DK171417B1 - Aprotininalaloger med Ala eller Gly i position 17 og fremgangsmåde til fremstilling deraf - Google Patents

Description

DK 171417 B1

Den foreliggende opfindelse angår hidtil ukendte aprotininanaloger og en fremgangsmåde til fremstilling deraf.

I den foreliggende beskrivelse betegner udtrykket naturligt forekommende aminosyre (eller aminosyrerest) en af de 5 aminosyrer, som er opregnet nedenfor sammen med symbolerne, der anvendes til at betegne de individuelle aminosyrerester:

Asp Asparaginsyre Ile Isoleucin

Ttyr Threonin Leu Leucin

Ser Serin Tyr Tyrosin 10 Glu Glutaminsyre Phe Phenylalanin

Pro Prolin His Histidin

Gly Glycin Lys Lysin

Ala Alanin Arg Arginin

Cys Cystein Trp Tryptophan 15 Val Valin Gin Glutamin

Met Methionin Asn Asparagin

Alle aminosyrer (eller aminosyrerester) omtalt i den foreliggende beskrivelse har L-konfiguration, undtagen glycin, som ikke har et chiralt center.

20 Aprotinin (bovin pancreastrypsininhibitor, BPTI) er et polypeptid, som findes i adskillige bovine organer og væv, såsom lymfeknuder, pancreas, lunge, ørespytkirtel, milt og lever. Det er et enkeltkædet polypeptid bestående af 58 aminosyrerester tværbundet med tre disulfidbroer i den følgende 25 sekvens:

Arg-Pro-Asp-Phe-Cys-Leu-Glu-Pro-Pro-Tyr-Thr-Gly-Pro-Cys-1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

Lys-Ala-Arg-Ile-Ile-Arg-Tyr-Phe-Tyr-Asn-Ala-Lys-Ala-Gly-15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 30 Leu-Cys-Gln-Thr-Phe-Val-Tyr-Gly-Gly-Cys-Arg-Ala-Lys-Arg-29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42

Asn-Asn-Phe-Lys-Ser-Ala-Glu-Asp-Cys-Met-Arg-Thr-Cys-Gly-43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56

Gly-Ala 35 57 58

De tre disulf idbroer er beliggende mellem henholdsvis Cys(5)-Cys(55), Cys(14)-Cys(38) og Cys(30)-Cys(51).

DK 171417 Bl 2

Aprotinin inhiberer forskellige serinproteaser, såsom trypsin, chymotrypsin, plasmin og kallikrein, og det anvendes i behandlingen af akut pancreatitis, forskellige choktilstande, hyperfibrinolytisk hæmorrhagi og hjerteinfarkt. Indgift af 5 aprotinin i høje doser nedsætter blodtabet i forbindelse med hjertekirurgi væsentligt.

Aprotinin ekstraheres fra forskellige bovine organer eller væv, såsom lunge, bugspytkirtel og ørespytkirtel. Ekstraktion fra dyrevæv er en vanskelig proces og kræver store 10 mængder bovine organer eller væv. Aprotinin kan også fremstilles ved hjælp af rekombinant DNA-teknik ved indsættelse af et gen, der koder for aprotinin i en egnet mikroorganisme, som ved dyrkning i et egnet næringsmedium producerer det ønskede produkt.

15 Fremstilling af aprotininanaloger i E. coli er be skrevet i EP offentliggjort patentansøgning nr. 238.993, og fremstilling af aprotinin i gær er beskrevet i dansk patentansøgning nr. 4501/87.

Visse aprotininanaloger og derivater er beskrevet, se 20 f.eks. Jering H. og Tschesche H., Eur.J.Biochem. 61 (1976), 453-463, som beskriver erstatning af Lys(15) med Arg, Phe eller Trp, eller US patentbeskrivelse nr. 4.595.674, som beskriver aprotininanaloger, hvor lysinresten i position 15 i aprotinins aktive centrum er erstattet med Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Met, 25 Arg, L-a-aminosmørsyre, L-norvalin, L-norleucin, dehydroalanin eller L-homoserin. Det ovenfor nævnte EP skrift nr. 238.993 beskriver desuden aprotininanaloger, hvor Lys(15) er erstattet med Arg, Val, Ile, Leu, Phe, Gly, Ser, Trp, Tyr eller Ala og/eller Met(52) erstattet med Glu, Leu, Val, Thr eller Ser.

30 De kendte aprotininanaloger hævdes at have modifi ceret virkning og styrke over for forskellige proteinaser. For eksempel har aprotinin(15Val) en relativt høj selektivitet for granulocyt elastase og en inhiberende effekt over for collagenase, aprotinin(15Ala) har kun en svag inhiberende 35 effekt over for elastase, og aprotinin(15Gly) har en udtalt antitrypsinaktivitet og inhiberer overraskende kallikrein.

3 DK 171417 B1

Det er formålet med den foreliggende opfindelse at tilvejebringe hidtil ukendte aprotininanaloger med mere specifik inhiberende effekt over for visse serinproteaser, såsom elastase, kallikrein, t-PA, urokinase og koagulationsfaktorer, 5 såsom thrombin.

Den foreliggende opfindelse er baseret på den overraskende kendsgerning, at erstatning af Arg i position 17 af aprotinin(3-58 ;42Ser) med Ala eller af Arg i position 17 med Ala og af Ile i position 19 af aprotinin(3-58 ;42Ser) med Glu 10 giver anledning til en væsentlig stigning i inhiberingen af human plasma kallikrein. Dette er endnu mere udtalt ved erstatning af Lys i position 15 med Arg og af Arg i position 17 med Ala i aprotinin(3-58;42Ser).

