DE69228705T2

DE69228705T2 - Methode zur rückfaltung von igf-i in eine aktive konformation

Info

Publication number: DE69228705T2
Application number: DE69228705T
Authority: DE
Inventors: Judy Chang; Nancy Mcfarland; James Swartz
Original assignee: Genentech Inc
Current assignee: Genentech Inc
Priority date: 1991-12-06
Filing date: 1992-12-04
Publication date: 1999-08-19
Anticipated expiration: 2012-12-05
Also published as: US5410026A; CA2122837A1; DE69228705D1; EP0618971B1; EP0618971A1; JPH07501704A; ES2131573T3; CA2122837C; JP3438227B2; US5288931A; WO1993011240A1

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Gebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft ein wirksames Verfahren zum Neufalten von insulinartigem Wachstumsfaktor-I (IGF-I), der in heterologen Wirtszellen produziert wurde und in diesen Zellen in Form von unlöslichen Proteinklumpen vorliegt.

Beschreibung verwandter Gebiete

Die Produktion großer Mengen relativ reiner, biologisch aktiver Polypeptide und Proteine ist bei der Herstellung menschlicher und tierischer pharmazeutischer Formulierungen, von Enzymen und anderen Sonderchemikalien wirtschaftlich von Bedeutung. Zur Produktion zahlreicher Proteine sind nunmehr DNA-Rekombinations-Verfahren am geeignetsten, da große Mengen exogener Proteine in Bakterien und anderen Wirtszellen frei von anderen kontaminierenden Proteinen exprimiert werden können.
Die Herstellung von rekombinantem Protein umfaßt das Transfizieren von Wirtszellen mit für das Protein kodierender DNA und das Vermehren der Zellen unter Bedingungen, welche die Expression des rekombinanten Proteins begünstigen. Der Prokaryot E. coli ist als Wirt bevorzugt, da er rekombinante Proteine in hoher Ausbeute produzieren kann. Es existieren zahlreiche US-Patente über die allgemeine bakterielle Expression von durch rekombinante DNA kodierten Proteinen, z. B. die US-A-4.565.785 über ein rekombinantes DNA-Molekül, das ein bakterielles Gen für ein extrazelluläres oder periplasmatisches Trägerprotein und ein nichtbakterielles Gen umfaßt; 4.673.641 über die gemeinsame Produktion eines fremden Polypeptids und eines aggregatbildenden Polypeptids; 4.738.921 über einen Expressionsvektor mit einem trp-Promotor/Operator und trp LE-Fusion mit einem Polypeptid wie z. B. IGF-I; 4.795.706 über Expressionskontrollsequenzen, die mit einem Fremdprotein zu kombinieren sind; und 4.710.473 über spezifische runde DNA-Plasmide, wie z. B. jene, die für IGF-I kodieren.
Unter bestimmten Bedingungen werden gewisse heterologe Proteine, die in großen Mengen von bakteriellen Wirten exprimiert werden, innerhalb der Zellen in dichten Massen gefällt; man erkennt sie als helle Flecken, die innerhalb der Zelleinschlüsse unter einem Phasenkontrastmikroskop in einer Vergrößerung bis hinunter zum 1000fachen sichtbar sind. Diese Klumpen gefällter Proteine werden als "refraktile Körper" bezeichnet und stellen einen beträchtlichen Anteil des gesamten Zellproteins dar. Brems et al., Biochemistry 24, 7662 (1985). Die Proteinklumpen sind unter dem Phasenkontrastmikroskop möglicherweise aber auch nicht sichtbar, und der Ausdruck "Einschlußkörper" wird oft verwendet, um die Proteinaggregate zu bezeichnen, ob sie nun unter dem Phasenkontrastmikroskop sichtbar sind oder nicht.
Die Gewinnung des Proteins aus diesen Körpern stieß auf zahlreiche Probleme, wie etwa die Schwierigkeit, wie man das innerhalb der Zelle eingeschlossene Protein aus dem Zellmaterial und den Proteinen, die es umfassen, trennt und wie das eingeschlossene Körperprotein in biologisch aktiver Form zu gewinnen ist. Die gewonnenen Proteine sind biologisch oft inaktiv, da sie zu einer dreidimensionalen Konformation gefaltet sind, die sich von jener von aktivem Protein unterscheidet. Beispielsweise besitzt rekombinanter IGF-I, der Disulfidbindungen zwischen Cysteinpaaren aufweist, die sich von den Paaren in anderen Disulfidbindungen von nativem IGF-I unterscheiden, eine deutlich reduzierte biologische Aktivität. Raschdorf et al., Biomedical and Environmental Mass Spectroscopy 16, 3-8 (1988). Fehlfaltungen treten entweder in der Zelle oder während des Isolierverfahrens auf. Verfahren zum Neufalten der Proteine zur korrekten, biologisch aktiven Konformation sind zur Verarbeitung funktionaler Proteine wesentlich.
Proteinfaltung wird durch die Beschaffenheit des Mediums, welches das Protein enthält, und eine Kombination schwach anziehender oder abstoßender intramolekularer Kräfte beeinflußt, die an der Wasserstoffbindung, Ionenbindung und hydrophoben Wechselwirkungen beteiligt sind. Wenn Paare von Cysteinresten in enge Nähe gebracht werden, während sich das Peptid-Rückgrat faltet, bilden sich starke kovalente Disulfidbindungen zwischen Cysteinresten, die dazu dienen, die tertiäre Konformation zu verankern. Neufaltungs-Arbeitsvorschriften wurden entwickelt, um inkorrekte Disulfidbindungen aufzubrechen, zufällige Disulfidbindungen zu blockieren und die Neufaltung und korrekte Disulfidbindung unter Bedingungen zu ermöglichen, die für die Bildung von aktivem Konformer günstig sind.
Man stellte fest, daß der lösliche Anteil von in großen Mengen exprimiertem Protein in E. coli durch Senken der Fermentationstemperatur auf unter 30ºC drastisch erhöht wurde. Ein beträchtlicher Teil verschiedener Fremdproteine, d. h. menschliches IFN-α2, IFN- γ und Mäuse-MX-Protein [Schein und Noteborn, Bio/Technology 6, 291-294 (1988)] und menschliches IFN-β [Mizukami et al., Biotechnol. Lett. 8, 605-610 (1986)], blieben in Lösung. Dieses Verfahren stellt eine Alternative zur Renaturierung von Proteinen aus refraktilen Körpern dar, erfordert aber ein Expressionssystem, das bei Temperaturen unter 30ºC wirksam eingeleitet wird. Das Verfahren ist daher nicht für alle Proteine geeignet.
Eine Reihe von Techniken zur Gewinnung von aktivem Protein aus Einschlußkörpern umfaßt das Solubilisieren von Einschlußkörpern in stark denaturierenden Lösungen und gegebenenfalls das Austauschen stark denaturierender Lösungen durch schwach denaturierende Lösungen (oder das Verdünnen des starken Denaturants) oder die Verwendung von Molekularsieb- oder Hochgeschwindigkeits-Zentrifugationsverfahren. Man geht davon aus, daß solche Gewinnungsverfahren, wie sie z. B. in den US-A-4.512.922, 4.518.256, 4.511.502 und 4.511.503 beschrieben sind, mit nur geringen Modifikationen universell auf die Gewinnung biologisch aktiver rekombinanter Proteine aus Einschlußkörpern anwendbar sind. Diese Verfahren zielen darauf ab, zufällige Disufidbindung zu verhindern, bevor das rekombinante Protein durch seine anderen stabilisierenden Kräfte dazu angeregt wird, seine biologisch aktive Konformation einzunehmen.
In einem solchen Verfahren wird das umzufaltende denaturierte Protein unter reduzierenden Bedingungen weiter gereinigt, bei denen die Cysteingruppen des Proteins als freie Sulfhydrylgruppen bewahrt werden, indem während aller Reinigungsschritte ein Reduktionsmittel zugesetzt wird. Dadurch kann sich das Protein unter Reinigungsbedingungen ohne inkorrekte Disulfidbindung selbst neu falten. Das Reduktionsmittel wird dann in einer wäßrigen Lösung verdünnt, um es dem umgefalteten Protein zu ermöglichen, in Gegenwart von Luft oder eines anderen Oxidationsmittels geeignete Disulfidbindungen auszubilden. Dadurch kann die Neufaltung leicht in den gesamten Reinigungsprozeß eingegliedert werden; dieses Verfahren funktioniert optimal für rekombinante Proteine mit relativ unkomplizierten Tertiärstrukturen in ihren biologisch aktiven Formen.
In einem zweiten Ansatz aus dieser Reihe erfolgt die Neufaltung des rekombinanten Proteins in Gegenwart der reduzierten (R-SH) als auch oxidierten (R-S-S-R) Formen einer Sulfhydrylverbindung. Dadurch können freie Sulfhydrylgruppen und Disulfide während des gesamten Reinigungsprozesses gebildet und neu gebildet werden. Die reduzierten und oxidierten Formen der Sulfhydrylverbindung werden in einem Puffer mit ausreichender Denaturierungsleistung bereitgestellt, sodaß alle Zwischenkonformationen des Proteins im Lauf des Entfaltens und Neufaltens löslich bleiben. Harnstoff gilt als zweckmäßiges Puffermedium, da er offensichtlich folgende Fähigkeiten besitzt: er dient als ausreichend schwacher Denaturant, damit das Protein an seine korrekte Konformation herankommt, und als ausreichend starker Denaturant, damit die Neufaltungs-Zwischenprodukte ihre Löslichkeit beibehalten. Dieser Ansatz funktioniert am besten, wenn die rekombinanten Einschlußkörper-Proteine von Interesse relativ unkomplizierte Faltmuster aufweisen.
Die dritte Alternative in dieser Reihe, die bei schwierigeren Neufaltungen zum Einsatz kommt, zielt darauf ab, Disulfidbindungen aufzubrechen, die sich während der Isolierung der Einschlußkörper möglicherweise gebildet haben, und die verfügbaren freien Sulfhydrylgruppen des rekombinanten Proteins dann zu derivatisieren. Dieses Ziel wird folgendermaßen erreicht: Sulfonieren des Proteins, um zufällige Disulfidbindungen zu blockieren, korrektes Neufaltenlassen des Proteins in schwachem Denaturant und anschließendes Desulfonieren des Proteins, wobei die Arbeitsvorschrift korrekte Disulfid bindungen begünstigt. Die Desulfonierung findet in Gegenwart einer Sulfhydrylverbindung und einer geringen Menge ihrer entsprechenden oxidierten Form statt, um sicherzustellen, daß geeignete Disulfidbindungen intakt bleiben. Der pH-Wert wird auf einen Wert angehoben, der es ermöglicht, daß die Sulfhydrylverbindung zumindest teilweise in ionisierter Form vorliegt, um die nukleophile Umlagerung des Sulfonats zu fördern.
Diese Neufaltungs-Arbeitsvorschriften mögen in ihrer universellen Anwendbarkeit nützlich sein, doch es wurde bislang noch nicht gezeigt, daß sie z. B. mit rekombinantem IGF-I maximal wirksam sind.
Die Verbesserung ausgewählter Disulfidbindungen durch Zugabe von 50% Methanol zu Puffer mit niedriger Ionenstärke wurde von G. H. Snyder, J. Biol. Chem. 259, 7488-7472 (1984), beschrieben. Diese Strategie umfaßt die Förderung der Bildung spezifischer Disulfidbindungen durch Einstellen elektrostatischer Faktoren im Medium, um das Nebeneinanderanordnen entgegengesetzt geladener Aminosäuren zu ermöglichen, die zu den ausgewählten Cysteinresten benachbart sind. Siehe auch das Referat und Poster von Tamura et al., die anläßlich des 11. American Peptide Symposium am 11. Juli 1989 präsentiert wurden, wobei für die Zugabe von Acetonitril, DMSO, Methanol oder Ethanol eingetreten wurde, um die Produktion von korrekt gefaltetem IGF-I zu fördern. Die US- A-4.923.967 und EP-A-361.830 offenbaren eine Arbeitsvorschrift zum Solubilisieren und Sulfitolysieren von Refraktilprotein in Denaturant sowie zum anschließenden Austauschen von Lösungsmittel, um das Protein zu fällen. Das Protein wird in Denaturant resolubilisiert und kann sich in Gegenwart von Reduktionsmittel neufalten. Diese zur Erreichung korrekter Faltung erforderlichen Schritte sind zeitaufwendig.
Die Wiedererlangung der biologischen Aktivität erfordert ein sorgfältig überwachtes Renaturierungsverfahren und kann sich je nach vorliegendem Protein als schwierig erweisen. Einige Veröffentlichungen berichten über Neufaltungsversuche für einzelne Proteine, die in bakteriellen Wirten produziert werden oder in einer denaturierten oder nicht-nativen Form vorliegen. Die Bildung eines dimeren, biologisch aktiven M-CSF nach der Expression in E. coli wird z. B. in der WO 88/8003 und von Halenbeck et al., Biotechnology 7, 710-715 (1989), beschrieben. Diese beschriebenen Verfahren umfassen die Schritte der einleitenden Solubilisierung von M-CSF-Monomeren, die von Einschlußkörpern unter reduzierenden Bedingungen in einer chaotropen Umgebung isoliert werden, umfassend Harnstoff oder Guanidinhydrochlorid, des Neufaltens mittels schrittweiser Verdünnung der Chaotrope und schließlich des Oxidierens der umgefalteten Moleküle in Gegenwart von Luft oder eines Redoxsystems.
Eine praktikable Gewinnung nach Renaturierung wurde für verschiedene Proteine beschrieben, z. B. Interleukin-2 (IL-2) [Tsuji et al., Biochemistry 26, 3129-3134 (1987); WO 87/8849], Wachstumshormon aus verschiedenen Quellen [George et al., DNA 4, 273-281 (1984); Gill et al., Bio/Technology 3, 643-646 (1985); Sekine et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 4306-4310 (1985); US-A-4.985.544, wobei diese Publikation den Zusatz eines Denaturants und Reuktionsmittels, um das Protein zu solubilisieren, die Entfernung des Reduktionsmittels, das Oxidieren des Proteins und die Entfernung des Denaturants umfaßt), Prochymosin [Green et al.,]. Dairy Res. 52, 281-286 (1985)), Urokinase [Winkler et al., Bio/Technology 3, 990-1000 (1985)], Somatotropin [US-A- 4.652.630, wobei Harnstoff zur Solubilisierung und ein mildes Oxidationsmittel dann zur Neufaltung verwendet wird] und Gewebe-Plasminogenaktivator [Rudolph et al., in: 623rd Biochem. Soc. Meeting, Canterbury (1987)]. Siehe auch Marston, Biochemical J. 240, 1 (1986).
In Berichten über die Wirksamkeit der Gewinnung wurden bis zu 40% aktives gewonnenes Fremdprotein genannt. Siehe z. B. Boss et al., Nucl. Acids. Res. 12, 3791-3806 (1984); Cabilly et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 3273-3277 (1984); Marston et al., Bio/Technology 2, 800-804 (1984); und Rudolph et al. s. o. Solche Ausbeuten sind jedoch möglicherweise nicht annehmbar, Wenn die Produktion des Proteins kostspielig ist und es in kommerziellen Mengen hergestellt werden muß. Weitere repräsentative Beispiele aus der Literatur über das Neufalten nicht-nativer Proteine aus unterschiedlichen Quellen sind z. B. ein Bericht, wonach IL-2 und Interferon-β (IFN-β) unter Verwendung von SDS zur Solubilisierung und Cu&spplus;²-Ionen als Oxidationspromotoren der vollständig reduzierten Proteine umgefaltet wurden [US-A-4.572.798]. Ein Verfahren zum Isolieren rekombinanter refraktiler Proteine nach US-A-4.620.948 umfaßt die Verwendung stark denaturierender Mittel zur Solubilisierung der Proteine, reduzierende Bedingungen zur Erleichterung korrekter Faltung und das Ersetzen von Denaturant durch Luft oder andere Oxidationsmittel zur Neubildung der Disulfidbindungen. Die Proteine, auf die das Verfahren anwendbar ist, sind z. B. Urokinase, menschliches, Rinder- und Schweine-Wachstumshormon, Interferon, Gewebe-Plasminogenaktivator, FMD-Beschichtungsprotein, Prorennin und das src-Protein.
Ein Verfahren zum Renaturieren ungefalteter Proteine, umfassend Cytochrom C, Eialbumin und Trpysin-Inhibitor, durch reversibles Binden des denaturierten Proteins an eine feste Matrix und schrittweises Renaturieren desselben durch Verdünnen des Denaturants wird in der WO 86/5809 geoffenbart. Eine modifizierte monomere Form von in E. coli exprimiertem menschlichem Blutplättchen-Wachstumsfaktor (PDGF) wurde während der Reinigung S-sulfoniert, um Thiolgruppen zu schützen, und dann in Gegenwart von Oxidationsmitteln dimerisiert, um das aktive Protein zu ergeben. Hoppe et al., Biochemistry 28, 2956 (1989).
Außerdem offenbart die EP-A-433-225 vom 19. Juni 1991 ein Verfahren zur Produktion von dimerem, biologisch aktivem Transformations-Wachstumsfaktor-β-Protein oder eines Salzes davon, worin die denaturierte monomere Form des Proteins Neufaltungsbedingungen ausgesetzt wird, die ein Solubilisierungsmittel wie z. B. mildes Detergens, ein organisches, mit Wasser mischbares Lösungsmittel und/oder ein Phospholipid umfassen. Siehe auch Bowden et al., Bio/Technology 9, 725 (1991), über zytoplasmatische und periplasmatische β-Lactamase-Einschlußkörper und Samuelsson et al., Bio/Technology 9, 731 (1991), über das Neufalten menschlicher Interferon-γ-Mutanten. Allgemeine Review-Artikel gibt es von Marston, Biochem. J. 240, 1-12 (1986); Mitraki und King, Bio/Technology 7, 690 (1989); Marston und Hartley, Methods in Enzymol. 182, 264- 276 (1990); Wetzel, "Protein Aggregation In Vivo: Bacterial Inclusion Bodies and Mam malian Amyloid," in: Stability of Protein Pharmaceuticals: In Vivo Pathways of Degradation and Strategies for Protein Stabilization, Ahern und Manning (Hrsg.), Plenum Press, 1991; und Wetzel, "Enhanced Folding and Stabilization of Proteins by Suppression of Aggregation In Vitro and In Vivo," in: Protein Engineering - A Practical Approach, Rees, A. R. et al. (Hrsg), IRL Press at Oxford University Press, Oxford, 1991.
Es gibt einige Literaturbeispiele über die Produktion von IGF-I in Bakterien. Dazu zählen die EP-A-128.733 vom 19. Dezember 1984 und EP-A-135-094 vom 27. März 1985, wobei diese Publikationen die Expression von IGF-I in Bakterien betreffen. EP-A- 288.451 betrifft die Verwendung des IamB- oder ompE-Signals zur Sekretion von IGF-I in Bakterien; Obukowicz et al., Mol. Gen. Genet. 215, 19-25 (1988), und Wong et al., Gene 68, 193-203 (1988), offenbaren ähnliche Lehren. EP-A-286.345 offenbart die Fermentation von IGF-I unter Verwendung eines γ-Promotors.
Ferner wurden Verfahren zur Herstellung von IGF-I als Fusionsprotein vorgeschlagen. Beispielsweise offenbart die EP-A-130.166 die Expression von Fusionspeptiden in Bakterien; EP-A-155.655 (US-A-5.019.500) und EP-A-219.814 offenbaren eine Fusion von IGF-I mit einem schützenden Polypeptid zur Expression in Bakterien. Die EP-A-264.074 offenbart einen Zwei-Cistron-met-IGF-I-Expressionsvektor mit einem schützenden Peptid mit einem Molekulargewicht von 500-50.000 [siehe auch US-A-5.028.531 und Saito et al.,]. Biochem. 101, 1281-1288 (1987)]. Andere beschriebene IGF-I-Fusionsverfahren sind z. B. die Fusion mit schützendem Peptid, aus dem ein rop-Gen ausgeschnitten wird (EP-A-219.814), IGF-I-Multimerexpression [Schulz et al., J. Bacteriol. 169, 5385-5392 (1987)], die Fusion von IGF-I mit LH-Protein über einen chemisch spaltbaren Methionyl- oder Tryptophanrest an der Verbindungsstelle [Saito et al., J. Biochem. 101, 123-134 (1987)] und die Fusion mit Superoxid-Dismutase (EP-A-196.056). Niwa et al., Ann. NY Acad. Sci. 469, 31-52 (1986), besprechen die chemische Synthese, Klonierung und erfolgreiche Expression von Genen für mit einem weiteren Polypeptid fusioniertem IGF-I.
Diese Verfahren unter Verwendung von Fusionsproteinen erfordern jedoch im allgemeinen eine relativ lange Leadersequenz und betreffen die Verbesserung der Expression des Einschlußkörperproteins, nicht die Verbesserung der Neufaltung des denaturierten rekombinanten Proteins. WO 91/02807 vom 7. März 1991 beschreibt ein Verfahren zum Neufalten von rekombinantem IGF-I, welches das Klonieren des IGF-I-Gens mit einer positiv geladenen Leadersequenz vor dem Transfizieren der DNA in die Wirtszelle umfaßt. Die zusätzliche positive Ladung auf dem Aminoterminus des rekombinanten IGF-I ermöglicht die korrekte Neufaltung, wenn das solubilisierte Protein 2-16 Stunden lang in Denaturantlösung gerührt wird. Nach der Neufaltung wird die Leadersequenz abgespalten und das aktive rekombinante Protein gereinigt. Dieses mehrstufige Verfahren ist kompliziert, erfordert zusätzliches Material und weiteren Aufwand, um eine heterologe Leadersequenz vor dem IGF-I-Gen zu klonieren, um dann die Leadersequenz aus dem gereinigten Protein zu entfernen. Ferner ist die 30-50%-ige Ausbeute an aktivem Konformer unter Anwendung dieses Verfahrens unspektakulär.
Ein weiteres Verfahren zur Erleichterung der in vitro-Neufaltung von rekombinantem IGF-I umfaßt die Verwendung eines solubilisierten Affinitäts-Fusionspartners, der aus zwei IgG-Bindedomänen (2Z) aus Staphylokokken-Protein A besteht. Samuelsson et al., Bio/Technology 9, 363 (1991). Während dieses Verfahren, das die Verwendung der Protein A-Domäne als Solubilisator von fehlgefaltetem und multimerem IGF-I vorsieht, zu höheren Ausbeuten an IGF-I ohne die Verwendung von Denaturierungsmitteln oder Redoxchemikalien führt, umfaßt es die zusätzlichen Schritte des Fusionierens eines eigenen Gens mit dem IGF-I-Gen und des Entfernens des Polypeptids, für das dieses Gen kodiert, nach der Expression des Fusionsgens.
Betreffend die bakteriellen Wirte, die für Fermentationsprozesse verwendet werden können, offenbart die WO 88/05821 vom 11. August 1988 ein Verfahren zum Isolieren eines Mutantenstamms von E. coli mit einer defizienten periplasmatischen Protease. Die WO 89/02465 vom 23. März 1989 offenbart ein Verfahren zur Produktion eines Polypeptids, umfassend die direkte Expression des Polypeptids in bakteriellen Wirtzellen unter Verwendung eines induzierbaren Expressionssystems in Verbindung mit einem bakteriellen Wirtsystem mit Protease-Defizienz, einschließlich eines Wirts, der eine Defizienz zweier Proteasen aufweist. Die WO 85/03949 vom 12. September 1985 offenbart bakterielle Zellstämme, die spezifische Mutationen innerhalb ihrer DNA-Sequenzen tragen, die dazu führen, daß die Zellen eine eingeschränkte Kapäzität zum Abbau von Fremdprodukten aufgrund reduzierter Expression zellulärer Proteinasen aufweisen, wobei htpR-Ion-E. coli als Beispiel angeführt wird. Die WO 89/10976 vom 16. November 1989 offenbart Protease-defiziente grampositive Bakterien und ihre Verwendung als Wirtsorganismen zur Produktion rekombinanter Proteine. Außerdem berichten Buell et al., Nucl. Acids Res. 13,1 923-1938 (1985) über die Verwendung eines an Ion und htpR mutierten E. coli-Wirts, um IGF-I zu produzieren.
Es besteht auf dem Gebiet ein Bedarf an einer einfachen, aus einem Schritt bestehenden, wirksamen Arbeitsvorschrift zur Neufaltung von unlöslichem fehlgefaltetem IGF-I zur korrekten Konformation, sodaß die biologische Aktivität des IGF-I wiederhergestellt werden kann.
Demzufolge ist es ein Ziel der Erfindung, ein solches Verfahren zum Reaktivieren von fehlgefaltetem IGF-I aus Einschlußkörpern in prokaryotischen Zellen in einem Schritt bereitzustellen, wodurch die Gewinnung von biologisch aktivem IGF-I zu niedrigen Kosten und mit hoher Ausbeute ermöglicht wird.
Es ist ein besonders bevorzugtes Ziel, ein aus einem Schritt bestehendes Solubilisierungs- und Neufaltungsverfahren bereitzustellen, um fehlgefalteten rekombinanten IGF-I zu reaktivieren, der im periplasmatischen Raum bakterieller Wirtzellen ausgefallen ist.
Es ist ein weiteres Ziel, E. coli-Wirte mit Protease-Defizienz bereitzustellen, die sich besonders für das vorliegende Solubilisierungs- und Neufaltungsverfahren eignen.
Diese und andere Ziele sind für Fachleute auf dem Gebiet offenkundig.

