KR0169976B1 - 재조합 아프로티닌 변형체, 균일하게 프로세싱된 아프로티닌 변형체의 미생물을 이용한 유전공학적 제조 방법 및 그의 치료 용도 - Google Patents
재조합 아프로티닌 변형체, 균일하게 프로세싱된 아프로티닌 변형체의 미생물을 이용한 유전공학적 제조 방법 및 그의 치료 용도 Download PDFInfo
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Abstract
유전 공학적으로 아미노산 2위치에서 아미노산 프롤린이 결실되거나 또는 Ala-(-2)-Gln-(-1)이 N-말단에 부가된 아프로티닌 변형체는 효모 중에서 정확하고 높은 퍼센트로 프로세싱된다. 아프로티닌은 인간 또는 동물의 아프로티닌일 수 있다.
적합한 벡터를 사용하여 효모 또는 다른 하등 진핵생물을 형질전환시키고, 이 형질전환체를 배양시키고 아프로티닌 변형체를 배양액으로부터 정제한다.
Description
제1도는 대장균-효모 셔틀 벡터 pMT 15의 제한효소 지도. 효모 중 유전자 발현에 필수적인 DNA 신호 서열은 박스로 표시함.
제2도는 프리-프로-α-인자 서열 중에 새로운 Hind III 절단 부위를 유전자공학적으로 도입하는 방법을 나타내는 도면. Hind III 인식 서열은 세린 코돈의 치환(TCT가 AGC로)에 의해 생성되었음.
제3도는 대장균-효모 셔틀 벡터 pS 580을 제조하는 방법을 도시한 다이아그램.
제4도는 α-인자 리터 (α-인자 프리-프로-서열)의 DNA 서열이 5' 말단에서 Hind III 절단 부위까지 확장되어 있는 합성 Val-15-Leu-17-아프로티닌 유전자의 DNA 서열임. 아미노산 서열 중 KEX2 효모 효소의 절단 부위를 표시하였음.
제5도는 대장균-효모 셔틀 벡터 pS 604를 제조하는 방법을 도시한 다이아그램.
제6도는 맥주효모(S. cerevisiae)의 발효 상징액으로부터 아프로티닌 변형체를 정제하는 방법을 도시한 흐름도임.
제7도는 몇몇 선택된 DePro-2 및 Ala-(-2)-Gln-(-1) 변형체의 아미노산 분석을 나타낸 것임.
제8도는 선택된 DePro-2 및 Ala-(-2)-Gln-(-1) 변형체의 N-말단 서열 분석을 나타낸 것임.
제9도는 KEX2 프로테아제에 의한 몇몇 DePro-2 및 Ala0(-2)-Gln-(-1) 변형체의 프로세싱을 나타낸 것임.
제10도는 DePro-2 및 Ala-(-2)-Gln-(-1) 변형체의 억제제 상수를 나타낸 표.
본 발명은 재조합 아프로티닌 변형체, 형질 전환된 효모를 사용하여 균일하게 프로세싱된 분비 생성물로서 상기 펩티드 변형체를 제조하는 방법 및 이 재조합 아프로티닌 변형체를 함유하는 약물에 관한 것이다.
아프로티닌은 이미 잘 연구된 단백질로서 아미노산을 58개 함유하며, 트립신, 키모트립신, 플라스민 및 플라스마 칼리크레인 억제 작용을 갖는다(H. Fritz 및 G. Wunderer, Drug Res., 제33호, 제479-494페이지, 1983년 : W. Gebhard, H. Tschesche 및 H. Fritz, Proteinase Inhinitors, Barrett and Salvesen (eds.), Elsevier Science Publ. BV 375-387, 1986년 참조).
소의 기관으로부터 얻은 아프로티닌은 선용항진성(線溶亢進性) 출혈 및 외상 출혈성 쇼크와 같은 각종 질병의 치료에 사용되는 약물인 트라실롤(Trasylol)중의 유효 성분이다.
또한, 심장 개방 수술 중에 섬유소 분리 및 응고에 의한 혈액 손실은 트라실롤을 사용함으로써 크게 줄일 수 있다는 것이 임상적으로 새로이 발견되었다.(W. Van Oeveren 등의 Ann. Thorac. Surg., 제44호, 제640-645페이지, 1987년 ; D. Royston 등의 Labcet II, 제1289-1291페이지, 1987년 ; B.P. Bistrup 등, Lancet I, 제366-367페이지, 1988년 참조).
