Zusammenfassung der Erfindung
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Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein neues
Verfahren zur Herstellung von Hirudin. Hirudin kann als
Proteaseinhibitar mit Antithrombin-Aktivität definiert werden,
der in den Speichelorganen (Sialaden) von Hirudo medicinalis
anwesend ist. Im Gegensatz zu gewöhnlichen
Antithrombin-Arzneien hat das Hirudin der vorliegenden Erfindung eine
direkte inhibitorische Wirkung auf Thrombin.
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Aus diesem Grund wird erwartet, daß das Hirudin als
Vorbeugungsmittel oder als Gegenmittel für Thrombose wirkt.
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Bei gewöhnlichen Techniken wird die kleine Menge Hirudin
lediglich direkt aus Hirudo medicinalis extrahiert. Eine
Technik ist schon bekannt, in der Hirudin in E. coli produziert
wird, aber die Menge des sich darin ansammelnden Hirudins
ist so gering, daß die Technik für das medizinische Gebiet
als nicht brauchbar angesehen wird.
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Bei der vorliegenden Erfindung erlaubt der Einsatz von
Gentechnologie, Hirudin in dramatisch großen Mengen zu
produzieren.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
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Fig. 1 ist eine Ansicht, die ein Zusammenbau-Verfahren eines
Vektors pNPA225 für die Sekretion und Expression eines
heterologen Proteins, der in den Beispielen verwendet wird,
zeigt.
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Fig.2 ist eine Ansicht, die ein Zusammenbau-Verfahren eines
Hirudin-Sekretionsvektors pNPH208, der in den Beispielen
verwendet wird, zeigt.
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Fig.3 ist eine Ansicht, die ein synthetisiertes
Oligonukleotid zum Codieren von Aminosäuren vom N-Terminus bis zur
zehnten Aminosäure von Hirudin, zeigt.
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Fig. 4 ist eine Ansicht, die ein Zusammenbau-Verfahren eines
Hybridplasmids p3009, das die Basensequenz zum Codieren von
Hirudin enthält, zeigt.
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Hier werden Symbole in Zusammenhang mit den Zeichnungen
erklärt: "Promoter" bezeichnet die Promoterregion eines
neutralen Proteasegens; "SD" eine Ribosomenbindungsregion
innerhalb eines neutralen Proteasegens; "pre" eine Region, die
für ein Sekretionssignal eines neutralen Proteasegens
codiert; "Δpro" eine Stromaufwärtsregion bzw. eine upstream-
Region eines Propeptids des neutralen Proteasegens; "α-
Amylase" eine DNA-Sequenz, die für α-Amylase codiert; "H"
eine DNA-Sequenz, die für Hirudin codiert; "ΔH" eine
Stromaufwartsregion bzw. upstream-Region einer DNA-Sequenz, die
für Hirudin codiert; und "Δ Protease" ein Hinterteil (back
portion) eines neutralen Proteasegens.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
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Ein in der vorliegenden Erfindung produziertes Hirudin wirkt
direkt auf Thrombin in Blut und kann deshalb für die
medizinische Behandlung von Thrombosen verwendet werden.
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Hirudin ist ein Proteaseinhibitor mit
Antithrombin-Aktivität, welches in Speichelorganen von Hirudo medincinalis, was
eine Art von Eukaryot ist, anwesend ist. Weiterhin umfaßt
Hirudin nicht ein einzelnes Protein, sondern eine Gruppe
verschiedener Arten von Molekülen. Zum Beispiel sind HVI
(Referenzliteratur 1) und HV2 (Referenzliteratur 2) als Teil
eines Moleküls bekannt, das Hirudin bildet, und über
Primärstrukturen von ihnen wurde auch schon berichtet
(Referenzliteratur 1 und 2).
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Diese Primärstrukturen haben hohe Homologie und gemeinsame
Strukturmerkmale dieser Hirudinmoleküle sind, daß ein
Tyrosinrest in Form eines Sulfatmonoesters darin anwesend ist
und daß drei intramolekulare S-S-Bindungen darin anwesend
sind.
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Im allgemeinen ist Thrombin als inaktives Prothrombin im
Blut anwesend und wird gemäß der Anfrage des Organismus
aktiviert, um Fibrinogen in Fibrin umzuwandeln. Kurz gesagt,
Thrombin übernimmt die Leitung eines wichtigen biologischen
Mechanismus' im Blutgerinnungssystem. Falls Thrombin im
gesamten Blut eines Organismus' pathologisch aktiviert wird,
wird Fibrin in einem mikrovaskulären System abgelagert, so
daß Thrombin bzw. Thromben darin gebildet werden. Der
Thrombus kann als eine Masse koaguliertes Blut im Blutgefäß
definiert werden, und das pathologische Phänomen zur Bildung
solcher Thrombin bzw. Thromben wird Thrombose genannt. Die
Thrombose führt zu Verengung und Obstruktion der Blutgefäße
infolge der Thrombin bzw. Thromben, so daß in Hauptorganen,
wie z.B. Herz, Großhirn und Lunge eine ischämische
Pathologie oder ein Infarkt stattfinden, um ihre funktionalen
Störungen
zu verursachen. In früheren Jahren wurde einer
Thrombose große Aufmerksamkeit geschenkt, weil sich letztere mit
dem Auftreten einer Organpathologie befaßt, welche einer
immunologischen Störung zuzuschreiben ist, wie z.B. Nephritis
oder Pneumonien und sie befaßt sich auch mit einer
Begleitpathologie zur Zeit der Transplantation eines Organs oder
ausgetauschten Blutgefäßen. Zusätzlich wird auch einem
diffusen intravaskulären Koagulationssyndrom (DIC)
Aufmerksamkeit geschenkt, was als ein spezifisches pathologisches
Symptom bekannt ist, bei dem häufig Thromben in einem
mikrovaskulären System vorkommen. Der DIC betreffende Bericht wurde
in 1960 angefertigt, und DIC wurde zuerst als ein seltenes
Syndrom angesehen. Jedoch wurde es später ersichtlich, daß
DIC nicht selten vorkommt und mit Bezug auf verschiedene
klinische Syptome, welche als Bluten am Ende verschiedener
Erkrankungen oder als Organpathologien ohne genügende
Untersuchung betrachtet wurden, wurde es deutlich, daß diese
klinischen Symptome aus DIC resultieren.
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Heutzutage hat die Thrombose eine zunehmende Neigung. Es ist
bekannt, daß der Thrombus häufig an einer Position an der
Innenwand eines Blutgefäßes gebildet wird, wo eine abnormale
Änderung, insbesondere eine Sklerose oder Entzündung,
anwesend ist, und solch eine Pathologie nimmt mit dem Alter zu.
Weiterhin ist die weltweite Verlängerung des Lebens eine
Ursache für die Zunahme der Thrombose.
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Klinische pathologische Beispiele von Thrombose schließen
ein: (Schlag)anfall, Myokardinfarkt, tiefe Venenthrombose,
Obstruktion von Arterien der Gliedmaßen, Lungenthrombose und
Netzhautarterienthrombose. Die Gesamtsumme der Thrombosen in
verschiedenen Organen steht an der Spitze aller Erkrankungen
hinsichtlich Erkrankungsinzidenzrate und Todesursache. In
der Zukunft wird deshalb die klinische und pathologische
Signifikanz der Thrombose immer wichtiger werden.
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Als Heilmittel der gerade beschriebenen Thrombose, sind
Heparin, das durch Antithrombin III wirkt, und Antivitamin K
bekannt, das die Biosynthese eines Vitamin K-abhängigen
Blutgerinnungsfaktors inhibiert. Zusätzlich ist auch als ein
anderer Thrombininhibitor ein Gabexatmesylatmittel bekannt,
welches ein proteolytischer Enzyminhibitor ist.
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Es ist ehemals gut bekannt, daß Heparin ein
Antithrombinmittel ist, das häufig für Thrombosen einschließlich DIC
verwendet wird. Jedoch ist die Funktion von Heparin, den
inhibitorischen Effekt von Antithrombin III auf die
Blutgerinnung zu beschleunigen und deshalb wird Heparin nicht als
wirksam für mit DIC oder Nephrosen assozierte Thrombosen
angesehen, wo der Gehalt an Antithrombin III gering ist
(Referenzliteratur 3). Darüberhinaus hat das
Gabexatmesylatmittel eine inhibitorische Wirkung auf physiologisch
wichtige Enzyme, wie z.B. Plasmin, Kallikrein und Trypsin.
Demgemäß ist große Vorsicht erforderlich, wenn das
Gabexatmesylatmittel verwendet wird.
