DE69133033T2

DE69133033T2 - Stabilisierte Sulfonat- und Sulfatderivate von Hirudin

Info

Publication number: DE69133033T2
Application number: DE69133033T
Authority: DE
Inventors: John L. Krstenansky; Simon J. T. Mao
Original assignee: Merrell Dow Pharmaceuticals Inc
Current assignee: Aventis Pharmaceuticals Inc
Priority date: 1990-02-13
Filing date: 1991-02-13
Publication date: 2003-02-06
Anticipated expiration: 2011-02-14
Also published as: JP2899430B2; AU641215B2; CA2035917A1; ES2174819T3; JPH04211097A; CA2035917C; DE69133033D1; US5541161A; IE910469A1; ATE219102T1; DK0443429T3; EP0443429A1; AU7089091A; EP0443429B1

Description

Diese Erfindung betrifft neue Peptide, die nützliche anticoagulante Agenzien sind. Anticoagulantien sind bei der pharmazeutischen Behandlung von zum Beispiel akuter tiefer Venenthrombose, Lungenembolie, akuter arterieller Embolisation der Extremitäten, Herzinfarkt und disseminierter intravaskulärer Coagulation nützliche Therapeutika. Es wird angenommen, dass die prophylaktische Verabreichung von Anticoagulantien ein Wiederauftreten der Embolie bei Patienten mit rheumatischen oder arteriosklerotischen Herzerkrankungen verhindert und bestimmte thromboembolische Komplikationen in der Chirurgie verhindert. Die Verabreichung von Anticoagulantien wurde ebenfalls bei der Behandlung von Erkrankungen der Coronararterien und der Gehirngefäße indiziert. Arterielle Thrombose, besonders bei Arterien, die den Herzmuskel und das Gehirn versorgen, ist eine der häufigsten Todesursachen.
Hirudin ist ein Polypeptid mit 65 Resten, das aus den Speicheldrüsen von Blutegeln isoliert wird. Es ist ein anticoagulantes Agens, welches ein Thrombin-spezifischer Hemmstoff ist. Obwohl es relativ wirksam ist, ist die klinische Verwendung von Hirudin, das von Blutegel-Extrakten isoliert wird, auf Grund seiner begrenzten Menge, der Kosten sowie allergischer Reaktionen, die üblicherweise der Verabreichung jedes fremden Proteins dieser Größe folgen, unwahrscheinlich.
Der Anmelder entdeckte vor Kurzem eine spezifische Region des Hirudins, die für seine anticoagulierende Aktivität verantwortlich ist. Diese Region wurde chemisch synthetisiert, und bestimmte Analoga davon scheinen an die Erkennungsstelle von Thrombin zu binden, jedoch nicht an die enzymatische Spaltstelle, die räumlich getrennt ist. Die Bindung der synthetischen Peptide verhindert kompetitiv die Bindung des Fibrinogens an den Erkennungsort von Thrombin, eine Vorstufe der Fibrinproduktion und der Gerinnselbildung. Diese Peptide, von denen zuvor berichtet wurde, mit der Formel
X-A&sub1;-A&sub2;-A&sub3;-A&sub4;-A&sub5;-A&sub6;-A&sub7;-A&sub8;-A&sub9;-A&sub1;&sub0;-Y
worin X ein Amino-terminaler Rest ist, ausgewählt aus Wasserstoff, einer oder zwei Alkylgruppen von 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, einer oder zwei Acylgruppen 5 von 2 bis 10 Kohlenstoffatomen, einer Carbobenzyloxy- oder t-Butyloxycarbonylgruppe;
A&sub1; eine Bindung oder ein Peptid ist, das 1 bis 11 feste einer Aminosäure enthält;
A&sub2; Phe, SubPhe, β-(2- und 3-thienyl)alanin, β-(2- und 3-furanyl)alanin, β-(2-3- und 4-pyridyl)alanin, β-(benzothienyl-2- und 3-yl)alanin, β-(1- und 2- naphthyl)alanin, Tyr oder Trp ist;
A&sub3; Glu oder Asp ist;
A&sub4; jede Aminosäure ist;
A&sub5; Ile, Val, Leu, Nle, oder Phe ist;
A&sub6; Pro, Hyp, 3,4-DehydroPro, Thiazolidin-4-carboxylat, Sar, NMePgl oder D-Ala ist;
A&sub7; jede Aminosäure ist;
A&sub8; jede Aminosäure ist;