Derfor angår den foreliggende opfindelse 15 aprotininanaloger med formlen Χ,-Asp-Phe-Cys-Leu-Glu-Pro-Pro-Tyr-Thr-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-Arg-Tyr-Phe-Tyr-Asn-Ala-Lys-Ala-Gly-Leu-Cys-Gln-Thr-Phe-Val-Tyr-Gly-Gly-X^-Arg-Ala-X^-X^-Asn-Asn-Phe-Lys-Ser-Ala-Glu-Asp-Cys-Met-Arg-Thr-Cys-Gly-Gly-Ala, kendetegnet ved, at X1 betyder Arg-Pro, Pro eller hydrogen, X4 20 og X10 begge er Cys, X2 og X3 uafhængigt er en hvilken som helst naturligt forekommende aminosyrerest; X5 er Lys, Arg, Val, Thr, Ile, Leu, Phe, Gly, Ser, Met, Trp, Tyr eller Ala, X6 er Ala eller Gly, X8 er Ile, Leu, Met, Val eller Phe; X9 er en hvilken som helst naturligt forekommende aminosyrerest; Xn er en 25 hvilken som helst naturligt forekommende aminosyrerest; eller X12 er Lys, Arg eller Ser, og at X7 er Ala eller Gly.

I den ovenfor nævnte danske patentansøgning nr. 4501/87 beskrives aprotininanaloger med visse arainosyrerest-substitutioner og/eller -deletioner. Formålet med disse ami-30 nosyrerestsubstitutioner og/eller -deletioner er at undgå proteolytisk spaltning ved visse basiske aminosyrerester under fremstillingen af aprotininanaloger i gær. Især kan ami-nosyreresterne 1 og 2 deleteres, og en af de basiske aminosyrerester ved den dibasiske sekvens 41-42 kan erstattes af en 35 anden aminosyrerest. Det er blevet påvist, at sådanne aprotininanaloger fremstilles i høje udbytter i gær og udviser de samme karakteristika som naturligt aprotinin.

4 DK 171417 B1

For at sikre høje udbytter i gær kan de foreliggende aprotininanaloger yderligere modificeres på lignende måde. Heraf følger, at de foreliggende aprotininanaloger foruden at være modificeret i sekvensen fra aminosyre 16 til 19 også kan 5 modificeres ved henholdsvis sekvensen 1 - 2 og 41 - 42, forudsat at sådanne yderligere modifikationer ikke har en skadelig virkning på den foreliggende opfindelses formål.

Ifølge et yderligere aspekt af den foreliggende opfindelse tilvejebringes der en fremgangsmåde til fremstilling 10 af de nævnte aprotininanaloger ved dyrkning af en gærstamme indeholdende en replicerbar ekspressionsvektor indeholdende et gen, der koder for aprotininanalogerne i et egnet næringsmedium efterfulgt af udvinding af det ønskede produkt fra næringsmediet.

15 Den foreliggende opfindelse skal yderligere illu streres under henvisning til tegningen, hvor

Fig. 1 viser et syntetisk gen, der koder for apro-tinin(3-58;42Ser):

Fig. 2 illustrerer konstruktionen af plasmidet pKFN 20 306?

Fig. 3 illustrerer konstruktionen af plasmidet pKFN 504?

Fig. 4 illustrerer konstruktionen af plasmidet pMT 636? 25 Fig. 5A illustrerer inhiberingen af plasmakallikrein med naturligt aprotinin og med aprotininanalogerne KFN 396 og KFN 399? og

Fig. 5B illustrerer inhiberingen af plasmakallikrein med naturligt aprotinin og med aprotininanalogerne 30 KFN 396, KFN 772 og KFN 773.

Ifølge et mere begrænset aspekt kan de foreliggende aprotininanaloger repræsenteres ved den følgende formel (II): 5 DK 171417 B1 X1-Asp-Phe-Cys-Leu-Glu-Pro-Pro-Tyr-Thr-Gly-Pro-Cys-X5-X6-X7-Xg-X9-Arg-Tyr-Phe-Tyr-Asn-Ala-Lys-Ala-Gly-Leu-Cys-Gln-Thr-Phe-Val-5 Tyr-Gly-Gly-Cys-Arg-Ala-X^-X^-Asn-Asn-Phe-Lys-Ser-Ala-Glu-Asp-Cys-Met-Arg-Thr-Cys-Gly-Gly-Ala (II) hvor X1( X5, X6, X7, Xa, X9, Xn og X12 er som ovenfor defineret for formel (I).

10 Ifølge et endnu mere begrænset aspekt kan aproti- ninanalogerne repræsenteres ved følgende formel (III): X1-Asp-Phe-Cys-Leu-Glu-Pro-Pro-Tyr-Thr-Gly-Pro-Cys-Lys-X6-X7-X8-X9-Arg-Tyr-Phe-Tyr-Asn-Ala-Lys-Ala-Gly-Leu-Cys-Gln-Thr-Phe-Val-Tyr-Gly-Gly-Cys-Arg-Ala-X^-X^-Asn-Asn-Phe-Lys-Ser-Ala-Glu-Asp-15 Cys-Met-Arg-Thr-Cys-Gly-Gly-Ala (III) hvor X1# X6, X7, Χ8, X^ Xn og X12 er som defineret ovenfor for formel (I) . I den ovenfor viste sekvens med formlen I er X, fortrinsvis hydrogen; X2 er fortrinsvis Gly; X3 er fortrinsvis 20 Pro? X5 er fortrinsvis Lys eller Arg; X6 er fortrinsvis Ala; X7 er fortrinsvis Ala; X8 er fortrinsvis Ile; ^ er fortrinsvis Ile; Xn er fortrinsvis Lys; og/eller X12 er fortrinsvis Arg eller Ser.

