DE69616770T2

DE69616770T2 - Thrombin inhibitore mit einer hirudin-ähnlichen sequenz

Info

Publication number: DE69616770T2
Application number: DE69616770T
Authority: DE
Inventors: John Dimaio
Original assignee: National Research Council of Canada
Current assignee: National Research Council Of Canada Ottawa Ontar
Priority date: 1995-03-20
Filing date: 1996-03-18
Publication date: 2002-08-01
Anticipated expiration: 2016-03-19
Also published as: AU4934996A; DE69616770D1; HUP9800727A2; CN1182436A; ZA962267B; EP0815139B1; AU695920B2; NO974342L; HK1005511A1; EP0815139A1; ES2168461T3; EA199700239A1; HUP9800727A3; ATE208401T1; IL117526A; NO974342D0; JPH11502203A; EA000088B1; CA2215702A1; IL117526A0

Description

Technisches Gebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft Peptidderivate die sich als Thrombin-Inhibitoren eignen und insbesondere Peptidderivate, die sich von einer Sequenz des Hirudinsegments ableiten, das die Aminosäuren 45 bis 65 enthält.

Hintergrund der Erfindung

Thrombin ist eine wichtige Serin-Proteinase-Komponente der Blutgerinnungskaskade. Neben der Auslösung der Blutgerinnung durch Spaltung von Fibrinogen, aktiviert Thrombin andere Blutgerinnungsfaktoren wie die Faktoren V, VIII und XIII und das gerinnungshemmende Enzym Protein C. Thrombin ist auch ein starker Thrombozyten-Aktivator, der die Thrombolyse beeinflußt, die in vivo durch Gewebe- Plasminogen-Aktivator vermittelt wird. Daher dient die positive Rückkopplungsregulation von Thrombin dazu die blutstillenden Ereignisse zu verstärken, verursacht aber lebensbedrohende Blutpfropfen als Antwort auf Veränderungen in Schlagadern und Gehirnschlagadern.
In Hinblick auf die verschiedenartigen Funktionen dieses Enzyms könnte seine Inhibierung durch wirksame und spezifische Verbindungen einen wertvollen Beitrag für die Behandlung von Thrombosekrankheiten leisten. Diese Krankheiten umfassen Koronararterienerkrankung, Gehirnschlagadererkrankung, periphere arterielle Verschlußerkrankung, tiefe Venenthrombose und Lungenembolie.
Der wirksamste bekannte Inhibitor von Thrombin ist Hirudin, das zu einer Familie von Isoproteinen gehört, die aus dem Speicheldrüsensekret des Blutegels Hirudo medicinalis isoliert wurden. Die blutgerinnungshemmenden Eigenschaften von Hirudin sind schon lange bekannt. Jedoch war es bisher von geringem therapeutischen Nutzen, da die Bereitstellung einer pharmazeutischen Formulierung für dieses Protein in einer sofort wirksamen und applizierbaren Form sehr schwierig erschien, weil sowohl die Absorption über den Darm als auch die Haut sehr gering ist, so dass es nicht möglich war ausreichende Blutspiegel des Proteins zu erreichen.
Ferner ist die klinische Anwendung von Hirudin, das aus Blutegelextrakten isoliert wurde, unwahrscheinlich, wegen ihrer begrenzten Mengen, Kosten und allergischen Reaktionen, die gewöhnlich auftreten, wenn fremde Proteine von der Größe von Hirudin appliziert werden.
In der Publikation mit dem Titel "Pharmacology of selective thrombin inhibitors", (1988), Nouv. Rev. Fr. Hematol., 30, Seiten 161-165, liefert Markwardt weitere klinische Informationen über Hirudin, die auf pharmakologischen Studien basieren die mit natürlichen und synthetischen Thrombin Inhibitoren durchgeführt wurden.
Der Autor macht allgemeine Beobachtungen die Hirudin betreffen und merkt an, dass das Peptid, welches einen stark sauren C-terminalen Teil enthält, sehr spezifisch für α-Thrombin ist. Er zieht daraus den Schluß, dass der C-terminale Teil von Hirudin wahrscheinlich an die anionische Binderegion des Enzyms bindet, während der kompakte N-terminale Teil anscheinend an den katalytisch aktiven Teil des Enzyms bindet.
Es wurde gefunden, dass natürliches Desulfohirudin&sup4;&sup5;&supmin;&sup6;&sup5; die durch α-Thrombin von Rindern und Menschen ausgelöste Fibrinogengerinnung in einer Dosis abhängigen Art inhibiert. Der IC&sub5;&sub0; Wert von 940 ± 200 nM für Rinder-α-Thrombin ist in guter Übereinstimmung mit den Werten für die Blutplasmafibringerinnungsbildung für dasselbe Fragment und dreimal geringer als für Hirudin&sup5;&sup5;&supmin;&sup6;&sup5; das als das kleinste Fragment angesehen wird, welches eine gerinnungshemmende Wirkung hat. Es ist auch gezeigt worden, dass die gleichen Peptide übereinstimmend stärker wirksam gegen menschliches α-Thrombin als gegen Rinder-α-Thrombin sind.
Verschiedene Dokumente aus dem Stand der Technik haben gezeigt, dass anscheinend das aktive Fragment durch die Aminosäuren 45 bis 65 der Aminosäuresequenz von Hirudin gebildet wird. Aus diesem Grund sind viele Anstrengungen unternommen worden, durch Substitution einiger der Aminosäuren in dieser Aminosäuresequenz die inhibierende Wirkung des Peptids zu verstärken.
Krstenansky et al. beschreibt in "Antithrombin properties of C-terminus of hirudin using synthetic unsulfated Nα-acetyl-hirudin", (1987), Febs Letters, Band 211, Nr. 1, Seiten 10-16, die Synthese des C-terminalen unsulfatierten Nα-Acetyl-Hirudin&sup4;&sup5;&supmin;&sup6;&sup5; Fragments. Die Autoren beziehen sich auf vorherige Arbeiten (Chang, J.-V., Febs Letters, 164, 307 (1983)) und erwähnen, dass dieses Fragment potentiell zwei spezifische Bindedomänen enthalten könnte, eine, die an die katalytische Stelle von Thrombin bindet und eine, die an eine andere Erkennungsstelle von Thrombin bindet. Die Autoren folgerten daraus, dass dies nicht der Fall sei.
Die Autoren demonstrierten noch, dass die Aminosäuresequenz 45-65 von Hirudin die Fähigkeit besitzt, die Gerinnungsaktivität und die Freisetzung von Fibrinopeptid A durch Thrombin zu inhibieren. Sie vertraten auch die Meinung, dass dieselbe Aminosäuresequenz von Hirudin&sup4;&sup5;&supmin;&sup6;&sup5; nicht direkt an der Bindung an die katalytische Stelle von Thrombin beteiligt sein könne, da die amidolytischen Eigenschaften von Thrombin gegen synthetische Substrate nicht gestört sind.
In dem Artikel von Krstenansky mit dem Titel "Anticoagulant peptides: nature of the interaction of the C-terminal region of hirudin with a noncatalytic site of thrombin" (1987), J. Med. Chem., 30, Seiten 1688-1691, berichten die Autoren, dass die kleinste aktive Sequenz an der nicht katalytischen Bindungsstelle von Thrombin Hirudin&sup5;&sup6;&supmin; &sup6;&sup4; ist. Basierend auf dieser Annahme berichten die Autoren über die Synthese verschiedener C-terminaler Hirudin&sup5;&sup6;&supmin;&sup6;&sup5; Analoga und deren Fähigkeit thrombininduzierte Fibrinogengerinnung zu inhibieren um damit die Natur der Interaktion zwischen Hirudin&sup5;&sup6;&supmin;&sup6;&sup5; und einer nicht katalytischen Bindungsstelle von Thrombin zu beweisen. In ihrer Schlußfolgerung bemerken die Autoren, dass die C-terminale Region von Hirudin an eine thrombinbindenden Region von Fibrinogen bindet, die bisher nicht in der Literatur vorgeschlagen wurde.
In den Artikeln von Dodt et al. (Interaction of site specific hirudin variants with α- thrombin, (1988), Febs Letters, Band 229, Nr. 1, Seiten 87-90), Degryse et al. (Point mutations modifying the thrombin inhibition kinetics and antithrombotic activity in vivo of recombinant hirudin, (1989), Protein Engineering, Band 2, Nr. 6, Seiten 459-465) und Braun et al. (Use of site-directed mutagenesis to investigate the basis for the specificity of hirudin, (1988), Biochemistry, 27, Seiten 6517-6522), berichten die Autoren über die Resultate von ortgerichteter Mutagenese, die auf dem Hirudingen durchgeführt wurde. Die Hemmung von Thrombin durch mutierte Hirudinpeptide wurde studiert.
In diesen Publikationen studierten die Autoren die Effekte von Mutationen auf das ganze Protein und beschränkten sich nicht auf das 45-65 Segment von Hirudin. Ferner beschränkten sich die Modifikationen, die auf dem 45-65 Segment durchgeführt wurden, auf eine einzelne Modifikation, gewöhnlich an der Position 47, um zu illustrieren, dass dieser Rest nicht mit der aktiven Stelle wechselwirkt, obwohl diese Publikation auch Mutationen an den Positionen 51, 57, 58, 61 und 62 aufzeigen.
In einer ähnlichen Weise beschreibt der Artikel von Dodt et al. mit dem Titel "Distinct binding sites of Ala&sup4;&sup8;-Hirudin¹&supmin;&sup4;&sup7; and Ala&sup4;&sup8;-Hirudin&sup4;&sup8;&supmin;&sup6;&sup5; on α-thrombin", (1990), The Journal of Biological Chemistry, Band 265, Nr. 2, Seiten 713-718, Experimente, die das Ziel haben ortsspezifische Mutagenese an der Position 48 in der Aminosäuresequenz von Hirudin durchzuführen. Es scheint so, als ob die von Dodt et al. durchgeführte Arbeit darauf beschränkt ist Prolin durch Alanin an dieser Position zu ersetzen, um die für ihr Experiment benötigte Proteolyse zu erleichtern.
Schließlich beschreiben Maraganore et al., in "Anticoagulant activity of synthetic hirudin peptides"" (1989), The Journal of Biological Chemistry, Band 264, Nr. 15, Seiten 8692-8698, Dennis et al. in "Use of fragments of hirudin to investigate thrombin-hirudin interaction", (1990), Eur. J. Biochem." 188, Seiten 61-66 und Chang et al. in "The structural elements of hirudin which bind to the fibrinogen recognition site of thrombin are exclusively located within its acidic C-terminal tail", (1990), Febs Letters, Band 261, Nr. 2, Seiten 287-290, die Synthese und gerinnungshemmenden Eigenschaften einer Anzahl von Peptiden, deren Sequenzen auf der Aminosäuresequenz von verschiedenen Fragmenten von natürlichem Hirudin beruhen.
Verbindungen mit gerinnungshemmenden Eigenschaften sind wertvolle Therapeutika, die in vivo bei der Behandlung von verschiedenen pathologischen Zuständen eingesetzt werden können. Zu den wichtigsten Erkrankungen wobei eine gerinnungshemmende Behandlung nützlich sein könnte zählen beispielsweise Herzinfarkt, Lungenembolie und Gehirnschlagadererkrankungen, tiefe Venenthrombose und andere Indikationen der Thrombosekrankheiten.
Die momentan verfügbaren gerinnungshemmenden Mittel sind in vielen Aspekten unzureichend. Beispielsweise ist Heparin eingesetzt worden um die Aktivität von Thrombin zu inhibieren, um dadurch Erkrankungen wie venöse Thrombose und thrombische Embolie zu behandeln. Jedoch besitzt Heparin eine Vielzahl von unerwünschten Nebenwirkungen und demonstriert damit die Notwendigkeit für gerinnungshemmende Mittel mit vorteilhafteren toxischen Eigenschaften.
Das Design von spezifischen Thrombininhibitoren mit niedrigem Molekulargewicht die assessorische Bindeorte nutzen, die abseits von oder in Konjunktion mit katalytischem Zentrum stehen, ähnlich wie Fibrinogen oder Hirudin an Thrombin binden, bildet eine Herausforderung in der Proteinchemie. Es ist vorstellbar, dass so ein multifunktionaler Inhibitor zwei oder mehr Erkennungselemente integriert, die durch einen geeigneten Spacer voneinander getrennt sind, wodurch mehrfache simultane Interaktionen gefördert werden und somit eine erhöhte Wirksamkeit und Spezifität manifestiert werden könnte. Die Einfügung von "fremden" chemischen Elementen in eine niedermolekulare Struktur könnte Resistenz gegen Proteolyse und vorteilhafte Bioverfügbarkeit verleihen. Diese Verbindungen könnten auch, weil sie kleiner sind als Hirudin, eine geringere Stimulierung der unerwünschten Immunantwort in Patienten bewirken, die damit behandelt wurden.
Die PCT-Anmeldung WO 91/02750 weist darauf hin, dass einige Thrombininhibitoren CSDM's besitzen, die langsam oder gar nicht gespalten werden. Jedoch werden darin nur modifizierte Bindungen offenbart zwischen Arg und Gly oder Pro, beispielsweise Arg[psi CH&sub2;-NH]-Gly; β-HomoArg-Gly; β-HomoArg-Pro; β-HomoArg-Val; oder Arg-[ψCO-CH&sub2;]- CH&sub2;-(CONH)-Gly. Es ist kein Hinweis dafür vorhanden, dass die Aminosäuren Gly oder Pro komplett eliminiert werden und durch einen synthetischen Linker ersetzt werden könnten, der vollkommen resistent gegen eine Thrombinspaltung ist.
In dem J. Med. Chem., Band 35, Nr. 18, 1992, Seiten 3331-3341 und der PCT- Anmeldung WO-A-9119734, werden bivalente Thrombininhibitoren offenbart, welche sich von denen der vorliegenden Erfindung durch den Brückenrest Di-5-aminopent-3- enoyl unterscheiden, während das Peptidderivat der vorliegenden Erfindung eine Di- 5-aminopentanoyl-Gruppe als Brückenrest aufweist.