A&sub9; eine lipophile Aminosäure, ausgewählt aus Tyr, Trp, Phe, Leu, Nle, Ile, Val, Cha und Pro, oder ein Dipeptid ist, das mindestens eine dieser lipophilen Aminosäuren enthält;
A&sub1;&sub0; eine Bindung oder ein Peptidfragment ist, das eine bis fünf Reste einer Aminosäure enthält; und
Y ein Carboxyl-terminaler Rest ist, ausgewählt aus einer OH-, C1-C6-alkoxy-, Amino-, mit einer Mono- oder Di-(C1-C4)alkylgruppe substituierter Amin- oder Benzylamingruppe;
besitzen signifikante anticoagulierende Aktivität. Um jedoch die Therapieergebnisse zu verbessern, werden noch immer Verbindungen gebraucht, die eine höhere Affinität für Thrombin zeigen. Entsprechend war das technische Problem, das der vorliegenden Erfindung zu Grunde lag, die Herstellung einer neuen Klasse modifizierter Peptide, die die wünschenswerte therapeutische Aktivität der Peptide, von welchen zuvor berichtet wurde, beibehalten, jedoch eine größere Affinität zu Thrombin und/oder eine höhere Stabilität gegen metabolischen Abbau besitzen.
Die Lösung für dieses technische Problem wird durch die Bereitstellung der Peptid- Derivate von Formel 1 erreicht, welche nachstehend aufgelistet ist:
X-A&sub1;-A&sub2;-A&sub3;-A&sub4;-A&sub5;-A&sub6;-A&sub7;-A&sub8;-A&sub9;-A&sub1;&sub0;-Y (1)
1. Suc-Tyr-Pro-Ile-Pro-Glu-Glu-Ala-Pnh(SO&sub3;)-D-Glu-OH,
2. Suc-Tyr-(SO&sub3;H)-Glu-Pro-Ile-Pro-Glu-Glu-Ala-Phe-(pNHSO&sub3;H)-D-Glu-OH,
3. Suc-Tyr-Glu-Pro-Ile-Pro-Glu-Glu-Phe(pNHSO&sub3;H)-Glu-OH,
4. Suc-Phe-(pNHSO&sub3;H)-Glu-Pro-Ile-Pro-Glu-Glu-Ala-Cha-D-Glu-OH,
5. Suc-Tyr(SO&sub3;H)-Glu-Pro-Ile-Pro-Glu-Glu-Ala-Cha-D-Glu-OH und
6. Suc-Tyr-Ser(SO&sub3;H)-Pro-Ile-Pro-Ser(SO&sub3;H)-Ser(SO&sub3;H)-Ala-Cha-Ser(SO&sub3;H)OHOH oder durch kationische Salze oder pharmazeutisch verträgliche Säureadditionssalze davon, die nützliche anticoagulante Agentien sind.
Die folgenden üblichen Abkürzungen der Aminosäuren werden in dieser Spezifizierung durchgängig verwendet:
Gly - Glycin
Ala - Alanin
Val - Valin
Leu - Leucin
Ile - Isoleucin
Cha - Cyclohexylalanin
Orn - Ornithin
Pro - Prolin
Phe - Phenylalanin
Trp - Tryptophan
Met - Methionin
Ser - Serin
Thr - Threonin
Cys -Cystein
Tyr - Tyrosin
Asn - Asparagin
Gln - Glutamin
Asp - Asparaginsäure
Glu - Glutaminsäure
Lys - Lysin
Arg - Arginin
His - Histidin
Nle - Norleucin
Hyp - Hydroxyprolin
Glt - Glutaryl
Mal - Maleyl
Npa-β-(2-naphthyl)alanin
3,4-dehydroPro-3,4-dehydroprolin
Tyr(SO&sub3;H)-Tyrosinsulfat
Pgl - Phenylglycin
NMePgI -N-methyl-phenylglycin
Sar - Sarcosin(N-methylglycin)
pSubPhe - parasubstituiertes Phenylalanin
SubPhe - ortho-, meta- oder para-, mono- oder di-substituiertes Phenylalanin
DAla - D-Alanin
Ac - Acetyl
Suc - Succinyl
pClPhe - Para-chlor-phenylalanin
Pnh - p-Aminophenylalanin
Pno - Para-nitro-phenylalanin.
Die natürlichen Aminosäuren, mit Ausnahme von Glycin, enthalten ein chirales Kohlenstoffatom. Wenn nicht anders spezifisch angezeigt, sind die optisch aktiven Aminosäuren, auf die hierin Bezug genommen wird, von der L-Konfiguration. Jede der Aminosäuren kann von der D- oder L-Konfiguration sein. Wie es üblich ist, ist die Peptidstruktur, die hierin dargestellt ist, derart, dass das amino-terminale Ende auf der linken Seite der Kette ist und das carboxy-terminale Ende auf der rechten Seite der Kette ist.
