DE69003595T2

DE69003595T2 - Mikroproteine, Verfahren zur Herstellung derselben und Anwendung dieser Mikroproteine als Arzneimittel.

Info

Publication number: DE69003595T2
Application number: DE90401432T
Authority: DE
Inventors: Bertrand Castro; Anne Favel; Dung Le-Nguyen Dung Le-Nguyen; Maria-Antonia Previero
Original assignee: Roussel Uclaf SA
Current assignee: Sanofi Aventis France
Priority date: 1989-05-31
Filing date: 1990-05-30
Publication date: 1994-02-17
Anticipated expiration: 2010-05-31
Also published as: EP0401109B1; EP0401109A1; JPH0368599A; ATE95195T1; US5089474A; FR2647677A1; ES2060100T3; FR2647677B1; DE69003595D1; CA2017803A1

Description

Die vorliegende Anmeldung betrifft Mikroproteine, Verfahren zu ihrer Herstellung und die Verwendung dieser Mikroproteine als Medikament.
Man weiß, daß die Samen von Ecballium elaterium, die allgemeiner unter dem Namen "Cornichon Sauteur" bekannt sind, eine sehr wichtige Quelle für Proteine, die Proteinasen inhibieren, sind. So hat man insbesondere aus diesen Samen ein Mikroprotein, das unter dem Namen EETI II (Ecballium elaterium Trypsin Inhibitor II) bekannt ist und die folgende Struktur besitzt:
isoliert.
(- Protease inhibitors from Ecballium Elaterium seeds. A. Flavel, H. Mattras, M.A. Coletti-Previero, R. Zwilling, E.A. Robinson & Castro. International Journal of Peptide Protein Research.
- 1H 2D NMR and Distance Geometry of the folding of Ecballium elaterium, a member of the squash inhibitor family. A. Heitz, L. Chiche, D. Le-Nguyen & B. Castro, Biochemistry, (1989) 28, p. 2392, 2398)
Die verwendete Nomenklatur entspricht der IUPAC-IUB- Kommission (1984), European J. Biochem 183, 9-37.
Dieses Mikroprotein, das 28 Aminosäurereste, 3 Disulfidbrücken und 5 Glycinreste besitzt, zeigt insbesondere die Eigenschaft, Trypsin zu inhibieren.
Im Versuch, bestimmte Aminosäurereste dieses Mikroproteins durch andere Aminosäuren auszutauschen, hat die Anmelderin auf synthetischem Weg neue Mikroproteine hergestellt, bei denen die Anti-Trypsinaktivität von EETI II zugunsten einer Anti-Elastaseaktivität sowohl gegen die Rinder- Pankreas-Elastase als auch gegen die menschliche Leucocyten- Elastase verschwunden ist. Diese Produkte sind u.a. deshalb von Interesse, da sie vollsynthetisch in großen Mengen hergestellt werden können.
Gegenstand der vorliegenden Anmeldung sind somit neue Mikroproteine aus 28 Aminosäuren der allgemeinen Formel (I):
worin:
- X in Position 4 für einen Valin-, Leucin-, Isoleucin-, Norleucin-, Alanin-, Cyclohexylalanin-, o-Methylthreonin-, Phenylglycin-, α-Aminobuttersäure oder Argininrest steht,
- Y in Position 5 für einen Isoleucin- oder Serinrest steht,
- Z in Position 7 für einen Methionin oder Norleucinrest steht, mit der Maßgabe, daß, Z für einen Norleucinrest steht, wenn X für einen Argininrest steht.
Unter den vorstehend definierten Mikroproteinen sind insbesondere diejenigen zu berücksichtigen, die dadurch gekennzeichnet sind, daß Y in Position 5 für einen Isoleucinrest steht, X in Position 4 und Z in Position 7 wie vorstehend definiert sind.
Unter den zuletzt genannten sind bevorzugt die Mikroprotein zu erwähnen, worin Z in Position 7 für einen Norleucinrest steht, sowie diejenigen, worin X in Position 4 für einen Valin-, Alanin- oder Norleucinrest steht.
Unter den erfindungsgemäßen bevorzugten Mikroproteinen sind ganz besonders diejenigen zu erwähnen, worin:
- X in Position 4 für einen Valinrest, Y in Position 5 für einen Isoleucinrest und Z in Position 7 für einen Norleucinrest steht,
- X in Position 4 für einen Alaninrest steht, Y in Position 5 für einen Isoleucinrest steht und Z in Position 7 für einen Methioninrest steht,
- X in Position 4 für einen Norleucinrest steht, Y in Position 5 für einen Serinrest steht, und Z in Position 7 für einen Methioninrest steht.
Gegenstand der Erfindung ist ebenso ein Verfahren zur Herstellung der vorstehend definierten Mikroproteine, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man eine Festphasensynthese durchführt, wobei man schrittweise auf einem vernetzten Oxymethylpolystyrolharz die ordnungsgemäß geschützten Aminosäuren unter Verwendung eines Kupplungsmittels einführt, die so gebildetete Peptidkette von dem Harz freisetzt und die Schutzgruppen der Aminosäuren abspaltet, anschließend 3 Disulfidbrücken schließt, um das gewünschte Mikroprotein zu erhalten.
Unter den bevorzugten Durchführungsbedingungen ist das vorstehend beschriebene Verfahren dadurch gekennzeichnet, daß
