DE60215315T2

DE60215315T2 - Verwendung von fusionsproteinen, deren n-terminaler teil aus einem hirudinderivat besteht, zur herstellung rekombinanter proteine durch sekretion durch hefen

Info

Publication number: DE60215315T2
Application number: DE60215315T
Authority: DE
Inventors: Paul Habermann
Original assignee: Sanofi Aventis Deutschland GmbH
Current assignee: Sanofi Aventis Deutschland GmbH
Priority date: 2001-02-20
Filing date: 2002-02-08
Publication date: 2007-05-24
Anticipated expiration: 2022-02-09
Also published as: DE10108211A1; CY1106274T1; JP4199543B2; NO20033672D0; US20030176673A1; NO20033672L; JP2004518446A; CN1279171C; CA2439042A1; CN1526021A; IL157416A; NZ527642A; DK1364032T3; HK1065068A1; NO331376B1; AU2002250903B2; IL157416A0; EP1364032B1; KR100858833B1; ZA200305868B

Description

Die Entwicklung optimierter Verfahren zur Herstellung von Pharmazeutika auf Basis rekombinanter Proteine ist eine Aufgabe, die den folgenden Gesichtspunkten gerecht werden muss. Zunächst muss ein Verfahren so kostengünstig wie möglich sein und zweitens muss das Produkt von höchster Reinheit sein. In diesem Zusammenhang bestimmt die Wahl des Expressionssystems den Verlauf des jeweiligen Herstellungsverfahrens, wobei für den Fachmann offensichtlich ist, dass die Entwicklung neuer proteinchemischer Techniken und die breite Vielfalt biochemischer Möglichkeiten und neuer Kombinationen bekannter Techniken immer Verbesserungen bestehender Verfahren möglich machen. Die Expression relevanter Proteine dieser Art in Hefen findet hierbei breite Anwendung.
Die Produktion von Proteinen, wie Insulin, GM-CSF (Leukine^®) und Hirudin (Refludan^®) ist ein Beispiel für die erfolgreiche Entwicklung gentechnischer Verfahren, die auf der Synthese des jeweiligen Proteins oder Vorläufern davon in Hefe basieren. Im Allgemeinen können Hefen besonders Hirudine direkt in guten Ausbeuten synthetisieren, die sich bei Verwendung von Hansenula polymorpha (Weydemann et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. 44: 377–385, 1995) oder Pichia pastoris (Rosenfeld et. al., Protein Expr. Purif 4: 476–82, 1996) im Grammassstab bewegen.
In der europäischen Patentanmeldung 0 158 564 A1 sind Vektoren zur Expression von Hirudin oder einem Hirudinanalogon offenbart.
Die internationale Patentanmeldung WO 91/09125 offenbart, dass inaktive Fusionsproteine durch Enzyme der Gerinnungskaskade derart aktiviert werden können, dass sie eine fibrinolytische Aktivität und/oder eine Aktivität zur Hemmung der Gerinnselbildung besitzen. Zum Beispiel kann ein Fusionsprotein, das zwei Hirudin- oder Streptokinasemoleküle umfasst, die durch eine spaltbare Verbindungssequenz verknüpft sind, durch Thrombin oder Faktor Xa gespalten werden, so dass antithrombotisches Hirudin oder fibrinolytische Streptokinase erhalten werden. So wird die fibrinolytische oder die Gerinnselbildung hemmende Aktivität an die Stelle der Gerinnselbildung geleitet.
Winter et al. (Journal of Biotechnology 84 (2000) 175–185) beschreiben ein Verfahren zur Produktion großer Mengen an löslichem nativem menschlichem Proinsulin in E. coli durch Fusion von Proinsulin an den C-Terminus der periplasmatischen Disulfid-Oxidoreduktase DsbA über eine Trypsin-Spaltstelle.
