KR100858833B1 - 효모에 의해 분비되는 재조합 단백질의 제조를 위한,ｎ-말단 부분이 히루딘 유도체인 융합 단백질의 용도 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 PX-SX-Bn-(ZR)-Hir(AsmR)-단백질(Y)-T[여기서, PX는 목적하는 단백질의 최적 수율이 성취될 수 있는 방식으로 선택되는 임의의 프로모터 DNA 서열이고, SX는 최적의 수율을 가능하게 하는 시그날 서열 또는 리더 서열을 암호화하는 임의의 DNA이고, Bn은 1 내지 15개의 아미노산 코돈 또는 화학 결합이고, Z는 Lys 및 Arg를 포함하는 그룹으로부터 선택되는 아미노산의 코돈이고, R은 Arg 코돈 또는 화학 결합이고, Asm은 화학 결합 또는 m개의 아미노산 코돈(여기서, m은 1 내지 10이다)이고, Hir은 히루딘 또는 천연 히루딘과 40% 이상 상동성인 히루딘 유도체를 암호화하는 DNA 서열이고, 단백질 Y는 효모에서 생산되고 분비될 수 있는 임의의 단백질을 암호화하는 DNA 서열이고, T는 발현에 유리한 비해독 DNA 서열이다] 형태의 발현 카세트에 관한 것이다.
융합 단백질, 효모, 히루딘, 인슐린, 발효, 인터류킨, 림포킨
Description
재조합 단백질을 주요 성분으로 하는 약제를 제조하기 위해 최적화된 방법의 개발은 하기의 관점에서 타당해야만 하는 작업이다. 첫번째로, 방법은 가능한한 저렴해야만 하고 두번째로는 생성물이 고순도이어야만 한다. 이와 관련하여, 발현 시스템의 선택은 특정 제조 방법의 진행과정을 결정하고 단백질 화학 및 광범위한 생화학적 가능성에 있어서 신규 기술 및 공지된 기술을 새롭게 조합시킨 기술의 개발이 기존의 방법을 개선시킬 수 있음은 당업자에게 있어서 자명한 사실이다. 효모에서 이러한 부류의 관련 단백질의 발현이 본원에서 광범위하게 사용된다.
인슐린, GM-CSF(LeukineR) 및 히루딘(RefludanR)과 같은 단백질의 제조는 효모의 특정 단백질 또는 이의 전구체의 합성을 바탕으로 하는 유전자 공학 방법으로서 성공적으로 개발된 일례이다. 일반적으로, 효모는 한세눌라 폴리모르파(Hansenula polymorpha)(문헌참조: Weydemann et al. Appl. Microbiol Biotechnol. 44:377-385, 1995) 또는 피치아 파스토리스(Pichia pastoris)(문헌참조: Rosenfeld et al. Protein Expr. Purif:4, 476-82, 1996)를 사용하는 경우 그램 규모의 우수한 수율로 특히 히루딘을 직접 합성할 수 있다.
