DE68916850T2

DE68916850T2 - Antikoagulierende Peptid-Alkohole.

Info

Publication number: DE68916850T2
Application number: DE68916850T
Authority: DE
Inventors: John L Krstenansky
Original assignee: Merrell Dow Pharmaceuticals Inc
Current assignee: Aventis Pharmaceuticals Inc
Priority date: 1988-05-10
Filing date: 1989-05-05
Publication date: 1994-10-27
Anticipated expiration: 2009-05-06
Also published as: PH26973A; FI892222A0; DK226889A; JPH01313500A; ATE108801T1; ES2060689T3; DE68916850D1; CA1341354C; IL90220A0; AU626070B2; EP0341607A3; PT90504B; KR900018138A; CN1041157A; HUT51295A; EP0341607A2; NZ228995A; KR0131378B1; PT90504A; FI892222A

Description

Diese Erfindung bezieht sich auf neue Peptid-Alkohole, die nützliche Antikoagulationsmittel sind.
Antikoagulantien sind nützliche Therapiemittel bei der pharmakologischen Behandlung von z.B. akuter tiefer Venenthrombose, Lungenembolie, akuter arterieller Embolisation der Extremitäten, Myokardinfarkt und disseminierter intravasculärer Gerinnung. Man glaubt, daß die prophylaktische Verabreichung von Antikoagulantien eine Rückfallembolie bei Patienten mit rheumatischer oder arteriosklerotischer Herzkrankheit verhindert und bestimmten Thromboembolie-Komplikationen der Chirurgie vorbeugt. Die Verabreichung von Antikoagulantien ist auch bei der Behandlung von Koronararterien- und cerebrovasculärer Erkrankung indiziert worden. Arterielle Thrombose, besonders in den Herzmuskel und Gehirn versorgenden Arterien, ist eine Haupttodesursache.
Hirudin ist ein aus den Speicheldrüsen von Blutegeln isoliertes Polypeptid mit 65 Resten. Es ist ein Antikoagulationsmittel, das ein Thrombin-spezifischer Hemmstoff ist. Obwohl durchaus wirksam, erscheint die klinische Verwendung von aus Blutegel-Extrakten isoliertem Hirudin unwahrscheinlich auf Grund seiner begrenzten Menge, der Kosten und der Allergiereaktionen, die gewöhnlich der Verabreichung eines Fremdproteins dieser Größe folgen.
Die Anmelder haben eine spezifische Region des Hirudins entdeckt, die zumindest teilweise verantwortlich ist für dessen Antikoagulationswirksamkeit. Diese Region ist chemisch synthetisiert worden und bestimmte Analoge davon scheinen die Erkennungsstelle von Thrombin zu binden, aber nicht die räumlich getrennte enzymatische Spaltstelle. Die Bindung der synthetischen Peptide verhindert kompetitiv die Bindung von Fibrinogen an die Thrombin- Erkennungsstelle, einer Vorbedingung für Fibrinproduktion und Blutgerinnselbildung. Die Anmelder haben jetzt bestimmte reduzierte Derivate dieses Peptids hergestellt. Die Carbonsäure-Funktion dieser neuen Derivate ist nun auf die entsprechende Alkohol-Funktionalität reduziert worden. Die erfindungsgemäßen Peptid-Alkohole besitzen eine beträchtliche Antikoagulationswirksamkeit und ihre ungewöhnliche Fähigkeit, ohne Bindung an die Spaltstelle von Thrombin nur an die Erkennungsstelle zu binden, kann einen wisenschaftlich interessanten und therapeutisch bedeutsamen Zusatz zur Antikoagulanstherapie ermöglichen. Das Vorhandensein der Alkohol-Funktion kann außerdem eine erhöhte Wirksamkeit und verlängerte Wirkungsdauer bewirken.
Peptid-Derivate der Formel
X-A&sub1;-A&sub2;-A&sub3;-A&sub4;-A&sub5;-A&sub6;-A&sub7;-A&sub8;-A&sub9;-A&sub1;&sub0;-ol
sind nützliche Antikoagulationsmittel,
wobei X ein Amino-terminaler Rest ist, ausgewählt aus einem Wasserstoffatom, einem oder zwei Alkylresten mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, einem oder zwei Acylresten mit 2 bis 10 Kohlenstoffatomen, einer Carbobenzyloxy- oder t-Butyloxycarbonylgruppe;
A&sub1; eine Bindung oder ein Peptid ist, das 1 bis 11 Reste einer beliebigen Aminosäure enthält;
A&sub2; Phe, SubPhe, β-(2- und 3-Thienyl)-Alanin, β-(2- und 3- Furanyl)-alanin, β-(2-, 3- und 4-Pyridyl)-alanin, β-(Benzothienyl-2- und 3-yl)-alanin, β-(1- und 2-Naphthyl)- alanin, Tyr oder Trp ist;
A&sub3; Glu oder Asp ist;
A&sub4; eine beliebige Aminosäure ist;
A&sub5; Ile, Val, Leu, Nle oder Phe ist,
A&sub6; Pro, Hyp, 3,4-DehydroPro, Thiazolidin-4-carboxylat, Sar, NMePgl oder D-Ala ist;
A&sub7; eine beliebige Aminosäure ist;
A&sub8; eine beliebige Aminosäure ist;