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Unter solchen Umständen ist die Entwicklung eines neuen
Vorbeugungsmittels oder Gegenmittels für Thrombosen
einschließlich DIC für die therapeutische und präventive Medizin
wichtig.
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Andererseits hat Hirudin eine direkte inhibitorische
Wirksamkeit auf Thrombin, im Gegensatz zu gewöhnlichen Mitteln
für Thrombose. Insbesondere hat Hirudin eine hohe
funktionale Spezifität für Thrombin und Präthrombin 2
(Dissoziationskonstante = 0,8 x 10&supmin;¹&sup0;) (Referenzliteratur 4) und
es inhibiert zusätzlich zu Thrombin nur Aktivator Nr. IV
allein. Das heißt, Hirudin inhibiert niemals andere Enzyme als
solche, die die Blutgerinnung betreffen. Darüberhinaus ist
die Toxizität von Hirudin extrem gering und es wird als
nicht-antigen bezeichnet, und Hirudin, das eine biologische
Aktivität hat, wird schnell von den Nieren in den Urin
ausgeschieden (Referenzliteratur 5). Somit kann Hirudin
anstelle gewöhnlicher antithrombischer Mittel als nützliches
Vorbeugungsmittel und Gegenmittel für Thrombosen
einschließlich DIC verwendet werden.
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Bevor rekombinante DNA-Technik entwickelt wurde, wurde
Hirudin direkt aus Hirudo medicinalis extrahiert. Jedoch war
sogar, um die kleine Menge Hirudin in dieser Weise zu
erhalten, eine große Menge fastender Hirudo medicinalis notwendig
und sogar, wenn Roh-Hirudin hergestellt wurde, war ein
komplizierter Reinigungsschritt und viel Zeit erforderlich. Zum
Beispiel, sogar im Fall, daß Roh-Hirudin mit einer Reinheit
von ungefähr 10% hergestellt worden ist, bei dem unreine
Proteine aus Hirudo medicinalis stammend anwesend sind, wird
ein Homogenat von Hirudo medicinalis, der 2 bis 3 Wochen
gefastet hat, zuerst einer Heißwasserextraktion ausgesetzt und
danach einer Ethanolpräzipitation, fraktionierter Fällung
mit Aceton, Adsorption und Desorption unter Verwendung von
Bentonit, und schließlich muß eine Präzipitation am
isoelektrischen Punkt sukzessiv ausgeführt werden. Weiterhin
erfordert die Präzipitation von reinem Hirudin aus dem Rohprodukt
eine ECTEOLA-Cellulose-Säulenchromatographie, Sephadex CM C-
25 Säulenchromatographie und Gelfiltration unter Verwendung
von Sephadex G-25, und gemäß einem Bericht ist in solch
einem Fall die Ausbeute geringer als 0,001%
(Referenzliteratur 6). Seit es unmöglich ist, Hirudin in den oben
beschriebenen Mengen zu erhalten, kann dieser Bestandteil jetzt
nicht in der Praxis als Medizin verwendet werden und die
therapeutische Verwendung von Hirudin, welche aus dessen
überragenden Merkmalen erwartet werden kann, wurde bis jetzt
nicht erreicht. Aus diesem Grund wird es heftig gefordert,
ein effizientes Herstellungsverfahren für Hirudin
einzuführen.
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In der nahen Zukunft wird die Massenproduktion eines
heterologen Genprodukts unter Verwendung von rekombinanter DNA-
Technik möglich sein, bei der ein heterologes Gen in einem
Mikroorganismuswirt exprimiert wird. Das heterologe
Genprodukt
aus dem Mikroorganismus kann als ein Protein definiert
werden, das aus der Expression eines Gens resuliert, welches
nicht aus diesem Mikroorganismus stammt.
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Die Produktion einer gewünschten Substanz durch Verwendung
von rekombinanter DNA-Technik, bei der ein Mikroorganismus
als Wirt verwendet wird, kann grob in die intrazelluläre
Herstellung und die extrabakterielle sekretorische
Herstellung aufgeteilt werden.
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Bei der früheren Herstellung kann das heterologe Genprodukt
wirksam in Bakterien erhalten werden, aber es stellen sich
die folgenden Probleme:
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An erster Stelle ist das in Bakterien erhaltene heterologe
Genprodukt gewöhnlich eine unlösliche Masse, die
Einschlußkörper ohne biologische Aktivität genannt wird. Im
allgemeinen ist es nicht schwierig, einen solchen
Einschlußkörper aus den Bakterien wiederzugewinnen. Jedoch, um
das heterologe Genprodukt mit einer natürlichen Struktur
höherer Ordnung und Aktivität zu erlangen, muß der
Einschlußkörper durch Verwendung eines solubilisierenden
Mittels, wie Harnstoff, löslich gemacht werden und nachher ist
es notwendig, daß der Einschlußkörper zu dem heterologen
Genprodukt mit der natürlichen Struktur höherer Ordnung und
Aktivität wiederkehrt. Dieses Verfahren wird als nicht
praktikabel angesehen, weil es sehr kompliziert und seine
Effizienz gering ist. Zum Beispiel wird, gemäß Schoner et al.
(Referenzliteratur 7), der Einschlußkörper von
Rinderwachstumshormon, der in E. coli gebildet wird, in der Anwesenheit
von 5 Molen Harnstoff teilweise solubilisiert, aber die
Menge des solubilisierten Einschlußkörpers ist nur 10% der
Gesamtmenge und der Rest davon bleibt im Zustand von
Pellets.
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An zweiter Stelle ist es schwierig, ein natürliches
heterologes Genprodukt zu erhalten.
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Gewöhnlich im Fall, daß das heterologe Gen durch Verwendung
eines Mikroorganismus exprimiert wird, ist es notwendig, daß
ein Initiationscodon bzw. Startcodon (ATG) am 5'-Terminus
des Gens existiert, das für ein Protein codiert. Folglich
wird ein fusioniertes Protein hergestellt, bei dem Met am N-
Terminus angehangen ist. Falls ein solches fusioniertes
Protein mit dem angehangenen Met einem Mensch als Arznei
verabreicht wird, ist das Vorkommen eines Antikörpers, der auf
dem fusionierten Protein beruht, erhöht, so daß
Nebenwirkungen, wie Verschlechterung der medizinischen Wirksamkeit und
Anaphylaxe, störenderweise stattfinden. In der Tat war ein
in E. coli hergestelltes menschliches Wachstumshormon (hGH)
ein Met-hGH, bei dem Met an den N-Terminus angehängt war und
welches ungefähr die gleichen Wirkungen wie natürliches hGH
hatte. Jedoch wurde beobachtet, daß das Vorkommen eines
Antikörpers hoch war, wenn das Met-hGH einem Menschen
verabreicht wurde (Referenzliteratur 8).
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Drittens war auch bekannt, daß wenn das heterologe
Genprodukt mit S-S-Bindungen in Bakterien hergestellt worden ist,
die S-S-Bindungen nicht exakt geknüpft sind. Zum Beispiel
wurde von J.M. Schoemarker (Referenzbeispiel 9) berichtet,
daß wenn ein Rinderchymosin (Labferment) mit drei
S-S-Bindungen in einem Molekül mit Hilfe von E.coli exprimiert
worden ist, die S-S-Bindung zwischen den Molekülen gebildet
wird.
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Auch in Hinblick auf Hirudin gibt es einen bekannten Stand
der Technik (Referenzliteratur 10) für seine Herstellung in
E. coli, aber in diesem Fall, wurde in der Literatur
berichtet, daß das in den Bakterien angereicherte Hirudin
nur eine Antithrombin-Aktivität entsprechend 0,2 mg/l x A600
hat. Der Grund, warum die Menge des angereicherten Hirudins
so gering ist, könnte sein, daß in E. coli das inaktive
Hirudin angereichert wird, bei dem die S-S-Bindung, die für
die Expression der Antithrombin-Aktivität essentiell ist,
nicht exakt geknüpft ist.
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Obwohl nun ein Verfahren zur Bildung von Hirudin mit hoher
Antithrombin-Aktivität gefordert ist, ist das
intrabakterielle Herstellungsverfahren aus den oben genannten Gründen
nicht wünschenswert.
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Andererseits hat das extrabakterielle sekretorische
Herstellungsverfahren für das nützliche heterologe Genprodukt
verschiedene zu lösende Probleme zur Folge, aber trotzdem wird
dieses Verfahren für die Aufgabe der vorliegenden Erfindung
als mehr geeignet angesehen.
