelelektrophorese: DesPro2-lle13-Arg 15-Tyr17-Thr19-Leu39-Leu46-Spacer- Arg15-Ala17-Bikunin wurde mittels SDS-Elektrophoresen unter nicht reduzierenden Bedingungen analysiert. Das Gel zeigt eine Bande im Bereich von ca. 14kD. - 36 -
Beispiel 13: Bestimmung der Ki-Werte für die Komplexierung von Enzymen mit DesPro2-lle13-Arg 15-Tyr17-Thr19-Leu39-Leu46-Spacer-Arg 15-Ala17-Bikunin
Die inhibitorischen Konstanten von DesPro2-lle13-Arg15-Tyr17-Thr19-Leu39-Leu46- Spacer-Arg15-Ala17-Bikunin wurden für verschiedene Enzyme bestimmt. In der Tabelle 4 sind die Ki-Werte wiedergegeben.
Tabelle 4: Inhibitorische Konstanten der Komplexierung von DesPro2-lle13-Arg15- Tyr17-Thr19-Leu39-Leu46-Spacer-Arg15-Ala17-Bikunin mit den Enzymen Harnkallikrein, Faktor Xa, Rinderchymotrypsin, Plasmakallikrein und Plasmin.
Enzym Ki-Wert [M]
Plasmakallikrein 1x10"9
Plasmin IxlO"8
Faktor Xa 2x10"8
Harnkallikrein 5x10"8
Chymotrypsin IxlO"8
Beispiel 14: Ergebnisse der proteinchemischen Charakterisierung von Thr-Thr-Leu- Gln-Gln-Glu-Lys-DesArg 1 -Arg 15-Ala17-Aprotinin
Der Proteaseinhibitor Thr-Thr-Leu-Gln-Gln-GIu-Lys-DesArg1-Arg15-Ala17-Aprotinin wurde aus dem Hefeüberstand neben anderen Spaltprodukten des Bikunins durch verschiedene chromatographische Verfahren isoliert. Der Proteaseinhibitor - 37 -
entspricht dem hinteren Teil des Bikunins. Er enthält die 2. Kunitzdomäne. Er wurde bis zur Homogenität gereinigt. Die Zugehörigkeit zum Bikunin zeigen die nachfolgenden proteinanalytischen Untersuchungen.
Sequenzanalyse: Die Sequenzierung wurde N-terminal über 60 Stufen durchgeführt. Sie zeigt die Identität mit der 2. Bikunindomäne.
1
Thr-Thr-Leu-Gln-Gln-Glu-Lys-Pro-Asp-Phe-Cys-Leu-Glu-Pro-Pro-Tyr-Thr-Gly-Pro- 20
Cys-Arg-Ala-Ala-Ile-Ile-Arg-Tyr-Phe-Tyr-Asn-Ala-Lys-Ala-Gly-Leu-Cys-Gln-Thr-
39
Phe-Val-Tyr-Gly-Gly-Cys-Arg-Ala-Lys-Arg-Asn-Asn-Phe-Lys-Ser-Ala-Glu-Asp-Cys-
58 Met-Arg-Thr...
Reverse Phase Chromatographie: Bei der HPLC-Chromatographie von Proteinen an chemisch gebundene Umkehrphasen kommt es über eine hydrophobe Wechselwirkung der Proteine zu einer Bindung an die verwendete Phase. Die Proteine werden gemäß der Stärke ihrer Bindung an die stationäre Phase von organischen Lösungsmitteln (mobile Phase) verdrängt. Aus diesem Grund ist diese Methode ein gutes Kriterium für die Beurteilung der Reinheit eines Proteins. Thr-Thr- Leu-Gln-Gln-Glu-Lys-DesArg1-Arg15-Ala17-Aprotinin eluiert als sauberer Peak von der RP-18-Phase.
Molekulargewichtsbestimmung: Das Molekulargewicht von Thr-Thr-Leu-Gln-Gln-Glu- Lys-DesArg1-Arg15-Ala17-Aprotinin wurde mit der MALDI-Technik als Na+-lon zu 7154 Dalton bestimmt. Das ermittelte Molekulargewicht ist dabei in guter Übereinstimmung mit dem theoretischen Wert des Na+-lons von 7150 Dalton im Rahmen der Genauigkeit der Messmethode. Sinapinsäure wurde als Matrix eingesetzt. - 38 -
SDS-Gelelektrophorese: Thr-Thr-Leu-Gln-Gln-Glu-Lys-DesArg 1 -Arg 15-Ala 17-
Aprotinin wurde mittels SDS-Elektrophorese unter reduzierenden und nicht reduzierenden Bedingungen analysiert. Die Gele zeigen eine Bande im Bereich von ca. 7kD.
Beispiel 15: Bestimmung der Ki-Werte für die Komplexierung von Enzymen mit Thr- Thr-Leu-Gln-Gln-Glu-Lys-DesArg1-Arg15-Ala17-Aprotinin
Die inhibitorischen Konstanten von Thr-Thr-Leu-Gln-Gln-Glu-Lys-DesArg1-Arg15- Ala17-Aprotinin wurden für verschiedene Enzyme bestimmt. In der Tabelle 5 sind die Ki-Werte wiedergegeben.
Tabelle 5: Inhibitorische Konstanten der Komplexierung von Thr-Thr-Leu-Gln-Gln- Glu-Lys-DesArg1-Arg15-Ala17-Aprotinin mit den Enzymen Harnkallikrein, Faktor Xa, Chymotrypsin, Plasmakallikrein und Plasmin.