놀랍게도, 본 발명에 이르러, 본 발명자는 N 말단에서 히루딘 또는 히루딘 유도체를 포함하는 융합 단백질이 히루딘 자체의 수율과 유사한 우수한 수율로 효모로부터 방출될 수 있음을 밝혔다. 수율은 몰 농도를 기준으로 한다. 이것은 천연 히루딘을 리터당 100mg의 수율로 생산하는 숙주/벡터 시스템이 히루딘, 및 예를 들어 미니-프로인슐린(문헌참조: 유럽 특허원 제0 347 781호)으로 구성된 융합 단백질을 리터당 약 180mg으로 생산할 수 있음을 의미한다. 놀랍게도, 히루딘은 생물학적으로 활성이고 미니-프로인슐린은 정확하게 폴딩된 3차원 형태로 존재한다. 2개의 단백질이, 어떠한 다른 위치에서는 융합단백질을 효율적으로 절단하지 못하는 엔도프로테아제에 의해 특이적으로 인지되는 아미노산 링커를 통해 융합되는 경우, 목적하는 단백질은 활성 형태로 직접적으로 절단될 수 있다. 인슐린 제조의 경우에, 히루딘 및 미니-프로인슐린 사이의 링커는 바람직하게 카복시 말단에 아르기닌을 함유한다. 동시적 프로세싱에 있어서, 트립신을 사용한 전환으로, 융합 부분을 절단해 내고 프로인슐린을 모노-Arg 인슐린으로 전환시킬 수 있다. 따라서, 본 발명은, 서열 AsmR을 통해 단백질 Y와 융합 단백질을 형성하는 히루딘 또는 히루딘 유도체를 암호화하는 발현 카세트를 갖는 하기 형태의 DNA-분자(별칭: 발현 카세트)에 관한 것이다:
PX-SX-Bn-(ZR)-Hir(AsmR)-단백질(Y)-T[여기서, PX는 목적하는 단백질의 최적 수율이 성취될 수 있는 방식으로 선택되는 임의의 프로모터 DNA 서열이고, SX는 최적의 수율을 가능하게 하는 시그날 서열 또는 리더 서열을 암호화하는 임의의 DNA이고, Bn은 1 내지 15개의 아미노산 코돈 또는 화학 결합이고, Z는 Lys 및 Arg를 포함하는 그룹으로부터 선택되는 아미노산의 코돈이고, R은 Arg 코돈이고, Asm은 화학 결합 또는 m개의 아미노산 코돈(여기서, m은 1 내지 10이다)이고, Hir는 천연 히루딘과 40% 이상 상동성인 히루딘 또는 히루딘 유도체를 암호화하는 DNA 서열이고, 단백질 Y는 효모에서 생산되고 분비될 수 있는 임의의 단백질을 암호화하는 DNA 서열이고, T는 발현에 유리한 비해독 DNA 서열이다]
바람직한 단백질 Y는 미니-프로인슐린 유도체, 인터류킨 또는 림포킨 또는 인터페론과 같은 폴리펩타이드이다. 발현 카세트는 바람직하게 효모로 도입된다. 당해 발현 카세트는 특정 효모 게놈으로 안정하게 통합된 하나 이상의 복제물을 가질 수 있거나 다중 복제 벡터 또는 소형 염색체 구성 요소의 유형으로 염색체 외적으로 존재할 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태는 상기 언급된 DNA 분자중 어느 하나에 의해 암호화된 융합 단백질이다.
본 발명의 추가의 양태는 상기 언급된 DNA 분자를 포함하는 다중 복제 벡터 및 플라스미드이다.
본 발명의 추가의 양태는 염색체의 일부로서, 소형 염색체의 일부로서 또는 염색체 외적으로서 상기 언급된 DNA 분자 또는 상기 언급된 다중 복제 벡터 또는 상기 언급된 플라스미드를 포함하는 숙주 세포이고, 이때, 숙주 세포가 효모, 특히, 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae), 클루이베로마이세스 락티스(Kluyveromyces lactis), 한세눌라 폴리모르파(Hansenula polymorpha) 및 피치아 파스토리스(Pichia pastoris)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 효모인 것이 바람직하다.
본 발명의 또 다른 양태는,
(a) 상기 언급된 DNA-분자, 상기 언급된 다중 복제 벡터 또는 상기 언급된 플라스미드를 상기 언급된 숙주 세포에서 발현시키고,
(b) 발현된 융합 단백질을 세포 배양물의 상등액으로부터 분리하여 상기 언급된 융합 단백질을 발효시키는 방법으로서,
특히, 발효가 종료된 후, pH를 2.5 내지 3.5로 조정하여 목적하지 않은 단백질을 침전시키고 발현된 융합 단백질을 침전물의 상등액으로부터 분리함을 특징으로 하는, 상기 언급된 융합 단백질을 발현시키는 방법이다.