Wir haben nun überraschenderweise gefunden, dass Fusionsproteine, die Hirudin oder Hirudinderivate am N-Terminus enthalten, mit aus Hefen mit guten Ausbeuten exportiert werden können, die denjenigen des Hirudins selbst ähneln. Die Ausbeuten beziehen sich auf die Molarität. D.h., dass ein Wirts-/Vektorsystem, das Ausbeuten von 100 mg natives Hirudin pro Liter produziert, etwa 180 mg Fusionsprotein pro Liter produzieren kann, das sich aus Hirudin und beispielsweise Mini-Proinsulin zusammensetzt, wie in EP-A 0 347 781 beschrieben. Überraschenderweise ist Hirudin biologisch aktiv, und Mini-Proinsulin liegt in der korrekt gefalteten dreidimensionalen Form vor. Werden die beiden Proteine über einen Linker aus Aminosäuren fusioniert, die durch Endoproteasen spezifisch erkannt werden, die das Fusionsprotein an keiner anderen Stelle effizient spalten, dann lässt sich das Protein von Interesse direkt und in aktiver Form abspalten. Im Fall der Produktion von Insulin enthält der Linker zwischen Hirudin und Mini-Proinsulin am Carboxyterminus vorzugsweise Arginin. Bei gleichzeitiger Prozessierung ist es dann möglich, durch Umsetzung mit Trypsin der Fusionsteil abzuspalten und Proinsulin in Mono-Arg-Insulin umzuwandeln. Die Erfindung betrifft somit ein DNA-Molekül (alternative Bezeichnung: eine Expressionskassette) der Form: P_x-S_x-B_n-(ZR)-Hir(As_mR)-Protein(Y)-T, worin
P_x für eine beliebige Promotor-DNA-Sequenz steht und so ausgewählt ist, daß optimale Ausbeuten des interessierenden Proteins erzielbar werden;
S_x für eine beliebige, für eine optimale Ausbeuten gestattende Signalsequenz oder Leitsequenz codierende DNA steht;
B_n für 1–15 Aminosäurecodons oder eine chemische Bindung steht;
Z für das Codon einer Aminosäure, ausgewählt aus der Gruppe Lys und Arg, steht;
R für ein Arg-Codon oder eine chemische Bindung steht;
As_m für eine chemische Bindung oder m Aminosäurecodons, mit m = 1–10, steht;
Hir für eine DNA-Sequenz steht, die für Hirudin oder ein mindestens 40% Homologie zu natürlichem Hirudin aufweisendes Hirudinderivat codiert, wobei sich das Hirudinderivat mit guten Ausbeuten, die denen für Hirudin selbst ähneln, aus Hefe exportieren läßt;
Protein Y für eine ein Mini-Proinsulin codierende DNA-Sequenz steht und
T für eine nichttranslatierte DNA-Sequenz mit einem stabilisierenden Effekt auf die mRNA steht.
Bevorzugte Proteine Y sind Polypeptide, wie Mini-Proinsulinderivate, Interleukine oder Lymphokine oder Interferone. Die Expressionskassette wird vorzugsweise in Hefen eingeführt. Von dieser Expressionskassette kann/können eine oder mehrere Kopien stabil in das jeweilige Hefegenom integriert sein, oder sie kann extrachromosomal auf einem Multicopy-Vektor oder auf einer Art minichromsomalem Element vorliegen.
Eine andere Ausführungsform der Erfindung ist ein Fusionsprotein, das von einem der vorstehend genannten DNA-Moleküle codiert wird.
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist ein Multicopy-Vektor und ein Plasmid, der/das das vorstehend genannte DNA-Molekül umfasst.
Eine zusätzliche Ausführungsform der Erfindung ist eine Wirtszelle, umfassend das vorstehend genannte DNA-Molekül oder den vorstehend genannten Multicopy-Vektor oder das vorstehend genannte Plasmid als Teil ihres Chromosoms, als Teil eines Minichromosoms oder extrachromosomal, wobei die Wirtszelle vorzugsweise eine Hefe ist, die insbesondere aus der Gruppe S. cerevisiae, K. lactis, H. polymorpha und P. pastoris ausgewählt ist.
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist ein Verfahren zur Fermentation des vorstehend genannten Fusionsproteins, bei dem man

(a) das vorstehend genannte DNA-Molekül, den vorstehend genannten Multicopy-Vektor oder das vorstehend genannte Plasmid in einer vorstehend genannten Wirtszelle exprimiert und
(b) das exprimierte Fusionsprotein aus dem Überstand der Zellkultur isoliert, wobei insbesondere nach Beendigung der Fermentation der pH-Wert zur Ausfällung unerwünschter Proteine auf 2,5–3,5 eingestellt wird und das exprimierte Fusionsprotein aus dem Überstand der Ausfällung isoliert wird.

Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist das vorstehend genannte Verfahren, bei dem man nach Trennung des Fermentationsüberstands von den Wirtszellen diese wiederholt in frischem Medium kultiviert und jeweils das freigesetzte Fusionsprotein aus den während der Kultivierung erhaltenen einzelnen Überständen isoliert.
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist das vorstehend genannte Verfahren, wobei ein Verfahrensschritt zur Anreicherung des exprimierten Proteins im Überstand nach der Ausfällung ausgewählt ist aus der Gruppe Mikrofiltration, hydrophobe Wechselwirkungschromatographie und Ionenaustauschchromatographie.
Eine zusätzliche Ausführungsform der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung von Insulin, bei dem man

(a) das vorstehend genannte Fusionsprotein gemäß dem vorstehend genannten Verfahren exprimiert und isoliert,
(b) das Fusionsprotein mit Trypsin und Carboxypeptidase B behandelt und
(c) Insulin aus dem Reaktionsgemisch aus Schritt (b) isoliert.

Das nachstehend beschriebene Expressionssystem dient als Beispiel. Es ist für den Fachmann offensichtlich, dass zur Einführung der Expressionskassette in das ausgewählte System je nach dem Typ des ausgewählten Wirtssystems die geeigneten rekombinanten DNA-Konstruktionen vorgenommen werden müssen. Folglich kann die industrielle Fermentation in Bezug auf das ausgewählte Wirts-/Vektorsystem optimiert werden.
Blutegel des Typs Hirudo haben beispielsweise verschiedene Isoformen des Thrombinhibitors Hirudin entwickelt. Hirudin wurde für pharmazeutische Anforderungen durch künstliche Variation des Moleküls optimiert, zum Beispiel durch Austausch der N-terminalen Aminosäure (z.B. EP-A 0 324 712). Die Erfindung beinhaltet die Verwendung von Hirudin und Hirudinvarianten. Bestimmte Ausführungsformen der Erfindung verwenden eine der natürlichen Hirudinisoformen (die natürlichen Isoformen werden zusammen als "Hirudin" bezeichnet). Eine natürliche Isoform ist beispielsweise Val-Val-Hirudin oder Ile-Thr-Hirudin. Andere Ausführungsformen der Erfindung verwenden eine Variante einer natürlichen Hirudinisoform. Eine Variante leitet sich von einer natürlichen Hirudinisoform ab, enthält aber zum Beispiel zusätzliche Aminosäuren und/oder Aminosäuredeletionen und/oder Aminosäureaustausche verglichen mit der natürlichen Isoform. Eine Hirudinvariante kann abwechselnde Peptidsegmente aus natürlichen Hirudinisoformen und neuen Aminosäuren enthalten. Hirudinvarianten sind bekannt und zum Beispiel in DE 3 430 556 beschrieben. Hirudinvarianten sind in Form von Proteinen kommerziell erhältlich (Calbiochem Biochemicals, Kat.-Nr. 377–853, -950–960).
Fusionsproteine, die Hirudin enthalten, zeigen überraschenderweise in saurem Medium eine gute Löslichkeit, und dies führt zu deutlichen Vorteilen im Hinblick auf die chemische Aufarbeitung des Proteins. Zunächst werden die viele Komponenten des Überstands unter diesen Bedingungen ausgefällt, und zweitens sind die meisten Peptidasen oder Proteasen inaktiv. Durch Ansäuern der Fermentationsbrühe am Ende des Arbeitsganges können somit unerwünschte Überstandsproteine mit den Wirtszellen direkt von dem Fusionsprotein abgetrennt werden, und in einem weiteren Schritt kann das Fusionsprotein aufkonzentriert werden. Dies ist ebenfalls ein Gegenstand der Erfindung.