- das vernetzte Oxymethylpolystyrolharz ein Harz vom "Boc- Gly-CM-Typ" ist, worin Boc eine tert.-Butyloxycarbonylgruppe ist, Gly eine Glycingruppe ist, und CM vernetztes Oxymethylpolystyrol bedeutet,
- das Kupplungsmittel BOP oder (Benzotriazol-1- yloxy)tris(dimethylamino)phosphoniumhexafluorphosphat ist,
- die Freisetzung der Peptidkette von dem Harz sowie die Abspaltung der Schutzgruppen der Aminosäuren mittels Fluorwasserstoffsäure bei einer tiefen Temperatur durchgeführt wird.
Die erfindungsgemäßen Mikroproteine besitzen sehr interessante pharmakologische Eigenschaften. Es ist insbesondere eine beachtliche Anti-Elastaseaktivität sowohl gegen die Rinder-Pankreas-Elastase als auch gegen die menschliche Leucocyten-Elastase festzustellen. Die Anti-Trypsinaktivität dieses Produkts ist im Gegensatz dazu verschwunden.
Diese Eigenschaften werden nachstehend im experimentellen Teil näher erläutert.
Diese Eigenschaften rechtfertigen die Verwendung der neuen Mikroproteine der vorstehenden Formel (I) als Medikamente.
Gegenstand der Erfindung ist somit ebenso die Verwendung der neuen Mikroproteine, die durch die vorstehende allgemeine Formel (I) definiert sind, als Medikamente.
Unter den erfindungsgemäßen Medikamenten sind insbesondere die Medikamente zu erwähnen, die dadurch gekennzeichnet sind, daß sie aus den neuen Mikroproteinen der vorstehenden allgemeinen Formel (I), worin Y in Position 5 für einen Isoleucinrest steht, X in Position 4 und Z in Position 7 wie vorstehend definiert sind, bestehen.
Unter den zuletzt genannten sind insbesondere die Medikamente zu erwähnen, die die vorstehend definierten Mikroproteine, worin Z in Position 7 für einen Norleucinrest steht sowie worin X in Position 4 für einen Valin-, Alanin- oder Norleucinrest steht, enthalten.
Unter den bevorzugten erfindungsgemäßen Medikamenten sind ganz besonders diejenigen zu erwähnen, die Mikroproteine, worin:
- X in Position 4 für einen Valinrest steht, Y in Position 5 für einen Isoleucinrest steht, und Z in Position 7 für einen Norleucinrest steht,
- X in Position 4 für einen Alaninrest steht, Y in Position 5 für einen Isoleucinrest steht, und Z in Position 7 für einen Methioninrest steht,
- X in Position 4 für einen Norleucinrest, Y in Position 5 für einen Serinrest, und Z in Position 7 für einen Methioninrest steht, enthalten.
Diese Medikamente finden beispielsweise in der Pulmologie bei der Behandlung von Emphysemen, Pneumonien, Bronchitis, Lungenstörungen, die durch Tabakgebrauch oder Luftverschmutzung verursacht wurden, in der Kardiologie bei der Behandlung der Atherosklerose, in der Rheumatologie, bei der Behandlung von Arthritis ebenso wie beispielsweise in der Dermatologie bei der Behandlung von Psoriasis, Verbrennungen, Bullosen und bei der Alterung der Haut, in der Gastroenterologie, bei der Behandlung von akuter Pankreatitis und allgemein bei der Behandlung aller Erkrankungen, deren Ursache eine Elastase-Fehlfunktion ist, Anwendung.
Die übliche Dosis, die nach dem verwendeten Produkt, den behandelten Patienten und der ursächlichen Erkrankung variiert, kann beispielsweise 1 bis 300 mg pro Tag intravenös beim Menschen betragen.
Gegenstand der Erfindung sind auch pharmazeutische Präparate, die mindestens ein vorstehend genanntes Derivat als Wirkstoff enthalten.
Als Wirkstoff können die Mikroproteine der allgemeinen Formel (I) in pharmazeutische Präparate, die auf dem Weg über die Verdauung, parenteral oder topisch verabreicht werden sollen, eingearbeitet sein.
Diese pharmazeutischen Präparate können beispielsweise fest oder flüssig sein und in gegenwärtig in der Humanmedizin verwendeten pharmazeutischen Formen vorliegen, wie beispielsweise einfache oder dragierte Tabletten, Gelatinekapseln, Kapseln, Granulate, Suppositorien, injizierbare Präparate, Salben, Aerosole; sie werden nach üblichen Verfahren hergestellt. Der bzw. die Wirkstoff/Wirkstoffe kann bzw. können in üblicher Weise in in diesen pharmazeutischen Präparaten verwendete Excipientien eingearbeitet sein, wie beispielsweise Talk, Gummi arabicum, Lactose, Stärke, Magnesiumstearat, Kakaobutter, wäßrige oder nichtwäßrige Träger, Fette tierischen oder pflanzlichen Ursprungs, Paraffinderivate, Glykole, diverse Weichmacher, Dispergiermittel oder Emulgatoren, Konservierungsstoffe.
Es werden nun nichtbeschränkende Ausführungsbeispiele der Erfindung angegeben.