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Im allgemeinen wird ein sekretorisches Protein in Bakterien
als ein Vorläufer- bzw. Precursorprotein synthetisiert, bei
dem ein Sekretionssignal an den N-Terminus des maturierten
Proteins angehängt ist, und das Sekretionssignal des
Vorläuferproteins wird davon im Laufe der Sekretion entfernt, so
daß das maturierte Protein ohne Sekretionssignal aus den
Bakterien freigesetzt wird (Referenzliteratur 11). Hier kann
das oben erwähnte maturierte Protein als ein
Sekretionsignal-freies sekretorisches Protein definiert
werden.
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Falls Hirudin in Bakterien als Vorläuferprotein exprimiert
wird, bei dem das Sekretionssignal am N-Terminus von Hirudin
anwesend ist und dann von den Bakterien sekretiert wird,
kann das so erhaltene Hirudin Antithrombin-Aktivität haben,
wodurch das oben erwähnte Problem des extrazellulären
sekretorischen Herstellungsverfahrens gelöst werden kann.
Zusätzlich kann, falls die Ligationsweise des Sekretionssignals an
Hirudin erfolgreich zustandegebracht worden ist, das
Sekretionssignal an einer gewünschten Stelle im Hirudin zur Zeit
der Sekretion abgespalten werden, und es kann erwartet
werden, daß ein Hirudin mit demselben N-Terminus wie in von
Hirudo medicinalis stammendes Hirudin hergestellt wird.
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Nun haben die Erfinder der vorliegenden Anmeldung Verfahren
zur Verwendung von Bakterien der Bacillus-Gattung als Wirt
erforscht, welche das Merkmal besitzen, daß sie eine große
Menge sekretorisches Protein sekretieren und nicht pathogen
sind und häufig als industrielle Mikroorganismen für Enzyme,
Aminosäuren, Nukleinsäuren und ähnliches verwendet werden.
Insbesondere mit Bezug auf Bacillus subtilis von der
Bacillus-Gattung, sind reichlich Daten vom Standpunkt der
Genetik, Biochemie, Molekularbiologie und angewandten
Mikrobiologie vorhanden. Somit ist es wichtig, ein Wirt-Vektor-
System unter Verwendung des Bacillus subtilis-Wirts
einzuführen, bei dem das heterologe Genprodukt in Bacillus
subtilis gebildet wird und dann aus den Bakterien freigesetzt
wird.
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Ehemals wurden bezüglich der Sekretion von β-Lactamase aus
E. coli unter Verwendung des α-Amylasegens von Bacillus
amyloliquefaciens (Referenzliteratur 12), der Sekretion von
Nuklease aus Staphylococcus aureus (Referenzliteratur 13),
der Sekretion von Protein A aus Staphylococcus aureus
(Referenzliteratur 14), der Sekretion von menschlichem
α-Interferon (Referenzliteratur 15), der Sekretion von Maus-β-
Interferon durch Verwendung eines α-Amylasegens von Bacillus
subtilis (Referenzliteratur 16), der Sekretion von Protein A
aus Staphylococcus durch die Verwendung eines neutralen
Proteasegens oder eines alkalischen Proteasegens von Bacillus
amyloliquefaciens (Referenzliteratur 17) und der Sekretion
von menschlichem Serumalbumin (Referenzliteratur 18)
Berichte angefertigt. Gemäß dieser Berichte kann, wenn
Bacillus subtilis als Wirt verwendet wird, ein von einer
bestimmten Art von Prokaryot stammendes Protein sekretiert und
wirksam angereichert werden.
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Zum Beispiel sind die Mengen von sekretierte(r/m) und
angereicherte(r/m) β-Lactamase (Referenzliteratur 12), Nuklease
(Referenzliteratur 13), Protein A (Referenzliteratur 17)
ungefähr
20 mg, ungefähr 50 mg bzw. ungefähr 1000 mg pro Liter
Kulturmedium.
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Jedoch zeigen die oben erwähnten Berichte an, daß die
sekretierten Anteile an menschlichem α-Interferon
(Referenzliteratur 15), Maus-β-Interferon (Referenzliteratur 16),
menschlichem Serumalbumin (Referenzliteratur 18), die aus
Eukaryoten stammen, sehr gering sind. Zum Beispiel gibt es
den Bericht, daß die Menge an menschlichem α-Interferon 0,5
mg pro Liter Kulturmedium ist. Wie es in diesen Berichten
gezeigt wird, ist es nicht immer einfach, eine große Menge
eines Proteins, das aus einem Eukaryote stammt, durch die
Verwendung von Bacillus subtilis als Wirt zu erhalten.
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Im allgemeinen wird das Gen des sekretierten Proteins durch
die RNA-Polymerase in mRNA transkribiert, und diese mRNA
wird als Templat verwendet, um ein Vorläuferprotein zu
synthetisieren, bei dem ein Sekretionssignal an den N-Terminus
des maturierten Proteins hinzugefügt ist. Es ist bekannt,
daß das Sekretionsignal von dem Vorläuferprotein im Verlauf
der Sekretion entfernt wird.
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Zum Zweck des Herausfindens eines Grundes, warum die Menge
des sekretierten und angereicherten Proteins von der Art des
Proteins selbst anhängt, haben Ulmanen et al.
(Referenzliteratur 19) die Transkription und Translation
eines fusionierten Gens untersucht, bei dem eine für ein
Heteroprotein codierende DNA-Sequenz an eine Stelle ligiert
worden ist, die der Region, die für den Promoter, die
Ribosomenbindungsregion und das Sekretionssignal eines
Sekretionprotein-Gens codiert, direkt vorausgeht, und weiter
haben sie eine Sekretions-Effizienz des sich ergebenden
heterologen Genprodukts untersucht, um festzustellen, welcher
der oben erwähnten Faktoren Einfluß auf die Menge des
sekretierten und angereicherten heterologen Genprodukts hat.
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Das heißt, sie haben die Sekretion des EI Proteins, das das
Glycoprotein des Semiliki Forest Virus ist, von β-Lactamase
von E. coli und des α-Amylasegens von Bacillus
amyloliquefaciens getestet, und zwar durch Verwendung der
Region, die für einen Promoter, eine Ribosomenbindungsregion
und das Sekretionssignal des Amylasegens von Bacillus
amyloliquefaciens codiert. Als ein Ergebnis wurde sichtbar, daß
sich die Menge an mRNA, die für das Vorläuferprotein
codiert, bei dem das Sekretionssignal an die Stelle oberhalb
des N-Terminus eines in Bakterien hergestellten maturierten
Proteins hinzugefügt worden ist, schrecklich ändert.
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Andererseits wurde berichtet, daß die Mengen an sekretiertem
und angereichertem E1 Protein und β-Lactamase 0,01% bzw. 10%
von der Menge der sekretierten und angereicherten α-Amylase
sind. Gemäß diesem Bericht ist die Ursache der oben
erwähnten Ergebnisse, daß Bacillus subtilis bestimmte Arten eines
fusionierten Proteins nicht wirksam sekretieren kann, und
zwar bei dem eine DNA-Sequenz für ein heterologes Protein an
den 3'-Terminus der Sekretionsignal codierenden Region des
α-Amylasegens fusioniert ist, oder die Ursache liegt in der
Zersetzung des heterologen Proteins durch die proteolytische
Aktivität des Wirts nach oder während der Sekretion.
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Wie aus dem Vorhergehenden verstanden werden kann, wurde
berichtet, daß sogar, wenn dasselbe Sekretions-Proteingen,
d.h. dieselbe Region, die für den Promoter, die
Ribosomenbindungsregion und das Sekretionssignal des α-Amylasegens
codiert, verwendet worden ist, die Menge des sekretierten
und angereicherten Proteins von der Art des Proteins selbst
abhängt.
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Gemäß dem Bericht von Palva. I (Referenzliteratur 15) und
Schein C.H. (Referenzliteratur 20), ergibt sich sogar, wenn
diesselbe für das Sekretionssignal eines sekretorischen
Proteingens codierende Region und dasselbe DNA-Fragment
codierend für ein von einem Eukaryoten stammendes Protein
verwendet worden sind, ein Unterschied der Ligationsstruktur
zwischen den beiden, so daß in einem Fall, das von dem
Eukaryoten stammende Protein von Bacillus subtilis sekretiert
wird oder in einem anderen Fall wird es nicht davon
sekretiert.
