DE69310540T2

DE69310540T2 - Verhindern von spaltung von n-terminalen aminosäuren durch endogene aminopeptidasen während die expression von fremden genen in bakterien

Info

Publication number: DE69310540T2
Application number: DE69310540T
Authority: DE
Inventors: Markus Heitzmann; Rao Movva; Paul Ramage
Original assignee: Sandoz AG
Current assignee: Novartis AG
Priority date: 1992-11-30
Filing date: 1993-11-29
Publication date: 1998-01-02
Anticipated expiration: 2013-11-30
Also published as: WO1994012659A1; CA2145384A1; DK0670907T3; ATE152772T1; US6165746A; EP0670907A1; ES2101489T3; DE69310540D1; JPH08503376A; GR3023348T3; GB9225021D0; EP0670907B1

Description

Die Erfindung betrifft die rekombinante Herstellung von Säugerproteinen und Säugerpeptiden in prokaryotischen Wirtszellen.
Wenn ein Protein nut Säugerursprung in einer bakteriellen Wirtszelle exprimiert wird, beispielsweise in E. coli, wird es normalerweise als Vorläuferprotein exprimiert, das einen Methioninrest (Met) am N-Terminus trägt. Dieser Met Rest muß entfernt werden, um das Protein in seiner natürlichen, reifen Form zu erhalten. Dies kann durch die Verwendung bestimmter Aminopeptidaseenzyme durchgeführt werden, beispielsweise der Aminopeptidase-1 (AP-1), die man aus Aeromonas erhält, welche zur sequentiellen Abspaltung von N-terminalen Aminosäuren von Proteinen fahig sind. Dieser Abspaltungsprozeß wird durch bestimmte Aminosäuren oder Aminosäurekombinationen aufgehalten, die als "Stoppsignale" wirken.
Stoppsignale für AP-1 sind unter anderem Asparaginsäure (Asp), Glutaminsäure (Glu) und die Kombination X-Pro, worin X für jede Aminosäure außer Prolin steht. Aus diesem Grund kann dieses Enzym, wie dies in der WO-A 86 01229 beschrieben ist, zur spezifischen Abspaltung des N-terminalen Met von einem in einem bakteriellen Wirt exprimierten Protein verwendet werden, das die folgende N-terminale Sequenz aufweist:
Jedoch enthalten bakterielle Wirte, wie E. coli, endogene Peptidaseenzyme, die die N-terminalen Reste von bestimmten durch das Bakterium gebildeten Proteinen auf eine unspezifische Weise abspalten können. Dies führt zu einem Gemisch an Produkten, das oft sehr unerwünscht ist. Wenn beispielsweise ein Protein mit Pro in der Position 2 in E. coli exprimiert wird, wird das entstehende Met-X-Pro- Protein durch das N-terminale Methioninaminopeptidaseenzym (MAP) von E. coli prozessiert. Dieses Enzym erkennt X-Pro nicht als Stopsignal und nicht nur der Met Rest sondern auch das X können entfernt werden.
Ein Beispiel für ein solches Protein ist IL-6. IL-6 ist ein sekretorisches Lymphokin, das in Säugerzellen durch die Synthese und Prozessierung eines Vorläuferproteins gebildet wird, das am N-Terminus eine Signalsequenz von 28 Aminosäuren aufweist. Die Entfernung dieser Signalsequenz ergibt das reife Protein mit 185 Aminosäuren, das die N-terminale Sequenz Ala-Pro-Val- aufweist. Wenn das rekombinante Protein in E. coli gebildet wird, wird eine für das Protein kodierende Sequenz verwendet, die keine Codons enthält, welche für das Signalpeptid kodieren, sondern ein Startcodon aufweist, das den für das reife Protein kodierenden Codons vorangeht. Bei der Expression erzeugt dieses Startcodon einen Methioninrest, so daß das initiale Translationsprodukt die folgende N-terminale Sequenz aufweist:
Eine partielle Prozessierung dieses Produkts in vivo durch das MAP Enzym von E. coli führt jedoch zu einem heterogenen Gemisch aus IL-6 Arten mit unterschiedlichen N-Termini, wie dies im folgenden für bestimmte Fermentationsbedingungen gezeigt ist:
Daher sind nur 16 % des erhaltenen Proteinprodukts das gewünschte, reife Protein. Ferner verursacht eine Behandlung dieses Gemisches mit AP-1 zur Abspaltung des Met vom ersten dieser Produkte eine weitere Spaltung des dritten Produkts zu Val³-Pro&sup4;---- Il-6, was die Heterogenität weiter erhöht.
Ein weiteres Beispiel für ein solches Protein ist LIF Leukämie hemmender Faktor), das in der EP-A 0 285 448 beschrieben ist. Wenn dieses Protein in E. coli gebildet wird, hat das anfangliche Translationsprodukt die folgende N-terminale Sequenz:
Eine partielle Prozessierung dieses Produkts durch das MAP Enzym von E. coli führt zu dem folgenden heterogenen Gemisch von LIF Arten für bestimmte Fermentationsbedingungen:
Met-Ser-Pro--- 79 %
Ser-Pro--- 12 %
Pro--- 9 %
Daher sind nur 12 % der erhaltenen Proteine das gewünschte, reife Protein. Erneut verursacht eine Behandlung des Gemisches mit AP-1 zur Abspaltung des Met vom ersten dieser Produkte eine weitere Spaltung des dritten Produkts.