A&sub9; eine lipophile Aminosäure, ausgewählt aus Tyr, Met, Trp, Phe, Leu, Me, Ile, Val, Cha und Pro, oder ein Dipeptid, enthaltend mindestens eine dieser lipophilen Aminosäuren, ist; und
A&sub1;&sub0;-ol ein reduziertes, null bis fünf Reste einer beliebigen Aminosäure enthaltendes Peptidfragment ist, wobei die Carboxyterminale Aminosäure zu ihrem Alkoholderivat reduziert ist.
Die folgenden allgemeinen Abkürzungen der Aminosäuren werden in dieser Beschreibung durchgängig verwendet:
Ac - Acetylgruppe
Ala (oder A) - Alanin
DAla (oder a) - D-Alanin
Arg (oder R) - Arginin
Asn (oder N) - Asparagin
Asp (oderD) - Asparaginsäure
pClPhe - para-Chlor-phenylalanin
Cha - Cyclohexylalanin
Cys (oder C) - Cystein
3,4-dehydroPro - 3,4-Dehydroprolin
Gly (oder G) - Glycin
Glu (oder E) - Glutaminsäure
Glu (oder e) - D-Glutaminsäure
Gln (oder Q) - Glutamin
Glt - Glutarylgruppe
His (oder H) - Histidin
Hyp - Hydroxyprolin
Ile (oder I) - Isoleucin
Leu (oder L) - Leucin
Lys (oder K) - Lysin
Mal - Maleylgruppe
Met (oder M) - Methionin
NMePgl - N-Methyl-phenylglycin
Npa - β-(Naphtyl)-alanin
pNO&sub2;Phe - para-Nitro-phenylalanin
Nle - Norleucin
Orn - Ornithin
pSubPhe - parasubstituiertes Phenylalanin
Phe (oder F) - Phenylalanin
Pgl - Phenylglycin
Pro (oder P) - Prolin
Sar - Sarcocin (N-Methylglycin)
Ser (oder S) - Serin
SubPhe - ortho-, meta- oder para-, mono- oder disubstituiertes Phenylalanin
Suc - Succinylgruppe
Thr (oder T) - Threonin
Trp (oder W) - Tryptophan
Tyr (oder Y) - Tyrosin
Val (oder V) - Valin
Die Anmelder meinen mit dem Begriff "ein reduziertes, einen bis fünf Rest(e) einer beliebigen Aminosäure enthaltendes Peptidfragment, wobei die Carboxy-terminale Aminosäure zu ihrem Alkoholderivat reduziert ist", daß das Kohlenstoffatom der Carboxylgruppe der Carboxy-terminalen Aminosäure ersetzt wird durch eine Hydroxymethylgruppe, -(CH&sub2;)OH. Wenn auch der A&sub1;&sub0;- Rest der erfindungsgemäßen Polypeptide bis zu fünf Aminosäuren enthalten kann, ist doch beabsichtigt, daß nur die Carboxy-terminale Aminosäure zu ihrem entsprechenden Alkoholderivat reduziert wird. ln der Praxis ist es natürlich nicht möglich, daß eine andere als die Carboxy-terminale Aminosäure derart reduziert wird, weil eine Peptidbindung ausgeschlossen wäre. Diese einzelne Säure ist in den Beispielen, in denen A&sub1;&sub0; eine einzelne Aminosäure ist, die zu ihrem Alkoholderivat reduzierte Säure. Die Strukturformel solcher reduzierten Aminosäuren kann dargestellt werden als:
wobei R der charakteristische Rest jeder Aminosäure ist. Z.B. ist R im Fall von Glycin ein Wasserstoffatom, im Fall von Alanin eine Methylgruppe, im Fall von Valin eine lsopropylgruppe, im Fall von Phenylalanin eine Benzylgruppe und im Fall von Cystein eine Mercaptomethylgruppe. Die reduzierte Form von Prolin ist ein Alkohol der folgenden Strukturformel.
Eine zu ihrem Alkoholderivat reduzierte Aminosäure wird hierbei abgekürzt entweder unter Verwendung des Dreibuchstaben- (oder einer anderen verkürzten Form) oder des Einbuchstaben-Codes, gefolgt von "-ol", wobei z.B. "Ala-ol" oder "A-ol" ein Alanin bedeutet, bei dem der Carboxylanteil zu dem entsprechenden Alkohol reduziert worden ist, und "Leu-ol" oder "L-ol" ein Leucin bedeutet, bei dem der Carboxylanteil zum entsprechenden Alkohol reduziert worden ist.
Ein Alkylrest und der Alkylteil eines Mkoxyrestes wird so aufgefaßt, daß unverzweigte, verzweigte oder cyclische Alkylreste umfaßt sind, z.B. eine Methyl-, Ethyl-, Propyl-, Isopropyl-, Butyl-, Isobutyl-, tert.-Butyl-, Pentyl-, Isopentyl-, sec.-Pentyl-, Cyclopentyl-, Hexyl-, Isohexyl-, Cyclohexyl- und Cyclopentyl-Methylgruppe. Ein Acylrest mit 2 bis 10 Kohlenstoffatomen wird so aufgefaßt, daß unverzweigte, verzweigte, cyclische, gesättigte und ungesättigte Acylreste mit 1 oder 2 Carbonylanteilen pro Rest enthalten sind, z.B. eine Acetyl-, Benzoyl-, Succinyl-, Maleyl- und Glutarylgruppe. Ein Halogenrest ist ein Fluor-, Chlor-, Brom- oder Jodatom.