Zusammenfassung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung bietet somit ein Verfahren zum Reaktivieren von unlöslichem, fehlgefaltetem IGF-I, der in prokaryotischen Wirtszellen enthalten ist, durch Isolieren des unlöslichen IGF-I und Inkubieren desselben in gepufferter alkalischer Lösung, umfassend nicht mehr als 3 M Chaotrop und die minimale Menge des für die Solubilisierung notwendigen Reduktionsmittels, unter Bedingungen von IGF-I-Konzentration und Inkubationstemperatur und -zeit, die dafür sorgen, daß die Entfaltung und Neufaltung in die aktive Konformation gleichzeitig mit der Solubilisierung im gleichen Puffer erfolgen.
Vorzugsweise wird der IGF-I isoliert, indem die Zellen einem Puffer geeigneter Ionenstärke ausgesetzt werden, um die meisten Polypeptide, nicht jedoch den unlöslichen IGF-I zu solubilisieren, die Zellen aufgebrochen werden, um eine lösliche und eine unlösliche Fraktion zu bilden, und die unlösliche IGF-I-Fraktion z. B. durch Zentrifugation isoliert wird.
Die Verwendung minimaler Mengen an Chaotrop und Reduktionsmittel ermöglicht das Aufbrechen von Disulfidbindungen, sodaß sich fehlgefaltete Konformere unter schonenden Bedingungen korrekt neufalten können. Ferner findet das gesamte Solubilisierungs- und Neufaltungsverfahren in einem einfachen Inkubationsschritt ohne die Notwendigkeit des Entfernens von Chaotrop oder Reuktionsmittel oder des Hinzufügens von Redoxpuffer oder eines anderen Mittels statt.
In einem weiteren Aspekt bietet die Erfindung einen E. coli-Stamm mit dem vollständigen Genotyp tonAΔptr3phoAΔE15Δ(argF-lac)169 in einem W3110-Hintergrund, wobei die Stämme ferner den Genotyp ompTΔ oder ompTΔdegP41 aufweisen. Die Erfindung stellt überdis solche Stämme bereit, die mit einem für IGF-I kodierenden Vektor transformiert sind. Diese Stämme können im Verfahren der Erfindung eingesetzt werden.

Kurze Beschreibung der Abbildungen

Fig. 1 veranschaulicht die Abstammung von E. coli W3110-Wirtstamm 27C7.
Die Fig. 2A und 2B zeigen die Mutationsschemata für das tonA- bzw. phoA-Gen in E. coli-Stamm W3110.
Fig. 3 ist eine detaillierte Veranschaulichung der Konstruktion zur Eliminierung des tonA-Gens aus W3110.
Fig. 4 zeigt die Konstruktion von Plasmid pLS32, einem Zwischenplasmid bei der Herstellung von pLS32Tsc, das ein für IGF-I kodierendes Gen enthält.
Fig. 5 zeigt die Konstruktion von pAPIamB, einem weiteren Zwischenprodukt bei der Herstellung von pLS32Tsc.
Fig. 6 zeigt die Konstruktion von pLS32IamB, einem weiteren Zwischenprodukt bei der Konstruktion von pLS32Tsc.
Fig. 7 zeigt die Konsruktion von pLS33IamB, einem weiteren Zwischenprodukt bei der Herstellung von pLS32Tsc.
Fig. 8 zeigt die Konstruktion von pLS33Tsc, einem weiteren Zwischenprodukt bei der Herstellung von pLS32Tsc.
Fig. 9 veranschaulicht die Konstruktion von pLS32Tsc aus pLS33Tsc und pLS32IamB.
Fig. 10 zeigt die Nukleotidsequenz der Expressionskassette und Aminosäuresequenz, die für die IamB-Signalsequenz und den IGF-I in Plasmid pLS32Tsc kodiert.
Die Fig. 11 A und 11 B zeigen die Auswirkung auf IGF-I-RIA-Titern verschiedener pH- Werte und Puffer, die beim Solubilisieren von IGF-I verwendet werden.
Fig. 12 ist eine grafische Darstellung des resultierenden IGF-I-Titers als Funktion der Konzentration des vorhandenen IGF-I mit konstantem IGF-I/DTT-Verhältnis.
Die Fig. 13A, 13B und 13C zeigen die Auswirkungen der Verweilzeit im Solubilisierungspuffer zur Neufaltung auf IGF-I-RIA-Titer, wobei in Fig. 13A ein pH-Wert von 8,2 ohne Methanol, in Fig. 13B ein pH-Wert von 10,5 ohne Methanol und in Fig. 13C ein pH-Wert von 10,5 mit Methanol verwendet wurde.
Die Fig. 14A und 14B zeigen IGF-I-Titer und korrekt gefalteten im Vergleich zu fehlgefaltetem IGF-I als Funktion der Konzentration von Dithiothreitol (DTT) bzw. β-Mercaptoethanol (BME) im Solubilisierungspuffer.
Fig. 15A zeigt die korrekte IGF-I-Formation als Funktion von zugesetztem IGF-I für IGF-I, der unter Verwendung von IGF-I/DTT = 0,11, 1 mM DTT und 2 mM DTT, solubilisiert wurde. Die Fig. 15B, 15C und 15D zeigten IGF-1-Titer und korrekt gefalteten im Vergleich zu fehlgefaltetem IGF-I als Funktion von zugesetztem IGF-I für IGF-I, der unter Verwendung von konstantem IGF-I/DTT = 0,11, 2 mM DTT bzw. 1 mM DTT, solubilisiert wurde.
Fig. 16 zeigt die Auswirkungen der Verdünnung konzentrierterer Harnstofflösungen auf 2 M Harnstoff auf die Faltung, wobei die schraffierten Balken korrekt gefalteter IGF-I und die vollen schwarzen Balken fehlgefalteter IGF-I sind und ursprüngliche Harnstoffkonzentrationen von 2 M, 4 M und 6 M nach 4 Stunden (verdünnt und weitere 5 Stunden lang inkubiert) und 24 Stunden (unverdünnt) untersucht werden.

Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen

A. Definitionen

"Unlöslicher, fehlgefalteter IGF-I" bezieht sich hierin auf gefällten oder aggregierten IGF-I, der im Zellplasma prokaryotischer Wirtszellen enthalten oder mit prokaryotischen Wirtszellen assoziiert ist und eine biologisch inaktive Konformation mit fehlgefalteten oder ungebildeten Disulfidbindungen eingeht. Der unlösliche IGF-I ist vorzugsweise in refraktilen Körpern enthalten (muß dies aber nicht sein), d. h. er kann unter einem Phasenkontrastmikroskop sichtbar sein.
Der Ausdruck "Konformer" bezieht sich auf Polypeptide, die aus Einschlußkörpern gewonnen werden, die rekombinanten IGF-I enthalten und sich nur hinsichtlich intramolekularer Disulfidbindung unterscheiden. IGF-I ist 70 Aminosäuren lang und besitzt sechs Cysteinreste, die intramolekulare Disulfidbindungen bilden. Das korrekte aktive Konformer besitzt Disulfidbindungen zwischen den Aminosäureresten C6-C48, C47-C52 und C18-C61. Das andere aus solchen Einschlußkörpern gewonnene Haupt-Polypeptid ist ein fehlgefaltetes, biologisch inaktives Konformer mit Disulfidbindungen zwischen den Aminosäureresten C6-C47, C48-C52 und C18-C61.
Der Ausdruck "Chaotrop" bezieht sich hierin auf eine Verbindung, die in einer geeigneten Konzentration in wäßriger Lösung die räumliche Konfiguration oder Konformation von Proteinen durch Änderungen an deren Oberfläche modifizieren kann, um den IGF-I im wäßrigen Medium bis zu etwa 90% löslich zu machen. Die Änderungen können durch Modifikation der Lösungsmittelumgebung, z. B. des Hydratationszustands, oder der Lösungsmittel-Oberflächen-Wechselwirkung hervorgerufen werden. Die Konzentration des Chaotrops hat einen direkten Einfluß auf seine Stärke und Wirksamkeit. Ein starkes Chaotrop ist eine Verbindung, die in Lösung ein in der Lösung vorhandenes Protein wirksam entfaltet. Das Entfalten ist relativ umfangreich, jedoch reversibel. Ein moderates Chaotrop ist eine Verbindung, die in Lösung die teilweise Faltung eines Proteins aus einer beliebig verformten Konformation, die das Protein durch in der Lösung lösliche Zwischenprodukte eingenommen hat, in die räumliche Konformation ermöglicht, in der es sich befindet, wenn es unter endogenen oder homologen physiologischen Bedingungen in seiner aktiven Form vorliegt.
"IGF-I" bezieht sich hierin auf insulinartigen Wachstumsfaktor aus jeder Spezies, z. B. Rinder, Schafe, Schweine, Pferde und vorzugsweise Menschen, in nativer Sequenz oder in Variantenform und rekombinant produziert. Vorzugsweise wird IGF-I kloniert und exprimiert, z. B. durch das in EP-A-128.733 vom 19. Dezember 1984 beschriebenen Verfahren.
Der Ausdruck "Reduktionsmittel" bezieht sich hierin auf eine Verbindung oder ein Material, die bzw. das in einer geeigneten Konzentration in wäßriger Lösung Sulfhydrylgruppen im reduzierten Zustand beibehält und intra- oder intermolekulare Disulfidbindungen reduziert.
Der Ausdruck "Pufferlösung" bezieht sich hierin auf eine Lösung, die Änderungen des pH-Werts durch die Wirkung ihrer Säure-Base-Konjugatkomponenten standhält.
Der Ausdruck "hydrophobes Mittel" bezieht sich hierin auf einen apolaren gelösten Stoff, der bei Zugabe zu wäßriger Lösung die Hydrophobie der Lösung erhöht.

B. Durchführungsarten der Erfindung

Unlöslicher, fehlgefalteter IGF-I wird nach beliebigen geeigneten Verfahren von Wirtszellen in einem geeigneten Isolierungspuffer isoliert, z. B. durch Aussetzen der Zellen einem Puffer geeigneter Ionenstärke, um die meisten Wirtsproteine zu solubilisieren, worin jedoch aggregierter IGF-I im wesentlichen unlöslich ist, durch Aufbrechen der Zellen, um die Einschlußkörper freizusetzen und sie z. B. durch Zentrifugation gewinnen zu können. Dieses Verfahren ist allgemein bekannt und z. B. in US-A-4.511.503 beschrie ben. Zusammenfassend gesagt werden die Zellen im Puffer suspendiert (typischerweise bei pH 5-9, vorzugsweise etwa 6-8, unter Verwendung einer Ionenstärke von etwa 0,01 bis 2 M, vorzugsweise 0,1 bis 0,2 M). Jedes geeignete Salz, z. B. NaCl, kann einen ausreichenden Wert der Ionenstärke aufrechterhalten. Die im Puffer suspendierten Zellen werden dann durch Lyse nach herkömmlichen Verfahren aufgebrochen, z. B. durch mechanische Verfahren wie etwa mittels einer Manton-Gaulin-Presse, einer französischen Presse oder eines Ultraschalloszillators oder nach chemischen oder enzymatischen Verfahren.
Beispiele für chemische oder enzymatische Verfahren des Zellaufbrechens sind Spheroplasting, das die Verwendung von Lysozym umfaßt, um die Bakterienwand zu lysieren [H. Neu et al., Biochem. Biphys. Res. Comm. 17, 215 (1964)], und osmotischer Schock, der die Behandlung lebensfähiger Zellen mit einer Lösung hoher Tonie und mit kaltem Wasser niedriger Tonie umfaßt, um die Polypeptide freizusetzen [H. Neu et al., J. Biol. Chem. 240(9), 3685-3692 (1965)]. Ein drittes Verfahren, das in der US-A-4.680.262 vom 14. Juli 1987 beschrieben ist, umfaßt das In-Kontakt-Bringen der transformierten bakteriellen Zellen mit einer wirksamen Menge eines Niederalkanols mit 2 bis 4 Kohlenstoffatomen über einen Zeitraum und bei einer Temperatur, die ausreichen, die Zellen abzutöten und zu lysieren.
Nach dem Aufbrechen der Zellen wird die Suspension typischerweise bei geringer Geschwindigkeit von im allgemeinen etwa 500 bis 15.000 · g, vorzugsweise etwa 12.000 · g, in einer herkömmlichen Zentrifuge über einen ausreichenden Zeitraum zentrifugiert, der vom Volumen und der Konstruktion der Zentrifuge abhängt und üblicherweise etwa 10 Minuten bis 0,5 Stunden beträgt, vorzugsweise 12.000 · g über den Zeitraum von 10 Minuten. Die Zeit kann in einer Scheibenstapelzentrifuge deutlich verringert werden. Das resultierende Pellet enthält im wesentlichen die gesamte unlösliche IGF-I- Fraktion, doch wenn das Verfahren des Zellaufbrechens nicht abgeschlossen ist, kann es auch intakte Zellen oder Fragmente aufgebrochener Zellen enthalten. Die Vollständigkeit des Zellenaufbrechens kann durch erneutes Suspendieren des Pellets in einer gerin gen Menge der gleichen Pufferlösung und Untersuchen der Suspension mit einem Phasenkontrastmikroskop, falls der IGF-I in refraktilen Körpern enthalten ist, ermittelt werden. Die Gegenwart von Fragmenten aufgebrochener Zellen oder ganzer Zellen ist ein Indikator dafür, daß eine weitere Ultraschallbehandlung oder andere Mittel zum Aufbrechen notwendig sind, um die Fragmente oder Zellen und die assoziierten nicht- refraktilen Polypeptide zu entfernen. Nach einem solchen Aufbrechen kann die Suspension erforderlichenfalls noch einmal zentrifugiert und das Pellet gewonnen, erneut suspendiert und untersucht werden. Das Verfahren wird wiederholt, bis die visuelle Kontrolle das Fehlen von Fragmenten aufgebrochener Zellen im pelletierten Material ergibt oder bis eine weitere Behandlung die Größe des resultierenden Pellets nicht weiter verringern kann.
Das obige Verfahren kann sowohl dann angewandt werden, wenn das unlösliche Protein intrazellulär ist, als auch dann, wenn es sich im periplasmatischen Raum befindet. Die bevorzugten Bedingungen zum Isolieren von IGF-I betreffen hierin insbesondere im periplasmatischen Raum gefällte Einschlußkörper.
Der isolierte, unlösliche, fehlgefaltete IGF-I wird dann in Alkalipuffer inkubiert, umfassend die minimale Menge an Chaotrop und Reduktionsmittel, die notwendig ist, um den IGF-I im wesentlichen zu solubilisieren und neu zu falten. Die Inkubation erfolgt unter Bedingungen betreffend IGF-I-Konzentration, Inkubationszeit und Inkubationstemperatur, die eine Solubilisierung von IGF-I sowie dessen Entfaltung und Neufaltung ermöglichen, die gleichzeitig im Alkalipuffer erfolgen.
Die Messung des Solubilisierungsgrads des IGF-I im Puffer erfolgt günstigerweise durch Trübheitsbestimmung, durch Analysieren von IGF-I-Fraktionierung zwischen dem Überstand und dem Pellet nach Zentrifugation auf reduzierenden SDS-Gelen, durch Proteinassay (z. B. mittels des Bio-Rad-Proteinassay-Sets) oder mittels HPLC. Der Neufaltungsgrad wird günstigerweise anhand des RIA-Titers von IGF-I oder durch HPLC-Analyse unter Verwendung z. B. einer Vydac C18-Säule bestimmt, wobei steigender RIA-Titer oder die Peakgröße von korrekt gefaltetem IGF-I direkt mit steigenden Mengen an korrektem, biologisch aktivem IGF-I-Konformer im Puffer korreliert. Diese Inkubation wird durchgeführt, um das Verhältnis von korrekt gefaltetem IGF-I-Konformer zu fehlgefaltetem gewonnenen IGF-I-Konformer (bestimmt durch RIA oder HPLC) zu maximieren.
Der pH-Wert des Puffers liegt typischerweise bei zumindest etwa 7,5 und reicht vorzugsweise von 7,5-10,5. Beispiele für geeignete Puffer, die einen pH-Wert in diesem Bereich ergeben, sind CAPSO (3-[Cyclohexylamino]-2-hydroxy-1-propansulfonsäure), AMP (2-Amino-2-methyl-1-propanol), CAPS (3-[Cyclohexylamino]-1-propansulfonsäure), CHES (2-[N-Cyclohexylamino]ethansulfonsäure, TRIS (Tris[hydroxymethyl]aminomethan und Natriumacetat. Der bevorzugte Puffer ist hierin CAPSO bei einem pH von etwa 8,5- 10,5.
Beispiele für geeignete Reduktionsmittel sind DTT, BME und Cystein. Die minimale Menge an Reduktionsmittel, die im Puffer vorhanden sein muß, hängt hauptsächlich von der Art des Reduktionsmittels und Chaotrops, der Art und dem pH-Wert des verwendeten Puffers, der Sauerstoffmenge, die in der Lösung mitgeführt oder in diese eingebracht wird, und der Konzentration des IGF-I im Puffer ab. Beispielsweise betragen im Fall von 0,5-1,5 mg/ml IGF-I in einer Pufferlösung bei pH 7,5-10,5 mit 1-4 M Harnstoff die DTT-Konzentration etwa 1-8 mM und die BME-Konzentration etwa 0,2-2 mM. Das bevorzugte Reduktionsmittel ist DTT bei etwa 2-4 mM, BME bei etwa 1-2 mM oder Cystein bei etwa 2-4 mM.
Chaotrope, die sich zur Durchführung der Erfindung eignen, sind z. B. Harnstoff und Salze von Guanidin oder Thiocyanat, noch bevorzugter Harnstoff, Guanidinhydrochlorid oder Natriumthiocyanat. Die Menge an Chaotrop, die im Puffer zumindest vorhanden sein muß, beträgt nicht mehr als etwa 3 Mol-%. Das bevorzugte Chaotrop ist hierin Harnstoff bei etwa 1,5-2,5 M, noch bevorzugter bei etwa 2 M, oder Guanidinhydrochlorid bei etwa 1-3 M.
Die Inkubationsbedingungen des unlöslichen, fehlgefalteten IGF-I sind im allgemeinen solcherart, daß beträchtliche oder vollständige Solubilisierung des IGF-I sowie maximale Neufaltung erfolgen. Die genauen Bedingungen sind z. B. vom pH-Wert des Puffers und den Arten und Konzentrationen der Chaotrope und Reduktionsmittel abhängig. Die Reaktionstemperatur darf nicht so hoch sein, daß sie den IGF-I denaturiert, und liegt daher im allgemeinen bei etwa 10-40ºC. Die Inkubation erfolgt im allgemeinen zumindest etwa 1 Stunde lang, um gleichzeitige Solubilisierung und Neufaltung zu ermöglichen. Die Reaktion erfolgt vorzugsweise bei etwa 15-37ºC, noch bevorzugter 20-30ºC, und dauert zumindest etwa 1 Stunde lang, noch bevorzugter 2-12 Stunden.
Die Konzentration des IGF-I in der Pufferlösung muß solcherart sein, daß der IGF-I größtenteils solubilisiert und das Verhältnis von korrekt gefaltetem und fehlgefaltetem gewonnenem Konformer maximiert wird (bestimmt mittels HPLC). Die genaue einzusetzende Menge ist z. B. von den Konzentrationen und Arten anderer Bestandteile der Pufferlösung, insbesondere von der IGF-I-Konzentration, dem Reduktionsmittel und dem pH-Wert des Puffers, abhängig. Beispielsweise kann die Konzentration von IGF-I um das zumindest Dreifache erhöht werden, ohne das Verhältnis von korrekt und fehlgefaltetem Konformer zu senken, wenn die Konzentration von Reduktionsmittel wie z. B. DTT gleichzeitig erhöht wird, um das Verhältnis von IGF-I : DTT von etwa 0,11 auf 0,2 anzuheben. Die bevorzugte Konzentration von IGF-I (führt zur maximalen Ausbeute an korrekt gefaltetem Konformer) liegt im Bereich von 0,5-5,5 mg/ml, vorzugsweise 1,5-5,0 m g/m l.
Die Zugabe eines hydrophoben Mittels zum Puffer kann im allgemeinen die Ausbeute an korrekt gefaltetem Konformer erhöhen. Beispiele für geeignete hydrophobe Mittel sind organische Lösungsmittel, wie z. B. Methanol, Ethanol, DMSO (Dimethylsulfoxid) und Acetonitril. Methanol und Ethanol sind als etwa 5-20%-ige Lösungen, noch bevorzugter etwa 20%-ig, wirksam, DMSO als etwa 40-50%-ige Lösung.
Wirtszellen, die den rekombinanten IGF-I in großen Mengen in Form von Einschlußkörpern exprimieren, sind prokaryotische Zellen. Geeignete Prokaryoten sind beispielsweise Bakterien, vorzugsweise Eubakterien, z. B. gramnegative oder grampositive Organismen, wie E. coli, Bacilli, wie z. B. B. subtilis, Pseudomonas-Spezies, wie z. B. P. aeruginosa, Salmonella typhimurium oder Serratia marcescens. Ein bevorzugter E. coli-Klonierwirt ist E. coli 294 (ATCC 31.446), obwohl auch andere Stämme, wie z. B. E. coli B, E. coli X1776 (ATCC 31.537) und E. coli W3110 (ATCC 27.325) in Frage kommen. Diese Beispiele sind veranschaulichend und nicht einschränkend. Stamm W3110 ist ein bevorzugter Wirt oder Stammwirt, da er ein üblicher Wirtsstamm für DNA-Rekombinations-Produkt-Fermentationen ist. Vorzugsweise sollte die Wirtszelle minimale Mengen proteolytischer Enzyme sekretieren. Beispielsweise kann Stamm W3110 modifiziert werden, um eine genetische Mutation in den für Proteine kodierenden Genen herbeizuführen, wobei Beispiele für solche Wirte die E. coli W3110-Stämme 1A2, 27A7, 27B4 und 27C7 sind (wie weiter unten beschrieben).
Es folgt eine ausführliche Beschreibung der Erfindung durch nachstehende Beispiele, die die Erfindung veranschaulichen, ihren Schutzbereich jedoch nicht einschränken. Alle Literatur- und Patentzitate sind explizit durch Verweis aufgenommen.