Ahnliche Probleme treten bei der rekombinanten Herstellung von vielen anderen brauchbaren Proteinen in bakteriellen Wirten auf.
Daher ist es ein Ziel der Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von Proteinen und Peptiden in prokaryotischen Wirtszellen bereitzustellen, worin die Prozessierung des Produkts durch endogene MAP Enzyme reduziert wird.
Die DE-A 40 39 415 beschreibt ein Verfahren zur spezifischen Abspaltung des N-terminalen Met von Proteinen, indem man den bakteriellen Wirt zur Expression von zusätzlichen Aminosäuren am N-Terminus veranlaßt. Das exprimierte Protein ist Met-X-Y-Pro-A, worin X für Thr, Ma oder Ser steht, Y für zumindest zwei Aminosäuren steht, die mit der Sequenz Pro-Pro endet oder wenn X für Ser steht, mit Pro-Ala-Pro, und A für den Rest des Proteins von Interesse steht. Dann wird eine Ig-A-Protease verwendet, um das Met-Y abzuspalten und das Protein X-Pro-A übrigzulassen. Jedoch beschäftigt sich dieses deutsche Patent mit dem Problem, eine spezifische Abspaltung von Met mittels der IgA-Protease zu erhalten und spricht das Problem der in vivo Spaltung des entstehenden Proteins durch MAP nicht an.
In der WO-A 86 01229 ist erwähnt, daß die Aeromonas Aminopeptidase zur Spaltung von Met-Leu-bGH, wie auch Met-bGH zum reifen Rinderwachstumshormon (bGH) verwendet werden kann. Jedoch findet sich kein Vorschlag, daß man einen Vorteil durch die Insertion von Leu erzielen kann und das Problem der in vivo Prozessierung durch endogene bakterielle Aminopeptidasen ist nicht erwähnt oder berücksichtigt.
Es wurde nun festgestellt, daß falls das initial translatierte Protein oder Polypeptid eine einzelne geeignete, zusätzliche Aminosäure zwischen dem N-terminalen Met und dem ersten Aminosäurerest der reifen Form des Proteins oder Polypeptids enthält, das Protein oder Polypeptid durch die endogene MAP dann nicht oder nur in einem geringen Ausmaß prozessiert wird. Das Protein oder Polypeptid ist auch fähig, spezifisch zur gewünschten reifen Form des Proteins oder Polypeptids durch eine geeignete Aminopeptidase gespalten zu werden.
Demnach liefert die vorliegende Erfindung ein Verfhren zur rekombinanten Herstellung der reifen Form eines Säugerproteins oder Säugerpolypeptids in einer bakteriellen Zelle, das gegenüber einer Prozessierung durch endogene bakterielle Aminopeptidasen empfindlich ist, wobei das Protein oder das Polypeptid die Formel X-Pro-Z aufweist, worin X für eine einzelne N-terminale Aminosäure außer Prolin steht und Z für die verbleibende Sequenz an Aminosäureresten des Proteins oder Polypeptids steht, wobei das Verfahren durch folgende Schritte gekennzeichnet ist
a) Transformation von bakteriellen Wirtszellen mit einem geeigneten Vektor, der eine DNA enthält, die für Met- Y-X-Pro-Z kodiert, worin X und Z wie oben definiert sind und Y für eine natürliche Aminosäure steht, die in vitro spezifisch von Y-X-Pro-Z durch eine Aminopeptidase abgespalten werden kann und die eine Resistenz gegenüber einer in vivo Prozessierung durch endogene bakterielle Aminopeptidasen verleiht,
b) Induktion der transformierten Zellen zur Expression des Produkts Met-Y-X-Pro-Z,
c) Behandlung des Produkts Met-Y-X-Pro-Z mit einer geeigneten Aminopeptidase zur Abspaltung von Met und Y, und
d) Isolierung des Proteins oder Polypeptids X-Pro-Z, mit der Maßgabe, daß Y nicht für Leu oder Lys steht, wenn X-Pro-Z ein reifes Tierwachstumshormon ist.
Der Einbau des geeignet ausgewählten Aminosäurerests Y in das Produkt Met-Y-X-Pro-Z liefert eine große Verbesserung in der Homogenität der Expressionsprodukte der bakteriellen Wirtszellen. Dies wiederum führt zu einer großen Verbesserung der Homogenität des Produkts nach der Behandlung mit einer geeigneten Aminopeptidase.
Vorzugsweise ist der bakterielle Wirt E. coli. Das Säugerprotein oder Säugerpeptid kann jedes Protein oder Peptid sein, das X-Pro als die ersten zwei Aminosäurereste am N-Terminus aufweist. Bevorzugte Säugerproteine sind unter anderem IL-6 und LIF. Ein weiteres Beispiel ist IL-3, das die N-terminale Sequenz Ala¹-Pro²- Met³- aufweist. Die Aminopeptidase erhält man vorzugsweise aus Bacillus stearothermophilus Streptomyces griseus oder Aeromonas, bevorzugter aus Aeromonas. Am bevorzugtesten ist sie die Aminopeptidase AP- 1 von Aeromonas, deren Herstellung von Prescott et al., J. Biol.Chem. 246, 1756 (1971) beschrieben wurde.
Das Met-Y-X-Pro-Z Expressionsprodukt von Schritt b) wird vorzugsweise isoliert, bevor es mit einer geeigneten Aminopeptidase behandelt wird. In Schritt d) wird das gewünschte Protein oder Polypeptid X-Pro-Z in reifer Form im wesentlichen frei von anderen Formen wie Met-Y-X-Pro-Z, Y-X-Pro-Z und Pro-Z isoliert.
