CN102007143B

CN102007143B - 具有超延迟时效特征的新型胰岛素衍生物

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Publication number: CN102007143B
Application number: CN200980101962.3A
Authority: CN
Inventors: P·哈伯曼; G·赛普克; R·库尔勒; G·米勒; M·索默费尔德; N·特纳格尔斯; G·钱克; U·韦尔纳
Original assignee: Sanofi Aventis Deutschland GmbH
Current assignee: Sanofi Aventis Deutschland GmbH
Priority date: 2008-01-09
Filing date: 2009-01-06
Publication date: 2015-08-26
Anticipated expiration: 2029-01-06
Also published as: DOP2010000209A; MA31998B1; ZA201003926B; AU2009203809B2; CO6311108A2; WO2009087081A3; JP2011509088A; ES2613152T3; CA2711749A1; BRPI0907371A2; IL206844A; NZ586590A; ECSP10010333A; PL2229407T3; HUE030537T2; NI201000114A; PE20091377A1; MY152979A; US20110077197A1; HK1149772A1

Abstract

本发明涉及具有基础时效特征的新型胰岛素类似物，其特征为：a)B链末端由酰胺化的碱性氨基酸残基组成，如赖氨酰胺或精氨酰胺；b)胰岛素A链N末端氨基酸残基是赖氨酸或精氨酸残基；c)A8氨基酸位置被组氨酸残基占据；d)A21氨基酸位置被甘氨酸残基占据；e)在A5、A15、A18、B-1、B0、B1、B2、B3和B4位置上实现带负电荷氨基酸残基的一个或者多个替换和/或添加。

Description

具有超延迟时效特征的新型胰岛素衍生物

本发明涉及具有基础时效特征的新型胰岛素类似物、其制备及用途。

糖尿病发病率近些年逐年增高，几近流行的程度。该病能严重缩短预期寿命。糖尿病患者必须频繁补充外源胰岛素。优化胰岛素治疗是合情理的。现在可获得具有特定药理性质的不同胰岛素。实际上，根据作用持续时间，不同胰岛素可区分为短效胰岛素、速效胰岛素、长效胰岛素和混合型胰岛素。长效胰岛素也称为慢效胰岛素(slow insulin)、贮库型胰岛素(depot insulin)或基础胰岛素(basal insulin)。在许多这些胰岛素产品中的活性成分是所谓的胰岛素类似物，其通过取代、删除和/或添加一个或更多个氨基酸而从人胰岛素制得。术语“胰岛素类似物”和“胰岛素”在此处具有相同的意思。

强化的胰岛素治疗策略试图通过针对稳定控制血糖水平而降低健康风险，该稳定控制血糖水平通过早期施予基础胰岛素而实现。现有的一个基础胰岛素例子是药物(活性成分：甘精胰岛素＝Gly(A21)，Arg(B31)，Arg(B32)人胰岛素)。开发新型的改良型基础胰岛素的一般目标是将低血糖事件降至最低。关于这一点，理想的基础胰岛素是在每一位患者中可靠地作用至少24小时的胰岛素。理想的胰岛素效力应延迟开始且时效特征应尽可能平缓，以使短暂的低血糖症风险明显降到最低并甚至可在未提前进食的情况下施予胰岛素。当胰岛素效力以相同水平持续尽可能长时间时基础胰岛素供应良好，即身体得到了恒定量的胰岛素供应。因此低血糖事件风险得以降低并将患者特异的差异和日期特异的差异降至最低。因此，理想基础胰岛素的药物动力学谱的特征是作用延迟开始且作用延迟，即作用长效且均一。

然而，尽管已经获得了治疗上的优点，截至目前公开的慢效胰岛素均未显示出理想基础胰岛素的药物动力学性质。目标胰岛素的时效特征应尽量平缓且长效，以使患者的低血糖事件风险和日期依赖的差异风险进一步降低并使作用时间进一步延长，以便在某些环境下不必再每日施予胰岛素。这可简化糖尿病患者的治疗，特别是均不再能自己注射胰岛素的老年糖尿病患者和需要照料的糖尿病患者，因此也将具有重大的经济利益。此外，这样的基础胰岛素也有利于早期II型糖尿病。临床医师报道，许多人对注射存在恐惧感从而不能及时开始进行胰岛素治疗。结果不能很好的控制血糖，导致后期的胰岛素后遗症。基础胰岛素减少了注射给与的胰岛素剂量数，使胰岛素治疗更为患者所接受。

Kohn等(peptides 28(2007)935-948)描述了如何能通过制备胰岛素类似物优化胰岛素药效动力学的做法，与人胰岛素的等电点(pI＝5.6)相比，通过在B链末端或A链和B链的N末端添加赖氨酸或精氨酸，所述胰岛素类似物的等电点向碱性方向移动，因此降低了在生理条件下的溶解度并使时效特征得以延长。关于这一点，Kohn等人文中的化合物18(Arg(A0)，Gly(A21)，Arg(B31)，Arg(B32)人胰岛素(实验测定的pI＝7.3；计算的pI＝7.58)被描述为上下文中理想的最佳化合物。因此，Kohn等把设计新型胰岛素类似物的主要目标理解为将带正电荷的氨基酸添加到人胰岛素的氨基酸序列，以将等电点从pI＝5.6增加到中性范围。

该新型胰岛素类似物的设计目标与用酸性氨基酸取代人胰岛素的中性氨基酸和/或添加酸性氨基酸的做法相反，因为这样的取代和/或添加至少部分抵消了引入带正电荷的氨基酸的效果。然而，现在惊奇地发现，用胰岛素类似物获得了所描述的目标基础时效特征，所述胰岛素类似物的特征为：

·B链末端由如赖氨酰胺或精氨酰胺(argininamide)的酰胺化碱性氨基酸残基组成，及，

·胰岛素A链N末端氨基酸残基是赖氨酸或精氨酸残基，及

·A8氨基酸位置被组氨酸残基占据，及

·A21氨基酸位置被甘氨酸残基占据，即在B链末端的酰胺化碱性氨基酸残基上，末端氨基酸的羧基以其酰胺化形式存在，及

·在A5、A15、A18、B-1、B0、B1、B2、B3和B4位置上用酸性氨基酸替换了两个中性氨基酸，添加了两个带负电荷的氨基酸残基或一个所述替换和一个所述添加。

由于上述前三个特征通过引入正电荷或消除负电荷而倾向于增加相应胰岛素类似物的pI，最后述及的替换和/或添加带负电荷的氨基酸残基具有相反效应并能降低pI。令人惊奇地，恰好是该所述的胰岛素类似物具有目标时效特征优点。这些化合物的pI值低于Kohn等的文章中化合物18(Arg(A0),Gly(A21),Arg(B31),Arg(B32)人胰岛素)的pI值，但仍然显示了延迟的作用开始和更长的作用持续时间，即超平缓、长效、均一的作用特征。因此，低血糖事件风险被明显降低。该延迟是如此显著以至于可以令人惊奇地在大鼠实验模型中检测到该效力，尽管作为对比，不能在大鼠中明确地观察到甘精胰岛素的延迟作用。图1显示了与甘精胰岛素的降血糖效力相比，本发明的化合物YKL205的降血糖效力。在犬中获得了相似的结果(参见图2)。因此，提供了可以以明显低的频率施予的新型基础胰岛素。除了这些所述的药物动力学优点，与甘精胰岛素相比，本发明的类似物具有明显更好的药理学性质，如受体特异性和体外促有丝分裂性。请求保护的胰岛素也具有理化优点。

因此，本发明涉及通式I的胰岛素类似物

其中

A0对应于Lys或Arg；

A5对应于Asp、Gln或Glu；

A15对应于Asp、Glu或Gln；

A18对应于Asp、Glu或Asn；

B-1对应于Asp、Glu或氨基；

B0对应于Asp、Glu或化学键；

B1对应于Asp、Glu或Phe；

B2对应于Asp、Glu或Val；

B3对应于Asp、Glu或Asn；

B4对应于Asp、Glu或Gln；

B29对应于Lys或化学键；

B30对应于Thr或化学键；

B31对应于Arg、Lys或化学键；

B32对应于Arg-酰胺、Lys-酰胺或氨基。

其中，包含A5、A15、A18、B-1、B0、B1、B2、B3和B4的组的两种氨基酸残基同时且彼此独立地对应于Asp或Glu。

本发明特别涉及如上详述的胰岛素类似物，其中彼此独立地，A0对应于Arg，或其中A5对应于Glu，或其中A15对应于Glu，或其中A18对应于Asp，或其中B-1对应于氨基，或其中B0对应于Glu，或其中B1对应于Asp，或其中B2对应于Val，或其中B3对应于Asp，或其中B4对应于Glu，或其中B29对应于Lys，或其中B30对应于Thr，或其中B31对应于Arg或Lys。