아미노산 서열 15 위치의 리신 대신에 다른 아미노산을 함유하는 반합성 아프로티닌 동족체는 아프로티닌과는 현저하게 상이한 작용 프로파일 및 작용 특이성을 갖는다는 것을 알 수 있었다(Tschesche 등의 미합중국 특허 제4,595,674호; H. R. Wenzel 등의 Chemistry of Peptides and Proteins, 제3권, 1985년 참조).
이러한 반합성 아프로티닌 동족체 중 몇몇은 예를 들면 췌장 및 백혈구로부터의 엘라스타제에 대해 강력한 억제 작용을 갖는다. 이러한 새로운 작용 특이성 때문에, 이와 같은 아프로티닌 동족체는 엘라스타제의 분비 증가로 인하여 발생하는 질병, 예를 들면 기종의 발육, ARDS(성인 호흡 곤란 증후군) 및 류머티스 관절염 치료에 사용될 수 있다.
아미노산 서열 15 위치가 아르기닌인 다른 아프로티닌 동족체는 혈액 단계적 응고에 중심적으로 관련된 플라스마 칼리크레인에 대하여 아프로티닌보다 현저하게 그 억제 작용이 큰 것이 특징이다.
소의 아프로티닌의 반합성적 변형에 의해 성취될 수 있는 수율이 작다는 것은 경험으로부터 알 수 있었다. 따라서, 합성제조한 유전자를 사용하여 아프로티닌 동족체를 유리하게는 대량으로 제조하기 위해서 원핵 미생물 중의 재조합 유전자 생성물을 발효시킴으로써 제조하였다(Auerswald 등의 유럽 특허 제01238993 A2호 ; B.V. Wilcken-bergmann 등의 EMBO J., 제5호 제3219-3225페이지, 1986년 참조)
예를 들면, 대장균 K12 균주 중의 재조합 아프로티닌 변형체를 제조하는데 사용된 발현계는 MS 2 레플리카제의 N-말단 펩티드 부분과 같은 적합한 융합 파트너와 융합된 융합 단백질(세포질 내에서 형성됨)로서 아프로티닌 뮤테인(mutein)을 세포간 봉입체 형태로 축적하는 종류이었다.(E.A. Auerswald 등의 Biol. Chem. Hoppe Seyler, 제369호, 제27-35페이지, 1988년 참조)
상기 이외에도, OmpA 신호 서열 또는 phoA 신호 서열과 같은 분비성 펩티드에 적합한 유전자 서열과 아프로티닌 뮤테인을 융합시킴으로써, 억제성 아프로티닌 변형체를 박테리아 세포의 페리플라즈마 중으로 분비할 수 있도록 하는 대장균 발현/분비계를 사용할 수 있다.(Bayer A.G 사에 근무하는 W. Bruns 박사의 personal communication ; C.B. Marks 등의 J. Biol. Chem. 제261호, 제7115-7118페이지, 1986년 참조)
진핵계 중에서 효모 발현계는 재조합 아프로티닌 변형체를 유전 공학적으로 제조하는 방법에 특히 적합하며, 이 방법에서 유전자 생성물은 세포 내에서 축적되거나, 또는 효모로부터 적합한 분비성 신호 서열과의 융합체로서 분비 경로를 통과한 다음, 막 프로테아제에 의하여 절단된 후에 억제성 물질로서 배양 배지 중으로 배출된다. 분비에 사용될 수 있는 적합한 신호 서열의 예로서는 α-메이팅인자, α-아밀라제, 클루코아밀라제 또는 인버타제의 신호서열이 있다.
그러나, 대장균 및 효모 이외에도, 재조합 아프로티닌 변형체의 제조를 위해 많은 다른 원핵 및 진핵 발현/분비계, 예를 들면 간균류(Bacilli), 포도상구균류(Staphylococci) 및 국균류(Aspergilli)를 사용할 수 있다.
상기 예시한 바와 같이, 다양한 원핵 및 진핵계 중에서 아프로티닌 뮤테인의 발현은 당업계에 알려져 있다.
이와 관련하여, 아프로티닌 변형체를 세포 내에서 축적된 형태가 아닌, 사용되는 계에 대해 고유한 분비 메커니즘을 이용하여 발효 배지 중으로 분비되는 활성 물질로서 공업적인 규모로 얻을 수 있을 경우 유익하다.
효모계를 사용할 경우, 분비 효모 단백질, 예를 들면 α-아밀라제, 글루코아밀라제, 인버타제 또는 α-메이팅인자의 신호 서열을 상기 목적을 위해서 유전 공학적 방법으로 아프로티닌 변형체의 N-말단에 융합시킨다.