Die Wahl der Aminosäure Y hängt vom bestimmten Säugerprotein oder Säugerpeptid und dem verwendeten Expressionssystem ab und wird durch die folgenden Eigenschaften des initialen Expressionsprodukts Met-Y- X-Pro-Z bestimmt:
i) Das Produkt muß zu einer hohen Expressionsmenge im verwendeten Wirtektor System fähig sein,
ii) Das Produkt muß gegenüber einer in vivo Prozessierung durch endogene bakterielle Aminopeptidasen resistent sein oder muß gegenüber jeder endogenen Prozessierung resistent sein, die mehr als Met&supmin;¹ entfernt, und
iii) Das Produkt muß durch die im obigen Schritt c) verwendete Aminopeptidase spezifisch zu X-Pro-Z gespalten werden.
Vorzugsweise wird Y aus den Aminosäuren ausgewählt, die lange Seitenketten aufweisen, und wird insbesondere ausgewählt aus Ser, Asn, Gln, His, Arg, Lys, Tyr, Phe, Met, Val, Ile und Leu. Die Auswahl der geeigneten Aminosäure Y kann auf der Grundlage der bekannten Eigenschaften von Aminosäuren und einer geeigneten Gptimierung durchgeführt werden. Beispielsweise führt in bestimmten Proteinen die Auswahl von Y aus Phe, Ile, Leu, Met, Val und His zu einer spezifischen und schnellen Abspaltung von Y vom Protein durch AP-1. Daher wird für Y sehr wahrscheinlich eine dieser Aminosäuren ausgewählt, falls AP- 1 verwendet wird. Dies muß jedoch mit der Fähigkeit der Aminosäure Y abgeglichen werden, die endogene MAP Spaltung zu hemmen. In bestimmten Proteinen hemmen Gln, His, Arg, Lys, Tyr, Phe und Met stark die endogene MAP Spaltung und Am, Ile und Leu hemmen ebenfalls die Spaltung in diesen Proteinen. Die Auswahl einer Aminosäure, die in beide Gruppen fallt, wird daher ziemlich wahrscheinlich eine spezifische AP- 1 Spaltung und eine Hemmung der endogenen MAP Spaltung liefern. Der entstehende Vektor sollte dann auf eine adäquate Expression des Proteins getestet werden.
Bei Tests, die mit dem IL-6 System (Met-Y-Ala-Pro-Z) durchgeführt wurden, stellt man fest, daß keine in vivo Prozessierung des Proteins durch MAP auftritt wenn Y für Gln, His, Arg, Lys, Tyr, Phe oder Met steht. Wenn Y für Leu, Ile oder Asn steht, ist die Menge der Prozessierung sehr gering, so daß nur sehr geringe Mengen an Y- Ala-Pro-Z detektiert werden können. Jedoch erhält man eine hohe Spezifität bei der Spaltung von Met-Y-Ma-Pro- Z durch AP-1 zu Ala-Pro-Z, wenn Y für Ile, Leu, His, Phe oder Met steht. Daher sind Met-Y-Ala-Pro-Z Proteine, in denen Y für Ile, Leu, His, Phe oder Met steht, geeignete Vorläufer für IL-6. Adäquate Expressionsmengen erhält man, wenn Y für His, Phe und Met steht. Vorzugsweise steht bei IL-6 Y für Phe.
Im LIF System (Met-Y-Ser-Pro-Z) wird die Met-Abspaltung in vivo signifikant reduziert, wenn Y für His, Phe und Ile steht. Man findet eine hohe Spezifität bei der Spaltung von Met-Y-Ser-Pro-Z zur reifen Form durch AP-1, wenn Y für Phe oder Ile steht. Die Expressionsmengen sind für beide Reste adäquat hoch. Vorzugsweise steht Y im LIF System für Ile.
Der Vektor, der eine DNA enthält, welche für Y-X-Pro-Z kodiert, kann durch jede von vielen herkömmlichen Techniken hergestellt werden. Vorzugsweise wird die Polymerasekettenreaktionstechnik (PCR) verwendet, um die für das Protein kodierende Sequenz mittels geeigneter 5' und 3' Primer und der für das reife Protein kodierenden DNA als Matrize herzustellen. Die DNA kann dann in einen geeigneten Vektor kloniert werden und der entstehende Expressionsvektor wird dann in einen geeigneten Wirt transfiziert, wie E. coli.
Dann wird die Fermentation dieses Wirts durchgeführt und der Wirt wird zur Expression des erforderlichen Proteins veranlaßt. Wenn eine ausreichend hohe Zelldichte erreicht ist, können die Zellen geerntet und zur Freisetzung der Proteine lysiert werden. Dies kann durch die Verwendung von osmotischen oder mechanischen Techniken durchgeführt werden. Die Verwendung einer Manton-Gaulin Presse führt gewöhnlich zu einer vollständigen Zellzerstörung. Erforderlichenfalls können die Zellen zuerst mit Lysozym behandelt werden, um die Zellen empfindlicher für die Zerstörung zu machen. Gewöhnlich liegt das exprimierte Protein in Form von dichten Einschlußkörperchen vor, die dann durch Zentrifügation gesammelt werden.
Das Protein wird dann durch die Behandlung mit einem chaotropen Mittel, wie Guanidinhydrochlorid oder Harnstoff, aus der Einschlußkörperchenfraktion aufgelöst. Das entstehende gelöste und entfaltete Protein wird dann durch eine geeignete Technik, wie Verdünnung, oxidative Rückfaltung, Zugabe eines Detergenzes oder dergleichen renaturiert. Diese Techniken sind bekannt und man findet Beispiele in EP-A 0 219 874, EP-A 0 114 506 und WO-A 84 03711.