Jedes der Peptidderivate dieser Erfindung enthält eine negativ geladene Gruppe an einer oder zwei einen Bestandteil der Derivate bildenden Aminosäureseitenketten. Natürlich müssen die Verbindungen dieser Erfindung elektrostatisch neutral sein, und deshalb muss ein positiv geladenes Gegenion mit jedem Molekül des negativ geladenen Peptidderivats assoziiert sein, um die Ladung des Peptidderivats zu neutralisieren. Während jede positiv geladene Spezies das negativ geladene Peptidderivat neutralisieren kann, zieht der Anmelder nur die Verwendung jener Kationen in Betracht, die pharmazeutisch verträglich sind, das heißt, jene Kationen, die im Wesentlichen in der Dosierung, die verabreicht wird, um die erwünschte Wirkung zu erzielen, nicht toxisch sind und die nicht unabhängig signifikante pharmakologische Aktivität besitzen. Veranschaulichend umfassen diese Salze jene von Alkalimetallen wie zum Beispiel Natrium und Kalium; Erdalkalimetalle wie Calcium und Magnesium, Leichtmetalle der Gruppe IIIA, umfassend Aluminium; sowie organische primäre, sekundäre und tertiäre Amine, wie zum Beispiel Trialkylamine, umfassend Triethylamin, Procain, Dibenzylamin, 1-Ethenamin, N,N'-Dibenzylethylendiamin, Dihydroabietylamin, N-(Niedriger)alkylpiperidin und jedes andere geeignete Amin. Natriumsalze werden bevorzugt.
Die Polypeptide gemäß der Erfindung können ebenfalls pharmazeutisch verträgliche Säureadditionssalze mit jeder nicht-toxischen, organischen oder anorganischen Säure bilden. Veranschaulichende anorganische Säuren, die geeignete Salze bilden, umfassen Salzsäure, Bromwasserstoffsäure, Schwefelsäure und Phosphorsäure und saure Metallsalze wie Natriummonohydrogenorthophosphat und Kaliumhydrogensulfat. Veranschaulichende organische Säuren, die geeignete Salze bilden, umfassen die Mono-, Di-, und Tricarbonsäuren. Veranschaulichend für derartige Säuren sind zum Beispiel Essigsäure, Glycolsäure, Milchsäure, Brenztraubensäure, Malonsäure, Sukzinsäure, Glutarsäure, Fumarsäure, Apfelsäure, Weinsteinsäure, Citronensäure, Ascorbinsäure, Maleinsäure, Hydroxymaleinsäure, Benzoesäure, Hydroxybenzoesäure, Phenylessigsäure, Zimtsäure, Salicylsäure, 2-Phenoxybenzoesäure und Sulfonsäure wie Methansulfonsäure und 2- Hydroxyethansulfonsäure. Salze der carboxyterminalen Aminosäureeinheit umfassen die nicht-toxischen Carbonsäuresalze, die mit allen geeigneten anorganischen oder organischen Basen gebildet werden.
Die Proteine dieser Erfindung können durch verschiedene Verfahren hergestellt werden, die dem Fachmann ohne Weiteres bekannt sind. Solche Verfahren umfassen die sequenzielle Festphasen- und Blocksynthese, Genclonierung und Kombinationen dieser Verfahren. Das sequenzielle Festphasenverfahren kann unter Verwendung von etablierten automatisierten Verfahren durchgeführt werden, wie durch die Verwendung eines automatisierten Peptid-Synthesegeräts. Bei diesem Verfahren wird eine α-Aminogruppen geschützte Aminosäure an einen Harzträger gebunden. Der verwendete Harzträger kann jedes geeignete Harz sein, welches herkömmlich auf dem Fachgebiet für die Festphasen- Herstellung von Polypeptiden verwendet wird, bevorzugt Polystyrol, welches mit Divinylbenzol von 0,5 bis etwa 3 Prozent quervernetzt wurde, welches entweder chlormethyliert oder hydroxymethyliert wurde, um Orte für die Esterbildung mit der anfänglich eingeführten α-Aminogruppen geschützten Aminosäure bereitzustellen.