Zusammenfassung der Erfindung

Die Verbindung der vorliegenden Erfindung ist ein Peptidderivat (1) der Formel (D)-Phe-Pro-Arg-(CH&sub2;)&sub4;(CO)-[NH(CH&sub2;)&sub4;CO]&sub2;-DFEPIPL welches die Carboxyl- Domäne von Hirudin, enthaltend die Reste 45-65, nachahmt. Die Buchstaben D, F, E, P, I und L identifizieren die Aminosäuren gemäß dem bekannten Ein-Buchstaben- Code für Aminosäuren.
Ein anderer Aspekt der Erfindung betrifft eine pharmazeutische Zubereitung für die Behandlung von Thrombosekrankheiten, umfassend eine wirksame Menge des Peptidderivats (I) (D)-Phe-Pro-Arg-(CH&sub2;)&sub4;(CO)-[NH(CH&sub2;)&sub4;CO]&sub2;-DFEPIPL und pharmazeutisch verträgliche Salze davon.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft die Verwendung einer Zubereitung, umfassend eine wirksame Menge des Peptidderivats (I) (D)-Phe-Pro-Arg-(CH&sub2;)&sub4;(CO)- [NH(CH&sub2;)&sub4;CO]&sub2;-DFEPIPL zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung oder Prophylaxe von Gefäßerkrankungen, die mit der Thrombose verwandt sind.
Ein weiterer Aspekt betrifft die Verwendung der erfindungsgemäßen Verbindung zum Einsatz in Zubereitungen und Verfahren für die in vivo diagnostische Abbildung, zur in vitro Lagerung von Blut außerhalb des Körpers, Beschichten von invasiven Apparaturen und für die ex vivo Behandlung von Blut.