Am Ende der Fermentation ist der Faltungsvorgang möglicherweise noch nicht zu 100 abgeschlossen. Die Zugabe von Mercaptan oder zum Beispiel Cysteinhydrochlorid kann den Vorgang vervollständigen. Dies ist ebenfalls Gegenstand der Erfindung.
Die folgenden Beispiele beschreiben die Erfindung näher, ohne sie zu beschränken.
Beispiel 1: Konstruktion einer Expressionskassette, die ein Fusionsprotein aus Leu-Hirudin(Refludan^®)-Arg-Mini-Proinsulin kodiert
Ausgangsmaterialien sind die Plasmide pK152 (PCT/EP00/08537), pSW3 (EP-A 0 347 781) und das rekombinante Hefeplasmidderivat, das Rinder-Interleukin 2 codiert (Price et al., Gene 55, 1987). Das Hefeplasmid zeichnet sich dadurch aus, dass es die Leadersequenz des α-Faktors unter der Kontrolle des Hefe-ADH2-Promotors trägt. Auf diese Sequenz folgt die cDNA-Sequenz für Rinderinterleukin 2, die über eine KpnI-Restriktionsenzym-Erkennungsstelle angebunden ist und nach Manipulation im nichttranslatierten 3'-Ende eine NcoI-Restriktionsenzym-Erkennungsstelle enthält, die die einzige in dem Vektor ist. Somit kann die cDNA- Sequenz über eine KpnI/NcoI-Spaltung leicht aus dem Plasmid entfernt werden. Da über gute Expressionsausbeuten berichtet wurde, kann man davon ausgehen, dass die verbleibende 3'-Interleukin-2-Sequenz (als T) eine stabilisierende Wirkung auf die mRNA hat und somit nicht gegen eine hefespezifische Terminatorsequenz ausgetauscht werden muss. Das Plasmid pK152 trägt die DNA-Sequenz, die für Leu-Hirudin (Refludan) codiert, und das Plasmid pSW3 trägt die DNA-Sequenz für Mini-Proinsulin. Die Gensequenz, die Hirudin-Lys Arg-Mini-Proinsulin codieren soll, wird mittels PCR-Technologie zuerst hergestellt. Zu diesem Zweck werden 4 Primer mithilfe des Expedite^TM-DNA-Synthesesystems hergestellt:
i. hir_insf1 (SEQ ID NR: 1, codiertes Proteinsegment: SEQ ID NR: 2)
Der Primer hir_insf1 beschreibt den Übergang zwischen den Codons für die endständigen Aminosäuren von Hirudin (59–65) und der Insulinsequenz B1–B7 über den Arg-Linker (fett gedrucktes Codon). Der Primer hir_insrev1 ist 100 komplementär dazu. Der Primer hirf1 codiert für den Start des Hirudingens bis zur KpnI-Schnittstelle, wie in EP-A 0 324 712 beschrieben. Der Primer insnco1rev markiert das 3'-Ende des synthetischen Mini-Proinsulins gemäss EP-A 0 347 781.
Es werden zwei Standard-Polymerasekettenreaktionen unter Verwendung der Primerpaare hirf1/hir_insrev1 mit DNA des Plasmids pK152 als Matrize und hir_insf1/insnco1rev mit DNA des Plasmids pSW3 als Matrize durchgeführt. Die Reaktionen werden in 100 μl PCR-Puffer mit jeweils 200 nmol Primer, 1 μl Polymerase und 100 ng Vektor durchgeführt. Schritt 1 ist eine 2-minütige Inkubation bei 95°C.