BEISPIEL 1

Produktion und Isolierung von rhIGF-I und Test auf dessen Löslichkeit in Tris-Puffer

i. Konstruktion von Wirtszellenstamm 27C7

Der zur Produktion von rekombinantem menschlichem IGF-I bei der hierin beschriebenen Fermentation verwendete Wirt war ein Derivat von E. coli W3110 mit der Bezeichnung 27C7. Der vollständige Genotyp von 27C7 ist tonAΔptr3phoAΔE15Δ(argF-lac)169 ompTΔdegP41kanr. Die Ableitung von Stamm 27C7 wird schematisch in Fig. 1 dargestellt und nachstehend beschrieben. Stamm 27C7 wurde am 30. Oktober 1991 bei der American Type Culture Collection als ATCC Nr. 55.244 hinterlegt.
Stamm 27C7 wurde in verschiedenen Schritten unter Anwendung von Verfahren konstruiert, die Transduktionen mit Phagen P1 kc, abgeleitet aus P1 [J. Miller, Experiments in Molecular Genetics [Cold Spring Harbor, N. Y.: Cold Spring Harbor Laboratory, 1972)], und Transposon-Genetik [Kleckner et al., J. Mol. Biol. 116, 125-159 (1977)] umfassen. Der eingesetzte Ausgangswirt war E. coli K12 W3110, ein K12-Stamm, der F&supmin;, λ&supmin; ist [Bachmann, Bact. Rev. 36, 525-557 (1972); Bachman, "Derivates and Genotypes of Sume Mutant Derivatives of Escherichia coli K-12", S. 1190-1219, in: F. C. Niedhardt et al. (Hrsg.), Escherichia coli and Salmonella typhimurium: Cellular and Molecular Biology, Bd. 2, American Society for Microbiology, Washington, D. C. (1987)].
Als erstes wurde das tonA-Gen (thuA) [Kadner et al., J. Bact. 143, 256-264 (1980), Bachmann, Microbiol. Rev. 47, 180-230 (1983), Bachman, "Linkage Map of Escherichia coli K-12", Ausgabe 7, S. 807-876, in: F. C. Niedhardt et al. (Hrsg.), Escherichia coli and Salmonella tryphimurium: Cellular and Molecular Biology", Bd. 2, American Society for Microbiology, Washington, D. C., 1987] aus W3110 durch Insertion und anschließende ungenaue Exzision eines Tn10-Transposons in das tonA-Gen deletiert. Diese Konstruktion ist schematisch in den Fig. 2B und 3 dargestellt.
Im ersten Schritt dieses Verfahrens wurde E. coli W3110 mit λ::Tn10 transduziert, um einen Tn10-Hop-Pool von E. coli W31 10 zu bilden [Kleckner et al., J. Mol. Biol., s. o.].
Der E. coli W3110::Tn10-Hop-Pool wurde in L-Brühe bei 37ºC bis zu einer Zelldichte von etwa 1 · 10&sup9;/ml gezüchtet. Insgesamt 0,5 ml der Kultur wurden zentrifugiert und das Pellet in 0,2 ml eines λphi80-Lysats mit 7,0 · 10&sup9; pfu resuspendiert. Man ließ den Phagen 30 min lang bei 37ºC adsorbieren. Die Suspension wurde dann auf mit Tetracyclin (15 ug/ml) ergänzten EMB-Platten aufgetragen. Nach Inkubation über Nacht bei 37ºC wurden die Kolonien in 3 ml L-Brühe gepoolt, über Nacht bei 37ºC vermehrt, zweimal gewaschen und wieder in L-Brühe suspendiert. Ein Bakteriophagen P1kc-Lysat wurde aus dieser Kultur gebildet [Miller, J. H., Experiments in Molecular Biology, s. o., S. 304].
E. coli AT982 (Nr. 4546, E. coli Genetic Stock Center, New Haven, Conn., USA) wurde durch dieses P1kc-Lysat zu Tetracyclin-Resistenz transduziert. Transduktanden wurden auf L-Brüheplatten selektiert, die mit Tetracyclin (15 ug/ml) und 40 ug/ml Diaminopimelinsäure (dap) ergänzt waren. Die resultierenden Transduktanden wurden auf Tetracyclin-Resistenz und Regenerierung des dap-Gens (dap&spplus;, tetR) gescreent. Transduktanden mit dem dap+, tetR-Genotyp wurden dann auf λphi80-Resistenz untersucht.
P1kc-Lysate wurden dann aus verschiedenen dap+, tetR, λphi80-resistenten Stämmen gebildet. Die Lysate dienten dazu, E. coli W3110 zu Tetracyclin-Resistenz zu transduzieren. Die Transduktanden wurden auf λphi80-Resistenz gescreent und selektiert.
Tetracyclin-sensitive Isolate wurden aus den W3110 tonA:: Tn10-λphi80R-Transduktanden selektiert [Maloy und Nunn, J. Bacteriol. 145, 1110 (1981)]. Diese Isolate wurden auf λphi80-Resistenz und Tetracyclin-Sensitivität nach Einzelkolonie-Reinigung überprüft.
DNA wurde aus verschiedenen tetracylcin-sensitiven Xphi80-resistenten Mutanten isoliert und mit SstII gespalten. Die mit Sst-II gespaltene DNA wurde durch Southern Blot- Verfahren unter Verwendung radioaktiv markierter und mit SstII gespaltener λ::Tn10- DNA als Sonde charakterisiert, um zu bestimmen, ob das Tn10 exzidiert worden war [Davis et al., Advanced Bacterial Genetics (Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1980). Eines der tetracyclin-sensitiven Isolate hatte im Vergleich zur Hybridisierung zwischen DNA aus dem λ::Tn10 und dem ursprünglichen W3110 tonA::Tn10λphi80R offenbar zwei der Tn10-Hybridisierungsbanden verloren. Eine dritte Hybridisierungsbande wies geänderte Mobilität auf - ein Indikator dafür, daß eine Deletion infolge ungenauer Exzision von Tn10 erfolgt war.
SDS-Gel-Elektrophorese der äußeren Membranpräparate vom Stamm mit ungenauer Tn10-Exzision zeigte, daß die Bande, von der man annahm, sie wäre das Protein, für das tonA kodiert, eine andere elektrophoretische Mobilität aufwies als Protein des Wildtyps, wofür das tonA-Gen kodiert. Das resultierende Protein war als λphi80-Phagen-Rezeptorprotein nicht-funktionell. Ein zweiter unabhängiger Stamm, der auch einer ungenauen Exzision von Tn10 unterzogen worden war, zeigte auf dem SDS-Gel kein Protein, für das tonA kodiert.
Keiner dieser Stämme zeigte eine Rückkehr zur Tetracyclin-Resistenz oder λphi80-Sensitivität; ein Anzeichen dafür, daß ungenaue Exzision eines Teils oder des gesamten Tn10- Transposons zusammen mit teilweiser oder vollständiger Deletion des tonA-Gens erfolgt war. Somit wurde das Protein, wofür das tonA-Gen kodiert (Molekulargewicht 78.000) aus der Außenmembran eliminiert, wodurch der W3110 tonA-Stamm gegenüber Bakteriophagen resistent wurde. Der resultierende Stamm, als 1A2 bezeichnet, ist gegenüber Bakteriphagen T1 und φ80 resistent.
Das ptr3-Gen [Cheng et al., J. Bacteriol. 140, 125-130 (1979)] wurde wie folgt in den Stamm 1A2 eingebracht. Als erstes wurde die thyA8-Mutation in 1A2 isoliert, indem auf Trimethoprim-Resistenz selektiert wurde, um Stamm 9E1 zu bilden. Dann wurde der argA81:tn10-Locus durch Transduktion mit Phagen p1kc von 9D9 (erhalten von B. Bachman, E. coli Genetic Stock Center, New Haven, Conn.) in 9E1 transportiert, um 9E3 zu bilden. Der ptr3-Locus liegt zwischen thyA8 und argA81. Die Transduktion mit P1-Phagen (gezüchtet auf einer ptr3-Mutante [9D7, J. Bact. 140, 125 (1979)] führt zur Einführung der ptr3-Mutation gleichzeitig mit der Umwandlung von thyA8 und argA81::Tn10 in Loci des Wildtyps. Dieser als 9E4 bezeichnete Stamm weist Defizienz an periplasmatischer Protease III auf. Die Schlußfolgerung, daß die ptr3-Mutation in 9E4 enthalten ist, wird durch verbesserte IGF-I-Akkumulierung im resultierenden Stamm untermauert.
Dann werden zwei weitere Deletionsmutanten, phoAΔE15 [Sarthy et al.,J. Bacteriol. 145, 288-292 (1981)] und Δ(argF-lac)169 [Schweizer und Boos, Mol. Gen. Genet. 192, 293-294 (1983)] gleichzeitig durch genetische Verbindung auf ein Kanamycin-Resistenz- Transposon übertragen, das in ein biosynthetisches Prolin-Gen eingesetzt ist (proC::Tn5) (enthalten in 6D3, von Prof. Barry Wanner, Purdue University, zur Verfügung gestellt). Diese Konstruktion ist schematisch in Fig. 2B dargestellt.
Das Transposon wurde durch Selektion auf ein prototrophes (pro&spplus;)-Isolat auf minimalen Glucose-Agarplatten nach P1-Transduktion mit 1A2 eliminiert. Die Einführung der phoA-Mutation eliminiert alkalische Phosphatase-Expression und wurde als Transduktanden erkannt, die weiße Kolonien auf minimalen Glucose-Agarplatten mit 0,2 mM Phosphat und 20 mg/l 5-Brom-4-chlor-3-indolylphosphat bilden. Ebenso bewirkt die Δ(argF-lac)169-Mutation den Verlust der Enzym-β-Galactosidase (eines lac-Phenotyps) und führt zu Zellen, die weiße Kolonien auf MacConkey-1%-Lactose-Agarplatten bilden. Der resultierende Stamm wurde als 27A7 bezeichnet.
Die ompT-Deletion [Earhart et al., FEBS Microbiol. Lett. 6, 277-280 (1979)] wurde durch P1-Cotransduktion in 27A7 eingeführt. Man beachte, daß diese ompl-Deletion bis in den benachbarten ent-Gen-Cluster reicht, der für die Fixierproteine für die Colicine B und D kodiert. Als erstes wurde eine verbundene Tn10-Insertion im purE-Gen benachbart zur ompl-Deletion unter Anwendung herkömmlicher Transduktionsverfahren insertiert [Zwischenprodukte 3E9 (ein ähnlicher Stamm ist von Dr. Carol Gros, University of Wisconsin, erhältlich), 16B2, 25C9 (J. Bacter. 153, 1104-1106 (1983)) und 25D3]. Dann wurde purE::Tn10 in 27A7 transduziert. Schließlich wurde dieser Stamm auf Purin- Prototrophie transduziert, um das Transposon zu entfernen. Die Beibehaltung des ompTΔ-Genotyps wurde durch Colicin B-Resistenz im resultierenden als 27C6 bezeichneten Stamm bestätigt. Dieser Stamm besitzt Defizienz an der äußeren Membran- Protease VII.
Schließlich wurde eine zusätzliche periplasmatische Protease-Mutation, degP41kanr, [Strauch et al., J. Bacteriol. 171, 2689-2696 (1989); Harvard Medical School] durch herkömmliche Verfahren in Stamm 27C6 transduziert. Diese Mutation wurde in vitro konstruiert, indem ein Abschnitt des degP-Gens durch das Kanamycin-Gen ersetzt wurde. Dies ist kein Transposon, sondern ermöglicht die Selektion der Deletion unter Nutzung von Kanamycin-Resistenz.
Dieser letzte Stamm, 27C7, besitzt die folgenden Eigenschaften: er ist phagen-resistent, es fehlen drei Proteasen, er kann nicht auf Lactose wachsen und produziert keine alkalische Phosphatase, wenn kein Phosphat im Medium mehr vorhanden ist - die gleichen Bedingungen, welche die Produktion von rhIGF-I hervorrufen.

ii. Beschreibung/Konstruktion von Expressionsplasmid pLS32Tsc

Das Sekretionsplasmid pLS32Tsc, das zur Transformation von Stamm 27C7 dient, enthält das IGF-I-Gen. Die zur Expression des IGF-I-Gens in E. coli erforderlichen Transkriptions- und Translationssequenzen werden durch den alkalische Phosphatase-Promotor und die trp-Shine-Dalgarno-Sequenz bereitgestellt. Der λ-t&sub0;-Ttranskriptions-Terminator liegt neben dem IGF-I-Terminationscodon. Die Sekretion des Proteins aus dem Zytoplasma wird durch die IamB-Signalsequenz oder alternativ dazu durch die STII-Signalsequenz gesteuert. Ein Großteil des rhIGF-I findet sich im periplasmatischen Zellraum. Das Plasmid pLS32Tsc verleiht dem transformierten Wirt Tetracyclin-Resistenz.
Plasmid pLS32Tsc wurde in mehreren Schritten unter Verwendung von pLS32, pAPIamB, pLS32IamB, pLS33IamB und pLS33Tsc als Zwischenplasmide konstruiert.