아프로티닌 변형체의 N-말단의 신호 펩티드의 효소적 절단은 효모에 고유하며 특정 절단 서열(신호 펩티드의 C 말단)을 인식하는 효소에 의하여 막 통과 시에 일어난다(Review Article R.C. Das and J.L Schultz, Biotechn. Rrogress, 제3호, 제43-48페이지, 1987년 참조)
그러나, 효모 중에서 발현되는 천연 N-말단 아미노산 서열 Arg-Pro-Asp를 가지는 재조합 아프로티닌 변형체의 경우에 있어서, 상기 신호 펩티드의 부정확한 절단 때문에 분비된 물질은 융합된 신호 펩티드의 다양한 아미노산이 N-말단에 부가된 상태라는 것이 밝혀졌다. 정제에 적합하도록 균일하고 정확하게 프로세싱된 분비 생성물은 발견되지 못하였다.
또한, 부분적으로 또는 완전히 결함이 있는 분비 생성물의 프로세싱은 효모 고유의 분비 신호 서열과 융합된 생성물로서 발현된 다른 이종 단백질에 관하여 문헌에 기재되어 있다.(R.C Das 및 J.L Schultz, Biotechn. Progress, 제3호, 제43-48페이지, 1987년 ; P.J. Barr 등의 J. Biol. Chem., 제263호, 제16471-16478페이지, 1988년 참조)
놀랍게도, 본 발명자들은 유전 공학적으로 변형된, 예를 들면 아미노산 서열 2위치에서 아미노산 프롤린이 결실되거나 또는 Ala-(-2)-Gln-(-1)이 N-말단에 부가된 아프로티닌 변형체는 효모 중에서 높은 퍼센트로 정확하게 프로세싱됨을 최근에 발견하였다.
따라서, 본 발명은 아미노산 서열 2위치에서 아미노산 프롤린이 결실되거나 또는 알라딘-(-2)-글루타민-(-1)이 부가된 재조합 아프로티닌 또는 아프로티닌 변형체에 관한 것이다. 이 아프로티닌은 인간 또는 동물 유래의 아프로티닌일 수 있다.
구체적으로, 바람직한 아프로티닌 변형체는
으로 이루어진 군으로부터 선택된 것이다.
본 발명은 또한 상기한 아프로티닌을 1종 이상 함유하는 약물에 관한 것이다.
바람직한 아프로티닌은 상기한 치환 이외에도, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 34, 36, 37, 38, 39, 41, 42 및 52 위치 중 하나 이상이 치환된 것이다. 이러한 치환 및 그러한 각각의 위치에 존재할 수 있는 아미노산에 대한 좀더 상세한 내용은 유럽특허 출원 제238,993호, 동 제297,362호 및 동 307,592호에 기재되어 있다.
다음의 실시예에는 천연 아프로티닌과 비교하여 변형된 N-말단 아미노산 서열을 함유하는 재조합 아프로티닌 뮤테인을 유전 공학적으로 제조하는 방법을 설명한다. 또한, 효모 중에 α-메이팅인자 프리-프로-서열과의 융합 생성물로서 상기와 같은 아프로티닌 뮤테인의 발현 및 프로세싱된 분비 생성물의 정제 방법을 실시예로써 기재하였다 단리된 아프로티닌 변형체의 매우 균일할 N-말단 프로세싱 및 이들의 억제 특성에도 기재하고 있다.
[방법]
[효소 및 표준 기술]
분자 유전학적 실험을 위한 효소는 뵈링거 만하임(Boehringer Mannheim, 프랑스 소재), 그브코-비알엘(Gibco-BRL, 미합중국 소재) 및 파마시아(Pharmacia, 스웨덴 소재)사로부터 구입하였다.
분자 유전학적 실험을 위한 표준 기술, 예를 들면 대장균으로부터 플라스미드 DNA의 단리, 다양한 효소를 사용한 클로닝 실험을 위한 DNA 단편의 단리 및 연결은 문헌[마니에이트(Maniates) 등, Molecular Cloning, Cold Spring Harbor 출판사(1982)]에 기재된 방법을 사용하였다.
[DNA 합성]
아프로티닌 변형체 및 DNA 프라이머(직접 변이유발을 위함)를 제조하는데 필요한 DNA 블록은 어플라이드 바이오시스템즈(Appied Biosystems)사의 380A DNA 합성기를 사용하여 제조하였다. 탈보호시킨 DNA 올리고뉴클레오티드는 폴리아크릴 아미드 겔 전기영동 변성화와 같은 통상의 방법으로, 또는 트리틸 유도체로서 고압 액체 크로마토그래피(HPLC)를 사용하여 정제하였다.