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Palva et al. haben von dem folgenden Experiment berichtet:
Ein für ein maturiertes Interferon (IFN) codierendes DNA-
Fragment ist, entweder direkt oder über eine
Verbindungsregion (Asn-Gly-Thr-Glu-Ala) mit 5 Aminosäureresten, an eine
Stelle ligiert, und zwar unterhalb der Region (Ala-Val), die
eine Spaltstelle des Sekretionssignals im α-Amylasegen von
Bacillus amyloliquefaciens enthält, welches eines der
Sekretionsproteine ist, d.h. ein DNA-Fragment, das die Region
(Val) enthält, die für eine N-terminale Aminosäure eines
maturierten Proteins an der Stromabwärtsstelle (downstream
side) des 3'-Terminus codiert, der für das Sekretionssignal
codiert. In diesem Fall wird das Sekretionssignal entfernt,
aber das sekretierte und angereicherte Interferon ist ein
fusioniertes Protein, bei dem eine Aminosäure (Val) an den
N-Terminus des maturierten Interferons hinzugefügt ist oder
es ist ein anderes fusioniertes Protein, bei dem 6
Aminosäuren (Val-Asn-Gly-Thr-Gln-Ala) hinzugefügt sind, und die
gesamte Menge dieser Interferone ist 0,5 mg bis 1 mg pro Liter
Kulturmedium. Andererseits haben Schein et al. die Sekretion
eines menschlichen IFN versucht, und zwar durch Ligation des
für das maturierte Interferon codierenden DNA-Fragments an
eine Stelle direkt nach der Region, die für die Aminosäure
(Ala) des C-Terminus des Sekretionssignals desselben
α-Amylasegens wie in Palva et al. codiert. Jedoch wurde in
diesem Fall berichtet, daß eine grobe Menge Vorläufer-IFN
oder maturiertes IFN in den Bakterienzellen bleiben und die
Effizienz der Sekretion in das Kulturmedium sehr gering ist.
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Wie oben diskutiert ist es unvorhersehbar, ob oder ob nicht
der Vorläufer, bei dem das Sekretionssignal an eine Stelle
oberhalb des N-Terminus des aus einem Eukaryot stammenden
maturierten Proteins fusioniert ist, in ein System
sekretiert wird, das Bacillus subtilis als Wirt verwendet, und ob
oder ob nicht das Sekretionssignal im Laufe der Sekretion
prozessiert wird. Es ist weithin anerkannt, daß diese
Ergebnisse von der Kombination aus ausgewähltem maturiertem
Protein und Sekretionssignal abhängen oder von der
Ligationsweise der beiden.
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Unter diesen Umständen wurde die vorliegende Erfindung
geschaffen, und eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist
es, Hirudin bereitzustellen, das ein nützliches
antithrombisches Mittel als Vorbeugungsmittel und Gegenmittel bei
Thrombosen ist, und andere Aufgaben im vorliegenden Fall
sind die Schaffung eines Hirudin-Sekretionsplasmids, die
Bereitstellung eines transformierten Stammes und die
Bereitstellung eines Herstellungsverfahrens für Hirudin unter
Verwendung des transformierten Stammes.
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Zieht man die oben beschriebenen Situationen in Erwägung,
haben die vorliegenden Erfinder Forschung betrieben, um ein
Gen mit einem Promoter, einer Ribosomenbindungsregion und
einem Sekretionsignal zu suchen, welches die Sekretion von
Hirudin erlaubt und als ein Ergebnis wurde die vorliegende
Erfindung schließlich vollendet.
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Das heißt, die vorliegende Erfindung ist auf ein
Hirudin-Sekretionsplasmid gerichtet, bei dem eine DNA-Sequenz in eine
Vektor-DNA ligiert ist, wobei die vorher erwähnte
DNA-Sequenz durch Ligation eines für Hirudin codierenden
DNA-Fragments an eine Stelle direkt nach der Region, die für den
Promoter, die Ribosomenbindungsregion und das
Sekretionssignal des neutralen Proteasegens von Bacillus
amyloliquefaciens codiert, hergestellt worden ist; auf einen
transformierten Stamm, der durch Transformation mit dem oben
erwähnten Hirudin-Sekretionsplasmid erhalten worden ist und
auf ein Verfahren zum Herstellen von Hirudin, das die
Schritte des Kultivierens des oben genannten transformierten
Stammes und Rückgewinnen von Hirudin aus dem
Kulturmediumüberstand umfaßt.
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Nun wird die vorliegende Erfindung im Detail beschrieben.
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Der Promoter, auf den in der vorliegenden Erfindung Bezug
genommen wird, kann als eine DNA-Sequenz definiert werden,
welche durch eine RNA-Polymerase erkannt wird und an welche
letztere bindet.
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Es ist bekannt, daß wenn der Initiationspunkt bzw.
Startpunkt der RNA-Synthese als "+1" betrachtet wird, gewöhnlich
zwei Consensus-DNA-Sequenzen in der -35 Region (5'-TTGACA-
3') und -10 Region (5'-TATAAT-3') anwesend sind. Im
allgemeinen wird die "-35 Region" für die Erkennung der
RNA-Polymerase als notwendig erachtet und die "-10 Region" als
notwendig für die Ligation der RNA-Polymerase
(Referenzliteratur 21).
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Wie es schon bekannt ist, besitzt Bacillus subtilis
verschiedene Arten von RNA-Polymerasen. Diese Vielseitigkeit
spielt eine wichtige Rolle im Verlauf der Sporenbildung, die
die schwierige Expressionskontrolle von Bacillus subtilis
einschließt. Insbesondere umfassen die meisten Polymerasen
in einer vegetativen Propagierungs- bzw. Fortpflanzungsphase
eine RNA-Polymerase vom 55-Typ und deshalb ist es bekannt,
daß die Transkription der meisten Gene mit Hilfe dieses Typs
von Polymerase ausgeführt wird (Referenzliteratur 22).
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Die DNA-Sequenz der vorliegenden Erfindung, bei der das für
Hirudin codierende DNA-Fragment an eine Stelle direkt nach
der Region, die für den Promoter, die Ribosomenbindungstelle
und das Sekretionssignal des neutralen Proteasegens von
Bacillus amyloliquefaciens codiert, ligiert worden ist, ist
wie folgt:
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Bei dieser DNA-Sequenz wird angenommen, daß die "-10 Region"
des Promoters 5'TATTAT3'ist (b-Teil der obigen Sequenz) und
die "-35 Region" 5'TTGCAG3' ist (a-Teil der obigen Sequenz).
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Diese DNA-Sequenz hat eine große Homologie zu der durch die
RNA-Polymerase vom Typ 55 erkannten Consensus-Sequenz,
welche die überwiegende RNA-Polymerase in der vegetativen
Propagierungsphase von Bacillus subtilis ist (Referenzliteratur
22).
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Weiterhin kann die Ribosomenbindungsregion als die
DNA-Sequenz definiert werden, die für eine Region von mRNA
codiert, an welches Ribosom mRNA gebunden werden kann, die
durch die RNA-Polymerase synthetisiert worden ist, wobei die
mRNA mit einem Ribosom kombiniert.
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Im allgemeinen, ist die Ribosomenbindungsregion eine
DNA-Sequenz, die 5 bis 9 Basen upstream (stromaufwärts) von dem
Initiationscodon anwesend ist, welches komplementär zu der
3'-terminalen Sequenz der 16S RNA ist ein Initiationscodon
und welches komplementär zu dem eines 16S rRNA 3'-Terminus
ist. Die DNA-Sequenz der 16S rRNA hängt von der Art des
Mikroorganismus ab, aber es ist bekannt, daß die DNA-Sequenz
der 16S rRNA von Bacillus subtilis 3'UCUUUCCUCC5'ist
(Referenzliteratur 22).
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Als die DNA-Sequenz, die als die Ribosomenbindungsregion in
der oben erwähnten DNA-Sequenz betrachtet wird, gibt es eine
Sequenz 5'AAAGGGG3'(c-Teil in der oben gezeigten Sequenz),
und diese DNA-Sequenz hat eine extrem hohe Komplementarität
zu der 16S rRNA von Bacillus subtilis.
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Die DNA-Sequenzen des Promoters und der gerade beschriebenen
Ribosomenbindungsregion spielen eine wichtige Rolle für die
Expression des Gens. Heutzutage ist es weit bekannt, daß
sich diese DNA-Sequenzen mit der Expressionseffizienz eines
Gens befassen (Referenzliteratur 21).
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In dem Fall, daß das Gen eines gewünschten Proteins unter
Verwendung eines Bacillus-Bakteriums als Wirt exprimiert
wird, haben die RNA-Polymerase und das Ribosom eines
Bacillus-Bakteriums strikte Spezifität für den Promoter und die
Ribosomenbindungsregion (Referenzliteratur 22), und deshalb
stammen die Regionen dafür wünschenswerterweise aus dem
Bacillus-Bakterium (Referenzliteratur 23).