Schritt 1: pLS32

Das Plasmid pLS32 führt zur Fusion der IGF-I-Kodiersequenz mit jener der hitzebeständigen Enterotoxin II-(STII-)Signalsequenz und wurde durch Zusammenligieren von vier DNA-Fragmenten hergestellt (siehe Fig. 4). Das erste davon war der Vektor pTF2A12 [Paborsky et al., Biochemistry 28, 8072-8077 (1989)], aus dem das kleine, das Gewebefaktor-Gen enthaltende NsiI-BamHI-Fragment entfernt worden war. Die STII- Signalsequenz wird von Picken et al., Infect. Immun: 42, 269-275 (1983), beschrieben.
Das zweite Fragment war ein synthetisches Duplex mit 55 bp, das für die ersten 18 Aminosäuren von reifem IGF-I kodiert. Dieses Duplex besitzt die folgende Sequenz:
5' - GGTCCCGAAACTCTGTGCGGTGCTGAACTGGTTGACGCTCTGCAGTTTGTTTGC-
3' - CGTCCAGGGCTTTGAGACACGCCACGACTTGACCAACTGCGAGACGTCAAACAAACG- G-3'
CCACTG-5'
(Sequenz-Identitätsnummern 1 bzw. 2)
Das dritte Stück in der Ligation war ein 154 bp BstEII-HindIII-Fragment aus pK1ZZIGF-I, das für die verbleibenden Aminosäuren 19-70 von IGF-I kodiert. pK1ZZIGF-I ist ein kanamycin-resistentes Plasmid, das einen lac-Promotor enthält, der an einen Protein A- Promotor gebunden ist, der an ein Protein A-Signal gebunden ist, gebunden an zwei Konsens Z-Bereiche von Protein A, die IgGs binden und Proteine sekretieren, fusioniert unter Verwendung von zwei Codons, die für eine Asn-Gly-Schnittstelle kodieren, mit einem synthetischen IGF-I-Gen, ferner umfassend einen F-Bereich, um eine hohe Kopienanzahl zu ergeben. Dieses Plasmid ähnelt pZZ-IGF-I aus Fig. 6 und dem in der EP-A-230.869 vom 5. August 1987 beschriebenen, worin das Ampicillin-Gen durch ein Kanamycin-Gen ersetzt ist.
Das fetzte Fragment war ein 291 bp-HindIII-BamHI-Fragment aus dem Plasmid pLS8. Dieses letzte Fragment ist einfach die Kodiersequenz für den Beginn des Tetracyclin- Gens aus pBR322 [Sutcliffe, Cold Spring Harbor Symposia an Quantitative Biology 43, 77-90 (1978)], worin eine HindIII-Restriktionsstelle unmittelbar stromauf vom Methionin-Startcodon konstruiert wurde.
Das resultierende Plasmid, pLS32, exprimiert und sekretiert rhIGF-I wirksam in das Medium. Die folgenden zwei Konstruktionsschritte erfolgten, um die STII-Signalsequenz durch die IamB-Signalsequenz zu ersetzen, wodurch die Produktausbeute verbessert wurde.

Schritt 2: pAPIamB

Das Plasmid pAPIamB wurde wie in Fig. 5 konstruiert, indem zwei DNA-Fragmente miteinander ligiert wurden; dies führt zur Positionierung der IamB-Signal-Kodiersequenz stromab vom AP-Promotor und der trp-Shine-Dalgarno-Sequenz. In der Ligation war der Vektor pRA1 enthalten, in dem das kleine XbaI-BgIII-Fragment entfernt worden war. Dieses Plasmid ist ein Derivat von phGH1 [Chang et al., Gene 55, 189-196 (1987)], wobei das Plasmid den AP-Promotor, das STII-Signal und für hGH kodierende DNA enthält. pRA1 unterscheidet sich insofern von phGH1, als er DNA enthält, die für Relaxin A-Kette kodiert (deren Sequenz in der US-A-4.758.516 beschrieben ist) und nicht hGH, und eine geeignete BgIII-Restriktionsstelle stromab von Promotor und Ribosomen-Bindestelle enthält. Das zweite Stück in der Ligation war ein synthetisches DNA- Duplex mit 80 bp und nachstehender Sequenz, das für die IamB-Signalsequenz kodiert, die von Clement und Hofnung, Cell 27, 507-514 (1981), beschrieben wurde:
5'-CTAGAATTATGATGATTACTCTGCGCAAACTTCCTCTGGCGGTTGCCGTCGCAGC-
3'- TTAATACTACTAATGAGACGCGTTTGAAGGAGACCGCCAACGGCAGCGTCG-
GGGCGTAATGTCTGCTCAGGCCATGGCCA-3'
CCCGCATTACAGACGAGTCCGGTACCGGTCTAG-5'
(Sequenz-Identitätsnummern 3 bzw. 4)

Schritt 3: pLS32IamB

Das Plasmid pLS32IamB führt zur Fusion der IamB-Signalsequenz mit dem IGF-I-Kodierbereich und wurde, wie aus Fig. 6 ersichtlich, durch Ligation dreier DNA-Fragmente konstruiert. Das erste davon war der Vektor pLS32, aus dem das kleine XbaI-BstEII-Frag ment entfernt worden war. Das zweite war ein 75 bp-XbaI-EaeI-Fragment aus pAPIamB, das für die lamb-Signalsequenz kodiert. Das dritte war ein synthetisches DNA-Duplex mit 55 bp, das für die ersten 18 Aminosäuren von reifem IGF-I kodiert und die folgende Sequenz besitzt:
5'-GGCCGGTCCCGAAACTCTGTGCGGTGCTGAACTGGTTGACGCTCTGCAGTTTGT-
3'-CCAGGGCTTTGAGACACGCCACGACTTGACCAACTGCGAGACGTCAAACA-
TTGCG - 3 '
AACGCCACTG-5'
(Sequenz-Identitätsnummer 5 bzw. 6)
Die folgenden Schritte führen den transkriptionalen Terminator in das Plasmid ein. Diese Plasmidänderungen führten zu einer verbesserten Produktausbeute.

Schritt 4: pLS33IamB

Das Plasmid pLS33IamB ist ein Zwischenprodukt bei der Herstellung von pLS32Tsc und wurde, wie aus Fig. 7 ersichtlich, durch Ligieren dreier DNA-Fragmente konstruiert. Das erste davon war der Vektor pLS32, aus dem das kleine XbaI-BstEII-Fragment entfernt worden war. Das zweite war ein 75 bp-XbaI-EaeI-Fragment aus pAPIamB, das für die IamB-Signalsequenz kodiert. Das dritte war ein DNA-Duplex mit 46 bp und der folgenden Sequenz:
5'-GGCCACTCTGTGCGGTGCTGAACTGGTTGACGCTCTGCAGTTTGTTTGCG-3'
3'-TGAGACACGCCACGACTTGACCAACTGCGAGACGTCAAACAAACGC -
CACTG-5'
(Sequenz-Identitätsnummern 7 bzw. 8)
Die obige Sequenz kodiert für die Aminosäuren 4-18 von reifem IGF-I.

Schritt 5: pLS33Tsc

Das Plasmid pLS33Tsc führt zur Positionierung des λ-t&sub0;-Transkriptions-Terminators unmittelbar stromab von der IGF-I-Kodiersequenz. Drei DNA-Fragmente wurden, wie aus Fig. 8 ersichtlich, miteinander ligiert, um dieses Plasmid zu konstruieren. Das erste Stück war der Vektor pLS18, aus dem das kleine XbaI-BamHI-Fragment entfernt worden war. pLS18 ist ein Derivat von phGH1 [Chang et al., s.o.], das DNA enthält, die für menschliche DNase (geoffenbart in der WO 90/07572 vom 12. Juli 1990) und nicht für hGH kodiert. phGH1 konnte zur Erzeugung des gleichen Fragments verwendet werden. Der zweite Teil der Ligation war ein 288 bp-XbaI-HindIII-Fragment aus pLS33IamB, worin die HindIII-Restriktionsstelle durch Behandlung mit DNA-Polymerase I (Klenow) abgestumpft worden war. Der dritte Teil der Ligation war ein 412 bp-StuI-BamHI-Fragment aus dem Plasmid pdH108-4. Dieses Fragment enthält den λ-t&sub0;-Transkriptions-Terminator [Scholtissek und Grosse, Nuc. Acids Res. 15, 3185 (1987)] und die Basen paare 2-375 von pBR322 [Sutcliffe, s.o.], worin die Basenpaare 2-375 stromab oder 3' vom Transkriptions-Terminator angeordnet sind. Die Sequenz des Terminatorbereichs dieses Fragments. lautet wie folgt:
5'-CCTAACGCTCGGTTGCCGCCGGGCGTTTTTTGTTAA-3'
3'-GGATTGCGAGCCAACGGCGGCCCGCAAAAAATAACAATT-5'
(Sequenz-Identitätsnummern 9 bzw. 10)

Schritt 6: pLS32Tsc

Das endgültige Plasmid pLS32Tsc wurde, wie aus Fig. 9 ersichtlich, durch Ligieren zweier DNA-Fragmente konstruiert. Das erste davon war der Vektor pLS33Tsc, aus dem das kleine EcoRI-BstEII-Fragment entfernt worden war. Das zweite war ein 550 bp- EcoRI-BstEII-Fragment aus pLS32IamB, umfassend den AP-Promotor, trp-Shine-Dalgarno und die Kodiersequenz für die IamB-Signalsequenz, die mit den ersten 18 Aminosäuren von IGF-I fusioniert ist. Das resultierende Plasmid wurde durch Restriktions-Endonukle ase-Spaltung analysiert. Die gesamte Promotor- und Kodiersequenz wurde durch DNA- Sequenzierung verifiziert, wobei die Sequenz in Fig. 10 dargestellt ist (Sequenz-Identitätsnummer 11)

iii. Fermentations- und Gewinnungsverfahren

Kompetente E. coli 27C7-Zellen wurden mit pLS32Tsc durch herkömmliche Transformationsverfahren transformiert. Transformanten wurden selektiert und auf LB-Platten mit 20 mg/l, Tetracyclin gereinigt. Dieses Medium besaß die folgende Zusammensetzung: 10 g/l Bacto-Trypton, 5 g/l, Hefeextrakt, 10 g/l, Natriumchlorid und 20 mg/l, Tetracyclin-HCl.
Eine transformierte Kolonie diente dazu, sterile LB-Brühe mit 20 mg/l, Tetracyclin zu impfen. Die Kolbenkultur wurde bei 35-39ºC inkubiert, bis die optische Dichte bei 550 nm etwa 1,0 erreichte. Steriles DMSO wurde der Kultur zugesetzt, um eine Endkonzentration von DMSO von 10 Vol.-% zu ergeben. Aliquoten von 1-2 ml wurden in sterile Fläschchen abgefüllt und bei -60ºC oder einer tieferen Temperatur gelagert.
Das Fermentationsverfahren zur Herstellung von rhIGF-I unter Verwendung von 27C7/pLS32Tsc erfolgte in Chargen mit Volumina von 5 bis 12 Litern. Am Ende der Fermentation wurden Zellen durch Zentrifugation geerntet.
Eine Schüttelflaschen-Impflösung wurde durch Beimpfen von etwa 500 ml sterilem, Tetracyclin umfassenden LB-Medium mit der frisch aufgetauten Kultur im 1-2 ml-Fläschchen (s.o.) hergestellt. Die Schüttelflasche wurde bei 35-39ºC bei 50-200 U/min 7-12 Stunden lang inkubiert. Der Schüttelflasche wurde dann dazu verwendet, ein 15 l-Fermentationsgefäß mit 5-9 l Kulturmedium zu impfen, das wie folgt zusammengesetzt war:
Bestandteil Menge/l
Glucose* 250-350 g
Ammoniumsulfat 2-6 g
Ammoniumhydroxid erforderliche Menge, um den pH bei 7,1 bis 7,5 zu halten
Natriumphosphat, einbasiges Dihydrat 1-2 g
Kaliumphosphat, zweibasig 2-3 g
Natriumcitrat, Dihydrat 0,5-1,5 g
Kaliumchlorid 1-2 g
25% Pluronic-Polyol L61 - 0,2 ml anfänglich und dann in der erforderlichen Menge, um Schäumen zu bekämpfen
Magnesiumsulfat, Heptahydrat 1-3 g
Tetracyclin-HCl 5-20 g
Hefeextrakt** 5-15 g
NZ Amin AS** 5-20 g
Isoleucin 0-10 g
Eisenchlorid, Heptahydrat 10-30 mg
Zinksulfat, Heptahydrat 2-5 mg
Kobaltchlorid, Hexahydrat 2-5 mg
Natriummolybdat, Dihydrat 2-5 mg
Kupfer(II)-sulfat, Pentahydrat 2-5 mg
Borsäure 0,5-2 mg
Mangansulfat, Monohydrat 1-3 mg
*2-5 g/l, Glucose wurden anfänglich zur Kultur hinzugefügt. Der Rest wurde der Kultur im Lauf der Fermentation in Raten zugegeben, die rasch genug waren, um schnelles Wachstum während der Anfangsphase der Fermentation zu ermöglichen, aber nicht rasch genug waren, um ein Sinken der Menge an gelöstem Sauerstoff auf unter 30% des Luftsättigungsniveaus während der restlichen Fermentationsdauer zu bewirken (wenn sich eine signifikante Zellmasse akkumuliert hatte).
** Hefeextrakt und NZ Amin AS können anfänglich und/oder zu einem späteren Zeitpunkt während der Fermentation zugegeben werden.
Das Fermentationsverfahren erfolgte bei 35-39ºC bei pH 7,1-7,5 über einen Zeitraum von 24-48 Stunden. Die Rührgeschwindigkeit wurde auf 650-1000 U/min eingestellt, die Belüftungsrate auf das 0,7- bis 1,5fache des Kulturvolumens an Luftvolumen pro Minute. Die Produktion von IGF-I erfolgte, nachdem das Phosphat im Medium aufgebraucht war. Nach der Fermentation wurde die Kultur abgekühlt und dann durch Zentrifugation geerntet. Geerntete Zellen wurden in Zell-Lyse-Puffer (etwa 4 g Zellpaste/100 ml), umfassend 25 mM Tris, pH 7,5, 5 mM EDTA, mit 200 ug/ml Hühnereiweiß- Lysozym suspendiert und bei 4ºC etwa 5 min lang ultraschallbehandelt. Zell-Lysate wurden bei 5.000 bis 15.000 · g und 4ºC 10 min lang zentrifugiert und der Überstand und Pelletfraktionen auf reduzierten und nicht-reduzierten SDS-Gelen analysiert.

iv. Ergebnisse

A. Verteilung von IGF-I

Das reduzierte Gel zeigte, daß bei Gesamtzell-Lysaten etwa 10% des gesamten Zellproteins IGF-I ist, das fast vollständig in der Pelletfraktion enthalten ist. Auf dem nichtreduzierten Gel fehlte die IGF-I-Bande fast völlig, während zahlreiche hochmolekulare schwache Banden auftraten, was darauf hindeutete, daß der Großteil an zellassoziiertem IGF-I in einer disulfid-gebundenen, aggregierten Form vorlag.

