FI92601C - Menetelmä hyötyproteiinien erittämiseksi hiivoista - Google Patents

Description

5 92601

MENETELMA HYOTYPROTEIINIEN ERITTÅMISEKSI HIIVOISTA

KEKSINNON ALUE

Keksinto kåsittåå menetelmån, jolla hyotyproteiini voidaan erittåå, proteiinin samalla muokkautuessa, eritysreittiå 10 pitkin hiivasolun plasmamembraanin ulkopuolelle. Hyotyproteiini tuotetaan ja eritetåån transformoimalla hiivasolu uudella yhdistelmå-DNA-rakenteella, joka sisåltåå Saccha-romvces cerevisiaen tai muun hiivan HSP150-geenin, sen osan tai funktionaalisen johdannaisen, kytkettynå vierasta prote-15 iinia koodittavaan geeniin. Fuusiogeeni ilmennetåån HSP150-geenin sååtelyalueiden tai muiden sååtelyalueiden kontrol-lissa.

20 TEKNIIKAN TASO

Hiivasolun eritysreitti

Hiivasolu tarjoaa vaihtoehdon bakteerisolulle hyotyproteii-25 nien tuottamiseksi geeniteknologisin menetelmin låhinnå siksi, ettå se pystyy erittåmåån glykoproteiineja eritys-.. reittiå pitkin plasmamembraaninsa ulkopuolelle, joko so- luseinåån tai kasvuliuokseen (Tekamp-Olson ja Valenzuela, Curr. Opinion Biotechnol. 1: 28-35, 1990). Hiivan eritys- 30 reitti koostuu endoplasmisesta kalvostosta, Golgin lait- teesta ja eritysrakkuloista, ja se toimii samaan tapaan kuin nisåkåssolun eritysreitti. Syntetisoitumassa oleva tai juuri ' syntetisoitu polypeptidiketju låpåisee endoplasmisen kalvos- ton membraanin signaalisekvenssinså avulla ja siirtyy eri-35 tysreitille endoplasmisen kalvoston onteloon. Endoplasmisen kalvoston membraanista kuroutuu rakkuloita, joissa proteiini kulkeutuu Golgin laitteeseen, kun rakkulat fuusioituvat Golgin membraanin kanssa. Golgin laite koostuu useista membraanin ympåroimistå osastoista, joiden låpi erittyvå prote-40 iini kulkeutuu rakkulaliikenteellå. Viimeisestå Golgin 2 92601 osastosta kuroutuvat eritysrakkulat fuusioituvat plasmamem-braanin kanssa, jolloin erittyvå proteiini vapautuu solun ulkopuolelle, jååden joko plasmametnbraania kattavaan soluse-inåån kiinni, tai erittyen soluseinån låpi kasvuliuokseen.

5 Erittyminen on siis proteiinin kuljetusta rakkulaliikenteel-la solun plasmamembraanin ulkopuolelle, joko soluseinåån tai kasvuliuokseen. Eritysreitin organelleissa olevat entsyymit muokkaavat erittyviå proteiineja sokeriketjuin, proteolyyt-tisin katkaisuin, rikkisiltojen muodostuksella, rasvahappo-10 jen lisåyksillå ja oligomerisaatioilla (Schekman, Annu. Rev.

Cell Biol. 1:115-143, 1985). Nåmå inuokkaukset tapahtuvat hiivassa samankaltaisesti, joskaan eivåt vålttåmåttå ident-tisesti, kuin nisåkåssolussa. Esimerkiksi sokeriketjut ovat erilaisia hiivassa ja nisåkkååsså (Ballou, The Molecular 15 Biology of the Yeast Saccharomvces. Strathern, J.N., Jones, E.W. ja Broach J.R. (toim.) Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, ss. 335-360, 1982). Hiivasolun eritys-reitillå tapahtuvat inuokkaukset tuottavat proteiinimolekyy-lin, jonka konformaatio on oikea tai oikeampi kuin baktee-20 risolussa tuotetun (Curtis et al. . PNAS 88:5809-5813, 1991). Useat tavoitellut hyotyproteiinit ovat nisåkåssolun erittyviå proteiineja. Hiivassa ilmennettyinå nisåkåsproteiinien odotetaan muokkautuvan ja laskostuvan autenttisesti ja erittyvån kasvuliuokseen. Hyotyproteiinin erittyminen hii-25 vasolukon kasvuliuokseen on erityisen tavoiteltua, koska solu itse tålloin puhdistaa hyotyproteiinituotteen sellu-laarisista proteiineista. Tuotteen jatkopuhdistus kasvuli-uoksesta on helpompaa ja halvempaa kuin solulysaatista.

30 Saccharomvces cerevisiae-hiivan erittyvåt proteiinit

Soluseinån låpåisy. S. cerevisiaen plasmamembraaninsa ulkopuolelle erittåmistå omista proteiineista tunnetaan noin 15. Valtaosa niistå ei erity kasvuliuokseen, vaan jåå kiinni 3 92601 soluseinåån (de Nobel ja Barnett, Yeast 7:313-132, 1991).

Soluseinåksi kutsutaan tåsså sekå soluseinån rakennekom-ponentteja ettå periplasmista tilaa. α-faktori (Julius et al., Cell 36:309-318, 1984), Barl-proteaasi (MacKay et al..

5 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:55-59, 1988), killer-toksiini ja exo-/3-l-3-glukanaasi (Klebl ja Tanner, J. Bacteriol. 171:6259-6264, 1989) låpåisevåt soluseinån ja erittyvåt kasvuliuokseen. α-faktori ja killer-toksiini ovat pieniå molekyyleja, mikå saattaa selittåå soluseinån låpåisyn. Muut 10 ovat suuria tai suhteellisen suuria glykosyloituneita mole-kyylejå. Sååntojå, joiden mukaan molekyyli jåå soluseinåån kiinni tai låpåisee sen, ei tunneta.

Glykosylaatio. Låhes kaikki tunnetut soluseinåån tai kasvu-15 liuokseen erittyvåt S. cerevisiaen ornat proteiinit gly-kosyloidaan erityksen aikana ns. N-glykaaneilla, jotka saattavat koostua yli 200 mannoositåhteestå. Mikåli hetero-loginen proteiini N-glykosyloituu hiivassa, saattaa sen biologinen aktiivisuus muuttua. Koska hiivan suuret N-gly-20 kaanit ovat immunogeenisiå, ei niitå kantavia proteiineja voi kåyttåå terapeuttisesti (Kukuruzinska et al., Annu. Rev. Biochem. 56:914-944, 1987). Mainittakoon, ettå kypså a- faktorimolekyyli ei ole glykosyloitunut, mutta esiastemo-lekyyli, josta se irrotetaan, on N-glykosyloitu (Julius et 25 al·# Cell 36:309-318, 1984). a-agglutiniini on glykosyloitu pelkåståån 1-5 mannoosi-tåhdettå sisåltåvillå ns. O-glykaa-neilla, jotka eivåt ole iminunogeenisia (Watzele et al. EMBO J. 7:1483-1488, 1988).

30 Såately. Suurinta osaa S. cerevisiaen erittyvistå proteii-neista ei ilmennetå konstitutiivisesti. Niitå koodittavia geenejå såådellåån ravinto-olosuhteilla tai solujen sukupuo-lella. Esimerkiksi invertaasi ilmentyy vain silloin, kun solukon kasvuliuoksen glukoosipitoisuus on alentunut. a- 4 92601 faktoria taas syntetisoidaan vain ΜΑΤα-soluissa ja Barl-proteaasia vain MATa-soluissa. S. cerevisiae esiintyy kahte-na sukupuolena, MATa ja MATa. jotka yhteen saatettuna konju-goituvat keskenåån tuottaakseen diploidin solun (Cross et 5 al. Annu. Rev. Cell Biol. 4:429-457, 1988).

Glykoproteiinien eritys sec-mutanteissa. S. cerevisiaen sec-mutantit ovat låmpoherkkiå kantoja, joissa proteiinien eritys tapahtuu normaalisti 25°C:ssa. Restriktiivisesså 10 låmpotilassa (37°C) eritettåvåt proteiinit syntetisoituvat normaalisti, mutta niiden solunsisåinen kuljetus pysåhtyy kannasta riippuen eri osastoihin: sytoplasmaan, endoplasmi-seen kalvostoon, endoplasmisen kalvoston ja Golgin laitteen vålillå liikkuviin rakkuloihin, Golgin eri osastoihin, tai 15 eritysrakkuloihin (Schekman, Annu. Rev. Cell Biol. 1:115- 143, 1985). Kaikkien testattujen erittyvien proteiinien on raportoitu pysåhtyvån kyseisiin organelleihin 37°C:ssa. Golgin laitteeseen pysåhtyvåt alkuperåisesså sec7 mutantissa seuraavat proteiinit: Invertaasi( Novick et al.. Cell 21:2-20 05-215, 1980), killer-toksiini (Bussey et al. . Mol. Cell.

Biol. 3:1362-1370, 1983), soluseinån glykoproteiineja (Novick ja Schekman, 1983), soluseinån mannaaneja (Sanz et al.. 1987), α-faktori (Julius et al. . 1984), a-agglutiniini (Watzele et al.. EMBO J. 7: 1483-1488, 1988), hapan fosfa- 25 taasi (Novick et al.. Cell 21: 205-215, 1980), α-galak- tosidaasi (Tshopp et al.. J. Bacteriol. 160:966-970, 1984), vakuolin karboksipeptidaasi Y (Stevens et al.. Cell 30:439-448, 1982) ja sulfaattipermeaasi (Novick et al. . Cell 21:- 205-215, 1980).

30 S. cerevisiae-hiivan erittyvien proteiinien hyvåksikåytto hyotyproteiinien erityksesså S. cerevisiaessa on tuotettu useita hyotyproteiineja solun- « 5 92601 sisåisesti (Terkamp-Olson ja Valenzuela, Biotechnology l: 28-35, 1990). Koska tåmån keksinnon mukaisen HSP150-geenin hyotykåytto perustuu sen koodittaman hspl50-proteiinin erittymiseen, esitellåån seuraavassa esimerkkejå proteiini-5 tuotteista, jotka on hiivassa tuotettu eritysreittiå hyvåksi-kåyttåen plasmamembraanin ulkopuolelle. Erittyviå vieraita proteiineja on hiivassa ilmennetty autenttisista rakennegee-neistå omalla signaalisekvenssillå, kåyttårnållå hiivaprote-iinin tai muun proteiinin signaalisekvenssiå tai keinote-10 koista signaalisekvenssiå, sekå kåyttårnållå S. cerevisiaen α-faktorin pre-pro-osaa. Nåiden johdannaisten lisåksi voi-daan valmistaa johdannaisia, joissa rakennegeenistå on poistettu potentiaalisia glykosylaatiokohtia tai proteolyyt-tisiå katkaisukohtia koodaavia kodoneja, tai joissa rakenne-15 geeniin on lisåtty proteolyyttisiå katkaisukohtia koodaavia kodoneja. Promoottoreina on usein kåytetty hiivan voimak-kaita konstitutiivisia tai indusoituvia promoottoreita.

Tehokkaimman signaalisekvenssin valinta erittyvålle hetero-20 logiselle proteiinille on empiiristå. Autenttista signaalisekvenssiå on kåytetty esim. ihmisen lysotsyymin (Yoshimu-ra et al ♦ . BBRC 145:712-718, 1987 ; Jigami et al ♦ . Gene 43:273-279, 1986), Aspergillus niaerin glukoosioksidaasin (Frederick et al.. J. Biol. Chem. 265:3793-3802, 1990), ja 25 ihmisen a-amylaasin sekå seerumin albumiinin (Sato et al., Gene 83:355-356, 1989; Sleep et al.. Biotechnology 8:42-46, 1990) tuotannossa. Ihmisen lysotsyymiå on ilmennetty myos keinotekoisella signaalisekvenssillå (Yamamoto et al., BBRC 149:431-436, 1989). S. cerevisiaen invertaasin signaalisek-30 venssiå on kåytetty pro-urokinaasin ilmentåmisesså, jolloin tuottotaso oli peråti 15 mg/1 ja kaksi kolmasosaa tuotteesta erittyi kasvuliuokseen (Melnick et al.. J. Biol. Chem. 265-:801-807, 1990). Interleukiini-1/3 on saatu erittymåån S.

cerevisiaessa kåyttårnållå Candida albicans-hiivan glukoamy- 6 92601 laasigeenin signaalisekvenssiå (Livi et al. . J. Biol. Chexn. 266:15348-15355, 1991), tai Kluweromvces lactis-hiivan killer-toksiinin signaalisekvenssiå (Baldari et al., EMBO J. 6:229-234, 1987).

5

Eniten kåytetty systeemi heterologisten proteiinien erittå-miseksi S. cerevisiaessa on α-faktorin (MFal) pre-pro-muoto. Pre-pro-a-faktori muodostuu amino-terminaalisesta signaa-lisekvenssistå (pre-osa) ja sitå seuraavasta pro-osasta, 10 jotka yhdesså koostuvat 89 aminohaposta. Pro-osassa on 3 N-glykaania. Pro-osan karboksi-terminuksessa on sekvenssi Lys-Arg-Glu-Ala-Glu-Ala89 (våliosa). Tåtå seuraa nelja kolmen-toista aminohapon α-faktori-osaa, joita erottaa toisistaan våliosa. Golgin laitteessa oleva kex2-proteaasi pilkkoo 15 polypeptidiketjun Lys-Arg-parien karboksi-terminaaliselta puolelta ja STE13-geenin tuote dipeptidyyliaminopeptidaasi irroittaa Glu-Ala sekvenssit, vapauttaen kypsåt a-faktorimo-lekyylit. Tuottosysteemisså vieras proteiini fuusioidaan geeniteknologisesti oikeassa lukujaksossa α-faktorin pre-20 pro-osaan, joka vastaa fuusioproteiinin translokaatiosta eritysreitille sekå sen solunsisåisestå kuljetuksesta. Kun kex2-proteaasi katkaisee myohåisesså Golgissa esiastemo-lekyylin Lys-Arg- sekvenssin karboksi-terminaaliselta puolelta, vapautuu vieras proteiini, jonka amino-terminuksesta 25 vaihtelevalla teholla dipeptidyyliaminopeptidaasi irrottaa ylimååråiset glutamaatti- ja alaniinitåhteet. a-faktorin pre-pro-osaa on kåytetty mm. ihmisen epidermaalisen kasvute-kijån (hEGF) , /3-endorfiinin, interferonien, GM-CSF:n (granu-locyte/macrophage colony stimulating factor), seerumi albu-30 miinin ja hermokasvutekijån (hNGF) erittåmiseen S. cere visiaessa (Brake et al.. PNAS 81:4642, 1984; Bitter et al.. PNAS 81:5330, 1984; Singh et al.. Nucl. Acid. Res. 12:8927, 1984; Cantrell et al.. PNAS 82:6250-6254, 1985; Sleep et al., Biotechnology 8:42-46, 1990; Sakai et al., Biotechnolo- 7 92601 gy 9:1382-1385, 1991). Tuntemattomasta syystå monet vieraat geenituotteet eivåt S. cerevisiaessa erity solun ulkopuolel-le oman signaalisekvenssinså avulla (Cabezon et al. . Proc. Natl. Acad. Sci USA 81:6594-6598, 1984; Etcheverry et al ♦ .