Das rückgefaltete Protein wird dann mittels Chromatographietechniken isoliert, die für das spezielle Protein geeignet sind. Diese Techniken sind wiederum bekannt.
Dann wird eine Aminopeptidase, vorzugsweise AP-1, zum isolierten Protein gegeben, gewöhnlich in einem Verhältnis von Enzym: Substrat im Bereich von 1:100 bis 1:10 000 und bevorzugter im Breich von 1:1000 bis 1:5000. Geeignete Temperaturen und Reaktionszeiten können ausgewählt werden und die Reaktion kann gestoppt werden, gewöhnlich durch die Zugabe von Säure oder der chromatographischen Entfernung des Enzyms wenn die erforderliche Zeit erreicht ist. Das Protein wird dann weiter mittels geeigneter Chromatographietechniken gereinigt. Erforderlichenfalls kann eine weitere Reinigung zur Entfernung von oxidierten Formen des Proteins und von Endotoxinen durchgeführt werden.
Vorausgesetzt, daß die Aminopeptidase für eine ausreichende Zeit wirken kann, kann eine mehr als 99 %ige Homogenität der aus diesem Verfahren gewonnenen Proteine erhalten werden.
In einem weiteren Aspekt umfaßt die Erfindung auch ein Verfahren zur Herstellung eines Vorläufers eines reifen Säugerprotein- oder Säugerpolypeptidprodukts der Sequenz X-Pro-Z, wobei der Vorläufer die Sequenz Met-Y-X-Pro-Z aufweist, worin Y für eine natürliche Aminosäure steht, die in vitro spezifisch von Y-X-Pro-Z durch eine Aminopeptidase abspaltbar ist und eine Resistenz gegenüber einer in vivo Prozessierung durch endogene bakterielle Aminopeptidasen verleiht, X für eine einzelne N-terminale Aminosäure außer Prolin steht und Z für den Rest der Aminosäuresequenz des reifen Proteins steht, gekennzeichnet durch die Expression des Vorläufers in bakteriellen Wirtszellen, mit der Maßgabe, daß Y nicht für Leu oder Lys steht, wenn X-Pro-Z für ein reifes Tierwachstumshormon steht.
In einem weiteren Aspekt liefert die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines reifen Säugerprotein- oder Säugerpolypeptidprodukts der Sequenz X-Pro-Z, worin X für eine einzelne N-terminale Aminosäure außer Prolin steht und Z für den Rest der Aminosäuresequenz des reifen Produkts steht, gekennzeichnet durch die Behandlung eines Vorrläufers, der die Sequenz Met-Y-X-Pro-Z aufweist, worin X und Z wie oben definiert sind und Y für eine natürliche Aminosäure steht, die in vitro spezifisch von Y-X-Pro-Z durch eine Aminopeptidase abspaltbar ist und eine Resistenz gegenüber einer in vivo Prozessierung durch endogene bakterielle Aminopeptidasen verleiht, mit einer Aminopeptidase unter Bildung des reifen Produkts, mit der Maßgabe, daß Y nicht für Leu oder Lys steht, wenn X-Pro-Z für ein reifes Tierwachstumshormon steht.
Typischerweise wird der Met-Y-X Pro-Z Vorläufer dieses letzteren Aspekts durch die Expression in bakteriellen Wirtszellen gebildet. Vorzugsweise wird auch der Met-Y-X-Pro-Z Vorläufer vor der in vitro Behandlung mit der Aminopeptidase unter Bildung des reifen Produkts isoliert.
In einem weiteren Aspekt umfaßt die Erfindung einen N-terminal erweiterten Vorläufer eines reifen Säugerprotein- oder Säugerpolypeptidprodukts mit der Sequenz Met-Y-X-Pro-Z oder Y-X-Pro-Z, worin X-Pro-Z für die Sequenz des reifen Produkts steht und worin X für eine einzelne Aminosäure außer Prolin steht, Z für die verbleibende Aminosäuresequenz des reifen Produkts steht und Y für eine natürliche Aminosäure steht, die in vitro spezifisch von Y-X-Pro-Z durch eine Aminopeptidase abspaltbar ist und in vivo eine Resistenz gegenüber einer Prozessierung durch endogene bakterielle Aminopeptidasen verleiht, mit der Maßgabe, daß Y nicht für Leu oder Lys steht, wenn X-Pro-Z für ein reifes Tierwachstumshormon steht.
Es wurde im Fall von IL-6 festgestellt, daß einige der Met-Y-IL-6 und Y-IL-6 Vorläufer eine zu IL-6 ähnliche biologische Aktivität aufweisen. In einigen Fällen, beispielsweise bei Met-Phe-IL-6 ist diese biologische Aktivität äquivalent zu der des reifen Ma-Pro-Z Proteins. Es wird erwärtet, daß andere Met-Y-X-Pro-Z und Y-X- Pro-Z Vorläufer eine biologische Aktivität aufweisen, die der der reifen X-Pro-Z Proteinentsprechnungen entspricht. Solche biologisch aktiven Vorläufer können als pharmazeutische Wirkstoffe in denselben Indikationen verwendet werden, wie ihre reifen X-Pro-Z Proteinentsprechungen.
Die Ausführungsformen der Erfindung werden nun durch Beispiele beschrieben.