Detaillierte Beschreibung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Peptidderivat, das sich als Thrombininhibitor eignet. Es wurde gefunden, dass das natürlich Fragmente von Hirudin, umfassend die Reste 45-65 mit zwei unabhängigen und entfernten Stellen des Thrombins gleichzeitig wechselwirken können, eine Stelle ist der als anionische Außenseite bezeichnete Bereich und die andere Stelle ist der katalytische Ort, der für die Proteolyse verantwortlich ist. Dieser Bindemodus simuliert aber unterscheidet sich von dem Mechanismus des natürlichen Hirudinmoleküls, welcher nun darin besteht, dass die drei Nterminalen Reste von Hirudin mit dem katalytischen Zentrum von Thrombin wechselwirken. Daher scheint es so zu sein, dass die Reste 45, 46 und 47 im natürlichen Protein keine Bindungsrolle spielen, während sie in der Abwesenheit des N- terminalen Kerns räumlich korrekt angeordnet sind um wechselwirken zu können, jedoch nur schwach.
Basierend auf diesen Beobachtungen wurden Peptidderivate synthetisiert, die Modifikationen in beiden inhibitorischen Komponenten des Moleküls betreffen und welche eine Antithrombinwirkung aufweisen, die über dem Niveau jeder einzelnen Komponente allein liegt. Ferner ergibt die chemische Modifikation der neu gebildeten spaltbaren Bindung eine aktivere Verbindung, welche den Vorteil hat proteolytisch stabil gegen Thrombin zu sein. Das Peptidderivat ist einsetzbar als Gerinnungshemmer und als Inhibitor der Blutplättchenaggregation, wodurch das Risiko der arteriellen Thrombose und anderer vergleichbarer Gefäßerkrankungen verringert wird. Die erfindungsgemäße Verbindung kann auch in der Behandlung der Tumormetastasenbildung eingesetzt werden, beispielsweise im Falle von Krebsgeschwüren.
Der Begriff "Rest" bedeutet, wenn er bei α-Aminosäuren verwendet wird, ein Radikal, das sich von der entsprechenden α-Aminosäuren ableitet durch Entfernen des Hydroxyls aus dem Carboxylgruppe und einem Wasserstoffatom von der α- Aminosäure.
Die in der vorliegenden Anmeldung verwendeten Abkürzungen zur Bestimmung individueller Reste basieren auf den Empfehlungen der IUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclature [Biochemistry, 11, 1726-1732, (1972)]. Der Begriff "Aminosäure" wie er hier benutzt wird, beinhaltet natürlich vorkommende Aminosäuren und auch nicht natürliche Analoga wie sie von den Fachleuten im Bereich der chemischen Synthese und Peptidchemie verwendet werden. Eine Liste von nicht natürlich vorkommenden Aminosäuren kann im Buch von D. C. Roberts und F. Vellaccio "The Peptides", Band 5, 1983, Academic Press, Kapitel 6, gefunden werden.
Zum Bereich der vorliegenden Erfindung gehört auch die Verwendung einer Zusammensetzung, umfassend das erfindungsgemäße Peptidderivat in einem Verfahren zur Behandlung oder Prophylaxe von Gefäßerkrankheiten, die mit der Thrombose verwandt sind. Das Verfahren besteht darin, einem Patienten eine wirksamen Menge des Peptidderivats in einer Mischung mit einem pharmazeutisch akzeptablen Träger zu verabreichen.
Die vorliegenden Erfindung betrifft auch die Verwendung einer Zusammensetzung, umfassend das erfindungsgemäße Peptidderivat in einem Verfahren zur Verringerung der Wiederdurchströmungszeit oder Erhöhung der Wiedergerinnungszeit eines Patienten, der mit einem thrombolytischen Agens behandelt worden ist. Das Verfahren besteht darin, einem Patienten eine wirksamen Menge einer Zusammensetzung aus einem erfindungsgemäßen Peptidderivat und einem thrombolytischen Agens in einer Mischung mit einem pharmazeutisch akzeptablen Träger zu verabreichen.
Gemäß einem weiteren Aspekt der Erfindung kann das erfindungsgemäße Peptidderivat in einer Zusammensetzung zur Behandlung der Tumormetastasenbildung verwendet werden. Die Wirksamkeit des Peptidderivats zeigt sich bei der Behandlung der Tumormetastasenbildung durch die Hemmung des Metastasenwachstums. Dies basiert auf der Anwesenheit einer Vorstufe eines Gerinnungsenzyms in bestimmten Krebszellen. Diese Enzym aktiviert die Umwandlung von Faktor X und Faktor Xa in der Blutgerinnungskaskade, und ergibt dadurch eine Fibrinablagerung, welche wiederum als Substrat des Tumorwachstums dient. Durch die Inhibierung der Fibrinablagerung auf Grund der Inhibition von Thrombin, läßt sich die erfindungsgemäße Zusammensetzung als effektives Mittel gegen die Tumormetastasenbildung einsetzen. Beispiele für Tumormetastasenbildner die durch die erfindungsgemäßen Thrombininhibitoren behandelt werden können, umfassen, sind aber darauf nicht beschränkt, Krebsgeschwulste des Gehirns, Krebsgeschwulste der Leber, Krebsgeschwulste der Lunge, Krebsgeschwulste der Knochen und Krebs im blutbildenden Gewebe.
Gemäß einem weiteren Aspekt der Erfindung kann ein Thrombininhibitor in Zusammensetzungen für die Verwendung in Methoden zum Beschichten der Oberflächen von invasiven Apparaturen eingesetzt werden, wodurch sich bei Patienten bei denen solche Apparaturen angewendet werden ein geringeres Risiko der Gerinnungsbildung und Blutplättchenaktivierung ergeben. Oberflächen, die mit erfindungsgemäßen Zusammensetzungen beschichtet werden, können umfassen beispielsweise Prothesen, künstliche Ventile, Gefäßtransplantate, Hülsen oder Katheter. Methoden und Zusammensetzungen zum Beschichten dieser Apparaturen sind dem Fachmann bekannt. Diese umfassen chemische Vernetzung oder physikalische Adsorption der Thrombininhibitor enthaltenden Zusammensetzungen mit der Oberfläche der Apparaturen.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform der Erfindung kann der Thrombininhibitor in Zusammensetzungen für die Anwendung bei der diagnostischen Abbildung von einem Thrombus in einem Patienten eingesetzt werden. In dieser Ausführungsform der Erfindung wird der Thrombininhibitor mit einem Radioisotop markiert. Die Auswahl des Radioisotopen basiert auf einer Anzahl von sehr bekannten Faktoren beispielsweise Toxizität, biologische Halbwertzeit und Nachweisbarkeit. Bevorzugte Isotope umfassen, sind aber nicht darauf beschränkt, ¹²&sup5;I, ¹²³I und ¹¹¹In. Techniken zum Markieren von Thrombininhibitoren sind im Stand der Technik bekannt. Bevorzugt ist das Radioisotop ¹²³I und die Markierung erfolgt mit dem ¹²³I-Bolton-Hunter Reagenz. Der markierte Thrombininhibitor wird einem Patienten verabreicht und abgewartet bis er an das Thrombin in einem Thrombus bindet. Der Thrombus wird dann mit bekannten Detektierungsmitteln beobachtet, beispielsweise mit einer Kamera, die Radioaktivität detektieren kann und an einen bildverarbeitenden Computer gekoppelt ist. Diese Technik ergibt auch Bilder von Blutplättchen, die an Thrombin und Meizothrombin gebunden sind.
In einem weiteren Aspekt können der oben beschriebene Thrombininhibitor oder Zusammensetzungen auch als Gerinnungshemmer zur ex vivo Behandlung von Blut oder bei extrakorporalem (in vitro) Blut eingesetzt werden. Hierin wird unter dem Begriff "ex vivo" Behandlung folgende Verfahrensweise verstanden: Blut wird dem Patienten entnommen und einer extrakorporalen Behandlung unterworfen und wieder in den Patienten zurückgeführt, beispielsweise bei Dialyseverfahren, Blutfiltration oder Bypass-Operationen. Unter dem Begriff "extrakorporales Blut" werden hierin Blutprodukte verstanden, die außerhalb des Körpers gelagert werden um sie gegebenenfalls einem Patienten zuzuführen, und Blut, das von Patienten gewonnen wird, um verschiedene Blutbestimmungen durchzuführen. Solche Produkte umfassen Blut als solches, Blutplasma oder irgendwelche Blutfraktionen für die die Inhibition der Blutgerinnung gewünscht wird.
Das erfindungsgemäße Peptidderivat kann mit einer Vielzahl von Verfahren hergestellt werden, die dem Fachmann gut bekannt sind. Beispielsweise können die Peptide mit der Festphasenmethode hergestellt werden wie beschrieben von Stewart et al. in "Solid phase peptide synthesis", Freeman & Co., San Francisco, 1969 mit einem geeigneten Peptidsyntheseapparat. Die Bereiche des Peptidderivats, die keine Aminosäuren enthalten, müssen vorher chemisch synthetisiert werden, bevor diese Teile mit anderen Aminosäuren verknüpft werden, um anschließend das gewünschte Peptid durch konventionelle Festphasensynthese zu erhalten. Ein Fachmann weiß, dass ein organischer Chemiker die synthetischen Bereiche des Peptidderivats leicht herstellen kann.