5 Biotechnology 4:726-730, 1986).

Vaihtoehtoisesti voidaan hyotyproteiini irrottaa fuusiopro-teiinista erityksen jålkeen proteaasilla tai kemiallisesti (Moks et al.. Biotechnology 5:379-382, 1987), edellyttåen, 10 ettå kantajaproteiinin ja hyotyproteiinin saumassa on vali-tun irrotusmenetelmån vaatimat aminohapot.

Menestyksellinen sovellus α-faktorisysteemille S. cerevisiaessa on ihmisen insuliinin teollinen tuotanto. Insu-15 liinia koodittava geeni on liitetty α-faktorin pre-pro-osaa koodittavaan nukleotidisekvenssiin, tai pre-pro-sekvenssiin, josta on geeniteknologisin menetelmin poistettu Arg-Lys-sekvenssin jålkeiset glutamaatti- ja alaniinikodonit (Thim et al. . PNAS 83:6766-6770, 1986). Insuliinimolekyyli itse 20 koostuu osista B-Arg-Arg-C-Lys-Arg-A. Oligopeptidejå B, C ja A siis erottaa kex2- proteaasin tunnistuskohdat Arg-Arg ja Lys-Arg. Kex2-proteaasi irrottaa B-, C- ja A-osat nåistå kohdista fuusioproteiinin kulkeutuessa Golgin laitteeseen. Katkaisu saattaa tapahtua tehottomasti, jos fuusioproteiinin 25 ilmentymistaso on liian korkea (Thim et al., 1986), tai jos Glu-Ala-sekvenssit puuttuvat (Zsebo et al. . J. Biol. Chem. 261:5858, 1986). α-faktorisysteemisså oleellinen osa fuu sioproteiinin solunsisåiselle kuljetukselle on pro-osa, koska α-faktorin signaalisekvenssi voidaan korvata muilla 30 signaalisekvensseillå, kunhan heterologisen proteiinin geenin ja signaalisekvenssin våliin sijoitetaan a-faktorin pro-osa (Sleep et al.. Biotechnology 8: 42-46, 1990; elements et al. . Gene 106:267-272, 1991). a-faktorisysteemiå kåytettåesså voidaan fuusiogeeni ilmentåå joko MFal-geenin 8 92601 oman promoottorin kontrollissa tai jonkin toisen, esim. jotain glykolyyttistå entsyymiå koodittavan geenin vahvan promoottorin kontrollissa.

5 Barl-proteaasi on yksi S. cerevisiaen kasvuliuokseen eritty-vistå proteiineista. Se siirtyy eritysreitille signaali-sekvenssinså avulla ja erittyy kasvuliuokseen samoin kuin a-faktori. Barl-proteaasi on N-glykosyloitu, eikå ilmeisesti prosessoidu kex2-proteaasilla, vaikka sisåltååkin kex2-10 proteaasin tunnistuskohtia. Barl-proteaasia on yritetty kåyttåå samalla tavalla kuin α-faktorin pre-pro-osaa vieraiden proteiinien tuottamiseksi ja erittåmiseksi hiivan kasvuliuokseen. Hyotyproteiinia koodittava geeni liitetåån BAR1-geeniin tai sen osaan, ja fuusioproteiinin pitåisi erittyå 15 tehokkaasti kasvuliuokseen. Barl-proteaasia koodittavan geenin kåytolle hyotyproteiinien erittåmiseksi on haettu patenttia (EP-patenttihakemus 220 689).

Muut hiivat heterologisten proteiinien tuotantoisåntinå 20

Saccharomvces-hiivan lisåksi myos muita hiivoja, joille on kehitetty transformaatiomenetelmiå ja ekspressiovektoreita, kehitellåån vieraiden proteiinien tuotantoisånniksi (Buck-holz ja Gleeson, Biotechnology 9:1067-1072, 1991). Kluwero-25 mvces lactis-hiiva erittåå tehokkaasti pro-kymosiinia kasvuliuokseen, S. cerevisiaen tuottaessa samaa proteiinia låhin-nå solunsisåisesti (van den Berg et al. , Biotechnology 8:135-139, 1990). Pichia pastoris tuottaa ja erittåå kasvuliuokseen lysotsyymiå (Digan et al. . Biotechnology 7:160-30 164, 1989). P. oastoriksen glykosylaatiokoneisto on eri- lainen kuin S. cerevisiaen. sillå se ei syntetisoi suuria N-glykaaneja kuten S. cerevisiae (Grinna ja Tshopp, Yeast 5:107-115, 1989). Schizosaccharomvces pombe on evolutionaa-risesti kaukana S. cerevisiaesta ja muistuttaa solusyklil- 9 92601 tåån elåinsoluja (Forsburg ja Nurse, Annu. Rev. Cell Biol. 7:227-256, 1991). Hiivan 2/x-vektorit toimivat Torulaspora delbrueckii-hiivassa. jota on perinteisesti kåytetty leivon-nassa ja sekundaarifermentaatiossa viinien valmistuksessa.

5

KEKSINNON KUVAUS

HSP150-geeni ja hsplSO-proteiini 10

Olen nyt loytånyt S. cerevisiae-hiivasta uuden erittyvån proteiinin (hspl50) ja sitå koodittavan geenin (HSP150). Proteiinin soluseinån låpåisevyys, erittyminen, glykosylaa-tio ja sååtely omaavat poikkeavia piirteitå verrattuna 15 aiemmin kuvattuihin S. cerevisiaen proteiineihin. Keksinto kåsittåå HSP150-aeenin kåyton hyotyproteiinien erittåmiseen hiivassa samalla periaatteella kuin yllå on kuvattu a-fakto-ria koodittavalle geenille ja BARl-geenille.

20 Normaalissa hiivakannassa 90% juuri syntetisoituneesta hspl50-proteiinista erittyy soluseinån låpi kasvuliuokseen. HsplSO-proteiini on siis viides tunnettu S. cerevisiaen kasvuliuokseen erittyvå proteiini. Hspl50-proteiini erittyy alkuperåisesså Golgi-spesifisesså sec7-mutantissa restrik-25 tiivisesså låmpotilassa 37°C:ssa, påinvastoin kuin kaikki muut tutkitut erittyvåt proteiinit. Hspl50-proteiinin eritys on kuitenkin riippuvaista SEC7-geenin geenituotteesta, koska sen eritys pysåhtyy 37°C:ssa takaisinristeytetysså sec7 kannassa. HsplSO-proteiini on O-glykosyloitunut di-, tri-, 30 tetra- ja pentamannosideilla. Hspl50-proteiinin sååtely poik-keaa muiden erittyvien proteiinien sååtelystå. Kun solukko siirretåån 25°C:sta 37°C:seen, nousee proteiinin tuotantotaso nopeasti ja dramaattisesti. Nåmå hspl50-proteiinin ominai-suudet on kuvattu opinnåytetydsså. Seuraavassa esitetty 10 92601 HSP150-qeenin kloonaus ja karakterisointi ja karakterisoin-nista saatu informaatio hspl50-proteiinin rakenteesta, biosynteesista, sååtelystå ja konservoituneisuudesta on uutta julkaisematonta informaatiota ja muodostaa perustan 5 kåsiteltåvånå olevalle keksinnolle.

HSP150-geeni kloonattiin seulomalla S. cerevisiaen cDNA-kirjasto oligonukleotidilla, jonka sekvenssi oli suunniteltu S. cerevisiaen kasvuliuoksesta puhdistetun hspl50-proteiinin 10 yhden peptidin aroinohapposekvenssin perusteella. Positiivis- ten cDNA-kloonien sekvensointi osoitti, ettå geeni on eri-lainen kuin minkåån nuun toistaiseksi geenipankkiin tallen-netun geenin sekvenssi. Nukleotidisekvenssin perusteella pååteltiin hspl50-proteiinin aminohapposekvenssi, joka ei 15 myoskåån muistuta muiden proteiinien sekvenssejå (kuva 1) . Neljånsadankolmentoista aminohapon pituinen primååritrans-laatiotuote koostuu amino-terminuksesta påin 18 aminohapon signaalisekvenssistå, 54 aminohapon alayksikko I:stå ja 341 aminohapon alayksikko Ilrsta. Alayksikko II koostuu suurelta 20 osin repetitiivisestå jaksosta, jossa 19 aminohapon peptidi toistuu 11 kertaa (kuva 2).

:· HSP150-geenin primååritranslaatiotuote translokoituu signaa- lipeptidinså avulla endoplasmisen kalvoston membraanin låpi 25 sen onteloon. Samalla signaalisekvenssi irrotetaan ja man-noositåhteitå kiinnitetåån kovalenttisesti seriini- ja treo-niinitåhteisiin. Proteiini siirtyy Golgin laitteeseen, jossa sokeriketjut tåydennetåån lopulliseen kokoonsa. Hspl50-proteiinissa ole ole yhtåån potentiaalista N-glykosylaatio-30 kohtaa, eikå siksi lainkaan N-glykaaneja. Sen sijaan amino-hapoista 25% on seriinejå ja treoniineja, jotka ovat poten-tiaalisia O-glykosylaatiokohtia.

Hspl50-proteiinia muokataan signaalisekvenssin irrotuksen • · 11 92601 lisåksi toisellakin proteolyyttisellå katkaisulla. Alayk-sikot I ja II irrotetaan toisistaan ja irrotus tapahtuu ilmeisesti myohåisesså Golgissa kex2-proteaasin toimesta. Alayksikot jååvåt kuitenkin prosessoinnin jålkeen toisiinsa 5 ei-kovalenttisesti kiinni, toisin kuin o-faktorin ja killer-toksiinin tapauksessa. Alayksikkojen I ja II muodostama dimeeri erittyy eritysrakkuloiden kautta solun ulkopuolelle ja diffundoituu soluseinån låpi kasvuliuokseen.

10 Hspl50-proteiini erittyy restriktiivisisså olosuhteissa sec7-mutantin lisåksi myos sec3-. seclO- ja sec21-mutan-teissa, joissa normaalisti proteiinit akkumuloituvat eritys-rakkuloihin tai endoplamiseen kalvostoon.

15 HSP150 geenin ilmentymistå såådellåån transkriptiotasolla, jolloin låmposhokki aiheuttaa mRNA-molekyylien synteesin kiihtymisen. Koska HSP150-geenin transkriptio såådellåån låmmollå, kuuluu se ns. heat shock-geeneihin (Lindquist ja Craig, Annu. Rev. Genet. 22:631-677, 1988).

20

Hspl50-proteiini nåyttåå olevan konservoitunut, sillå sen antigeenisia homologeja loytyi muista hiivoista, kuten Kluweromvces marxianuksesta ja Torulaspora delbrueckiista ja Schizosaccharomvces pombesta. Antigeenisellå homologilla 25 tarkoitetaan tåsså proteiinia, jonka anti-hspl50-antiseerumi tunnistaa. Kaikkien tutkittujen antigeenisten homologien synteesi kiihtyi låmposhokin aikana. Kaikkien hiivojen HSP150-homologigeenejå kutsutaan tåsså hakemuksessa HSP150-geeneiksi, ja nåiden geenien koodittamia proteiineja hspl50-30 proteiineiksi.

HSP150-geenin hyvåksikåytto hyotyproteiinien erityksesså

Keksinto tarjoaa uuden DNA-rakenteen hyotyproteiinien viemi- 12 92601 seksi hiivan eritysreitille ja sitå pitkin soluseinåån tai kasvuliuokseen. Uusissa plasmideissa heterologista proteii-nia koodittava geeni kytketåån oikeassa lukujaksossa HSP150 geeniin, sen osaan tai johdannaiseen. Hyotyproteiini voidaan 5 tuottaa fuusioproteiinina, jolloin hyotyproteiini irrotetaan kantajasta erityksen jålkeen, tai siten, ettå hyotyproteiini irrotetaan kantajasta Golgin kex2-proteaasin, muun prote-aasin tai kemikaalin toimesta kantajan ja hyotyproteiinin våliin sijoitetusta katkaisukohdasta.

10

Kun fuusioproteiinia koodittava yhdistelmå-DNA-rakenne transformoidaan sec-mutanttikantoihin. joissa vain hspl50-proteiini erittyy restriktiivisisså olosuhteissa, puhdistaa solukko fuusioproteiinin ei ainoastaan sellulaarisista 15 proteiineista, vaan myos muista tunnetuista erittyvistå proteiineista.

Fuusiogeeni ilmennetåån joko HSP150-geenin omien ylåvirran ja alavirran sååtelyalueiden kontrollissa, tai xnuita sååte-20 lyalueita hyvåksikåyttåen. HSP150 geenin låmposhokkipro-moottoria hyvåksikåyttåen voidaan fuusioproteiinin ilmenty-mistå såådellå låmposhokilla.

Koska hspl50-proteiinin antigeenisia homologeja ilmentyy 25 muissakin hiivoissa kuin Saccharomvceksesså. voidaan muiden-kin hiivojen HSPl50-geenejå kåyttåå fuusioproteiinien ilmen-tåmiseen joko S. cerevisiaesså tai muissa hiivoissa.