Beispiel 1: Val-4-, Nle-7-Derivat

Stufe A: Verknüpfung der Peptidkette

Es wird das Festphasensyntheseverfahren an einem vernetzten Oxymethylpolystyrolharz (nachstehend CM-Harz) verwendet. Es wird ein Harz vom Typ "Boc-Gly-CM-Harz" verwendet, worin Boc eine tert.-Butyloxycarbonylgruppe bedeutet, Gly eine Glycingruppe bedeutet, und CM-Harz ein vernetztes Oxymethylpolystyrolharz bedeutet.
Ein Harz mit 0,4 mMol Gly/g wurde nach dem Cesiumsalzverfahren nach der von GISIN, BF (1973) Helv. Chim. Acta 56, 1476-1482 beschriebenen Technik hergestellt.
Es wurden die folgenden Schutzgruppen für die Aminosäuren verwendet:
- p-Methoxybenzyl für Cystein,
- Cyclohexylester für Asparagisäure,
- Xanthyl für Aspargins und Glycin,
- Tosyl für Arginin,
- Benzyl für Serin,
- o-Chorbenzyloxycarbonyl für Lysin,
- Methionin wird nicht geschützt.
Die Kupplungsreaktion wurde unter Verwendung von BOP Benzotriazol-1-yloxytris(dimethylamino)phosphoniumhexafluorphosphat durchgeführt.
Ein Kupplungszyklus kann wie folgt zusammengefaßt werden:

Abschaltung der Schutzgruppe:

1. Waschen mit 30%iger Trifluoressigsäure in Dichlormethan, 1 min.
2. Abspaltung der Schutzgruppe mit 30%iger Trifluoressigsäure in Dichlormethan, 30 min.
3. Waschen mit 3 % Ethandithiol in Isopropanol, einmal.
4. Waschen mit Dichlormethan, zweimal.