Synthese des Peptidderivats

Das Peptidderivat kann mit einem Applied Biosystems 430A Peptidsyntheseapparat mit einem BOC-GlnPAM-Harz (Applied Biosystems; 0,64 mmol/Gramm) als Festphasenträger hergestellt werden. Die Aminosäureverknüpfung erfolgt mit Hilfe von Dicyclohexylcarbodiimid/N-Hydroxybenzotriazol und die Schutzgruppe wird mit einer 50 % Trifluoressigsäure (TFA) in Methylenchlorid Behandlung über 3 Minuten entfernt, gefolgt von einem zusätzlichen 20 Minuten Zyklus. Folgende Seitenkettenschutzgruppen wurden eingesetzt: Asp (Chx), Arg (Tos). Ein vollständig geschütztes Peptidharz kann dann mit flüssiger Fluorwasserstoffsäure behandelt werden, die Methylphenylether und Dimethylsulfid (10 Volumenprozent) enthält. Die Behandlung erfolgt bei -5ºC für 60 Minuten. Überschüssiges HF kann dann durch einen Stickstoffstrom entfernt werden und der erhaltene Feststoff kann mit Ether extrahiert und gefiltert werden. Das Harz kann dann mit Eisessig und Wasser extrahiert werden und anschließend lyophilisiert werden.

Reinigung und Analyse des Peptidderivats

Das erhaltene lyophilisierte rohe Peptid kann bis zur Homogenität mit allgemein anerkannten Peptidreinigungstechniken gereinigt werden. Eine brauchbare Technik ist die Umkehrphasenchromatographie in einer Vydac Octadecanylsiliciumdioxid Glasssäule (15 Å, 1,5·30 cm, 40 psi) mit Hilfe eines linearen Gradienten des folgenden Lösungsmittelsystems: A, 500 ml 0,1% TFA/H&sub2;O und B, 1 l 60% Acetonitrile/H&sub2;O, enthaltend 0,1% TFA. Die Fraktionen können analysiert werden mit Hilfe der Umkehrphasen HPLC auf einer Varian LC mit Hilfe einer Cydac C18 analytischen Säule und Detektion bei 215 nm. Fraktionen mit einer Reinheit von mehr als 99% können vereinigt und lyophilisiert werden. Der Peptidgehalt kann durch Aminosäureanalyse auf einem Beckman 6300 Aminosäureanalyseapparat bestimmt werden. Proben werden in einem Waters Pico-Tag Work Station getrocknet. Konstant siedende HCl (200 ul) enthaltend 1% Phenol wird zum Gefäß hinzugefügt und alternativ mit trockenem Stickstoff gereinigt und nach drei Reinigungen evakuiert. Schließlich wird das Gefäß, das die Probe enthält, unter verminderten Druck für 1 Stunde auf 150ºC erwärmt. Massenspektralanalyse kann mit Hilfe eines SCIEX® API III Spektrometer durchgeführt werden, der mit einer Ionensprüheinlaßöffnung versehen ist.
Daher kann die Struktur und Sequenz der synthetisierten Peptide bestätigt werden durch die korrekte Aminosäurezusammensetzung und das Massenspektrum um Übereinstimmung mit den kalkulierten Molekulargewichten zu zeigen.

Pharmazeutische Zusammensetzungen

Das erfindungsgemäße Peptid kann auch in der Form seiner pharmazeutisch geeigneten Salze erhalten werden. Salze von organischen Säuren (zum Beispiel Essig-, Trifluoressig-, Milch-, Bernstein- oder Äpfelsäure) oder Basen (zum Beispiel Natrium, Kalium oder Calcium) können erhalten werden, weil das Peptidderivat Reste enthält, die sowohl als Säure und/oder Base fungieren können. Die Salze des Peptidderivats sind voll biologisch aktiv. Eine Form der therapeutisch geeigneten Salze kann in eine andere Form umgewandelt werden, indem ein geeignetes Ionenaustauscherharz eingesetzt wird in einer Weise wie sie von R.A. Boissonas et al. in Helv. Chim. Acta, 43, 1849, (1960), beschrieben wird.
Das Peptidderivat oder seine therapeutisch geeigneten Salze können allein oder in Kombination für die Behandlung oder Prophylaxe von Gefäßerkrankungen auf Grund von Thrombosen eingesetzt werden. Es wird Warmblütern, zum Beispiel Menschen, Pferden oder Hunden, zusammen mit einem pharmazeutisch geeigneten Träger systemisch verabreicht, die Proportionierung hängt von der Löslichkeit und dem gewählten Applikationsweg ab. Das erfindungsgemäße Peptidderivat wird zusammen mit dem pharmazeutisch geeigneten Träger entweder durch intravenöse, subkutane oder intramuskuläre Injektion verabreicht. Beispiele für brauchbare Träger können in Standardfachbüchern gefunden werden, beispielsweise "Remington's Pharmaceutical Sciences", 16. Ausgabe, Mack Publishing Company, Easton, Penn., 1980.
Die Dosierung des Peptidderivats wird in Abhängigkeit von der Applikationsform und vom etwaigen eingesetzten Salz variieren. Im Falle der Injektion wird die therapeutisch effektive Dosis des Peptidderivats im Bereich von etwa 0,05 mg/kg bis 10 mg/kg Körpergewicht liegen. Zusätzlich zu der aktiven Wirkkomponente enthält die Zusammensetzung auch einen geeigneten Puffer, zum Beispiel Phosphatpuffer, um einen geeigneten pH aufrecht zu erhalten und Natriumchlorid, Glucose oder Mannitol um eine isotonische Lösung herzustellen.
Das erfindungsgemäße Peptidderivat kann allein oder in Kombination mit anderen Pharmazeutika verabreicht werden. Das Peptidderivat kann beispielsweise in Kombination mit einer fibrinolytischen Verbindung wie Gewebeplasminogenaktivator, Streptokinase oder Urokinase verabreicht werden, um den Wiederverschluß von Koronararterien zu verhüten. Alternativ könnte das Peptidderivat zusammen mit Heparin oder niedermolekular gewichtigem Heparin verabreicht werden, eine Kombination mit der die Dosierung von Heparin oder niedermolekular gewichtigem Heparin vorteilhaft erniedrigt werden könnte. Andere Verbindungen, die mit dem Peptidderivat verabreicht werden können umfassen Thromboxane und EPIIb3a.
Abkürzungen, die in den folgenden Beispielen verwendet werden, umfassen BOC: tert.-Butoxycarbonyl; Tos: p-Toluolsulfonyl; CH&sub2;Cl&sub2;: Methylenchlorid; TEA: Triethylamin; BOP: Benzotriazolyl-N-oxytrisdimethylamino-phosphonium-hexafluorphosphat; DMF: Dimethylformamid; EtOAc: Ethylacetat; DCC: N,N'-Dicyclohexylcarbodiimid; DPPA: Diphenyl-phosphoryl-azid; THF: Tetrahydrofuran; HF: Hydrogenfluorid; CBZ: Benzyloxycarbonyl.

Beispiel 1

Synthese von (2S)-2-(BOC)-N-Methoxy-N-methyl-5-tosylguanidinpentanamid.