Beispiel 1: Bildung von LIF

a) Herstellung von Klonen

Es wird eine Polymerasekettenreaktion (PCR) durchgeführt, um DNA Sequenzen zu erzeugen, die für Met-Y-LIF kodieren, worin Y für Phe, His oder Ile steht. Die für LW kodierende Sequenz wird als Matrize verwendet. Das Gen für humanes LIF wird in H. Gough et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. US 85: 2623-2627 beschrieben. Der 5' Primer ist ein Oligonukleotid, das die ersten 15 Aminosäuren von LIF und die zusätzliche Aminosäure Y spezifiziert. Das 5' Oligonukleotid enthält auch eine HpaI Restriktionsschnittstelle am 5' Ende. Als PCR Partner wird ein 3' Oligonukleotid ausgewählt, das die einzigartige Sequenz des 3' Endes des LIF Gens spezifiziert und das ebenfalls eine HpaI Schnittstelle am 3' Ende enthält. Dann wird die Polymerasekettenreaktion durchgeführt, um die Vektoren bereitzustellen, die die DNA Sequenzen enthalten. Die PCR Techniken sind herkömnilich und werden in J.L. Marx 1988, Science 240: 1408-1410 und R.K. Salki et al., 1988 Science 239: 487- 491 beschrieben.
Die die für Met-Y-LIF kodierenden Regionen enthaltenden PCR Produkte werden als HpaI-HpaI Fragmente ausgeschnitten und in die HpaI Restriktionsschnittstelle des Expressionsplasmids pPL kloniert, das man von Pharmacia erhält. Man geht sorgfältig vor, um sicherzustellen, daß die Fragmente mit den korrekten Größen in das Plasmid kloniert werden und die Plasmide mit den Fragmenten in der korrekten Orientierung werden zur weiteren Verwendung ausgewählt.
In diesem Plasmid ist der λPL Promotor vom cl Repressor des Phagen λ kontrolliert. Der Promotor kann durch die Temperatur geregelt werden, wenn man einen bakteriellen Wirtsstamm verwendet, wie N4830-1, der den temperaturempfindlichen cI857 Repressor enthält. Bei einer niedrigen Temperatur (29-31ºC) hält der cI857 Repressor den Promotor im reprimierten Zustand, wogegen die Erhöhung der Temperatur, beispielsweise auf 42ºC, die Repressoraktivität zerstört und eine ausgiebige Transkription vom PL Promotor aus erlaubt. In bakteriellen Wirtszellen, die den cI+ Repressor enthalten, kann der λPL Promotor durch die Zugabe von Nalidixinsäure zum Wachstumsmedium induziert werden (Mott et al., PNAS 82, 88, (1985).
Die Met-Y-LIF Expressionsplasmide werden in geeignete E. coli Wirtsstämme transformiert, wie N4830- 1, und es werden Transformanden ausgewählt und auf Ampicillin gehalten (das pPL Plasmid enthält ein Ampicillinresistenzmarkergen). Die Transformanden werden auf Nährmedium angezogen und die Met-Y-LIF Produkte werden gewonnen.
Die aus den die Expressionsplasmide enthaltenden E. coli isolierten Met-Y-LIF Produkte werden durch Edmananalyse charakterisiert. Sie sind im wesentlichen homogen und enthalten wie erwartet ein N-terminales Met. Der das Plasmid Met-Ile-LIF exprimierende E. coli wird für das weitere Verfahren ausgewählt. Eine Einzelkolonie, die von diesem Stamm herrührt, wird zur Fermentation ausgewählt.
Zum Vergleich wird ein Plasmid, das für Met-LIF kodiert, ebenfalls in den E. coli Wirt eingeführt. Die Charakterisierung durch Edmananalyse des Expressionsprodukts, das anschließend aus E. coli gereinigt wurde, der das Plasmid Met-LIF trägt, zeigt, daß es ein heterogenes Gemisch ist, das aus 79 % Met-LIF, 12 % korrekt prozessiertem LIF und 9 % LIF mit einem N-terminalen Pro besteht (das normalerweise die zweite Aminosäure von LIF ist).

b) Expression von Met-Ile-LIF

Eine Vorkultur des ausgewählten Klons wird hergestellt und als Inokulum für die Fermentation verwendet. Es wird ein Fermenter mit einer sterilen Salz- und Metallspurenelementlösung gefüllt und die Temperatur der Lösung wird auf 30ºC und der pH auf 7 gehalten. Die Lösung wird belüftet und bei 300 Upm gerührt.
Die Fermentation wird dann durch die Zugabe des Inokulums zum Fermenter gestartet. Eine Nährlösung, die 2 g/l Hefeextrakt (BBL) und 7 g/l Casaminosäuren enthält, wird dann zugegeben, wie dies erforderlich ist. Eine Glucoselösung, die 550 g/l Glucose 1 H&sub2;O enthält und eine Ammoniaklösung (Konzentration 25 % NH&sub4;OH) werden in Intervallen zugegeben, uni den pH der Lösung auf 7 zurückzubringen. Die Wachstumsphase wird fortgesetzt bis eine optische Dichte (OD&sub5;&sub5;&sub0;) zwischen 7 und 15 erreicht ist.
Die Met-Ile-LIF Expression durch E. coli wird dann durch Erhöhung der Temperatur von 30ºC auf 42ºC induziert. Ferner wird Nährmedium zugegeben, wie dies erforderlich ist. Das Zuführen von Glucose-und Ammoniaklösungen wird fortgesetzt.
Nach drei Stunden Induktion wird die Fermentation durch das Ernten der Kulturbrühe in mobile Gefäße beendet, die dann in eine Zentrifüge transferiert werden. Die Zentrifügation wird mittels einer Rohrzentrifuge (Padberg Z 41) bei 18 000 x g und einer mittleren Verweilzeit von 150 Sekunden durchgeführt.