[직접 변이유발]
특정 아미노산 코돈 또는 유전자 부분의 직접 변이유발은 변이유발 키트(Amerscham-Buchler사 제품, 주문번호 : PRN. 2322)를 사용하여 문헌[J.W. Taylor, J. Ott 및 F. Eckstein, Nucl. Acids. Res., 제13호, 제8764-8785페이지]의 방법에 의해 행하였다.
[DNA 서열화]
유전자 미 벡터 구조체의 DNA 서열을 확인하기 위하여 M13 벡터에 서브클로닝 시킨 단일 가닥 DNA를 문헌[생거(Sanger) 등, PNAS, 제74호, 제5463-5467페이지, 1977] 의 방법으로 서열화시켰다. 이중 가닥 DNA는 문헌[엠.호토리(M. Hattori)및 와이, 사카히(Y. Sakahi), Anal, Biochem. 제 152호, 제232-238페이지. 1986년]의 방법에 따라 서열화시켰다.
[맥주 효모(S. cerevisiae)의 형질 전환]
세포농도가 2x107/ml 인 균주 SC106(MAT-α, hom3, gal2, his6, ura3 ; 균일주 S2207A, 미합중국 94720 캘리포니아주 소재 University of Califonia Berkely 대학 부속 Yeast Genetics Stock Center로부터 구입가능)의 효모 세포 현탁액 100ml를 원심 분리시키고, 세포 침전물은 TE 완충액(10mM Tris x HCl , ph 7.5, 1mM EDTA) 5ml로 1회 세척한 후, LiA 완충액(TE 완충액 중의 0.1M 아세트산리튬) 5ml로 세척하였다. 이어서 세포를 LiA 완충액 1ml 중에 현탁시키고, 30℃에서 1시간 동안 배양시켰다.
플라스미드 용액 10μl (1 내지 5μg 의 DNA) 및 캐리어 DNA(청어정자로부터의 변성된 DNA, 3mg/ml) 15μl을 세포 현탁액 0.1ml에 첨가하였다. 30℃에서 30분 동안 배양시킨 후, 폴리프로필렌 글리콜(LiA 완충액 중의 40% 폴리프로필렌 글리콜 3350) 0.7ml를 첨가하고, 30℃에서 60분 동안 추가로 배양시켰다. 이어서, 세포를 42℃에서 5분 동안 열 쇼크(heat shock)시킨 후, 에펜도르프 마이크로퓨즈(Eppendorf microfuge) 중에서 4초 동안 원심 분리하였다. 세포 펠릿을 TE 완충액 5ml 씩으로 각각 2회 세척하고, 이어서 세포를 TE 완충액 0.1ml 중에 현탁시키고, 선택 영양 배지상에 플레이팅 시켰다. 형질전환체는 30℃에서 3일 동안 배양시킨 후 얻었다.
[형질전환체의 성장 및 분비 생성물의 분석]
형질전환체를 트레오닌, 메티오닌 및 히스티딘 (각각 20mg/리터의 농도)이 보강된 SD 배지(아미노산이 없는 0.67% 효모 질소 염기, 2% D-글루코오스)중에서 배양시켰다. 세포 밀도가 충분한 상태(통상적으로 5x109 세포 /ml 농도)에 도달한 후에, 세포를 원심분리하고, 배양 상징액 중의 트립신 및 엘라스타제 억제 활성도를 측정하였다.
[10리터 규모로 사용한 재조합 아프로티닌 변형체의 발현을 위한 효모 형질변환제의 발효]
다음의 배지를 사용하였다.
상기 성분들은 탈이온수에 용해시키고, pH는 5.5로 조정하였다. 영양 용액은 121℃에서 20분 동안 멸균시켰다. 글루코오스는 탈이온수 필요량의 1/5 중에 용해시키고, 각각을 멸균시킨 후, 냉각시키고, 영양 용액과 합하였다.
종균 배양액 : 효모 형질전환제를 냉장고 중의 SD 플레이트(SD 배지 2% 한천) 상에서 4주 이하 동안 유지하였다. 장기간 저장용은 액체 질소 중에서 보관하였다.
예비 배양액 : 예비 배양액은 1리터용 진탕 플라스크(내용물 부피 : 100ml)중의 SD2 영양 용액 중에서 제조하였다. 이 플라스크를 SD 종균 플레이트로부터 단일 집락으로써 접종하고, 28℃의 진탕기에서 280rpm으로 2 내지 3일 동안 진탕시키면서 배양하였다.(진탕기 회전 직경 :2.5 또는 5.0 cm)
[10 리터 발효]
10리터 발효물은 예비 배양 배지 약 200ml를 현탁시킨 1.0 리터 예비 배양액으로부터의 세포 침전물로 접종시켰다. 발효 조건은 SC6 영양 용액, 28℃, 교반 속도 600rpm, 공기 공급 속도 0.5vvm, 2.5N NaOH 및 2.5N H2SO4를 사용하여 pH 조절한 것이었다.