Ein Beispiel für ein Hydroxymethyl-Harz wird von Bodanszky, et al., Chem. Ind. (London) 38, 1597-98 (1966) beschrieben. Ein chlormethyliertes Harz ist im Handel erhältlich bei Bio Rad Laboratories, Richmond California, und MieflJrstellung eines solchen Harzes wird von Stewart et al., "Solid Phase Peptide Synthesis" (Freeman & Co., San Francisco 1969), Kapitel 1, S. 1-6 beschrieben. Die geschützte Aminosäure kann durch das Verfahren von Gisin, Helv. Chem. Acta, 56, 1476 (1973) an das Harz gebunden werden. Viele Harzgebundene, geschützte Aminosäuren sind im Handel erhältlich. Als Beispiel kann ein tertbutyloxycarbonyl (Boc)-geschütztes Thr, das an ein benzyliertes, hydroxymethyliertes Phenylacetamidomethyl (PAM)-Harz gebunden ist, verwendet werden, um ein Polypeptid dieser Erfindung herzustellen, worin das Carboxylende ein Thr-Rest ist; dieses ist im Handel erhältlich.
Nach dem Koppeln der α-Aminogruppen geschützten Aminosäure an den Harzträger wird die Schutzgruppe unter Verwendung irgendeines geeigneten Verfahrens wie unter Verwendung von Trifluoressigsäure in Methylenchlorid, Trifluoressigsäure allein oder HCl in Dioxan entfernt. Die Entfernung der Schutzgruppe wird bei einer Temperatur zwischen 0ºC und Raumtemperatur durchgeführt. Andere Standard-Spaltreagenzien und - Bedingungen für die Entfernung spezifischer α-Aminogruppen geschützter Gruppen können verwendet werden. Nach Entfernen der α-Aminogruppen geschützten Gruppe werden die anderen Aminogruppen geschützten Aminosäuren schrittweise in der gewünschten Reihenfolge miteinander verbunden. Alternativ können multiple Aminosäuregruppen vor dem Koppeln mit der von dem Harz getragenen Aminosäuresequenz durch das Lösungsverfahren miteinander verbunden werden.
Die α-Aminogruppen geschützte Gruppe, die bei jeder Aminosäure, die in die Polypeptidsequenz eingeführt wird, verwendet wird, kann jegliche derartige Schutzgruppe sein, die dem Fachgebiet bekannt ist. Zu den Klassen α-Aminogruppen geschützter Gruppen, welche in Betracht gezogen werden, gehören (1) Schutzgruppen vom Acyl-Typ, wie: die Formyl-, Trifluoracetyl-, Phthalyl-, Toluolsulfonyl- (Tosyl), Benzolsulfonyl-, Nitro- Phenylsulfenyl-, Tritylsulfenyl-, o-Nitrophenoxyacetyl- und α-Chlorbutyrylgruppe; (2) aromatische Schutzgruppen vom Urethan-Typ wie die Benzyloxycarbonyl- und substituierte Benzyloxycarbonylgruppe wie die p-Chlorbenzyloxycarbonyl-, p-Nitrobenzylcarbonyl-, p- Brombenzyloxycarbonyl-, p-Methoxybenzyloxycarbonyl-, 1-(p-biphenylyl)-1- Methylethoxycarbonyl-, α, α-Dimethyl-3,5-dimethoxybenzyloxycarbonyl- und Benzhydryloxycarbonylgruppe; (3) aliphatische Urethan-Schutzgrppen, wie die tert- Butyloxycarbonyl- (Boc), Diisopropylmethoxycarbonyl-, Isopropyloxycarbonyl-, Ethoxycarbonyl- und Allyloxycarbonylgruppe; (4) Schutzgruppen vom Cycloalkyl-Urethan- Typ, wie die Cyclopentyloxycarbonyl-, Adamantyloxycarbonyl- und Cyclohexyloxycarbonylgruppe; (5) Schutzgruppen vom Thiourethan-Typ wie die Phenylthiocarbonylgruppe; (6) Schutzgruppen vom Alkyltyp wie die Triphenylmethyl- (Trityl) und Benzylgruppe; und (7) Trialkylsilan-Gruppen wie Trimethylsilan. Die bevorzugte α-Aminogruppen Schutzgruppe ist tert-Butyloxycarbonyl.
Die Selektion eines geeigneten Kupplungsreagens liegt innerhalb der Kenntnisse auf dem Fachgebiet. Ein besonders geeignetes Kupplungsreagens, bei dem die zuzusetzende Aminosäure Gln, Asn oder Arg ist, ist N,N'-Diisopropylcarbodiimid und 1-Hydroxybenzotriazol. Die Verwendung dieser Reagenzien verhindert die Nitril- und Lactam-Bildung. Andere Kupplungs-Agenzien sind (1) Carbodiimide (z. B. N,N'-Dicyclohexylcarbodiimid und N-Ethyl-N'-(y-Dimethylaminopropylcarbodiimid); (2) Cyanamide (z. B., N,N- 1 Dibenzylcyanamid); (3) Ketenimine; (4) Isoxazoliumsalze (z. B. N-ethyl-5-phenyl- Isoxazolium-3'-Sulfonat; (5) monocyclische, Stickstoff enthaltende, heterocyclische Amide von aromatischem