30 HSP150-GEENIN ΗYOTYKAYTON YKSITYISKOHTAINEN TARKASTELU

Jokin osa hspl50-proteiinin rakenteesta on vastuussa sen nopeasta, tehokkaasta ja helposta erittymisestå kasvuliuokseen. Sen alueen loytåmiseksi, joka saa ei ainoastaan hsp- 92601 13 150-proteiinin itsenså vaan myos fuusioproteiinin erittymåån kasvuliuokseen, liitetåån erilaisia HSP150-geenin osia vierasta proteiinia ilmentåvåån geeniin, ja fuusioproteiinin erittyminen tutkitaan. Hspl50-proteiinin voidaan olettaa 5 jakautuvan ainakin neljaan rakenteelliseen domeeniin. Nåmå ovat signaalisekvenssi (primåaritranslaatiotuotteen aminoha-pot 1-18), alayksikko I (aminohapot 19-72), alayksikko II:n repet it i ivinen alue (aminohapot 73-299), sekå alayksikko II :n repet iti ivisen alueen karboksi-terminaalinen alue 10 (aminohapot 300-413) (kuva 2).

Ensimmåisesså suoritustavassa kaytetåan f u u s i opr ot e i i n i n si i rtåmiseksi eritysreitille hsoi50-proteiin in omaa signaa-1isekvenssiå. Tcisessa suoritustavassa kaytetåan mitå tahan-15 sa toimivaa luonnollista toisen geenin signaalisekvenssia, keinotekoista signaalisekvenssia, tai hybridisignaalisekven-siå. DNA-molekyyliå, jossa HSP150-geenin signaalisekvenssi ei ole autenttinen, kutsutaan johdannaiseksi. Muunnellun signaalisekvenssin toiminta testataan måårittåmållå eritty-20 neen geenituotteen osuus syntetisoituneen geenituotteen kokona ismååråstå. Kolmannessa suoritustavassa hyotyproteiini sijoitetaan signaalisekvenssin peråån toiminnallisen hsplSO-johdannaisen amino-terminaaliselle puolelle.

25 Koska domeenien katkaisu johtaa usein proteiinien vaåraan la sk ost umi seen ja solunsisåisen kul jet u 1. s e is v aik o υ t;: m i. s e < -:: tai pysåhtymiseen, o n s y y t å f uusioi da n y o t y o rotei in i a k o o -dittavan geenin ylåvirtaan HSP150-geen:n traomentteja, potka vastaavat mahdol1isimman hyvin vllåmainittuja alayksikko I:n '30 ja II:n domeeneja koodictavia nukieotidisekvenssejå. Pstl-fragmentti (kuva 3) sisåltåå signaalisekvenssin kodonien lisåksi alayksikko I:tå koodittavan DNA:n 54:sta kodonista 45 ensimmåistå kodonia. KpnI-fragmentti sisåltåå signaa-lisekvenssiå ja alayksikkd I:tå koodittavan alueen lisåksi 14 92601 249 kodonia alayksikko II:n 341:stå kodonista, eli alayksikko II:n koko repetitiivistå aluetta koodittavan sekvenssin. Clal-fragxnentti sisåltåå koko HSP150-geenin lukuunottaroatta neljåå viimeistå kodonia. Uudet plasmidit sisåltåvåt hyoty-5 proteiinia koodittavan geenin, joka on kytketty mainittuihin HSPISO-aeenin PstI-, Kpnl- ja Clal-fragroentteihin (kuva 3). Yhdistelmå-DNA-rakenteet, jotka sisåltåvåt jonkun yllåmaini-tuista fuusiogeeneistå HSPi50-geenin oman promoottorin kontrollissa, transformoidaan erilaisiin S. cerevisiae-10 kantoihin. Kantojen tuotto tutkitaan selvittåmållå hyotypro-teiinin mååråt kasvuliuoksessa, soluseinåsså ja solun sisållå proteiinin biologisen aktiivisuuden perusteella ja ver-taainalla proteiinimååriå Western-blot-tekniikalla ja im-munopresipitaatiokokeilla.

15

Erååsså suoritustavassa kloonataan mikå tahansa HSP150-geenin funktionaalinen osa tai johdannainen hyotyprote-iinigeenin ylåvirtaan. Johdannaisissa on HSP150-DNA:ta muokattu esimerkiksi kohdennetulla mutagenisaatiolla tai 20 linkkerien lisåyksellå kloonauskohtien luomiseksi. Toinen esimerkki johdannaisista on katkaisukohtia koodittavien DNA-sekvenssien lisåys sen aikaansaamiseksi, ettå hyotyproteiini voidaan irrottaa fuusioproteiinista. Katkaisun voi tehdå proteaasi solun sisållå tai ulkopuolella, tai katkaisu 25 voidaan tehdå erittyneelle fuusioproteiinille kemiallisesti. Pstl-fragmentin tapauksessa ei hyotyproteiini irtoa kex2-proteaasin katkaisukohdan puutteen vuoksi kantajamolekyylistå, joten fuusioproteiini erittyy sellaisenaan. Kpnl- ja Clal-fragmenteissa hspl50:n alayksikko I irtoaa kex2-prote-30 aasilla, mutta alayksikko II :n sekvenssit jååvåt kiinni hyotyproteiiniin ilman hspl50-sekvenssin ja hyotyproteiinin vålille rakennettuja kex2-kohtia. Kex2-katkaisukohtien lisåys merkitsee sitå, ettå fuusioproteiinin solunsisåisen kuljetuksen tarvitsee tapahtua vain kex2-proteaasin sijain- 15 92601 tikohtaan myohåiseen Golgiin. Golgin jålkeen vapautunut hyotyproteiini jatkaa erittyiniståån. Mikål i fuusioproteiinin erittymisominaisuudet ovat paremmat kuin irrotetun hyotypro-teiinin, ilmennetåån hyotyproteiini fuusioproteiinina ilman 5 lisåttyjå katkaisukohtia ja irrotetaan se hspl50-kantajamo-lekyylistå erittymisen jålkeen joko lisåtyllå proteaasilla tai kemiallisella reagenssilla, tai kasvattamalla tuotanto-kannan joukossa samaa sukupuolta olevaa S. cerevisiae-kan-taa, joka erittåå kasvuliuokseen kex2-proteaasia (Brenner ja 10 Fuller, Proc. Natl. Acad. Sci USA 89:922-926, 1992).

Hyotyproteiini on mikå tahansa heterologinen proteiini, sen osa tai funktionaalinen johdannainen, joka halutaan erittåå hiivassa. Hyotyproteiinia koodittavaa DNA:ta saatetaan 15 muokata esimerkiksi tarpeettomien sekvenssien kuten signaa-lisekvenssin tai potentiaalisten glykosylaatiokohtien pois-tamiseksi. Mikåli hyotyproteiini tulee hiivassa glykosyloi-tuneeksi suurilla N-glykaaneilla, saattaa tållå olla haital-lisia vaikutuksia biologiseen aktiivisuuteen ja immunogeeni-20 syyteen, jolloin tuote ilmennetåån johdannaisesta, jossa glykosylaatiokohtia koodittavat kodonit on poistettu (Travi et al. . J. Biol. Chem. 260:4384-4389, 1985). Jos hyotyprote-iinin aminohapposekvenssisså on luonnostaan kex2-kohtia, jotka pilkkoutuvat hiivassa tuhoten tuotteen, valmistetaan 25 johdannainen, josta kex2-kohtia koodittavat kodonit on poistettu. Mikåli toimenpide vaikuttaa epåsuotuisasti tuotteen biologiseen aktiivisuuteen tai tuotteen erittymiseen, ilmennetåån fuusiogeeni S. cerevisiae-kannassa. josta kro-mosomaalinen KEX2-geeni on poistettu (kex2-mutantti).

30

Hiivan heikosti (geenin koodittaroaa proteiinia tuotetaan våhån) ja vahvasti (geenin koodittamaa proteiinia tuotetaan paljon) ilmennetyt geenit kåyttåvåt samoille aminohapoille eri kodoneja. Samoja aminohappoja koodaavia eri kodoneja 16 92601 kutsutaan synonyyinikodoneiksi. Kodonikåytto on erilaista hiivassa, prokaryooteissa ja nisåkkåisså (Bennetzen ja Hall, J. Biol. Chem. 257:3026-3031, 1982; Guthrie ja Abelson, The Molecular Biology of the Yeast Saccharomvces. toim. Strat-5 hern, Jones ja Broach, 1982, Cold Spring Harbor, NY). HSP-150-geenin kodonit ovat niitå, joita vahvasti ilmennetyt S. cerevisiaen geenit kåyttåvåt. Hspl50-proteiinin tuottotaso sec7-mutantissa YPD-liuokseen on 37°C:ssa yhden tunnin aikana noin 0,5-1 mg/1. Kun nisåkåsgeeniå ilmennetåån hiivassa, 10 saattaa hiivalle harvinaisempien tRNA-molekyylien saatavuus rajoittaa oleellisesti ilmentymistasoa. Tålloin voidaan syntetisoida koko heterologinen geeni kåyttåen vahvasti ilmennettyjå synonyymikodoneja (Kotula ja Curtis, Biotechnology 9:1386-1389, 1991). Nukleotidisekvenssin johdannainen 15 voidaan siis valmistaa synonyymikodoneja kåyttåen.

HSP150-rekombinanttiaeeni kloonataan mihin tahansa toimivaan vektoriin, joka on joko autonomisesti replikoituva tai genomiin integroituva. Autonomisesti replikoituvien vektori-20 en, esim. Yep-plasmidien, kopioluku per solu saattaa olla korkea, mutta niitten mitoottinen stabiilisuus voi olla riittåmåton (Bitter et al. . Methods Enzymol. 153:516-544, ' 1987) . Ne sisåltåvåt hiivan 2μ-plasmidin sekvenssin, joka

takaa autonomisen replikaation, sekå E. colin plasmidisek-25 venssin, joka takaa vektorin replikoitumisen E. colissa. Lisåksi vektorit sisåltåvåt hiivan merkkigeenin, jonka perusteella hiivatransformantit selektoidaan, sekå antibi-oottiresistenssigeenin, jonka perusteella bakteeritransfor-mantit selektoidaan. ARS- ja CEN-alueet sisåltåvåt episomaa-30 liset vektorit esiintyvåt yhtenå kopiona per solu ja ne ovat stabiileja. Integroituvia vektoreita kåytetåån, kun DNA-fragmentti halutaan viedå yhtenå tai useana kopiona genomiin. Tålloin pysyy geeni stabiilisti kannassa, eikå selek-tiivistå alustaa tarvitse kåyttåå (Struhl et al. . PNAS

17 92601 76:1035-1039, 1989; Pouwels et al.. Cloning vectors, I-VI, et seq., Elsevier, 1985; Sakai et al. . Biotechnology 9:1382-1385, 1991).

5 Vektoreissa on replikaation aloituskohta, joka toimii vali-tussa isåntåsolussa. Vektorit sisåltåvåt restriktioentsyymi-en tunnistuskohtia fuusiogeenin ja promoottoreiden sijoitta-mista vårten, sekå selektiomerkkigeenin. Vektoreita voidaan muunnella restriktioentsyymien tunnistuskohtia lisååmållå 10 tai niitå poistamalla, tai muita tarpeettomia tai haitalli-sia nukleotidisekvenssejå poistamalla. Plasmideissa voidaan asettaa HSP150-geenifuusiot minkå tahansa toimivan promoot-torin kontrolliin (Stretler et al.. Biotechnology 7:55-60, 1989) . Hiivan promoottoreista voidaan valita joko konstitu-15 tiivinen tai såådelty promoottori. Konstitutiivisista promoottoreista mainittakoon esimerkkeinå fosfoglyseraatti-kinaasigeenin (PGK) ja muiden glykolyyttisiå entsyymejå koodittavien geenien vahvat promoottorit, sekå a-faktorigee-nin tai a-faktorigeenin promoottorit. Konstitutiivista 20 promoottoria kåytettåesså syntetisoidaan proteiinituotetta koko solukasvun ajan. Såådellyistå promoottoreista mainittakoon etanolilla ja glukoosilla såådelty ADH2-promoottori, galaktoosilla ja glukoosilla såådellyt GAL1-10- ja GAL7-promoottorit, fosfaatilla såådelty PH05-promoottori ja 25 kuparilla såådelty metallotioniinipromoottori. Oman luokkan-sa muodostavat låmposåådellyt HSE-promoottorit, joihin HSP150-geenin omakin promoottori kuuluu. Myos hybridipro-moottoreita voidaan kåyttåå. Såådellyn promoottorin kåytto on edullista tapauksissa, joissa fuusioproteiinin ilmentymi-30 nen on haitallista soluille. Transformoitu solukko kasvate-taan repressoituna, tai låmpopromoottorin tapauksessa 25°C:-ssa, sopivaan tiheyteen. Sitten suoritetaan promoottorin induktio, jolloin varsinainen tuotteen synteesi alkaa tai tehostuu. Hiivapromoottorien lisåksi saatetaan kåyttåå 18 92601 vahvaa prokaryoottista promoottoria, kuten T7-promoottoria, jolloin hiivaan on transformoitava vastaavaa polymeraasia koodittava geeni. Fuusiogeenin transkription lopetussignaa-lina kåytetåån HSP150-geenin omaa terminaattoria tai muuta 5 toimivaa terminaattoria. Tåsså hakemuksessa tarkoitetaan sååtelyalueilla rakennegeenien ylåvirrassa olevia promootto-reita ja alavirrassa olevia terminaattoreita.