B. Solubilisierung von IGF-I in Tris-Puffer

Das Refraktil-Körper-Material aus einem 4 ml OD-Zellpellet (wie oben isoliert) wurde in 100 ul 25 mM Tris, pH 7,5, plus 5 mM EDTA und variierenden Mengen an DTT und Chaotrop (Harnstoff oder Guanidinchlorid) solubilisiert. Die Solubilisierung der refraktilen Teilchen wurde untersucht, indem die Klärung der Refraktilteilchen-Suspensionen beobachtet wurde (d. h. die Abnahme der Trübheit in der Suspension), und durch Zentrifugieren der Proben sowie Durchführung einer Analyse des resultierenden Überstands und der Pelletfraktionen mit mittels Coomassieblau eingefärbtem PAGE-Gel bestätigt. Die Proteinkonzentration im Überstand (auch ein Indikator der Löslichkeit) wurde durch das Proteinassay-Set von BioRad (Richmond, CA, USA) gemessen. Der Überstand wurde auch durch Radioimmungssay (RIA) auf IGF-I untersucht. Refraktilkörper-Protein war weder mit Chaotrop alleine noch DTT alleine löslich; in Kombination war das Protein allerdings ausreichend solubilisiert. Siehe Tabelle 1. TABELLE 1 Solubilisierung mit minimalem Chaotrop und DTT in Tris-Puffer
* "-" bedeutet nicht löslich; "+ + + +" ist am besten löslich
** 5 Stunden lang neugefaltet; "* *" bedeutet 2 Stunden lang neugefaltet.
*** GuCl bedeutet Guanidinhydrochlorid.
Vollständige Solubilisierung wurde mit 2 M Harnstoff/4 mM DTT oder zumindest 4 M Harnstoff und zumindest 2 mM DTT erzielt. Man stellte fest, daß die RP-HPLC-Peakfläche, die der korrekten, authentischen Form von IGF-I entspricht, für den gesamten RIA-Titer verantwortlich ist; was nahelegt, daß, wenn löslicher IGF-I durch RIA erkannt werden kann, er eine korrekt gefaltete Konformation annimmt. Nur geringe Mengen an IGF-I waren durch RIA nachweisbar, sogar in vollständig solubilisierten Proteinproben; dies läßt vermuten, daß die Tertiärstruktur des unter diesen Bedingungen solubilisierten Proteins nicht die gleiche war wie jene von authentischem IGF-I.
Bei pH 7,5 oder weniger führt Tris-Puffer zu keiner signifikanten Ausbeute an korrekt gefaltetem IGF-I; korrekte Neufaltung erfolgt jedoch in Tris-Puffer bei einem pH-Wert von mehr als 8,0. Siehe Fig. 11A, wo verschiedene Puffer verglichen werden (eine ausführliche Beschreibung findet sich in Beispiel III, Abschnitt C).

BEISPIEL II

Test auf Löslichkeit von IGF-I in Acetatpuffer sowie Neufaltung und Auswirkungen der Inkubationstemperatur

A. Solubilisierung und Neufaltung von IGF-I in Natriumacetatpuffer

Zell-Lysate wurden wie oben im Zellernteschritt hergestellt. Refraktilkörper-Protein wurde in 100 mM Natriumacetat (NaOAc), pH 8,2, umfassend 100 mM NaCl, und in verschiedenen Konzentrationen von Harnstoff und DTT solubilisiert.
Zumindest 70% des Refraktilkörper-Proteins waren mit 2 M Harnstoff und DII bei 2 mM oder mehr löslich. Optimale Löslichkeit und IGF-I-Titer lagen bei 2 M Harnstoff, 2- 4 mM DTT vor. Siehe Tabelle 2. Wo DTT fehlte, waren sowohl die Löslichkeit als auch IGF-I-Titer nicht nennenswert. TABELLE 2 Auswirkungen von Harnstoff- und DTT-Konzentration bei pH 8,2
In Gegenwart von 1 oder 2 mM DTT und 2M Harnstoff zeigte die Schwankung der anfänglichen Zellkonzentration (zum Erhalt von Refraktilkörper-Protein) von 0,10 bis 4,00 ml-OD, daß die höheren untersuchten Konzentrationen nur dann für die Neufaltung günstiger waren, wenn 2 mM DTT verwendet wurden. Siehe Tabelle 3. Protein von 1-4 ml-OD aus Zellpellet war optimal. TABELLE 3 Auswirkungen der IGF-I-Konzentration auf die Neufaltung
In einer getrennten Bestimmung der Auswirkungen der IGF-I-Konzentration auf die Neufaltung (bei konstantem IGF-I/DTT) wurden die in Fig. 12 dargestellten Ergebnisse erzielt; es zeigte sich eine optimale IGF-I-Konzentration zur optimalen Ausbeute, die 1,5 bis 5 mg/ml (etwa 0,2 bis 0,7 mM) entsprach.

B. Änderung der Inkubationstemperatur

Refraktilkörper-Protein wurde wie oben erhalten und in Acetatpuffer solubilisiert, der 2 M Harnstoff und 2 mM DTT enthielt. Die Neufaltung erfolgte über 4 Stunden bei verschiedenen Temperaturen. Die Neufaltung bei 4ºC reduzierte RIA-Titer um 50% im Vergleich zu 23ºC oder 37ºC. Siehe Tabelle 4. TABELLE 4 Auswirkungen der Temperatur
In einem getrennten Versuch, wo das Falten in einem CAPSO-Puffer, pH 10,5, in Gegenwart von 20% Methanol stattfand, wurde die Menge an erhaltenem korrektem IGF-I zwischen 15ºC und 37ºC optimiert. Siehe Tabelle 5. TABELLE 5 Auswirkungen der Temperatur
* % Methionylsulfoxid im Vergleich zur Menge an korrektem IGF-I.

C. Änderung der Inkubationszeit

Wenn die Temperatur bei 23ºC gehalten und das Zeitintervall variiert wurde (pH 8,2; Zeitintervalle von 1/2, 1, 2, 3, 4, 5 und 24 Stunden), nahmen die RIA-Titer im Lauf der Zeit zu und erreichten bei etwa 5 Stunden ein Plateau. Siehe Fig. 13A.
Die Neufaltung erfolgte unter Verwendung von CAPSO-Puffer bei pH 10,5 mit und ohne Methanol. Die Daten zeigten, daß IGF-I-Titer (laut HPLC-Assay) im Lauf der Zeit zunahmen und ein Plateau erreichten. Siehe die Fig. 13B (kein Methanol) und 13C (mit Methanol).

D. HPLC-Profil von neugefaltetem Refraktilkörper-Protein

Neugefaltetes Protein (solubilisiert wie in obigem Abschnitt B bei 23ºC über einen Zeitraum von 4 Stunden) wurde mittels HPLC auf einer RP-Vydac C-18-Säule bei pH 2,0 untersucht. Zwei IGF-I-Hauptpeaks eluierten, wobei einer mit authentischem IGF-I und der andere mit einer fehlgefalteten Form in einem Verhältnis von 1,5/I bis 5/I co-migrierte. Refraktile Körper (solubilisiert in 2 M Harnstoff und 1-4 mM DTT) ergaben 25- 30% an korrekt gefaltetem IGF-I in Acetatpuffer, was aus den RIA-Titern ersichtlich war, die ein Maß für die Menge an vorhandenem authentischem IGF-I sind.

BEISPIEL III

Auswirkungen verschiedener Parameter auf die Neufaltung

A. Charakterisierung von neugefaltetem IGF-I

Zell-Lysate wurden wie oben mittels des Zellernteschritts hergestellt. Refraktilkörper- Protein aus einer 200 ml-OD Zellpaste wurde in 10 ml Puffer solubilisiert, umfassend 100 mM NaOAc, pH 8,2, 100 mM NaCl, 2 M Harnstoff und 2 mM DTT. Die Neufaltung von Refraktilkörper-Protein erfolgte über 4 Stunden bei 23ºC. Das Protein wurde mittels präparativer RP-HPLC bei pH 7,0 auf einer Waters-C4-Säule bei pH 7,0 bestimmt. Fraktionen, die mit authentischem IGF-I co-migrierten, wurden V-8-Protease- Spaltung und Massenspektrometrie-Analyse ausgesetzt.
RIA des neugefalteten Proteins zeigte einen IGF-I-Titer von 7,9 pg/ml OD. Das Proteinmuster der neugefalteten Probe wurde vor der Neufaltung unter Verwendung von mit Coomassieblau gefärbten 10-20% Tricin-Gelen mit jenem des Refraktilkörper-Proteins verglichen. Unter reduzierten Gelbedingungen war nur eine Bande sichtbar, die dem IGF-I-Monomer entsprach, das in der Nähe von 6,2 kD migrierte. Unter nichtreduzierten Gelbedingungen wurden Banden, die Monomer-, Dimer- und Oligomerformen entsprachen, für die neugefaltete, nicht jedoch für die nicht-neugefaltete Probe nachgewiesen. Unter nicht-reduzierten Gelbedingungen enthielt die nicht-neugefaltete Probe zahlreiche hochmolekulare Banden, allerdings keine Bande, die in der Nähe des 6,2 kD- Monomers migrierte.
Nach präparativer RP-HPLC der neugefalteten Probe wurden zwei IGF-I-Hauptpeaks erhalten. Eine co-migrierte mit authentischem IGF-I, der andere mit fehlgefaltetem IGF-I. Eine signifikante Proteinmenge wurde auch in einer Regenerat-Fraktion festgestellt und enthielt Aggregate von IGF-I. Wenn das Proteinmuster jedes dieser zwei Hauptpeak- Fraktionen auf reduzierten SDS-Tricin-Gelen sichtbar gemacht wurde, enthielt jedes nur eine Bande, die mit IGF-I co-migrierte. Die Verteilung von IGF-I, hervorgerufen durch die Intensität der gefärbten Banden, betrug etwa 35/25/40 an korrekt gefalteter : fehlgefalteter : regenerierter Form. In nicht-reduzierten Gelen erschienen mehr als 50% von IGF-I in der Regenerat-Fraktion als Dimere und Oligomere. Die Ergebnisse zeigen, daß korrekt gefalteter und fehlgefalteter IGF-I identische Mobilität in reduzierten und nichtreduzierten Gelen zeigt und daß ein Großteil von IGF-I in der Regenerat-Fraktion in einer disulfid-gebundenen oligomeren Form vorliegt.
Die aus der HPLC gewonnenen Fraktionen wurden auch durch RIA auf IGF-1 und durch Bioassay auf IGF-I-Aktivität untersucht. Der Bioassay mißt die Fähigkeit des IGF-I, die Aufnahme von tritiiertem Thymidin in dosisabhängiger Weise in die DNA von BALB/c 3T3-Fibroblasten zu steigern, die mit einigen Modifikationen gemäß dem Verfahren von Tamura et al., J. Biol. Chem. 262, 5616-5621 (1989), erfolgt. Hohe IGF-I-RIA-Titer wur den nur in jener Fraktion festgestellt, die mit korrekt gefaltetem IGF-I co-migriert. IGF-I- Aktivität war ebenfalls nur in dieser Fraktion hoch. Siehe Tabelle 6. TABELLE 6 IGF-Titer verschiedener Fraktionen aus HPLC
* ND = nicht nachweisbar
Um die Disulfidbindung zu charakterisieren und die Aminosäuresequenz von neugefaltetem Protein zu überprüfen, wurden die HPLC-Fraktionen 46-51, die mit authentischem IGF-I co-migrierten, V-8-Protease-Spaltung unterzogen und dann mittels HPLC analysiert. Das Profil ist fast identisch zu jenem von authentischem IGF-I. Verschiedene kleine Peaks von Varianten, die durch Massenspektroskopie weiter analysiert wurden, wurden als unvollständige Spaltprodukte von IGF-I-Fragmenten identifiziert. Diese Ergebnisse zeigen, daß das mit korrekt neugefaltetem Material co-migrierende neugefaltete Protein korrekte Disulfidbindungen und korrekte terminale Sequenzen enthielt. Das mit fehlgefaltetem Protein co-migrierende neugefaltete Protein wurde in ähnlicher Weise analysiert. Die Ergebnisse veranschaulichen, daß zwei der drei Disulfidbindungen inkorrekt gebildet waren.

B. Auswirkungen des pH-Werts auf die Neufaltung

Refraktilkörper-Protein aus 4 ml-OD-Zellpellet wurde in 100 ul NaOAc-Puffer in einem pH-Bereich von 4,1-8,2 suspendiert, umfassend 100 mM CaCl, 2 M Harnstoff und 2 mM DTT. Die Solubilisierung und Neufaltung wurden 5 Stunden lang bei 23ºC fortgesetzt. Siehe Tabelle 7. TABELLE 7 Auswirkungen des pH-Werts auf die Neufaltung
Trübheitsmessungen zeigten, daß das Protein unter pH 6,0 vollständig unlöslich und bei pH 8,2 fast gänzlich löslich war. Dies wurde durch Messung von löslichem Protein und PAGE bestätigt. Aus RIA auf IGF-I ging hervor, daß korrekte Neufaltung in signifikanter Menge bei pH 8,2, jedoch nicht bei den tieferen untersuchten pH-Werten erfolgte.

C. Auswirkungen von Puffer und pH-Wert auf die Neufaltung

Verschiedene Puffer wurden in einem pH-Bereich innerhalb des wirksamen Bereichs jedes Puffers untersucht. Diese Puffer und ihre pKa-Werte sind: Glycylglycin, pKa 8,4, Taps, pKa 8,4, Tris, pKa 8,3, Bicin, pKa 8,3, Tricin, pKa 8,1; Hepes, pKa 7,5, Ampso, pKa 9,0, Ches, pKa 9,3, Capso, pKa 9,6, Amp, pKa 9,7, Caps, pKa 10,4. Alle Puffer ent hielten 100 mM NaCl, 2 M Harnstoff und 2 mM DTT. Refraktilkörper-Protein aus 4 ml- OD-Zellpellets wurde in 100 ul jedes Puffers suspendiert. Neufaltung erfolgte über 5 Stunden bei 23ºC.
Trübheitsdaten, Messungen von löslichem Protein und PAGE zeigten, daß unter Puffern mit leicht basischem pKa (pKa 7,5-8,4) die Löslichleit von IGF-I mit steigendem pH- Wert zunahm. Bei pH 9 und darüber war fast der ganze IGF-I solubilisiert. Für Tris-, Taps-, Bicin- und Glycylglycin-Puffer nahm korrekte Neufaltung (mittels RIA auf IGF-I gemessen) signifikant zu, als der pH-Wert von etwa 7,5 auf 9,5 stieg. Siehe Fig. 11 A.
Von den Puffern mit sehr basischem pKa (pKa 9,0) war IGF-I innerhalb des brauchbaren pH-Bereichs dieser Puffer (pH 8,5-11) fast vollständig löslich. RIA auf IGF-I ergab im gesamten untersuchten pH-Bereich hohe Titer in allen diesen Puffern. Siehe Fig. 11 B. Die Fig. 13A-C zeigen einen typischen zeitlichen Verlauf für diese Reaktionen.