[영양물 공급]
배양액의 글루코오스를 연속적으로 공급하고, 하루에 한번 디프코 효모 추출물을 공급하였다.
글루코오스 용액 : 1000ml 전체 부피 중의 글루코오스 500g를 접종 후 4시간부터 시작하여 0.02ml/리터 X 분의 속도로 공급하고, 10 내지 20시간 후에는 그 공급 속도를 0.1ml/리터 X 분으로 증가시켰다. 글루코오스 도입 속도는 호흡량이 1을 넘지 않도록 선택하였다.
디프코 효모 추출물(Difco yeast extract) : 효모 추출물을 하루에 1회 5g/리터의 양으로 첨가하였다. 효모 추출물을 탈이온수 중에 현탁액으로 제조하였다.
글루코오스 및 효모 추출물 용액을 121℃에서 20분 동안 멸균하였다.
상기 조건하에서 96시간 동안 발효시킨 후 세포 건조 중량은 약 30g/리터에 도달하였다. 얻은 생성물의 수득량은 6g/리터 이었다.
[폴리아크릴아미드 겔 전기영동]
단백질을 통상적으로 SDS 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(Laemmli, Nature, 제277호, 제680페이지, 1970년)으로 검출하고 쿠마스 브릴리언트 블루(Coomassie Briliant Blue)로 염색하였다
[아미노산 분석]
단백질 약 1nmol을 6M MCl 200 μl 및 0.05% β-메르캅토에탄올의 존재하에 진공하의 110℃에서 22시간 동안 배양시켰다. 가수분해물을 건조시키고, pH 2.2 인 0.2M 시트르산나트륨 완충액 150μl 중에 용해시키고, 여과시켰다. 아미노산 분석은 형광 검출기 및 시마다주(Shimadzu) C-R2AX 적충기를 갖춘 바이오트로닉(Biotronic) LC 5000 아미노산 분석기 중에서 행하였다. 아미노산은 다음 문헌에 기재된 바와 같이 프탈알데히드와 반응시킨 후 정량하였다. (Benson Hare, Proc. Natl. Acad. Sci. USA,. 제72호, 제619페이지, 1975년)
[아미노산 서열화]
단백질 1내지 2nmol을 트리플루오로아세트산 30μl 중에 용해시킨 후, 폴리브렌 처리 유리 섬유 여과기에 적용하고, 문헌[훼익(Hewick) 등, J. Biol. Chem., 제256호, 제7990페이지, 1981]의 방법에 의해 가스상 서열화기(어플라이드 바이오스시템즈사 제품)중에서 서열화하였다. 페닐티오히단토인 유도체를 분리하고, 문헌[베이레유더(Beyreuther) 등, Modern Methods in Protein Chemistry, 제303-325페이지, Berlin(1983)]에 기재된 바와 같이 시아노 HPLC 컬럼(DuPont 사제품) 및 HPLC 시스템(Waters 사 제품)을 사용하여 분석하였다.
[트립신 억제 분석]
트립신 활성은 문헌[케이거(Geiger) 및 프리쯔(Fritz) 등, Methods of Enzymatic Analysis, 제V권, 제3판, Bergmeyer(ed), Verlag Chemie, Weinheim(1984), 제121페이지]에 기재된 방법에 의해 기질로서 벤조일-L-아르기닌P - 니트로아닐리드를 사용하여 결정하였다. 분비된 P-니트로아닐린을 405nm에서 분광계로 측정하였다. 효소 및 억제제는 기질을 첨가하기 전에 15분 동안 예비 배양시켰다.
[엘라스타제 억제 분석]
인간 백혈구 엘라스타제는 엘라스틴 프로덕츠 캄파니, 인크. 사[Elastin Products Company, Inc., P.O.Box 147, Pacific, Miss. 63069/USA 소재]로부터 구입하였다. 사용한 기질은 MeO-Suc-Ala-Ala-Pro-Val-pNA(Bachem, Bubendorf/Switzerland)이었다. 분석 조건은 표3에 나타냈다. 일반적으로, 억제제 시료분석은 분석 완충액으로 희석시키고 기질을 첨가한 후(0.1M 농도 중의 DMSO 중에 용해시키고, 보존 용액의 농도에 완충액으로 조정하였음) 시작하였으며 기질로부터의 p - 니트로아닐린의 분비는 405nm에서 연속적으로 측정하였다. 100% 값은 억제제 없이 대응하는 분석에서 결정한 것이었다. 억제율(%)은 다음의 방정식으로 계산하였다.