Der Begriff "eine beliebige Aminosäure", wie hierin verwendet, bedeutet nicht, daß jede beliebige Carbonsäure mit einem Aminosubstituenten umfaßt ist, sondern wird eher so verwendet, wie er gewöhnlich von einem Fachmann auf dem Gebiet der Polypeptidderivate verwendet wird, und umfaßt sowohl die natürlich vorkommenden Aminosäuren als auch andere, "nichtproteinogene"- α-Aminosäuren, die gewöhnlich vom Fachmann auf dem Gebiet der Peptidchemie verwendet werden, wenn er synthetische Analoge natürlich vorkommender Peptide herstellt. Die natürlich vorkommenden Aminosäuren sind Glycin, Alanin, Valin, Leucin, lsoleucin, Serin, Methionin, Threonin, Phenylalanin, Tyrosin, Tryptophan, Cystein, Prolin, Histidin, Asparaginsäure, Asparagin, Glutaminsäure, Glutamin, Arginin, Ornithin und Lysin. Beispiele von "nichtproteinogen"-α-Aminosäuren sind Norleucin, Norvalin, Alloisoleucin, Homoarginin, Thiaprolin, Dehydroprolin, Hydroxyprolin (Hyp), Homoserin, Cyclohexylglycin (Chg), α-Amino-n-buttersäure (Aba), Cyclohexylalanin (Cha), Aminophenylbuttersäure (Pba), Phenylalanine, die an der Ortho-, Meta- oder Paraposition des Phenylteils substituiert sind mit ein oder zwei der folgenden (C&sub1;-C&sub4;)-Alkyl-, (C&sub1;-C&sub4;)-Alkoxy-, Halogen- oder Nitroreste oder mit einer Methylendioxygruppe, β-2- und 3-Thienylalanin, β-2- und 3-Furanylalanin, β-2-, 3- und 4-Pyridylalanin, β-(Benzothienyl-2- und 3- yl)-alanin, β-(1- und 2- Naphthyl)-alanin, O-alkylierten Derivaten von Serin, Threonin oder Tyrosin, S-alkyliertem Cystein, dem O-Sulfatester von Tyrosin, 3,5-Dijodtyrosin und den D-Isomeren der natürlich vorkommenden Aminosäuren.
Der Begriff "lipophile Aminosäure" umfaßt Tyr, Phe, Leu, Met, Nle, Ile, Val, His und Pro.
Die natürlichen Aminosäuren enthalten mit Ausnahme von Glycin ein chirales Kohlenstoffatom. Die optisch aktiven Aminosäuren, auf die hier Bezug genommen wird, besitzen die L-Konfiguration, falls nicht ausdrücklich anders beschrieben. Z.B. kann jede Aminosäure des A&sub1;- oder A&sub1;&sub0;-Restes die D-oder L- Konfigurauon haben. Wie üblich ist die hier beschriebene Struktur der Peptide derart, daß sich das Amino-terminale Ende auf der linken Seite der Kette befindet und das Carboxy-terminale Ende auf der rechten Seite der Kette.
Die Polypeptide der Formel 1 können mit jeder nicht-toxischen, organischen oder anorganischen Säure pharmazeutisch verträgliche Salze bilden. Zu beispielhaften, geeignete Salze bildenden anorganischen Säuren gehören Salzsäure, Bromwasserstoffsäure, Schwefelsäure und Phosphorsäure und saure Metallsalze, wie Natriummonohydrogenorthophosphat und Kaliumhydrogensulfat. Zu beispielhaften, geeignete Salze bildenden organischen Säuren gehören Mono-, Di- und Tricarbonsäuren. Beispiele solcher Säuren sind z.B. Essigsäure, Glycolsäure, Milchsäure, Brenztraubensäure, Malonsäure, Bernsteinsäure, Glutarsäure, Fumarsäure, Apfelsäure, Weinsäure, Citronensäure, Ascorbinsäure, Maleinsäure, Hydroxymaleinsäure, Benzoesäure, Hydroxybenzoesäure, Phenylessigsäure, Zimtsäure, Salicylsäure, 2-Phenoxybenzoesäure und Sulfonsäuren wie Methansulfonsäure und 2-Hydroxyethansulfonsäure. Zu Salzen des Carboxyterminalen Aminosäureteils gehören die nicht-toxischen Carbonsäuresalze, die mit beliebigen geeigneten anorganischen oder organischen Basen gebildet werden. Zu diesen Salzen gehören beispielsweise die der Mkalimetalle, wie z.B. Natrium und Kalium; der Erdalkalimetalle, wie Calcium und Magnesium; der Leichtmetalle der Gruppe IIIa, einschließlich Aluminium; und organischer primärer, sekundärer und tertiärer Amine, wie z.B.Trialkylamine, einschließlich Triethylamin, Procain, Dibenzylamin, 1-Ethylenamin, N,N'- Dibenzylethylendiamin, Dihydroabietylamin, N-(Nieder)alkylpiperidin, und jedes andere geeignete Amin.
Wie bei jeder Klasse chemischer Verbindungen werden bestimmte Gruppen bevorzugt. Die Anmelder bevorzugen die Peptidderivate der Formel 1, bei denen X ein Wasserstoffatom, eine Acetyl- oder eine Succinylgruppe ist.
Ebenfalls bevorzugt sind Verbindungen der Formel 1, wobei
A&sub1; -Thr-Pro-Lys-Pro-Gln-Ser-His-Asn-Asp-Gly-Asp ist, -Ser-Thr-Pro-Asn-Pro-Glu-Ser-His-Asn-Asn-Gly-Asp, -His-Asn-Asp-Gly-Asp-, -Asn-Asp-Gly-Asp-, -Asp-Gly-Asp-, -Gly-Asp-, -Asp- oder eine Bindung;
A&sub2; Phe, β-2- oder 3-Thienylalanin, Tyr, Trp, Npa oder pClPhe;
A&sub3; Glu;
A&sub4; Glu, Asp, Pro oder Ala;
A&sub5; Ile, Leu;
A&sub6; Pro, Sar, D-Ala, Hyp oder NMePgl;
A&sub7; Glu, Gln, Asp oder Ala;
A&sub8; Glu, Asp oder Ala;
A&sub9; Pro, Ala-Tyr, Ala-Cha, Tyr-Cha, Tyr-Leu, Ala-Phe, Tyr-Tyr;