本发明特别优选地涉及选自下组的胰岛素类似物：

Arg(A0),His(A8),Glu(A5),Asp(A18),Gly(A21),Arg(B31),Arg(B32)–NH₂人胰岛素,

Arg(A0),His(A8),Glu(A5),Asp(A18),Gly(A21),Arg(B31),Lys(B32)–NH₂人胰岛素,

Arg(A0),His(A8),Glu(A15),Asp(A18),Gly(A21),Arg(B31),Arg(B32)–NH₂人胰岛素,

Arg(A0),His(A8),Glu(A15),Asp(A18),Gly(A21),Arg(B31),Lys(B32)–NH₂人胰岛素,

Arg(A0),His(A8),Glu(A5),Glu(A15),Gly(A21),Arg(B31),Arg(B32)–NH₂人胰岛素,

Arg(A0),His(A8),Glu(A5),Glu(A15),Gly(A21),Arg(B31),Lys(B32)–NH₂人胰岛素,

Arg(A0),His(A8),Glu(A5),Gly(A21),Asp(B3),Arg(B31),Arg(B32)–NH₂人胰岛素,

Arg(A0),His(A8),Glu(A5),Gly(A21),Asp(B3),Arg(B31),Lys(B32)–NH₂人胰岛素,

Arg(A0),His(A8),Glu(A15),Gly(A21),Asp(B3),Arg(B31),Arg(B32)–NH₂人胰岛素,

Arg(A0),His(A8),Glu(A15),Gly(A21),Asp(B3),Arg(B31),Lys(B32)–NH₂人胰岛素,

Arg(A0),His(A8),Asp(A18),Gly(A21),Asp(B3),Arg(B31),Arg(B32)–NH₂人胰岛素,

Arg(A0),His(A8),Asp(A18),Gly(A21),Asp(B3),Arg(B31),Lys(B32)–NH₂人胰岛素,

Arg(A0),His(A8),Gly(A21),Asp(B3),Glu(B4),Arg(B31),Arg(B32)–NH₂人胰岛素,

Arg(A0),His(A8),Gly(A21),Asp(B3),Glu(B4),Arg(B31),Lys(B32)–NH₂人胰岛素,

Arg(A0),His(A8),Glu(A5),Gly(A21),Glu(B4),Arg(B31),Arg(B32)–NH₂人胰岛素,

Arg(A0),His(A8),Glu(A5),Gly(A21),Glu(B4),Arg(B31),Lys(B32)–NH₂人胰岛素,

Arg(A0),His(A8),Glu(A15),Gly(A21),Glu(B4),Arg(B31),Arg(B32)–NH₂人胰岛素,

Arg(A0),His(A8),Glu(A15),Gly(A21),Glu(B4),Arg(B31),Lys(B32)–NH₂人胰岛素,

Arg(A0),His(A8),Asp(A18),Gly(A21),Glu(B4),Arg(B31),Arg(B32)–NH₂人胰岛素,

Arg(A0),His(A8),Asp(A18),Gly(A21),Glu(B4),Arg(B31),Lys(B32)–NH₂人胰岛素,

Arg(A0),His(A8),Glu(A5),Gly(A21),Glu(B0),Arg(B31),Arg(B32)–NH₂人胰岛素,

Arg(A0),His(A8),Glu(A5),Gly(A21),Glu(B0),Arg(B31),Lys(B32)–NH₂人胰岛素,

Arg(A0),His(A8),Glu(A15),Gly(A21),Glu(B0),Arg(B31),Arg(B32)–NH₂人胰岛素,

Arg(A0),His(A8),Glu(A15),Gly(A21),Glu(B0),Arg(B31),Lys(B32)–NH₂人胰岛素,

Arg(A0),His(A8),Asp(A18),Gly(A21),Glu(B0),Arg(B31),Arg(B32)–NH₂人胰岛素,

Arg(A0),His(A8),Asp(A18),Gly(A21),Glu(B0),Arg(B31),Lys(B32)–NH₂人胰岛素,

Arg(A0),His(A8),Glu(A5),Gly(A21),Asp(B1),Arg(B31),Arg(B32)–NH₂人胰岛素,

Arg(A0),His(A8),Glu(A5),Gly(A21),Asp(B1),Arg(B31),Lys(B32)–NH₂人胰岛素,

Arg(A0),His(A8),Glu(A15),Gly(A21),Asp(B1),Arg(B31),Arg(B32)–NH₂人胰岛素,

Arg(A0),His(A8),Glu(A15),Gly(A21),Asp(B1),Arg(B31),Lys(B32)–NH₂人胰岛素,

Arg(A0),His(A8),Asp(A18),Gly(A21),Asp(B1),Arg(B31),Arg(B32)–NH₂人胰岛素,

Arg(A0),His(A8),Asp(A18),Gly(A21),Asp(B1),Arg(B31),Lys(B32)–NH₂人胰岛素,

Arg(A0),His(A8),Gly(A21),Glu(B0),Asp(B1),Arg(B31),Arg(B32)–NH₂人胰岛素,

Arg(A0),His(A8),Gly(A21),Glu(B0),Asp(B1),Arg(B31),Lys(B32)–NH₂人胰岛素,

Arg(A0),His(A8),Asp(A18),Gly(A21),Asp(B3),Arg(B30),Arg(B31)–NH₂人胰岛素,

Arg(A0),His(A8),Asp(A18),Gly(A21),Asp(B3),Arg(B30),Lys(B31)–NH₂人胰岛素。

在提及的胰岛素类似物命名中说明的术语“人胰岛素”指人胰岛素A链和B链的氨基酸序列，在给定名称的胰岛素类似物中指明人胰岛素的所有衍生物(添加、取代、删除)。

本发明进一步涉及制备如上所述的胰岛素类似物的方法，具体地其中重组制备胰岛素类似物前体，该前体酶法加工为双链胰岛素，在存在具有胰蛋白酶活性的酶的情况下与精氨酰胺偶联，分离胰岛素类似物。

本发明进一步涉及如上所述的胰岛素类似物在制备用于治疗糖尿病，特别是I型或II型糖尿病的药物中的用途。本发明同样涉及如上所述的胰岛素类似物在制备协助β细胞再生的药物中的用途。

本发明进一步涉及包含如上所述的胰岛素类似物和/或其生理上可接受的盐的药物。

本发明进一步涉及如上所述的胰岛素类似物的制剂，其中该制剂是包含溶解的胰岛素类似物的水性溶液形式。

本发明进一步涉及如上所述的胰岛素类似物的制剂，其中该制剂是粉末形式。

本发明进一步涉及如上所述的制剂，其中如上所述的胰岛素类似物是结晶形式和/或非结晶形式。

本发明进一步涉及如上所述的胰岛素类似物的制剂，其中该制剂是悬浮液形式。

本发明进一步涉及如上所述的胰岛素类似物的制剂，其中该制剂还包含化学伴侣分子。

本发明进一步涉及编码如上所述的胰岛素类似物前体的DNA，或编码如上所述的胰岛素类似物A链或B链的DNA。

本发明进一步涉及包含如上所述的DNA的载体。

本发明进一步涉及包含如上所述的DNA或如上所述的载体的宿主生物。

本发明进一步涉及前胰岛素原类似物，其中C肽在其N末端带有精氨酸残基，其C末端带有两个精氨酸残基或一个精氨酸残基和一个赖氨酸残基，且在后一情况下，赖氨酸残基形成真正的C末端。