Enzym Ki-Wert [M]
Plasmakallikrein 3x10"11
Plasmin 2x10"10
Faktor Xa 8x10"8
Harnkallikrein 3x10"11
Chymotrypsin 1x10"8 - 39 -
Beispiel 16: Ergebnisse der proteinchemischen Charakterisierung von Asp(-3)-Lys(- 2)-Arg(-1 )-DesPro2-lle13-Arg15-Tyr17-Thr19-Leu39-Leu46-Aprotinin-Asn59-Ala60- Asn61
Der Proteaseinhibitor Asp(-3)-Lys(-2)-Arg(-1)-DesPro2-lle13-Arg15-Tyr17-Thr19- Leu39-Leu46-Aprotinin-Asn59-Ala60-Asn61wurde aus dem Hefeüberstand neben anderen Spaltprodukten des Bikunins durch verschiedene chromatographische Verfahren isoliert. Der Proteaseinhibitor entspricht dem vorderen Teil des Bikunins. Er enthält die LKunitzdomäne. Er wurde bis zur Homogenität gereinigt. Die Zugehörigkeit zum Bikunin zeigen die nachfolgenden proteinanalytischen Untersuchungen.
Sequenzanalyse: Die Sequenzierung wurde N-terminal über 21 Stufen durchgeführt. Sie zeigt die Identität mit der LBikunindomäne.
-3 Asp-Lys-Arg-Arg-Asp-Phe-Cys-Leu-Glu-Pro-Pro-Tyr-Thr-Gly-Ile-Cys-Arg-Ala-Tyr-
Ile-Thr...
Reverse Phase Chromatographie: Bei der HPLC-Chromatographie von Proteinen an chemisch gebundene Umkehrphasen kommt es über eine hydrophobe Wechselwirkung der Proteine zu einer Bindung an die verwendete Phase. Die Proteine werden gemäß der Stärke ihrer Bindung an die stationäre Phase von organischen Lösungsmitteln (mobile Phase) verdrängt. Aus diesem Grund ist diese Methode ein gutes Kriterium für die Beurteilung der Reinheit eines Proteins. Der Proteaseinhibitor Asp(-3)-Lys(-2)-Arg(-1 )-DesPro2-lle13-Arg15-Tyr17-Thr19-Leu39- Leu46-Aprotinin-Asn59-Ala60-Asn61 eluiert als sauberer Peak von der RP-18- Phase. - 40 -
Molekulargewichtsbestimmung: Das Molekulargewicht von Asp(-3)-Lys(-2)-Arg(-1 )- DesPro2-lle13-Arg15-Tyr17-Thr19-Leu39-Leu46-Aprotinin-Asn59-Ala60-Asn61 wurde mit der MALDI-Technik als Na+-lon zu 7118 Dalton bestimmt. Das ermittelte Molekulargewicht ist dabei in guter Übereinstimmung mit dem theoretischen Wert des Na+-lons von 7117 Dalton im Rahmen der Genauigkeit der Messmethode. Sinapinsäure wurde als Matrix eingesetzt.
Kapillarelektrophorese: Der Proteaseinhibitor Asp(-3)-Lys(-2)-Arg(-1)-DesPro2-lle13- Arg15-Tyr17-Thr19-Leu39-Leu46-Aprotinin-Asn59-Ala60-Asn61 wurde mittels Kapillarelektrophoresen unter analysiert. Der Inhibitor zeigt einen schlanken Peak bei ca.12 min.
Beispiel 17: Bestimmung der Ki-Werte für die Komplexierung von Enzymen mit Asp(- 3)-Lys(-2)-Arg (-1)-DesPro2-lle13-Arg15-Tyr17-Thr19-Leu39-Leu46-Aprotinin-Asn59-Ala60-Asn61
Die inhibitorischen Konstanten von Asp(-3)-Lys(-2)-Arg(-1)-DesPro2-lle13-Arg15- Tyr17-Thr19-Leu39-Leu46-Aprotinin-Asn59-Ala60-Asn61 wurden für verschiedene Enzyme bestimmt. In der Tabelle 6 sind die Ki-Werte wiedergegeben.
Tabelle 6: Inhibitorische Konstanten der Komplexierung von Asp(-3)-Lys(-2)-Arg(-1)- DesPro2-lle13-Arg15-Tyr17-Thr19-Leu39-Leu46-Aprotinin-Asn59-Ala60-Asn61 mit den Enzymen Faktor Xa, Plasmakallikrein und Plasmin.
Enzym Ki-Wert [M]
Plasmakallikrein 2x10"10
Plasmin 2x10"10
Faktor Xa 1x10"10 - 41
Beispiel 18: Synthese und Reinigung von Ser10-Ile13-Arg15-Tyr17-Thr19-Asp24- Thr26-Glu31-Asn41-Glu53-Aprotinin-PEG-5000
Ser10-Ile13-Arg15-Tyr17-Thr19-Asp24-Thr26-Glu31-Asn41-Glu53-Aprotinin wurde mit SC-PEG-5000, das spezifisch mit freien NH2-Gruppen reagiert in 0,2 M Boratpuffer pH 8,3 für 1 h bei 37 °C unter leichtem Schütteln umgesetzt. Nicht umgesetzter Inhibitor oder SC-PEG-5000 wurde mittels Gelfiltration an einer Superdex 30 mit 50 mM Na-Phosphat / 150 mM NaCI pH 7,2 entfernt.
Das SC-PEG-5000 (Succinimidylcarbonat Polyäthylenglykoll Monomethyläther-5000; mittleres Molekulargewicht 5 kD) wurde von Calbiochem, D- Bad Soden bezogen.