Keksinto ei ole rajoittunut minkåån yksittåisen vektorin, 10 promoottorin, terminaattorin, hyotyproteiinin tai isån-tåsolun kåyttoon. Suositeltavat isåntåsolut lienevåt kuiten-kin hiivoja. Saccharomvces cerevisiaen erilaisten haploidis-ten ja diploidisten kantojen lisåksi voidaan isåntånå kåyt-tåå muita hiivoja, kuten Kluyveromvces. Torulaspora. Schi-15 zosaccharomvces ja Pichia. Muut hiivat kuin Saccharomvces ovat kåyttokelpoisia silloin, kun niille on kåytettåvisså transformaatiomenetelmå, episomaalisia ja integroituvia plasmideja ja toimivia promoottoreita. Taman keksinnon kannalta oleellista on, ettå ko. hiivan eritysreitti toimii 20 tehokkaasti. Koska hspl50-proteiinin antigeenisia homologeja on Western-blot tekniikalla loytynyt useista muista hiivois-ta Saccharomvceksen lisåksi, voitaisiin naitå HSP150-geeneja kayttåå vieraiden proteiinien tuottoon ja eritykseen vastaa-vasti kuin yllå on S. cerevisiaen HSP150-geenille kuvattu. 25 Koska hspl50-proteiini erittyy tietyisså sec-mutanteissa olosuhteissa, joissa monet muut erittyvåt proteiinit jååvåt solun sisåån, hspl50-hyotyproteiini-fuusiogeenin sisåltåvå plasmidi transformoidaan nåihin sec-mutantteihin, joista mahdollisesti on tuhottu kromosomaalinen HSP150-geeni. Kun 30 transformantti on saavuttanut sopivan solutiheyden 25°C:ssa, nostetaan låmpdtila restriktiiviseksi (37°C) , jolloin useim-mat normaalisti erittyvåt proteiinit jååvåt solunsisåisiksi, mutta fuusioproteiini tai siitå Golgissa vapautunut vieras proteiini jatkaa erittymiståån. Nåin moninkertaistuu eritys- 19 92601 reitistå koituva puhdistusetu. Samalla kiihtyy HSP150-fuu-siogeenin ilmentyminen 37°C:ssa moninkertaiseksi, kun se ilmennetåån HSP150-geenin låmpopromoottorien kontrollissa. -Haittapuolena on se, ettå sec-mutanttisolut eivåt kestå 5 rajattomasti restriktiivisesså låmpotilassa vaan kuolevat. Jos solukko siirretåån låmposhokin jålkeen tunniksi takaisin 25°C:een, voidaan låmposhokki kuitenkin toistaa useita kerto-ja.

10

KUVIEN SELITYKSET

KUVA 1. GENEETTINEN SEKVENSSI HSP150 JA SIITÅ JOHDETTU hspl50-PROTEIININ AMINOHAPPOSEKVENSSI

15 HSP150-rakennegeenin ylåvirrassa on TATA-elementti kehystet-ty ja HSE-tyyppiset sekvenssit on merkitty pilkkuviivalla. HSE-tyyppisten sekvenssien ne nukleotidit, jotka ovat yh-tenevåiset HSE:n konsensus-sekvenssin kanssa, on merkitty 20 tåhdillå. Rakennegeenin alueella on avonaisella nuolenpåållå merkitty signaalisekvenssin katkaisukohta ja mustalla nuolenpåållå alayksikko I:n ja II:n vålinen katkaisukohta. Alleviivatut aminohapposekvenssit 1 ja 2 on saatu puhdiste-tun hspl50-proteiinin amino-terminaalin sekvenssoinnilla. 25 Numeroidut aminohapposekvenssit 3, 4, 5, 6 ja 7 on saatu sekvenssoimalla puhdistetun hspl50-proteiinin vilden trypti-sen peptidin amino-terminukset. Rakennegeenin alavirrassa on merkitty kaksoisalleviivauksella kaksi nukleotidisekvenssiå, • jotka muistuttavat transkription lopetussignaaleja.

30

KUVA 2. Hspl50-PROTEIINI

Paneeli A on kaavamainen esitys hspl50-proteiinista. Amino-terminuksessa on 18 aminohapon signaalisekvenssi (Ss), jota seuraa 54:n aminohapon alayksikko I (Subunit I) ja 341 :n 20 92601 aminohapon alayksikko II (Subunit II) . Signaalisekvenssi katkeaa alaniini18:n ja alaniini19 :n vålistå. Alayksikot irrotetaan toisistaan arginiini72:n ja alaniini73:n vålistå. Raidoitetut alueet esittåvåt peptidiå, joka toistuu 11 5 kertaa peråkkåin alayksikko II:ssa. Paneeli B esittåå alayksikko II:n repetitiivisen alueen aminohappojårjestyksen. Alleviivatut aminohapot kuuluvat våliosiin, jotka erottavat repetitiivisiå sekvenssejå toisistaan. Ei-konservoidut aminohappomuutokset repetitiivisesså peptidisså on merkitty 10 pisteellå. Ylåindeksi on ko. aminohapon numero primååri-translaatiotuotteessa. Aminohapot on esitetty yksi-kirjain-koodilla.

KUVA 3. HSP150-GEENIN OSIEN FUUSIOT MERKKIGEENIN RANSSA

15 Kuva A esittåå HSP150-rakennegeeniå, kuten kuvassa 2 on selostettu. Merkkigeenin (musta paksu viiva) ylåvirtaan on fuusioitu HSP150-geenin Sall-Pstl-fragmentti (B), Sall-Kpnl-fragmentti (C) tai Sall-Clal-fragmentti (D) . Rakennegeenin ylåvirrassa esittåvåt tåhdet HSE-tyyppisiå sekvenssejå ja 20 pallo TATA-elementtiå. Kirjaimet osoittavat restriktioent- syymien Sall (S), EcoRV (E), Xhol (X), PstI (P), Kpnl (K) ja Clal (C) katkaisukohtia.

KUVA 4. PLASMIDIT pKTH4506 JA pKTH4507 25 HSP150-CDNA on ligoitu Bluescript-vektorin EcoRI-kohtaan.

KUVA 5. PLASMIDI pKTH4508

Genominen HSP150-geeni YEp24-vektorin BamHI-kohdassa. Plas-«' midi pKTH4509 on restriktiokuvioltaan identtinen pKTH4508:n 30 kanssa.

KUVA 6. PLASMIDI pKTH4510 HSP150-geeni on disruptoitu URA3-geenillå.

21 92601 KUVA 7. PLASMIDIT pRS414 JA pKTH4530

Plasmidista pKTH4508 (kuva 5) on siirretty noin 4000 emåspa-rin Sall-Sall HSP150-fragmentti pRS414:n Sall-kohtaan.

5 KUVA 8. PLASMIDIN pKTH4529 VALMISTUS

Plasmidista pAAH5 on siirretty alkoholidehydrogenaasigeenin terminaattori ADH-TERM. plasmidiin pKTH4505.

KUVA 9. PLASMIDIN pKTH4536 VALMISTUS

10 Plasmidista pKTH4529 poistettiin vektorin KpnI-kohta kat-kaisemalla plasmidi Sall-kohdasta ja hajottamalla DNA:ta Bal31-nukleaasilla. Tåmån jålkeen DNA-molekyylin påat tasat-tiin Klenow-entsyymillå ja niihin ligoitiin BamHI-linkkeri (taulukko 1).

15 KUVA 10. PLASMIDI pKTH4538

Plasmidin pKTH4536 (kuva 9) noin 1000 emåsparin Pstl-Hindll-I-fragmentti on korvattu PCR-tekniikalla syntetisoidulla noin 900 emåsparin bla-geenillå.

20 KUVA 11. PLASMIDI pKTH4539

Plasmidin pKTH4536 (kuva 9) 265 emåsparin Kpnl-Hindlll- fragmentti on korvattu PCR-tekniikalla syntetisoidulla noin 900 emåsparin bla-geenillå.

25 KUVA 12. PLASMIDI pKTH4540

Plasmidin pKTH4536 (kuva 9) Clal- ja Hindlll-kohtien våliin on ligoitu PCR-tekniikalla syntetisoitu noin 900 emåsparin bla-geeni.

30 KUVA 13. PLASMIDI pKTH4542 HSP150-bal-fuusiolle kåytetty integraatiovektori.

KUVA 14. PLASMIDI pKTH4543 22 92601

Plasmidin pKTH4538 (kuva 10) HSP150-bla-fuusio on siirretty BamHI-fragmenttina pKTH4542:n Clal-kohtaan.

KUVA 15. PLASMIDl pKTH4544 5 Plasmidin pKTH4539 (kuva 11) HSP150-bla-fuusio on siirretty

BamHI-fragmenttina pKTH4542:n Call-kohtaan.

KUVA 16. PLASMIDI pKTH4545

Plasmidin pKTH4540 (kuva 12) HSP150-bla-fuusio on siirretty 10 BamHI-fragmenttina pKTH4542:n Clal-kohtaan.

KUVA 17. PLASMIDI pKTH4547

Plasmidin pKTH4544:n (kuva 15) EcoRI-kohtaan on ligoitu YEp24:n replikaatioalue (2μ) 2241 emAsparin EcoRI-fragment-15 tina.

KUVA 18. PLASMIDI pKTH4548

Plasmidin pKTH4545 (kuva 16) EcoRI-kohtaan on ligoitu YEp24-plasmidin replikaatioalue (2μ) 2241 emAsparin EcoRI-frag- 20 menttina.

KUVA 19. LacZ-FUUSIOVEKTORIT YEp353 JA YEp364

EcoRI- (E) ja Hindlll- (H) kohtien vAlissA on multilink- kerialue lacZ-fuusioiden tekemistA vårten.

25 KUVA 20. PLASMIDI pKTH4519

Plasmidin pKTH4508 (kuva 5) noin 2600 emAsparin Sall-Pstl-fragmentti on siirretty plasmidiin YEp353 (kuva 19).

30 KUVA 21. PLASMIDI pKTH4520

Plasmidin pKTH4508 (kuva 5) noin 3600 emAsparin Sall-Clal-fragmentti on siirretty Bluescript-vektorin kautta plasmidiin YEp364 (kuva 19).

23 92601

KAYTTOESIMERKIT

Seuraavat esimerkit ovat ainoastaan keksintoå kuvaavia, eivåtkå mitenkåån rajoita keksinnon piiriå tai laajuutta. 5 Kautta linjan on kåytetty molekyylibiologian yleisiå mene-telmiå, ellei toisin ole inainittu.

Restriktioendonukleaasit hankittiin New England Biolabsistå ja Promegalta, ja niitå kåytettiin valmistajan ohjeiden 10 mukaisesti. T4 DNA-ligaasi oli Promegasta ja sitå kåytettiin valmistajan ohjeiden mukaisesti. Bluescript II SK+-vektori oli Stratageneltå. DNA-polymeraasi I (Klenow-entsyymi) oli Promegalta ja sitå kåytettiin kuten on kuvattu Cold Spring Harborin kåsikirjassa (Sambrook et al. . 1989, Molecular 15 Cloning). Radioaktiiviset nukleotidit ATP ja dCTP olivat Amershamilta. E. coli-vilielmåt transformoitiin Hanahanin menetelmållå (Hanahan, J. Mol. Biol. 166:557-580, 1983). S. cerevisiae-solut transformoitiin litiumasetaatti-menetelmål-lå (Ito et al.. J. Bacteriol. 153:163-171, 1983), tai elekt-20 roporaatiolla (Becker ja Guarante, Meth. Enzymol. 194:182-187, 1991). Fenoli- ja eetteriuutot, etanolisaostukset sekå DNA-eristykset E. colista tehtiin Molecular Cloning-kåsikir-jan mukaan (Sambrook et al. , 1989). DNA-fragmentit eluoitiin agaroosigeelistå seuraavasti. Halutun DNA-fragmentin sisål-25 tåvå geelipalanen leikattiin talteen mahdollisimman pienenå palasena, joka murskattiin Eppendorf-putkessa huolellisesti paksulla lasisauvalla. Lasisauvasta huuhdottiin agaroosin muruset 200 /xl:lla TE:tå (10 mM TRIS-HCl pH 8,0, 1 mM EDTA) . Sekoituksen jålkeen putkeen lisåttiin 400-500 μΐ neutra-30 loitua fenolia ja seosta sekoitettiin voimakkaasti 1 min. Putki siirrettiin vålittomåsti nestetyppeen. Typen lakattua kiehumasta (<1 min), sentrifugoitiin suspensiota 15 min. huoneenlåmmosså. Tålloin agaroosi asettuu putken pohjalle, fenolifaasi sen påålle ja ylimmåksi jåå DNA:n sisåltåvå 24 92601 vesifaasi. Vesifaasi otettiin talteen ja fenoloitiin. Fenoli poistettiin eetteriuutoilla ja DNA saostettiin etanolilla. Oligonukleotidit syntetisoitiin Helsingin yliopiston Biotek-niikan instituutin DNA-synteesi-laboratoriossa.

5

Esimerkki 1. HSP150-geeni ja hsplSO-proteiini

Hspl50-proteiinin puhdistus ja aminohapposekvensointi.

S. cerevisiaen sec7-kantaa (H3; kaikki kåytetyt ja luodut 10 hiivakannat on esitetty taulukossa 2) kasvatettiin YPD-liuoksessa (1% hiivaekstrakti, (Oxoid Ltd. Basingstoke, Eng-lanti), 2% baktopeptoni (Difco Detroit USA), 2% glukoosi (BDH Pharmaceuticals Ltd. UK) yli yon 25°C:ssa tiheyteen 25 x 106 solua/ml. Solukko siirrettiin 15 minuutiksi 37°C:een, 15 jonka jålkeen solut keråttiin sentrifugaatiolla ja suspen-doitiin solutiheyteen 5 x 1011 solua/1 tuoretta YPD-liuosta, joka oli esilåmmitetty 37°C:seen. Solukkoa inkuboitiin 60 min 37°C:n vesihauteessa, suspensioon lisåttiin NaN3 (10 mM) ja kasvuliuos suodatettiin Seitz-filtterin låpi. Kasvuliuos 20 konsentroitiin Romicon (Amicon) ultrasuodattimella ja saostettiin 60% ammoniumsulfaatilla. Supernatantti saostettiin edelleen 90% ammoniumsulfaatilla ja presipitaatti dialysoi-·' tiin kylmåsså steriiliå tislattua vettå vastaan 48 h. Dia- lysaatti konsentroitiin kylmåkuivauksella ja ajettiin Bio-25 Gel P-200 pylvåån låpi, joka eluoitiin 20 mM Tris-HCl:lla pH 7,6. Tyhjavolyymi (void volume) keråttiin ja ajettiin Mono Q-patsaassa, joka eluoitiin 0-60% NaCl-gradientilla 20 mM Tris-HCl:ssa, pH 7,6. HsplSO-proteiini etsittiin gradien-tista Western-blot tekniikalla, jossa polyakryyliamidigee-30 lielektroforeesin (Laemmli, Nature 227:680-685, 1970) jål keen proteiinit siirrettiin nitroselluloosakalvolle såhko-virran avulla (Towbin et al. . Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76:4350-4354, 1979), ja vårjåttiin anti-hspl50-antiseerumil-la (1:1500 laimennus) ja anti-kani-IgG-molekyyleihin konju- 25 92601 goidulla alkalisella fosfataasilla. Konjugaatti ja fosfa-taasin substraatit NBT ja BCIP olivat Promegalta ja niitå kåytettiin valmistajan ohjeen mukaan.