c) Isolierung von Met-Ile-LIF

Nasse E. coli Pellets, die aus der Zentrifüge erhälten werden, werden in eiskalten Puffer A (50 mM Tris- HCl pH 8,0, enthält 2 mM DTT (Dithiothreit), 5 mM Benzamidin-HCl und 1 mM EDTA) gegeben und die Lösung wird stark auf Eis gerührt, um die Zellen in Suspension zu bringen. Die suspendierten Zellen werden dann durch eine Passage durch ein Manton-Gaulin Homogenisiergerät (zwei Passagen bei 1200 bar) lysiert, wonach das Lysat 2 fach mit Puffer A verdünnt wird, um die Zentrifügation zu erleichtern.
Das verdünnte Zellysat wird für 30 Minuten bei 16 000 x g zentrifügiert. Das Pellet wird in Puffer A resuspendiert, ein weiteres Mal durch das Manton-Gaulin Homogenisiergerät gegeben und dann wie vorher zentrifügiert. Dieses Waschverfahren wird einmal mehr wiederholt, aber mit verringerter Zentrifügation (25 min bei 13 000 x g). Das entstehende Pellet wird dann in Wasser suspendiert, wie vorher beschrieben zentrifugiert, gewogen und bei -20ºC eingefroren.
Das eingefrorene Pellet, das die LIF Einschlußkörperchen enthält, wird in Solubilisierungspuffer (Puffer B: 0,1 M Glycin-HCl pH 3,0, enthält 8,5 M Harnstoff) mit 50 ml/g resuspendiert. Nach dreißigminütigem Rühren bei Raumtemperatur wird DTT (Dithiothreit) bis zu 100 mM zugegeben und das Gemisch wird über Nacht unter Vakuum gerührt.
Die reduzierten, aufgelösten Einschlußkörperchen werden dann zentrifugiert (25 min, 13 000 x g) und der Überstand wird dekantiert und filtriert. Der filtrierte Überstand wird mit einer Flußrate von 50 ml/min auf eine XK50/20 Säule mit Pharmacia S-Sepharose Fast Flow aufgetragen, die vorher mit Puffer B äquilibriert wurde. Die Chromatographie wird bei Raumtemperatur durchgeführt. Nach dem Auftragen wird die Säule mit Puffer C (50 mM Citronensäure 1 NaOH pH 5,0, enthält 8,5 M Harnstoff und 100 mM NaCl) gewaschen. Während dem Waschen bildet sich am oberen Ende der Säule eine scharfe gelbe Bande und wandert schrittweise nach unten. Wenn diese Bande eluiert hat, wird der Waschschritt mit Puffer C durch einen 100 bis 1000 mM NaCl Gradienten ersetzt, der über 800 ml ausgebildet wird. Es wird ein einzelner Proteinpeak eluiert, manuell gesammelt und das Volumen wird gemessen.
Der eluierte Peak wird unmittelbar auf 2 M Harnstoff durch die Zugabe von 3 Volumina entgaster 100 mM Essigsäure verdünnt und unter Vakuum gelassen (60 mm Hg), bis eine genaue HPLC Porteinbestimmung durchgeführt werden kann. Dieser "schnelle Verdünnungaschritt" auf 2 M Harstoff wird ausgeführt, um die Rückfaltung auszulösen. Wenn die Proteinbestimmung durchgeführt wurde, wird Met-Ile-LIF weiter mit 50 mM Essigsäure (enthält 2 M Harnstoff) verdünnt, bis eine Proteinkonzentration von 50 µg/ml erreicht ist.
Es wird festes Tris zur verdünnten Met-Ile-LIF Lösung bis zu 50 mM gegeben, wonach oxidiertes Glutathion (GSSG) bis zu einem 1,5 fachen molaren Überschuß zugegeben wird. Die Lösung wird durch die Zugabe von 5 N NaOH auf pH 8,0 gebracht und bei Raumtemperatur gerührt. Nach 3 bis 5 Stunden wird der pH erneut auf 8,0 heraufgestellt und nach 20 Stunden wird Eisessig zugegeben, um den pH auf 5,0 zu bringen.
Die oxidierte, angesäuerte Met-Ile-LIF Lösung wird mittels eines Sartobran 0,45/0,22 µm Dualmembranfilters filtriert. Das Filtrat wird dann durch Ionenaustauschchromatographie auf S-Sepharose F XK 50/15 konzentriert (äquilibriert und betrieben mit 50 ml/min mit Puffer D, 50 mM Na-Acetat pH 5,0). Nach dem Beladen wird die Säule mit Puffer D gewaschen, bis die UV-Spur zum Hintergrund zurückkehrt Dann wird ein Salzgradient angelegt (0 bis 1 M NaCl in Puffer D über 800 ml), um das Met-Ile-LIF zu eluieren.
Der entstehende Met-Ile-LIF Pool (400 bis 600 ml) wird auf 1 mg/ml konzentriert und durch ein 0,2 µm Filter filtriert. Das Filtrat wird dann in Injektionen mit 15 ml auf eine Pharmacia Hi-Load Superdex XK 26/60 Gelfiltrationssäule aufgetragen, die mit PBS pH 7,2 äquilibriert ist. Monomeres Met-Ile-LIF (eluiert bei 160 bis 225 ml) wird dann vereinigt. Die Met-Ile-LIF Monomere werden auf 0,5 bis 1,0 mg/ml konzentriert, um einen effizienten Verdan mit AP-1 zu erleichtern. Das konzentrierte, monomere Met-Ile-LIF ist im wesentlichen homogen.