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Das Sekretionssignal kann als ein Polypeptid mit 20 bis 30
Aminosäureresten definiert werden, die dem N-Terminus eines
maturierten Proteins vorausgehend anwesend sind. Merkmale
des Sekretionssignals sind folgende: Es ist bekannt, daß
eine basische Aminosäure nahe dem N-Terminus vorhanden ist,
daß das Cluster einer hydrophoben Aminosäure in der Mitte
davon existiert und daß eine Aminosäure mit einer kleinen
Seitenkette an der Spaltstelle des Sekretionssignals
anwesend ist. Dieses Polypeptid wird im Verlauf der Sekretion
entfernt und es wird erwägt, daß es eine wichtige Rolle beim
Durchgang eines Vorläuferproteins durch eine
cytoplasmatische Membran spielt (Referenzliteratur 11).
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Die Aminosäuresequenz, welche als das Sekretionssignal des
neutralen Proteasegens von Bacillus amyloliquefaciens
betrachtet wird und für den Zusammenbau des
Hirudin-Sekretionsplasmids gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet wird,
ist
Met-Gly-Leu-Gly-Lys-Lys-Leu-Ser-Ser-Ala-Val-Ala-Ala-Ser-Phe-Met-Ser-Leu-Thr-Ile-Ser-Leu-Pro-Gly-Val-Gln-Ala-, und
diese Sequenz hat eine typische Primärstruktur des
Sekretionssignals. Das heißt, in dieser Aminosäuresequenz kann es
verstanden werden, daß Lys, das eine basische Aminosäure
ist, in Nachbarschaft zum N-Terminus anwesend ist, daß das
Cluster
(Leu-Ser-Ser-Ala-Val-Ala-Ala-Ser-Phe-Met-Ser-Leu-Thr-Ile-Ser-Leu) einer hydrophoben Aminosäure in der Mitte
davon existiert und daß eine Aminosäure (Ala) mit einer
kleinen Seitenkette an der Spaltstelle des Sekretionssignals
anwesend ist.
-
Somit ist die DNA-Sequenz, die für das Sekretionssignal in
der oben erwähnten DNA-Sequenz codiert:
-
(d-Teil in der oben erwähnten DNA-Sequenz).
-
Die Aminosäuresequenz des Hirudinproteins, die für den
Zusammenbau des Hirudin-Sekretionsplasmids der vorliegenden
Erfindung verwendet worden ist, ist:
und die DNA-Sequenz für das Hirudin ist:
-
(e-Teil der oben erwähnten DNA-Sequenz).
-
In früheren Jahren wurden die DNA-Sequenzen vieler Gene
aufgeklärt und es ist möglich, die Häufigkeit von Codons, die
in den Genen verwendet werden, zu erforschen. Als ein
Ergebnis wurde sichtbar, daß die Häufigkeit der verwendeten
Codons von der Art der Kreatur abhängt. Somit ist es in dem
Fall, daß die DNA-Sequenz chemisch synthetisiert wird, um
eine hocheffiziente Expression zu erhalten, der übliche Weg,
die DNA-Sequenz so zu entwerfen, daß geeignete Codons darin
genügend enthalten sein können. Beim Zusammenbau des
Hirudin-Sekretionsvektors der vorliegenden Erfindung wird die
DNA-Sequenz verwendet, die für chemisch synthetisiertes
Hirudin codiert. Gewöhnlich ist eine DNA-Sequenz, die für
ein Polypeptid codiert, nicht auf eine Art von Codon
beschränkt und deshalb können verschiedene DNA-Sequenzen, die
für Hirudin codieren, ausgedacht werden. Jedoch wird in der
vorliegenden Erfindung die DNA-Sequenz verwendet, die
entworfen worden ist, um viele wünschenswerte Codons für
Bacillus subtilis zu enthalten, wobei man in Betracht gezogen
hat, daß die Expression unter Verwendung von Bacillus
subtilis als Wirt erfolgt.
-
Für die Sekretion eines heterologen Proteins durch Bacillus
subtilis ist es wesentlich, daß das heterologe Gen, das für
das gewünschte Protein codiert, an die Region ligiert worden
ist, die für den Promoter, die Ribosomenbindungsregion und
das Sekretionssignal codiert, welche aus einem Gen für ein
extrazelluläres Protein stammt. Es ist wichtig, das Gen für
das extrazelluläre Protein zu verwenden, welches
extrazellulär in großer Menge und kurzer Zeit hergestellt werden kann.
-
Als solche Sekretionsproteine sind Alkalische Phosphatase,
α-Amylase, Lävansucrase bzw. Lävaninvertase und ähnliches
bekannt. Jedoch sollte bemerkt werden, daß das heterologe
Genprodukt nicht effizient rechtzeitig sekretiert werden
kann, nur durch Zusammenbau des Sekretionsplasmids für ein
heterologes Protein, bei dem das für das heterologe Protein
codierende DNA-Fragment an eine Stelle ligiert worden ist,
die der Region folgt, die für den Promoter, die
Ribosomenbindungsregion und das Sekretionssignal eines solchen
Sekretionsproteins codiert und mit Bacillus subtilis repliziert
werden kann. Diese Tatsache wurde von Ullmanen et al.
(Referenzliteratur 19) und Schein (Referenzliteratur 20)
berichtet.
-
Die Erfinder der vorliegenden Anmeldung haben intensiv
geforscht, um das Gen zu erhalten, das für das
Sekretionsprotein mit der Fähigkeit codiert, durch welche Hirudin in
großen Mengen aus dem Bakterium sekretiert werden kann, und
sie haben auch eine Ligationsweise zwischen dem
DNA-Fragment, das für das Sekretionssignal codiert, und dem DNA-
Fragment, das für Hirudin codiert, erforscht. Als ein
Ergebnis wurde gefunden, daß es möglich ist, das
Sekretionsplasmid der vorliegenden Erfindung, das solche extrem guten
Ergebnisse, wie es in den Beispielen des vorliegenden Falles
gezeigt ist, liefert, zusammenzubauen, wenn das neutrale
Proteasegen eines Bacillus-Bakteriums, insbesondere
vorzugsweise Bacillus amyloliquefaciens, ausgewählt worden ist und
wenn das DNA-Fragment, das für Hirudin codiert, an eine
Stelle direkt nach der Region, die für den Promoter, die
Ribosomenbindungsregion und das Sekretionssignal codiert,
ligiert worden ist.
-
Als Vektor-DNA zum Bilden des Hirudin-Sekretionsplasmids der
vorliegenden Erfindung kann irgendeine verwendet werden, so
lange sie in Bacillus subtilis repliziert werden kann.
Beispiele des Vektors, der gewöhnlich häufig verwendet werden
kann, schließen pUB110, pTP5, pC194, pDB9, pBD64, pBC16 und
pE194 ein, welche aus Staphylococcus stammende Plasmide
sind. Bacillus subtilis mit den oben erwähnten Plasmiden
kann für jedermann im Bacillus Stock Center in der Ohio
Universität (Adresse: 484 West 12th Avenue, Columus, Ohio 43210
USA) erhältlich sein.
-
Insbesondere kann als in der vorliegenden Erfindung
verwendete Vektor-DNA irgendeine verwendet werden, solange es ein
Plasmid ist, das in Bacillus-Bakterien repliziert werden
kann. Jedoch ist pUB110 das Beste, weil molekularbiologische
Daten über dieses reichlich vorhanden sind, und es kann in
Bacillus-Bakterien stabil gehalten werden.
-
Wie es in den nachfolgend angegebenen Beispielen beschrieben
ist, kann das Hirudin-Sekretionsplasmid der vorliegenden
Erfindung hergestellt werden durch Ligation des DNA-Fragments,
das für Hirudin codiert, an eine Stelle direkt nach der
Region, die für den Promoter, die Ribosomenbindungsregion und
das Sekretionssignal eines neutralen Proteasegens codiert,
und zwar durch Verwendung eines Expressionsvektors für ein
heterologes Protein, der fähig ist, ein heterologes Protein
direkt nach der Region zu codieren, die für den obigen
Promoter, die Ribosomenbindungsregion und das Sekretionssignal
codiert. Das Hirudin-Sekretionsplasmid der vorliegenden
Erfindung kann zusammengebaut werden, und zwar durch
Kombinieren eines chemisch synthetisierten DNA-Fragments, das die
oben erwähnte DNA-Sequenz enthält, mit einem mit einem
geeigneten Restriktionsenzym gespaltenen Vektor-DNA-Fragment,
welches in Bacillus subtilis repliziert werden kann, gemäß
einer üblichen Ligationstechnik. In diesen Fällen können
zwei DNA-Fragmente miteinander ligiert werden, zum Beispiel
über eine gemeinsame Restriktionsenzymstelle und/oder durch
Verwendung eines synthetisierten DNA-Linkers und/oder
mittels einer "Blunt-End-Ligation".