5 Puhdistettu hspl50-proteiini pilkottiin trypsiinillå, ja peptidit eroteltiin kåånteisfaasikromatografialla. Seitsemån peptidin amino-terminaaliset aminohapposekvenssit mååritet-tiin automaattisella kaasufaasisekvenaattorilla, johon on kytketty "on-line" PTH-axninohappoanalysaattori (Kalkkinen ja 10 Tilgman, J. Prot. Chem. 7:242-243, 1988).

HSP150-qeenin kloonaus ja karakterisointi. HSP150-geeni kloonattiin oligonukleotidiseulonnalla. Peptidi nro 5:n (kuva 1) sekvenssiå vastaava 38:n nukleotidin synteettinen 15 oligonukleotidi T8977 (taulukko 1) leimattiin γ-32Ρ-ΑΤΡ:llå T4 polynukleotidikinaasia kåyttåen (Sambrook et al., Molecular Cloning, 1989). Koettimella seulottiin yli 300000 hiivan cDNA-lgtll-kirjaston plakkia (Benton ja Davis, Science 196:180-182, 1977). Positiiviset DNA-fragmentit kloonattiin 20 Bluescript II SlC-vektoriin (Stratagene), ja kahdesta kloo-nista sekvensoitiin molemmat juosteet (Sanger et al. , PNAS 74:5463-5467, 1977). Nåille plasmideille annettiin nimet pKTH4506 ja pKTH4507, ja ne erosivat toisistaan vain orien-taation suhteen (kuva 4) . HSP150-rakennegeenillå tarkoi-25 tetaan nukleotidisekvenssiå +1 - +1239, joka koodittaa aminohapposekvenssiå 1 - 413.

Nukleotidisekvenssistå johdettu HSP150-geenin 413 aminohapon pituinen primååritranslaatiotuote alkaa amino-terminaalisel-30 la 18 aminohapon signaalipeptidillå, jonka rakenne muis-tuttaa muita hiivan signaalipeptidejå. Tunnusmerkkejå ovat kaksi emåksistå aminohappoa (Lys^-Lyss) amino-pååsså, hydro-fobisten aminohappojen ketju signaalipeptidin ydinosassa, ja pienet apolaariset aminohapot Thr16 ja Ala18 signaalipeptidin • 26 92601 katkaisukohdassa. Kasvuliuoksesta puhdistetun hspl50-prote-iinin N-terminuksen suora aminohapposekvensointi paljasti kaksi N-terminusta ekvimolaarisissa suhteissa (kuvassa 1 alleviivatut sekvenssit 1 ja 2). Tåmå osoittaa, ettå signaa-5 lipeptidi irtoaa, ja ettå polypeptidiketju katkaistaan aminohappojen Arg72 ja Ala73 vålistå, jolloin syntyy 54 aminohapon alayksikko I, ja 341 aminohapon alayksikko II. Katkaisukohta on kex2-proteaasille tyypillinen, koska sen N-terminaalisella puolella on kaksi peråttåistå emåksistå 10 aminohappoa Lys71-Arg72. Noin kaksi kolmasosaa alayksikko II:n rakenteesta koostuu 19 aminohapon peptidistå, joka toistuu 11 kertaa peråkkåin. Joissakin våleisså on ylimååråisiå aminohappoja, useimmissa tapauksissa repetitiiviset yksikot ovat liittyneet suoraan toisiinsa. Repetiiviset jaksot ovat 15 hyvin konservoituneet, vain joitakin ei-konservatiivisia aminohappomuutoksia on tapahtunut (kuva 2).

HSP150-geenin sååtelyalueet. HSP150-geenin sååtelyalueiden karakterisointia vårten kloonattiin HSP150-geeni S. cere-20 visiaen genomisesta kirjastosta (Carlson ja Botstein, Cell 28:145-154, 1982), kåyttåen koettimena HSP150-cDNA-kloonia. joka oli leimattu random primer-tekniikalla a-32P-CTP: lla (Feinberg ja Vogelstein, Anal. Biochera. 132:6-13, 1983)

Multiprime DNA Labelling System-kittiå (Amersham) kåyttåen. 25 Kirjastosta otettiin talteen kaksi positiivista kloonia, jotka olivat restriktiokuvioiltaan identtiset. Niille annet-tiin nimet pKTH4508 ja pKTH4509. pKTH4508 (kuva 5) subkloo-nattiin ja sekvensoitiin. HSP150-geenin koodaava alue sekå yla- ja alavirran sekvenssit mååritettiin kummastakin juos-30 teesta. Aloituskodonin ATG ylåvirtaan sekvensoitiin 396 nukleotidia. Avoin lukukehys alkaa nukleotidistå +l:sta ja jatkuu 3'-suuntaan nukleotidiin +1239. Rakennegeenin alavir-taan sekvensoitiin 413 nukleotidia. Kuvassa 1 on esitetty geneettinen sekvenssi HSP150. joka ulottuu 5'-pååstå nukle- 27 92601 otidista -396 3'-pååhån nukleotidiin +1652. Geenin alavir-rassa on kaksi transkription lopetussignaalia (kuva 1), TATATA (Russo et al.. EMBOJ. 10:563-571, 1991), sekå TTTTTTTTATA (Henikoff ja Cohen, Mol. Cell. Biol.

5 4:1515-1520, 1984).

HSP150-geenin sååtely tapahtuu transkriptiotasolla, koska HSP150 mRNA:n måårå nousee låmposhokin seurauksena Northern-blot analyysin perusteella. Northern-blot analyysi tehtiin 10 erottelemalla formaldehydiagaroosigeelielektroforeesilla S.

cerevisiaen totaali-RNA, ja siirtåmållå se nailonkalvolle (Sherman et al♦, Laboratory Manual for Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 1986). Kalvo hybridisoitiin yli yon 42°C:ssa HSP150 15 cDNA-kloonilla, jota kåytettiin edellå hiivan genomisen kirjaston seulontaan. HSP150-geenin ylåvirrassa on TATA-ele-mentti alueella (-127) - (-131), ja låmpopromoottorisekvens-sejå (HSE = lampopromoottori) alueilla (-103) - (-115), (-185) - (-197), (-162) - (-174) ja (-269) - (-282) (kuva 20 1) . TATA-elementti vastaa useimpien geenien ilmentymisen perustasosta. DNA:sta riippuvaisen RNA-polymeraasin moittee-ton toiminta edellyttåå useitten transkriptiofaktoreiden sitoutumista DNA:han, joista ainakin TFIID-faktori sitoutuu TATA-elementtiin (Hahn et al.. PNAS 86:5718-5722, 1989).

25 Yllåmainittu HSP150-geenin TATA-elementti on ilmeisesti funktionaalinen, koska konstruktio, jossa on vain 137 sååte-lyalueen emåsparia, ilmentåå HSP150 mRNA:ta (kuvat 1 ja 3). Toimivan HSE:n on osoitettu sisåltåvån våhintaån kolme GAA ja TTC motiivia, jotka vuorottelevat kahden nukleotidin 30 pååsså toisistaan (Amin et al.. Mol. Cell. Biol. 8:3761- 3769, 1988). S. cerevisiaessa on kuvattu useita toimivia HSE:jå, joiden sekvenssi ei tåysin vastaa konsensusta. HSP150-geenin HSE-tyyppinen sekvenssi _115GAAGTCTAACGACA_103, TATA-elementin alavirrassa, riittåå HSP150 geenin låmposåå- 28 92601 telyn aikaansaaxniseen, koska rakenne, joka sisåltåå sååtely-alueella vain TATA-elementin ja tåmån HSE:n (kuvat 1 ja 3) , ilmentåå HSP150 mRNA:ta låmposååtelyn alaisena.

5 Hspl50-proteiinin erittyminen. Kromosomaalisen HSPl50-geenin tuottaman hspl50-proteiinin erittyminen selvitettiin im-munopresipitaatiokokeessa seuraavasti. Hl-kantaa kasvatet-tiin yli yon YPD-liuoksessa 2 5°C:ssa. 2 x 108 solua suspen-doitiin tuoreeseen YPD-liuokseen, johon lisåttiin 50 /xCi 35S-10 metioniinia. Solukkoa inkuboitiin 60 min 25°C:ssa tai 37°C:-ssa. Leimaus lopetettiin lisååmållå suspensioon NaN3 (10 mM), solut erotettiin supernatantista sentrifugaatiolla ja hajo-tettiin lasihelmillå. Toiset samalla tavalla leimatut solut erotettiin supernatantista ilman NaN3-lisåystå sentrifugoi-15 malla, leimausliuos poistettiin ja solut suspendoitiin 400 Ml:aan tuoretta YPD-liosta, jossa oli 100 μg/ml sykloheksi-midiå. Solukkoja inkuboitiin tunti 25°C:ssa, lisåttiin nat-riumatsidia, solut erotettiin supernatanteista ja hajoi-tettiin kuten yllå. Supernatanteista ja solulysaateista 20 otettiin 200 μ1:η nåytteet, joihin lisåttiin 200 μΐ NET-puskuria (0,05 M TRIS-HCl, pH 8,0, 5 mM EDTA, 0,4 M NaCl, 100 U/ml aprotinin, 1% NP-40) , 8 μΐ 100 mM fenyylimetyy- lisulfonyylifluoridia ja 4 μΐ anti-hspl50-antiseerumia. Nåytteitå inkuboitiin ravistellen 90 min kylmåsså, lisåttiin 25 100 μΐ 5% proteiini-A-Sepharosea (Pharmacia) NET-puskurissa, ja inkubaatiota jatkettiin 90 min kylmåsså. Proteiini-A-Sepharose-helmet sentrifugoitiin putkien pohjaan ja pestiin kahdesti NET-puskurilla, joka oli laimennettu 1:1 vedellå, sitten kahdesti pesupuskurilla (0,1 M TRIS-HCl, pH 7,5, 0,2 30 M NaCl, 2 M urea, 0,5% Tween 20), sitten 1% Ø-merkap-toetanolilla ja lopuksi 0,1% SDS:llå. Sepharose-helmiin sitoutuneet radioleimautuneet proteiinit analysoitiin SDS-polyakryyliamidigeelielektroforeesilla ja autoradiografial-la. Immunopresipitaatiokoe osoitti, ettå 37°C:ssa leimatussa • · ' 29 92601

Hl-kannassa noin 90% leimautuneesta hspl50-proteiinista oli erittynyt YPD-liuokseen ja noin 10% loytyi soluista. So-lusidonnainen proteiini oli kypsån hspl50-proteiinin kokois-ta. Kun solukkoa inkuboitiin edelleen radioleiman poistami-5 sen ja sykloheksimidin lisåyksen jålkeen, eritti solu enåå alle 10% siitå hspl50-mååråstå, minkå se eritti leimauksen aikana. Kun leimaus tehtiin 25°C:ssa, oli valtaosa hspl50-proteiinista jålleen erittynyt YPD-liuokseen, mutta hspl50-proteiinin kokonaismåårå oli noin 8-kertaa pienempi kuin 10 37°C:ssa leimatun hspl50-proteiinin måårå. Samanlaiset tulok-set saatiin H3-solukolle, mikå osoittaa, ettå hspl50-prote-iini erittyy H3-kannassa sec7-xnutaatiosta huolimatta kuten villityyppikannassa. Myos kex2-mutanttisolukko eritti im-munopresipitaatiokokeen perusteella hspl50-proteiinia.

15 HSP150-aeenin disruptio. Jotta HSP150-geenin sååtelyå ja ilmentymistå voitaisiin tutkia geeniteknologisesti aikaan-saaduin muunnoksin, tuhottiin S. cerevisiaen kromosomaalinen HSP150-geeni geenidisruptiolla (Rothstein, Methods Enzymol. 20 194:281-301, 1991). HSP150-geeni siirrettiin noin 4000 einåsparin Sall-fragmenttina pKTH4508:sta (kuva 5) Bluescript II SlC-vektoriin, josta oli ensin Pstl-kohta poistettu. HSP150-geenisså on kaksi Pstl-kohtaa, joista toinen sijait-see alayksikko I:tå koodittavalla alueella ja toinen alayk-25 sikko II:ta koodittavalla alueella repetitiivisen alueen 3'-pååsså. Pstl-kohtien våliin jååvå 720 einåsparin fragmentti poistettiin Pstl-kåsittelyllå ja erottelemalla fragmentit agaroosigeelielektroforeesilla. Geelistå puhdistetun frag-mentin yksijuosteiset DNA-pååt tasattiin T4 DNA-polymeraa-30 silla (Sambrook et al., Molecular Cloning, 1989). Nåin saatuun plasmidiin ligoitiin URA3-geeni noin 1000 einåsparin Hindlll-fragmenttina, jonka pååt oli tasattu T4 DNA-polyme-raasilla. Uuden plasmidin (pKTH4510) (kuva 6) URA3-geenin 5'-puolella on noin 2000 einåsparin ja 3'-puolella noin 1000 30 92601 emåsparin palat hiivan kromosomaalista DNA:ta. pKTH4510 transformoitiin diploidiin S. cerevisiae-kantaan H246, jossa plasmidin kantama tuhottu HSP150-geeni korvaa yhden kro-mosomaalisen HSP150-alleelin homologisella rekombinaatiolla.