Darauf folgen dann 25 Zyklen von 30'' bei 95°C, 30" bei 55°C und 30'' bei 72°C. Auf den letzten Zyklus folgt eine 3-minütige Inkubation bei 72°C, und anschließend wird die Reaktion abgestoppt. Da die Primer hir_insrevkr und hir_insfkr zu 100% komplementär sind, überlappen die DNA-Produkte der beiden Produkte gemäß dieser Sequenz, so dass in einer dritten Reaktion unter Verwendung der Produkte aus den beiden ersten Reaktionen als Matrizen und der Primer hirf1 und insnco1rev ein DNA-Fragment hergestellt wird, das Hirudin und Mini-Proinsulin codiert, die durch Arg getrennt sind. Das PCR-Fragment wird mit den Enzymen KpnI und NcoI gespalten und anschließend in einer T4-Ligase-Reaktion in den mit KpnI/NcoI geöffneten Vektor pαADH2 inseriert. In Analogie zum Beispiel 7 der EP-A 0 347 781 werden dann kompetente E.-coli-MM294-Zellen mit dem Ligationsgemisch transformiert. Dann wird aus zwei Klonen die Plasmid-DNA für die Charakterisierung mittels DNA-Sequenzanalyse isoliert. Nach Bestätigung der inserierten DNA-Sequenz wird die DNA einer Plasmidpräparation zur Transformation von Zellen des Bäckerhefestamms Y79 gemäß diesem Beispiel verwendet. Wird jedoch der pαADH2-Vektor verwendet, folgt im Gegensatz zu diesen Beispiel auf das Einbringen des Vektors eine Selektion hinsichtlich einer Komplementierung der trp1-1-Mutation. Als weitere Kontrolle wird Plasmid-DNA aus Hefetransformanten reisoliert und mittels Restriktionsanalyse analysiert.
Der konstruierte Expressionsvektor wird als pADH2Hir_Ins bezeichnet. Die Expression erfolgt gemäß Beispiel 4. Das Fusionsprotein befindet sich im Überstand.
Beispiel 2: Konstruktion einer Expressionskassette, die ein Fusionsprotein aus Leu-Hirudin(Refludan)-Gly Asn Ser Ala Arg-Mini-Proinsulin codiert
Das Beispiel zeigt eine Weise zur Modifikation der Trypsin-Erkennungsstelle zwischen dem Hirudinderivat und Mini-Proinsulin. Die Konstruktion erfolgt gemäß Beispiel 1.
Es werden zwei neue Oligonukleotide synthetisiert:
Hir_insf (SEQ ID NR: 7, codiertes Proteinsegment: SEQ ID NR: 8)
Zwei Polymerasekettenreaktionen werden unter Verwendung der Primerpaare hirf1/hir_insrev1 mit DNA des Plasmids pK152 als Matrize und hir_insf1/insnco1rev mit DNA des Plasmids pSW3 als Matrize durchgeführt. In einer dritten Reaktion wird unter Verwendung der Produkte aus den ersten beiden Reaktionen als Matrizen und der Primer hirf1 und insnco1rev ein DNA-Fragment hergestellt, das Hirudin und Mini-Proinsulin codiert, die durch den Linker Gly Asn Ser Ala Arg getrennt sind. Das Produkt der PCR3 wird anschließend mit KpnI und NcoI gespalten, in den geeignet geöffneten Vektor pαADH2 eingebracht und gemäß Beispiel 1 charakterisiert. Das Plasmid wird als pADHH_GNSA_Ins bezeichnet. Zellen werden mit der Plasmid-DNA transformiert. Die Expression wird gemäß Beispiel 3 durchgeführt. Das Fusionsprotein befindet sich im Überstand.
Beispiel 3: Expression der rekombinanten Produkte im Bäckerhefesystem
Die Expression wird in zwei Phasen unterteilt. Zunächst wird eine Vorkultur in Hefe-Minimalmedium angezogen. Das Medium hat die folgende Zusammensetzung pro Liter:

6,7 g – Yeast Nitrogen Base (ohne Aminosäuren)

5,0 g – Casaminosäuren (vitaminfrei)

0,008 – Adenin

0,008 – Uracil

2% – Glucose
Die Haupt- oder Expressionskultur wird mit einem Aliquot der Vorkultur angeimpft.
Das Hauptkulturmedium enthält pro Liter:

10 g – Hefeextrakt

20 g – Pepton

0,008 – Adenin

0,008 – Uracil

4% – Glucose
Unter Verwendung der beschriebenen Medien erfolgt die Expression in einem Schüttelkolben auf die folgende Weise: 0,3 ml einer Vorkultur, die über Nacht angezogen wurde, wird mit 80 ml vorgewärmtem Medium verdünnt und etwa 24 Std. lang unter starkem Schütteln bei 30°C inkubiert. Es wird jeweils 1 ml der auf diese Weise hergestellten Kultur dann nach Bestimmung der optischen Dichte zentrifugiert, und nach Abtrennen der Zellen wird der Überstand lyophilisiert und mittels SDS-PAGE analysiert. Der Gehalt an biologisch aktivem Hirudin wird mittels Durchführung eines Thrombin-Hemmtests bestimmt. Bei einem alternativen Fermentationsprotokoll werden die Zellen mittels Filtration oder vorsichtige Zentrifugation abgetrennt. Während das Protein von Interesse aus dem Medium isoliert wird, werden die Zellen mit frischem vorgewärmten Hauptkulturmedium versorgt, das Alkohol und nicht mehr als 0,5% Glucose als Kohlenstoffquellen enthält, und so wird die Fermentation ohne Unterbrechung fortgesetzt. Dieser Schritt kann bis zu 5 Mal wiederholt werden.
Beispiel 4: Klonierung und Expression des Hirudin-Arg-Mini-Proinsulin-Fusionsproteins im P.-pastoris-System
Invitrogen^® vertreibt ein Klonierungs- und Expressionskit zur Herstellung rekombinanter Proteine mithilfe des P.-pastoris-Systems. Dazu wird ein detailliertes technisches Protokoll im Hinblick auf die Präparation und anschließende Expression eines P.-pastoris-Systems zur Produktion eines gewünschten rekombinanten Proteins bereitgestellt, so dass nur die Konstruktion des Expressionsvektors beschrieben werden muss, der das gewünschte Protein codiert, wenn ansonsten nach diesen Protokollen vorgegangen wird. Es wird des EasySelect^TM-Pichia-Expressionskit (Katalog-Nr. K1740-01) verwendet.
Der Vektor pPICZαA ist ein Teil des Kits. Durch Öffnen des Vektors mit den Restriktionsenzymen XhoI und SacII lässt sich, ähnlich wie im Beispiel 1, ein Protein von Interesse an die alpha-Faktor-Leadersequenz anhängen und auf die Sekretion in den Überstand hin testen. Die Klonierung des Fusionsproteins erfordert zwei Primer. Der Primer pichia_H_If1 (SEQ ID NR: 10) hat die Sequenz:
Der Primer pichia_H_Irev2 (SEQ ID NR: 11) hat die Sequenz:
Die verwendete Matrize ist DNA des Plasmids pADH2Hir_Ins. Eine Standard-PCR mit beiden Primern erzeugt ein DNA-Produkt, das die Sequenz Hirudin-Arg-Mini-Proinsulin, verlängert um die XhoI- und SacII-Integrationsstellen, enthält. Wird das DNA-Produkt entsprechend gespalten und das Fragment isoliert, kann das Fragment in einer T4-DNA-Ligase-Reaktion in die geöffnete Vektor-DNA inseriert werden. Abweichend von dem Protokoll des Herstellers wird der im Beispiel 1 beschriebene E.-coli-Stamm MM294 mit dem Ligationsgemisch transformiert, und rekombinante Kolonien werden auf Zeocin-Selektionsplatten im Hinblick auf eine erfolgreiche Transformation gescreent. Von den Klonen wird Plasmid-DNA reisoliert und dann mithilfe von Restriktions- und DNA-Sequenzanalyse charakterisiert. Unter Verwendung des auf diese Weise konstruierten Plasmids wird dann nach den Anweisungen des Herstellers ein P.-pastoris-Expressionsklon für die Produktion des Fusionsproteins hergestellt.