본 발명의 또 다른 양태는 숙주 세포로부터 발효 상등액을 분리한 후, 숙주 세포를 신선한 배지에서 반복적으로 배양하고 방출된 융합 단백질을 배양동안에 수득된 상등액 각각으로부터 분리함을 특징으로 하는 상기 언급된 방법이다.
본 발명의 또 다른 양태는 침전 후 상등액중에 발현된 단백질을 농축시키기 위한 단계가 미세여과, 소수성 상호작용 크로마토그래피 및 이온 교환 크로마토그래피를 포함하는 그룹으로부터 선택됨을 특징으로 하는 상기 언급된 방법이다.
본 발명의 추가의 양태는,
(a) 상기 언급된 융합 단백질을 상기 언급된 방법에 따라 발현시킴에 이어서 분리시키는 단계,
(b) 융합 단백질을 트립신 및 카복시펩티다제 B로 처리하는 단계 및
(c) 인슐린을 단계 (b)의 반응 혼합물로부터 분리하는 단계를 포함하는, 인슐린의 제조 방법이다.
하기에 기술된 발현 시스템은 일례로서 제공한다. 발현 카세트를 상기 선택된 시스템으로 도입하기 위해서는 적절한 재조합 DNA 작제물을 선택된 숙주 시스템의 유형에 따라 제조해야만 한다는 것은 당업자에게 있어서 자명한 사실이다. 따라서, 산업용 발효가 선택된 숙주/벡터 시스템에 따라 최적화될 수 있다.
히루도 유형의 거머리가 다양한 이소형태의 트롬빈 억제제 히루딘으로서 개발되었다. 히루딘은 예를 들어, N-말단 아미노산을 대체시키는 인위적인 분자 변형에 의해 약제로서의 요구조건에 맞게 최적화될 수 있다(문헌참조: EP-A 0 324 712). 본 발명은 히루딘 및 히루딘 변형체의 사용을 포함한다. 본 발명의 특정 양태는 천연 히루딘 이소형태중 하나를 사용하는 것이다(천연 이소형태는 모두 "히루딘"으로서 명명한다). 천연 이소형태는 예를 들어, Val-Val-히루딘 또는 Ile-Thr-히루딘이다. 본 발명의 또 다른 양태는 천연 히루딘 이소형태의 변형체를 사용하는 것이다. 변형체는 천연 히루딘 이소형태로부터 유도되지만 예를 들어, 천연 이소형태와 비교하여 아미노산이 부가되고/되거나 아미노산이 결실되고/되거나 아미노산이 대체되어 있다. 히루딘 변형체는 천연 히루딘 이소형태 및 새로운 아미노산의 반복적인 펩타이드 절편을 포함할 수 있다. 히루딘 변형체는 공지되어 있고 예를 들어, 문헌[참조: DE 3 430 556]에 기재되어 있다. 히루딘 변형제는 단백질의 형태로서 시판되고 있다[문헌참조: Calbiochem Biochemicals, Cat. no. 377-843, -950-960].
흔히, 히루딘을 포함하는 융합 단백질은 산성 매질에서 놀랍게도 우수한 가용성을 나타내고 이것은 단백질의 화학적 후처리에 관한 한 명백한 장점을 초래한다. 첫번째로, 상등액의 많은 성분은 상기 조건하에서 침전되고 두번째로 대부분의 펩티다제 또는 프로테아제는 불활성이다. 따라서, 작업 말기에 발효조를 산성화시켜 융합 단백질로부터 숙주 세포와 함께 원치않는 상등액 단백질을 직접 분리할 수 있고 추가의 단계에서 융합 단백질을 농축시킬 수 있다. 이것은 또한 본 발명의 요지이다.
발효 말기에, 폴딩 과정은 아직 100% 완전하지 않을 수 있다. 머캅탄 또는 예를 들어, 시스테인 하이드로클로라이드의 첨가는 당해 과정을 완성시킬 수 있다. 이것은 또한 본 발명의 요지이다.
하기 실시예는 보다 상세하게 본 발명을 설명하고 이를 제한하지 않는다.