本发明进一步涉及如上所述的制剂，其额外包含胰高血糖素样肽1(GLP1)或其类似物或衍生物，或exendin-3或4或其类似物或衍生物，优选exendin-4。

本发明进一步涉及如上所述的制剂，其中exendin-4的类似物选自：

H-desPro³⁶-exendin-4-Lys₆-NH₂，

H-des(Pro^36,37)-exendin-4-Lys₄-NH₂或

H-des(Pro^36,37)-exendin-4-Lys₅-NH_2，

或其药学上可耐受的盐。

desPro³⁶[Asp²⁸]exendin-4(1-39),

desPro³⁶[IsoAsp²⁸]exendin-4(1-39),

desPro³⁶[Met(O)¹⁴,Asp²⁸]exendin-4(1-39),

desPro³⁶[Met(O)¹⁴,IsoAsp²⁸]exendin-4(1-39),

desPro³⁶[Trp(O₂)²⁵,Asp²⁸]exendin-2(1-39),

desPro³⁶[Trp(O₂)²⁵,IsoAsp²⁸]exendin-2(1-39),

desPro³⁶[Met(O)¹⁴Trp(O₂)²⁵,Asp²⁸]exendin-4(1-39)和

desPro³⁶[Met(O)¹⁴Trp(O₂)²⁵,IsoAsp²⁸]exendin-4(1-39)，

或其药学上可耐受的盐。

本发明进一步涉及如前面段落中所述的制剂，其中肽-Lys₆-NH₂被连到exendin-4类似物的C末端。

本发明进一步涉及如上所述的制剂，其中exendin-4类似物选自：

H-(Lys)₆-des Pro³⁶[Asp²⁸]exendin-4(1-39)-Lys₆-NH₂

des Asp²⁸Pro³⁶,Pro³⁷,Pro₃₈exendin-4(1-39)-NH₂,

H-(Lys)₆-des Pro³⁶,Pro³⁷,Pro³⁸[Asp²⁸]exendin-4(1-39)-NH₂,

H-Asn-(Glu)₅des Pro³⁶,Pro³⁷,Pro³⁸[Asp²⁸]exendin-4(1-39)-NH₂,

des Pro³⁶,Pro³⁷,Pro³⁸[Asp²⁸]exendin-4(1-39)-(Lys)₆-NH₂,

H-(Lys)₆-des Pro³⁶,Pro³⁷,Pro³⁸[Asp²⁸]exendin-4(1-39)-(Lys)₆-NH₂,

H-Asn-(Glu)₅-des Pro³⁶,Pro³⁷,Pro³⁸[Asp²⁸]exendin-4(1-39)-(Lys)₆-NH₂,

H-(Lys)₆-des Pro³⁶[Trp(O₂)²⁵,Asp²⁸]exendin-4(1-39)-Lys₆-NH₂,

H-des Asp²⁸ Pro³⁶,Pro³⁷,Pro³⁸[Trp(O₂)²⁵]exendin-4(1-39)-NH₂,

H-(Lys)₆-des Pro³⁶,Pro³⁷,Pro³⁸[Trp(O₂)²⁵,Asp²⁸]exendin-4(1-39)-NH₂,

H-Asn-(Glu)₅-des Pro³⁶,Pro³⁷,Pro³⁸[Trp(O₂)²⁵,Asp²⁸]exendin-4(1-39)-NH₂,

des Pro³⁶,Pro³⁷,Pro³⁸[Trp(O₂)²⁵,Asp²⁸]exendin-4(1-39)-(Lys)₆-NH₂,

H-(Lys)₆-des Pro³⁶,Pro³⁷,Pro³⁸[Trp(O₂)²⁵,Asp²⁸]exendin-4(1-39)-(Lys)₆-NH₂,

H-Asn-(Glu)₅-des Pro³⁶,Pro³⁷,Pro³⁸[Trp(O₂)²⁵,Asp²⁸]exendin-4(1-39)-(Lys)₆-NH₂,

H-(Lys)₆-des Pro³⁶[Met(O)¹⁴,Asp²⁸]exendin-4(1-39)-Lys₆-NH₂,

des Met(O)¹⁴ Asp²⁸ Pro ³⁶,Pro³⁷,Pro³⁸ exendin-4(1-39)-NH₂,

H-(Lys)₆-des Pro³⁶,Pro ³⁷,Pro³⁸[Met(O)¹⁴,Asp²⁸]exendin-4(1-39)-NH₂,

H-Asn-(Glu)₅-des Pro³⁶,Pro³⁷,Pro³⁸[Met(O)¹⁴,Asp²⁸]exendin-4(1-39)-NH₂,

des Pro³⁶,Pro³⁷,Pro³⁸[Met(O)¹⁴,Asp²⁸]exendin-4(1-39)-(Lys)₆-NH₂,

H-(Lys)₆-des Pro³⁶,Pro³⁷,Pro³⁸[Met(O)¹⁴,Asp²⁸]exendin-4(1-39)-Lys₆-NH₂,

H-Asn-(Glu)₅ des Pro³⁶,Pro³⁷,Pro³⁸[Met(O)¹⁴,Asp²⁸]exendin-4(1-39)-(Lys)₆-NH₂,

H-(Lys)₆-des Pro³⁶[Met(O)¹⁴,Trp(O₂)²⁵,Asp²⁸]exendin-4(1-39)-Lys₆-NH₂,

des Asp²⁸ Pro³⁶,Pro³⁷,Pro³⁸[Met(O)¹⁴,Trp(O₂)²⁵]exendin-4(1-39)-NH₂,

H-(Lys)₆-des Pro^36,Pro³⁷,Pro³⁸[Met(O)¹⁴,Trp(O₂)²⁵,Asp²⁸]exendin-4(1-39)-NH₂,

des Pro³⁶,Pro³⁷,Pro³⁸[Met(O)¹⁴,Trp(O₂)²⁵,Asp²⁸]exendin-4(1-39)-(Lys)₆-NH₂,

H-(Lys)₆-des Pro^36,Pro³⁷,Pro³⁸[Met(O)¹⁴,Trp(O₂)²⁵,Asp²⁸]exendin-4(1-39)-(Lys)₆-NH₂,

H-Asn-(Glu)₅-des Pro³⁶,Pro³⁷,Pro³⁸[Met(O)¹⁴,Trp(O₂)²⁵,Asp²⁸]exendin-4(1-39)-(Lys)₆-NH₂

或其药学上可耐受的盐。

本发明进一步涉及如上所述的制剂，其额外包含Arg³⁴,Lys²⁶(N^ε(γ谷氨酰基(N^α-十六酰基)))GLP-1(7-37)[利拉糖肽]或其药学上可耐受的盐。

关于这一点本领域技术人员清楚，本发明的胰岛素可以是施予后具有有益效应的药物制剂产品。就这一点而言，水性溶液是起点。相应地，其他组分必须是易混的。将病毒性动物污染风险降至最低，因为该制品不应含有任何动物源组分。进一步有利的是加入防腐剂以阻止微生物污染。可通过加入等张剂消除该制剂对施予位点组织细胞生理的可能的不良影响。加入鱼精蛋白可具有稳定效应，所以可通过向制剂中加入鱼精蛋白获得基本不含盐的胰岛素制品。加入酚组分可稳定使用的胰岛素类似物的结构，因此额外带来除其它之外的对作用开始的延迟作用。也可向制剂中加入稳定本发明的慢效胰岛素空间结构的物质并使热稳定性更高。这样的化学分子伴侣可例如是短的合成肽，其也可包含氨基酸类似物或包括例如胰岛素C肽来源的肽序列。

可将本发明的胰岛素装入纳米颗粒以开发贮库型胰岛素。也可能是所谓的缓释制剂，其中本发明的慢效胰岛素可逆地结合到多聚体载体。

本发明的胰岛素可与下述药物平行施予：速效胰岛素如或在研的胰岛素衍生物或具有适当时效特征的制剂或吸入型胰岛素，或在研的经鼻或经口给药的胰岛素。本领域技术人员清楚，在这一点上也可将进行适当配制的速效胰岛素和本发明的慢效胰岛素的混合物用于该目的。本发明的胰岛素类似物能进一步用于药物制品中，所述制品包含具有可与GLP-1(胰高血糖素样肽1)或exendin-4或exendin-3相比的活性的肽。这样的肽的例子是GLP-1(7-37)、依泽那太(exenatide)或在专利申请WO2006/058620、WO 2001/04156、WO 2004/005342和WO 98/08871中公开了制备方法的肽。在这一点上特别有利的制剂是那些包含这些肽的贮库型剂型的制剂。在II型糖尿病初发期特别有利的治疗类型是那些提供平行施予本发明的药物的类型，其增加了胰岛素效力，如二甲双胍。如与增加胰腺胰岛素分泌的磺脲类药物的联用一样，也可能采用与增加肠降血糖素水平的二肽基肽酶-4抑制剂的联合治疗。当通过施予分化因子启动来源于适当干细胞的胰脏β细胞再生时，使用本发明的慢效胰岛素特别有利。通过治疗糖尿病的例子提及了所有这些应用，本发明同样涉及这些应用。因此，本发明进一步涉及本发明的胰岛素与其他活性成分联合用于治疗糖尿病，特别是I型或II型糖尿病的用途。。

本发明进一步涉及包含本发明的胰岛素类似物的药物，其特别表现为水性溶液制剂或粉末。

该药物是优选用于注射目的的溶液或悬浮液的药物制品；其特征在于包含至少一种本发明的胰岛素类似物，和/或至少一种其生理上可耐受的盐，该胰岛素类似物和/或盐为溶解、非结晶和/或结晶形式，优选溶解形式。

该制品的pH优选介于约2.5至8.5，特别是介于4.0至8.5，包含合适的张度剂、合适的防腐剂，及，在适当的情况下，合适的灭菌缓冲水溶液，也优选特定锌离子浓度的灭菌缓冲水溶液。除了活性成分外的其他全部制品成分构成了制品的载体。合适的张度剂的例子如甘油、葡萄糖、甘露醇、NaCl、钙化合物或镁化合物如CaCl₂等。张度剂和/或防腐剂的选择可影响本发明胰岛素或其生理上可耐受的盐在弱酸性pH值条件下的溶解度。

合适防腐剂的例子是酚、间-甲酚、苯甲醇和/或对-羟基苯甲酸酯。

能特别用于调节pH使之介于约4.0～8.5的缓冲物质的例子是醋酸钠、柠檬酸钠、磷酸钠等。此外，生理上可接受的稀酸(一般为HCl)或稀碱(一般为NaOH)也适于调节pH。

如果制品含有锌，优选1～2mg/ml，特别是1μg/ml～200μg锌/ml的浓度。令人惊奇的是，加入锌可令人满意地影响本发明胰岛素类似物的作用特征。这允许生产总作用持续时间、作用开始速度和效力曲线特征不同的制品，因此能个体化稳定患者。产生通过“双室胰岛素装置”的另一种可能，其允许根据生活情况而给予具有作用快速发生和/或作用慢速逐步发生的制剂。

为了改变本发明制品的活性成分特征，也可混合未修饰的胰岛素，优选牛胰岛素、猪胰岛素或人胰岛素，特别是人胰岛素，或其胰岛素类似物和衍生物。同样可能混合一种或更多种exendin-4衍生物或肽，其特征在于其活性可与GLP-1(胰高血糖素样肽1)相比或直接对应于GLP-1。本发明同样涉及这样的药物(制品)。

优选的活性成分浓度为约1-1500，更优选约5-1000，特别是约40-400国际单位/ml的那些。

本发明的胰岛素类似物利用生物技术最初制备为尚未包括酰胺的前体。技术人员熟知大量制备胰岛素的技术。用于此目的的宿主细胞系统是通过发酵用于培养的细菌、酵母和植物或植物细胞。假如费用方面的考虑允许，也可使用以动物细胞作为宿主系统的表达系统。然而，其先决条件是确保不含动物病毒。因此，清楚的是，利用范例描述的表达系统仅代表了开发用于重组制备蛋白质的宿主/载体系统的一小部分。例如，基于酵母或植物系统的生物技术方法未在本申请中描述，所述酵母或植物系统如藓类、藻类或更高等植物如烟草、豌豆、红花、大麦、玉米或油菜(oilseed rape)。然而，本发明同样包括允许在合适的生物技术表达系统中制备目标肽的宿主/载体系统和编码DNA序列。因此，宿主生物可具体选自植物界，选自包含裂殖菌纲、细菌或蓝藻的第一门裂殖植物门的生物，第二门藻类植物V纲绿藻纲的生物，第二门藻类植物VII纲红藻纲的生物，第三门真菌植物门的生物，第五门苔藓植物门的生物和第七门种子植物门的生物。