A&sub1;&sub0;-ol Glu-ol, Asn-ol, Pro-ol, Gln-ol, Ma-ol, D-Lys-ol, Lys-ol, D-Asp-ol, Orn-ol oder Asp-Glu-ol ist.
Besonders bevorzugt sind die Peptidderivate der Formel 1, wobei entweder X eine Acetylgruppe ist und A&sub1; Gly-Asp oder Asp ist oder X eine Succinylgruppe ist und A&sub1; eine Bindung ist und wobei
A&sub2; Phe, β-(2-Thienylalanin) oder Tyr ist;
A&sub3; Glu;
A&sub4; Glu oder Pro;
A&sub5; Ile;
A&sub6; Pro;
A&sub7; Glu;
A&sub8; Glu oder Asp;
A&sub9; Tyr-Leu, Ala-Tyr, Tyr-Tyr, Ma-Phe, Ala-Cha oder Pro; und
A&sub1;&sub0;-ol Ma-ol, Gln-ol, Asp-ol, Pro-ol, D-Asp-ol, D-Lys-ol, D-Glu-ol oder -Asp-Glu-ol ist.
Die erfindungsgemäßen Proteine können hergestellt werden mit einer Anzahl von Verfahren, die dem Fachmann bestens bekannt sind. Zu derartigen Verfahren gehören die schritt- oder blockweise Festphasensynthese, Genclonierung und Kombinationen dieser Verfahren. Das schrittweise Festphasen-Verfahren kann durchgeführt werden unter Verwendung etablierter automatisierter Verfahren, wie z.B. die Verwendung eines Peptid- Syntheseautomaten. Bei diesem Verfahren werden die Peptide an einem Harz konstruiert, wobei mit der vorletzten C-terminalen, geschützten Aminosäure begonnen wird. Der verwendete Harzträger kann jedes geeignete, herkömmlich auf dem Gebiet der Festphasen-Herstellung von Polypeptiden verwendete Harz sein, vorzugsweise Polystyrol, welches mit 0,5 bis 3 Prozent Divinylbenzol vernetzt worden ist, das entweder chlormethyliert oder hydroxymethyliert worden ist, um Stellen zur Esterbildung mit den ursprünglich eingeführten, α-Amino-geschützten Aminosäuren bereitzustellen. Nach Abschluß der Sequenzverknüpfung wurde die Boc- Schutzgruppe entweder an Ort und Stelle belassen oder sie wurde entfernt und die N-terminale Aminogruppe acyliert. Die Entfernung des geschützten Fragments vom Harz wurde mit dem passenden Aininoalkohol erreicht.
Ein Beispiel eines Hydroxymethyl-Harzes wird beschrieben von Bodanszky et al., Chem. Ind. (London) 38, (1966) 1597-98. Ein chlormethyliertes Harz ist kommerziell verfügbar von Bio Rad Laboratories, Richmond, Kalifornien, und die Herstellung eines solchen Harzes wird beschrieben von Stewart et al., "Solid Phase Peptide Synthesis" (Freeman & Co., San Francisco 1969), Kapitel 1, S. 1-6. Die geschützte Aminosäure kann an das Harz gebunden werden mit dem Verfahren von Gisin, Helv. Chem. Acta. 36, (1973) 1476. Viele an Harz gebundene, geschützte Aminosäuren sind kommerziell verfügbar. Z.B. kann ein an ein benzyliertes, hydroxymethyliertes Phenylacetamidomethyl (PAM)-Harz gebundenes, tert.-Butyloxycarbonyl(Boc)-geschütztes Thr zur Herstellung eines erfindungsgemäßen Polypeptids verwendet werden, bei dem das Carboxyterminale Ende ein Thr-Rest ist, und ist kommerziell verfügbar.
Im Anschluß an die Verknüpfung einer α-Amino-geschützten Aminosäure an den Harzträger wird die Schutzgruppe entfernt unter Verwendung eines beliebigen geeigneten Verfahrens, wie z.B. Verwendung von Trifluoressigsäure in Methylenchlorid, von Trifluoressigsäure allein oder von HCl in Dioxan. Die Schutzgruppenentfernung wird bei einer Temperatur zwischen 0ºC und Raumtemperatur durchgeführt. Andere Standardabspaltungsmittel und Bedingungen zur Entfernung bestimmter α-Amino-Schutzgruppen können verwendet werden. Nach der Entfernung der α-Amino-Schutzgruppe werden die anderen Amino-geschützten Aminosäuren in der gewünschten Reihenfolge verknüpft. In einer anderen Ausführungsform können mehrere Aminosäurereste vor der Verknüpfung mit der an den Harzträger gekoppelten Aminosäuresequenz durch das Lösungsverfahren verknüpft werden.
Die für jede in die Polypeptidsequenz eingeführte Aminosäure verwendete α-Amino-Schutzgruppe kann irgendeine, auf dem Fachgebiet bekannte Schutzgruppe sein. Unter den in Betracht kommenden α-Amino-Schutzgruppen befinden sich (1) Schutzgruppen des Acyltyps, wie z.B. Formyl-, Trifluoracetyl-, Phthalyl-, Toluolsulfonyl- (Tosyl), Benzolsulfonyl-, Nitrophenylsulfenyl-, Tritylsulfenyl-, o-Nitrophenoxyacetyl- und α-Chlorbutyrylgruppe; (2) Schutz gruppen des aromatischen Urethan-Typs, wie z. B. Benzyloxycarbonylund substituierte Benzyloxycarbonylgruppen, wie z.B. p- Chlorbenzyloxycabonyl-, p-Nitrobenzylcarbonyl-, p-Brombenzyloxycarbonyl-, p-Methoxybenzyloxycarbonyl-, 1-( p-Biphenylyl)-1-methylethoxycarbonyl-, α,α-Dimethyl-3 ,5-dimethoxybenzyloxycarbonyl- und Benzhydryloxycarbonylgruppe; (3) aliphatische Urethan-Schutzgruppen, wie z.B. tert.