실시예 1: Leu-히루딘(RefludanR)-Arg-미니 프로인슐린으로 구성된 융합 단백질을 암호화하는 발현 카세트의 작제
출발 물질은 플라스미드 pK152(PCT/EP00/08537), pSW3(EP-A 0 347 781) 및 소 인터류킨 2(문헌참조: Price et al. Gene 55, 1987)를 암호화하는 재조합 효모 플라스미드 유도체이다. 효모 플라스미드의 특징은 효모 ADH2 프로모터의 조절하에 α인자 리더 서열을 갖고 있다는 것이다. 당해 서열에 이어서 KpnI 제한 효소 인지 부위를 통해 연결된 소 인터류킨 2 cDNA 서열이 존재하고 이것은 조작 후에 비해독 3' 말단에 벡터내에서 유일한 NcoI 제한 효소 인지 부위를 포함한다. 따라서, cDNA 서열은 Kpn/NcoI 절단을 통해 당해 플라스미드로부터 용이하게 제거될 수 있다. 우수한 발현 수율이 보고되어 왔기 때문에, 잔여 3' 인터류킨 2 서열(T로서)이 mRNA에 대해 안정화 효과를 나타냄에 따라서 효모 특이적 종결인자 서열에 의해 대체될 필요가 없음을 추측할 수 있다. 플라스미드 pK 152는 Leu-히루딘(레플루단(Refludan)) 코디어트(kodiert)를 암호화하는 DNA 서열을 갖고 플라스미드 pSW3은 미니 프로인슐린에 대한 DNA 서열을 갖는다. 먼저, 히루딘-Lys Arg-미니 프로인슐린을 암호화하는 유전자 서열을 PCR 기술을 사용하여 제조한다. 당해 목적을 위해, 4개의 프라이머를 엑스피다이트(Expedite)TM DNA 합성 시스템을 사용하여 제조한다:
i. hir_insf1(서열 1, 암호화된 단백질 절편: 서열 2)
ii. hir_insrev1(서열 3)
iii. hirf1(서열 4, 암호화된 단백질 절편: 서열 5)
iv. insnco1rev (서열 6)
프라이머 hir_insf1은 히루딘의 말단 아미노산(59 내지 65)과 인슐린 서열 B1-B7에 대한 코돈 사이에 Arg 링커(굵은 표시의 코돈)를 통한 연결부를 갖는다. 프라이머 hir_insrev1은 여기에 100% 상보적이다. 프라이머 hirf1은 문헌[참조: EP-A 0 324 712]에 기재된 바와 같이 KpnI 절단 부위로 연장된 히루딘 유전자의 개시부를 암호화하고 있다. 프라이머 insncoirev는 문헌[참조: EP-A 0 347 781]에 따른 합성 미니 프로인슐린의 3' 말단을 갖고 있다.