欧洲专利申请EP-A 1 222 207公开了编码包括修饰的C肽的前胰岛素原的质粒pINT358d。现在可借助聚合酶链式反应(PCR)特定地修饰编码胰岛素原的序列，从而能表达可作为本发明胰岛素前体的前胰岛素原。相应的融合蛋白不必在细胞内制备。技术人员清楚，也可利用随后分泌至周质和/或培养基上清的细菌表达系统制备这样的蛋白质。欧洲专利申请EP-A 1 364 029利用实施例公开了这一点。本发明同样涉及可产生本发明的类似物的胰岛素原前体。

原则上，可将如此制备的胰岛素原转变成胰岛素类似物前体，其在位置A0包括赖氨酸或精氨酸并在B链C末端携带赖氨酸或精氨酸。

假如本发明的胰岛素原在细菌胞内表达后为包涵体或可溶形式，在进行加工和生化修饰前必须利用体外折叠技术将这些前体折叠为正确构象。在这一点上，公开的融合蛋白在用尿素或盐酸胍变性后可直接折叠，本发明同样涉及折叠中间体。

使用生化方法浓缩单个中间体，尤其是采用了已出版的及事实上为教科书主题的原理的分离方法。技术人员清楚，这样的原理可以因此组合并产生先前并未以此结果公开的方法。因此，本发明同样涉及可纯化本发明的类似物的方法。

本发明进一步涉及制备本发明的胰岛素类似物的方法，其中利用重组方法制备胰岛素类似物前体并利用酶法将其转变为双链的胰岛素前体，其在涉及A链氨基酸1的N末端携带有精氨酸或赖氨酸，在B链的C末端带有赖氨酸或精氨酸残基，其在存在具有胰蛋白酶活性的酶时用精氨酰胺或赖氨酰胺(lysinamide)转变成酰胺并因此转变成本发明的慢效胰岛素，然后利用生化纯化方法以高纯度制得本发明的胰岛素类似物。

蛋白质“类似物”指通过用其他氨基酸残基取代相应的或相同的天然蛋白质的至少一个天然氨基酸残基和/或添加和/或删除相应的或相同的天然蛋白质的至少一个氨基酸残基而不同的蛋白质。就这一点而言，也可添加非天然氨基酸残基和/或用非天然氨基酸残基取代氨基酸残基。

蛋白质“衍生物”指利用化学修饰起始蛋白质的某些氨基酸残基而获得的蛋白质。化学修饰可例如由向一个或更多个氨基酸添加一个或更多个特定化学基团组成。

附图说明

图1：新型胰岛素类似物在大鼠中的降血糖效力

图2：新型胰岛素类似物在犬中的降血糖效力

图3：YKL205在犬中的降血糖效力

图4：YKL205在犬中的降血糖效力的锌依赖性

下述实施例意图说明本发明的概念而非限制本发明。

实施例1：制备编码Gly(A21)-胰岛素和在C/A链交界带有Arg Arg的修饰C肽的衍生载体pINT3580

欧洲专利申请EP-A 1 222 207公开了质粒pINT358d、pINT91d和引物序列Tir。使用这些产品的DNA构建质粒pINT3580。质粒pINT358d的特征还包括编码具有特定性质的修饰C肽的基因序列。合成了三条引物序列：

pint3580_glya21rev

5′-CAAAGGTCGACTATTAGCAGTAGTTCTCCAGCTGG-3′(SEQ ID NO：3)

该引物用于在pINT358d编码的胰岛素原序列A链的位置21引入甘氨酸(粗体、加下划线)而不是天冬酰胺。

arg_cjuncf

5′-GTCCCTGCAGCGCGGCATCGTGGAGCAG-3′(SEQ ID NO：4)

该引物与引物arg_cjunc_rev的作用一样，用于在胰岛素A/B链交界处引入精氨酸而不是赖氨酸。

arg_cjunc_rev

5′-CCACGATGCC GCGCTGC AGGGACCCCT CCAGCG-3′(SEQ ID NO：5)

在两条引物中，待引入的精氨酸密码子均以粗体表示。按照欧洲专利申请EP-A 1 222 207的方法，分别用引物对Tir/arg_cjunc_rev和arg_cjuncf/pint3580_glya21rev和质粒pINT358d的DNA作为模板进行PCR。组合两个反应产物的等份样品并在第三个PCR中与引物对Tir/pint3580_glya21rev共同使用。按照厂商说明书在一个或相同反应中，在用凝胶电泳分离该反应混合物后纯化该反应产物，用限制酶SalI/NcoI消化该反应产物，利用凝胶电泳分离该反应混合物，分离编码胰岛素原序列的DNA片段。然后，利用DNA连接酶反应将该片段插入NcoI/SalI切开的pINT91d载体DNA。

用连接混合物转化大肠杆菌感受态细胞。将转化混合物涂布在含25mg/l氨苄青霉素的选择平板上。从长出的克隆中分离质粒DNA并用DNA序列分析进行鉴定。正确的质粒称为pINT3580。

实施例2：构建编码His(A8)，Gly(A21)-前胰岛素原的质粒pINT3581

如实施例1中所述，用3个聚合酶链式反应完成该构建。将第三个反应的产物用NcoI/SalI酶切后插入用NcoI/SalI切开的pINT91d载体DNA中。使用了引物Tir和pint3580_glya21rev。另外合成了两条引物：

pint3580_Ha8f

5’-AGCAGTGCTGCAGCATCTGCTCCCTCTAC-3’(SEQ ID NO：6)

pint3580_Ha8rev

5’-GAG CAGATGCTGCAGCACTG CTCCACGATG-3’(SEQ ID NO：7)

通过加粗每个字母强调了编码A链位置8组氨酸的密码子。按实施例1中所述的方法完成该构建。PCR1和2的模板为质粒pINT3580的DNA。分别用引物对Tir/pint3580_Ha8rev和pint3580_Ha8f/pint3580_glya21rev进行PCR1和PCR2。PCR3使用了引物对Tir/pint3580_glya21rev。该反应的模板为PCR1和PCR2反应产物的混合物。正确的质粒称为pINT3581。

实施例3：构建编码His(A8),Glu(A5),Gly(A21)-前胰岛素原的质粒pINT3582

按实施例1和2所述方法用3个聚合酶链式反应完成该构建过程。第三个反应的产物用NcoI/SalI酶切后插入NcoI/SalI切开的pINT91d载体DNA。使用了引物Tir和pint3580-glya21rev。另外合成了两条引物。

pint3581_Ea5f

5′GCATCGTGGAGTGCTGCCACAGCATCTG 3′(SEQ ID NO：8)

pint3581_Ea5rev

5’-CTGT GGCAGCACTCCACGATG CCGCGACG-3’(SEQ ID NO：9)

通过加粗每个字母强调了编码A链位置5谷氨酸的密码子。按实施例1所述方法完成该构建过程。模板为质粒pINT3581的DNA。正确的质粒称为pINT3582。

实施例4：构建编码His(A8),Asp(A18),Gly(A21)-前胰岛素原的质粒pINT3583

该构建过程与实施例1不同，仅利用一个聚合酶链式反应完成。该反应的产物用NcoI/SalI酶切后插入NcoI/SalI切开的pINT91d载体DNA。使用了引物Tir。另外合成了一条引物：

pint3580_Da18rev

5′CAAAGGTCGACTATTAGCCGCAGTACTCCAGCTGGTAGAGGGAG 3′(SEQ ID NO：10)

加粗强调了编码A链位置18天冬氨酸的密码子。模板是质粒pINT3581的DNA。正确的质粒称为pINT3583。

实施例5：构建编码His(A8),Glu(A5)Asp(A18),Gly(A21)–前胰岛素原的质粒pINT3584

不同于实施例1，该构建方法仅利用一个聚合酶链式反应完成。该反应的产物用NcoI/SalI酶切后插入用NcoI/SalI切开的pINT91d载体DNA。使用了引物Tir.pint3580_Da18rev(ex.4)。模板是质粒pINT3582的DNA。正确的质粒称为pINT3584。该质粒编码的前胰岛素原是化合物YKL205-1的前体，其用精氨酰胺酰胺化并具有下述结构：

Arg(A0),Glu(A5),His(A8),Asp(A18),Gly(A21),Arg(B31),Arg(B32)-NH₂–人胰岛素。

用赖氨酰胺酰胺化后获得了化合物YKL205-1b：

Arg(A0),Glu(A5),His(A8),Asp(A18),Gly(A21),Arg(B31),Lys(B32)-NH₂–人胰岛素。

实施例6：构建编码His(A8),Glu(A15),Gly(A21)-前胰岛素原的质粒pINT3585

pint3580_Ea15rev

5′-CAAAGGTCGA CTATTAGCCG CAGTAGTTCTCCAGGTA GAGGGAGCAGATGCTG-3′(SEQ ID NO：11)

加粗强调了编码A链位置15谷氨酸的密码子。模板是质粒pINT3581的DNA。正确的质粒称为pINT3585。

实施例7：构建编码His(A8),Glu(A15),Asp(A18),Gly(A21)–前胰岛素原的质粒pINT3586

与实施例1不同，该构建方法仅利用一个聚合酶链式反应完成。该反应的产物用NcoI/SalI酶切后插入用NcoI/SalI切开的pINT91d载体DNA。使用了引物Tir。另外合成了一条引物：

pint3585_Ea15_Da18rev

5′-CAAAGGTCGACTATTAGCCGCAGTACTCCAGGTAGAGGGAGCAGATGCTG-3′(SEQ ID NO：12)