d) Aminopeptidasebehandlung

Die Behandlung des konzentrierten, monomeren Met-Ile-LIF wird über Nacht bei Raumtemperatur mittels eines Enzym: Substratverhältnisses von 1:600 und einer Met-Ile-LIF Konzentration von 0,5 mg/ml durchgeführt. Das Enzym wird vorher aus einer Stammlösung mit 0,5 mg/ml durch eine Verdünnung auf 26 µg/ml und einer Hitzeinaktivierung aller kontaminierenden Aktivitäten durch eine Vorinkubation auf 70ºC für 3 Stunden präpariert. Nach der Behandlung wird die Reaktion durch die Zugabe von Eisessig bis pH 5,0 gestoppt und die Lösung wird filtriert, bevor sie auf eine XK 26/3 Säule mit Pharmacia DEAE Fast Flow aufgetragen wird, die vorher mit 50 mM Tris/HCl pH 8,0 äquilibriert wurde. Der LIF (ungebunden unter diesen Bedingungen) wird gesammelt und sterilfiltriert.
Nach einer einstundigen Behandlung werden 91,4 % des Proteins zu LIF herunterverdaut, der SER am N- Terminus aufweist. Nach einer vierundzwanzigstündigen Behandlung erhält man 100 % LIF mit Ser am N- Terminus.

BEISPIEL 2: Produktion von IL-6

a) Herstellung von Klonen

Es wird eine Polymerasekettenreaktion (PCR) durchgefülrrt, um auf herkömmliche Weise DNA Sequenzen zu erzeugen, die für Met-Y-IL-6 kodieren, worin Y für Ser, Am, Gln, His, Arg, Lys, Tyr, Phe, Met, Val, Ile oder Leu steht. Die Polymerasekettenreaktion wird dann durchgeführt, um Vektoren bereitzustellen, die die DNA Sequenzen enthalten. Die zwölf PCR Produkte, die die für Met-Y-IL-6 kodierenden Regionen enthalten, werden dann jeweils in das in Beispiel 1 beschriebene Expressionsplasmid kloniert.
Die Plasmide werden dann jeweils in den E. coli Wirt durch dieselbe Technik eingefülrrt, die in Beispiel 1 verwendet wurde. Die Plasmide werden wie vorher durch Ampicillinselektion gehalten.

b) Expression von Met-Y-IL-6

Die E. coli werden auf herkömmliche Weise fermentiert und die Expression der Met-Y-IL-6 Produkte wird induziert. Die Fermentation wird durch Ernten der Kulturbrühe in mobile Behälter beendet, die in eine Zentrifüge transferiert werden. Dann wird die Zentrifügation durchgeführt.

c) Isolierung von Met-Y-IL-6

Nasse E. coli Pellets, die man aus der Zentrifuge erhält, werden dann in Puffer resuspendiert. Die suspendierten Zellen werden dann durch eine Passage durch eine Glaskugelmühle oder ein Hochdruckhomogenisiergerät lysiert.
Das verdünnte Zellysat wird zentrifügiert und der entstehende Überstand (einschließlich des viskosen Materials) wird dekantiert und das Pellet wird gewonnen.
Die Pellets, die Met-Y-IL-6 Einschlußkörperchen enthalten, werden in einer Lösung aus 7 M Guanidinhydrochlorid / 5 mM DTT / Tris Puffer pH 8 suspendiert, um das Protein zu aufzulösen.
Das reduzierte, aufgelöste Protein wird dann oxidativ durch Verdünnung der Lösung auf 1 M Guanidinhydrochlorid in Gegenwart einer geeigneten Menge oxidierten Glutathions und Tris Puffers bei pH 8,0 rückgefaltet. Nach 5 Stunden wird die Lösung weiter verdünnt, auf pH 5 eingestellt und filtriert. Das Protein wird dann durch Chromatographie auf S-Sepharose FF isoliert. Die Zusammensetzung des N-Terminus jedes Met-Y-IL-6 Proteins wird dann durch Edmannanalyse bestimmt.

d) Aminopeptidasebehandlung

Die Behandlung des Met-Y-IL-6 Proteins wird für 3 Stunden bei 37ºC und pH 7 mittels eines Enzym. Substratverhältnisses von 1:1000 durchgeführt. Nach der Behandlung wird die Reaktion durch die Futration der Lösung durch eine Q-Sepharose Säule gestoppt. Die Zusammensetzung des N-Terminus jedes IL-6 Proteins wird dann durch Edmananalyse bestimmt.
Die Proteinausbeuten für eine gegebene Zelldichte für jedes Met-Y-IL-6 Protein und das Verhältnis der detektierten N-terminalen Sequenzen in den Produkten sind in Tabelle 1 angegeben. Tabelle 1: Ausbeute an Met-Y-IL-6 Protein
Pro²-Val³-Pro&sup4;-Z werden ebenfalls erhalten
4% Val³-Pro&sup4;-Z werden ebenfälls erhalten, die durch die AP-1 Spaltung von Pro²-Val³-Pro&sup4;-Z erklärt werden.
Zum Vergleich ergibt die Wiederholung des Verfahrens für das entsprechende Plasmid, das die DNA enthält, die für Met-IL-6 kodiert, die folgenden Ergebnisse:
Proteinausbeute: 20,0 mg
Met-Ala-Pro-Z: 33 %
Ala-Pro-Z: 16 % (3,2 mg)
Pro-Z: 51 %
Daher wird für IL-6 im wesentlichen homogenes Protein erhalten, wenn Y für His, Phe, Met, Ile und Leu steht und die Ausbeute ist die hochste, wenn Y für His, Met und Phe steht.