Eksempler på foretrukne aprotininanaloger ifølge den 25 foreliggende opfindelse er henholdsvis aprotinin(3-58;17Ala+42Ser), som mangler de første to aminosyrerester i naturligt aprotinin og har Ala indsat i stedet for Arg i position 17 og Ser indsat i stedet for Arg i position 42; aprotinin (3-58;17Ala+19Glu+42Ser), som mangler de første to ami-30 nosyrerester i naturligt aprotinin og har Ala indsat i stedet for Arg i position 17, Glu indsat i stedet for Ile i position 19 og Ser indsat i stedet for Arg i position 42; og aprotinin (3-58;15Arg+17Ala+42Ser), som mangler de første to amino- DK 171417 B1 e syrerester i naturligt aprotinin og har henholdsvis Arg indsat i stedet for Lys i position 15, Ala indsat i stedet for Arg i position 17 og Ser indsat i stedet for Arg i position 42.

yderligere eksempler på aprotininanaloger ifølge den 5 foreliggende opfindelse er:

Aprotinin(3-58;17Ala)

Aprotinin(3-58;17Ala+19Glu)

Aprotinin(3-58;15Arg+17Ala)

Aprotinin(17Ala+42Ser) 10 Aprotinin(15Arg+17Ala+42Ser)

Aprotinin(17Ala)

Aprotinin(17Ala+19Glu)

Aprotinin(15Arg+17Ala)

Med henblik på secernering bindes den DNA-sekvens, 15 der koder for den ønskede aprotininanalog til en DNA-sekvens, der koder for en signalpeptidsekvens og en leader-peptidse-kvens. Signalpeptiderne og leader-peptiderne fraspaltes af den transformerede mikroorganisme under secerneringen af det udtrykte proteinprodukt fra cellerne, hvilket sikrer en mere 20 enkel isoleringsprocedure for det ønskede produkt. Et velegnet leader-peptidsystem for gær er MFal gær-leadersekvensen eller en del deraf (Kurjan, J. og Herskowitz, I., Cell 30 (1982) 933-943). Imidlertid kan en hvilken som helst signalsekvens eller leadersekvens, der bevirker secernering i gær, anvendes, og den 25 foreliggende opfindelse tænkes ikke begrænset til et bestemt secerneringssystem.

Til ekspressionsformål anbringes en promotersekvens oven for DNA-sekvensen for det ønskede proteinprodukt. Der anvendes fortrinsvis en promoter fra et gen, der naturligt 30 findes i gærværtsorganismen, f.eks. en promoter fra TPI-genet (triosephosphatisomerase). DNA-sekvensen for det ønskede produkt efterfølges af en transkriptionsterminatorsekvens, fortrinsvis en terminatorsekvens fra et gen, der naturligt findes i værtsgærorganismen, f.eks. terminatoren fra TPI-genet eller 35 MFal-genet.

7 DK 171417 B1 DNA-sekvensen, der koder for den ønskede aprotinin-analog bundet til passende promoter-, signal-, leader- og terminatorsekvenser, indsættes i en ekspressionsvektor til ekspression af aprotininanalogen i gær.

5 Ekspressionsvektoren kan være et plasmid, der kan replikere uafhængigt i gær eller kan integreres i gærkromosomet. Plasmidet kan fortrinsvis stabiliseres mod plasmidtab fra værtsorganismen ved indføring af et gen, der er essentielt for værtscellernes levedygtighed eller normale vækst, f.eks. et 10 gen, der koder for celledeling, biosyntese af cellevæg, proteinsyntese, etc.

Eksempel 1

Aprotinin(3-58:17Ala+42Ser) (KFN396)

En sekvens, der koder for aprotinin(3-58;42Ser) blev 15 konstrueret ud fra et antal oligonucleotider ved ligering.

Oligenucleotiderne blev syntetiseret på en automatisk DNA syntesemaskine under anvendelse af phosphoramiditkemi på en bærer af glas med veldefineret porestørrelse (Beaucage, S.L. og Caruthers, M.H. (1981) Tetrahedron Letters 22, 1859-1869).

20 Følgende 10 oligonucleotider blev syntetiseret:

I: AAAGAGTTTCTGTTTGGAACCTCCATACACTGGTCC

37-mer

Duplex A

II: TTACATGGACCAGTGTATGGAGGTTCCAAACAGAAACT

25 38-mer

III: ATGTAAAGCTAGAATCATCAGATACTTCTACAACG

35-mer

Duplex B

IV: CTTGGCGTTGTAGAAGTATCTGATGATTCTAGCT

30 34-mer

V: CCAAGGCTGGTTTGTGTCAAACTTTCGTTTACGGTGGCT

8 DK 171417 B1 39- mer

Duplex C

VI: CTCTGCAGCCACCGTAAACGAAAGTTTGACACAAACCAGC

40- mer

5 VII: GCAGAGCTAAGTCCAACAACTTCAAGT

27-mer

Duplex D

VIII: AGCAGACTTGAAGTTGTTGGACTTAG

26-mer

10 IX: CTGCTGAAGACTGCATGAGAACTTGTGGTGGTGCCTAAT

39-mer

Duplex E

X: CTAGATTAGGCACCACCACAAGTTCTCATGCAGTCTTC

38-mer 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 5 duplexer A - E blev dannet ud fra ovenstående 10 2 oligonucleotider som vist i fig. 1 og 2.

3 20 pmol af hver duplex A - E blev dannet ud fra de 4

tilsvarende par af 51-phosphorylerede oligonucleotider I - X

5 ved opvarmning i 5 minutter til 90°C efterfulgt af nedkøling 6 til stuetemperatur over en periode på 75 minutter. De fem 7 duplexer blev blandet og behandlet med T4 ligase. Den synte 8 tiske sekvens blev isoleret som et 176 bp bånd efter elektro- 9 forese af ligeringsblandingen på en 2% agarosegel.

10

Den syntetiske sekvens blev ligeret til et 330 bp 11

EcoRI-Hgal fragment fra plasmid pKFN9, der koder for MFal 12 signal og leadersekvens (1-85) og til det store EcoRI-Xbal 13 fragment fra pUC19. Konstruktionen af pKFN9, der indeholder et 14

Hgal site umiddelbart efter MFal leadersekvensen, er beskrevet 15 i EP patentansøgning nr. 0214826.

16

Ligeringsblandingen blev anvendt til at transformere en kompetent E. coli stamme (r~, m+), idet der blev selekteret for ampicillinresistens. Sekvensbestemmelse af et 32P-XbaI-EcoRI fragment (Maxam, A. og Gilbert, W., Methods Enzymol. 65 9 DK 171417 B1 (1980) 499-560) viste, at plasmider fra de fremkomne kolonier indeholdt den korrekte DNA-sekvens for aprotinin(3-58;42Ser).