Charakter, welche im Ring ein bis vier Stickstoffatome enthalten, wie Imidazolide, Pyrazolide und 1,2,4-Triazolide. Spezifische heterocyclische Amide, die nützlich sind, umfassen N,N'-Carbonyldiimidazol und N,N-Carbonyl-di-1,2,4-triazol; (6) alkoxyliertes Acetylen (z. B. Ethoxyacetylen); (7) Reagenzien, die mit der Carboxyleinheit der Aminosäure (z. B. Ethylchlorformiat und Isobutylchlorformiat) oder dem symmetrischen Anhydrid der zu koppelnden Aminosäure (z. B. Boc-Ala-O-Ala-Boc) ein gemischtes Anhydrid bilden und (8) Stickstoff enthaltende, heterocyclische Verbindungen, die eine Hydroxylgruppe an einem Ring-Stickstoff (z. B. N-Hydroxyphthalimid, N- Hydroxysuccinimid und 1-Hydroxybenzotriazol) haben. Andere aktivierende Reagenzien und ihre Verwendung bei der PeptidKupplung werden von Kapoor, J. Pharm. Sci., 59, S. 1-27 (1970) beschrieben. Die Anmelder bevorzugen die Verwendung des symmetrischen Anhydrids als Kupplungsreagens für alle Aminosäuren mit Ausnahme von Arg, Asn und Gln.
Jede geschützte Aminosäure oder Aminosäuresequenz wird in etwa vierfachem Überschuss in den Festphasenreaktor eingeführt, und die Kupplung wird in einem Medium aus Dimethylformamid Methylenchlorid (1: 1) oder nur in Dimethylformamid oder bevorzugt nur in Methylenchlorid durchgeführt. In Fällen, in welchen unvollständige Kupplung auftritt, wird das Kupplungsverfahren vor Entfernen der α-Aminogruppen geschützten Gruppe vor Kupplung der nächsten Aminosäure im Festphasenreaktor wiederholt. Der Erfolg der Kupplungsreaktion wird in jedem Stadium der Synthese durch die Ninhydrin-Reaktion überwacht, wie beschrieben bei E. Kaiser et al., Analyt. Biochem. 34, 595 (1970).
Nachdem die gewünschte Aminosäuresequenz erhalten wurde, wird das Peptid von dem Harz entfernt. Dies kann durch Hydrolyse wie durch Behandlung des harzgebundenen Polypeptids mit einer Lösung aus Dimethylsulfid, p-Cresol und Thiocresol in verdünnter wässriger Fluorwasserstoffsäure durchgeführt werden.
Wie auf dem Fachgebiet der Festphasen-Peptidsynthese bekannt ist, tragen viele Aminosäuren Funktionalitäten, die während der Herstellung der Kette Schutz benötigen. Die Verwendung und Selektion der geeigneten Schutzgruppe liegt innerhalb der Fähigkeiten des Durchschnittsfachmanns und wird von der zu schützenden Aminosäure sowie der Gegenwart anderer geschützter Aminosäurereste auf dem Peptid abhängen. Die Selektion einer solchen Seitenketten-Schutzgruppe ist insofern kritisch, als dass es eine sein muss, die während der Spaltung der Schutzgruppe von der α-Aminoeinheit nicht durch Spaltung entfernt wird. Zum Beispiel sind geeignete Seitenketten-Schutzgruppen für Lysin Benzyloxycarbonyl und substituiertes Benzyloxycarbonyl, wobei der Substituent aus einem Halogenatom (z. B. Chlor-, Brom-, Fluoratom) und einer Nitro- (z. B. 2-Chlorbenzyloxycarbonyl-, p- Nitrobenzyloxycarbonyl-, 3,4-Dichlorbenzyloxycarbonylgruppe), Tosyl-, Amyloxycarbonyl-, t-Butyloxycarbonyl- und Diisopropylmethoxycarbonylgruppe selektiert sind. Die alkoholische Hydroxylgruppe von Threonin und Serin kann mit einer Acetyl-, Benzoyl-, tert-Butyl- Trityl-, Benzyl, 2,6-Dichlorbenzyl- oder Benzyloxycarbonylgruppe geschützt werden. Die bevorzugte Schutzgruppe ist Benzyl.
Diese Gruppen können durch Verfahren, die auf dem Fachgebiet wohlbekannt sind, entfernt werden. Typischerweise wird die Entfernung der Schutzgruppe durchgeführt, nachdem die Peptidkettensynthese vollständig ist, die Schutzgruppen können jedoch zu jedem anderen geeigneten Zeitpunkt entfernt werden.