Zu einer Lösung von Nα-BOC-NG-Tosyl Arginin (428 mg, 1 mmol) in 30 ml DMF, bei 0ºC in einem Eisbad, enthaltend TEA (0,4 ml, 3 mmol) und N,O- Dimethylhydroxylamin-hydrochlorid (146 mg, 1,5 mmol) wurde BOP Reagenz (500 mg, 1,1 mmol) hinzugefügt (B. Castro, J.R. Dormoy, G. Elvin, C. Selve, Tetrahydron Letters # 14, Seiten 1219-1222, 1975). Die Reaktionslösung wurde 15 Stunden bei 4 ºC gerührt, danach wurde das Lösungsmittel unter verminderten Druck verdampft. Der Rückstand wurde in 50 ml EtOAc gelöst und mit Wasser gewaschen. Die organische Phase wurde weiter mit 5% NaHCO&sub3; extrahiert (dreimal), 1 N HCl (dreimal) und über Na&sub2;SO&sub4; getrocknet. Die erhaltene Lösung wurde durch Celite filtriert und unter verminderten Druck konzentriert. Das Zufügen einer kleinen Menge Hexan zum Konzentrat führte zum Auskristallisieren eines weißen Feststoffes (500 mg) der der Titelsubstanz entspricht. Massenspektralanalyse: M/Z = 472 (M + H)&spplus;.

Beispiel 2

Synthese von 6-BOC-9-Tosylguanidin-1-nonen-5-on

Zu einer Lösung vom Produkt gemäß Beispiel 1 (600 mg, 1.3 mmol) in 25 ml THF wurden 10 Äquivalente von Grignard Reagenz, hergestellt aus 4-Brom-1-buten, hinzugefügt (Notiz zur Präparation: 312 mg von Magnesiumdrehspänen (13 mmol) in 50 ml wasserfreiem Ether wurden tropfenweise mit 1,75 g von 4-Brom-1-buten behandelt um einen schonenden Rückfluß zu erhalten). Nach totaler Umsetzung des Metalls wurde die Grignard Lösung mit einer Spritze unter Argon in die THF Mischung überführt. Nachdem die TLC das Verschwinden des Startmaterials zeigte, wurde die gesamte THF Mischung mit wäßriger NH&sub4;Cl abgeschreckt (TLC wurde auf Kieselgel® 60F 254, Merck, Glasplatten, durchgeführt). Die Phasen wurden separiert und die organische Phase wurde weiter mit 1 N HCl und Wasser gewaschen, getrocknet (Na&sub2;SO&sub4;) und unter verminderten Druck eingedampft. Chromatographie auf Silicagel (Elution mit 4 : 1 EtOAc/Hexan) ergab ein klares Öl, das der Titelverbindung entsprach. Massenspektralanalyse: M/Z = 469 (M + H)&spplus;.

Beispiel 3

Synthese von 5-BOC-4-Oxo-8-tosylguanidinoctansäure

Das Produkt aus Beispiel 2 (2,5 g, 5,3 mmol) wurde in 50 ml Acetonitril gelöst und anschließend wurde Natriumperjodat (8 g, 37,5 mmol) gelöst in 50 ml Wasser zugefügt. Die gesamte Mischung wurde mit 100 mg Rutheniumchlorid behandelt. Nach einer Stunde heftigen Rührens bei Raumtemperatur war kein Startmaterial mehr durch TLC nachweisbar. Die Mischung wurde mit 100 ml Wasser und 100 ml Ether verdünnt. Die Phasen wurden getrennt und die wäßrige Phase wurde weiter mit Ether extrahiert. Die vereinigten organischen Extrakte wurden mit Wasser gewaschen, getrocknet (Na&sub2;SO&sub4;) und unter verminderten Druck eingedampft und ergaben 1,5 g eines Schaums, der der Titelverbindung entsprach. M/Z = 485 (M + H)&spplus;.

Beispiel 4

Synthese von 6-BOC-5-Oxo-9-tosylguanidinnonansäure

Die Titelverbindung von diesem Beispiel wurde in analoger Weise wie in den Beispielen 1 bis 3 hergestellt. Kurz dargestellt wurde das Produkt gemäß Beispiel 1 mit einem Grignard Reagenz, hergestellt aus Magnesium und 5-Brom-1-penten, umgesetzt. Die erhaltenen Addukte wurde analog zu Beispiel 3 als Öl isoliert und anschließend mit einer Kombination von Natriumperjodat und von Rutheniumchlorid behandelt, um die Titelverbindung dieses Beispiels zu erhalten. M/Z = 499 (M + H)&spplus;.

Beispiel 5

Synthese von 7-BOC-6-Oxo-10-tosylguanidindecansäure

Die Titelverbindung von diesem Beispiel wurde in analoger Weise wie in den Beispielen 1 bis 4 hergestellt. In diesem Beispiel wurde das Produkt gemäß Beispiel 1 mit einem Grignard Reagenz, hergestellt aus Magnesium und 6-Brom-1-hexen, umgesetzt. Anschließend wurde das Addukt durch Siliciumgel-Chromatographie wie in Beispiel 2 isoliert, das Addukt wurde mit Natriumperjodat und Rutheniumchlorid umgesetzt. Isolierung des erhaltenen Produkts ergab die Titelverbindung als Öl. M/Z = 513 (M + H)&spplus;. Beispiel 6 Ethyl-4N-t-BOC-3-oxo-7-tosylguanidin-thioheptanoat (gemischtes Anhydrid-Verfahren)
Bildung von gemischten Anhydriden: Zu einer gerührten Lösung von 1 g (2,4 mmol) von (L)- Nα-BOC-Arg (Nw)TOS)OH und 0,66 ml (0,48 mmol) von Triethylamin in 15 ml wasserfreiem Tetrahydrofuran bei -20ºC wurden tropfenweise 0,40 ml (0,3 mmol) Isobutyl-chlorameisensäureester über 15 Minuten zugefügt. Nach 1 Stunde wurde die Mischung mit 15 ml Ether verdünnt und der ausgefallene Feststoff abfiltriert. Das Filtrat, enthaltend das gemischte Anhydrid, wurde bei 0ºC gelagert.
In der Zwischenzeit wurde in eine gerührte Lösung von Diisoproylamin (3,4 ml, 24 mmol) in 25 ml wasserfreiem Ether unter Argon bei 0ºC tropfenweise 1 Äquivalent von N-But Li in THF über 30 Minuten zugefügt. Danach wurde die Reaktionslösung auf -60ºC gekühlt und mit 2,5 ml von Ethylthioacetat behandelt. Nach 30 minütigem Rühren bei -60ºC wurde die Mischung mit 6 g MgBr&sub2;-Etherat behandelt und weitere 30 Minuten gerührt. Schließlich wurde zu dieser Mischung das vorher hergestellte gemischte Anhydrid gegeben und weitere 5 Stunden gerührt bis die Umsetzung vollständig war, welches durch HPLC kontrolliert wurde.
Die Reaktionsmischung wurde tropfenweise mit 6 M NH&sub4;Cl behandelt und die Phasen wurden getrennt. Die organische Phase wurde mit 50 ml von EtOAc verdünnt und mit 1 N HCl (dreimal), Wasser (dreimal) extrahiert, mit Na&sub2;SO&sub4; getrocknet und unter verminderten Druck eingedampft. Die Titelverbindung wurde als Öl erhalten M/Z = 515 (M + H)&spplus;.

Beispiel 7

Verknüpfen des Thioesters gemäß Beispiel 6 mit einer a-Aminosäure und nicht geschützten Aminoacyl-Polystyrol-Harzen.
Die geschützte Arginylverbindung gemäß Beispiel 6 (2 Äquivalente) wurde in CH&sub2;Cl&sub2; gelöst und zu einer Mischung von α-Aminosäureestern (1 Äquivalent) oder Polystyrolharz, der die wachsende Polypeptidkette enthält, zugefügt. Zu dieser Mischung wurde Kupfer(I)iodid (2 Äquivalente) und Triethylamin (2 Äquivalente) zugefügt. Im Falle der Aminosäureester wurde die Reaktion mit Hilfe der HPLC und im Falle des polystyrolgebundenen Peptids wurde die Reaktion mit dem konventionellen Ninhydrin Test verfolgt.