Et plasmid pKFN306 blev udvalgt til videre anvendelse. Konstruktion af plasmid pKFN306 er vist i fig. 2.

5 For at indføre Ala i position 17 blev følgende oli- gonucleotider syntetiseret som beskrevet nedenfor:

la: CTGGTCCATGTAAAGCTGCTATCATCAGATACTTCTACAACGC

43-mer

Ila: CTTGGCGTTGTAGAAGTATCTGATGATAGCAGCTTTACATGGACCAGTGT

10 50-mer

Oligonucleotiderne blev 5'-O-phosphoryleret ved behandling med ATP og T4-kinase.

En duplex dannet ved baseparring af de 5'-phos-phorylerede oligonucleotider la og Ila blev ligeret til 352 bp 15 EcoRI-Pf1MI fragmentet og 3kbp EcoRI-Styl fragmentet, begge fra pKFN306. pKFN306 koder for S. cerevisiae parringsfaktor al signal-leader (1-85) bundet til det syntetiske aprotinin(3-58;42Ser)gen.

Ligeringsblandingen blev anvendt til at transformere 20 en egnet E. coli stamme (r“ m+), idet der blev selekteret for ampicillinresistens. Sekvensbestemmelse af et 32P-mærket Xbal-EcoRI fragment (Maxam, A. og Gilbert, W., Methods Enzymol. 65 (1980), 499-560) viste, at plasmider fra de resulterende kolonier indeholdt den korrekte DNA-sekvens for aprotinin(3-25 58;17Ala+42Ser).

Et plasmid, pKFN501, blev selekteret til yderligere anvendelse. Konstruktionen af plasmid pKFN501 er vist i fig. 3.

pKFN501 blev skåret med EcoRI og Xbal og 0,5 kb fragmentet blev ligeret til 9,5 kb Ncol-Xbal fragmentet fra pMT636 30 og 1,4 kb NcoI-EcoRI fragmentet fra pMT636, hvilket resulterede i plasmid pKFN504, se fig. 3. Plasmid pMT636 blev fremstillet ud fra pMT608 efter deletion af LEU-2 genet og ud fra pMT479, se fig. 4. pMT608 er beskrevet i EP patentansøgning nr. 195691. pMT479 er beskrevet i EP patentansøgning nr. 163529. pMT479 10 DK 171417 B1 indeholder Schizo. pombe TPI genet (POT), S. cerevisiae triosephosphatisomerasepromoteren og -terminatoren, TPIp og TPIij. (Alber, T. og Kawasaki, G., J.Mol.Appl.Gen. i (1982) 419-434). Plasmid pKFN504 indeholder følgende sekvens: 5 TPIp-MFal-signal-leader(l-85) -aprotinin(3-58 ?17Ala+42Ser) -TPIT, hvor MFal er den parringsfaktor al kodende sekvens fra S.

cerevisiae (Kurjan, J. og Herskowitz, I., Cell 30, (1982) 933- 943), signal-leader(1-85) betyder, at sekvensen indeholder de første 85 aminosyrerester fra MFal signal-leadersekvensen og 10 aprotinin(3-58;17Ala+42Ser) er den syntetiske sekvens, der koder for et aprotininderivat, som mangler de første to aminosyrerester ved N-terminalen, og som får aminosyreresterne 17 og 42 erstattet med henholdsvis en Ala- og en Ser-rest.

S. cerevisiae stamme MT663 (E2-7B XE11-36 a/α, Δ tpi 15 Δ tpi, pep 4-3/pep 4-3) blev dyrket på YPGaL (1% Bacto gærekstrakt, 2% Bacto pepton, 2% galactose, 1% lactat) til en optisk densitet ved 600 nm på 0,6.

100 ml kulturmedium blev høstet ved centrifugering, vasket med 10 ml vand, centrifugeret igen og atter suspenderet 20 i 10 ml opløsning indeholdende 1,2 M sorbitol, 25 mM Na2EDTA, pH = 8,0, og 6,7 mg/ml dithiotreitol. Suspensionen blev inkuberet ved 30’C i 15 minutter, centrifugeret, og cellerne

blev resuspenderet i 10 ml opløsning indeholdende (1,2 M

sorbitol, 10 mM Na EDTA, 0,1 M natriumcitrat, pH = 5,8, 2 mg 2 25 Novozym®234). Suspensionen blev inkuberet ved 30'C i 30 minutter, cellerne isoleret ved centrifugering, vasket i 10 ml

1,2 M sorbitol og 10 ml CAS (1,2 M sorbitol, 10 mM CaCl , 10 mM

2

Tris HC1 (Tris = Tris(hydroxymethyl)aminomethan), pH = 7,5) og resuspenderet i 2 ml CAS. Til transformering blev 0,1 ml CAS- 30 resuspenderede celler blandet med ca. 1 μg plasmid pKFN504 og henstillet ved stuetemperatur i 15 minutter. 1 ml (20% poly- ethylenglycol 4000, 10 mM CaCl^, 10 mM Tris HC1, pH = 7,5) blev tilsat, og blandingen henstod yderligere 30 minutter ved stuetemperatur. Blandingen blev centrifugeret, og pillen

35 resuspenderet i 0,1 ml SOS (1,2 M sorbitol, 33% v/v YPD, 6,7 mM

CaCl , 14 Mg/ml leucin) og inkuberet ved 30°C i to timer.

2 11 DK 171417 B1

Suspensionen blev derpå centrifugeret, og pillen blev resuspen-deret i 0,5 ml 1,2 M sorbitol. Derpå blev 6 ml topagar (SC medium ifølge Sherman et al., (Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, 1981) indeholdende 1,2 M sorbitol 5 plus 2,5% agar) tilsat ved 52*C og opløsningen hældt på plader indeholdende det samme sorbitolholdige medium, der var gjort stift med agar. Transformante kolonier blev opsamlet efter tre dage ved 30‘C, genisoleret og anvendt til at starte flydende kulturer med. En sådan transformant, KFN396, blev valgt til 10 yderligere karakterisering.