Verfahren zur Herstellung der Phosphate sind von L. Otvas, Jr. et al., Int. J. Pept. Protein Res. 34: 129-133 (1989); J. W. Perich et al., Tet. Lett. 27: 1377-1380 (1986); J. W. Perich et al. Tet. Lett. 27: 1373-1376 (1986) bekannt. Verfahren zur Herstellung der Sulfate sind von T. Nakahara, et al., Anal. Bio. Chem. 154: 193-199 (1986) und J. Martinez, et al., J. Med. Chem. 25: 589-593 (1982) bekannt. Verfahren zur Herstellung der S-Sulfate sind von R. D. Cole, Met. Enzymol. 11: 206 (1967) bekannt.
Die Anticoagulanzien-Dosis eines Peptidderivats dieser Erfindung liegt zwischen 0,2 mg/kg und 250 mg/kg des Körpergewichts des Patienten pro Tag, abhängig vom Patienten, der Schwere der thrombotischen Situation, die zu behandeln ist, und des ausgewählten Peptidderivats. Die geeignete Dosis für einen bestimmten Patienten kann hinreichend bestimmt werden. Typischerweise würden 1 bis 4 tägliche Dosen mit 5 mg bis 100 mg aktiver Verbindung pro Dosis verabreicht werden.
Eine Anticoagulanzien-Therapie ist für die Behandlung und Prävention verschiedener thrombotischer Situationen, besonders bei Erkrankung der Coronararterien und der Hirngefäße angezeigt. Der erfahrene Fachmann ist sich hinreichend der Umstände bewusst, die eine Anticoagulanzien-Therapie erforderlich machen. Der Begriff "Patient", der hierin verwendet wird, soll sich auf Säuger wie Primaten, einschließlich Menschen, Schafe, Pferde, Rinder, Schweine, Hunde, Katzen, Ratten und Mäuse beziehen.
Obwohl einige der Peptidderivate nach der oralen Verabreichung die Passage durch den Darmkanal überleben können, ziehen die Anmelder die nicht-orale Verabreichung vor, z. B. subkutan, intravenös, intramuskulär oder intraperitoneal; die Verabreichung durch Depot- Injektion; durch Herstellung eines Implantats; oder durch Applikation an die Schleimhäute wie die der Nase, des Rachens und der Bronchialröhren; zum Beispiel kann in einem Aerosol ein Peptidderivat dieser Erfindung in Form eines Sprays oder eines Trockenpuders enthalten sein.
Für die parenterale Verabreichung können die Verbindungen als injizierbare Dosen einer Lösung oder Suspension der Verbindung in einem physiologisch verträglichen Verdünnungsmittel mit einem pharmazeutischen Träger, der eine sterile Flüssigkeit wie Wasser und Öle sein kann, mit oder ohne Zusatz eines grenzflächenaktiven Mittels und anderer pharmazeutisch verträglicher Adjuvantien verabreicht werden. Veranschaulichend für Öle, die in diesen Mitteln verwendet werden können, sind jene von Erdöl, tierischem, pflanzlichem oder synthetischem Ursprung, zum Beispiel Erdnussöl, Sojaöl und Mineralöl. Im Allgemeinen sind Wasser, Kochsalzlösung, wässrige Dextrose und verwandte Zuckerlösungen, Ethanol und Glycole wie Propylenglycol oder Polyethylenglycol bevorzugte wässrige Trägerstoffe, besonders für injizierbare Lösungen.
Die Verbindungen können in Form einer Depotinjektion oder eines Implantatpräparats verabreicht werden, die so hergestellt sind, dass sie eine Langzeit-Freisetzung des aktiven Bestandteils gewähren. Der aktive Bestandteil kann in Pellets oder kleine Zylinder komprimiert werden und subcutan oder intramuskulär als Depotinjektionen oder Implantate implantiert werden. Implantate können inerte Materialien wie biologisch abbaubare Polymere oder synthetische Silikone, zum Beispiel Silastic, Silikongummi, hergestellt durch die Dow- Corning Corporation, verwenden.
Diese Erfindung wird durch die folgenden, nicht-begrenzenden Beispiele veranschaulicht.