BEISPIEL IV

Neufaltung von durch verschiedene E. coli-Wirte produziertem IGF-I

Drei Periplasma- und Membran-Protease-defiziente E. coli-Wirte mit den Bezeichnungen 27A7, 27B4 und 27C7, die das IGF-I-Sekretionsplasmid pLS32Tsc (oben beschrieben) tragen, wurden als Quelle für Refraktilkörper-Protein verwendet. Die Konstruktion der Stämme 27A7 und 27C7 wird in Beispiel 1 beschrieben. Stamm 27B4, der den vollständigen Genotyp W3110 tonAΔptr3phoAΔE15 Δ(argF-Iac)169degP41 besitzt, wurde durch Transduzieren der periplasmatischen degP41-Protease-Mutation [Strauch et al., s. o.] in Stamm 27A7 hergestellt. Diese Mutation wurde in vitro konstruiert, indem ein Abschnitt des degP-Gens durch das Kanamycin-Gen ersetzt wurde, um die Selektion der Deletion unter Nutzung von Kanamycin-Resistenz zu ermöglichen.
Refraktilkörper-Protein wurde von jedem dieser drei Wirtsstämme wie oben aus 0,2 g Zellpaste in einem 5 ml-Volumen isoliert. Refraktilkörper-Protein aus einem 4 ml-OD- Zellpellet wurde in 100 pI Puffer suspendiert, der 100 mM CAPSO, pH 10,5, 100 mM NaCl, 2 M Harnstoff und 1-4 mM DTT umfaßte. Die Neufaltung erfolgte über S Stunden bei 23ºC.
Während der Isolierung des Refraktilkörper-Proteins wurden zur Identifizierung der Proteinverteilung Proben aus den verschiedenen Wirten gezogen. Die Proteinmuster wurden auf mit Coomassieblau gefärbten reduzierten SDS-Gelen sichtbar gemacht. Für gesamte Zell-Lysate waren für den Stamm 27A7 sowie für die Stämme 27B4 und 27C7 5% bzw. 10% des Gesamtproteins IGF-I. Überstandfraktionen von Zell-Lysaten zeigten ähnliche Proteinmuster wie Zell-Lysate, jedoch mit einer sehr schwachen IGF-I-Bande. Pelletfraktionen (Refraktilkörper) zeigte fast ausschließlich IGF-I-Banden.
IGF-I-Neufaltung wurde durch RIA gemessen. Nur die Pelletfraktionen, die eine IGF-I- Bande aufwiesen, zeigten im RIA einen nennenswerten IGF-I-Titer. Die IGF-I-Titer waren in den Fraktionen mit den dunkelsten IGF-I-Banden am höchsten, was die höheren IGF-I-Konzentrationen in diesen Fraktionen bestätigte. Die verschiedenen E. coli-Wirte und Expressionswerte übten keinen Einfluß auf die Extraktionsfähigkeit, Reinheit oder Neufaltung der Refraktilkörper-Proteine aus. Refraktilkörper-Proteine aus allen Stämmen wurden mit ähnlichen relativen Ausbeuten neugefaltet, was durch die Beobachtung festgestellt wurde, daß IGF-I-Titer gut mit der Intensität der IGF-I-Bande auf den SDS-Gelen korrelierten.

BEISPIEL V

Messung von Gesamt-IGF-I (korrekt und fehlgefaltet) aus Wirtszellen

Dreifach protease-defiziente E. coli-Zellen wie in Beispiel 1 (27C7) wurden in 50 mM Tris-Puffer, pH 8,0, 6 M Harnstoff, 5 mM EDTA, 10 mM DTT, extrahiert. Nach der Zentrifugation wurde die Überstandfraktion über zwei PLRP-S-Säulen (Polymer Labs Reverse Phase-S) mit einem linearen Gadienten von 32-45% Acetonitril, kombiniert mit Stufengradienten, eluiert. Der IGF-I eluierte in einem Peak, der von jenen von E. coli- Proteinen deutlich getrennt war. Die Mengen von zellassoziiertem und Refraktilkörper- IGF-I wurden anhand der Peakdaten errechnet und betrugen 4,5 g/l, bzw. 3,8 g/l,. Dies zeigte, daß die Gewinnung von IGF-I im Refraktilkörper-Proteinpräparat 85% betrug.
Zellassoziierter IGF-I wird für eine 10 I-Fermentation bei 100 OD berechnet und beträgt 4,7 g/l. Die IGF-I-Konzentration beträgt etwa 1,5 mg/ml in Refraktilkörper-Protein aus einem 4 OD-ml E. coli-Zellpellet in 100111 Neufaltungspuffer.

BEISPIEL VI

Auswirkungen von hydrophoben Mitteln auf die IGF-I-Neufaltung

Refraktilkörper-Protein aus einem 4 OD-ml E. coli-Stamm 27C7-Zellpellet wurde in 100 ul IGF-I-Neufaltungspuffer neugefaltet, der aus 100 mM CAPSO, pH 10,5, 100 mM NACl, 2 M Harnstoff, 2 mM DTT und. entweder 2Q% Ethanol oder 20% Methanol als hydrophobes Mittel bestand. Siehe Tabelle 8. TABELLE 8 Auswirkungen von hydrophoben Mitteln auf die IGF-I-Neufaltung
* Durch das organische Lösungsmittel Methanol oder Ethanol verstärkt.
Die Neufaltung erfolgte über 5 Stunden bei 23ºC. Die Zugabe von Metahnol oder Ethanol steigerte das Verhältnis von korrekt gefaltetem zu fehlgefaltetem IGF-I und die Gesamtausbeute (korrekt + fehlgefaltet), gemessen durch Peakanalyse nach HPLC mit einer Cydac C-18-Säule. Das Verhältnis zwischen korrekt und fehlgefaltet betrug etwa 4,1-4, 4 und 2,4-2,7 für Proben mit bzw. ohne Methanol. Die Verhältnisse mehrerer kleiner IGF-I-Peaks mit höherer Hydrophobie änderten sich auch im Puffer höherer Hydrophobie. Ferner stellte man fest, daß mit dem Anstieg des Methanol-Prozentsatzes von 0 auf 20% das Verhältnis zwischen korrekt und fehlgefaltet zunahm.

BEISPIEL VII

Vergleich von β-Mercaptoethanol (BME) und DTT als Reduktionsmittel

Refraktilkörper-Protein aus einem 4 OD-ml E. coli-Zellpellet (beschrieben in Beispiel 1) wurde in 100 ul IGF-I-Neufaltungspuffer, umfassend 100 mM CAPSO, pH 10,5, 100 mM NaCl, 2 M Harnstoff und verschiedenen Konzentrationen von BME oder DTT, neugefaltet. Die Neufaltung erfolgte über 5 Stunden bei 23ºC. Das Verhältnis von korrektem und fehlgefaltetem Konformer und die Ausbeute wurden durch HPLS des solubilisierten Proteins über eine Vydac C-18-Säule analysiert. Siehe Tabelle 9. Die Ausbeute an gesamtem IGF-I (sowohl korrekt als auch fehlgefaltet) nahm mit DME als Reduktionsmittel im Vergleich zu DTT als Reduktionsmittel bei allen Konzentrationen ab. Das Verhältnis von korrektem und fehlgefaltetem Konformer war allerdings bei beiden Reagentien ähnlich. TABELLE 9 Auswirkungen von BME und DTT auf die IGF-I-Neufaltung

BEISPIEL VIII

Vergleich von BME und DTT als Reduktionsmittel in Gegenwart von Methanol

Refraktilkörper-Protein aus einem 4 OD-ml E. coli-Zellpellet (beschrieben in Beispiel 1) wurde in 100 ul IGF-I-Neufaltungspuffer, umfassend 100 mM CAPSO, pH 10,5, 100 mM NaCl, 2 M Harnstoff, 20% Methanol und verschiedene Konzentrationen von BME und DTT als Reduktionsmittel, neugefaltet. Die Neufaltung erfolgte über 5 Stunden bei 23ºC. Das neugefaltete Protein wurde unter Verwendung einer Vydac C-18-HPLC-Säule analysiert, um korrekte und fehlgefaltete Formen voneinander zu trennen. Bei 1 mM, 2 mM oder 4 mM DTT zeigte die HPLC der neugefalteten Probe ein Verhältnis zwischen korrektem und neugefaltetem IGF-I von etwa 4 : 1. Die Gesamtausbeute (korrekt + fehlgefaltet) bliebt ungeachtet der DTT-Konzentration etwa konstant. Siehe Fig. 14A.
BME konnte die Neufaltung sogar bei einer niedrigen Konzentration wie 0,2 mM wirkungsvoll unterstützen. Bei Konzentrationen über 0,8 mM BME war IGF-I vollständig löslich. Drei mittels HPLC eluierte Peaks wurden als korrekte, fehlgefaltete und Methionylsulfoxid-Konformere identifiziert, wobei die maximale Ausbeute an IGF-I bei 1-2 mM BME auftrat. Die Ausbeute ist etwas niedriger (13%) als die maximale Ausbeute mit DTT. Das Verhältnis zwischen korrekt und fehlgefaltet betrug bei geringer BME-Konzentration (0,2 mM) etwa 3 : 1 und stieg auf etwa 4,2 : 1, wenn die BME-Konzentration auf 2 mM stieg. Werte der Methioninsulfoxid-Varianten nahmen jedoch auch mit steigender BME-Konzentration zu. Siehe Fig. 14B.

BEISPIEL IX

Auswirkungen des Variierens der IGF-I- und DTT-Konzentrationen

Refraktilkörper-Protein aus einer 4 OD-ml E. coli-Zellpaste (beschrieben in Beispiel 1) wurde in 100 ul IGF-I-Neufaltungspuffer, umfassend 100 mM CAPSO, pH 10,5, 100 mM NaCl, 2 M Harnstoff, 20% Methanol und verschiedene DTT-Konzentrationen, neugefaltet. Die Neufaltung erfolgte über 5 Stunden bei 23ºC. Das lösliche neugefaltete Protein wurde mittels einer Vydac C-18-HPLC-Säule analysiert, um korrekte und neugefaltete Formen voneinander zu trennen. Unlösliches Protein wurde in 100 ul Lösung, umfassend 6 M Harnstoff, 50 mM Tris, pH 8,0, 5 mM EDTA und 10 mM DTT, solubilisiert und unter Verwendung zweier in Serie geschalteter PLRP-S-Säulen analysiert. Solubilisiertes Protein im Neufaltungspuffer wurde als Differenz zwischen Gesamt- IGF-I-Protein im Neufaltungspuffer und IGF-I im Pellet bestimmt (errechnet anhand der PLRP-S-Analyse). Der Gesamt-IGF-I aus Refraktilkörper-Teilchen aus 4 ml-OD-Zellpaste beträgt etwa 1,5 mg/ml.
Die Auswirkungen variierender Konzentrationen von DTT und IGF-I-Refraktilkörper- (RB-)Protein sind in Tabelle 10 und den Fig. 15A, 15B, 15C und 15D veranschaulicht, wobei Fig. 15A nur korrekten IGF-I-Titer entweder für eine einzelne DTT-Konzentration oder ein konstantes IGF-I/DTT-Verhältnis von 0,11 zeigt. Die anderen Figuren veranschaulichen IGF-I-Titer und Verhältnisse von korrektem und fehlgefaltetem IGF-I entweder bei konstantem IGF-I/DTT-Verhältnis (Fig. 15B) oder konstanter DTT-Konzentration (1 mM für Fig. 15D und 2 mM für Fig. 15C). TABELLE 10 Auswirkungen der Refraktilkörper-Teilchenkonzentration auf die IGF-I-Neufaltung
Sowohl das Verhältnis zwischen richtig gefaltetem und fehlgefaltetem IGF-I als auch die Ausbeute an richtig gefaltetem IGF-I nahm zum, wenn die lösliche Konzentration auf etwa 0,2 mM stieg. Weitere Zunahmen auf 0,7 mM (5,3 mg/ml) IGF-I führten weder hinsichtlich der Ausbeute noch des Verhältnisses zwischen richtig gefaltet und fehlgefaltet zu einer signifikanten Abnahme. Die beste Ausbeute und das beste Verhältnis wurden bei einem IGF-I/DTT-Verhältnis von 0,11-0,22 erzielt.

BEISPIEL X

Auswirkungen von konzentriertem und verdünntem Harnstoff auf die Faltung

Refraktilkörper-IGF-I-Protein aus einer 4 OD-ml E. coli-Zellpaste (in Beispiel 1 beschrieben) wurde 4 oder 24 Stunden lang mit verschiedenen Harnstoffkonzentrationen behandelt. Das Protein/DTT-Verhältnis wurde bei 0,11 gehalten, 20% Methanol zugegeben und die anfängliche Proteinkonzentration gesteigert, um proportional zur anfänglichen Harnstoffkonzentration zu sein. 4-Stunden-Proben wurden mit IGF-I-Neufaltungspuffer, wie in Beispiel IX beschrieben (mit Ausnahme des Weglassens von Harnstoff und DTT), auf eine Harnstoff-Endkonzentration von 2 M verdünnt. Dann wurden sie weitere 5 Stunden lang inkubiert, bevor IGF-I-Werte gemessen wurden. IGF-I-Titer wurden auch an den 24-Stunden-Proben gemessen, die ohne Harnstoffverdünnung inkubiert wurden. Die in Fig. 16 gezeigten Ergebnisse veranschaulichen, daß die Neufaltungsausbeute bei den mit 4 M oder 6 M Harnstoff 4 Stunden lang behandelten und dann verdünnten Proben und auch bei den in 4 M oder 6 M Harnstoff 24 Stunden lang neugefalteten Proben geringer war als jene, die mit einer anfänglichen Harnstoffkonzentration von 2 M erzielt wird. Sowohl bei verdünnten als auch unverdünnten Inkubationen nahm die Neufaltungsausbeute mit steigender Harnstoffkonzentration ab.
Zusammenfassend zeigen die Ergebnisse, daß unlöslicher, fehlgefalteter, aus prokaryotischen Zellen gewonnener IGF-I in einem einzigen Puffer, der Chaotrop und Reduktionsmittel enthält, gleichzeitig solubilisiert und zur korrekten Konformation umgefaltet werden kann. Um dies zu erreichen, werden das Chaotrop und die Reduktionsmittel bei ihren minimalen Konzentrationen gehalten, die den IGF-I in großen Mengen solubilisieren. Die Ausbeute an korrekt gefaltetem IGF-I verbesserte sich mit der Zugabe von hydrophobem Mittel zur gepufferten Lösung. Optimale Solubilisierung und Neufaltung werden mit alkalischem Puffer in einem pH-Bereich von 7,5-10,5 mit etwa 2 M Harnstoff und etwa 2-4 mM DTT oder 1-2 mM BME erzielt.