Gærstamme KFN396 blev dyrket på YPD medium (1% gærekstrakt, 2% pepton (fra Difco Laboratories) og 2% glucose).

En 1 1 kultur af stammen blev rystet ved 30'C til en optisk densitet ved 600 nm på 13. Efter centrifugering blev super-15 natanten oprenset ved FPLC ionbytterkromatografi. Gær-supernatanten blev filtreret gennem en 0,22 μπι Millex*GV filterenhed, og 1 ml blev sat på en MonoS kationbyttersøjle (0,5 x 5 cm), der var ækvilibreret med 20 mM Bicin, pH 8,7. Efter vask med ækvilibreringspuffer blev søjlen elueret med en lineær 20 NaCl gradient (0-1 M) i ækvilibreringspuffer. Trypsin-inhibitoraktivitet blev bestemt kvantitativt i de eluerede fraktioner ved spektrofotometrisk bestemmelse og yderligere ved integration af absorption ved 280 nm fra 25 E^qq (aprotinin) =8,3

Udbyttet af aprotinin(3-58;17Ala+42Ser) var ca. 4,3 mg/liter.

Med henblik på aminosyreanalyse blev gærsupernatanten 30 (7 ml) indstillet til pH 8,7 med 0,1 M NaOH og filtreret (0,22 Mm). Effluenten fra en Q-Sepharose anionbyttersøjle (1x4 cm) ækvilibreret med 20 mM Bicin, pH 8,7, blev sat på en MonoS kationbyttersøjle (0,5 x 5 cm). Kationbytterkromatograferingen blev udført som beskrevet ovenfor. Opkoncentrering af det 35 gradienteluerede aprotinin(3-58) blev udført ved gentagen kromatografering på MonoS og eluering med en stejl NaCl- 12 DK 171417 B1 gradient. De opsamlede fraktioner blev yderligere koncentreret ved vakuumcentrifugering til ca. 100 jul og sat på en RP-HPLC søjle (Vydac C4, 4,6 x 250 mm). Eluering blev udført med CH3CN gradient i 0,1% TFA. De opsamlede fraktioner blev koncentreret 5 til ca. 100 μΐ ved vakuumcentrifugering, og prøver blev udtaget med henblik på aminosyreanalyse.

Resultatet af aminosyreanalysen fremgår af den følgende tabel 1. Af denne tabel fremgår, at produktet har den forventede aminosyresammensætning.

10 Tabel 1

Aminosyre Teoretisk Aprotinin (3-58;17Ala+42Ser) _(fundet)_

Asx 5 4,90 15 Thr 3 2,95

Ser 2 2,10

Glx 3 3,01

Pro 3 3,14

Gly 6 5,93 20 Ala 7 6,69

Cys 6 5,91

Val 1 1,02

Met 1 0,99

Ile 2 2,00 25 Leu 2 1,98

Tyr 4 3,73

Phe 4 3,75

Lys 4 4,29

Arg_3_3.21 30 Total_§6_55.60_

Eksempel 2

Aprotinin (3-58 .· 17Ala+19Glu+42Serl (KFN3991

Et syntetisk gen, der koder for aprotininisse ;17Ala+19Glu+42Ser) blev konstrueret som beskrevet i eksempel 35 1. Følgende oligonucleotider Ib og Ilb blev anvendt i stedet for la og Ila:

Ib: CTGGTCCATGTAAAGCTGCTATCGAAAGATACTTCTACAACGC

43-mer 13 DK 171417 B1

IIb: CTTGGCGTTGTAGAAGTATCTTTCGATAGCAGCTTTACATGGACCAGTGT

50-mer

Det pUC19 deriverede plasmid pKFN503 blev konstrueret på samme måde som pKFN501.

5 Ved at følge fremgangsmåden beskrevet i eksempel 1 opnåedes et plasmid pKFN507 indeholdende følgende konstruktion

TPIp-MFal-signal-leader(1-85)-aprotinin(358 ?17Ala+19Glu+42Ser)-TPIT

hvor aprotinin(3-58;17Ala+19Glu+42Ser) er det syntetiske gen, 10 der koder for et aprotininderivat, der mangler de første to aminosyrerester ved N-terminalen, og som har resterne 17, 19 og 42 i naturligt aprotinin erstattet med henholdsvis en alanin-, en glutaminsyre- og en serinrest.

Gærstammen MT663 blev transformeret med plasmid 15 pKFN507 som beskrevet ovenfor, og dyrkning af den transformerede stamme KFN399 gav ca. 10 mg/liter af aprotinin (3-58;17Ala+19Glu+42Ser).

Aminosyreanalysen er vist i tabel 2 og bekræfter den forventede aminosyresammensætning.

20 Tabel 2

Aminosyre Teoretisk Aprotinin (3-58;17Ala+19Glu+42Ser) _(fundet)_

Asx 5 4,95 25 Thr 3 2,83

Ser 2 1,90

Glx 4 4,08

Pro 3 2,98

Gly 6 5,98 30 Ala 7 6,92

Cys 6 5,06

Val 1 0,99

Met 1 0,86

Ile 1 0,99 35 Leu 2 1,99

Tyr 4 3,77

Phe 4 3,89 14 DK 171417 B1

Lys 4 4,07 Æg_3_3.06_

Total_56_54.36_

Eksempel 3 5 Aprotinin(3-58:15Ara+17Ala+42Ser) (KFN7731

Et syntetisk gen, der koder for aprotinin(3-58; 15Arg+17Ala+42Ser) blev konstrueret som beskrevet i eksempel 1. Følgende oligonucleotider Ic og Ile blev anvendt i stedet for la og Ila:

10 Ic: CTGGTCCATGTAGAGCTGCTATCATCAGATACTTCTACAACGC

43-mer

IIC: CTTGGCGTTGTAGAAGTATCTGATGATAGCAGCTCTACATGGACCAGTGT

50-mer

Det pUC19 deriverede plasmid pKFN777 blev konstrueret 15 på tilsvarende måde som pKFN501.