Beispiel 8

Herstellung der Untereinheit des synthetischen Spacers der Formel II:
-[NH-CH&sub2;-CH=CH-CH&sub2;-(CO)]&sub3;-
Die Synthesevorschrift entsprach (Cox M.T., Heston D.W. und Horbury J., J. Chem. Soc. Chem. Comm., 1980, 799-800) mit wichtigen Modifikationen. Das gesamte Verfahren wurde wie folgt durchgeführt:

a) Synthese von trans-β-Hydromuconsäuredimethylester

22 g (153 mmol) von trans-β-Hydromuconsäure wurde in 200 ml Benzol, enthaltend 500 mg p-Toluolsulfonsäure und 100 ml Methanol, gelöst. Die Lösung wurde 6 Stunden unter Rückflussbedingungen gehalten und mit 100 ml Wasser versetzt. Die Phasen wurden getrennt und die organische Schicht wurde weiter mit 5% NaHCO&sub3; und Wasser extrahiert. Nach dem Trocknen (Na&sub2;SO&sub4;) wurde das Lösungsmittel unter verminderten Druck eingedampft und der Rückstand wurde destilliert ((83-85ºC) 0,5 mm Hg) und 19 g der Titelverbindung wurden erhalten.

b) Synthese von trans-β-Hydromuconsäuremonomethylester

5 g (27,5 mmol) des Produkts aus Verfahrensschritt a) wurden in 100 ml einer 0,1 M KH&sub2;PO&sub4;-Lösung suspendiert; anschließend wurden 20 mg Schweineleber- Esterase zugefügt. Der pH-Wert der Lösung wurde konstant auf 7 gehalten durch das tropfenweise Zufügen einer Lösung von 1 M NaOH. Die Zugabe der 1 M NaOH Lösung entsprach 1 Mol Äquivalent des Diesters, die Lösung wurde mit Aktivkohle behandelt, 5 Minuten gerührt und durch Celite filtriert. Das Filtrat wurde mit Ether extrahiert und die vereinigten organischen Extrakte wurden verworfen. Die wäßrige Phase wurde mit 3 N HCl angesäuert und wieder mit Ether extrahiert. Die vereinigten Etherextrakte wurden getrocknet (Na&sub2;SO&sub4;) und unter verminderten Druck eingedampft. Der Rückstand wurde unter verminderten Druck (105-110ºC, 0,5 mm Hg) destilliert und 4 g der Titelverbindung wurden als Öl erhalten.

c) Synthese von 4-Methoxycarbonyl-2-dehydro-butyl-isocyanat

1,22 g (7,3 mmol) des Monoesters erhalten gemäß Verfahrensschritt b) wurden in 25 ml Benzol gelöst. 0,76 ml (8,7 mmol) Oxalylchlorid wurde tropfenweise über 15 Minuten zugefügt und die Lösung wurde heftig 3 Stunden gerührt. Die Lösung wurde unter verminderten Druck eingedampft. Der Rückstand wurde in 10 ml Aceton gelöst und zu einer gekühlten Lösung (0ºC) von 1 g Natriumazid in 20 ml 50% Wasser/Aceton gegeben. Nach 30 Minuten wurde die Mischung mit Wasser (50 ml) verdünnt und dreimal mit 20 ml Portionen von Benzol extrahiert. Die vereinigten organischen Extrakte wurden getrocknet (Na&sub2;SO&sub4;) und filtriert. Das Filtrat wurde in einem Ölbad auf 80ºC erwärmt bis keine weitere Stickstoffbildung mehr beobachtet werden konnte. Das Lösungsmittel wurde unter verminderten Druck verdampft und der Rückstand wurde unter verminderten Druck destilliert (80-85ºC, 0,5 mm Hg) und es wurden 700 mg der Titelverbindung erhalten.

d) Synthese von 4-N-Butyloxycarbonyl-pent-3-ensäure

890 mg tert.-Butanol (12,2 mmol) wurden zu einer Lösung, enthaltend das Reaktionsprodukt aus Verfahrensschritt c) (1 g, 6,1 mmol) in 25 ml Benzol, hinzugefügt. Die gesamte Lösung wurde 10 Stunden unter Rückfluss erhitzt und anschließend unter verminderten Druck eingedampft. Der Rückstand wurde wie in Verfahrensschritt b) mit Schweineleber Esterase behandelt und wie in Verfahrensschritt b) beschrieben aufgearbeitet; es wurden 700 mg der Titelverbindung erhalten.
Das Produkt gemäß Verfahrensschritt d) wird dann als Einheit in der Herstellung des synthetischen Spacers II verwendet. Diese Einheiten werden mit dem Fachmann wohl bekannten Techniken zusammengefügt um Spacer II zu bilden.

Beispiel 9

Herstellung von P79

Ac-(D) Phe-Pro&sup4;&sup5;-Arg-(COCH&sub2;)CH&sub2;-(CO)-Gln-Ser&sup5;&sup0;-His-Asn-Asp-Gly-Asp&sup5;&sup5;-Phe-Glu- Glu-Ile-Pro&sup6;&sup0;-Glu-Glu-Tyr-Leu-Gln-OH
1 g tert-Butyloxycarbonyl-Gln-phenylacetamidlomethyl-Harz (Applied Biosystems; 0,64 mmol/g) wurde 16 Synthesezyklen unterworfen, einschließlich nα- Seitenkettenentschützung (50% TFA in Methylenchlorid) und Verknüpfungen unter Verwendung von 2,5 meq geschützter Aminosäuren/DCC und N-Hydroxybenzotriazöl. Schutzgruppen von Seitenketten der Standardaminosäuren waren: Asp (Cyclohexyl), Glu (Benzyl), His (Benzyloxymethyl), Tyr (Brombenzyl), Ser (Benzyl).
Die synthetisch hergestellte geschützte Aminosäure gemäß Beispiel 3 wurde mit Hilfe von DCC/N-Hydroxybenzotriazol mit Gln&sup4;&sup9; verknüpft. Zur Optimierung der Ergebnisse konnte N-BOC-(D)-Phe-Pro-OH als einzelne Einheit zugefügt werden, statt der jeweils einzelnen Aminosäuren.
Das vollständig geschützte Peptidharz (500 mg) wurde mit Hydrogenfluorid in einem Teflongefäß enthaltend Anisol und Dimethylsulfid (10 Volumenprozent) bei -5 ºC für 60 Minuten behandelt. Überschüssiges HF wurde mit einem Stickstoffstrom entfernt und der Rückstand wurde mit Ether extrahiert und gefiltert. Das Harz wurde dreimal mit Eisessig und Wasser extrahiert und anschließend lyophilisiert.
Das rohe lyophilisierte Peptid wurde bis zur Homogenität durch Umkehrphasen-chromatographie in einer Octadecanylsiliciumdioxid Glassäule (15 Å, Vydac; 1,5 · 30 cm, 40 psi) gereinigt, mit Hilfe eines linearen Gradienten des folgenden Lösungsmittelsystems: A, 500 ml 0,1% TFA/H&sub2;O und B, 1 l 60% Acetonitril/H&sub2;O, enthaltend 0,1% TFA. Fraktionen mit 98% Reinheit oder mehr wurden vereinigt und lyophilisiert.
Aminosäureanalyse ergab: Asp (3), Ser (1), Glu (6), Gly (1), Ile (1), Leu (1), Tyr (1), Phe (2), His (1), Pro (2).
Das erhaltene Peptid zeigte ein Pseudomolekulargewicht, welches 2548,6 entsprach.

Beispiel 10

Herstellung von P183.

Ac-(D)-Phe-Pro-Arg-[(CO)-CH&sub2;]-CH&sub2;CH&sub2;CH&sub2;-(CO)-[NH-CH&sub2;-CH=CH-CH&sub2;-(CO)]- Asp-Phe-Glu-Pro-Ile-Pro-Leu-OH
Das Titelpeptidderivat wurde mit kleinen Modifikationen im wesentlichen so synthetisiert und gereinigt wie für P79 und seine Homologen gezeigt. Beispielsweise begann die Festphasensynthese mit tert.-Butyloxycarbonyl-Leu-phenylacetamidomethyl Polystyrolharz (Applied Biosystems, 0,64 mmol/g). Zur Entschützung der t- BOC-Gruppe, die an den Asp-Rest gebunden ist, wurde 50% TFA in Methylenchlorid enthaltend 10% Ethylmethylsulfid verwendet. Auf diese Weise wurde eine Ausbeute des Titelpeptids von mehr als 60% erreicht, bestimmt durch HPLC (UV Absorption bei 215 nm).
P184 und P185 wurden in einer ähnlichen Weise wie P183 hergestellt.