- Butyloxycarbonyl(Boc)-, Diisopropylmethoxycarbonyl-, Isopropyloxycarbonyl-, Ethoxycarbonyl- und Allyloxycarbonylgruppe; (4) Schutzgruppen des Cycloalkylurethan-Typs, wie z.B. Cyclopentyloxycarbonyl-, Adamantyloxycarbonyl- und Cyclohexyloxycarbonylgruppe; (5) Schutzgruppen des Thiourethan-Typs, wie z.B. Phenylthiocarbonylgruppe; (6) Schutzgruppen des Alkyltyps, wie z.B. Triphenylmethyl(Trityl)- und Benzylgruppe; (7) Trialkylsilangruppen, wie z.B. Trimethylsilan. Die bevorzugte α-Amino- Schutzgruppe ist die tert.-Butyloxycarbonylgruppe.
Die Auswahl eines geeigneten Verknüpfungsmittels gehört zu den Fertigkeiten des Fachmanns. Ein besonders geeignetes Verknüpfungsmittel, bei dem die anzulagernde Aminosäure Gln, Asn oder Arg ist, stellt N,N'- Diisopropylcarbodiimid und 1-Hydroxybenzotriazol dar. Die Verwendung dieser Reagenzien verhindert Nitril- und Lactambildung. Andere Verknüpfungsmittel sind (1) Carbodiimide (z.B. N,N'-Dicyclohexylcarbodiimid und N-Ethyl-N'-(γ-dimethylaminopropylcarbodiimid)); (2) Cyanamide (z.B. N,N'- Dibenzylcyanamid); (3) Ketenimine; (4) lsoxazoliumsalze (z.B. N-Ethyl-5- phenyl-isoxazolium-3'-sulfonat); (5) monocyclische, Stickstoff enthaltende, heterocyclische Amide mit aromatischen Eigenschaften, die einen bis vier Stickstoffatom(e) im Ring enthalten, wie z.B. lmidazolide, Pyrazolide und 1,2,4- Triazolide. Besondere, nützliche heterocyclische Amide umfassen N,N'- Carbonyldiimidazol und N,N'-Carbonyl-di- 1,2,4-triazol; (6) alkoxylierte Acetylene (z.B. Ethoxyacetylen); (7) Reagenzien, die mit dem Carboxylteil der Aminosäure gemischte Anhydride bilden (z.B. Ethylchlorformiat und lsobutylchlorformiat), oder das symmetrische Anhydrid der anzulagernden Aminosäure (z.B. Boc-Ala-O-Ala-Boc) und (8) Stickstoff enthaltende, heterocyclische Verbindungen mit einer Hydroxygruppe an einem Stickstoffring (z.B. N-Hydroxyphthalimid, N-Hydroxysuccinimid und 1- Hydroxybenzotriazol). Andere Aktivierungsmittel und deren Verwendung bei der Peptidverknüpfung werden beschrieben von Kapoor, J. Pharm. Sci., 59, (1970) S. 1-27. Für alle Aminosäuren bevorzugen die Anmelder die Verwendung des symmetrischen Anhydrids als Verknüpfungsmittel, außer für Arg, Asn und Gln.
Jede geschützte Aminosäure oder Aminosäuresequenz wird in die Festphasenumsetzungskammer mit einem etwa vierfachen Überschuß eingeführt und die Verknüpfung durchgeführt in einem Medium aus Dimethylformamid: Methylenchlorid (1:1) oder in Dimethylformamid allein oder vorzugsweise in Methylenchlorid allein. In Fällen, bei denen eine unvollständige Verknüpfung auftritt, wird das Verknüpfungsverfahren vor der Entfernung der α-Amino-Schutzgruppe und vor dem Verknüpfen der nächsten Aminosäure in der Festphasenumsetzungskammer wiederholt. In jedem Stadium der Synthese wird der Erfolg der Verknüpfungsumsetzung überwacht mit der Ninhydrinreaktion, wie beschrieben von E. Kaiser et al., Analyt. Biochem. 34, (1970) 595.
Das Peptid wird vom Harz entfernt, nachdem die gewünschte Aminosäuresequenz erhalten worden ist. Das kann ausgeführt werden durch Hydrolyse, wie z.B. durch Behandlung des an das Harz gebundenen Polypeptids mit einem Kohlenstoff-terminalen Aminoalkoholrest, Essigsäure und Dichlormethan (DCM).
Wie auf dem Gebiet der Festphasenpeptidsynthese bekannt ist, tragen viele der Aminosäuren Funktionalitäten, die während der Kettenherstellung Schutz benötigen. Die Verwendung und die Auswahl der geeigneten Schutzgruppe gehört zu der Fähigkeit des Fachmannes und hängt ab von der zu schützenden Aminosäure und dem Vorhandensein anderer, geschützter Aminosäurereste im Peptid. Die Auswahl einer solchen Seitenketten-Schutzgruppe ist insofern kritisch, als sie eine sein muß, die während der Abspaltung der Schutzgruppe des α-Amino-Teils nicht durch Spaltung entfernt wird. Z.B. sind geeignete Seitenketten-Schutzgruppen für Lysin eine Benzyloxycarbonyl- und substituierte Benzyloxycarbonylgruppe, wobei der Substituent ausgewählt wird aus einer Halogen-(z.B. Chlor-, Brom-, Fluor-) und Nitrogruppe (z.B. 2- Chlorbenzyloxycarbonyl-, p-Nitrobenzyloxycarbonyl-, 3,4-Dichlorbenzyloxycarbonylgruppe), Tosylgruppe, t-Amyloxycarbonylgruppe, t- Butyloxycarbonyl- und Diisopropylmethoxycarbonylgruppe. Die alkoholische Hydroxylgruppe von Threonin und Serin kann geschützt werden mit einer Acetyl-, Benzoyl-, tert.-Butyl-, Trityl-, Benzyl-, 2,6-Dichlorbenzyl- oder Benzyloxycarbonylgruppe. Die bevorzugte Schutzgruppe ist die Benzylgruppe.