주형으로서 플라스미드 pK152의 DNA와 함께 프라이머 쌍 hirf1/hir_insrev1 및 주형으로서 플라스미드 pSW3의 DNA와 함께 hir_insf1/insncoirev를 사용하여 2개의 표준 폴리머라제 연쇄 반응을 수행한다. 각각의 경우, 프라이머 200nmol, 폴리머라제 1㎕ 및 벡터 100ng을 사용하여 100㎕의 PCR 완충액중에서 반응을 수행한다. 단계 1은 95℃에서 2분 항온처리이다. 이어서 95℃에서 30초, 55℃에서 30초 및 72℃에서 30초로 25회 수행한다. 마지막 회에 이어서 72℃에서 3분동안 항온처리하고 이어서 반응을 종료한다. 프라이머 hir_insrevkr 및 hir_insfkr은 100% 상보적이기 때문에 2개의 생성물의 DNA 생성물은 상기 서열에 따라 일치하여 제3 반응에서 주형으로서 첫번째 2개의 반응 생성물 및 프라이머 hirf1 및 insncoirev를 사용하여 Arg에 의해 분리된 히루딘 및 미니 프로인슐린을 암호화하는 DNA 단편을 형성한다. PCR 단편을 KpnI 및 NcoI 효소로 분해하고 이어서 T4 리가제 반응에서 Kpn1/Ncol에 의해 개방된 pαADH2 벡터에 삽입한다. 이어서 문헌[참조: EP-A 0 347 781]의 실시예 7과 유사하게, 컴피턴트 이. 콜리 MM294 세포를 연결 혼합물로 형질전환시킨다. 이어서 플라스미드 DNA를 DNA 서열 분석에 의해 특성을 밝히고자 2개의 클론으로부터 분리한다. DNA 서열이 삽입되어 있는지 확인한 후, 플라스미드 제제의 DNA를 사용하여 상기 실시예에 따라 제빵 효모 균주 Y79의 세포를 형질전환시킨다. 그러나, pαADH2 벡터를 사용하는 경우, 상기 실시예와 대조적으로 벡터는 trp1-1 돌연변이에 상보적인 벡터를 선별하여 도입한다. 또 다른 대조를 위해, 플라스미드 DNA를 효모 형질전환체로부터 재분리하고 제한 효소 분석으로 분석한다. 작제된 발현 벡터는 pADH2Hir_Ins로 명명한다. 실시예 4에 따라 발현을 수행한다. 융합 단백질은 상등액중에서 발견된다.
실시예 2: Leu-히루딘(Refludan)-Gly Asn Ser Ala Arg-미니 프로인슐린으로 구성된 융합 단백질을 암호화하는 발현 카세트의 작제
본 실시예는 히루딘 유도체와 미니 프로인슐린사이의 트립신 인지 부위를 변형시키는 방법을 밝힌다. 실시예 1에 따라 작제한다.
2개의 신규 올리고뉴클레오타이드를 합성한다:
Hir_insf(서열 7, 암호화된 단백질 절편: 서열 8)
Hir_insrev(서열 9)
주형으로서 플라스미드 pK152의 DNA와 함께 프라이머 쌍 hirf1/hir_insrev1 및 주형으로서 플라스미드 pSW3의 DNA와 함께 hir_insf1/insncoirev를 사용하여 2개의 표준 폴리머라제 연쇄 반응을 수행한다. 제3 반응에서, 주형으로서 첫번째 2개의 반응 생성물 및 프라이머 hirf1 및 insncoirev의 생성물을 사용하여 링커 Gly Asn Ser Ala Arg에 의해 분리된 히루딘 및 미니 프로인슐린을 암호화하는 DNA 단편을 형성한다. PCR3의 생성물을 이어서 KpnI 및 NcoI로 절단하여 적절히 개방된 pαADH2 벡터에 도입하고 실시예 1에 따라 특성을 밝힌다. 플라스미드를 pADHH_GNSA_Ins로서 명명한다. 세포를 플라스미드 DNA로 형질전환시킨다. 실시예 3에 따라 발현을 수행한다. 융합 단백질은 상등액중에서 발견된다.
실시예 3: 제빵 효모 시스템내 재조합 생성물의 발현
발현은 2개의 단계로 분리된다. 첫번째로, 효모 최소 배지에서 전배양한다. 배지는 리터당 하기의 조성을 갖는다:
6.7g - 효모 질소 염기(아미노산 부재)
5.0g - 카사미노산(비타민 부재)
0.008% - 아데닌
0.008% - 우라실
2% - 글루코스
본 배양물 또는 발현 배양물에 일정액의 전배양물을 접종한다.