Ved at følge fremgangsmåden beskrevet i eksempel 1 opnåedes et plasmid pKFN807 indeholdende følgende konstruktion TPIp-MFal-signal-leader(l-85)-aprotinin(358;15Arg+17Ala+42Ser) -TPIT 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 hvor aprotinin(3-58;15Arg+17Ala+42Ser) er det syntetiske gen, 2 der koder for et aprotininderivat, der mangler de første to 3 aminosyrerester ved N-terminalen, og som har resterne 15, 17 og 4 42 i naturligt aprotinin erstattet med henholdsvis en arginin-, 5 en alanin- og en serinrest.

6 Gærstammen MT663 blev transformeret med plasmid 7 pKFN807 som beskrevet ovenfor, og dyrkning af den trans 8 formerede stamme KFN773 gav ca. 8,5 mg/liter af apro 9 tinin (3-58 ; 15Arg+17Ala+42Ser) .

10

Aminosyreanalysen er vist i tabel 3 og bekræfter den 11 forventede aminosyresammensætning.

15 DK 171417 B1

Tabel 3

Aminosyre Teoretisk Aprotinin (3-58 ?15Arg+17Ala+42Ser) _f fundet)_ 5 ASX 5 4,95

Thr 3 2,85

Ser 2 1,81

Glx 3 3,01

Pro 3 3,05 10 Gly 6 5,92

Ala 7 6,91

Cys 6 5,31

Val 1 1,02

Met 1 0,73 15 Ile 2 1,41

Leu 2 1,99

Tyr 4 3,80

Phe 4 3,94

Lys 3 2,97 20 Ara_4_4.24_

Total_&6_53,91.

Det let formindskede indhold af Ile sammenlignet med den teoretiske værdi kan højst sandsynligt tilskrives ufuldstændig hydrolyse af Ile(18)-Ile(19). Dette er velkendt 25 inden for området.

Eksempel 4

Inhibering af serinproteaser fra plasma med aprotinin(3-58;17Ala+42Ser) (KFN396) og aprotinin(3-58;17Ala+19Glu+42Ser) (KFN399), aprotinin(3-58?15Arg+42Ser) (KFN772) og aproti-nin(3- 30 58:15Ara+17Ala+42Ser^ (KFN7731_

Aprotinin(3-58;17Ala+42Ser) (KFN396), aprotinin(3- 58 ; 17Ala + 19Glu+42Ser) (KFN399) og aprotinin(3-58;15Arg+17Ala+42Ser) (KFN773) blev oprenset som ovenfor beskrevet. Som naturligt bovint pancreasaprotinin(l-58) anvendtes 35 batch B 5029-65 (67000 KlU/mg) fra Novo Nordisk A/S (Bagsværd). Koncentrationen blev beregnet under anvendelse af E280rm = 8,3 og Mr = 6500. Der anvendtes humant plasmakallikrein fra Sigma (St. Louis, MO), bovin faktor Xa blev oprenset ifølge (H. Nobukazu 16 DK 171417 B1 et al. J.Biochem. £7 (1985) 1347-1355), human faktor Ila (thrombin) var en gave fra Dr. W. Lawson (New York State Dept. of Health, Albany, N.Y.), rekombinant human faktor Vila var fra Novo Nordisk A/S (Bagsværd) og rekombinant human protein Ca var 5 fra ZymoGenetics, Inc. (Seattle, WA). Substrat S2302 (H-D-Pro-Phe-Arg-p-nitroanilid), substrat S2238 (H-D-Phe-Pip-Arg-p-nitroanilid) og substrat S2366 (Glu-Pro-Arg-p-nitroanilid) var fra Kabi (Stockholm, Sverige). Substrat FXa-1 (methoxycarbonyl DCH-Gly-Arg-p-nitroanilid) var fra NycoMed (Oslo, Norge).

10 Forsøgene blev udført i 100 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl 0,01% Tween80, pH 7,4 ved 25‘C.

Human plasmakallikrein (3 nM) blev inkuberet med aprotinin (0-20 nM) i 30 minutter i en mikrotitreringsbrønd. Substrat S2302 (0,6 mM) blev tilsat til et slutvolumen på 300 15 μΐ, og den hastighed, hvormed nitroanilin blev dannet, blev målt ved 405 nm ved hjælp af en Micro ELISA* Autoreader MR580 fra Dynatech Laboratories. Hastigheden er proportional med koncentrationen af frit enzym. I fig. 5A og 5B er vist naturligt aprotinins og de fire analogers KFN396, KFN399, KFN772 og 20 KFN773 inhibering af plasmakallikrein. Ved naturligt aprotinin iagttoges en moderat inhibering. Inhiberingen blev stærkt forøget af analogerne KFN396 og KFN399, der indeholder Ala i position 17 (Fig. 5A).

En yderligere forøgelse af inhiberingen opnåedes med 25 Arg i position 15 (KFN 772) ; og den stærkeste inhibering iagttogedes med analogen (KFN 773) med substituering af både position 17 (Ala) og position 15 (Arg) (fig. 5B).

Analogerne blev også testet for inhibering af se-rinproteasernes amidolytiske aktivitet: bovin faktor Xa, human 30 faktor Ila, human rekombinant faktor Vila og human rekombinant protein Ca. Forsøgene blev udført i det væsentlige som beskrevet for plasmakallikrein, blot anvendtes passende substrater.