Diese Gruppen können entfernt werden mit Verfahren, die im Fachgebiet gut bekannt sind. Typischerweise wird die Schutzgruppenentfernung ausgeführt, nachdem die Peptidkettensynthese vollständig ist, die Schutzgruppen können jedoch zu jedem anderen geeigneten Zeitpunkt entfernt werden.
Die Antikoagulans-Dosis eines erfindungsgemäßen Alkohol-Peptidderivates liegt bei 0,2 mg/kg bis 250 mg/kg des Patienten-Körpergewichtes pro Tag in Abhängigkeit vom Patienten, der Schwere des zu behandelnden Thrombosezustandes und des ausgewählten Peptid-Derivates. Die geeignete Dosis für einen bestimmten Patienten kann leicht bestimmt werden. Vorzugsweise 1 bis 4 tägliche Dosen würden typischerweise mit 5mg bis 100 mg der wirksamen Verbindung pro Dosis verabreicht. Durch einen Fachmann kann die Menge eines erfindungsgemaßen Peptid-Alkohols leicht bestimmt werden, die benötigt wird, um Blutgerinnung in einem extracorporalen Medium, wie z.B. gelagertem Vollblut, zu hemmen oder zu verhindern.
Die Antikoagulans-Therapie ist indiziert bei der Behandlung und Vorbeugung einer Vielzahl von Thrombosezuständen, insbesondere bei Coronararterien- und cerebrovaskulärer Erkrankung. Diejenigen mit Erfahrung auf diesem Gebiet nehmen leicht die Anzeichen wahr, die eine Antikoagulans-Therapie erfordern. Der Begriff "Patient" wird hierbei so aufgefaßt, daß Säugetiere gemeint sind, wie z.B. Primaten, einschließlich Menschen, Schafen, Pferden, Rindern, Schweinen, Hunden, Katzen, Ratten und Mäusen. Die Hemmung der Blutgerinnung ist nicht nur nützlich bei der Antikoagulans-Therapie von Individuen mit Thrombosezuständen, sondern ist vorteilhaft, wann immer die Hemmung der Blutgerinnung erwünscht wird, wie z.B. um Gerinnung in gelagertem Vollblut zu verhindern oder der Gerinnung in anderen biologischen Proben für Versuche oder Lagerung vorzubeugen.
Obwohl einige Peptid-Derivate die Darmpassage im Anschluß an orale Verabreichung überstehen, bevorzugen die Anmelder eine nicht-orale Verabreichung, z.B. subcutan, intravenös, intramuskulär oder intraperitoneal, Verabreichung durch Depotinjektion, durch ein Implantatpräparat oder durch AuIbringen auf Schleimhäute, wie z.B. der Nase, des Halses und der Bronchien, mit einem das erfindungsgemäße Peptid-Derivat enthaltendem Aerosol, mit einem Spray oder in Form eines Trockenpulvers.
Zur parenteralen Anwendung können die Verbindungen verabreicht werden als injizierbare Dosierungen einer Lösung oder Suspension der Verbindung in einem physiologisch verträglichen Verdünnungsmittel mit einem pharmazeutischen Träger, der eine sterile Flüssigkeit sein kann, wie z.B. Wasser oder Öle, mit oder ohne die Zugabe eines grenzflächenaktiven Mittels und anderer pharmazeutisch verträglicher Hilfsmittel. Beispiele von Ölen, die bei diesen Herstellungen verwendet werden können, sind diejenigen, die aus Petroleum, Tieren oder Pflanzen stammen oder synthetischen Ursprungs sind, z. B. Erdnußöl, Sojabohnenöl und Mineralöl. Bevorzugte Flüssigkeitsträger, insbesondere für injizierbare Lösungen, sind im allgemeinen Wasser, physiologische Kochsalzlösung, wäßrige Dextrose- und verwandte Zuckerlösungen, Ethanol und Glykole, wie z.B. Propylenglykol oder Polyethylenglykol.
Die Verbindungen können verabreicht werden in Form einer Depotinjektion oder eines Implantatpräparats, die in einer solchen Art und Weise zubereitet werden können, daß eine Langzeitfreisetzung des Wirkstoffs ermöglicht wird. Der Wirkstoff kann zu Tabletten oder kleinen Zylindern gepresst und als Depotinjektionen oder Implantate subcutan oder intramuskulär implantiert werden. Für Implantate können reaktionsträge Materialien verwendet werden, wie biologisch abbaubare Polymere oder synthetische Silicone, z.B. Silastic, Silicongummi, hergestellt von der "Dow- Corning Corporation".