P184

Ac-(D)-Phe-Pro-Arg-[(CO)-CH&sub2;]-CH&sub2;CH&sub2;CH&sub2;-(CO)-[NH-CH&sub2;-CH=CH-CH&sub2;-(CO)]&sub2;- Asp-Phe-Glu-Pro-Ile-Pro-Leu-OH
Aminosäureanalyse ergab: Asp (1,00), Glu (1,08), Ile (0,96), Leu (1,01), Phe (1,91), Pro (3,48).
Pseudomolekulargewicht 1553.

P185

Ac-(D)-Phe-Pro-Arg-[(CO)-CH&sub2;]-CH&sub2;CH&sub2;CH&sub2;-(CO)-[NH-CH&sub2;-CH=CH=CH&sub2;-(CO)]&sub3;- Asp-Phe-Glu-Pro-Ile-Pro-Leu-OH
Aminosäureanalyse ergab: Asp (1,00), Glu (1,06), Ile (0,93), Leu (0,98), Phe (1,88), Pro (3,6).
Pseudomolekulargewicht 1647.

Peptidderivat (I)

Ac-(D)-Phe-Pro-Arg-(CH&sub2;)&sub4;(CO)-[NH(CH&sub2;)&sub4;CO]&sub2;-DFEPIPL wurde in einer ähnlichen Weise wie P183, P184 und P185 hergestellt, außer dass der synthetische Rest Aminovaleriansäure anstelle von [NH-CH&sub2;-CH=CH-CH&sub2;-(CO)] eingesetzt wurde.
Aminosäureanalyse ergab: Asp (0,97), Glu (1,00), Ile (1,04), Leu (1,02), Phe (1,96), Pro (2,86).

Beispiel 11

Amidolytische Bestimmung der Thrombinaktivität

Thrombin katalysierte Hydrolyse von Tos-Gly-Pro-Arg-pNA wurde bei 405 nm in einem Varian Cary 2000 Doppelstrahl-Spektrophotometer beobachtet, unter Verwendung von Substratkonzentrationen von 2,5, 3,5, 5 und 10 uM in einem Endvolumen von 1 ml. Die hydrolytische Reaktion wurde bei 25ºC in einem 0,1 M Tris-HCl Puffer, pH 7,8, enthaltend 0,1 M NaCl und 0,1% PEG 6000, durchgeführt. Die Reaktionen wurden durch die Zugabe vom Substrat, gelöst in 0,1 M Tris-HCl Puffer, pH 7,8, zu einer vorher inkubierten Lösung von Enzym (0,4 oder 0,04 nM) und variablen Konzentrationen des Inhibitors gelöst im selben Puffer, gestartet. Die Anfangsreaktionsgeschwindigkeiten wurden aufgezeichnet und Ki Werte wurden grafisch durch gewichtete lineare Regression von einem Dixon Diagramm bestimmt im Falle der kompetitiven Inhibition oder durch die Methode von Baici (Baici, 1981) für hyperbolische Inhibition. Die Fluoreszenzbestimmung wurde unter den gleichen obengenannten Bedingungen und mit demselben Gerät durchgeführt, wobei im Fluoreszenzmodus mit dem Verhältnis (λex = 383 nm, λem = 455 nm), gearbeitet wurde. Die Intensitäten der Fluoreszenz wurden mit 7-Amino-4-methyl-cumann Lösung mit bekannter Konzentration kalibriert. Die Spezifität des erfindungsgemäßen Peptidderivats für humanes α-Thrombin kann auch durch Vergleich seiner relativen Hemmwirkung gegen α- Thrombin von Menschen und Rindern und Trypsin bestimmt werden, indem die erhaltenen Ki Werte in der amidolytischen Bestimmung der Thrombinaktivität verglichen werden.
Daher kann die inhibitorische Wirkung des erfindungsgemäßen Peptidderivats gegen Thrombin auch durch Messung der Prothrombinzeit (PT, exogenem Weg) oder der Inhibitionszeit von teilweise aktiviertem Thromboplastin (APTT, endogenem Weg) bestimmt werden, wobei gesammeltes rekonstituiertes normales menschliches Plasma mit dem Gerät Coag-A-Mate 2001 (General Diagnostics Inc., Morris Planes, New Jersey) gemessen werden oder ein anderes geeignetes Spektrophotometer eingesetzt wird.
Daher wurden für die Bestimmung der Prothrombinzeit 50 ul von rekonstituierten normalen menschlichem Plasma, das mit Citronensäure versetzt wurde (Sigma, St- Louis, MO.), mit 50 ul der Thromboplastinlösung bei 37ºC in einer 400 ul Küvette vermischt. Diese Mischung wurde dann entweder mit 200 ul Tris-HCl Puffer, pH 7,8 (enthaltend 0,1 M NaCl und 0,1% PEG 6000) oder mit variablen Konzentrationen des Inhibitors im selben Puffer behandelt. Die Gerinnungszeit wurde nach Zugabe von 100 ul 25 mM CaCl&sub2; aufgezeichnet. Die Gerinnungszeit betrug in Abwesenheit des Inhibitors zwischen 19-22 Sekunden.
Dieselbe Prozedur wurde für die Bestimmung der Inhibitionszeit von teilweise aktiviertem Thromboplastin angepaßt außer dass das rekonstituierte Plasma für 3 Minuten mit Cephalin (Sigma, St-Louis, MO.) aktiviert wurde.
Die Hemmwirkung des Peptidderivats gegen Thrombin wird durch seine Fähigkeit zur Inhibition der thrombinvermittelten Blutplättchengerinnung widergespiegelt, die sich darin zeigt, dass die Lichttransmission sich erhöht, die durch einen Blutplättchengerinnungsapparat von BioData PAP-4 gemessen wird.

Fibrinogengerinnungsbestimmung

Die Inhibition der Fibrinogengerinnung erfolgte spektrophotometrisch bei 405 nm mit einem Varian DMS 90 bei 37ºC. 300 ul 0,1% Fibrinogen (Sigma) in 0,1 M Tris-HCl pH 7,8, enthaltend 0,1 M NaCl, 0,1% PEG 600 und verschiedene Konzentrationen des Inhibitors im selben Puffer wurden in Polystyrolküvetten gemischt und die Reaktion wurde durch die Zugabe des Enzyms (0,4 nM α-Thrombin von Menschen oder Rindern) in einem Gesamtvolumen von 1 ml gestartet. Die Zeit vom Mischen bis zur Beugung durch Klumpenbildung wurde für verschiedene Inhibitorkonzentrationen aufgezeichnet und IC50 Werte wurden durch logarithmische Berechnung bestimmt. Die Konzentrationen der Inhibitoren bei den Bestimmungen basierten auf dem Peptidgehalt.
Die gerinnungshemmende Wirkung des erfindungsgemäßen Peptids kann mit verschiedenen anderen Bestimmungsmethoden gemessen werden. Daher kann die inhibitorische Wirkung des Peptidderivats gegen Thrombin auch durch Messung der Inhibitionszeit von teilweise aktiviertem Thromboplastin bestimmt werden (APTT endogenem Wege oder Prothrombin Zeit PT exogenem Wege). Daher kann die gerinnungshemmende Wirkung durch die Bestimmung von APTT von vereinigten normalen menschlichen Plasma mit dem Gerät Coag-A-Mate 2001 (General Diagnostics Inc., Morris Planes, New Jersey) gemessen werden.
Ferner kann das erfindungsgemäße Peptidderivat auch für die Inhibition der thrombinkatalysierten Hydrolyse des Tripeptid-p-nitroanilidsubstrats Tosyl-Gly-Pro-Arg-p- nitroanilid (Chromozym TH, Boehringer Mannheim, Indianapolis, In) spektrophotometrisch bei 420 nm in einem Cary 219 Doppelstrahl-Spektrophotometer getestet werden. Die Reaktionen können durch Mischen einer Thrombinlösung mit einem Tris-HCl, pH 7,4, NaCl Puffer durchgeführt werden.
Wenn diese Bestimmungsmethoden mit dem erfindungsgemäßen Peptidderivat durchgeführt werden, demonstrieren sie, dass dieses ein bifunktionaler Inhibitor von Thrombin ist. Tatsächlich wird gezeigt, dass durch die Verbindung der zwei kritischen Peptidbereiche, getrennt durch einen geeigneten Spacer, ein starker Thrombininhibitor zur Verfügung gestellt wird. Resultate sind in Tabelle I zusammengestellt.
Es ist klar, dass durch die Verbindung der zwei Bindungsbereiche zu einem einzelnen Molekül, getrennt durch einen geeigneten Linker, die Affinität zu Thrombin gesteigert wird. Tatsächlich ergibt die Kombination von getrennten IC50 Dosen der zwei unabhängigen Bereiche exakt die Verdoppelung der Gerinnungszeit, während eine größere Wirkung erzielt wird, wenn die zwei Bereiche durch einem Linker (Bindeglied) verbunden sind. Es erscheint daher, dass bei dem erfindungsgemäßen bifunktionalen Inhibitor eine doppelte kooperative Bindung stattfindet, wenn er mit Thrombin inkubiert wird. Das Bindeglied dient als geeigneter Spacer um eine zusätzliche Stelle (Bereich (ii)) und eine katalytische Stelle (Bereich (i)) zu überbrücken und auch als eine apolare Bindungsstelle benachbart zur katalytischen Stelle.