Beispiel 19: Ergebnisse der proteinchemischen Charakterisierung von PEG-Ser10- He13-Arg15-Tyr17-Thr19-Asp24-Thr26-Glu31-Asn41-Glu53-Aprotinin
Der Proteaseinhibitor PEG-Ser10-Ile13-Arg15-Tyr17-Thr19-Asp24-Thr26-Glu31- Asn41-Glu53-Aprotinin wurde nach der Reaktion durch Gelfiltration von den Ausgangsprodukten abgetrennt und zur Charakterisierung eingesetzt.
Sequenzanalyse: Die Sequenzierung wurde N-terminal über 21 Stufen durchgeführt. Sie zeigt die Identität des eingesetzten Inhibitors.
1 Arg-Pro-Asp-Phe-Cys-Leu-Glu-Pro-Pro-Ser-Thr-Gly-Ile-Cys-Arg-Ala-Tyr-
Me-Thr...
SDS-Gelelektrophorese: PEG-Ser10-Ile13-Arg15-Tyr17-Thr19-Asp24-Thr26-Glu31- Asn41-Glu53-Aprotinin wurde mittels SDS-Elektrophorese unter reduzierenden Bedingungen analysiert. Das Gele zeigt eine Bande im Bereich von ca. 12 kD. 42
Beispiel 20: Bestimmung der Ki-Werte für die Komplexierung von Enzymen mit PEG- Ser10-Ile13-Arg15-Tyr17-Thr19-Asp24-Thr26-Glu31-Asn41-Glu53-Aprotinin
Die inhibitorischen Konstanten von PEG-Ser10-Ile13-Arg15-Tyr17-Thr19-Asp24- Thr26-Glu31-Asn41-Glu53-Aprotinin wurden für verschiedene Enzyme bestimmt. In der Tabelle 7 sind die Ki-Werte wiedergegeben.
Tabelle 7: Inhibitorische Konstanten der Komplexierung von PEG-Ser10-Ile13- Arg15-Tyr17-Thr19-Asp24-Thr26-Glu31-Asn41-Glu53-Aprotinin mit den Enzymen Faktor Xa, Plasmakallikrein und Plasmin.
Enzym Ki-Wert [M]
Plasmakallikrein 5x10"10
Plasmin 6x10"9
Faktor Xa 5 x 10"9
- 43 -
SEQUENZPROTOKOLL
(1) ALLGEMEINE ANGABEN:
(i) ANMELDER:
(A) NAME: Bayer AG
(B) STRASSE: Bayerwerk
(C) ORT: Leverkusen (E) LAND: Deutschland
(F) POSTLEITZAHL: 51368
(ii) BEZEICHNUNG DER ERFINDUNG: Aprotxnin-Varianten mit verbesserten Eigenschaften und Bikunine von Aprotininvarianten
(iii) ANZAHL DER SEQUENZEN: 32
(iv) COMPUTER-LESBARE FASSUNG:
(A) DATENTRÄGER: Floppy disk (B) COMPUTER: IBM PC compatible
(C) BETRIEBSSYSTEM: PC-DOS/MS-DOS
(D) SOFTWARE: Patentin Release #1.0, Version #1.30 (EPA)
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 1:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 58 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang (D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO : 1:
Arg Pro Asp Phe Cys Leu Glu Pro Pro Tyr Thr Gly Pro Cys Lys Ala 1 5 10 15
Arg Ile Ile Arg Tyr Phe Tyr Asn Ala Lys Ala Gly Leu Cys Gin Thr 20 25 30
Phe Val Tyr Gly Gly Cys Arg Ala Lys Arg Asn Asn Phe Lys Ser Ala 35 40 45 Glu Asp Cys Met Arg Thr Cys Gly Gly Ala 50 55
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 2: (i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 13 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang - 44 -
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO : 2:
Asn Ala Asn Arg Ile Ile Lys Thr Thr Leu Gin Gin Glu 1 5 10 (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 3:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 13 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure (C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 3:
Asn Ala Asn Arg Leu Leu Lys Thr Thr Leu Gin Gin Glu 1 5 10 (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 4:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 13 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure (C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO : 4:
Gin Ala Gin Arg Ile Ile Lys Thr Thr Leu Gin Gin Glu 1 5 10 (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 5:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 72 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid (C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Sonstige Nucleinsäure
(A) BESCHREIBUNG: /desc = "synthetic DNA" - 45 -
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 5:
CCAGATTTCT GCCTCGAACA ACCACCATCT ACTGGTATTT GTAGAGCTTA CATTACTAGA 60 TACTTCTACG AT 72
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 6:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN: (A) LÄNGE: 27 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear (ii) ART DES MOLEKÜLS: Sonstige Nucleinsaure
(A) BESCHREIBUNG: /desc = "synthetic DNA"
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO : 6: TACGGCGGCT GCTTGGCTAA CCGTAAC 27
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 7:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN: (A) LÄNGE: 38 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear (ii) ART DES MOLEKÜLS: Sonstige Nucleinsaure
(A) BESCHREIBUNG: /desc = "synthetic DNA"