-
Der Bacillus subtilis kann transformiert werden, um einen
transformierten Stamm zu erhalten, durch Verwendung des
Hirudin-Sekretionsplasmids, das durch Ligation des
DNA-Fragments in die oben erwähnte Vektor-DNA zusammengebaut worden
ist, wobei das vorher genannte DNA-Fragment durch Ligation
des für das Hirudinprotein codierenden DNA-Fragments an eine
Stelle nach der Region, die für den Promoter, die
Ribosomenbindungsregion und das Sekretionssignal des neutralen
Proteasegens von Bacillus amyloliquefaciens codiert,
hergestellt worden ist.
-
Als eine Technik zur Transformation von Bacillus subtilis
kann irgendeine verwendet werden, solange es eine Technik
ist, die jetzt im Stand der Technik bekannt ist.
-
Zum Beispiel kann das von Chang et al. vorgeschlagene
Verfahren verwendet werden (Referenzliteratur 24). Dieses
Verfahren kann wie folgt in drei Schritte aufgeteilt werden:
-
(1) Schritt der Herstellung von zellwandfreiem Bacillus
subtilis, d.h. ein Protoplast durch Behandlung von Bacillus
subtilis mit Lysozym in einer isotonischen Lösung.
-
(2) Schritt der Transformation des Protoplasten mit Vektor-
DNA in einer Polyethylenglykollösung.
-
(3) Schritt der Wiederherstellung der Zellwand für den
Protoplast in einem reproduktiven Kulturmedium, und Auswählen
des transformierten Bacillus subtilis.
-
Um das Hirudin unter Verwendung des so hergestellten
transformierten Stammes zu erhalten, wird die Flüssigkultivierung
des Stammes durch das übliche Verfahren durchgeführt. Zum
Beispiel wird der transformierte Stamm in 400 ml eines LB-
Kulturmediums (Referenzliteratur 25) in einem 2-Liter
Erlenmeyerkolben eingeimpft, und die Kultivierung wird dann bei
37ºC für ungefähr 20 Stunden mit Schütteln ausgeführt,
vorzugsweise bis eine maximale Ausbeute an Hirudin sekretiert
und produziert worden ist.
-
Der transformierte Stamm der vorliegenden Erfindung kann in
einem flüssigen Medium, das eine verdauliche
Kohlenstoffquelle, Sickstoffquelle und Quelle anorganischer Salze
enthält, kultiviert werden. Zum Beispiel kann das flüssige
Kulturmedium, das gewöhnlich häufig verwendet werden kann, ein
LB-Kulturmedium sein.
-
Als Stamm, der in der vorliegenden Erfindung verwendet wird,
kann irgendeiner benutzt werden, solange es ein Bacillus-
Bakterium ist, das durch das Hirudin-Sekretionsplasmid der
vorliegenden Erfindung transformiert werden kann. Bacillus
subtilis ist der Beste, weil seine auf Genetik, Biochemie,
Molekularbiologie und angewandte Mikrobiologie basierenden
Daten zahlreich sind und die Sicherheit hoch ist.
-
Die Herstellung von Hirudin aus dem Kulturmedium kann durch
rückgewinnende Reinigung aus dem Überstand des Kulturmediums
erreicht werden. Das durch die vorliegenden Erfinder
gefundene Verfahren der Hirudingewinnung ist wie folgt: Der
Mediumüberstand wird mit Salzsäure auf pH 3 eingestellt und
die Behandlung wird dann bei 70ºC für 15 Minuten ausgeführt,
um ein Proteinpräzipitat zu bilden. Nachfolgend wird
letzteres durch Zentrifugation davon entfernt, um eine
Überstandsfraktion zu erhalten, die Hirudin enthält. In der
Überstandsfraktion ist das Hirudin in einem hohen Verhältnis
von 20% bezüglich des Gesamtproteins anwesend, und sie
enthält nur eine sehr geringe Menge unreine Proteine. Deshalb
kann das in den Überstand des Kulturmediums sekretierte
Hirudin leicht durch Kationenaustauscherchromatographie,
Anionenaustaucherchromatographie und
Affinitätschromatographie gereinigt werden.
-
Die vorliegenden Erfinder haben gefunden, daß Hirudin mit
einer Antithrombin-Aktivität entsprechend 10 mg/l x A660
sekretiert und angereichert werden kann, und zwar durch
Kultivieren von Bacillus subtilis, der mit dem
Hirudin-Sekretionsplasmid transformiert worden ist, in einem 2-fach
konzentrierten LB-Kulturmedium. In diesem Fall ist die
Extinktion (A660) des Kulturmediums, die die Wachstumsstufe
von Bacillus subtilis anzeigt, 10. Die oben erwähnte Einheit
(mg/l x A660) zeigt einen Wert, der erhalten worden ist
durch Teilen der Menge (mg) des angereicherten Hirudins im
Mediumüberstand (1 Liter) durch die Extinktion (A660), die
die Wachstumsstufe von Bacillus subtilis im Kulturmedium
anzeigt.
-
Es wurde gefunden, daß 35 mg Hirudin aus 1 Liter
Kulturmedium durch Einstellen des Überstandes (1 Liter) auf pH 3 mit
Salzsäure erhalten werden können, dann Behandeln bei 70ºC
für 15 Minuten, um ein Proteinpräzipitat zu bilden,
Entfernen von letzterem, um eine Überstandsfraktion zu erhalten,
und Reinigung der Überstandsfraktion durch Verwendung von
Anionenaustauscherchromatographie und
Affinitätschromatographie. Die vorliegende Erfindung wurde auf der Basis dieser
Kenntnis erreicht.
-
Weiterhin hat das Hirudin-Sekretionsplasmid der vorliegenden
Erfindung die DNA-Region, in der der 5'Terminus des DNA-
Fragments von Hirudin direkt an eine Stelle sofort unterhalb
des 3'Terminus der Sekretionssignalregion des neutralen
Proteasegens ligiert worden ist, und es kann in Betracht
gezogen werden, daß in den Bakterien oder cytoplasmatischen
Membranen des transformierten Stammes, der durch Ausführen der
Transformation mit diesem Plasmid erhalten worden ist, ein
Vorläuferprotein synthetisiert wird, bei dem eine am
N-Terminus von Hirudin anwesende Aminosäure an eine Stelle direkt
nach einer am C-Terminus des Sekretionssignals der neutralen
Protease anwesenden Aminosäure gebunden wird. Es ist
bekannt, daß das Sekretionssignal im allgemeinen im Verlauf
der Sekretion entfernt wird, und auch in der vorliegenden
Erfindung kann die Sekretion und Produktion eines solchen
Hirudins vom Naturtyp mit der N-terminalen Aminosäuresequenz
wie in einem Sekretionssignal-freien von Hirudo medicinalis
stammenden Hirudin erwartet werden. Gemäß dem Bericht von
Schein et al. (Referenzliteratur 20) jedoch kann nur durch
Ligation des DNA-Fragments, das für ein gewünschtes
maturiertes Protein codiert, an eine Stelle direkt nach der
Region, die für den Promoter, die
Ribosomen(ver)bindungsregion und das Sekretionssignal des für ein
Sekretionsprotein codierenden Gens codiert, das maturierte
Protein, von dem das Sekretionssignal entfernt worden ist,
nicht effizient rechtzeitig von dem Vorläuferprotein
sekretiert werden, wobei das Vorläuferprotein als in Bakterien
synthetisiert angenommen wird und bei dem das maturierte
Protein an den C-Terminus des Sekretionssignals fusioniert
ist. Auch in dem Fall, daß Bacillus subtilis mit dem
Hirudin-Sekretionsplasmid der vorliegenden Erfindung
transformiert worden ist, war es unbestimmt, ob oder ob nicht das
natürliche Hirudin, von dem das Sekretionssignal entfernt
worden ist, aus dem Vorläuferprotein sekretiert wird, bei
dem eine am N-Terminus von Hirudin anwesende Aminosäure an
eine Stelle direkt nach einer am C-Terminus des
Sekretionssignals der neutralen Protease anwesenden Aminosäure
gebunden ist.