Eisenchlorid verletzungsinduziertes Thrombosemodel

Art: Ratte, männlich, Sprague-Dawley
Gewicht: 375-450 g
Die Eisen(III)chlorid verletzungsinduzierte Thrombosemodelbestimmung wurde gemäß Kurz, K.D., Main, R.W., Sandusky, G.E., Thrombosis research 60; 269-280, 1990 und Schumacher, W. A. et al. J. pharmacology and experimental therapeutics 267; 1237-1242, 1993, durchgeführt.
Männliche Sprague-Dawley (375-450 g) wurden mit Urethan narkotisiert (1500 mg/kg IP). Die Tiere wurden auf eine Warmhalteplatte gelegt, die auf eine Temperatur von 37ºC gehalten wurde. Der Halsschlagader wurde sich durch einen mittleren Halsschnitt angenähert. Vorsichtige stumpfe Sektion wurde eingesetzt, um die Ader von der Halsschlagaderhülle zu exponieren und zu isolieren. Die Arterie wurde mit Pinzetten angehoben um darunter Raum zu schaffen zu Einsetzen von zwei schmalen Polyethylenröhrchen (PE-205). Die Temperatursonde (Physitemp MT23/3)TM wurde zwischen Arterie und PE-205 plaziert. Die Gefäßtemperatur wurde 60 Minuten lang nach Eisen(III)chloridzugabe gemessen. Die Gefäßtemperaturänderungen wurden auf einem Temperaturplotter (Cole-Palmer Model 08533-41) aufgezeichnet. Die Verletzung wurde induziert durch das Auflegen einer kleinen Filterscheibe (3 mm Durchmesser) aus WhatmanTM Nr. 1 Filterpapier, das vorher in eine 35% Lösung von Eisen(III)chlorid eingetaucht wurde, auf die Halsschlagarterie oberhalb der Temperatursonde. Der Bereich des Experiments wurde mit Aluminiumfolie abgedeckt, um den Abbau von Eisen(III)chlorid durch Licht zu verhindern.
Die Zeit zwischen der Eisen(III)chloridapplikation und dem Zeitpunkt, an dem die Gefäßtemperatur plötzlich erniedrigt wird (> 2,4ºC), wird als der Zeitpunkt der Gefäßverstopfung (TTO) aufgezeichnet.
Vor dem Start des Experiments wird eine Blutprobe (1 ml aus dem Augen-Fistelgang) entnommen und in ein Gefäß mit 0,105 M gepufferter Citratlösung überführt und das Tier wird am Ende des Experiments getötet. Alle Proben werden auf Eis aufbewahrt und so bald wie möglich bei 2000 Upm, bei 4ºC, für 10 min., zentrifugiert. Doppelproben von Blutplasma wurden auf das Vorkommen von teilweise aktiviertem Thromboplastin in einem Blutgerinnungsanalysator (STAGO ST4TM) untersucht.
Aus einer Gruppe von vier Tieren wurden zwei Arterien bei -80ºC zur weiteren Analyse aufbewahrt. Die anderen wurden benutzt um unter einem Lichtmikroskop bei 40 facher Vergrößerung (LeicaTM) den quantitativen Grad des Gefäßverschlusses (komplett, teilweise, kein Gefäßverschluß) zu bestimmen.

Blutplättchenaggregationsprüfung

Menschliche Blutplättchen wurden vom gespendeten Blut getrennt und die zweifach gewaschene Suspension wurde anschließend weiter behandelt wie bei Packman et al. beschrieben. Durch Herzpunktion erhaltenes Rattenblut wurde in ACD (6 : 1, v/v) gesammelt. Suspensionen von gewaschenen Blutplättchen wurden wie beschrieben bei Ardlie et al. (Br. J. Haematol. 1970, 19: 7, Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 1971, 136: 1021) hergestellt. Das letzte Suspensionsmedium war eine modifizierte Tyrode Lösung (NaCl 138 mM, KCl 2,9 mM, HEPES 20 mM, Na&sub2;PO&sub4; 0,42 mM, CaCl&sub2; 1 M, Mg Cl&sub2; 2mM, 0,1% Glucose, 0,35% Albumin, Apyrase (1 ul/ml) pH 7,4). Die Anzahl der Blutplättchen wurde auf 5 000 000 / ul eingestellt. Die Blutplättchen wurden in der ersten Waschlösung mit ¹&sup4;C-Serotonin (1 uCi/10 ml der Waschlösung) markiert, um das Ausmaß der Freisetzung des Inhalts der dichten Granula meßbar zu machen, wobei die Blutplättchen in der ersten Waschlösung mit ¹&sup4;C-Serotonin (1 u Ci/10 ml des Waschfluids markiert waren, und die Freisetzung von ¹&sup4;C-Serotonin wurde bestimmt. Imipramin (5 uM Endkonzentration) wurde zugefügt um die Wiederaufnahme von freigesetztem Serotonin zu verhüten. Eine Blutplättchengerinnungsapparatur (4 Kanal-BioData PAP4, Hatboro, PA, USA) wurde zur Bestimmung eingesetzt. Der Prozentsatz der Blutgerinnung wurde 3 Minuten nach Zugabe des stimulierenden Mittels bestimmt (Menschen 0,1 U/ml Endkonzentration). Inhibitoren wurden vorher eine Minute bei 37ºC inkubiert, bevor das stimulierende Mittel zugegeben wurde. IC&sub5;&sub0; Werte entsprachen der Konzentration, die notwendig ist, 50% der Blutplättchengerinnung oder -sekretion im Vergleich zu der Kontrolle zu inhibieren. TABELLE I
Die benötigte Dosis von Heparin zur Verdoppelung der Durchgängigkeitszeit beträgt 200 U/kg.
- bedeutet nicht bestimmt. Die angegebenen Werte sind Durchschnitt von 3-5 Messungen.
Die Durchgängigkeitszeit in der Kontrolle (mit Salz behandelt) beträgt für Ratten 19 ±1 min (n = 11).
* Konzentration der Verbindung, die benötigt wird, um die Thrombinzeit in einem Puffer enthaltend Fibrinogen zu verdoppeln.
** Konzentration der Verbindung, die benötigt wird, um die menschliche Blutplasmagerinnungszeit um 50% zu inhibieren.

Claims

1. Peptidderivat (I):

(D)-Phe-Pro-Arg-(CH&sub2;)&sub4;(CO)-[NH(CH&sub2;)&sub4;CO]&sub2;-DFEPIPL und pharmazeutisch verträgliche Salze davon.

2. Zusammensetzung zur Behandlung von Thrombosekrankheiten, umfassend eine wirksame Menge des Peptidderivates (I) (D)-Phe-Pro-Arg-(CH&sub2;)&sub4;(CO)- [NH(CH&sub2;)&sub4;CO]&sub2;-DFEPIPL und pharmazeutisch verträgliche Salze davon.

3. Verwendung einer Zusammensetzung nach Anspruch 2 zur Herstellung eines Medikamentes zur Behandlung oder Prophylaxe von Gefäßkrankheiten, die mit der Thrombose verwandt sind.