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 7: GGGATATCTA TTGATAAGAT TTAAAGGTAT TTGACAAG 38
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 8: (i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 100 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Sonstige Nucleinsaure
(A) BESCHREIBUNG: /desc = "synthetic DNA"
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO : 8:
GGGCTCGAGG CAGAAATCTG GTCTAGCCAA AGCAGAAGAA GCAGCGAACA AGACAGCAGT 60
GAAAATAGAT GGGAATCTCA TTCTTTTAAT CGTTTATATT 100 - 46
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO : 9:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN: (A) LÄNGE: 74 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear (ii) ART DES MOLEKÜLS: Sonstige Nucleinsaure
(A) BESCHREIBUNG: /desc = "synthetic DNA"
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 9: TCGAGACAGA AATCTGGCGT ATTAATAATT CTGTTAGCGT TAGCACCACC GCAGGTTCTC 60
ATACAATCTT CCGC 74
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 10:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 86 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid
(C) STRANGFORM: Einzelstrang (D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Sonstige Nucleinsaure
(A) BESCHREIBUNG: /desc = "synthetic DNA" (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 10:
GGAAGATTGT ATGAGAACCT GCGGTGGTGC TAACGCTAAC AGAATTATGA AGACTACTTT 60
GCAACAAGAA AAGCCAGATT TCTGTC 86
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 11:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 18 Basenpaare (B) ART: Nucleotid
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Sonstige Nucleinsaure (A) BESCHREIBUNG: /desc = "synthetic DNA"
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 11:
AACGGGTTAT TGTTTATA - 47 -
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 12:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 58 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 12:
Arg Pro Asp Phe Cys Leu Glu Pro Pro Ser Thr Gly Ile Cys Arg Ala 1 5 10 15
Tyr Ile Thr Arg Tyr Phe Tyr Asp Ala Thr Ala Gly Leu Cys Glu Thr 20 25 30
Phe Val Tyr Gly Gly Cys Arg Ala Asn Arg Asn Asn Phe Lys Ser Ala 35 40 45
Glu Asp Cys Met Glu Thr Cys Gly Gly Ala 50 55 (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 13:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 57 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure (C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 13:
Arg Asp Phe Cys Leu Glu Pro Pro Ser Thr Gly Ile Cys Arg Ala Tyr 1 5 10 15 Ile Thr Arg Tyr Phe Tyr Asp Ala Thr Ala Gly Leu Cys Glu Thr Phe
20 25 30
Val Tyr Gly Gly Cys Arg Ala Asn Arg Asn Asn Phe Lys Ser Ala Glu 35 40 45
Asp Cys Met Glu Thr Cys Gly Gly Ala 50 55
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 14:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 58 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure - 48 -
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 14:
Arg Pro Asp Phe Cys Leu Glu Pro Pro Ser Thr Gly Ile Cys Arg Ala 1 5 10 15
Tyr Ile Thr Arg Tyr Phe Tyr Asp Ala Thr Ala Gly Leu Cys Glu Thr 20 25 30
Phe Val Tyr Gly Gly Cys Leu Ala Asn Arg Asn Asn Phe Lys Ser Ala 35 40 45
Glu Asp Cys Met Glu Thr Cys Gly Gly Ala 50 55 (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 15:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 58 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure (C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 15:
Arg Pro Asp Phe Cys Leu Glu Pro Pro Ser Thr Gly Ile Cys Arg Ala 1 5 10 15 Arg Ile Thr Arg Tyr Phe Tyr Asp Ala Thr Ala Gly Leu Cys Glu Thr
20 25 30
Phe Val Tyr Gly Gly Cys Arg Ala Asn Arg Asn Asn Phe Lys Ser Ala 35 40 45
Glu Asp Cys Met Glu Thr Cys Gly Gly Ala 50 55
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 16:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 58 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang (D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid - 49 -
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 16:
Arg Pro Asp Phe Cys Leu Glu Pro Pro Ser Thr Gly Ile Cys Arg Ala 1 5 10 15
Arg Ile Thr Arg Tyr Phe Tyr Asp Ala Thr Ala Gly Leu Cys Glu Thr 20 25 30
Phe Val Tyr Gly Gly Cys Leu Ala Asn Arg Asn Asn Phe Lys Ser Ala 35 40 45
Glu Asp Cys Met Glu Thr Cys Gly Gly Ala 50 55 (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 17:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 58 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure (C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 17:
Arg Pro Asp Phe Cys Leu Glu Pro Pro Ser Thr Gly Ile Cys Arg Ala 1 5 10 15 Tyr Ile Thr Arg Tyr Phe Tyr Asp Ala Thr Ala Gly Leu Cys Glu Thr
20 25 30
Phe Val Tyr Gly Gly Cys Arg Ala Asn Arg Asn Asn Phe Lys Ser Ala 35 40 45
Glu Asp Cys Met Glu Thr Cys Gly Gly Ala 50 55
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 18:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 58 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang (D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO : 18
Arg Pro Asp Phe Cys Leu Glu Pro Pro Ser Thr Gly Ile Cys Arg Ala - 50 -
Tyr Ile Thr Arg Tyr Phe Tyr Asn Ala Thr Ala Gly Leu Cys Glu Thr 20 25 30
Phe Val Tyr Gly Gly Cys Arg Ala Asn Arg Asn Asn Phe Lys Ser Ala 35 40 45
Glu Asp Cys Met Glu Thr Cys Gly Gly Ala 50 55 (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 19:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 58 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure (C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 19:
Arg Pro Asp Phe Cys Leu Glu Pro Pro Ser Thr Gly Ile Cys Arg Ala 1 5 10 15 Tyr Ile Thr Arg Tyr Phe Tyr Asp Ala Thr Ala Gly Leu Cys Glu Thr
20 25 30
Phe Val Tyr Gly Gly Cys Leu Ala Asn Arg Asn Asn Phe Leu Ser Ala 35 40 45
Glu Asp Cys Met Glu Thr Cys Gly Gly Ala 50 55
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 20:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 58 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang (D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 20:
Arg Pro Asp Phe Cys Leu Glu Pro Pro Ser Thr Gly Phe Cys Arg Ala 1 5 10 15
Tyr Ile Thr Arg Tyr Phe Tyr Asp Ala Thr Ala Gly Leu Cys Glu Thr 20 25 30
Phe Val Tyr Gly Gly Cys Arg Ala Asn Arg Asn Asn Phe Lys Ser Ala 35 40 45 - 51 -
Glu Asp Cys Met Glu Thr Cys Gly Gly Ala 50 55 (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 21:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 58 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure (C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 21:
Arg Pro Asp Phe Cys Leu Glu Pro Pro Ser Thr Gly Leu Cys Arg Ala 1 5 10 15 Tyr Ile Thr Arg Tyr Phe Tyr Asp Ala Thr Ala Gly Leu Cys Glu Thr
20 25 30
Phe Val Tyr Gly Gly Cys Arg Ala Asn Arg Asn Asn Phe Lys Ser Ala 35 40 45
Glu Asp Cys Met Glu Thr Cys Gly Gly Ala 50 55
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 22:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 58 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang (D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 22
Arg Pro Asp Phe Cys Leu Glu Pro Pro Ser Thr Gly Leu Cys Arg Ala 1 5 10 15
Leu Ile Thr Arg Tyr Phe Tyr Asp Ala Thr Ala Gly Leu Cys Glu Thr 20 25 30
Phe Val Tyr Gly Gly Cys Arg Ala Asn Arg Asn Asn Phe Lys Ser Ala 35 40 45
Glu Asp Cys Met Glu Thr Cys Gly Gly Ala 50 55 - 52 -
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 23:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 58 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 23:
Arg Pro Asp Phe Cys Leu Glu Pro Pro Ser Thr Gly Ile Cys Arg Ala 1 5 10 15
Leu Ile Thr Arg Tyr Phe Tyr Asp Ala Thr Ala Gly Leu Cys Glu Thr 20 25 30
Phe Val Tyr Gly Gly Cys Arg Ala Asn Arg Asn Asn Phe Lys Ser Ala 35 40 45
Glu Asp Cys Met Glu Thr Cys Gly Gly Ala 50 55 (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 24:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 128 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure (C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO : 24:
Arg Asp Phe Cys Leu Glu Pro Pro Tyr Thr Gly Ile Cys Arg Ala Tyr 1 5 10 15 Ile Thr Arg Tyr Phe Tyr Asn Ala Lys Ala Gly Leu Cys Gin Thr Phe
20 25 30
Val Tyr Gly Gly Cys Leu Ala Lys Arg Asn Asn Phe Leu Ser Ala Glu 35 40 45
Asp Cys Met Arg Thr Cys Gly Gly Ala Asn Ala Asn Arg Ile Ile Lys 50 55 60
Thr Thr Leu Gin Gin Glu Lys Pro Asp Phe Cys Leu Glu Pro Pro Tyr 65 70 75 80
Thr Gly Pro Cys Arg Ala Ala Ile Ile Arg Tyr Phe Tyr Asn Ala Lys 85 90 95 - 53
Ala Gly Leu Cys Gin Thr Phe Val Tyr Gly Gly Cys Arg Ala Lys Arg 100 105 110
Asn Asn Phe Lys Ser Ala Glu Asp Cys Met Arg Thr Cys Gly Gly Ala 115 120 125
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 25:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 129 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang (D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 25:
Arg Pro Asp Phe Cys Leu Glu Pro Pro Tyr Thr Gly Ile Cys Arg Ala 1 5 10 15
Tyr Ile Thr Arg Tyr Phe Tyr Asn Ala Lys Ala Gly Leu Cys Gin Thr 20 25 30
Phe Val Tyr Gly Gly Cys Leu Ala Lys Arg Asn Asn Phe Leu Ser Ala 35 40 45 Glu Asp Cys Met Arg Thr Cys Gly Gly Ala Asn Ala Asn Arg Ile Ile 50 55 60
Lys Thr Thr Leu Gin Gin Glu Arg Pro Asp Phe Cys Leu Glu Pro Pro 65 70 75 80
Tyr Thr Gly Pro Cys Arg Ala Ala Ile Ile Arg Tyr Phe Tyr Asn Ala 85 90 95
Lys Ala Gly Leu Cys Gin Thr Phe Val Tyr Gly Gly Cys Arg Ala Lys 100 105 110
Arg Asn Asn Phe Lys Ser Ala Glu Asp Cys Met Arg Thr Cys Gly Gly 115 120 125
Ala
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 26: (i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 128 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang - 54 -
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 26:
Arg Asp Phe Cys Leu Glu Pro Pro Ser Thr Gly Ile Cys Arg Ala Tyr 1 5 10 15 Ile Thr Arg Tyr Phe Tyr Asp Ala Thr Ala Gly Leu Cys Glu Thr Phe
20 25 30
Val Tyr Gly Gly Cys Arg Ala Asn Arg Asn Asn Phe Lys Ser Ala Glu 35 40 45
Asp Cys Met Glu Thr Cys Gly Gly Ala Asn Ala Asn Arg Ile Ile Lys 50 55 60
Thr Thr Leu Gin Gin Glu Arg Pro Asp Phe Cys Leu Glu Pro Pro Tyr 65 70 75 80
Thr Gly Pro Cys Arg Ala Ala Ile Ile Arg Tyr Phe Tyr Asn Ala Lys 85 90 95 Ala Gly Leu Cys Gin Thr Phe Val Tyr Gly Gly Cys Arg Ala Lys Arg
100 105 110
Asn Asn Phe Lys Ser Ala Glu Asp Cys Met Arg Thr Cys Gly Gly Ala 115 120 125
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 27:
( i) SEQUENZKENNZEICHEN: (A) LÄNGE: 128 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear (ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 27:
Arg Asp Phe Cys Leu Glu Pro Pro Ser Thr Gly Ile Cys Arg Ala Tyr 1 5 10 15
Ile Thr Arg Tyr Phe Tyr Asp Ala Thr Ala Gly Leu Cys Glu Thr Phe 20 25 30 Val Tyr Gly Gly Cys Leu Ala Asn Arg Asn Asn Phe Lys Ser Ala Glu
35 40 45 - 55 -
Asp Cys Met Glu Thr Cys Gly Gly Ala Asn Ala Asn Arg Ile Ile Lys 50 55 60
Thr Thr Leu Gin Gin Glu Arg Pro Asp Phe Cys Leu Glu Pro Pro Tyr 65 70 75 80
Thr Gly Pro Cys Arg Ala Ala Ile Ile Arg Tyr Phe Tyr Asn Ala Lys 85 90 95 Ala Gly Leu Cys Gin Thr Phe Val Tyr Gly Gly Cys Arg Ala Lys Arg
100 105 110
Asn Asn Phe Lys Ser Ala Glu Asp Cys Met Arg Thr Cys Gly Gly Ala 115 120 125
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 28:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 128 Aminosäuren (B) ART: Aminosäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 28:
Arg Asp Phe Cys Leu Glu Pro Pro Ser Thr Gly Ile Cys Arg Ala Tyr 1 5 10 15
Ile Thr Arg Tyr Phe Tyr Asp Ala Thr Ala Gly Leu Cys Glu Thr Phe 20 25 30
Val Tyr Gly Gly Cys Arg Ala Asn Arg Asn Asn Phe Lys Ser Ala Glu 35 40 45
Asp Cys Met Glu Thr Cys Gly Gly Ala Asn Ala Asn Arg Ile Ile Lys 50 55 60 Thr Thr Leu Gin Gin Glu Arg Pro Asp Phe Cys Leu Glu Pro Pro Ser 65 70 75 80
Thr Gly Pro Cys Arg Ala Ala Ile Ile Arg Tyr Phe Tyr Asp Ala Thr 85 90 95
Ala Gly Leu Cys Glu Thr Phe Val Tyr Gly Gly Cys Arg Ala Asn Arg 100 105 110
Asn Asn Phe Lys Ser Ala Glu Asp Cys Met Glu Thr Cys Gly Gly Ala 115 120 125 - 56 -
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 29:
( i ) SEQUENZKENNZEICHEN :
(A) LÄNGE: 128 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 29:
Arg Asp Phe Cys Leu Glu Pro Pro Ser Thr Gly Pro Cys Val Ala Arg 1 5 10 15
Ile Ile Arg Tyr Phe Tyr Asp Ala Thr Ala Gly Leu Cys Glu Thr Phe 20 25 30
Val Tyr Gly Gly Cys Arg Ala Asn Arg Asn Asn Phe Lys Ser Ala Glu 35 40 45
Asp Cys Met Glu Thr Cys Gly Gly Ala Asn Ala Asn Arg Ile Ile Lys 50 55 60 Thr Thr Leu Gin Gin Glu Arg Pro Asp Phe Cys Leu Glu Pro Pro Ser 65 70 75 80
Thr Gly Pro Cys Arg Ala Ala Ile Ile Arg Tyr Phe Tyr Asp Ala Thr 85 90 95
Ala Gly Leu Cys Glu Thr Phe Val Tyr Gly Gly Cys Arg Ala Asn Arg 100 105 110
Asn Asn Phe Lys Ser Ala Glu Asp Cys Met Glu Thr Cys Gly Gly Ala 115 120 125
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO : 30:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN: (A) LÄNGE: 128 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear (ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO : 30:
Arg Asp Phe Cys Leu Glu Pro Pro Ser Thr Gly Pro Cys Lys Ala Arg 1 5 10 15
Ile Ile Arg Tyr Phe Tyr Asp Ala Thr Ala Gly Leu Cys Glu Thr Phe 20 25 30 57
Val Tyr Gly Gly Cys Arg Ala Asn Arg Asn Asn Phe Lys Ser Ala Glu 35 40 45
Asp Cys Met Glu Thr Cys Gly Gly Ala Asn Ala Asn Arg Ile Ile Lys 50 55 60