본배양 배지는 리터당 다음의 성분을 함유하고 있다:
10g - 효모 추출물
20g - 펩톤
0.008% - 아데닌
0.008% - 우라실
4% - 글루코스
상기된 배지를 사용하여 진탕 플라스크에서 하기의 방식으로 발현을 수행한다. 밤새 배양시킨 전배양물 0.3ml을 미리 가온된 배지 80ml로 희석시키고 약 24시간동안 30℃에서 강한 교반과 함께 배양한다. 각각의 경우, 당해 방식으로 생산된 배양물 1ml을 원심분리하고 광학 밀도를 측정하고 세포를 제거한 후에 상등액을 동결건조시키고 SDS-PAGE로 분석한다. 생물학적으로 활성인 히루딘 함량을 트롬빈 억제 분석을 수행하여 측정한다. 또 다른 발효 프로토콜은 여과 또는 신중하게 원심분리하여 제거될 세포를 제공한다. 배지로부터 목적하는 단백질을 분리한 후, 세포에 탄소원으로서 알콜 및 0.5% 이하의 글루코스를 함유한 신선한 가온된 본배양 배지를 제공하고 이어서 중단 없이 계속 발효시킨다. 당해 단계는 5회 이하까지 반복할 수 있다.
실시예 4: 피치아 파스토리스(Pichia pastoris) 시스템내에서 히루딘-Arg-미니 프로인슐린 융합 단백질의 클로닝 및 발현
인비트로겐(Invitrogen)R 사는 피치아 파스토리스 시스템의 도움으로 재조합 단백질을 제조하기 위한 클로닝 및 발현 키트를 판매하고 있다. 이를 위해, 목적하는 재조합 단백질의 제조를 위한 피치아 파스토리스 시스템의 제조 및 이어서 후속적인 발현에 관한 보다 상세한 기술적 프로토콜은 상기 프로토콜을 따르는 경우 목적하는 단백질을 암호화하는 발현 벡터의 작제만이 기재되도록 제공된다. 이지셀렉트(EasySelect)TM 피치아(Pichia) 발현 키트(카탈로그 번호 K1740-01)가 사용된다.
pPICZαA 벡터는 키트의 일부이다. 제한효소 Xhol 및 SacII에 의해 벡터를 개방시켜 실시예 1과 유사하게, 목적하는 단백질이 알파 인자 리더 서열에 부착되도록 하고 상등액으로의 분비에 대한 시험을 가능하게 한다. 융합 단백질의 클로닝은 2개의 프라이머를 필요로 한다. 프라이머 pichia_H_lf1(서열 10)은 하기의 서열을 갖는다:
프라이머 pichia_H_lrev2(서열 11)는 하기의 서열을 갖는다:
사용되는 주형은 플라스미드 pADH2Hir_Ins의 DNA이다. 2개의 프라이머를 사용한 표준 PCR은 XhoI 및 SacII 통합 부위에 의해 연장된 서열 히루딘-Arg-미니 프로인슐린을 함유하는 DNA 생성물을 생성시킨다. DNA 생성물이 적절하게 절단되고 단편이 분리되는 경우, 단편을 T4 DNA 리가제 반응에서 개방된 벡터 DNA에 삽입시킬 수 있다. 제조업자의 프로토콜과는 별도로, 실시예 1에 기술된 이. 콜리 균주 MM294를 연결 혼합물로 형질전환시키고 재조합 콜로니를 제오신 선별 플레이트상에서 성공적으로 형질전환된 것에 대해 스크리닝한다. 플라스미드 DNA를 클론으로부터 재분리하고 이어서 제한 분석 및 DNA 서열 분석으로 특성을 밝힌다. 당해 방식으로 작제된 플라스미드를 사용하여 융합 단백질의 제조용 피치아 파스토리스 발현 클론을 제조업자의 지시에 따라 제조한다.
실시예 5: 트롬빈 억제 분석
히루딘 농도를 문헌[참조: Grieβbach et al. Thrombosis Research 37, pp. 347-350, 1985]의 방법에 따라 측정한다. 당해 목적을 위해, 특정 양의 레플루단 표준물을 측정에 포함시켜 보정 곡선을 작성하고 이로부터 수율(mg/l)을 직접 측정할 수 있다. 융합 단백질의 프로인슐린 성분이 제대로 폴딩되어 있는지를 확인하기 위해 생물학적 활성을 또한 측정한다. 별법으로, 단백질 분해 에스. 아우레우스 분해를 사용할 수 있고 이어서 RP-HPLC 시스템에서 분석하여 S-S 브릿지 형성이 제대로 되어 있는지 측정할 수 있다.