Beispiel 5: Thrombin-Hemmtest
Die Hirudinkonzentration wird gemäß dem Verfahren von Grießbach et al. (Thrombosis Research 37, S. 347–350, 1985) bestimmt. Dazu werden spezifische Mengen eines Refludan-Standards in die Messungen einbezogen, um eine Kalibrationskurve zu erstellen, aus der die Ausbeute in mg/l direkt ermittelt werden kann. Die biologische Aktivität ist ferner ein direktes Maß für die korrekte Faltung der Proinsulinkomponente des Fusionsproteins. Alternativ kann eine proteolytische Spaltung mit S. aureus und eine anschließende Analyse in einem RP-HPLC-System dazu verwendet werden, die korrekte S-S-Brückenbildung zu bestimmen.
Beispiel 6: Reinigung des Fusionsproteins
Nach Beendigung der Fermentation wird der pH auf 2,5–3 eingestellt. Im Gegensatz zu den meisten anderen Polypeptiden, die man entweder aufgrund von spontaner Lyse der Wirtszellen oder Sekretion im Überstand findet, wird das Fusionsprotein bei pH 2,5–3 überraschenderweise nicht ausgefällt. Das Kulturmedium wird daher geeignet angesäuert, und dann werden nach Beendigung der Fällung der Niederschlag und die Zellen durch Zentrifugation oder Mikrofiltration entfernt und eingeengt. Anschließend wird das Medium auf pH 6,8 eingestellt, und der Fusionsproteingehalt wird parallel durch analytische HPLC-Messung bestimmt. Auf die Bestimmung folgt eine Zugabe von Trypsin zum Überstand, so dass etwa 1 μg Trypsin pro 1–1,5 mg Fusionsprotein vorliegt. Nach einer Inkubation bei Raumtemperatur für etwa 4 Stunden wird eine Reinigung mittels Kationenaustauschchromatographie bei pH 3,5 in Gegenwart von 2-Propanol durchgeführt. Die Elution erfolgt in dem Puffer, indem ein Gradienten von 0,15 bis 0,45 M angelegt wird. Mono-Arg-Insulin wird bei etwa 0,3 M eluiert. Nach 1:1-Verdünnung wird Mono-Arg Insulin aus den insulinhaltigen Fraktionen bei etwa pH 6, 8 unter Zugabe einer ZnCl₂-Lösung mit 10 %-iger Stärke ausgefällt. Insulin wird abfiltriert und dann in 0,05 M Tris-HCl (pH 8,5) gelöst, was eine 2 mg/ml-Lösung ergibt. Dann wird eine Menge von etwa einer 1 Einheit Carboxypeptidase B pro 100 ml Lösung hinzugefügt und die Reaktion unter leichtem Rühren durchgeführt. Der pH wird dann mit Zitronensäure auf 5,5 eingestellt, und Insulin wird in Anwesenheit von ZnCl₂ auskristallisiert. Die Kristalle werden entnommen, gelöst, und nach Reinigung mittels RP-HPLC wird Insulin erneut durch Kristallisation gereinigt.
Beispiel 7: Prozessierung des Fusionsproteins direkt im Kulturmedium
Am Ende des Expressionszeitraums wird das Kulturmedium auf pH 6,8 eingestellt, und dann wird unter Rühren Trypsin zugegeben, so dass eine Endkonzentration von 4–8 mg pro Liter erhalten wird. Nach etwa 4-stüdiger Inkubation wird die auf diese Weise behandelte Fermentationsbrühe auf pH 2,5–3 eingestellt. Nach Ausfällung für 1–6 Stunden wird der pH auf 3,5 erhöht, und das gebildete Mono-Arg-Insulin wird mittels Kationenaustauschchromatographie in Gegenwart von 30% 2-Propanol gereinigt. Die Elution erfolgt mithilfe eines NaCl-Gradienten von 0,05–0,5 M Salz. Die produkthaltigen Fraktionen werden mit H₂O 1:1 verdünnt, und dann wird ZnCl₂ zugegeben, so dass eine ZnCl₂-Lösung mit 0,1%-iger Stärke hergestellt wird. Mono-Arg-Insulin fällt bei etwa pH 6,8 aus und wird beispielsweise gemäß Beispiel 6 in Insulin umgewandelt. SEQUENZPROTOKOLL