-
Die vorliegenden Erfinder haben verschiedene Ligationsweisen
zwischen dem Sekretionssignal und Hirudin untersucht und als
ein Ergebnis haben sie gefunden, daß nur bei der
Lisgationsweise der vorliegenden Erfindung, das Hirudin vom
natürlichen Typ in ein Kulturmedium mit Hilfe des transformierten
Bacillus subtilis sekretiert wird, wie es in den Beispielen
des vorliegenden Falles gezeigt ist.
-
Wie es in einem Ausführungsbeispiel der vorliegenden
Erfindung gezeigt ist, kann Hirudin mit derselben N-terminalen
Aminosäuresequenz und derselben Aminosäurezusammensetzung
wie von Hirudo medicinalis stammendes Hirudin in den
Überstand eines Kulturmediums sekretiert werden, und zwar ohne
irgendeine Zersetzung durch Verwendung des Promotors, der
Ribosomenbindungsregion und der Sekretionssignalregion des
neutralen Proteasegens von Bacillus amyloliquefaciens, um
ein Hirudin-Sekretionsplasmid zusammenzubauen, dann
Einführen dieses Plasmids in Bacillus subtilis, um einen
transformierten Stamm zu erhalten, und Kultivieren des Stamms. Das
heißt, daß ein Hirudin-Präparationsverfahren etabliert
worden ist, bei dem Hirudin einfach gewonnen und gereinigt
werden kann.
-
Nun wird die vorliegende Erfindung im Detail mit Bezug auf
die Beispiele beschrieben, aber der Umfang der vorliegenden
Erfindung soll nicht darauf beschränkt sein.
Beispiel 1
(Zusammenbau des Heteroprotein exprimierenden und
sekretierenden Vektors pNPA225)
-
Ein in Figur 1 gezeigtes Verfahren wurde ausgeführt, um
einen ein heterologes Protein exprimierenden und
sekretierenden Vektor pNPA225 zusammenzubauen, bei dem das
für das heterologe Protein codierende DNA-Fragment an eine
Stelle direkt nach der Region, die für den Promoter, die
Ribosomenbindungsregion und das Sekretionssignal des neutralen
Proteasegens von Bacillus amyloliquefaciens codiert, ligiert
worden war.
-
In Figur 1 ist das Plasmid pNPA84 ein
Amylasesekretionsplasmid mit dem DNA-Fragment, bei dem das DNA-Fragment (α-
Amylase) codierend für das maturierte α-Amylaseprotein an
eine Stelle nach der Region, die für einen Promoter
(Promoter),
eine Ribosomenbindungsregion (SD), Sekretionssignal
(pre) und Propeptid (Δ pro) des neutralen Proteasegens
codiert, ligiert worden ist. Das maturierte α-Amylasegen kann
als das DNA-Fragment definiert werden, das für ein natürlich
vorkommendes Protein mit einer α-Amylaseaktivität und mit
Leucin beginnend codiert. Aus dem transformierten Stamm MT-
8400 (FERM BP-923), der das Plasmid pNPA84 enthält, wurde
letzteres pNPA84 in Übereinstimmung mit dem Verfahren von
Tabak et al. (Referenzliteratur 26) hergestellt. Diese
pNPA84-DNA wurde dann mit den Restriktionsenzymen HpaII und
BamHI (welche beide von Takara Shuzo Co., Ltd. hergestellt
wurden) gespalten, um ungefähr 7,8 Kb eines DNA-Fragments
(nachfolgend als "DNA-Fragment A" bezeichnet) zu erhalten
und letzteres wurde mittels einer Elektrophorese unter
Verwendung von Agarosegel gereinigt. Dieses DNA-Fragment
enthielt die Region, die für den Promoter, die
Ribosomenbindungsregion und das C-Terminus-freie Sekretionssignal
codiert. Andererseits wurden zum Zwecke der Spaltung des
neutralen Proteasegens direkt nach dessen
Sekretionssignalregion mit einem Restriktionsenzym StuI, zwei Arten von
Oligonukleotiden, d.h. 16mer und 18mer, durch eine verbesserte
Triestermethode (Referenzliteratur 27) synthetisiert. Danach
wurde 1 ug von jeder der beiden Arten von synthetisierten
Oligonukleotiden mittels T4-Polynukleotidkinase (hergestellt
von Takara Shuzo Co., Ltd.) und dATP (hergestellt von
Pharmacia Labs., Inc.) phosphoryliert (Referenzliteratur
28). Als nächstes wurden diese Reaktionsprodukte gemischt
und dann für 3 Minuten in heißem Wasser aufgeheizt, gefolgt
von einem langsamen Abkühlen, wodurch sich die beiden Arten
von synthetisierten Oligonukleotiden anlagerten (annealing).
Danach wurden das DNA-Fragment (0,5 ug) und das "annealte"
synthetisierte Oligonukleotid (1ug) durch die Verwendung von
T4-Ligase (hergestellt von Takara Shuzo Co., Ltd.)
aneinander ligiert, um ein Hybridplasmid pNPA225 zu erhalten.
Beispiel 2
(Zusammenbau des Hirudin-Sekretionsvektors pNPH208)
-
Ein Plasmid pNPH208 wurde in Übereinstimmung mit dem in Fig.
2 gezeigten Verfahren zusammengebaut.
-
An erster Stelle zum Zwecke des Zusammenbaus eines
DNA-Fragments (Fig. 3), das die DNA-Region enthält, die für eine
Aminosäure vom N-Terminus bis zum 10. Rest von Hirudin
codiert, wurden zwei Arten von Oligonukleotiden synthetisiert.
Als nächstes wurde 1ug von jeder der zwei Arten von
Oligonukleotiden phosphoryliert und dann "annealt". Dieses wurde an
die pNPA225-DNA (0,5 um bzw. ug), welche mit den
Restriktionsenzymen StuI und BamHI gespalten worden war,
durch die Verwendung von T4-Ligase (hergestellt von Takara
Shuzo Co., Ltd.) ligiert, um ein Hybridplasmid pNPA225ΔH zu
erhalten, bei dem die N-terminale Region (welche dem Teil
vom N-Terminus bis zum 10. Aminosäurerest von Hirudin
entsprach) des DNA-Fragments, das für Hirudin codiert, an eine
Stelle direkt nach der Region, die für das Sekretionssignal
des neutralen Proteasegens codiert, ligiert worden war.
-
Es ist schon ein Stamm hinterlegt (FERM BP-1985), der mit
dem Plasmid p4014 transformiert worden ist, das aus dem
Vektor pBR322 zusammengebaut worden ist und eine synthetisierte
DNA, die durch Auswählen eines Codons, das der
Aminosäuresequenz von Hirudin entspricht, aus häufig in Bacillus
subtilis verwendeten Codons, d.h. Optimumcodons, hergestellt
worden ist, und dann chemisches Synthetisieren des Codons.
Das DNA-Fragment (H), das für Hirudin codiert, wurde aus
diesem transformierten Stamm B9-1985 bzw. BP-1985 in der
folgenden Weise hergestellt: Zuerst wurde p4014 mit den
Restriktionsenzymen EcoRI und BamHI gespalten, um ein DNA-
Fragment herzustellen, das Hirudin enthält. Das so
hergestellte DNA-Fragment wurde zwischen den Spaltstellen des
Plasmids pUC 13 mit den Restriktionsenzymen EcoRI und BamHI
angeordnet, um ein Hybridplasmid p3009 (Fig. 4)
zusammenzubauen.
Diese p3009-DNA (2ug) wurde mit den
Restriktionsenzymen AccIII und HindIII gespalten, um das DNA-Fragment (DNA-
Fragment B) herzustellen, das die DNA-Region enthält, die
für die Aminosäuresequenz von der 11. Aminosäure bis zum C-
Terminus von Hirudin codiert, und das DNA-Fragment B wurde
dann mittels Elektrophorese gereinigt.
-
Dieses DNA-Fragment B und pNPA225ΔH wurden mit den
Restriktionsenzymen AccIII und HindIII gespalten, um ungefähr 6,0
Kb eines DNA-Fragments (DNA-Fragment C) herzustellen (1 ug)
wurden mittels Verwendung von T4-Ligase ligiert, wodurch ein
Hirudin-Sekretionsvektor pNPH208 zusammengebaut wurde.
Dieses pNPH208 war ein Hybridplasmid, das die DNA-Sequenz
enthielt, in welcher das für Hirudin codierende DNA-Fragment
an eine Stelle direkt nach der Region, die für den Promoter,
die Ribosomenbindungsregion und das Sekretionssignal des
neutralen Proteasegens von Bacillus amyloliquefaciens
codiert, ligiert worden war.