Kupplung:

1. Zugabe des Boc-Aminosäurekomplexes und BOP.
2. Zugabe von Diisopropylethylamin (4 Äquivalente), anschließend des Lösungsmittels (Dichlormethan oder Dimethylformamid) unter Rühren.
3. Nach negativer Ninhydrinreaktion zweimaliges Waschen mit Dichlormethan.
Zur Acylierung wird das Harz mit einem Gemisch (Essigsäureanhydrid/Dichlormethan) (50/50 Vol/Vol) 15 min lang behandelt.
Da das Methionin nicht geschützt ist, wird die zuletzt genannte Boc-Gruppierung durch Trifluoressigsäure vor der Behandlung mit Fluorwasserstoffsäure entfernt, um eine tert.-Butylierung zu vermeiden.
Ausgehend von 3 g "Boc-Gly-CM-Harz" werden so bei manuellem Vorgehen 9,5 g des Komplexes geschützte Peptidkette-Harz erhalten, den man direkt in der nächsten Stufe einsetzt.

Stufe B: Freisetzung des Komplexes geschützte Peptidkette-Harz

Man setzt 3 g des Komplexes geschützte Peptidkette-Harz 60 min lang mit 30 ml Fluorwasserstoffsäure bei 0ºC in Gegenwart von Anisol (3 ml) und Dimethylsulfid (1 ml) um. Das Harz wird mit Ether gewaschen; das Rohpeptid wird mit einer 20%igen waßrigen Essigsäurelösung extrahiert. Nach Lyophilisation werden 1,1 g Rohprodukt (nicht zyklisiert) erhalten, das direkt in der nachfolgenden Stufe verwendet wird.

Stufe C: Zyklisierung und Reinigung

Es werden 400 mg des vorstehend erhaltenen Rohpeptids in 350 ml Wasser aufgelöst, heftig gerührt und mit Diisopropylethylamin bis zu einem pH-Wert von 8 versetzt (ein Tropfen des Gemisches wird stündlich entnommen und mit einem Tropfen einer Lösung aus Dithiobis(2-nitrobenzoesäure) in einem molaren K&sub2;HPO&sub4;-Puffer (pH 8) versetzt, um die Oxidationsreaktion zu verfolgen). Während der ganzen Reaktion wird der PH-Wert durch Zugabe von Diisopropylethylamin bei 8 gehalten.
Nach 50 h wird das Fehlen einer Gelbfärbung im Dithiobis(2-nitrobenzoesäure)-Test festgestellt.
Das Produkt wird mittels Hochleistungsflüssigkeitschromatografie (HPLC) auf einer Whatman-M20 OD&sub3;-Säule gereinigt und durch eine CH&sub3;CN/H&sub2;O-Lösung mit 0,1 % Trifluoressigsäure eluiert.
Die erhaltene Fraktion wird lyophilisiert, und schließlich werden 40 mg des gewünschten Produkts erhalten.
Die Aminosäurezusammensetzung ist in der nachstehenden Tabelle I wiedergegeben:

Beispiele 2 bis 9:

Indem man wie in Beispiel 1, aber mit anderen Aminosäuren vorgeht, werden 8 andere Derivate hergestellt, die in der nachstehenden Tabelle I angegeben sind.
Die Aminosäurezusammensetzungen sind ebenfalls in der Tabelle I angegeben. Tabelle I Produkt der Beispiele

Beispiel 10:

Es wird eine injizierbare Lösung der folgenden Formulierung hergestellt:
- Produkt gemäß Beispiel 1 1 mg
- Excipiens: steriles Wasser 2 ml

Beispiel 11:

Es werden Tabletten entsprechend der folgenden Formulierung hergestellt:
- Produkt gemäß Beispiel 1 2 mg
- Excipiens q.s.p. für eine Tablette zu 150 mg (Zusammensetzung des Excipiens: Lactose, Stärke, Talk, Magnesiumstearat).