[실시예 1]
Val-15-Leu-17-, DePro-2-Val-15-Leu-17-. DePro-2-Arg-15-, DePro-2-Val-15-Leu-17-Arg-19 및 DePro-2-Arg-15-Ala-17- 아프로티닌 유전자의 작제 및 클로닝 대장균-효모 셔틀 벡터 pMT 15(제1도)의 유도체를 효모 중 아프로티닌 뮤테인을 클로닝 하는데 사용하였다.
벡터 pMT 15는 대장균에 대해 선택적인 마커로서 암피실린 내성 유전자 및 효모에 대한 URA3 유전자 단편을 함유한다. 대장균 및 효모 중의 복제를 위해 pBR322 유래의 Co1 E1 복제 기원 및 효모로부터의 2μ 플라스미드 B형 DNA 단편을 사용하였다. 이종유전자의 발현을 위해서, MTA 1-α 프로모터 및 α-인자 단백질 전구물질의 N-말단 프리-프로-서열에 대한 코딩 영역을 플라스미드 pCY 17로부터의 Eco RI - Hind III 단편중에 함유시켰다(Korjan and Herskowitz, cell, 제30호, 933페이지, 1982년 참조)
α-인자 프리-프로-서열의 하류에 벡터 pMT 15는 효모로부터의 URA3 유전자의 Bam HI-Sal I 단편을 함유하며, 이 단편은 전사 테이네이터 기능을 갖는다(Yarger 등, Mol. Cell. Biol. 제8호, 제1095페이지, 1986년 참조)
α-인자 프리-프로-서열의 코딩 영역을 운반하는 pMT 15의 235 bP PstI-Hind III 단편을 벡터 M13-mp18 중에 클로닝시키고, 올리고뉴클레오티드 프라이머 5'-GAA GAA GGG GTA TTG AAA AGA-3를 사용하여 직접 변이유발시켰다. 변이 유발은 α-인자 프리-프로-서열의 81 위치에서 TCT를 AGC로 변화시킴로써 세린코돈을 변화시킨 것이며, 이 변화로 인하여 Hind III 제한 절단부위가 생겼다(제2도). 이러한 213 bp Pst I-Hind III 단편으로 pMT 15 중의 235bp PstI-Hind III 단편을 치환시켰다. 이러한 방법으로 변형시킨 플라스미드는 pS 580으로 명명하였으며, 이 플라스미드는 KEX2 프로세싱 부위로서 Lys-Arg-Glu-Ala-Glu-Ala 대신에 Lys-Arg에 대한 코딩 서열을 함유한다(제3도).
pS 580 중에서 α-인자 프리-프로-서열과 융합에는 pS 580 중에서 α-인자 프리-프로-서열의 마지막 5개 코돈에 의하여 5' 말단에서 Hind III 절단 부위까지 확장된 합성 Val-15-Leu-17-아프로티닌 유전자를 사용하였다.(제4도)
변형된 Val-15-Leu-17-아프로티닌 유전자는 pS 580의 개환 Hind III-BamHI 절단 부위중에 혼입시켰다. 이 방식으로, α-인자 프리-프로 서열의 3' 말단은 Lys-Arg 프로세싱 부위로 재구성하였으며, Val-15-Leu 17-아프로티닌과 함께 리딩프레임 융합제를 생성하였다(제5도).
이와 같이 얻은 pS 580 유도체는 pS 604로 명명하였다.
Val-15-Leu 17-아프로티닌의 2 위치에서 아미노산 프롤린을 제거하기 위하여, 5' 말단에서 α-인자 프리-프로-서열의 융합된 아프로티닌 뮤테인을 pS 604로부터 Hind III-Bam HI 카세트로서 단리하여 변이유발 벡터 M13-mp18 중에 클로닝시켰다.
아미노산 서열 2 위치에서 프롤린 코돈을 결실시키기 위해서 다음의 합성 변이유발 프라이머 5'- AGC TTG GAT AAA AGA CGT GAC TTC TGC CTC GAG CCG CCG TAC ACT GGG CC-3'를 제1의 변이유발 싸이클 중에 사용하였다.
Val-15-Leu 17-아프로티닌 유전자의 2위치에서 프롤린 코돈의 결실 여부는 DNA 서열화에 의해 확인하였다.