Beispiel 3
(Sekretion und Produktion von Hirudin durch das
Hirudin-Sekretionsplasmid)
-
Durch die Verwendung des in Beispiel 2 zusammengebauten
Plasmids pNPH208, wurde ein Bacillus subtilis MT-430-Stamm
(FERM BP-1079) in Übereinstimmung mit dem Verfahren von
Chang et al. (Referenzliteratur 24) transformiert. Der sich
ergebende transformierte Stamm MT-208 (FERM BP-1983) wurde
einem Schüttelkulturverfahren bei 37ºC für 20 Stunden durch
die Verwendung eines 2-fach konzentrierten LB-Kulturmediums
unterzogen. Die Menge von sekretiertem und angereichertem
Hirudin wurde durch Messen einer Antithrombin-Aktivität im
Überstand des Kulturmediums bestimmt. Diese
Antithrombin-Aktivität wurde durch Messen eines inhibitorischen Grads der
Hydrolyseaktivität eines synthetisierten Substrats
H-D-Phenylanil-L-pipecolyl-L-arginyl-p-nitroanilid zu Thrombin
(Referenzliteratur
30) bestimmt. Das heißt, 50 ul einer
Thrombin- (hergestellt von Mochida Pharmaceutical Co., Ltd.)
Lösung (20 IU/ml) wurden mit 50 ul einer Pufferlösung (50 mM
Tris-HCl, pH=8,0) unter neutralen bis suren Bedingungen
gemischt, und das Gemisch wurde dann bei Raumtemperatur für 2
Minuten inkubiert. Danach wurden 50 ul des Gemisches zu H-D-
Phenylanil-L-pipecolyl-L-arginyl-p-nitroanilid (Daiichi
Chemical Pharmaceutical Co., Ltd.) (Endkonzentration des
Substrats = 0,25 mM) hinzugegeben. Nach Beginn der Reaktion
wurde die Freisetzung von p-Nitroanilid bei einer
Wellenlänge von 405 nm gemessen, und die Zunahme der Absorption
pro Zeiteinheit wurde durch a dargestellt. Als nächstes
wurde die Pufferlösung durch eine Probenlösung ersetzt, und
die gleiche Prozedur wurde dann ausgeführt, um die Zunahme
der Absorption bei einer Wellenlänge von 405 nm zu messen.
Der nun gemessene Wert wurde durch b dargestellt. Eine
Antithrombin-Aktivität des Überstands des Kulturmediums wurde
durch Berechnung von (a - b)/a bestimmt. Eine Einheit der
Antithrombin-Aktivität kann als die Fähigkeit definiert
werden, eine Einheit von 1N Thrombin zu neutralisieren. Der
Gehalt von Hirudin wurde erst durch getrenntes Messen einer
Thrombin spezifischen Aktivität und dann durch Ausnutzen der
Tatsache, daß Hirudin Thrombin in einem Verhältnis von 1:1
(molares Verhältnis) inhibiert, bestimmt.
-
Nachdem die Kultivierung bei 37ºC für 20 Stunden durch die
Verwendung eines 2-fach konzentrierten LB-Kulturmediums
ausgeführt worden war, wurde eine Antithrombin-Aktivität von
ungefähr 116 Millionen Einheiten, d.h. ungefähr 100 mg
angereichertes Hirudin pro Liter Kulturmedium, beobachtet. In
diesem Fall war die Extinktion (A660) des Kulturmediums, die
die Wachstumsstufe von Bacillus subtilis anzeigt, 10.
Weiterhin verringerte sich die Antithrombin-Aktivität des
sekretierten und angereicherten Hirudins nicht, aber sie
vergrößerte sich mit der Zeit. Wenn ein Präzipitat, das
durch Hinzufügen von Trichloressigsäure zu dem Überstand des
Kulturmediums erhalten worden war, mit SDS-PAGE analysiert
wurde, wurde sichtbar, daß ein Protein mit derselben Größe
wie eine Hirudinpräparation, die durch Reinigung eines von
Sigma Chemicals Co. verkauften Hirudins erhalten wurde, in
großen Mengen im Überstand des Kulturmediums angereichert
worden war. Zusätzlich gemäß den analytischen Ergebnissen
durch ein Gelscannerdensiotometer war die Menge von Hirudin
im Überstand eines MT-208 Stamm Kulturmediums so viel wie
5%. Wenn dieser Überstand auf 70ºC für 15 Minuten thermisch
behandelt worden war, um ein proteinöses bzw.
proteinhaltiges Präzipitat zu bilden und letzteres dann
davon mittels Zentrifugation entfernt worden war, war die
Antithrombin-Aktivität noch in der Überstandsfraktion
anwesend. Darüberhinaus war das Verhältnis von existierendem
Hirudinprotein zu Gesamtprotein auf bis 20% erhöht, wodurch
ausgedrückt wird, daß unreine Proteine deutlich verringert
waren. Hirudin (Referenzliteratur 31), das durch Reinigen
dieses Überstands erhalten worden war, zeigte eine Bande im
SDS-PAGE und es wurde sichtbar, daß das Molekulargewicht
dieses Hirudins dasselbe war wie das einer
Hirudinpräparation, die durch Reinigen eines von Hirudo medicinalis, von
Sigma Chemicals Co. käuflich erhältlich, stammenden Hirudins
erhalten worden war. Die N-terminale Aminosäuresequenz des
gereinigten Hirudins wurde dann gemessen und als ein
Ergebnis wurde bestimmt, daß die Sequenz Val-Val-Tyr-Thr-Asn war.
-
Das gereinigte Hirudin (10 mg) wurde bei 110ºC für 24
Stunden in 6N Salzsäure hydrolisiert und die hydrolisierte
Substanz wurde dann auf ihre Aminosäurezusammensetzung hin
untersucht (Referenzliteratur 33). Die Ergebnisse sind in
Tabelle 1 aufgeführt. Es ist deutlich, daß die analytischen
Werte in der Tabelle eng mit den theoretischen Werten einer
Aminosäurezusammensetzung, die aus der Aminosäuresequenz
eines von Hirudo medicinalis stammenden Hirudins berechnet
worden war, in Einklang stehen.
-
Diese Tatsache zeigt an, daß Hirudin, welches von Bacillus
subtilis, der mit dem Hirudin-Sekretionsplasmid der
vorliegenden
Erfindung transformiert worden ist, sekretiert und
produziert worden ist, diesselbe N-terminale
Aminosäuresequenz und diesselbe Aminosäurezusammensetzung wie von Hirudo
medicinalis stammendes Hirudin hat.
-
Als ein Ergebnis der Thrombininhibierungs-Experimente wurde
deutlich, das dieses gereinigte Hirudin fähig war, mit
Thrombin stöchiometrisch in einem Verhältnis von 1:1,14 zu
reagieren.
-
Diese Tatsache zeigt auch an, daß Hirudin, welches von
Bacillus subtilis, der mit dem Hirudin-Sekretionsplasmid der
vorliegenden Erfindung transformiert worden ist, sekretiert
und produziert worden ist, diesselbe Antithrombin-Aktivität
wie von Hirudo medicinalis stammendes Hirudin hat.
Tabelle 1
Analytische Ergebnisse der Aminosäurezusammensetzung
Zahl der Aminosäuren
Theoretischer Wert
Gefundener Werts
Literaturliste
-
1. Dodt, J. et al., FEBS Lett., 165, 180-184 (1984)
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2. Harvery, R.P. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83,
1084-1088 (1986)
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3. Rosenberg, R.D., Semin. Hematol., 14427-440 (1977)
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4. Markwardt, F., "Methods in Enzymol.", 19,
924-932 (1970)
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5. Markwardt, F. et al., Thromb. Haemostasis
(Stuffgart), 52, 160-163 (1984)
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6. Badgy, D. et al., "Methods in Enzymol.", 45,
669-678 (1976)
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7. Schoner, R.G. et al., BIO/TECHNOLOGY, 3,
151-154 (1985)
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8. Naomi Hizuka, BIO medica, 2(1), 79-83 (1987)
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9. J.M. Schoemaker et al., ENBO J., 4, 775 (1985)
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10. Japanische ungeprüfte Patentveröffentlichung Nr. 61-501 609
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11. Blobel, G. et al., Cell. Biol., 67, 835 (1975)
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12. Palva, I. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79,
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13. Kovacevic, S. et al., J. Bacteriol., 162,
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14. Fahnestock, S.R. et al., J. Bacteriol., 165,
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16. Yamane, K. et al., In J.A. Hoch and P. Setlow (ed.).,
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2917-2925 (1986)
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19. Ulmanen, I. et al., J. bacteriol., 162, 176-182 (1985)
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