5 Transformanttien joukosta seulottiin ne kloonit, jotka pystyivåt kasvamaan ilman urasiilia. Kloonit itioitettiin ja askuksista eroteltiin itiot erilleen. Kaikki URA+-itiot pystyivåt muodostamaan solukkoja, joten HSP150-geenin tuho-aminen ei vaikuttanut hiivan elinkykyyn. Ehjån HSPl50-geenin 10 puuttuxninen solukkojen DNA:sta osoitettiin Southern hybri-disaatiolla, ja ehjån HSP150-mRNA:n puuttuminen Northern hybridisaatiolla (Sambrook et al. , Molecular Cloning, 1989). Yhden ition tuottama disruptoitu kanta nimettiin H23:ksi. HSP150-geeni tuhottiin myos haploidisesta H3-kannasta trans-15 formoimalla solukko pKTH4510-plasmidilla. H3-disruptantti nimettiin H275-kannaksi.

Plasmidi-peraisen hsplSO-proteiinin erittyminen. Hiivakan-taan, josta kromosomaalinen HSP150-geeni oli tuhottu, siir-20 rettiin saman geenin muunnelma plasmidissa seuraavasti. Sama 4000 emåsparin Sall-fragmentti, joka sisåltåå ehjån HSP150-geenin ja jota kåytettiin edellå HSP150-geenin tuhoamiseen, ; siirrettiin pRS414-vektorin (kuva 7) multilinkkerialueelle (Sikorski ja Hieter, Genetics 122:19-22, 1989). Uuden plas-25 midin nimi on pKTH4530 (kuva 7). Koska vektori sisåltåå au-tonomiseen replikaatioon tarvittavan alueen (ARS) sekå sentromeerin (CEN), pysyy plasmidi stabiilisti solulinjassa ja esiintyy solussa yhtenå kopiona. pKTH4530 transformoitiin H275-kantaan, ja transformantit seulottiin tryptofaani-30 selektiolla. Uuden kannan numero on H284. Northern-analyysi, jossa kåytettiin HSP150 cDNA:ta koettimena, osoitti, ettå H284-kannan plasmidin HSP150-geenin transkriptio oli saman-laisen låmposååtelyn alaisena kuin kromosomaalisen HSP150-geenin transkriptio. H284-solukko leimattiin 37°C:ssa raeta- 31 92601 bolisesti 35S-metioniinilla, ja supernatantti ja solulysaatti analysoitiin immunopresipitaatiokokeessa, kuten ylla on kuvattu. Myos H284-kanta eritti yli 80% hspl50-proteiinista YPD-liuokseen.

5

Esimerkki 2. Escherichia colin TEM fi-laktamaasin fuusioimi-nen HSPl50-qeenin osiin ja fuusioproteiinien ilmentyminen S. cerevisiaessa 10 HSP150-bla-fuusioiden valmistus. E. colin β-laktamaasi on penisillinaasientsyymi, jota koodittaa bla-geeni. β-lakta-maasilla on oma signaalisekvenssi, joka vie sen E. colin periplasmaan (Sutcliffe, Proc. Natl. Acad. Sci USA 75:3737-3741, 1978) . S. cerevisiaessa sellaisenaan ilmennetty β- 15 laktamaasi jåå 90%:isesti solun sisåån, 10%:n kulkeutuessa hiivan soluseinåån (Roggenkamp et al., J. Biol. Chem. 260:1-508-1512, 1985) .

E. colin bla-geeni ilman signaalisekvenssiå koodittavia 20 nukleotidejå fuusioitiin eri mittaisten HSP150-geenin frag-menttien 3'-pååhån. Kaikissa fuusioissa on mukana HSP150-rakennegeenin ylavirta-alueita yli 2000 emåsparia ja itse rakennegeeniå joko 189 emåsparia (Sall-Pstl-fuusio), 962 -! emåsparia (SalI-KpnI-fuusio) tai 1226 emåsparia (Sall-Clal- 25 fuusio). Kaikki fuusiot sisåltåvåt HSP150:n signaalipeptidin kodonit. Sall-PstI-fuusiossa on sen lisåksi 45 kodonia alayksikko I-DNA:n 54:sta kodonista. Sall-KpnI-fuusiossa on kaikki alayksikko I:n kodonit ja alayksikko II:n 249 ensim-måistå kodonia, jotka koodaavat koko repetitiivisen alueen.

‘ 30 SalI-Clal-fuusiossa on β-laktamaasi-geeni liitetty HSP150- geeniin, josta puuttuu neljå viimeistå kodonia (kuva 3).

HSP150-bla-fuusiot rakennettiin pKTH4505-plasmidiin (kuva 8), jossa genomisen kloonin, pKTH4508, Sall-Clal-fragmentti 32 92601 on siirretty Bluescript-vektoriin. Koska pKTH4505-plasmidis-ta puuttuu HSP150-geenin transkription lopetussignaalit, ligoitiin Clal-kohdasta alavirtaan S. cerevisiaen alkoholi-dehydrogenaasigeenin terroinaattorifragmentti (ADH-TERM.)· 5 Terminaattori irrotettiin pAAH5-plasmidista (Ammerer, Methods Enzymol. 101:192-201, 1983) 450 emåsparin Hindlll-

BamHI-fragmenttina, ja ligoitiin pKTH4505-plasmidiin Hindll-I-BamHI-valiin (kuva 8) . Tunnistuskohdat kyseisille rest-riktioendonukleaaseille sijaitsevat Clal-kohdasta alavir-10 taan. Nåin saadulle plasmidille annettiin numero pKTH4529 (kuva 8).

pKTH4529-plasmidia tåytyi vielå muokata bla-fuusioiden teke-mistå vårten, koska Sall-KpnI-fuusiossa HSPl50-geenin ja 15 bla-geenin vålinen liitos oli pååtetty tehdå HSP150-sekvens-sin KpnI-kohtaan ja samassa plasmidissa oli toinenkin Kpnl-kohta vektorin multilinkkerialueella. Jålkimmåinen Kpnl-kohta poistettiin seuraavasti. pKTH4529-plasmidi linearisoi-tiin Sall-entsyymillå. DNA:ta hajotettiin vapaista påistå 20 låhtien Bal31-nukleaasilla (Promega) seuraavasti: 3,5 μq

linearisoitua pKTH4529-plasmidia inkuboitiin Bal31-nukleaa-sin (0,25 U) kanssa 30°C:ssa valmistajan suosittelemassa • puskuriliuoksessa (20 mM TRIS-HC1 pH 8,0, 0,6 M NaCl, 12 mM

CaCl2, 12 mM MgClz, 10 mM EDTA) 60 μ1:η kokonaistilavuudessa. 25 20 μ1:η nåytteet otettiin 10, 15 ja 20 minuutin kuluttua reaktion aloittamisesta, ja reaktio pysåytettiin lisååmållå kuhunkin nåytteeseen 5 μΐ 100 mM EGTA:ta ja siirtåmållå ne jåille. Bal31-nukleaasi inaktivoitiin kuumentamalla nåytteet 65°C:ssa 15 min, minkå jålkeen nåytteistå poistettiin nukle-30 aasi fenoliuutolla ja DNA konsentroitiin etanolisaostuksel-la. Ennen fenoliuuttoa nåytteistå otettiin 2 μ1:η eråt, jotka analysoitiin agaroosigeelisså, jotta voitaisiin arvi-oida nukleaasin syomån DNA:n pituus. DNA-molekyylien pååt tasattiin Klenow-entsyymillå (Sambrook et al. . 1989, Molecu- 33 92601 lar Cloning) ja niihin ligoitiin 8 emåsparin BamHI-linkkeri (Promega, taulukko l) seuraavasti. Vektoria ja linkkeria yhdistettiin moolisuhteessa 1:2. Vektorin kokonaismåårå oli 100 ng. Ligaatio tehtiin kuten on kuvattu (Sambrook et al., 5 1989, Molecular Cloning). Ligaatioseos transformoitiin E.

coli XL-1 Blue-kantaan (Stratagene), ja transformantit selektoitiin L-ampisilliini (100 Mg/ml) maljoilla. Neljåstå-kymmenestå erillisestå transformantista eristettiin DNA:t alkalisella hajotusmenetelmållå (Sambrook et al. . 1989, 10 Molecular cloning). BamHI- ja KpnI-digestioilla etsittiin sellaiset transformantit, joilla oli BamHI-linkkeri ja joilta Bal31-nukleaasi oli syonyt halutun KpnI-kohdan pois. Tållaisilla transformanteilla on kaksi BamHI-kohtaa ja vain yksi KpnI-kohta HSP150-geenin sisållå. Nåitå oli 40 tutkitun 15 joukossa 3. Niille tehtiin vielå BamHI-EcoRV-digestio, jotta saataisiin arvioitua, kuinka paljon Bal31 oli lyhentånyt DNA-juostetta. Jatkoon valittiin plasmidi, jolta Bal31 oli syonyt DNArta noin 100 emåsparia HSP150-geeniin påin, ja se nimettiin pKTH4536:ksi (kuva 9) . Genomisessa HSP150-geenin 20 Sall-fragmentissa oli 276 emåsparia pBR322-peråistå sekvens-siå (tetrasykliiniresistenssigeenin BamHI(Sau3AI)-Sall-pa-la) , joka juontuu geenipankista, josta HSP150 alunperin : kloonattiin. Tulevia DNA-konstruktioita ajatellen on hyvå, ettå Bal31 on poistanut pBR322-peråistå sekvenssiå, koska 25 sama sekvenssi on myos siinå vektorissa, jossa HSP150-bla-fuusio viedåån hiivaan. Nyt pKTH4536-plasmidi oli valmis β-laktamaasifragmenttien liittåmiselle.

Koska /?-laktamaasigeenisså ei ole sopivaa restriktioentsyy-30 min tunnistuskohtaa signaalisekvenssin ja kypsåå entsyymiå koodittavan geeniosan rajalla, syntetisoitiin /9-lakta-maasigeeni in vitro polymerase chain reaction-tekniikalla (PCR, Sambrook et al., Molecular Cloning, 1989). Samalla saatettiin ottaa bla-geenistå vain kypsåå entsyymiå koodit- 34 92601 tava osa ja luoda sopivat restriktioentsyymien (Pstl, Kpnl ja Clal) tunnistuskohdat oikeissa lukujaksoissa β-lakta-maasigeenin eteen. PCR-tekniikalla voidaan monistaa erilai-sia DNA-fragmentteja, jos niiden alku- ja loppupaån sekvens-5 sit tunnetaan. Halutun fragmentin alkuun ja loppuun synte-tisoidaan oligonukeotidit DNA-synteesiin alukkeiksi tunnet-tujen sekvenssien mukaisesti. Samalla voidaan oligonukleoti-dien avulla tehda muutoksia siile alueelle, jolle aluke pariutuu. Lisaksi alukkeiden 5'-påihin voidaan syntetisoida 10 restriktioentsyymien tunnistuskohtia. Templaatti-DNA denatu- roidaan, jolloin sen vast injuosteet eroavat toisistaan. Alukkeiden annetaan pariutua templaatin kanssa kohdesekvens-seihinså. Taman jålkeen DNA-polymeraasi syntetisoi alukkeis-ta alkaen DNA:ta kopioiden templaatin nukleot.idijårjestyk-15 sen. PCR-reaktiossa kåytetåån låmpoå kestaviå polymeraaseja, jotta denaturointi, alukkeiden pariutuminen ja synteesivaihe voidaan toistaa useita kertoja peråkkåin lisaåmåttå valillå entsyymiå.

20 β-laktamaasigeeni syntetisoitiin kåyttåmållå templaattina.5 ng pUC8-plasmidia, joka oli linearisoitu multilinkkerialueen EcoRI-kohdasta. pUC8-plasmidin koodittamassa β-lakta-maasigeenisså on alkuperaiseen geeniin verrattuna se etu, etta siita on tuhottu geenin Pstl-kohta, mikå helpottaa 25 HSPl50-bla-fuusioiden tekemista. Alukkeina synteesissa kaytettiin oligonukleotidia 91683 5'-paåhan Kpnl- ja Clal-fuusioita vårten, seka oligonukleotidia 2659 PstI-fuusiota vårten, ynna oligonukleotidiå 91684 3'-paåhan (taulukko 1). Oligonukleotidien 91683 (42 nukleotidia), 91684 (32 nukle- 30 otidia) ja 2659 (30 nukleotidia) sulamislåmmot pariutuessaan templaattiin olivat 56°C, 54°C ja vastaavasti 5R°C. Oligonuk-leotidillå 91683:11a luotiin bla-geenin 5'-påahån Clal-, Kpnl- ja PstI-entsyymien tunnistuskohdat, tasså jarjestyk-sessa. Oligonukleotidilla 2659 luotiin bla-geenin 5'-paahan 35 PstI-entsyymin tunnistuskohta. Oligonukleotidilla 91684 luotiin bla-geenin 3'-pååhån Hindlll-entsyymin tunnistuskohta. PCR-reaktiossa kaytettiin 35 92601 2/5 U Pyrococcus furiosus-bakteerin Pfu-DNA-polymeraasia (Stratagene). Oligonukleotidien konsentraatio PCR-reaktiossa oli 1 μΜ, deoksiribonukleotidien konsentraatio oli 200 μΜ, kokonaistilavuus oli 50 μΐ. Reaktiossa kåytettiin Stratage-5 nen yli 500 emasparia pitkille DNA-fragmenteille suosittele-maa ja valmistamaa puskuria il. DNA:ta monistettiin 30 syklin verran. Denaturaatio suoritettiin 94°C:ssa 1 min, pariutuminen 51°C:sså 1 min, ja DNA-synteesi 72°C:ssa 2 min. PCR-reaktiossa syntyi oikean mittaiset 907 ja 834 emåsparin 10 DNA-fragmentit, jotka digestoitiin Sall-PstI-fuusiota vårten PstI- ja Hindlll-entsyymeilla, Sall-KpnI-fuusiota vårten Kpnl- ja Hindlll-entsyymeilla ja Sall-Clal-fuusiota vårten Clal- ja Hindlll-entsyymeilla.