通过加粗每一个字母强调了A链位置15的谷氨酸及A链位置A18的天冬氨酸的密码子。模板是质粒pINT3581的DNA。正确的质粒称为pINT3586。该质粒编码的前胰岛素原是化合物YKL205的前体，其用精氨酰胺酰胺化并具有下述结构：

Arg(A0),His(A8),Glu(A15),Asp(A18),Gly(A21),Arg(B31),Arg(B32)–NH₂–人胰岛素。

该质粒编码的前胰岛素原是化合物YKL205b的前体，其用赖氨酰胺酰胺化并具有下述结构：

Arg(A0),His(A8),Glu(A15),Asp(A18),Gly(A21),Arg(B31),Lys(B32)–NH₂–人胰岛素。

实施例8：构建编码Glu(A5),His(A8),Glu(A15),Gly(A21)–前胰岛素原的质粒pINT3587

与实施例1不同，该构建过程仅利用一个聚合酶链式反应完成。该反应的产物用NcoI/SalI酶切后插入NcoI/SalI切开的pINT91d载体DNA。使用了引物Tir和实施例6所述的引物pint3580_Ea15rev。模板是质粒pINT3582的DNA。正确的质粒称为pINT3587。该质粒编码的前胰岛素原是化合物YKL205-2的前体，其用精氨酰胺酰胺化并具有下述结构：

Arg(A0),Glu(A5),His(A8),Glu(A15),Gly(A21),Arg(B31),Arg(B32)–NH₂–人胰岛素。

该质粒编码的前胰岛素原是化合物YKL205-2b的前体，其用赖氨酰胺酰胺化并具有下述结构：

Arg(A0),Glu(A5),His(A8),Glu(A15),Gly(A21),Arg(B31),Lys(B32)–NH₂–人胰岛素。

实施例9：构建编码His(A8),Gly(A21),Asp(B3)-前胰岛素原的质粒pINT3588

按实施例1和2所述方法用3个聚合酶链式反应完成了该构建过程。第三个反应的产物用NcoI/SalI酶切后插入NcoI/SalI切开的pINT91d载体DNA。使用了引物Tir和pint3580_glya21rev。另外合成了两条引物：

pint3581_Db3f

5′-GCACGATTTGTGCAGCACCTGTGCGGC-3′(SEQ ID NO：13)

pint3581_Db3rev

5′-CACAGG TGCTGCA CAAATCGTGC CGAATTTC-3′(SEQ ID NO：14)

通过加粗每一个字母强调了编码胰岛素B链位置3天冬氨酸的密码子。按实施例1所述方法完成了该构建过程。模板是质粒pINT3581的DNA。正确的质粒称为pINT3588。

实施例10：构建编码Glu(A5),His(A8),Gly(A21),Asp(B3)-前胰岛素原的质粒pINT3589

按实施例9所述方法进行该反应，但在PCR1和PCR2中使用质粒pINT3582的DNA作为模板，产物为质粒pINT3589。

该质粒编码的前胰岛素原是化合物YKL205-3的前体，其用精氨酰胺酰胺化并具有下述结构：

Arg(A0),Glu(A5),His(A8),Gly(A21),Asp(B3),Arg(B31),Arg(B32)–NH₂–人胰岛素。

该质粒编码的前胰岛素原是化合物YKL205-3b的前体，其用赖氨酰胺酰胺化并具有下述结构：

Arg(A0),Glu(A5),His(A8),Gly(A21),Asp(B3),Arg(B31),Lys(B32)–NH₂–人胰岛素。

实施例11：构建编码His(A8),Glu(A15),Gly(A21),Asp(B3)–前胰岛素原的质粒pINT3590

按实施例9所述方法进行该反应，但在PCR1和PCR2中使用质粒pINT3585的DNA作为模板，产物为质粒pINT3590。该质粒编码的前胰岛素原是化合物YKL205-4的前体，其用精氨酰胺酰胺化并具有下述结构：

Arg(A0),His(A8),Glu(A15),Gly(A21),Asp(B3),Arg(B31),Arg(B32)–NH₂–人胰岛素。

该质粒编码的前胰岛素原是化合物YKL205-4b的前体，其用赖氨酰胺酰胺化并具有下述结构：

Arg(A0),His(A8),Glu(A15),Gly(A21),Asp(B3),Arg(B31),Lys(B32)–NH₂–人胰岛素。

实施例12：构建编码His(A8),Asp(A18),Gly(A21),Asp(B3)-前胰岛素原的质粒pINT3591

按实施例9所述方法进行该反应，但在PCR1和PCR2中使用质粒pINT3586的DNA作为模板，产物为质粒pINT3591。该质粒编码的前胰岛素原是化合物YKL205-5的前体，其用精氨酰胺酰胺化并具有下述结构：

Arg(A0),His(A8),Asp(A18),Gly(A21),Asp(B3),Arg(B31),Arg(B32)–NH₂–人胰岛素。

该质粒编码的前胰岛素原是化合物YKL205-5b的前体，其用赖氨酰胺酰胺化并具有下述结构：

Arg(A0),His(A8),Asp(A18),Gly(A21),Asp(B3),Arg(B31),Lys(B32)–NH₂–人胰岛素。

实施例13：构建编码His(A8),Gly(A21),Asp(B3)-Glu(B4)–前胰岛素原的质粒pINT3592

按实施例1和2所述方法用3个聚合酶链式反应进行该构建过程。第三个反应的产物用NcoI/SalI酶切后插入NcoI/SalI切开的pINT91d载体DNA。使用了引物Tir和pint3580_glya21rev。另外合成了两条引物：

pint3581_Db3_Eb4f

5′-GCACGATTTGTGCACCTGTGCGGCTC-3′(SEQ ID NO：15)

pint3581_Db3_Eb4rev

5′-CGCACAGG TGCA CAAATCGTGC CGAATTTC-3′(SEQ ID NO：16)

通过加粗每一个字母强调了编码胰岛素B链位置3天冬氨酸和位置4谷氨酸的密码子。按实施例1所述方法完成了该构建过程。模板是质粒pINT3581的DNA。正确的质粒称为pINT3592。该质粒编码的前胰岛素原是化合物YKL202-6的前体，其用精氨酰胺酰胺化并具有下述结构：

Arg(A0),His(A8),Gly(A21),Asp(B3),Glu(B4),Arg(B31),Arg(B32)-NH₂-人胰岛素。

该质粒编码的前胰岛素原是化合物YKL202-6b的前体，其用赖氨酰胺酰胺化并具有下述结构：

Arg(A0),His(A8),Gly(A21),Asp(B3),Glu(B4),Arg(B31),Lys(B32)–NH₂-人胰岛素

实施例14：构建编码His(A8),Gly(A21),Glu(B4)前胰岛素原的质粒pINT3593

pint3581_Eb4f

5′-ACGATTTGTGAACCACCTGTGCGGCTC-3′(SEQ ID NO：17)

pint3581_Eb4rev

5′-CGCACAGG TGGTTCA CAAATCGTGC CGAATTTC-3′(SEQ ID NO：18)

加粗强调了编码胰岛素B链位置4谷氨酸的密码子。按实施例1所述方法完成了该构建过程。模板是质粒pINT3581的DNA。正确的质粒称为pINT3593。

实施例15：构建编码Glu(A5),His(A8),Gly(A21),Glu(B4)–前胰岛素原的质粒pINT3594

按实施例9所述方法进行该反应，但在PCR1和PCR2中使用质粒pINT3582的DNA作为模板，产物为质粒pINT3594。

该质粒编码的胰岛素原是化合物YKL205-7的前体，其用精氨酰胺酰胺化并具有下述结构：

Arg(A0),Glu(A5),His(A8),Gly(A21),Glu(B4),Arg(B31),Arg(B32)–NH₂–人胰岛素。

该质粒编码的胰岛素原是化合物YKL205-7b的前体，其用赖氨酰胺酰胺化并具有下述结构：

Arg(A0),Glu(A5),His(A8),Gly(A21),Glu(B4),Arg(B31),Lys(B32)–NH₂–人胰岛素。

实施例16：构建编码His(A8),Glu(A15),Gly(A21),Glu(B4)–前胰岛素原的质粒pINT3595

按实施例9所述方法进行该反应，但在PCR1和PCR2中使用质粒pINT3585的DNA作为模板，产物为质粒pINT3595。

该质粒编码的前胰岛素原是化合物YKL205-8的前体，其用精氨酰胺酰胺化并具有下述结构：

Arg(A0),His(A8),Glu(A15),Gly(A21),Glu(B4),Arg(B31),Arg(B32)–NH₂–人胰岛素。

该质粒编码的前胰岛素原是化合物YKL205-8b的前体，其用赖氨酰胺酰胺化并具有下述结构：

Arg(A0),His(A8),Glu(A15),Gly(A21),Glu(B4),Arg(B31),Lys(B32)–NH₂–人胰岛素。

实施例17：构建编码His(A8),Asp(A18),Gly(A21),Glu(B4)-前胰岛素原的质粒pINT3596

按实施例9所述方法进行该反应，但在PCR1和PCR2中使用质粒pINT3586的DNA作为模板，产物为质粒pINT3596。该质粒编码的前胰岛素原是化合物YKL205-9的前体，其用精氨酰胺酰胺化并具有下述结构：