Thr Thr Leu Gin Gin Glu Arg Pro Asp Phe Cys Leu Glu Pro Pro Ser 65 70 75 80
Thr Gly Ile Cys Arg Ala Tyr Ile Thr Arg Tyr Phe Tyr Asp Ala Thr 85 90 95
Ala Gly Leu Cys Glu Thr Phe Val Tyr Gly Gly Cys Arg Ala Asn Arg 100 105 110
Asn Asn Phe Lys Ser Ala Glu Asp Cys Met Glu Thr Cys Gly Gly Ala 115 120 125 (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 31:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 128 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure (C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO : 31:
Arg Asp Phe Cys Leu Glu Pro Pro Ser Thr Gly Pro Cys Arg Ala Ala 1 5 10 15 Ile Ile Arg Tyr Phe Tyr Asp Ala Thr Ala Gly Leu Cys Glu Thr Phe
20 25 30
Val Tyr Gly Gly Cys Arg Ala Asn Arg Asn Asn Phe Lys Ser Ala Glu 35 40 45
Asp Cys Met Glu Thr Cys Gly Gly Ala Asn Ala Asn Arg Leu Leu Lys 50 55 60
Thr Thr Leu Gin Gin Glu Arg Pro Asp Phe Cys Leu Glu Pro Pro Ser 65 70 75 80
Thr Gly Ile Cys Arg Ala Tyr Ile Thr Arg Tyr Phe Tyr Asp Ala Thr 85 90 95 Ala Gly Leu Cys Glu Thr Phe Val Tyr Gly Gly Cys Arg Ala Asn Arg
100 105 110 - 58 -
Asn Asn Phe Lys Ser Ala Glu Asp Cys Met Glu Thr Cys Gly Gly Ala 115 120 125
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 32:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 128 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang (D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 32:
Arg Asp Phe Cys Leu Glu Pro Pro Ser Thr Gly Pro Cys Arg Ala Ala 1 5 10 15
Ile Ile Arg Tyr Phe Tyr Asp Ala Thr Ala Gly Leu Cys Glu Thr Phe 20 25 30
Val Tyr Gly Gly Cys Arg Ala Asn Arg Asn Asn Phe Lys Ser Ala Glu 35 40 45 Asp Cys Met Glu Thr Cys Gly Gly Ala Asn Ala Asn Arg Leu Leu Lys 50 55 60
Thr Thr Leu Gin Gin Glu Arg Pro Asp Phe Cys Leu Glu Pro Pro Ser 65 70 75 80
Thr Gly Ile Cys Arg Ala Tyr Ile Thr Arg Tyr Phe Tyr Asp Ala Thr 85 90 95
Ala Gly Leu Cys Glu Thr Phe Val Tyr Gly Gly Cys Leu Ala Asn Arg 100 105 110
Asn Asn Phe Lys Ser Ala Glu Asp Cys Met Glu Thr Cys Gly Gly Ala
115 120 125

Claims

- 59Patentansprüche
1. Aprotininvarianten mit einer Nettoladung von +3 bis -3 bei pH 7, wobei in der Bindungsregion der Aminosäurerest 10 Ser ist, der Aminosäurerest 13 Ile, Phe oder Leu ist, der Aminosäurerest 15 Arg ist, der Aminosäurerest 17 Tyr, Leu oder Arg ist und der Aminosäurerest 19 Thr oder Lys ist.
2. Aprotininvarianten nach Anspruch 1 mit einer veränderten N-terminalen und/oder C-terminalen Sequenz, insbesondere mit einer N-terminalen Verlängerung oder
Verkürzung oder mit einer deletierten Aminosäure im N-Terminus.
3. Aprotininvarianten nach Anspruch 1 oder 2 mit der Formel
Arg X2 Asp Phe Cys Leu Glu Pro Pro Ser Thr Gly X13 Cys Arg Ala X17 Ile Thr Arg Tyr Phe Tyr X24 Ala Thr Ala Gly Leu Cys X31 Thr Phe Val Tyr Gly Gly Cys X39 Ala Asn Arg Asn Asn Phe X46 Ser Ala Glu Asp Cys Met Glu Thr Cys Gly Gly Ala
worin X2 Pro oder eine Bindung ist, X13 Ile, Phe oder Leu ist, X17 Tyr Leu oder Arg ist, X24 Asp oder Asn ist, X31 Glu oder Gin ist X39 Arg oder Leu ist, X46 Lys oder Leu ist oder Polyethylenglykolderivate derselben.
4. Aprotininvarianten nach Anspruch 3, ausgewählt aus DesPro2-Ser10-lle13-Arg15- Tyr17-Thr19-Asp24-Thr26-Glu31-Asn41-Glu53-Aprotinin, DesPro2-Ser10-lle13-Arg15- Thr19-Asp24-Thr26-Glu31-Asn41-Glu53-Aprotinin, DesPro2-Ser10-lle13-Arg15-Tyr17- Thr19-Asp24-Thr26-Glu31-Leu39-Asn41-Glu53-Aprotinin, DesPro2-Ser10-lle13- Arg15-Thr19-Asp24-Thr26-Glu31-Leu39-Asn41-Glu53-Aprotinin, DesPro2-Ser10- Phe13-Arg15-Tyr17-Thr19-Asp24-Thr26-Glu31-Asn41-Glu53-Aprotinin, DesPro2- Ser10-Leu13-Arg 15-Tyr17-Thr19-Asp24-Thr26-Glu31 -Asn41-Glu53-Aprotinin, DesPro2-Ser10-lle13-Arg 15-Tyr17-Thr19-Asp24-Thr26-Asn41 -Glu53-Aprotinin, PEG- DesPro2-Ser10-lle13-Arg 15-Tyr17-Thr19-Asp24-Thr26-Asn41 -Glu53-Aprotinin, DesPro2-Ser10-lle13-Arg 15-Tyr17-Thr19-Thr26-Asn41 -Glu53-Aprotinin. - 60 -
5. Aprotininvarianten nach Anspruch 4, worin die Aminosäure in Position 2 Prolin ist.
6. Bikunine, umfassend zwei durch einen Spacer mit mehreren Aminosäureresten verknüpfte Aprotininvarianten, wobei zumindest eine der Arpotininvarianten a) eine Aprotininvariante ist, in der der Aminosäurerest 13 Ile, Phe oder Leu ist, der Aminosäurerest 15 Arg Val oder Leu ist, der Aminosäurerest 17 Tyr, Leu oder Ala ist, der Aminosäurerest 19 Thr oder Lys ist, der Aminosäurerest 39 Arg oder Leu ist und der Aminosäurerest 46 Leu oder Lys ist, oder b) eine Arpotininvariante gemäß Anspruch 1 bis 5 ist.