DePro-2-Arg-15-아프로티닌 유전자를 자제하기 위하여 M13-mp18 변이유발화 벡터 중에 클로닝시킨 DePro-2-Val-15-Leu 17-아프로티닌 유전자에 제2변이유발 사이클을 수행하였다.
다음의 변이유발 프라이머,
Val-15의 Arg-15에 의한 치환 및 Leu 17의 Arg-17에 의한 치환을 DNA 서열화에 의해 확인하였다.
이어서, 두 가지 재조합 아프로티닌 뮤테인은 셔틀 벡터 pS 580의 Hind III-Bam HI 절단 부위 중에 혼입시킴으로써 α-인자 프리-프로 서열에 융합시켰다. pS 580 유도체는 pS 707(DePro -2-Val-150 -Leu 17-아프로티닌 함유) 및 pA 202(DePro -2-Arg-15-아프로티닌 함유)로 명명하였다.
뮤테인 DePro-2-Val-15-Leu-17-Arg-19-아프로티닌(벡터 pS 773) 및 DePro-2-Arg-15-Ala-17-아프로티닌(백터 pA 206)을 제조하고, 상기와 같은 방법으로 클로닝시켰다.
[실시예 2]
Ala(-2)-Gln(-1)-Val-15-Leu-17-, Ala(-2)-Gln(-1)-Arg-15,Ala
(-2)-Gln(-1)-Val-15-Len-17-Arg-19-및 Ala(-2)-Gln(-1)-Arg-15-Ala-17-아프로티닌에 대한 유전자의 작제
디펩티드 Ala-Gln을 상기한 아프로티닌 뮤테인의 N-말단 상에 유전공학적으로 부가하기 위하여, M13 변이유발 벡터 중에 클로닝시킨 DePro-2-Val-15-Leu-17-아프로티닌 및 DePro-2-Arg-15-아프로티닌에 대한 유전자를 다음의 DNA 프라이머,
를 사용하여 다른 변이유발 싸이클을 수행하였다.
5'말단에서 변형된 2개의 아프로티닌 뮤테인의 DNA 서열은 DNA 서열화에 의해 확인하였다.
Ala(-2)-Gln(-1)-Val-15-Leu-17-아프로티닌 유전자 및 Ala(-2)-Gln(-1)-Arg-15 아프로티닌 유전자는 상기 실시예 1과 유사한 방법을 사용하여 효모 셔틀벡터 pS580 중에 클로닝 시켰다.
클로닝된 아프로티닌 뮤테인 Ala(-2)-Gln(-1)-2-Val-15-Leu-17-아프로티닌 및 Ala(-2)-Gln(-1)-Arg-15-아프로티닌을 함유하는 pS 580 유도체는 각각 pS744 및 pA 204로 명명하였다.
뮤테인 Ala(-2)-Gln(-1)-Val-15-Leu-17-Arg-19-아프로티닌(벡터 pS 774) 및 Ala(-2)-Gln(-1)-Arg-15-Ala-17-아프로티닌(벡터 pA 207)을 구성하고, 상기와 같은 방법으로 클로닝 시켰다.
[실시예 3]
효모 중의 재조합 아프로티닌 변형체의 발현
효모 균주 SC 106을 상기 방법에 의하여 플라스미드 벡터 pS 604, pS 707, pS 744, pS 773, pS 774, pA 202, pA 204 및 pA 207로 형질전환시켰다.
URA 3+ 효모 형질전환체를 단리하고, 유도 조건(상기 방법 참조)하에서 배양시켰다. 수율을 측정하기 위하여, 발현된 아프로티닌 뮤테인이 15 위치에 발린 및 17 위치에 로이신을 가지는 경우에 배양 상징액을 엘라스타제 억제 활성에 대해 시험하였다. 발현될 아프로티닌 뮤테인이 15 위치에서 아르기닌을 가지는 경우, 상기 트립신 억제 분석을 행하였다. 이어서, 10 리터 발효물 중에 분비된 아프로티닌 뮤테인의 발현 생성물을 정제하고 특성화하였다.