Hinterlegung der Materialien

Die folgende Kultur wurde bei der American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD, USA, hinterlegt (ATCC):
Die Hinterlegung erfolgte gemäß dem Budapester Abkommen über die Internationale Anerkennung der Hinterlegung von Mikroorganismen zum Zwecke des Patentverfahrens (Budapester Abkommen) und den darunter fallenden Bestimmungen. Dies stellt die Aufbewahrung einer lebensfähigen Kultur über einen Zeitraum von 30 Jahren ab dem Hinterlegungsdatum sicher. Der Organismus wird durch die ATCC gemäß den Bestimmungen des Budapester Abkommens und in Übereinstimmung mit einer Vereinbarung zwischen Genentech, Inc. und ATCC bereitgestellt, was der Öffentlichkeit eine dauerhafte und uneingeschränkte Verfügbarkeit der Nachkommenschaft der Kultur ab Erteilung der einschlägigen US-Patentschrift oder ab Offenlegung einer beliebigen US-amerikanischen oder ausländischen Patentanmeldung (je nachdem, welches der beiden Ereignisse zuerst eintritt) garantiert sowie gewährleistet, daß die Nachkommenschaft einer Person zur Verfügung gestellt wird, die laut Anordnung des U. S. Commissioner of Patents and Trademarks gemäß 35 USC § 122 und den damit in Einklang stehenden Vorschriften des Commissioners (einschließlich 37 CFR § 1.14 unter besonderer Bezugnahme auf 886 OG 638) dazu berechtigt ist.
Der Zessionar der vorliegenden Anmeldung stimmte zu, daß die hinterlegte Kultur, falls sie beim Kultivieren unter zweckmäßigen Bedingungen sterben, verloren gehen oder zerstört werden sollte, unmittelbar nach einer entsprechenden Benachrichtigung durch ein lebensfähiges Exemplar der gleichen Kultur ersetzt wird. Die Verfügbarkeit des hinterlegten Stamms darf nicht als Erlaubnis ausgelegt werden, die Erfindung entgegen den Rechten durchzuführen, die durch eine beliebige Regierung in Übereinstimmung mit ihren Patentgesetzen gewährt werden.
Man geht davon aus, daß die obige Beschreibung ausreicht, die Durchführung der Erfindung durch Fachleute auf dem Gebiet zu ermöglichen. Die vorliegende Erfindung wird hinsichtlich ihres Schutzbereichs durch das hinterlegte Konstrukt nicht eingeschränkt, da die hinterlegte Ausführungsform als eine Veranschaulichung bestimmter Aspekte der Erfindung angesehen wird und alle Konstrukte, die funktionell gleichwertig sind, in den Schutzbereich der Erfindung fallen. Die Hinterlegung des vorliegenden Materials stellt kein Eingeständnis dar, daß die hierin enthaltene schriftliche Beschreibung unzulänglich ist, die praktische Umsetzung eines beliebigen Aspekts der Erfindung einschließlich ihrer besten Durchführungsart zu ermöglichen, und darf nicht solcherart interpretiert werden, daß der Schutzbereich der Patentansprüche auf ihre konkrete Darstellung beschränkt ist. Es ist für Fachleute auf dem Gebiet aufgrund der obigen Beschreibung offenkundig, daß die geoffenbarten Ausführungsformen zahlreichen Modifikationen zusätzlich zu den dargestellten unterzogen werden können, wobei diese Modifikationen im Schutzbereich der Erfindung enthalten sind.
Hinsichtlich der Bestimmungsländer, für die ein europäisches Patent angestrebt wird, wird eine Probe des hinterlegten Mikroorganismus bis die Veröffentlichung des Hinweises auf Erteilung des europäischen Patents oder bis zu dem Datum, an dem die Anmeldung zurückgewiesen oder zurückgezogen wird oder als zurückgezogen gilt, nur durch Aushändigung einer solchen Probe an einen Experten, der von der die Probe anfordernden Person bestellt wird, zur Verfügung gestellt (Regel 28(4) EPÜ).

SEQUENZAUFLISTUNG

(1) ALLGEMEINE INFORMATIONEN:

(i) ANMELDER: GENENTECH, INC.
(ii) TITEL DER ERFINDUNG: Verfahren zur Neufaltung von IGF-I in eine aktive Konformation
(iii) ANZAHL DER SEQUENZEN: 11
(iv) KORRESPONDENZADRESSE:
(A) ADDRESSAT: Genentech, Inc.
(B) STRASSE: 460 Point San Bruno Blvd
(C) STADT: South San Francisco
(D) BUNDESSTAAT: Kalifornien
(E) LAND: USA
(F) POSTLEITZAHL: 94080-4990
(v) COMPUTERLESBARE FORM:
(A) ART DES MEDIUMS: 5,25 Zoll, 360 Kb Diskette
(B) COMPUTER: IBM PC-kompatibel
(C) BETRIEBSSYSTEM: PC-DOS/MS-DOS
(D) SOFTWARE: Patin (Genentech)
(vi) AKTUELLE ANMELDUNGSDATEN:
(A) ANMELDUNGSNUMMER:
(B) EINREICH DATUM: 3. Dezember 1992
(C) KLASSIFIZIERUNG:
(vii) FRÜHERE ANMELDUNGSDATEN:
(A) ANMELDUNGSNUMMER:
(B) EINREICHDATUM:
(viii) INFORMATIONEN ÜBER ANWALT/VERTRETER:
(A) NAME: Hasak, Janet E.
(B) REGISTRIERUNGSNUMMER: 28.616
(C) KENNZAHL/ZEICHEN: 729
(ix) TELEKOMMUNIKATIONSANGABEN:
(A) TELEFON: 415/225-1896
(B) TELEFAX: 415/952-9881
(C) TELEX: 910/371-7168

(2) INFORMATIONEN ZU SEQ ID NR. 1:

(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 55 Basen
(B) TYP: Nukleinsäure
(C) STRANGBESCHAFFENHEIT: einfach
(D) TOPOLOGIE: linear
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR. 1:
GGTCCCGAAA CTCTGTGCGG TGCTGAACTG GTTGACGCTC TGCAGTTTGT 50
TTGCG 55

(2) INFORMATIONEN ZU SEQ ID NR. 2:

(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 64 Basen
(B) TYP: Nukleinsäure
(C) STRANGBESCHAFFENHEIT: einfach
(D) TOPOLOGIE: linear
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR. 2:
GTCACCGCAA ACAAACTGCA GAGCGTCAAC CAGTTCAGCA CCGCACAGAG 50
TTTCGGGACC TGCA 64

(2) INFORMATIONEN ZU SEQ ID NR. 3:

(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 84 Basen
(B) TYP: Nukleinsäure
(C) STRANGBESCHAFFENHEIT: einfach
(D) TOPOLOGIE: linear
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR. 3:
CTAGAATTAT GATGATTACT CTGCGCAAAC TTCCTCTGGC GGTTGCCGTC 50
GCAGCGGGCG TAATGTCTGC TCAGGCCATG GCCA 84

(2) INFORMATIONEN ZU SEQ ID NR. 4:

(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 84 Basen
(B) TYP: Nukleinsäure
(C) STRANGBESCHAFFENHEIT: einfach
(D) TOPOLOGIE: linear
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR.4:
GATCTGGCCA TGGCCTGAGC AGACATTACG CCCGCTGCGA CGGCAACCGC 50
CAGAGGAAGT TTGCGCAGAG TAATCATCAT AATT 84

(2) INFORMATIONEN ZU SEQ ID NR. 5.

(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 59 Basen
(B) TYP: Nukleinsäure
(C) STRANGBESCHAFFENHEIT: einfach
(D) TOPOLOGIE: linear
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR. 5.
GGCCGGTCCC GAAACTCTGT GCGGTGCTGA ACTGGTTGAC GCTCTGCAGT 50
TTGTTTGCG 59

(2) INFORMATIONEN ZU SEQ ID NR. 6:

(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 60 Basen
(B) TYP: Nukleinsäure
(C) STRANGBESCHAFFENHEIT: einfach
(D) TOPOLOGIE: linear
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR. 6:
GTCACCGCAA ACAAACTGCA GAGCGTCAAC CAGTTCAGCA CCGCACAGAG 50
TTTCGGGACC 60

(2) INFORMATIONEN ZU SEQ ID NR. 7:

(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 50 Basen
(B) TYP: Nukleinsäure
(C) STRANGBESCHAFFENHEIT: einfach
(D) TOPOLOGIE: linear
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR. 7:
GGCCACTCTG TGCGGTGCTG AACTGGTTGA CGCTCTGCAG TTTGTTTGCG 50

(2) INFORMATIONEN ZU SEQ ID NR. 8:

(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 51 Basen
(B) TYP: Nukleinsäure
(C) STRANGBESCHAFFENHEIT: einfach
(D) TOPOLOGIE: linear
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR. 8:
GTCACCGCAA ACAAACTGCA GAGCGTCAAC CAGTTCAGCA CCGCACAGAG 50
T 51

(2) INFORMATIONEN ZU SEQ ID NR. 9:

(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 39 Basen
(B) TYP: Nukleinsäure
(C) STRANGBESCHAFFENHEIT: einfach
(D) TOPOLOGIE: linear
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR. 9:
CCTAACGCTC GGTTGCCGCC GGGCGTTTTT TATTGTTAA 39

(2) INFORMATIONEN ZU SEQ ID NR. 10:

(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 39 Basen
(B) TYP: Nukleinsäure
(C) STRANGBESCHAFFENHEIT: einfach
(D) TOPOLOGIE: linear
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR. 10:
TTAACAATAA AAAACGCCCG GCGGCAACCG AGCGTTAGG 39

(2) INFORMATIONEN ZU SEQ ID NR. 11:

(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 757 Basen
(B) TYP: Nukleinsäure
(C) STRANGBESCHAFFENHEIT: einfach
(D) TOPOLOGIE: linear
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR. 11:
GAATTCAACT TCTCCATACT TTGGATAAGG AAATACAGAC ATGAAAAATC 50
TCATTGCTGA GTTGTTATTT AAGCTTGCCC AAAAAGAAGA AGAGTCGAAT 100
GAACTGTGTG CGCAGGTAGA AGCTTTGGAG ATTATCGTCA CTGCAATGCT 150
TCGCAATATG GCGCAAAATG ACCAACAGCG GTTGATTGAT CAGGTAGAGG 200
GGGCGCTGTA CGAGGTAAAG CCCGATGCCA GCATCCCTGA CGACGATACG 250
GAGCTGCTGC GCGATTACGT AAAGAAGTTA TTGAAGCATC CTCGTCAGTA 300
AAAAGTTAAT CTTTTCAACA GCTGTCATAA AGTTGTCACG GCCGAGACTT 350
ATAGTCGCTT TGTTTTTATT TTTTAATGTA TTTGTAACTA GTACGCAAGT 400
TCACGTAAAA AGGGTATCTA GAATT ATG ATG ATT ACT CTG CGC 443
TAGAAGCTCC TAACGCTCGG TTGCCGCCGG GCGTTTTTTA TTGTTAA 757

Claims

1. Verfahren zum Reaktivieren von unlöslichem, fehlgefaltetem IGF-I, der in prokaryotischen Wirtszellen enthalten ist, welches Verfahren umfaßt:

(a) das Isolieren des IGF-I; und

(b) das Inkubieren des isolierten IGF-I in gepufferter alkalischer Lösung, die nicht mehr als 3 M Chaotrop und die zur Solubilisierung ausreichende Minimalkonzentration an Reduktionsmittel umfaßt, unter Bedingungen einer IGF-I-Konzentration und Inkubationstemperatur und -zeit, aufgrund derer sowohl Solubilisierung, Entfaltung als auch Neufaltung des IGF-I während der Inkubation erfolgen.

2. Verfahren nach Anspruch 1, worin der IGF-I aus dem Periplasma der Wirtszellen isoliert wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1, worin die Konzentration an IGF-I etwa 0,05 bis 5,5 mg IGF-I pro ml beträgt.

4. Verfahren nach Anspruch 1, worin die gepufferte Lösung einen pH-Wert von zumindest etwa 7,5 aufweist.

5. Verfahren nach Anspruch 1, worin die gepufferte Lösung einen pH-Wert von etwa 7,5 bis 10,5 aufweist.

6. Verfahren nach Anspruch 5, worin die gepufferte Lösung Capso-Puffer, d. h. 3- (Cyclohexylamino)-2-hydroxy-1-propansulfonsäure-Puffer, mit etwa pH 8,5 bis 10,5 umfaßt.

7. Verfahren nach Anspruch 1, worin der Inkubationsschritt bei etwa 10 bis 40ºC für zumindest etwa 1 h durchgeführt wird.

8. Verfahren nach Anspruch 1, worin der Inkubationsschritt bei etwa 15 bis 37ºC für zumindest etwa 1 h ausgeführt wird.

9. Verfahren nach Anspruch 1, worin das Chaotrop Harnstoff in 1 bis 3 M oder Guanidinhydrochlorid in etwa 1 M ist.

10. Verfahren nach Anspruch 1, worin das Reduktionsmittel Dithiotreitol in etwa 1 bis 8 mM, β-Mercaptoethanol in etwa 0,2 bis 2 mM oder Cystein ist.

11. Verfahren nach Anspruch 1, worin das Chaotrop Harnstoff in etwa 1, 5 bis 2, 5 M ist und das Reduktionsmittel Dithiothreitol in etwa 2 bis 4 mM oder β-Mercaptoethanol in etwa 1 bis 2 mM ist.

12. Verfahren nach Anspruch 2, worin die gepufferte Lösung zusätzlich ein hydrophobes Mittel umfaßt.

13. Verfahren nach Anspruch 12, worin das hydrophobe Mittel Methanol oder Ethanol ist.

14. Verfahren nach Anspruch 1, worin Schritt (a) durch Behandeln der Wirtszellenkultur mit einer gepufferten Lösung, deren Ionenstärke ausreicht, um die Wirts- Polypeptide, nicht aber das unlösliche fehlgefaltete IGF-I im wesentlichen zu solubilisieren, wodurch die Zellen aufgebrochen werden, um eine lösliche Fraktion und eine den unlöslichen, fehlgefalteten IGF-I enthaltende Fraktion zu bilden, Zentrifugieren der aufgebrochenen Zellen und Sammeln des die Fraktion an unlöslichem, fehlgefaltetem IGF-I enthaltenden Pellets erfolgt.

15. Verfahren nach Anspruch 14, worin die Zellen durch Suspension in der gepufferten Lösung mit einem pH von etwa 5 bis 9 und einer Ionenstärke von etwa 0,01 bis 2 M behandelt werden.

16. Verfahren nach Anspruch 15, worin die gepufferte Lösung, in der die Zellen suspendiert werden, einen pH von etwa 6 bis 8 und eine Ionenstärke von 0,1 bis 0,2 M aufweist.

17. Verfahren nach Anspruch 1, worin die Wirtszellen Bakterienzellen sind.

18. Verfahren nach Anspruch 17, worin die Bakterienzellen E. coli-Zellen sind.

19. Verfahren nach Anspruch 18, worin die E. coli-Zellen eine Endogenproteasendefizienz aufweisen.

20. Verfahren nach Anspruch 19, worin die E. coli-Zellen den vollständigen Genotyp von E. coli 27C7 aufweisen, der als ATCC 55.244 hinterlegt ist.