15 β-laktamaasigeenin liittaminen HSP150-qeenin fragmentteihin suoritettiin seuraavasti. pKTH4536-plasmidi digestoitiin PstI- ja Hindlll-entsyymeilla SalI-PstI-fuusiota vårten, Kpnl- ja Hindlll-entsyymeilla Sall-KpnI-fuusiota vårten seka Clal- ja Hindlll-entsyymeilla Sall-Call-fuusiota vårten. 20 Sall-PstI- sekå Sall-KpnI-fuusioita vårten digestoidut DNA:t ajettiin agaroosigeelisså, jolloin vektori saatiin erotettua HSP150-fragmentista, joka korvattaisiin bla-geenillå . Vekto-riosa eristettiin ja puhdistettiin agaroosigeelistå. Sall-Clal-fuusiossa Clal- ja Hindlll-kohdat ovat aivan toistensa 25 vieresså niin, ettei mitaån erotettavaa fragmenttia jaa niiden våliin. PCR-tekniikalla valmistetut ja sen jålkeen digestoidut bla-geenit ligoitiin pKTH4536-plasmidin yllå-mainitulla tavalla valmistettuihin vektoriosiin. Ligaa-tioseos transformoitiin E. coli DH5a-kantaan (GIBCO BRL) , 30 jotka maljattiin L-ampis.illiinimal joille . Transformanttien joukosta seulottiin insertilliset seuraavasti. Yli yon kasvanutta bakteerimassaa suspendoitiin 50 μΐ:aan GET-liuos-ta (25 mM TRIS-HC1 pH 8,0, 10 mM EDTA, 0,5 % glukoosi), solut hajotettiin lisååmållå 5 μΐ SDS-NaOH-EDTA-liuosta (5 % 36 92601 SDS, 500 mM NaOH, 50 mM EDTA) ja inkuboitiin 30 min 68°C:-ssa. Solulysaattiin lisåttiin 6 /il 50 % glyserolia, jossa oli 10 mM TRIS-HC1 pH 8,0, 10 mM EDTA, 0,1 % SDS, 0,2 % bromifenolisinistå, ja nåytteestå pipetoitiin 25 μΐ 0,8 % 5 agaroosigeeliin. Insertillisten transforroanttien plasmidi-DNA:t eristettiin ja analysoitiin restriktioentsyymein. Kustakin fuusiosta loytyi halutunlainen transformantti. Ne nimettiin seuraavasti: pKTH4538 = Sall-Pstl-fuusio (kuva 10), PKTH4539 = Sall-KpnI-fuusio (kuva 11) ja pKTH4540 = 10 Sall-Call-fuusio (kuva 12) . Nåin valmistetuissa plasmideissa esiintyy /B-laktamaasirakennegeeni kahteen kertaan: E. coli-selektiomarkkerina ja HSP150-bla-fuusioissa. Koska kåytetyt E. coli-isåntåkannat ovat rekombinaatiomutantteja (recA), ei tåstå ole haittaa, koska geenit eivåt helposti rekombinoidu 15 keskenåån. Hiivasta ei ole vastaavia mutanttikantoja, joten fuusiot siirrettiin seuraavalla tavalla vektoriin pKTH4542 (kuva 13), jossa selektiomarkkerina on tetrasykliiniresis-tenssigeeni. Plasmideista pKTH4538, pKTH4539 ja pKTH4540 eristettiin HSP150-bla-fuusiot ss4000:n, =s4700:n ja «5000:η 20 emåsparin BamHI-fragmentteina. Fragmenttien pååt tasattiin Klenow-entsyymillå ja ne ligoitiin pKTH4542-plasmidiin, joka oli katkaistu Clal-entsyymillå ja pååt oli tasattu Klenow-: . entsyymillå. Nåin saadut plasraidit pKTH4543 (kuva 14), pKTH4544 (kuva 15) ja pKTH4545 (kuva 16) eivåt replikoidu 25 hiivassa, joten plasmidien pKTH4544 ja pKTH4545 EcoRI-koh-taan ligoitiin vielå YEp24-plasmidista eristetty 2241 emåsparin 2/x-replikoni EcoRI-palana. Nåin saatiin plasmidit pKTH4547 (kuva 17) ja pKTH4548 (kuva 18). Ne transformoitiin E. coli DH5a-kantaan ja transformanttien joukosta etsittiin 30 insertilliset. Nåiden plasmidirakenne varmistettiin oikeaksi restriktioentsyymein, ja kyseiset plasmidit transformoitiin S. cerevisiaen Hl- ja H3-kantoihin elektroporaatiomenetel-mållå ja transformantit seulottiin urasiili-selektiolla. Plasmidilla pKTH4548 transformoidulle Hl-kannalle annettiin 37 92601 nimi H329, ja plasmidilla pKTH4547 transformoidulle Hl-kannalle H331.

Genomiin integroituvien plasmidien valmistamiseksi katkais-5 tiin plasmidit pKTH4543 (kuva 14) , pKTH4544 (kuva 15) ja pKTH4545 (kuva 16) URA3-geenin Ncol-kohdasta, ja transfor-moitiin Hl-kantaan. Transformantit seulottiin urasiiliselek-tiolla. Plasmidilla pKTH4543 transformoitu Hl-kanta on H333, plasmidilla pKTH4544 transformoitu Hl-kanta on H335, ja 10 plasmidilla pKTH4545 transformoitu Hl-kanta on H337.

Hspl50-/?-laktamaasi-fuusioproteiinien ilmentyminen ja erit-tyminen. HSP150-bla-fuusiogeenien ilmentyminen transforman-teissa H329, H331, H335 ja H337 tarkistettiin kåyttåmållå 15 kromogeenista substraattia, nitrocefiiniå, jonka /3-laktamaa-si hajoittaa punaiseksi yhdisteeksi (Simons et al.. J. Mol. Biol. 126:673-690, 1978). Selektiivisellå alustalla kasva-tettuja transformanttipesåkkeitå suspendoitiin selektiivi-seen kasvatusliuokseen (2 x 10® solua/400 μΐ) ja inkuboitiin 20 tunti 37°C:ssa. Kun supernatanteista poistettiin solut, ja niihin lisåttiin nitrocefiiniå, muuttuivat liuokset punai-siksi, osoittaen, ettå transformantit erittivåt uutta prote-iinia, jolla oli Ø-laktamaasiaktiivisuutta.

25 HSP150-bla (Kpnl)-fuusiogeenillå transformoidussa Hl-kannas-sa (H331) tutkittiin fuusioproteiinin erittymistå seuraavas-ti. H331- ja Hl-kantaa kasvatettiin synteettisesså kemialli-sessa liuoksessa, josta puuttui urasiili, 25°C:ssa absorbans-siin A600=l/3. Solut erotettiin supernatanteista sentrifugaa-30 tiolla, ja hajotettiin lasihelmillå. Solulysaatti- ja super-natanttinåytteet analysoitiin Western blot-menetelmållå kåyttåen anti-hspl50-antiseerumia laimennoksena 1:1500 ja anti-/3-laktamaasi-antiseerumia laimennoksena 1:1000. Kummal-lakin antiseerumilla saatiin sama tulos. Supernatantissa 38 92601 nåkyi yksi 155 kD:n kokoinen proteiini, joka on hspl50 (Kpnl) -/3-laktamaasi-fuusioproteiini. Solulysaatissa oli samankokoinen proteiini, jonka måårå oli noin kym-menesosa supernatantissa olevan proteiinin mååråstå. Solu-5 lysaatissa nåkyi lisåksi 105 kD:n ja 100 kD:n proteiinit, joiden yhteismåårå oli noin 5% supernatantissa olevan proteiinin mååråstå. Koska myos 105 kD:n ja 100 kD:n proteiinit vårjåytyivåt kummallakin antiseerumilla, edustavat ne ko. fuusioproteiinin biosynteettisiå intermediaatteja. H331-10 kannan tuottaman yhdistelmåproteiinin /3-laktamaasiaktiivi- suus mååritettiin supernatantista ja soluseinåstå. Solusei-nån sisåltåmå aktiivisuus oli 20 U/ml ja supernatantin 200 U/ml. Fuusioproteiinia arvioitiin olevan kasvuliuoksessa suunnilleen 2 mg/1. H331-kanta oli kasvatettu nåitå kokeita 15 vårten synteettisesså kemiallisessa kasvuliuoksessa, jossa solujen kasvu ja proteiinien tuotto on huomattavasti hitaam-paa kuin YPD-liuoksessa. Kåyttoesimerkki 2 siis osoittaa, ettå hspl50-proteiinin KpnI-osa pystyy erittåmåån sen kar-boksiterminaaliseen pååhån liitetyn vieraan proteiinin, β-20 laktamaasin, soluseinån låpi kasvuliuokseen.

Esimerkki 3. Escherichia coli-bakteerin /?-galaktosidaasigee-nin fuusioiminen HSP150-qeeniin ja fuusioproteiinin ilmenty-minen S. cerevisiaessa 25

LacZ-vektorit. /3-galaktosidaasi on E. colin sytoplasminen proteiini, joka ei voi luonnollisessa muodossaan siirtyå S. cerevisiaesså eritysreitille, koska sillå ei ole signaa-lisekvenssiå. Se on aktiivinen vain muodostettuaan tetramee-30 rin. Tri Carol Lustyltå (Public Health Research Institute of the City of New York) saatiin sarja hiivan E. coli-sukkula-vektoreita, joissa /3-galaktosidaasia koodittavan geenin (lacZ-geeni) edesså on tunnistuskohtia useille restriktio-entsyymeille geenifuusioiden tekemistå vårten. Vektoreissa 39 92601 YEp353 ja YEp364 on ampisilliiniresistenssigeeni E. coli-selektioita vårten sekå URA3 tai LEU2-geeni hiivaselektiota vårten (Myers et al. . Gene 45:299-310, 1986) (kuva 19).

LacZ-geeni fuusioitiin kahteen erilaiseen HSP150-geenifrag-5 menttiin, Sall-Pstl-fragmenttiin ja Sall-Clal-fragmenttiin, konstruktiot transformoitiin erilaisiin S. cerevisiae-kan-toihin ja fuusiogeenien ilmentyminen tutkittiin seuraavasti.

HSP150-lacZ-qeenifuusiot. HSP150-geenin Sall-Pstl-geenifrag-10 mentti (2,8 kb) eristettiin pKTH4505:stå (kuva 8) PstI- ja Sall-restriktioentsyymidigestioilla, jotka pilkkovat plasmi-din neljåån osaan. Seoksen fragmentit eroteltiin agaroo-sigeelisså, josta 2,8 kb Sall-Pstl-fragmentti eluoitiin talteen. Tåmå fragmentti sisåltåå HSP150-geenin promoottori-15 alueen ja sen ylåvirta-alueita. HSP150-rakennegeenistå on mukana signaalisekvenssi ja alayksikko I:tå koodittavasta osasta 44 ensimmåistå kodonia (kuva 3). Sall-Pstl-fragmentti ligoitiin Sall- ja Pstl-entsyymeillå kåsiteltyyn YEp353-plasmidiin (kuva 19) . Ligaatioseos transformoitiin E. coli 20 XL-l Blue-kantaan, ja transfonuantit seulottiin ampisil- liiniresistenssin perusteella. Transformanttien joukosta etsittiin insertilliset, joista valittiin yksi jatkoon. Tåstå kannasta eristettiin plasmidi-DNA, joka nimettiin pKTH4519:ksi (kuva 20). Tåmå plasmidi sekå kåytetty vektori 25 ilman inserttiå transformoitiin litiumasetaattimenetelmållå S. cerevisiae-kantoihin Hl ja H3. Hl-transformantista tuli H294-kanta ja H3-transformantista H295-kanta. Hl- ja H3-solukoista, joka transformoitiin insertittomållå vektorilla YEp353, tuli H296-kanta ja H297-kanta. Transformantit seu-30 lottiin urasiili-selektiolla. Molemmat kåytetyt hiivakannat sisåltåvåt kromosomistossaan ehjån muokkaamattoman HSP150-geenin. Hl-kanta on erityskyvyltåån villityyppinen, H3-kannassa on sec7-mutaatio. joka pysåyttåå suurimman osan erittyvistå proteiineista Golgin laitteeseen, kuten aiemmin 40 92601 on selostettu.

HSP150-geenin Sall-Clal-fragmentti (3,8 kb) eristettiin pKTH4505:sta (kuva 8). pKTH4505-plasmidi kåsiteltiin Clal-5 ja Sall-entsyymeillå, jotka pilkkovat plasmidin kahteen fragmenttiin. Nåmå eroteltiin agaroosigeelisså, josta 3,8 kb:n pala eluoitiin talteen. Sall-Clal-fragmentti sisåltåå HSP150-geenin promoottorialueen, sen ylåvirta-alueet ja melkein koko HSP150-rakennegeenin, josta jåå puuttuinaan 10 neljå viimeistå kodonia (kuva 3). Koska Sall-Clal-fragment-tia ei voida liittåå lacZ-vektoreihin oikeassa lukujaksossa, ligoitiin Sall-Clal-palanen ensin Bluescript II SK+-vekto-riin, joka oli kåsitelty Clal ja Sall-entsyymeillå. Ligaa-tioseos transformoitiin E. coli XL-1 Blue-kantaan ja trans-15 formantit selektoitiin L-ampisilliinimaljoilla. Transfor- manttien joukosta etsittiin insertilliset, joista yksi valittiin jatkoon. Siitå eristettiin DNA jatkokloonausta vårten. Bluescript-vektorissa on heti Clal-kohdasta alavir-taan Hindlll-entsyymin tunnistuskohta. Kun HSP150-qeeni-20 fragmentti irrotettiin Sall-Hindlll-palasena Bluescript- vektorista, saatettiin se nyt liittåå oikeassa lukujaksossa lacZ-geeniin. Sall-Hindlll-fragmentti eristettiin aga-roosigeelistå ja ligoitiin YEp364-plasmidiin (kuva 19), joka oli katkaistu Sall- ja Hindlll-entsyyiueillå. HSP150-geenin 25 ja lacZ-geenin våliseen liitoskohtaan tulee kuusi ylimåå-råistå emåsparia Hindlll-entsyymin tunnistuskohdasta. Ligaa-tioseos transformoitiin E. coli XL-l Blue-kantaan ja trans-formantit selektoitiin ampisilliiniresistenssin perusteella. Transformanttien joukosta etsittiin insertilliset, joista 30 yksi valittiin jatkoon. Siitå eristettiin plasmidi-DNA, joka nimettiin pKTH4520:ksi (kuva 21). pKTH4520 plasmidi trans-formoitiin hiivakantoihin HI, H3, H23 ja H275 litiumasetaat-timenetelmåå kåyttåen. Uudet kannat saivat vastaavassa jårjestyksesså nimet H292, H293, H298 ja H299. Kun H23 ja • 41 92601 H275 transformoitiin insertittomållå YEp364-vektorilla, saatiin uudet kannat H300 ja H301. Transformantit seulottiin leusiini-selektiolla.