BEISPIEL 1

Herstellung von Suc-Tyr-Pro-Ile-Pro-Glu-Glu-Ala-Pnh(SO&sub3;)-D-Glu-OH

Das Peptid Suc-Tyr-Pro-Ile-Pro-Glu-Glu-Ala-Pno-D-Glu-OH wurde durch Festphasenverfahren unter Verwendung von 0,5 mMol eines 0,56 mMol/g Boc-D-Glu(Bzl)- Mernfield-Harzes synthetisiert. Doppelte symmetrische Anhydrid-Kupplungen wurden mit 2,0 mMol N-α-Boc-Aminosäure (Peptides International) durchgeführt, außer im Fall von N-α- Boc-p-Nitrophenylalanin, das mit dem DCC\HOBT-Verfahren gekoppelt wurde. Der verwendete Seitenkettenschutz war: Glu(Bzl), Tyr(2-BrZ). Nach Vervollständigung der Synthese des N-α-Boc wurde der Schutz mit 50% Trifluoressigsäure in Methylenchlorid entfernt. Das Peptid wurde mit Succinsäure-Anhydrid in Dimethylformamid N-terminal mit einer Kappenstruktur versehen, viermal mit Dimethylformamid gewaschen, viermal mit Methylenchlorid gewaschen und in vacuo getrocknet. Das Peptid wurde von Schutzguppen befreit und mit wasserfreiem HF, welches 5% Anisol enthielt, bei -5ºC 45 Minuten lang von dem Harz gespalten. Das HF wurde in vacuo bei -5ºC entfernt, das Peptid mit 50% wässrigem Acetonitril und 30% wässriger Essigsäure von dem Harz extrahiert und lyophilisiert.
Das Peptid wurde durch Umkehrphasen-HPLC auf einer Rainin Dynamax-21,4 · 250 mm-C18-Säule mit einem linearen Acetonitril-Gradienten von 20 bis 23% 15 Minuten lang in 0,1% wässrigem Trifluoressigsäurepuffer gereinigt. Die Reinheit wurde durch analytische HPLC auf einer Vydac 218TP54-Säule (4,6 · 250 mm C18) mit einem linearen Acetonitril-Gradienten von 15 bis 40%, 1% pro Minute, in 0,1% wässrigem Trifluoressigsäurepuffer überprüft; die Identität wurde durch FAB-Massenspektroskopie und Aminosäurenanalyse bestätigt.
Das p-Nitrophenylalanin des gereinigten Peptids wurd mit 10% Pd/C und trockenem Ammoniumformiat in wasserfreiem Methanol bei Raumtemperatur unter Argon eine Stunde lang zu p-Aminophenylalanin reduziert. Der Katalysator wurde abgefiltert, das Lösungsmittel auf einem rotierenden Evaporator bei Raumtemperatur entfernt und das Peptid in 50% Acetonitril gelöst, dann lyophilisiert. Das Peptid wurde wie vorstehend beschrieben unter Verwendung eines linearen Acetonitril-Gradienten von 15-19% gereinigt; Reinheit und Identität wurden wie vorstehend bestätigt.
Das getrocknete p-Aminophenylpeptid wurde mit Schwefeltrioxidpyridin-Komplex in wasserfreiem Puridin und Dimethylformamid bei Raumtemperatur unter Argon 1 Stunde lang in p-Sulfonylaminophenyl umgewandelt. Die Reaktion wurde mit Wasser, welches mit gesättigter Natriumcarbonatlösung auf einen pH-Wert von 7 eingestellt war, gelöscht und lyophilisiert. Das Peptid wurde durch Umkehrphasen-HPLC auf einer Rainin Dynamax-21,4 · 250 mm-C18-Säule mit einem Acetonitril-Gradienten von 0 bis 10% 15 Minuten in einem 10 mM Ammoniumacetatpuffer bei einem pH-Wert von 6,0 gereinigt. Die reinen Fraktionen wurden vereinigt und lyophilisiert, dann zweimal in deionisiertem Wasser erneut gelöst und lyophilisiert. Die Identität wurde durch analytische HPLC, positive und negative Ionen-FAB- MS und Aminosäureanalyse bestätigt; eine Fragmentierung war jedoch nur mit positiver Ionen-FAB-MS zu sehen, bei der das Sulfatamid die erste Bindung war, die aufbrach.
Protonen-NMR und UV-Spektroskopie bestätigten, dass das p-Aminophenylalanin sulfatiert war und dass der Tyrosin-Rest unverändert blieb.
Die Verbindungen der Beispiele 2-4 werden auf ähnliche Weise hergestellt.