Claims

DNA-Molekül der Form: P_x-S_x-B_n-(ZR)-Hir (As_mR)-protein(Y)-T worin P_x für eine beliebige Promotor-DNA-Sequenz steht und so ausgewählt ist, daß optimale Ausbeuten des interessierenden Proteins erzielbar werden; S_x für eine beliebige, für eine optimale Ausbeuten gestattende Signalsequenz oder Leitsequenz codierende DNA steht; B_n für 1–15 Aminosäurecodons oder eine chemische Bindung steht; Z für das Codon einer Aminosäure, ausgewählt aus der Gruppe Lys und Arg, steht; R für ein Arg-Codon oder eine chemische Bindung steht; As_m für eine chemische Bindung oder m Aminosäurecodons, mit m = 1–10, steht; Hir für eine DNA-Sequenz steht, die für Hirudin oder ein mindestens 40% Homologie zu natürlichem Hirudin aufweisendes Hirudinderivat codiert, wobei sich das Hirudinderivat mit guten Ausbeuten, die denen für Hirudin selbst ähneln, aus Hefe exportieren läßt; protein Y für eine ein Mini-Proinsulin codierende DNA-Sequenz steht und T für eine nichttranslatierte DNA-Sequenz mit einem stabilisierenden Effekt auf die mRNA steht.
Fusionsprotein, codiert von einem der DNA-Moleküle nach Anspruch 1.
"Multicopy"-Vektor, umfassend das DNA-Molekül aus Anspruch 1.
Plasmid, umfassend das DNA-Molekül aus Anspruch 1.
Wirtszelle, umfassend ein DNA-Molekül aus Anspruch 1, einen Multicopy-Vektor aus Anspruch 3 und/oder ein Plasmid aus Anspruch 4 als Teil ihres Chromosoms, als Teil eines Minichromosoms oder in extrachromosomaler Form.
Wirtszelle nach Anspruch 5, wobei es sich um eine Hefe handelt.
Wirtszelle nach Anspruch 6, ausgewählt aus der Gruppe S. cerevisiae, K. lactis, H. polymorpha und P. pastoris.
Verfahren zur Fermentation eines Fusionsproteins nach Anspruch 2, bei dem man a. ein DNA-Molekül aus Anspruch 1, einen Multicopy-Vektor aus Anspruch 3 oder ein Plasmid aus Anspruch 4 in einer Wirtszelle nach einem der Ansprüche 5 bis 7 exprimiert und b. das exprimierte Fusionsprotein aus dem Überstand der Zellkultur isoliert.
Verfahren nach Anspruch 8, wobei nach Beendigung der Fermentation der pH-Wert zur Ausfällung unerwünschter Proteine auf 2,5–3,5 eingestellt wird und das exprimierte Fusionsprotein aus dem Überstand des Niederschlags isoliert wird.
Verfahren nach Anspruch 9, bei dem man nach Trennung des Fermentationsüberstands von den Wirtszellen diese wiederholt in frischem Medium kultiviert und jeweils das freigesetzte Fusionsprotein aus den während der Kultivierung erhaltenen einzelnen Überständen isoliert.
Verfahren nach einem der Ansprüche 8 bis 10, wobei ein Verfahrensschritt zur Anreicherung des exprimierten Proteins im Überstand nach der Ausfällung ausgewählt ist aus der Gruppe Mikrofiltration, hydrophobe Wechselwirkungschromatographie und Ionenaustauschchromatographie.
Verfahren zur Herstellung von Insulin, bei dem man a. ein Fusionsprotein gemäß den Ansprüchen 9 bis 11 exprimiert und isoliert, b. das Fusionsprotein mit Trypsin und Carboxypeptidase B behandelt und c. Insulin aus dem Reaktionsgemisch aus Schritt (b) isoliert.