BEISPIELE

Diese Erfindung wird durch die folgenden, nicht einschränkenden Beispiele veranschaulicht.

BEISPIEL 1

Herstellung von Kohlenstoff-terminalen Peptid-Alkoholen

Die Peptide wurden synthetisiert unter Verwendung eines p-Nitrobenzhydrylidenisonitroso-Harzes (Oxim-Harz), hergestellt mit dem Verfahren von DeGrado und Kaiser (J. Org. Chem. 45, (1980) 1295-1300). Das Oxim-Harz (0,54 g, 0,52 mmol/O,97 mmol/g Substitution) wurde in einen Behälter eines Peptidsyntheseautomaten von "Applied Biosystems", Modell 430A, gegeben. Boc- geschützte Aminosäuren wurden einzeln aufeinanderfolgend verknüpft in Form ihrer symmetrischen Anhydride in einem zweifachen Überschuß. Der benutzte Seitenkettenschutz war wie folgt: Asp(Chx), Glu(Bzl), Tyr(2-BrZ). Die Programme des Syntheseautomaten wurden so geschrieben, daß sich für jeden Zyklus das folgende Protokoll ergab:
1) Zufügen von 1mmol von vorher hergestelltem symmetrischem Anhydrid;
2) Zufügen von 5% zusätzlichem Volumen DIEA;
3) 1 Stunde verwirbeln;
4) Abtropfen lassen;
5) Waschen (5x/1 Min.) mit DCM;
6) Waschen (1Min.) mit 20%TFA in DcM;
7) 15-minütiges Behandeln mit 20% TFA in DCM;
8) Waschen mit DCM (3x/0,5 Min.);
9) Waschen (4 Min.) mit Isopropanol;
10) Waschen (3x/0,5 Min.);
11) Waschen mit Isopropanol (4 Min.);
12) Waschen (3x/0,5 Min.) mit DCM;
13) Waschen (4 Min.) mit Isopropanol;
14) Waschen (3x/0,5 Min.).
Nach Abschluß der Synthese wurde das Harz im Vakuum getrocknet. Das Harz wurde dann 20 Stunden behandelt mit 2 Äquivalenten (auf der Grundlage der Anfangs-Harzsubstitution) Alaninol und 1 Äquivalent Essigsäure in DCM bei Raumtemperatur. Das Harz wurde gefiltert. Die Filtrate wurden gefriergetrocknet. Der Rückstand wurde 30 Minuten mit flüssiger HF, enthaltend 2% Anisol, bei -5ºC behandelt. Nach Entfernung der HF im Vakuum wurde das Peptid mit 30% Acetonitril extrahiert und gefriergetrocknet. Der Rückstand wurde aufgereinigt mit präparativer HPLC (Dynamax C18 21,4 x 150 mm Säule) unter Verwendung eines Acetonitril/0,1% TFA-Systems. Das mit diesem Verfahren erhaltene Peptid zeigte den gewünschten molekularen lonen-Peak mit FAB-MS und wies eine mit dem gewünschten Peptid übereinstimmende Aminosäurezusammensetzung auf. Auf diese Weise wurden die folgenden Peptide mit den dargelegten Eigenschaften hergestellt.
1) SucFEPIPEYL-ol MW 1092,6 FAB-MS (MH)&spplus; 1094,0 tR 17,53 E&sub2;&sub8;&sub0; 1573 Peptidgehalt 79,8% Glx(2) Pro (2) Ile (1) Tyr (1) Phe (1) 2,08 1,01 0,94 0,99 0,98
2) SucFEPIPEEYChaA-ol MW 1332,7 FAB-MS (MH)&spplus; 1333,4 tR 20,2 Min. E&sub2;&sub8;&sub0; 1755 Peptidgehalt 73% Glx(3) Pro (2) Ile (1) Tyr (1) Phe (1) Cha (1) 3,04 2,03 0,92 1,00 0,97 0,95
3) SucFEPIPEEYL-ol MW 1221,6 FAB-MS (MH)+ 1222,8 tR 16,83 E&sub2;&sub8;&sub0; 1686 Peptidgehalt 72,1% Glx(3) Pro (2) Ile(1) Tyr (1) Phe (1) 3,09 1,98 0,96 0,97 1,00

Claims

1. Alkohol-Peptidderivat der Formel

X-A&sub1;-A&sub2;-A&sub3;-A&sub4;-A&sup5;-A&sub6;-A&sub7;-A&sub8;-A&sub9;-A&sub1;&sub0;-ol

wobei

X ein Wasserstoffatom, ein oder zwei Alkylrest(e) mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen oder ein oder zwei Acylrest(e) mit 2 bis 10 Kohlenstoffatomen ist;

A&sub1; eine Bindung ist oder ein einen bis elf Rest(e) einer beliebigen Aminosäure enthaltendes Peptidfragment ist;

A&sub2; Phe, SubPhe, β-(2- und 3-Thienyl)-alanin, β-(2- und 3-Furanyl)- alanin, β-(2-, 3- und 4-Pyridyl)-alanin, β-(Benzothienyl-2- und 3- yl)-alanin, β-(1- und 2-Naphthyl)-alanin, Tyr oder Trp ist;

A&sub3; Glu oder Asp ist;

A&sub4; eine beliebige Aminosäure ist;

A&sub5; Ile, Val, Leu, Me oder Phe ist;

A&sub6; Pro, Hyp, 3,4-DehydroPro, Thiazolidin-4-carboxylat, Sar, NMePgl oder D-Ma ist;

A&sub7; eine beliebige Aminosäure ist;

A&sub8; eine beliebige Aminosäure ist;

A&sub9; eine lipophile Aminosäure, ausgewählt aus Tyr, Trp, Phe, Leu, Me, Ile, Val, Cha und Pro, oder ein Dipeptid, enthaltend mindestens eine dieser lipophilen Aminosäuren, ist;

A&sub1;&sub0;-ol ein reduziertes, null bis fünf Reste einer beliebigen Aminosäure enthaltendes Peptidfragment ist, wobei die Kohlenstoff-terminale Aminosäure zu ihrem Alkohol-Derivat reduziert ist, oder -ol ist; oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz davon.