Arg(A0),His(A8),Asp(A18),Gly(A21),Glu(B4),Arg(B31),Arg(B32)–NH₂–人胰岛素。

该质粒编码的前胰岛素原是化合物YKL205-9b的前体，其用赖氨酰胺酰胺化并具有下述结构：

Arg(A0),His(A8),Asp(A18),Gly(A21),Glu(B4),Arg(B31),Lys(B32)–NH₂–人胰岛素。

实施例18：构建编码His(A8),Gly(A21),Glu(B0)-前胰岛素原的质粒pINT3597

利用2个聚合酶链式反应完成了该构建过程。使用了引物pint3580_glya21rev。另外合成了两条引物：

pint3581_Eb0f1

5′-CAACAGGAA ATTCGGCACG ATTTGTG AACCAGCACC TGTGCG-3’(SEQID NO：19)

pint3581_Eb01f2

5′-TATCGA CCAT GG CAACAACA TCAACAGGAA ATTCGGCACG A-3’(SEQ ID NO：20)

该实施例中的两条引物有部分重叠。Pint3581_Eb0f2含有NcoI识别序列。用下划线标出了该序列。通过加粗每一个字母强调了编码B链开始部分位置0谷氨酸的密码子。PCR1的模板是质粒pINT3581的DNA。

用引物对pint3581_Eb-1f2/pint3580_glya21rev进行PCR1。PCR2的模板是PCR1的产物。用引物对pint3581_Eb-1f2/pint3580_glya21rev进行PCR2。PCR2的产物包含完整的前胰岛素原序列。第二个反应的产物用NcoI/SalI酶切后插入NcoI/SalI切开的pINT91d载体DNA。正确的质粒称为pINT3597。用天冬氨酸密码子替换位置B0的谷氨酸密码子并依照该实施例产生了在B0位置为天冬氨酸而不是谷氨酸的质粒。

实施例19：构建编码Glu(A5),His(A8),Gly(A21),Glu(B0)–前胰岛素原的质粒pINT3598

按实施例18所述方法进行该反应，但在PCR1中使用质粒pINT3582的DNA作为模板，产物为质粒pINT3598。该质粒编码的前胰岛素原是化合物YKL205-10的前体，其用精氨酰胺酰胺化并具有下述结构：

Arg(A0),Glu(A5),His(A8),Gly(A21),Glu(B0),Arg(B31),Arg(B32)–NH₂–人胰岛素。

该质粒编码的前胰岛素原是化合物YKL205-10b的前体，其用赖氨酰胺酰胺化并具有下述结构：

Arg(A0),Glu(A5),His(A8),Gly(A21),Glu(B0),Arg(B31),Lys(B32)–NH₂–人胰岛素。

实施例20：构建编码His(A8),Glu(A15),Gly(A21),Glu(B0)–前胰岛素原的质粒pINT3599

按实施例18所述方法进行该反应，但在PCR1中使用质粒pINT3585的DNA作为模板，产物为质粒pINT3599。该质粒编码的前胰岛素原是化合物YKL205-11的前体，其用精氨酰胺酰胺化并具有下述结构：

Arg(A0),His(A8),Glu(A15),Gly(A21),Glu(B0),Arg(B31),Arg(B32)–NH₂–人胰岛素。

该质粒编码的前胰岛素原是化合物YKL205-11b的前体，其用赖氨酰胺酰胺化并具有下述结构：

Arg(A0),His(A8),Glu(A15),Gly(A21),Glu(B0),Arg(B31),Lys(B32)–NH₂–人胰岛素。

实施例21：构建编码His(A8),Asp(A18),Gly(A21),Glu(B0)-前胰岛素原的质粒pINT3600

按实施例18所述方法进行该反应，但在PCR1中使用质粒pINT3586的DNA作为模板，产物为质粒pINT3600。该质粒编码的前胰岛素原是化合物YKL205-12的前体，其用精氨酰胺酰胺化并具有下述结构：

Arg(A0),His(A8),Asp(A18),Gly(A21),Glu(B0),Arg(B31),Arg(B32)–NH₂–人胰岛素。

该质粒编码的前胰岛素原是化合物YKL205-12b的前体，其用赖氨酰胺酰胺化并具有下述结构：

Arg(A0),His(A8),Asp(A18),Gly(A21),Glu(B0),Arg(B31),Lys(B32)–NH₂–人胰岛素。

实施例22：构建编码His(A8),Gly(A21),Asp(B1)-前胰岛素原的质粒pINT3601

利用两个聚合酶链式反应完成了该构建过程。使用了引物pint3580_glya21rev。另外合成了两条引物：

pint3581_Db1f1

5′-CAACAGGAA ATTCGGCACG AGTG AACCAGCACC TGTGCG-3’(SEQ IDNO：21)

pint3581_Db1f2

5′-TATCGA CCAT GG CAACAACA TCAACAGGAA ATTCGGCACG A-3’(SEQID NO：22)

在该实施例中，两条引物有部分重叠。Pint3581_Db-1f2含有NcoI识别序列。用下划线标出了该序列。通过加粗每一个字母强调了编码B链位置1天冬氨酸的密码子。PCR1模板是质粒pINT3581的DNA。用引物pint3581_Db1f1/pint3580_glya21rev进行PCR1。PCR2的模板是PCR1的产物。用引物对pint3581_Db1f2/pint3580_glya21rev进行PCR2。PCR2的产物包含完整的前胰岛素原序列。第二个反应的产物用NcoI/SalI酶切后插入NcoI/SalI切开的pINT91d载体DNA。正确的质粒称为pINT3601。

实施例23：构建编码Glu(A5),His(A8),Gly(A21),Asp(B1)-前胰岛素原的质粒pINT3602

按实施例22所述方法进行该反应，但在PCR1中使用质粒pINT3582的DNA作为模板，产物为质粒pINT3602。该质粒编码的前胰岛素原是化合物YKL205-13的前体，其用精氨酰胺酰胺化并具有下述结构：

Arg(A0),Glu(A5),His(A8),Gly(A21),Asp(B1),Arg(B31),Arg(B32)–NH₂–人胰岛素。

该质粒编码的前胰岛素原是化合物YKL205-13b的前体，其用赖氨酰胺酰胺化并具有下述结构：

Arg(A0),Glu(A5),His(A8),Gly(A21),Asp(B1),Arg(B31),Lys(B32)–NH₂–人胰岛素。

实施例24：构建编码His(A8),Glu(A15),Gly(A21),Asp(B1)–前胰岛素原的质粒pINT3603

按实施例22所述方法进行该反应，但在PCR1中使用质粒pINT3585的DNA作为模板，产物为质粒pINT3603。该质粒编码的前胰岛素原是化合物YKL205-14的前体，其用精氨酰胺酰胺化并具有下述结构：

Arg(A0),His(A8),Glu(A15),Gly(A21),Asp(B1),Arg(B31),Arg(B32)–NH₂–人胰岛素。

该质粒编码的前胰岛素原是化合物YKL205-14b的前体，其用赖氨酰胺酰胺化并具有下述结构：

Arg(A0),His(A8),Glu(A15),Gly(A21),Asp(B1),Arg(B31),Lys(B32)–NH₂–人胰岛素。

实施例25：构建编码His(A8),Asp(A18),Gly(A21),Asp(B1)–前胰岛素原的质粒pINT3604

按实施例22所述方法进行该反应，但在PCR1中使用质粒pINT3586的DNA作为模板，产物为质粒pINT3604。该质粒编码的前胰岛素原是化合物YKL205-15的前体，其用精氨酰胺酰胺化并具有下述结构：

Arg(A0),His(A8),Asp(A18),Gly(A21),Asp(B1),Arg(B31),Arg(B32)–NH₂–人胰岛素。

该质粒编码的前胰岛素原是化合物YKL205-15b的前体，其用赖氨酰胺酰胺化并具有下述结构：

Arg(A0),His(A8),Asp(A18),Gly(A21),Asp(B1),Arg(B31),Lys(B32)–NH₂–人胰岛素。

实施例26：构建编码His(A8),Gly(A21),Glu(B0),Asp(B1)-前胰岛素原的质粒pINT3605

利用两个聚合酶链式反应完成了该构建过程。使用了实施例18中所述的引物pint3580_glya21rev和引物pint3581_Eb01f2。合成了引物pint3597_Db1f：

5′-CAACAGGAA ATTCGGCACG AGTG AACCAGCACC TGTGC-3’(SEQID NO：23)

通过加粗每一个字母强调了编码位置0的谷氨酸和B链开始部分的天冬氨酸的密码子。PCR1的模板是质粒pINT3597的DNA。用引物对pint3597_Db1f/pint3580_glya21rev进行PCR1。PCR2的模板是PCR1产物。用引物对pint3581_Eb1f2/pint3580_glya21rev进行PCR2。PCR2的产物包含完整前胰岛素原序列。第二个反应的产物用NcoI/SalI酶切后插入NcoI/SalI切开的pINT91d载体DNA。正确的质粒称为pINT3605。该质粒编码的前胰岛素原是化合物YKL205-16的前体，其用精氨酰胺酰胺化并具有下述结构：

Arg(A0),His(A8),Gly(A21),Glu(B0),Asp(B1),Arg(B31),Arg(B32)–NH₂–人胰岛素。

该质粒编码的前胰岛素原是化合物YKL205-16a的前体，其用赖氨酰胺酰胺化并具有下述结构：

Arg(A0),His(A8),Gly(A21),Glu(B0),Asp(B1),Arg(B31),Lys(B32)–NH₂–人胰岛素。

实施例27：构建编码His(A8),Glu(A15),Asp(A18),Gly(A21),desThr(B30)–前胰岛素原的质粒pINT3606

按实施例1和2所述方法用3个聚合酶链式反应进行该构建过程。使用了引物Tir和pint3580_glya21rev。另外合成了两条引物：

desB30f

5′-TTCTACACACCCCGCGATGTTCCTCAGGTGG-3’(SEQ ID NO：24)

desB30rev

5’-AGG AACATCGCGC TTGGGTGTGT AGAAGAAGC-3’(SEQ ID NO：25)