Endelig blev analogerne analyseret for en effekt på 35 koaguleringsfaktorerne i humant plasma ved hjælp af to størkningsprøver. Disse prøver, prothrombintiden (PTT) og den aktiverede partielle thromboplastintid (APTT), blev udført med 17 DK 171417 B1

General Diagnostics® reagenser fra Organon (Durham, NC) ifølge producentens anvisninger. Resultaterne af inhiberingseks-perimenterne er opregnet i tabel 4, som beskriver inhi-beringsprofilen for de fire aprotininanaloger. KFN 773 er 5 kendetegnet ved en ekstraordinært stærk inhibering af humant plasmakallikrein, som er ti gange stærkere end Arg 15 analogens (KFN 772). Der iagttages en modsat rettet effekt med aktiveret protein C. I dette tilfælde svækkes den relativt stærke inhibering opnået ved substitution af Lys 15 til Arg ved 10 yderligere substitution af Arg 17 til Ala.

Tabel 4 Aprotininanalogers inhiberingsprofil K, (nM); Amidolytisk aktivitet Størk-af serinproteaser # nings assays 15 _

Plasma

Produkt kallikrein Flla FVIIa FXa Prot.Ca PTT

APTT

20 Naturligt

Aprotinin 180 - - - 400 - - KFN 396 12 - - KFN 399 12 KFN 772 1 - 1800 10 - + 25 KFN 773 0,1 - - 150 100 - + - Ingen inhibering med 1,0 μΜ aprotininanalog + Forlænget størkningstid med 1,0 μΜ aprotininanalog *) Inhiberingskonstanter estimeret ifølge den grafiske Dixonmetode (M. Dixon, Biochem.J. 129 (1972) 197-202) 30 # Substrater: Plasmakallikrein: S2302? Flla: S2238; FVIIa: Substrater FXa-1; FXa: Substrat FXa-l? Prot. Ca: S2366.

Claims (23)

18 DK 171417 B1

1. Aprotininanaloger med formlen Χ,,-Asp-Phe-Cys-Leu-Glu-Pro-Pro-Tyr-Thr-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-Arg-Tyr-Phe-Tyr-Asn-Ala-Lys-Ala-Gly-Leu-Cys-Gln-Thr-Phe-Val-Tyr-Gly-Gly-X10-Arg-Ala-5 X^-X^-Asn-Asn-Phe-Lys-Ser-Ala-Glu-Asp-Cys-Met-Arg-Thr-Cys-Gly-Gly-Ala, kendetegnet ved, at X1 betyder Arg-Pro, Pro eller hydrogen, X4 og X10 begge er Cys, X2 og X3 uafhængigt er en hvilken som helst naturligt forekommende aminosyrerest? X5 er Lys, Arg, Val, Thr, Ile, Leu, Phe, Gly, Ser, Met, Trp, Tyr 10 eller Ala, X6 er Ala eller Gly, X8 er Ile, Leu, Met, Val eller Phe; Xf er en hvilken som helst naturligt forekommende aminosyrerest ; x„ er en hvilken som helst naturligt forekommende aminosyrerest; eller X12 er Lys, Arg eller Ser, og at X7 er Ala eller Gly.

2. Aprotininanaloger ifølge krav 1, kendetegnet ved, at X, er Arg-Pro, Pro eller hydrogen, fortrinsvis Arg-Pro eller hydrogen, mest foretrukket hydrogen.

3. Aprotininanaloger ifølge krav 1 eller 2, kendetegnet ved, at X2 er Gly.

4. Aprotininanaloger ifølge et hvilket som helst af de foregående krav, kendetegnet ved, at X3 er Pro.

5. Aprotininanaloger ifølge et hvilket som helst af de foregående krav, kendetegnet ved, at X5 er Lys, Arg, Val, Thr, Ile, Leu, Phe, Gly, Ser, Met, Trp, Tyr eller Ala, for- 25 trinsvis Lys eller Arg.

6. Aprotininanaloger ifølge et hvilket som helst af de foregående krav, kendetegnet ved, at X6 er Ala eller Gly, fortrinsvis Ala. 19 DK 171417 B1

7. Aprotininanaloger ifølge et hvilket som helst af de foregående krav, kendetegnet ved, at X7 er Ala.

8. Aprotininanaloger ifølge et hvilket som helst af de foregående krav, kendetegnet ved, at X8 er Ile, Leu, Met, Val 5 eller Phe, fortrinsvis Ile.

9. Aprotininanaloger ifølge et hvilket som helst af de foregående krav, kendetegnet ved, at X^ er Ile eller Glu, fortrinsvis Ile.

10. Aprotininanaloger ifølge et hvilket som helst af 10 de foregående krav, kendetegnet ved, at Xn er Lys eller Arg, fortrinsvis Lys.

11. Aprotininanaloger ifølge et hvilket som helst af de foregående krav, kendetegnet ved, at X12 er Lys, Arg eller Ser, fortrinsvis Arg eller Ser.

12. Aprotininanalog ifølge krav 1, kendetegnet ved, at den har følgende struktur: Arg-Pro-Asp-Phe-Cys-Leu-Glu-Pro-Pro-Tyr-Thr-Gly-Pro-Cys-Lys-Ala-Ala-Ile-Glu-Arg-Tyr-Phe-Tyr-Asn-Ala-Lys-Ala-Gly-Leu-Cys-Gln-Thr-Phe-Val-Tyr-Gly-Gly-Cys-Arg-Ala-Lys-Arg-Asn-Asn-Phe-20 Lys-Ser-Ala-Glu-Asp-Cys-Met-Arg-Thr-Cys-Gly-Gly-Ala. (I)

13. Aprotininanalog ifølge krav 1, kendetegnet ved, at den har følgende struktur: Asp-Phe-Cys-Leu-Glu-Pro-Pro-Tyr-Thr-Gly-Pro-Cys-Lys-Ala-Ala-Ile-Glu-Arg-Tyr-Phe-Tyr-Asn-Ala-Lys-Ala-Gly-Leu-Cys-Gln-Thr-25 Phe-Val-Tyr-Gly-Gly-Cys-Arg-Ala-Lys-Arg-Asn-Asn-Phe-Lys-Ser-Ala-Glu-Asp-Cys-Met-Arg-Thr-Cys-Gly-Gly-Ala. (II)