2. Alkohol-Peptidderivat nach Anspruch 1, wobei A&sub2; Phe, β-(2- oder 3- Thlenyl)-alanin oder Tyr ist.

3. Alkohol-Peptidderivat nach Anspruch 1 oder 2, wobei A&sub3; Glu ist.

4. Alkohol-Peptidderivat nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei A&sub4; Glu, Ala oder Pro ist.

5. Alkohol-Peptidderivat nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei A&sub5; Ile ist.

6. Alkohol-Peptidderivat nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei A&sub6; Pro ist.

7. Alkohol-Peptidderivat nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei A&sub7; Glu oder Ma ist.

8. Alkohol-Peptidderivat nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei A&sub8; Glu oder Asp ist.

9. Alkohol-Peptidderivat nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei A&sub9; Tyr- Leu, Ala-Tyr oder Ala-Cha ist.

10. Alkohol-Peptidderivat nach einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei A&sub1;&sub0;-ol Gln-ol, Asp-ol, Pro-ol, Asn-ol, Asp-Glu-ol, Glu-ol, Ala-ol, D-Lys-ol, Lys-ol, D- Asp-ol, DGlu-ol oder Orn-ol ist.

11. Alkohol-Peptidderivat nach einem der Ansprüche 1 bis 10, wobei X H, eine Acetyl- oder eine Succinylgruppe ist.

12. Alkohol-Peptidderivat nach einem der Ansprüche 1 bis 11, wobei

A&sub1; Ser-His-Asn-Asp-Gly-Asp, Asn-Asp-Gly-Asp, Asp-Gly-Asp, Gly-Asp, Asp oder eine Bindung ist.

13. Alkohol-Peptidderivat nach einem der Ansprüche 1 bis 11, wobei A&sub1; -Thr-Pro-Lys-Pro-Gln-Ser-His-Asn-Asp-Gly-Asp- ist.

14. Alkohol-Peptidderivat nach einem der Ansprüche 1 bis 11, wobei A&sub1; -Thr-Pro-Asn-Pro-Glu-Ser-His-Asn-Asn-Gly-Asp ist.

15. Alkohol-Peptidderivat nach Anspruch 1, das H-Gly-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile- Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu-Gln-ol ist.

16. Alkohol-Peptidderivat nach Anspruch 1, das Suc-Phe-Glu-Glu-Ile-Pro- Glu-Glu-Tyr-Leu-Gln-ol ist.

17. Alkohol-Peptidderivat nach Anspruch 1, das H-Gly-Asp-Phe-Glu-Pro-Ile- Pro-Glu-Asp-Ala-Tyr-Asp-Glu-ol ist.

18. Alkohol-Peptidderivat nach Anspruch 1, das Suc-Phe-Glu-Pro-Ile-Pro- Glu-Glu-Tyr-Leu-Pro-ol ist.

19. Alkohol-Peptidderivat nach Anspruch 1, das Suc-Phe-Glu-Glu-Ile-Pro- Glu-Glu-Tyr-Leu-Gln-ol ist.

20. Alkohol-Peptidderivat nach Anspruch 1, das Suc-Phe-Glu-Pro-Ile-Pro- Glu-Glu-Tyr-Leu-Gln-ol ist.

21. Alkohol-Peptidderivat nach Anspruch 1, das Suc-Tyr-Glu-Pro-Ile-Pro- Glu-Glu-Ala-Phe-D-Lys-ol ist.

22. Alkohol-Peptidderivat nach Anspruch 1, das Suc-Tyr-Glu-Pro-Ile-Pro- Glu-Glu-Ala-Tyr-Lys-ol ist.

23. Alkohol-Peptidderivat nach Anspruch 1, das Suc-Tyr-Glu-Pro-Ile-Pro- Glu-Glu-Ala-Cha-Lys-ol ist.

24. Alkohol-Peptidderivat nach Anspruch 1, das Suc-Tyr-Glu-Pro-Ile-Pro- Glu-Glu-Ala-Phe-Glu-ol ist.

25. Alkohol-Peptidderivat nach Anspruch 1, das Suc-Tyr-Glu-Pro-Ile-Pro- Glu-Glu-Ala-Phe-Gln-ol ist.

26. Alkohol-Peptidderivat nach Anspruch 1, das Suc-Tyr-Glu-Pro-Ile-Pro- Glu-Glu-Ala-Cha-Asp-ol ist.

27. Verfahren zur Herstellung eines Alkohol-Peptidderivates nach einem der Ansprüche 1 bis 26, welches umfaßt

(a) Bindung einer geeignet geschützten, der A&sub9;-Aminosäure entsprechenden Aminosäure an einen aktivierten Harzträger;

(b) nachfolgende Bindung der anderen alpha-Amino-geschützten Aminosäuren in der Abfolge vom Carboxy-Ende bis zum Amino-Ende, von A&sub8; durchgehend bis A&sub1;, an das Amino-Ende der wachsenden Peptidkette, das inzwischen durch Entfernung seiner Amino- Schutzgruppe freigelegt worden ist; und

(c) zuletzt Behandlung des an das Harz gebundenen Peptides mit etwa 2 Äquivalenten des A&sub1;&sub0;-ol entsprechenden Carboxyterminalen Aminoalkohols und etwa 1 Äquivalent Essigsäure in Dichlormethan, um das Peptid vom Harz freizusetzen und gleichzeitig den Carboxy-terminalen Peptid-Alkohol an das Peptid zu binden, wodurch sich das gewünschte Peptid-Alkoholderivat ergibt.

28. Peptidderivat nach einem der Ansprüche 1 bis 26 oder ein Gemisch davon zur Verwendung als pharmazeutischer Wirkstoff.

29. Peptidderivat nach einem der Ansprüche 1 bis 26 oder ein Gemisch davon zur Verwendung als Antikoagulans.

30. Arzneimittel, enthaltend eine als Antikoagulans wirksame Menge eines Peptidderivates nach einem der Ansprüche 1 bis 26 oder eines Gemisches davon und gegebenenfalls ein pharmazeutisch verträgliches Trägermittel und/oder Verdünnungsmittel.