PCR1和PCR2的模板是质粒pINT3586的DNA。用引物对desB30f/pint3580_glya21rev进行PCR1，用引物对Tir/desB30rev template进行PCR2。PCR3的模板是PCR1和PCR2产物的等摩尔混合物。用引物对Tir/pint3580_glya21rev进行该反应。PCR3的产物包含完整前胰岛素原序列。第三个反应的产物用NcoI/SalI酶切后插入NcoI/SalI切开的pINT91d载体DNA。该质粒编码的前胰岛素原是化合物YKL205-17的前体，其用精氨酰胺酰胺化并具有下述结构：

Arg(A0),His(A8),Glu(A15),Asp(A18),Gly(A21),Arg(B30),Arg(B31)-NH₂-人胰岛素。

该质粒编码的前胰岛素原是化合物YKL205-17b的前体，其用赖氨酰胺酰胺化并具有下述结构：

Arg(A0),His(A8),Glu(A15),Asp(A18),Gly(A21),Arg(B30),Lys(B31)–NH₂-人胰岛素

实施例28：表达胰岛素原衍生物

按照欧洲专利申请EP A 1 222 207实施例1的方法进行该表达。

实施例29：折叠胰岛素原衍生物

基本按照EP-A 0 668 282公开的方法进行该折叠。

实施例30：酶法加工经折叠的前胰岛素原以给出B链末端C末端的特征为赖氨酸或精氨酸的双链Arg(A0)-胰岛素前体。

按照例如WO91/03550实施例4中公开的方法酶法加工经折叠的前胰岛素原前体。证明使用WO 2007/031187 A1中公开的胰蛋白酶变体在本实施例中具有特别有利的效果。

实施例31：制备Arg(A0),His(A8),Gly(A21),Arg(B31),Arg(B32)–NH₂-人胰岛素。

不用考虑其它酸性氨基酸的定位，可进行下述标准反应：在0.95ml精氨酰胺溶液(446g/L)中溶解100mg Arg(A0),Gly(A21),Arg(B31)-胰岛素类似物，加入0.13ml的M醋酸钠缓冲液(pH 5.8)和2ml DMF。将反应混合物冷却至12℃并通过加入0.094ml胰蛋白酶(0.075mg，RocheDiagnostics)而起始反应。8小时后通过加入TFA使pH降至2.5而终止反应，进行HPLC分析。形成了＞60％的Arg(A0),Gly(A21),Arg(B31),Arg(B32)-NH₂-人胰岛素。加入胰蛋白酶抑制剂溶液，然后以与US5,656,722所述方法相似的方法纯化酰胺化的类似物。

以类似方法制备相应的赖氨酰胺化合物。然而，该反应的起始材料是溶液形式的含有366g/L赖氨酰胺的赖氨酰胺水性储液。

实施例32：配制酰胺化的胰岛素衍生物

为了测试本发明胰岛素衍生物的生物药理学(biopharmacological)性质和理化性质，按如下方法制备该化合物的溶液：在含有80μg/mL锌(氯化锌形式)的1mM盐酸溶液中将本发明的胰岛素衍生物溶解至240±5μM的靶浓度。

使用下述组成作为溶解介质：

a)1mM盐酸

b)1mM盐酸,5μg/ml锌(以氯化锌或盐酸形式加入)

c)1mM盐酸,10μg/ml锌(以氯化锌或盐酸形式加入)

d)1mM盐酸,15μg/ml锌(以氯化锌或盐酸形式加入)

e)1mM盐酸,30μg/ml锌(以氯化锌或盐酸形式加入)

f)1mM盐酸,80μg/ml锌(以氯化锌或盐酸形式加入)

g)1mM盐酸,120μg/ml锌(以氯化锌或盐酸形式加入)

为了该目的，首先称出一定量的冷冻干燥材料，该材料的量比基于分子量和目标浓度所需的量高大约30％。然后，利用分析型HPLC测定本浓度，然后用含有80μg/mL锌的5mM盐酸溶液将该溶液制备成获取靶浓度所需要的体积。需要时可将pH重新调整至3.5±0.1。在用HPLC分析以最终确认240±5μM的靶浓度后，利用具有0.2μm滤器配件的注射器将该终溶液转移至灭菌管，该管用隔膜和螺口盖封闭。在短期单个测试本发明的胰岛素衍生物时并未优化制剂，例如关于加入等张剂、防腐剂或缓冲材料等。

实施例33：评估新型胰岛素类似物在大鼠中的降血糖效力

在健康、雄性、血糖正常的Wistar大鼠中测试了所选新型胰岛素类似物的降血糖效力。雄性大鼠皮下注射剂量为9nmol/kg的胰岛素类似物。临在注射胰岛素类似物前以及在注射后的规律间隔时间(最多至8小时)收集动物血样并测其血糖含量。该实验清楚显示(参见图1)，使用的本发明的胰岛素类似物明显延迟了作用开始并使作用持续时间更长且均一。

实施例34：评估新型胰岛素类似物在犬中的降血糖效力

在健康、雄性、血糖水平正常的比格犬(beagle dog)中测试了所选新型胰岛素类似物的降血糖效力。雄性比格犬皮下注射剂量为6nmol/kg的胰岛素类似物。临在注射胰岛素类似物前以及在注射后的规律间隔时间(最多至48小时)收集动物血样并测其血糖含量。该实验清楚显示(参见图2)，使用的本发明的胰岛素类似物明显延迟了作用开始并使作用持续时间更长且均一。

实施例35：以两倍剂量评估在犬中的降血糖效力

在健康、雄性、血糖水平正常的比格犬中测试了所选新型胰岛素类似物的降血糖效力。雄性比格犬皮下注射剂量为6nmol/kg和12nmol/kg的胰岛素类似物。临在注射胰岛素类似物前以及在注射后的规律间隔时间(最多至48小时)收集动物血样并测其血糖含量。该实验清楚显示(参见图3)，使用的本发明的胰岛素类似物具有剂量依赖性，但尽管剂量增加了一倍，作用依然很平缓，即未观察到显著的低点(最低点)。由此可推断，本发明的胰岛素与已知慢效胰岛素相比产生明显少的低血糖事件。

实施例36：评估含不同浓度锌的制剂在犬中的降血糖效力

按实施例35所述方法进行该实验。图4显示了结果。根据该结果，本发明胰岛素类似物的时间-效力曲线可被含相同浓度胰岛素的制剂中锌离子含量以如下方式所影响：当锌含量为零或低锌含量时，观察到作用快速开始且效力维持24小时，而当锌含量较高时，观察到作用逐步开始且胰岛素效力维持时间明显长于24小时。

序列表

<110>塞诺菲-安万特德国有限公司

<120>具有超延迟时效特征的新型胰岛素衍生物

<130>DE2008/001

<140>102008003568.8-43

<141>2008-01-09

<160>25

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>22

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>A链

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(1)..(1)

<223>Xaa对应于Lys或Arg

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(6)..(6)

<223>Xaa对应于Asp，Gln或Glu

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(16)..(16)

<223>Xaa对应于Asp，Glu或Gln

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(19)..(19)

<223>Xaa对应于Asp，Glu或Asn

<400>1

Xaa Gly Ile Val Glu Xaa Cys Cys His Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Xaa

1 5 10 15

Leu Glu Xaa Tyr Cys Gly

20

<210>2

<211>34

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>B链

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(1)..(1)

<223>Xaa对应于Asp，Glu或氨基

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(2)..(2)

<223>Xaa对应于Asp，Glu或化学键

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(3)..(3)

<223>Xaa对应于Asp，Glu或Phe

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(4)..(4)

<223>Xaa对应于Asp，Glu或Val

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(5)..(5)

<223>Xaa对应于Asp，Glu或Asn

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(6)..(6)

<223>Xaa对应于Asp，Glu或Gln

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(31)..(31)

<223>Xaa对应于Lys或化学键

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(32)..(32)

<223>Xaa对应于Thr或化学键

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(33)..(33)

<223>Xaa对应于Arg，Lys或化学键

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(34)..(34)