7. Bikunine nach Anspruch 6, wobei der Spacer 10 bis 40, insbesondere 10 bis 20 Aminosäurereste enthält.
8. Bikunine nach Anspruch 7, wobei der Spacer ausgewählt ist aus den Sequenzen: Asn-Ala-Asn-Arg-Ile-Ile-Lys-Thr-Thr-Leu-Gln-Gln-Glu, Asn-Ala-Asn-Arg-Leu-Leu-Lys- Thr-Thr-Leu-Gln-Gln-Glu, Gln-Ala-Gln-Arg-Ile-Ile-Lys-Thr-Thr-Leu-Gln-Gln-Glu und Fragmente derselben.
9. Bikunine nach einem oder mehreren der Ansprüche 6 bis 8 mit einer N-terminalen Verlängerung oder Verkürzung oder mit einer deletierten Aminosäure im N-
Terminus.
10. Bikunine nach einem oder mehreren der Ansprüche 6 bis 9 mit der Formel
Arg X2 Asp Phe Cys Leu Glu Pro Pro X10 Thr Gly X13 Cys X15 Ala X17 Ile X19 Arg Tyr Phe Tyr X24 Ala X26 Ala Gly Leu Cys X31 Thr Phe Val Tyr Gly Gly Cys X39 Ala X41 Arg Asn Asn Phe X46 Ser Ala Glu Asp Cys Met X53 Thr Cys Gly Gly Ala Asn Ala Asn Arg X63 X64 Lys Thr Thr Leu Gin Gin Glu X72 Pro Asp Phe Cys Leu Glu Pro Pro X81 Thr Gly X84 Cys Arg Ala X88 Ile X90 Arg Tyr Phe Tyr X95 Ala X97 Ala Gly Leu Cys X102 Thr Phe Val Tyr Gly Gly Cys X110 Ala X112 Arg Asn Asn Phe Lys Ser Ala Glu Asp Cys Met X124 Thr Cys Gly Gly Ala, - 61 -
wobei X2 Pro oder eine Bindung ist, X10 Ser oder Tyr ist, X13 Ile oder Pro ist, X15 Arg, Val oder Lys ist, X17 Tyr, Arg oder Ala ist, X19 Thr oder Ile ist, X24 Asp oder Asn ist, X26 Thr oder Lys ist, X31 Glu oder Gin ist, X39 Arg oder Leu ist, X41 Asn oder Lys ist, X46 Lys oder Leu ist, X53 Glu oder Arg ist, X63 und X64 jeweils Ile oder Leu ist, X72 Arg oder Lys ist, X81 Tyr oder Ser ist, X84 Pro oder Ile ist, X88 Ala oder Tyr ist, X90 Ile oder Thr ist, X95 Asn oder Asp ist, X97 Lys oder Thr ist, X102 Gin oder Glu ist, X110 Arg oder Leu ist, X112 Lys oder Asn ist und X124 Arg oder Glu ist.
11. Bikunine nach Anspruch 10 ausgewählt aus DesPro2-Ser10-lle13-Arg15-Tyr17- Thr19-Asp24-Thr26-Glu31-Asn41-Glu53-Arg86-Ala88-Bikunin, DesPro2-Ser10-lle13- Arg15-Thr19-Asp24-Thr26-Glu31-Asn41-Glu53-Arg86-Ala88-Bikunin, DesPro2-Arg15- Ala17-Ser81-Ile84-Arg86-Tyr88-Thr90-Asp95-Thr97-Glu102-Asn112-Glu124-Bikunin, DesPro2-lle13-Arg15-Tyr17-Thr19-Leu39-Leu46-Arg86-Ala88-Bikunin, DesPro2- Ser10-lle13-Arg15-Tyr17-Thr19-Asp24-Thr26-Glu31-Asn41 -Glu53-Ser81 -Arg86- Ala88-Asp95-Thr97-Glu102-Asn112-Glu124-Bikunin, DesPro2-Ser10-Val15-Asp24- Thr26-Glu31-Asn41-Glu53-Ser81-Arg86-Ala88-Asp95-Thr97-Glu102-Asn112-Glu124- Bikunin.
12. Bikunin nach Anspruch 11, worin die Aminosäure in Position 2 Prolin ist.
13. Arzneimittel, enthaltend eine oder mehrere Aprotininvarianten gemäß Ansprüchen 1 bis 5 und/oder ein oder mehrere Bikunine gemäß Ansprüchen 6 bis 12.
14. Verwendung von Aprotininvarianten gemäß Ansprüchen 1 bis 5 und von Bikuninen gemäß Ansprächen 6 bis 12 zur Herstellung eines Arzneimittels zur Anwendung in der
Chirurgie und zur Behandlung von thromboembolischen Krankheitszuständen.
15. DNA-Sequenz, codierend für eine Aprotininvariante gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 5 oder für ein Bikunin gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 6 bis 12.
16. Mikroorganismus, enthaltend eine DNA-Sequenz gemäß Anspruch 15. - 62 -
17. Verfahren zur Herstellung einer Aprotininvariante gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 5 oder eines Bikunins gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 6 bis 12, umfassend Kultivieren eines Mikroorganismus gemäß Anspruch 16.
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