5 Fuusiogeenien transkriptio. Fuusiogeenien transkriptio todennettiin Northern blot-analyysillå kåyttåen HSP150 cDNA:ta koettimena. Kromosomaalisen HSP150-qeenin tuottaman 1,6 kb:n mRNA:n lisåksi ilmensivåt H294- ja H295-kannat Sall-Pstl-fuusiogeenin tuottamaa mRNA:ta (noin 3,2 kb), ja 10 H292- ja H293-kannat Sall-Clal-fuusion tuottamaa mRNArta (noin 4,2 kb). H298- ja H299-kannat ilmensivåt vain Sall-Clal-fuusiogeenin tuottamaa mRNA:ta, koska kromosomaalinen HSP150-geeni oli tuhottu. Insertittomillå vektoreilla trans-formoidut solut eivåt ilmentåneet uusia mRNA-molekyylejå. 15 Northern blot-analyysin perusteella oli fuusiogeenien transkriptio låmposååtelyn alaista, kuten on yllå selostettu kromosomaaliselle HSP150-geenille.

Fuusioproteiinien ilmentyminen ja erittyminen. Kannat H298 20 ja H299 tuottivat aktiivista /3-galaktosidaasia, koska pesåk-keet muuttuivat sinisiksi selektiivisellå alustalla, johon oli lisåtty X-gal-indikaattoria. Kun /3-galaktosidaasi hydro-lysoi X-gal-substraatin, muodostuu tuotteena sinistå kromo-foria.

25

Fuusiogeenien tuottamia fuusioproteiinien erittymistå tut-kittiin leimaamalla transformantit metabolisesti 35S-me-tioniinilla ja immunopresipitoimalla hspl50-epitooppeja sisåltåvåt proteiinit anti-hspl50-antiseerumilla. Sall-Clal-30 fuusiolla transformoidut H23- ja H275-kannat (H298 ja H299) , joista kromosomaalinen HSP150-geeni on tuhottu, kasvatettiin 25°C:ssa yli yon YPD-liuoksessa. 2 x 10® solua erotettiin ja suspendoitiin 400 μ1:Άζη tuoretta YPD-liuosta. Solut leimat-tiin 50 pCi:llå 35S-metioniinia (Amersham) 37°C:ssa tunnin 42 92601 ajan. Supernatantit erotettiin soluista sentrifugoimalla, solut hajotettiin mekaanisesti lasihelmillå, ja kummatkin preparaatit iininunopresipitoitiin 1:100 laimennetulla anti-hspl50-antiseerumilla ja proteiini A-Sepharosella (Pharma-5 cia). Inununopresipitaatit analysoitiin 7.5-15% SDS-polyak-ryyliamidigeelielektroforeesilla ja autoradiografialla. Sekå H298- ettå H299-kantojen kasvuliuoksista loytyi natiivin hspl50-proteiinin kokoinen proteiini, vaikka kummassakaan kannassa ei ole kromosomaalista HSP150-geeniå. Kummassakin 10 solukossa proteiinin måårå oli kasvuliuoksessa noin kymmenen kertaa suurexnpi kuin solulysaatissa. Kannat H300 ja H301 eivåt tuottaneet mitåån anti-hspl50-antiseerumilla immuno-presipitoituvaa proteiinia.

15 Koska Sall-Clal-fuusiogeenin olisi Northern blot-analyysin perusteella pitånyt tuottaa hspl50-proteiinia paljon suurem-paa fuusioproteiinia, merkitsevåt tulokset seuraavaa. Sall-Clal-fuusiogeenin primååritranslaatiotuote oli fuusioprote-iini, joka siirtyi signaalisekvenssinså avulla endoplasmisen 20 kalvoston sisåpuolelle ja kulkeutui sieltå tehokkaasti ja nopeasti sekå H298- ettå H299-kannassa Golgin laitteen vii-meiseen osastoon, jossa kex2-proteaasi irroitti ^-galak-tosidaasin fuusioproteiinista ja hajoitti sen. Samalla irronnut hspl50-osa erittyi nopeasti kasvuliuokseen. β-25 galaktosidaasissa on neljå kex2-proteaasin tunnistuskohtaa, joista ensimmåinen on 6 aminohapon pååstå liitoskohdasta. Mikåli kex2-proteaasi katkaisee tuon liitoksen, vapautuu låhes normaalin kokoinen hspl50-osa. Vaikka tåsså esimerkis-såmme "tuote", /3-galaktosidaasi, hajosikin solun sisållå 30 kex2-proteaasin toimesta, osoittaa esiroerkkixnme, ettå hsp-150-proteiini kykenee viemåån heterologisen proteiinin, jolla ei ole signaalisekvenssiå, eritysreitille, ja ettå fuusioproteiini kulkeutuu kex2-proteaasin sijaintipaikkaan myohåiseen Golgiin. Koska H299-kannassa sec7-mutaation • « 43 92601 vaikutuskohta eritysreitillå sijaitsee kex2-proteaasia varhemmassa Golgin osastossa, osoittaa esimerkkinune edel-leen, ettå fuusioproteiini erittyy sec7-mutantissa 37°C:ssa, kuten kromosomaalisen HSP150-qeenin tuottama hspl50-proteii-5 ni.

44 92601 TAULUKKO 1. OLIGONUKLEOTIDIT JA LINKKERI T8977

5' GCI CCI GCI TGI GGI GGI GGI CCG/A TCG/A AAC/T TGG/A AAT/C TG

91683 10 Kpnl

5' GCT TÅ|T AT C GAT,'GGT AC.ClTGC AGT CAC CCA G AA ACG CTG GTG Clal PstI

91684

5' GCA ACC AAG CTT .GAG TAA ACT TGG TCT GAC AG

> J

Hindlll 20

BamHl-linkkeri 5' CGGATCCG 3' 3 ' G.CCTAGG.C 5'

BamHI

2659 5' GCT TAT £TG__CAGj CTC ACC CAG AAA CGC TGG Pst! 45 92601 TAULUKKO 2. SACCHAROMYCES CEREVISIAB-KAMNAT (H) JA ESCHERICHIA COIiI-KAHNAT (B)

Hl : Mata ade2-101 ura3-52 leu2-3.112 suc2-A9 gal2 H3 : Mata sec7-l his4-580 ura3-52 leu2-3.112 trp-289 H23 : Mata his3-ll.15 leu2-3.112 trpl-1 canl-100 HSP150::URA3 H246 : Mata/a ura3-l hls3-11.15 leu2-3.112 trol-1 canl-100 H275 : Mata sec7-l his4-580 ura3-52 leu2-3.112 trpl-289 HSP150::URA3 H284 : H275 transformoitu plasmidilla pKTH4530 H292 : Hl transformoitu plasmidilla pKTH4520 H293 : H3 transdormoitu plasmidilla pKTH4520 H294 : Hl transformoitu plasmidilla pKTH4519 H295 : H3 transformoitu plasmidilla pKTH4519 H296 : Hl transformoitu plasmidilla YEp353 H297 : H3 transformoitu plasmidilla YEp353 H298 : H23 transformoitu plasmidilla pKTH4520 H299 : H275 transformoitu plasmidilla pKTH4520 H300 : H23 transformoitu plasmidilla YEp364 H301 : H275 transformoitu plamsidilla YEp364 H329 : Hl transformoitu plasmidilla pKTH4548 • H331 : Hl transformoitu plasmidilla pKTH4547 H333 : Hl transformoitu plasmidilla pKTH4543 H335 : Hl transformoitu plasmdilla pKTH4544 H337 : Hl transformoitu plasmidilla pKTH4545 B36 : DH5a F' endAl hsdR17 (R.k.~ M.k.+) supE44 thi-1 recAl gyrA96 relAl fii80d lacZ-A-M15 B39 : XL-1 Blue F': :TnlO (Tcr) proA+B+lacIq del(lacZ)M15/recAl endAl gyrA96(NalR) Thi hsdR17 (R.k.' M.k.+) supE44 relAl lac

Claims (17)

92601 46

1. DNA-sekvenssi, joka koodittaa hiivan hspl50-proteiinia, tunnettu siitå, ettå se on 5 (a) kuvassa 1 esitetty DNA-sekvenssi tai sen osa, (b) DNA-sekvenssi, joka koodittaa kuvassa 1 esitettyå aminohapposekvenssia kohdan (a) DNA-sekvenssin synonyymikodoneilla, tai sen osa, tai (c) DNA-sekvenssi, joka koodittaa kuvassa 1 esitetyn 10 aminohapposekvenssin kanssa homologista aminohap posekvenssia tai sen osaa.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen DNA-sekvenssi, tunnettu siitå, etta se ilmentåå erittyvaa lamposaadeltya proteii- 15 nia, joka on homologinen kuvassa 1 esitetyn aminohapposekvenssin kanssa.

3. Yhdistelmå-DNA-rakenne, tunnettu siitå, ettå se sisåltåå hiivan hspl50-proteiinia koodittavan, patenttivaatimuksen 20. mukaisen DNA-sekvenssin tai sen osan, kytkettynå vierasta proteiinia koodittavaan nukleotidisekvenssiin, sen osaan tai johdannaiseen.

4. Patenttivaatimuksen 3 mukainen yhdistelmå-DNA-rakenne, 25 tunnettu siitå, ettå se ilmentaå HSP150-geenin signaali- sekvenssiå tai repetitiivistå jaksoa.

5. Patenttivaatimuksen 3 tai 4 mukainen yhdistelmå-DNA-rakenne, tunnettu siitå, ettå se sisåltåå ilmentyvån

30 HSP150-sekvenssin ja vierasta proteiinia ilmentåvån nuk-leotidisekvenssin siten, ettå syntetisoituu fuusioproteii-ni.

6. Patenttivaatimuksen 5 mukainen yhdistelmå-DNA-rakenne, 35 tunnettu siitå, ettå mainitun ilmentyvån HSP150-sekvenssin ja mainitun vierasta proteiinia ilmentåvån nukleotidisek-venssin vålisså on linkkeri-DNA-sekvenssi, joka koodittaa 47 92601 aminohapposekvenssiå, jossa on katkaisukohta, jonka kemi-kaali tai solunsisainen tai muu proteaasi katkaisee irrot-taen vieraan proteiinin roainitusta fuusioproteiinista.

7. Jonkin patenttivaatimuksista 3-6 mukainen yhdistelma- DNA-rakenne, tunnettu siita, etta mainitun fuusioproteiinin ilmentyminen on HSP150-geenin ylavirran ja alavirran sååte-lyalueiden tai muiden saåtelyalueiden kontrollissa.

8. Patenttivaatimuksen 7 mukainen yhdistelma-DNA-rakenne, tunnettu siita, etta ylavirran saatelyalue sisåltaå ainakin yhden laxnposaadellyn promoottorin.

9. Patenttivaatimuksen 3 mukainen yhdistelma-DNA-rakenne, 15 tunnettu siita, ettM se on plasmidi pKTH4543, pKTH4544, pKTH4545, pKTH4547 tai pKTH4548, joiden rakenne on esitetty kuvissa 14, 15, 16, 17 ja vastaavasti 18.

10. Hiivaisanta, tunnettu siita, etta se on transformoitu 20 jonkin patenttivaatimuksista 3-9 mukaisella yhdistelmå-DNA- rakenteella.

11. Patenttivaatimuksen 10 mukainen hiivaisanta, tunnettu siita, etta se on Saccharomvces cerevisiae. 25

12. Patenttivaatimuksen 11 mukainen hiivaisanta, tunnettu siita, etta se on jokin seuraavista Saccharomvces cerevisiae -kannoista: H329, joka sisaltaa kuvassa 18 esitetyn plasmidin pKTH4548, H331, joka sisåltaa kuvassa 17 esitetyn 30 plasmidin pKTH4547, H333, joka sisåltaa kuvassa 14 esitetyn plasmidin pKTH4543, H335, joka sisaltaa kuvassa 15 esitetyn plasmidin pKTH4544 tai H337, joka sisaltaa kuvassa 16 esitetyn plasmidin pKTH4545.

13. Menetelma hyotyproteiinin erittamiseksi hiivoista, tunnettu siita, etta 92601 48 a) valmistetaan yhdistelmå-DNA-rakenne, joka sisSltMM hiivan hspl50-proteiinia koodittavan, patenttivaatimuksen 1 mukaisen DNA-sekvenssin tai sen osan, kytket-tyna vierasta proteiinia, sen osaa tai johdannaista 5 koodittavaan nukleotidisekvenssiin, joko siten, etta ne kytkeytyvat suoraan yhteen, tai siten, etta niiden valissS on proteolyyttisen tai kemiallisen katkaisu-kohdan aminohappoja ilmentåvå nukleotidisekvenssi, jolloin 10 b) inainittu yhdistelma-DNA-rakenne sisåltaa HSP150-qeenin ylavirran ja alavirran sMatelyalueet tai muut sååtely-alueet, joiden kontrollissa kyseinen fuusiogeeni ilmentyy, c) transformoidaan sopiva hiivaisanta mainitulla yhdis- 15 telma-DNA-rakenteella, d) kasvatetaan mainittua transformoitua isSntaa sellai-sissa olosuhteissa, etta fuusioproteiini tai siitS irronnut vieras proteiini erittyy, ja e) puhdistetaan mainittu fuusioproteiini tai vieras 20 proteiini.

14. Patenttivaatimuksen 13 mukainen menetelma, tunnettu siita, ettå isånta on villityyppinen tai mutanttihiiva.

15. Patenttivaatimuksen 14 mukainen menetelma, tunnettu ’ siita, etta isanta on Saccharomvces cerevisiae.

16. Patenttivaatimuksen 15 mukainen menetelma, tunnettu siita, etta isanta on Saccharomvces cerevisiaen sec-mutant- 30 ti tai kex2-mutantti.

17. Hiivan HSP150-geenin kaytto vieraiden proteiinien erittamiseksi hiivoista. • · 49 92601