<223>Xaa对应于Arg-酰胺，Lys-酰胺或氨基

<400>2

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala

1 5 10 15

Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Xaa Xaa

20 25 30

Xaa Xaa

<210>3

<211>38

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>pint3580_glya21rev

<400>3

caaaggtcga ctattagccg cagtagttct ccagctgg 38

<210>4

<211>31

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>arg_cjuncf

<400>4

gtccctgcag cgtcgcggca tcgtggagca g 31

<210>5

<211>36

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>arg_cjunc_rev

<400>5

ccacgatgcc gcgacgctgc agggacccct ccagcg 36

<210>6

<211>32

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>pint3580_Ha8f

<400>6

agcagtgctg ccacagcatc tgctccctct ac 32

<210>7

<211>33

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>pint3580_Ha8rev

<400>7

gagcagatgc tgtggcagca ctgctccacg atg 33

<210>8

<211>31

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>pint3581_Ea5f

<400>8

gcatcgtgga ggagtgctgc cacagcatct g 31

<210>9

<211>32

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>pint3581_Ea5rev

<400>9

ctgtggcagc actcctccac gatgccgcga cg 32

<210>10

<211>47

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>pint3580_Da18rev

<400>10

caaaggtcga ctattagccg cagtagtcct ccagctggta gagggag 47

<210>11

<211>56

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>pint3580_Ea15rev

<400>11

caaaggtcga ctattagccg cagtagttct ccagctcgta gagggagcag atgctg 56

<210>12

<211>56

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>pint3585_Ea15_Da18rev

<400>12

caaaggtcga ctattagccg cagtagtcct ccagctcgta gagggagcag atgctg 56

<210>13

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>pint3581_Db3f

<400>13

gcacgatttg tggaccagca cctgtgcggc 30

<210>14

<211>34

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>pint3581_Db3rev

<400>14

cacaggtgct ggtccacaaa tcgtgccgaa tttc 34

<210>15

<211>32

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>pint3581_Db3_Eb4f

<400>15

gcacgatttg tggacgagca cctgtgcggc tc 32

<210>16

<211>36

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>pint3581_Db3_Eb4rev

<400>16

cgcacaggtg ctcgtccaca aatcgtgccg aatttc 36

<210>17

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>pint3581_Eb4f

<400>17

acgatttgtg aacgagcacc tgtgcggctc 30

<210>18

<211>36

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>pint3581_Eb4rev

<400>18

cgcacaggtg ctcgttcaca aatcgtgccg aatttc 36

<210>19

<211>43

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>pint3581_Eb0f1

<400>19

caacaggaaa ttcggcacga gagtttgtga accagcacct gtg 43

<210>20

<211>44

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>pint3581_Eb01f2

<400>20

tatcgaccat ggcaacaaca tcaacaggaa attcggcacg agag 44

<210>21

<211>42

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>pint3581_Db1f1

<400>21

caacaggaaa ttcggcacga gacgtgaacc agcacctgtg cg 42

<210>22

<211>44

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>pint3581_Db1f2

<400>22

tatcgaccat ggcaacaaca tcaacaggaa attcggcacg agac 44

<210>23

<211>44

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>pint3597_Db1f

<400>23

caacaggaaa ttcggcacga gaggacgtga accagcacct gtgc 44

<210>24

<211>34

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>desB30f

<400>24

ttctacacac ccaagcgcga tgttcctcag gtgg 34

<210>25

<211>32

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>desB30rev

<400>25

aggaacatcg cgcttgggtg tgtagaagaa gc 32

Claims

1.一种胰岛素类似物，

其为Arg(A0),His(A8),Glu(A15),Asp(A18),Gly(A21),Arg(B31),Arg(B32)–NH₂人胰岛素。

2.制备根据权利要求1所述的胰岛素类似物的方法。

3.根据权利要求2所述的方法，其中重组制备胰岛素类似物前体，该前体酶法加工为双链胰岛素，在存在具有胰蛋白酶活性的酶的情况下与精氨酰胺偶联，分离该胰岛素类似物。

4.根据权利要求1所述的胰岛素类似物在制备用于治疗糖尿病的药物中的用途。

5.根据权利要求4所述的用途，用于制备用于治疗I型或II型糖尿病的药物的用途。

6.包含根据权利要求1所述的胰岛素类似物和/或其生理上可接受的盐的药物。

7.根据权利要求1所述的胰岛素类似物的制剂，其中该制剂是包含溶解的胰岛素类似物的水性溶液形式。

8.根据权利要求1所述的胰岛素类似物的制剂，其中该制剂是粉末形式。

9.根据权利要求8所述的制剂，其中根据权利要求1所述的胰岛素类似物以结晶和/或非结晶形式存在。

10.根据权利要求1所述的胰岛素类似物的制剂，其中该制剂是悬浮液形式。

11.根据权利要求1所述的胰岛素类似物的制剂，其中该制剂额外包含化学分子伴侣。

12.编码根据权利要求1所述的胰岛素类似物的前体的DNA在制备根据权利要求1所述的胰岛素类似物中的用途。

13.(1)编码根据权利要求1所述的胰岛素类似物的A链的DNA和(2)编码根据权利要求1所述的胰岛素类似物的B链的DNA在制备根据权利要求1所述的胰岛素类似物中的用途。

14.包含编码根据权利要求1所述的胰岛素类似物的前体的DNA的载体在制备根据权利要求1所述的胰岛素类似物中的用途。

15.包含(1)编码根据权利要求1所述的胰岛素类似物的A链的DNA和(2)编码根据权利要求1所述的胰岛素类似物的B链的DNA的载体在制备根据权利要求1所述的胰岛素类似物中的用途。

16.包含编码根据权利要求1所述的胰岛素类似物的前体的DNA的宿主生物在制备根据权利要求1所述的胰岛素类似物中的用途。

17.包含(1)编码根据权利要求1所述的胰岛素类似物的A链的DNA和(2)编码根据权利要求1所述的胰岛素类似物的B链的DNA的宿主生物在制备根据权利要求1所述的胰岛素类似物中的用途。

18.包含下述载体的宿主生物在制备根据权利要求1所述的胰岛素类似物中的用途，该载体包含编码根据权利要求1所述的胰岛素类似物的前体的DNA。

19.包含下述载体的宿主生物在制备根据权利要求1所述的胰岛素类似物中的用途，该载体包含(1)编码根据权利要求1所述的胰岛素类似物的A链的DNA和(2)编码根据权利要求1所述的胰岛素类似物的B链的DNA。

20.根据权利要求7-11任一项所述的制剂，其额外包含exendin-4。

21.根据权利要求7-11任一项所述的制剂，其额外包含选自下组的exendin-4的类似物：

H-desPro³⁶-exendin-4-Lys₆-NH₂,

H-des(Pro^36,37)-exendin-4-Lys₄-NH₂和

H-des(Pro^36,37)-exendin-4-Lys₅-NH₂，

或其药理学上可耐受的盐。

22.根据权利要求7-11任一项所述的制剂，其额外包含选自下组的exendin-4的类似物：

desPro³⁶[Asp²⁸]exendin-4(1-39),

desPro³⁶[IsoAsp²⁸]exendin-4(1-39),

desPro³⁶[Met(O)¹⁴,Asp²⁸]exendin-4(1-39),

desPro³⁶[Met(O)¹⁴,IsoAsp²⁸]exendin-4(1-39),

desPro³⁶[Trp(O₂)²⁵,Asp²⁸]exendin-2(1-39),

desPro³⁶[Trp(O₂)²⁵,IsoAsp²⁸]exendin-2(1-39),

desPro³⁶[Met(O)¹⁴Trp(O₂)²⁵,Asp²⁸]exendin-4(1-39)和

desPro³⁶[Met(O)¹⁴Trp(O₂)²⁵,IsoAsp²⁸]exendin-4(1-39)，

或其药理学上可耐受的盐。

23.根据权利要求22所述的制剂，其中肽-Lys₆-NH₂被连到exendin-4类似物的C末端。

24.根据权利要求7-11任一项所述的制剂，其额外包含选自下组的exendin-4类似物：

H-(Lys)₆-des Pro³⁶[Asp²⁸]exendin-4(1-39)-Lys₆-NH₂

des Asp²⁸Pro³⁶,Pro³⁷,Pro³⁸exendin-4(1-39)-NH₂,

H-(Lys)₆-des Pro³⁶,Pro³⁷,Pro³⁸[Asp²⁸]exendin-4(1-39)-NH₂,

H-Asn-(Glu)₅des Pro³⁶,Pro³⁷,Pro³⁸[Asp²⁸]exendin-4(1-39)-NH₂,

des Pro³⁶,Pro³⁷,Pro³⁸[Asp²⁸]exendin-4(1-39)-(Lys)₆-NH₂,

H-(Lys)₆-des Pro³⁶[Trp(O₂)²⁵,Asp²⁸]exendin-4(1-39)-Lys₆-NH₂,

H-des Asp²⁸Pro³⁶,Pro³⁷,Pro³⁸[Trp(O₂)²⁵]exendin-4(1-39)-NH₂,

H-(Lys)₆-des Pro³⁶[Met(O)¹⁴,Asp²⁸]exendin-4(1-39)-Lys₆-NH₂,

des Met(O)¹⁴ Asp²⁸ Pro ³⁶,Pro³⁷,Pro³⁸ exendin-4(1-39)-NH₂,

H-(Lys)₆-des Pro³⁶,Pro³⁷,Pro³⁸[Met(O)¹⁴,Trp(O₂)²⁵,Asp²⁸]exendin-4(1-39)-NH₂,

H-(Lys)₆-des Pro³⁶,Pro³⁷,Pro³⁸[Met(O)¹⁴,Trp(O₂)²⁵,Asp²⁸]exendin-4(1-39)-(Lys)₆-NH₂,

H-Asn-(Glu)₅-des Pro³⁶,Pro³⁷,Pro³⁸[Met(O)¹⁴,Trp(O₂)²⁵,Asp²⁸]exendin-4(1-39)-(Lys)₆-NH₂，

或其药理学上可耐受的盐。

25.根据权利要求7-11任一项所述的制剂，其还包含Arg³⁴,Lys²⁶(N^ε(γ-谷氨酰基(N^α-十六酰基)))GLP-1(7-37)[利拉糖肽]或其药理学上可耐受的盐。

26.根据权利要求1所述的胰岛素类似物的水性溶液制剂，其不包含锌或包含低于15μg/ml的锌。

27.根据权利要求1所述的胰岛素类似物的水性溶液制剂，其不包含锌或包含低于15μg/ml至2mg/ml的锌。

28.根据权利要求27所述的制剂，其中锌含量为200μg/ml。