Claims

1. Verfähren zur rekombinanten Herstellung der reifen Form eines Säugerproteins oder Saugerpolypeptids in einem bakteriellen Wirt, das gegenüber einer Prozessierung durch endogene bakterielle Aminopeptidasen empfindlich ist, wobei das Protein oder das Polypeptid die Formel X-Pro-Z aufweist, worin X für eine einzelne N- terminale Aminosäure außer Prolin steht und Z für die verbleibende Sequenz an Aminosäureresten des Proteins oder Polypeptids steht, wobei das Verfahren durch folgende Schritte gekennzeichnet ist

a) Transformation von bäkteriellen Wirtszellen mit einem geeigneten Vektor, der eine DNA enthält, die für Met-Y-X-Pro-Z kodiert, worin X und Z wie oben definiert sind und Y für eine natürliche Aminosäure steht, die in vitro spezifisch von Y-X-Pro-Z durch eine Aminopeptidase abgespalten werden kann und die eine Resistenz gegenüber einer in vivo Prozessierung durch endogene bakterielle Aminopeptidasen verleiht,

b) Induktion der Zelle zur Expression des Produkts Met-Y-X-Pro-Z,

c) Behandlung des Produkts Met-Y-X-Pro-Z mit einer geeigneten Aminopeptidase zur Abspaltung von Met und Y, und

d) Isolierung des entstehenden Proteins oder Polypeptids X-Pro-Z,

mit der Maßgabe, daß Y nicht für Leu oder Lys steht, wenn X-Pro-Z ein reifes Tierwachstumshormon ist.

2. Verfahren zur Herstellung eines Vorläufers eines reifen Säugerprotein- oder Säugerpolypeptidprodukts der Sequenz X-Pro-Z, wobei der Vorläufer die Sequenz Met-Y-X-Pro-Z aufweist, worin Y für eine natürliche Aminosäure steht, die in vitro spezifisch von Y-X-Pro-Z durch eine Aminopeptidase abspaltbar ist und eine Resistenz gegenüber einer in vivo Prozessierung durch endogene bakterielle Aminopeptidasen verleiht, X für eine einzelne N-terminale Aminosäure außer Prolin steht und Z für den Rest der Aminosäuresequenz des reifen Produkts steht, gekennzeichnet durch die Expression des Vorläufers in bakteriellen Wirtszellen, mit der Maßgabe, daß Y nicht für Leu oder Lys steht, wenn X-Pro-Z für ein reifes Tierwachstumshormon steht.

3. Verfahren zur Herstellung eines reifen Säugerprotein- oder Säugerpolypeptidprodukts der Sequenz X-Pro-Z, worin X für eine einzelne N-terminale Aminosäure außer Prolin steht und Z für den Rest der Aminosäuresequenz des reifen Produkts steht, gekennzeichnet durch die Behandlung eines Vorrläufers, der die Sequenz Met- Y-X-Pro-Z aufweist, worin X und Z wie oben definiert sind und Y für eine natürliche Aminosäure steht, die in vitro spezifisch von Y-X-Pro-Z durch eine Aminopeptidase abspaltbar ist und eine Resistenz gegenüber einer in vivo Prozessierung durch endogene bakterielle Aminopeptidasen verleiht, mit einer Aminopeptidase unter Bildung des reifen Produkts, mit der Maßgabe, daß Y nicht für Leu oder Lys steht, wenn X-Pro-Z für ein reifes Tierwachstumshormon steht.

4 Verfahren nach Anspruch 1, 2 oder 3, worin Y ausgewählt ist aus Ser, Asn, Gln, His,Arg, Lys, Tyr, Phe, Met, Val, Ile und Leu.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, worin das Protein X-Pro-Z für IL-6 steht und Y für Phe, His, Met, Ile oder Leu steht.

6. Verfahren nach Anspruch 5, woriri Y für Phe, His oder Met steht.

7. Verfahren nach Anspruch 1, 2 oder 3, worin das Protein X-Pro-Z für LIF steht und Y für His, Phe oder Ile steht.

8. Verfahren nach Anspruch 7, worin Y für Ile steht.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, worin der bakterielle Wirt E. coli ist.

10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, worin die zur Abspaltung von Met und Y verwendete Aminopeptidase aus denjenigen ausgewählt wird, die von Bacillus stearothermophilus, Streptomyces griseus oder Aeromonas erhalten werden.

11. Verfahren nach Anspruch 10, worin die Aminopeptidase AP-1 ist.

12. Ein N-terminal erweiterter Vorläufer eines reifen Säugerprotein- oder Säugerpolypeptidprodukts mit der Sequenz Met-Y-X-Pro-Z oder Y-X-Pro-Z, worin X-Pro-Z für die Sequenz des reifen Produkts steht und worin X für eine einzelne Aminosäure außer Prolin steht, Z für die verbleibende Aminosäuresequenz des reifen Produkts steht und Y für eine natürliche Aminosäure steht, die in vitro spezifisch von Y-X-Pro-Z durch eine Aminopeptidase abspaltbar ist und in vivo eine Resistenz gegenüber einer Prozessierung durch endogene bakterielle Aminopeptidasen verleiht, mit der Maßgabe, daß Y nicht für Leu oder Lys steht wenn X-Pro-Z für ein reifes Tierwachstumshormon steht.

13. Vorläufer nach Anspruch 12, worin Y ausgewählt ist aus Ser, Asn, Gln, His, Arg, Lys, Tyr, Phe, Met, Val, Ile und Leu.

14. Vorläufer nach Anspruch 12 oder 13, worin X-Pro-Z für IL-6 steht und Y für Phe, His, Met, Ile oder Leu steht.

15. Vorläufer nach Anspruch 12 oder 13, worin X-Pro-Z für LIF steht und Y für His, Phe oder Ile steht.