14. Aprotininanalog ifølge krav l, kendetegnet ved, at den har følgende struktur: Arg-Pro-Asp-Phe-Cys-Leu-Glu-Pro-Pro-Tyr-Thr-Gly-Pro-Cys-Lys-30 Ala-Ala-Ile-Glu-Arg-Tyr-Phe-Tyr-Asn-Ala-Lys-Ala-Gly-Leu-Cys- Gln-Thr-Phe-Val-Tyr-Gly-Gly-Cys-Arg-Ala-Lys-Ser-Asn-Asn-Phe- Lys-Ser-Ala-Glu-Asp-Cys-Met-Arg-Thr-Cys-Gly-Gly-Ala. (III) 20 DK 171417 B1

15. Aprotininanalog ifølge krav 1, kendetegnet ved, at den har følgende struktur:

5 Asp-Phe-Cys-Leu-Glu-Pro-Pro-Tyr-Thr-Gly-Pro-Cys-Lys-Ala-Ala-Ile-Glu-Arg-Tyr-Phe-Tyr-Asn-Ala-Lys-Ala-Gly-Leu-Cys-Gln-Thr-Phe-Val-Tyr-Gly-Gly-Cys-Arg-Ala-Lys-Ser-Asn-Asn-Phe-Lys-Ser-Ala-Glu-Asp-Cys-Met-Arg-Thr-Cys-Gly-Gly-Ala. (IV)

16. Aprotininanalog ifølge krav 1, kendetegnet ved, 10 at den har følgende struktur: Arg-Pro-Asp-Phe-Cys-Leu-Glu-Pro-Pro-Tyr-Thr-Gly-Pro-Cys-Lys-Ala-Ala-Ile-Ile-Arg-Tyr-Phe-Tyr-Asn-Ala-Lys-Ala-Gly-Leu-Cys-Gln-Thr-Phe-Val-Tyr-Gly-Gly-Cys-Arg-Ala-Lys-Arg-Asn-Asn-Phe-Lys-Ser-Ala-Glu-Asp-Cys-Met-Arg-Thr-Cys-Gly-Gly-Ala. (V)

17. Aprotininanalog ifølge krav 1, kendetegnet ved, at den har følgende struktur: Asp-Phe-Cys-Leu-Glu-Pro-Pro-Tyr-Thr-Gly-Pro-Cys-Lys-Ala-Ala-Ile-Ile-Arg-Tyr-Phe-Tyr-Asn-Ala-Lys-Ala-Gly-Leu-Cys-Gln-Thr-Phe-Val-Tyr-Gly-Gly-Cys-Arg-Ala-Lys-Arg-Asn-Asn-Phe-Lys-Ser-20 Ala-Glu-Asp-Cys-Met-Arg-Thr-Cys-Gly-Gly-Ala. (VI)

18. Aprotininanalog ifølge krav 1, kendetegnet ved, at den har følgende struktur: Asp-Phe-Cys-Leu-Glu-Pro-Pro-Tyr-Thr-Gly-Pro-Cys-Lys-Ala-Ala-Ile-Ile-Arg-Tyr-Phe-Tyr-Asn-Ala-Lys-Ala-Gly-Leu-Cys-Gln-Thr-25 Phe-Val-Tyr-Gly-Gly-Cys-Arg-Ala-Lys-Ser-Asn-Asn-Phe-Lys-Ser-Ala-Glu-Asp-Cys-Met-Arg-Thr-Cys-Gly-Gly-Ala. (VII) 1 Aprotininanalog ifølge krav 1, kendetegnet ved, at den har følgende struktur: Arg-Pro-Asp-Phe-Cys-Leu-Glu-Pro-Pro-Tyr-Thr-Gly-Pro-Cys-Lys-30 Ala-Ala-Ile-Ile-Arg-Tyr-Phe-Tyr-Asn-Ala-Lys-Ala-Gly-Leu-Cys-Gln-Thr-Phe-Val-Tyr-Gly-Gly-Cys-Arg-Ala-Lys-Ser-Asn-Asn-Phe-Lys-Ser-Ala-Glu-Asp-Cys-Met-Arg-Thr-Cys-Gly-Gly-Ala. (VIII) 21 DK 171417 B1

20. Aprotininanalog ifølge krav 1, kendetegnet ved, at den har følgende struktur: Asp-Phe-Cys-Leu-Glu-Pro-Pro-Tyr-Thr-Gly-Pro-Cys-Arg-Ala-Ala-Ile-Ile-Arg-Tyr-Phe-Tyr-Asn-Ala-Lys-Ala-Gly-Leu-Cys-Gln-Thr-5 Phe-Val-Tyr-Gly-Gly-Cys-Arg-Ala-Lys-Ser-Asn-Asn-Phe-Lys-Ser-Ala-Glu-Asp-Cys-Met-Arg-Thr-Cys-Gly-Gly-Ala. (IX)

21. Aprotininanalog ifølge krav 1, kendetegnet ved, at den har følgende struktur: Arg-Pro-Asp-Phe-Cys-Leu-Glu-Pro-Pro-Tyr-Thr-Gly-Pro-Cys-Arg-10 Ala-Ala-Ile-Ile-Arg-Tyr-Phe-Tyr-Asn-Ala-Lys-Ala-Gly-Leu-Cys-Gln-Thr-Phe-Val-Tyr-Gly-Gly-Cys-Arg-Ala-Lys-Ser-Asn-Asn-Phe-Lys-Ser-Ala-Glu-Asp-Cys-Met-Arg-Thr-Cys-Gly-Gly-Ala. (X)

22. Fremgangsmåde til fremstilling af aprotininanalo-ger ifølge krav 1, kendetegnet ved, at den omfatter dyrkning af 15 en gærstamme indeholdende en replicerbar ekspressionsvektor, hvor vektoren omfatter et gen, der koder for aprotininanalogen og DNA-sekvenser, der tillader udtrykkelse af aprotininanalogen i et egnet næringsmedium og oparbejdning af de udtrykte aprotininanaloger.