BEISPIEL 2

Suc-Tyr(SO&sub3;H')-Glu-Pro-Ile-Pro-Glu-Glu-Ala-Phe(pNHSO&sub3;H)-D-Glu-OH

BEISPIEL 3

Suc-Tyr-Glu-Pro-Ile-Pro-Glu-Glu-Phe(pNHSO&sub3;H)-D-Glu-OH

BEISPIEL 4

Suc-Phe(pNHSO&sub3;H)-Glu-Pro-Ile-Pro-Glu-Glu-Ala-Cha-D-Glu-OH

BEISPIEL 5

Suc-Tyr(SO&sub3;H)-Glu-Pro-Ile-Pro-Glu-Glu-Ala-Cha-D-Glu-OH

BEISPIEL 8

Suc-Tyr-Ser(SO&sub3;H)-Pro-Ile-Pro-Ser(SO&sub3;H)-Ser(SO&sub3;H)-Ala-Cha-Ser(SO&sub3;H)OHOH

Die Eigenschaften für die Peptide aus den Beispielen 1-5 und 8 sind wie folgt.

Claims

1. Peptidderivat

Suc-Tyr-Pro-Ile-Pro-Glu-Glu-Ala-Pnh(SO&sub3;H)-D-Glu-OH

oder ein pharmazeutisch verträgliches Säureadditionssalz davon.

2. Peptidderivat

Suc-Tyr(SO&sub3;H)-Glu-Pro-Ile-Pro-Glu-Glu-Ala-Phe(pNHSO&sub3;H)-D-Glu-OH

oder ein pharmazeutisch verträgliches Säureadditionssalz davon.

3. Peptidderivat

Suc-Tyr-Glu-Pro-Ile-Pro-Glu-Glu-Phe(pNHSO&sub3;H)-D-Glu-OH -

oder ein pharmazeutisch verträgliches Säureadditionssalz davon.

4. Peptidderivat

Suc-Phe(pNHSO&sub3;H)-Glu-Pro-Ile-Pro-Glu-Glu-Ala-Cha-D-Glu-OH

oder ein pharmazeutisch verträgliches Säureadditionssalz davon.

5. Peptidderivat

Suc-Tyr(SO&sub3;H)-Glu-Pro-Ile-Pro-Glu-Glu-Ala-Cha-D-Glu-OH

oder ein pharmazeutisch verträgliches Säureadditionssalz davon.

6. Peptidderivat

Suc-Tyr-Ser(SO&sub3;H)-Pro-Ile-Pro-Ser(SO&sub3;H)-Ser(SO&sub3;H)-Ala-Cha- Ser(SO&sub3;H)-OH

oder ein pharmazeutisch verträgliches Säureadditionssalz davon.

7. Verfahren zur Herstellung eines Peptidderivats der Formel (1)

X-A&sub1;-A&sub2;-A&sub3;-A&sub4;-A&sub5;-A&sub6;-A&sub7;-A&sub8;-A&sub9;-A&sub1;&sub0;-Y

nach einem der Ansprüche 1 bis 6 oder eines pharmazeutisch verträglichen Salzes davon, umfassend:

a) Binden einer BOC-geschützten Aminosäure entsprechend der A10- Gruppe an einen aktivierten Harzträger;

b) anschließendes Binden der übrigen geschützten Aminosäuren von A9-A1 an die endständige Aminogruppe der wachsenden Peptidkette, welche unterdessen durch das Entfernen ihrer Aminoschutzgruppe freigelegt wurde; und

c) zuletzt Isolieren des gewünschten Peptids oder eines pharmazeutisch verträglichen Salzes davon.

8. Peptidderivat nach einem der Ansprüche 1 bis 6 oder ein Gemisch davon zur Verwendung als pharmazeutisch aktiven Stoff.

9. Peptidderivat nach einem der Ansprüche 1 bis 6 oder ein Gemisch davon zur Verwendung als Anticoagulans.

10. Arzneimittel beinhaltend eine als Anticoagulans wirksame Menge eines Peptidderivats nach einem der Ansprüche 1 bis 6 oder ein Gemisch davon und gegebenenfalls einen pharmazeutisch verträglichen Träger und/oder ein Verdünnungsmittel.

11. Verfahren zur Herstellung eines Arzneimittels, umfassend das Mischen eines Peptidderivats nach einem der Ansprüche 1 bis 6 oder eines Gemisches davon mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger und/oder einem Verdünnungsmittel.