실시예 6: 융합 단백질의 정제
발효를 종료한 후, pH를 2.5 내지 3으로 조정한다. 숙주 세포의 자발적인 용해 또는 분비로 인해 상등액으로부터 발현되는 대부분의 기타 폴리펩타이드와는 대조적으로 융합 단백질은 놀랍게도 pH 2.5 내지 3에서 침전하지 않는다. 따라서, 배양 배지를 적절히 산성화시킴에 이어서 침전 종결 후 침전물 및 세포를 원심분리 또는 미세여과하여 제거하고 농축시킨다. 이어서, 배지를 pH 6.8로 조정하고 융합 단백질 함량을 분석 HPLC 측정과 병행하여 측정한다. 측정에 이어서, 트립신이 융합 단백질의 1 내지 1.5mg당 약 1㎍이 되도록 상등액에 트립신을 첨가한다. 약 4시간동안 실온에서 항온처리한 후, 2-프로판올의 존재하에 pH 3.5에서 양이온 교환 크로마토그래피로 정제를 수행한다. 0.15 내지 0.45M의 농도 구배를 적용하여 완충액중에서 용출시킨다. 모노-Arg-인슐린을 약 0.3M에서 용출시킨다. 1:1 희석시킨 후 10% 농도의 ZnCl2 용액을 첨가하여 약 pH 6.8에서 인슐린 함유 분획물로부터 모노-Arg-인슐린을 침전시킨다. 인슐린을 여과하고 이어서 0.05M 트리스-HCl(pH 8.5)중에 용해시켜 2mg/ml의 용액을 수득한다. 이어서, 100ml의 용액당 카복시펩티다제 B의 약 1 유니트의 양을 첨가하여 반응을 약한 교반과 함께 수행한다. 이어서 pH를 시트르산으로 pH 5.5로 조정하고 인슐린을 ZnCl2의 존재하에 결정화한다. 결정을 제거하고 용해시키고 RP-HPLC로 정제한 후에 인슐린을 다시 결정화로 정제한다.
실시예 7: 배양 배지중에서 직접적인 융합 단백질의 프로세싱
발현 기간의 말기에, 배양 배지를 pH 6.8로 조정하고 이어서 트립신을 교반과 함께 첨가하여 리터당 4 내지 8mg의 농도를 설정한다. 약 4시간동안 배양한 후 당해 방식으로 처리된 발효액을 pH 2.5 내지 3으로 조정한다. 1 내지 6시간동안 침전시킨 후, pH를 3.5로 상승시키고 형성된 모노-Arg-인슐린을 30% 2-프로판올의 존재하에 양이온 교환 크로마토그래피를 통해 정제한다. 0.05 내지 0.5M 염의 NaCl 농도 구배로 용출을 수행한다. 생성물 함유 분획물을 H2O와 1:1로 희석시킴에 이어서 ZnCl2를 첨가하여 0.1% 농도의 ZnCl2 용액을 형성한다. 모노-Arg-인슐린을 약 pH 6.8에서 침전시키고 실시예를 통해 실시예 6에 따른 인슐린으로 전환시킨다.