[실시예 4]
재조합 아프로티닌 변형체의 정제
10 리터 배치로부터의 발효액을 9000 rpm(15 내지 30 분)으로 원심분리하였다. 상징액을 다양한 필터(8-0.2㎛)를 통해 여과시키고, 물을 사용하여 전도도 7.5mS 까지 희석시키고, 시트르산으로 pH 3으로 조정하였다. 이와 같은 방법으로 예비 처리된 시료를 50mM 시트르산나트륨(pH 3) 중에서 S-세파로스 패스트 플로우(S-Sepharose Fast Flow, 파마시아사 제품) 100 내지 200 ml 와 혼합하고, 30 내지 60분 동안 교반하였다 이어서, 겔을 50mM 시트르산나트륨(pH 3), 50mM TRIS HCl(pH9) 및 20 mM HEPES(pH6) 1 내지 5 리터로 연속 세척하였다. 이 세척한 겔을 적합한 컬럼 중으로 옮기고, 용출시키고, 20mM HEPES(pH 6) 중의 0내지 1m 사이의 염화나트륨 농도 구배를 사용하여 BIO-PILOT 시스템(마파시아사 제품)으로 분별증류하였다. 인간 백혈구 엘라스타제 또는 소의 트립신을 사용한 억제 분석에서 억제 활성도를 결정한 후, 적절한 분획물을 모으고, 회전 증발기 중에서 농축시켰다.
이 물질을 세파넥스 G-50 수퍼파인(Sephadex G-50 Superfine, 파마시아사 제품)상에서 겔 여과하고, 20mM HEPES (pH 6) 중의 S-세파로스 패스트 플로우 또는 S-세파로스 HP 또는 모노(Mono) S(파마시아 제품) 상에서 크로마토그래프를 행하여 좀더 정제하였다. 0 내지 1M 사이의 NaCl 농도 구배를 사용하여 S-세파로스로부터 용출시켰다. 분획물을 겔 전기영동 및 적절한 억제 분석으로 체크하였다 억제 활성도를 가지는 분획물을 모으고, 0.1M NH4HCO3에 대해 투석시키고, 동결 건조하였다.(제6도)
발효 배지 중에 존재하는 억제제 양을 기준으로 전형적인 20 내지 40%의 수율로 얻었다.
[실시예 5]
실시예 4의 방법으로 얻은 억제제의 특성화
동결건조물을 아미노산 분석(제7도) 및 N-말단 서열화(어플라이드 바이오시스템즈사 서열측정기를 사용)(제8도)에 의해 초기에 특징지웠다.
Val-15-Leu-17-아프로티닌의 경우, 이러한 아프로티닌 변형체 (정확한 프로세시)의 N-말단에서 정확하게 절단된 분비 물질을 발견하지 못하였다. 이와는 반대로, 2 위치에서 결실되거나 또는 N-말단 확장 Ala(-2)-Gln-(-1)을 가지는 아프로티닌 변형체는 정확한 N-말단 프로세싱된 (제8도 및 제9도) 것이 70 내지 90%이었음을 발견하였다.
또한, 억제 역학은 인간 백혈구 엘라스타제 또는 돼지 췌장 칼리크레인(제10도)을 사용하여 측정하였다. 이러한 측정으로부터 N-말단에서의 변화는 억제 특성에 아무런 영향도 미치지 않음이 밝혀졌다.
Claims (6)
- 2위치에서 아미노산 프롤린이 결실되거나 또는 알라닌-(-2)-글루타민-(-1)이 부가된 것을 특징으로 하는 아프로티닌.
- 제1항에 있어서, 아프로티닌이 인간 또는 동물 유래인 것을 특징으로 하는 아프로티닌.
- 제1항 또는 2항에 있어서, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 34, 36, 37, 38, 39, 41, 42 및 52 위치중 하나 이상에 추가에 변화를 갖는 것을 특징으로 하는 아프로티닌.
- DEPro-2-Val-15-Leu-17, DePro-2-Val-15-Leu-17-Arg-19, Ala(-2)-Gln(-1)-Val-15-Leu-17, Ala(-2)-Gln(-1)-Val-15-Leu-17-Arg-19, DePro-2-Arg-15, DePro-2-Arg-15-Ala-17, Ala(-2)-Gln(-1)-Arg-15 및 Ala(-2)-Gln(-1)-Arg-15-Ala-17의 군으로부터 선택된 아프로티닌 변형체.
- 제1항 내지 4항 중 어느 한 항의 아프로티닌 변형체를 코딩하는 DNA 서열을 함유하는 벡터를 사용하여 효모, 대장균(E. coli), 간균(Bacilli), 포도상구균(Staphylococci) 또는 국균(Aspergilli)을 형질전환시키고, 이 형질전환체를 배양하고, 아프로티닌 변형체를 배양액으로부터 정제하는 것을 특징으로 하는, 제1항 내지 4항 중 어느 한 항에 기재된 아프로티닌 변형체의 제조 방법.
- 제5항에 있어서, 형질전환되어 배양되는 효모가 맥주 효모균(S. cerevisaie)인 것을 특징으로 하는 방법.
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