Beispiel 12:

Es wird eine Salbe entsprechend der nachstehenden Formulierung hergestellt:
- Produkt gemäß Beispiel 1 10 mg
- Excipiens q.s.p. 100 mg

Untersuchung der Anti-Elastasewirkung

Die Anti-Elastasewirkung wurde durch spektrofotometrische Bestimmung gegenüber Rinder-Elastase und gegenüber menschlicher Leucocyten-Elastase bestimmt (gemäß einer der von Delmar et Tolia Biochem., 19, 468, 1980 beschriebenen analogen Technik). Produkte Beispiele Elastase Menschliche Leucocytenelastase

Claims

1) Mikroproteine mit 28 Aminosäuren der allgemeinen Formel (I)

worin

- X in Position 4 für einen Valin-, Leucin-, Isoleucin-, Norleucin-, Alanin-, Cyclohexylalanin-, O-Methylthreonin-, Phenylglycin-, α-Aminobuttersäure- oder Argininrest steht,

- Y in Position 5 für einen Isoleucin- oder Serinrest steht,

- Z in Position 7 für einen Methionin- oder Norleucinrest steht, mit der Maßgabe, daß Z für einen Norleucinrest steht, wenn X für einen Argininrest steht.

2) Mikroproteine nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß Y in Position 5 für einen Isoleucinrest steht, X in Position 4 und Z in Position 7 wie vorstehend definiert sind.

3) Mikroproteine nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichet, daß Z in Position 7 für einen Norleucinrest steht.

4) Mikroproteine nach einem der Ansprüche 1, 2 oder 3, dadurch gekennzeichet, daß X in Position 4 für einen Valin-, Alanin- oder Norleucinrest steht.

5) Mikroproteine nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß X in Position 4 für einen Valinrest steht, Y in Position 5 für einen Isoleucinrest steht, und Z in Position 7 für einen Norleucinrest steht.

6) Mikroproteine nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß X in Position 4 für einen Alaninrest steht, Y in Position 5 für einen Isoleucinrest steht, und Z in Position 7 für einen Methioninrest steht.

7) Mikroproteine nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichet, daß X in Position 4 für einen Norleucinrest steht, Y in Position 5 für einen Serinrest steht, und Z in Position 7 für einen Methioninrest steht.

8) Verfahren zur Herstellung der neuen in Anspruch 1 definierten Mikroproteine, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Festphasensynthese durchführt, indem man stufenweise an einem vernetzten Oxymethylpolystyrolharz die geeigneterweise geschützten Aminosäuren unter Verwendung eines Kupplungsmittels einführt, die so gebildete Peptidkette von dem Harz freisetzt und die Schutzgruppen von den Aminosäuren abspaltet, anschließend die 3 Disulfidbrücken zyklisiert, um das gesuchte Mikroprotein zu erhalten.

9) Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß

- das vernetzte Oxymethylpolystyrolharz ein Harz vom Typ "Boc- Gly-CM" ist, worin Boc eine tert.-Butyloxycarbonylgruppe ist, Gly ein Glycinrest ist, und CM das vernetzte Oxymethylpolystyrolharz bedeutet,

- das Kupplungsmittel BOP oder Tris-(dimethylamino)-benzotriazol-1-yloxyphosphoniumhexafluorphosphat ist,

- die Freisetzung der Peptidkette von dem Harz, sowie die Abspaltung der Schutzgruppen von den Aminosäuren mittels Fluorwasserstoffsäure bei einer tiefen Temperatur durchgeführt wird.

10) Medikamente, dadurch gekennzeichnet, daß sie die neuen Mikroproteine gemäß der allgemeinen Formel (I) nach Anspruch 1 enthalten.

11) Medikamente, dadurch gekennzeichnet, daß sie die neuen Mikroproteine nach einem der Ansprüche 2, 3, 4, 5, 6 oder 7 enthalten.

12) Pharmazeutische Präparate, dadurch gekennzeichnet, daß sie als Wirkstoff mindestens eines der Medikamente nach einem der Ansprüche 10 oder 11 enthalten.