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hirudin derivative for the production of recombinant
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<223> Description of Artificial Sequence:hir_insf1
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atccctgagg aataccttca gcgatttgtt aaccaacact tgtgtgg 47
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:protein
hir_insf1
<400> 2
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1 5 10 15
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: hir_insrev1
<400> 3
cctcacaagt gttggttaac aaatcgctga aggtattcct cagggat 47
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
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tttttttgga tcctttggat aaaagactta cgtatactga ctgcac 46
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ttttttccat gggtcgacta tcag 24
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atccctgagg aataccttca gggaaattcg gcacgatttg ttaaccaaca cttgtgtgg 59
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<223> Description of Artificial Sequence: protein
Hir_insf
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1 5 10
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<223> Description of Artificial Sequence: Hir_insrev
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ccacacaagt gttggttaac aaatcgtgcc gaatttccct gaaggtattc ctcagggat 59
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<223> Description of Artificial Sequence: pichia_H_lf1
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tttttttctc gagaaaagac ttacgtatac tgac 34
<210> 11
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: pichia_H_Irev2
<400> 11
ttttttggcg ccgaattcac tattagttac agtagttttc c 41
Claims (14)
- PX-SX-Bn-(ZR)-Hir(AsmR)-단백질(Y)-T[여기서, PX는 목적하는 단백질의 최적 수율이 성취될 수 있는 방식으로 선택되는 임의의 프로모터 DNA 서열이고, SX는 최적의 수율을 가능하게 하는 시그날 서열 또는 리더 서열을 암호화하는 임의의 DNA이고, Bn은 1 내지 15개의 아미노산 코돈 또는 화학 결합이고, Z는 Lys 및 Arg를 포함하는 그룹으로부터 선택되는 아미노산의 코돈이고, R은 Arg 코돈 또는 화학 결합이고, Asm은 화학 결합 또는 m개의 아미노산 코돈(여기서, m은 1 내지 10이다)이고, Hir은 히루딘을 암호화하는 DNA 서열이고, 단백질 Y는 미니-프로인슐린을 암호화하는 DNA 서열이고, T는 발현에 유리한 비해독 DNA 서열이다] 형태의 DNA 분자.
- 삭제
- 삭제
- 제1항에 따른 DNA 분자에 의해 암호화된 융합 단백질.
- 제1항에 따른 DNA 분자를 포함하는 벡터.
- 제1항에 따른 DNA 분자를 포함하는 플라스미드.
- 염색체의 일부로서, 소형 염색체의 일부로서 또는 염색체 외적으로서, 제1항에 따른 DNA 분자, 제5항에 따른 벡터 또는 제6항에 따른 플라스미드를 포함하는 숙주 세포.
- 제7항에 있어서, 효모인 숙주 세포.
- 제8항에 있어서, 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae), 클루이베로마이세스 락티스(Kluyveromyces lactis), 한세눌라 폴리모르파(Hansenula polymorpha) 및 피치아 파스토리스(Pichia pastoris)를 포함하는 그룹으로부터 선택되는 숙주 세포.
- (a) 제1항에 따른 DNA 분자, 제5항에 따른 벡터 또는 제6항에 따른 플라스미드를 숙주 세포에서 발현시키는 단계 및(b) 발현된 융합 단백질을 세포 배양물의 상등액으로부터 분리시키는 단계를 포함하는, 제4항에 따른 융합 단백질을 발효시키는 방법.
- 제10항에 있어서, 발효를 종료한 후에, pH를 2.5 내지 3.5로 조정하여 목적하지 않은 단백질을 침전시키고 발현된 융합 단백질을 침전물의 상등액으로부터 분리시킴을 포함하는 방법.
- 제10항에 있어서, 발효 상등액을 숙주 세포로부터 분리시킨 후 숙주 세포를 신선한 배지에서 반복적으로 배양하고 방출된 융합 단백질을 배양동안에 수득된 각각의 상등액으로부터 분리시킴을 포함하는 방법.
- 제10항에 있어서, 침전 후 상등액에서 발현된 단백질을 농축시키는 단계가 미세여과, 소수성 상호작용 크로마토그래피 및 이온 교환 크로마토그래피를 포함하는 그룹으로부터 선택되는 방법.
- (a) 제10항에 따라 융합 단백질을 발현하고 분리하는 단계,(b) 융합 단백질을 트립신 및 카복시펩티다제 B로 처리하는 단계 및(c) 인슐린을 (b) 단계의 반응 혼합물로부터 분리하는 단계를 포함하는, 인슐린의 제조 방법.
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