KR101511071B1 - 단백질 분석법 - Google Patents
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Abstract
피브리노겐의 존재하에 트롬빈 활성을 측정하거나, 트롬빈의 존재하에 피브리노겐의 기능성을 측정하는 방법을 개시한다.
트롬빈, 피브리노겐, 응괴 형성
Description
본 발명은 피브리노겐의 존재하에 트롬빈 활성을 측정하거나, 트롬빈의 존재하에 피브리노겐의 기능성(functionality)을 측정하는 방법에 관한 것이다.
피브리노겐과 트롬빈은 혈관 손상 후의 지혈에 관여하고 혈괴 형성에 필수적인 중요한 단백질들이다. 피브리노겐과 트롬빈은 전형적인 응괴 형성 반응을 개시하지 않고서 분말 형태 또는 비수성 현탁액에서 배합될 수 있기 때문에, 단백질이 용해될 수 있는 수성 매질 또는 다른 액체 환경속에서 이들 단백질을 수화하기 전까지는 피브린 응괴의 형성을 방지할 수 있다. 이들 단백질의 분말 형태의 혼합물은 국소적 지혈, 조직 복구, 약물 전달 등을 포함하는 다양한 잠재적 생의학 용도를 갖는다. 또한, 이들 단백질의 혼합물은 분말 형태로 캐리어(carrier) 또는 기질, 또는 다른 의료 장치 위에 로딩(loading)되어 예컨대 지혈 장치로서 사용될 수 있는 제품을 형성할 수 있다.
트롬빈의 응괴 형성 활성은 일반적으로 트롬빈 용액을 기지량의 피브리노겐 용액과 함께 배합함으로써 측정한다. 적합한 조건하에서 두 단백질을 배합한 후의 응괴 형성 속도는 트롬빈의 활성에 의존한다. 미지량의 트롬빈을 함유하는 시료의 응괴 형성 속도를 참조 트롬빈 또는 표준 트롬빈의 응괴 형성 속도와 비교하여 시료의 활성을 측정한다.
트롬빈 활성은 임의의 트롬빈/피브리노겐 제품의 중요한 특성이며 이의 기능성을 나타내줄 것이다. 유리된 트롬빈의 측정은 간단하지만, 트롬빈과 피브리노겐이 미반응 혼합물로 존재하는 경우에 트롬빈 활성을 측정하려면 전형적으로 단백질의 혼합물을 수화 및 용해시켜야 하며, 수화시 용해된 트롬빈과 피브리노겐 사이에서 피브린 응괴가 바로 시작되기 때문에 이의 활성을 측정하기가 힘들다. 더우기, 트롬빈은 즉시 형성된 피브린 응괴와 특이적으로 결합 및 상호작용한다고 알려져 있으므로, 트롬빈은 피브린 응괴와 결합하여 수화 용액 중에서 더이상 유리 상태로 용해되지 않고 후속의 트롬빈 활성의 측정에 이용될 수 없게 된다. 그러므로, 임의의 트롬빈/피브리노겐 제품의 수화 및 응괴 형성을 통한 트롬빈 활성의 측정은 단지 부분적일 뿐이며 부정확하다.
또한, 이들 단백질이 미반응 혼합물로 존재하고 캐리어, 기질 또는 의료 장치 위에 로딩된 경우, 예로서 만일 캐리어, 기질 또는 의료 장치가 측정 장치와의 물리적, 화학적 및 광학적 간섭에 의해서 단백질의 활성 또는 기능성의 측정에 악영향을 준다면 트롬빈 활성을 정확하게 측정하기 위해서 단백질들을 기질로부터 분리시킬 필요가 있을 수 있다. 캐리어, 기질 또는 의료 장치로부터의 간섭을 막기 위한 단백질들의 분리 또는 추출은 혼합물을 수성 조건에 노출시킴없이 수행해야 한다(혼합물이 수성 조건에 노출되면 응괴 형성을 일으켜서 후속의 측정을 방해할 것이다).
피브리노겐은 가장 흔하게는 응괴 형성의 속도를 기준으로 피브리노겐 기능성을 측정하는, 클라우스(Clauss)가 창시한 방법에 의해 측정된다. 전형적인 클라우스 분석법에서는 미지량의 용해성 피브리노겐을 함유하는 시료를 과량의 트롬빈과 함께 배합한다. 이러한 피브리노겐과 트롬빈의 비율에서는 피브리노겐이 속도 제한 반응물이고 응괴 형성 속도는 피브리노겐 농도의 함수가 된다. 빠른 응괴 형성 시간은 피브리노겐의 농도가 높음을 나타낼 것이다. 반대로, 긴 응괴 형성 시간은 기능성 피브리노겐의 농도가 낮음을 나타낼 것이다. 기능성 피브리노겐의 양은 시료의 응괴 형성 시간을 표준 곡선의 작성을 위한 일련의 표준물들의 응괴 형성 시간과 비교함으로써 정량할 수 있다. 시료 중의 피브리노겐의 농도는 표준물들의 응괴 형성 시간으로부터 얻은 방정식을 토대로 하여 수학적으로 측정할 수 있다.
용액, 예를 들면 사람의 혈장 중의 유리된 피브리노겐의 측정은 기존의 방법에 의해 수행될 수 있으나, 피브리노겐이 트롬빈과 함께 존재하는 경우에는 피브리노겐 기능성을 평가하기가 어렵다. 이 혼합물을 수화하면 피브리노겐이 트롬빈을 매개로 불용성의 피브린 응괴로 전환될 것이다. 일단 피브린이 생성되면, 피브린 형성을 초래한 피브리노겐으로부터의 피브리노펩타이드의 방출은 본질적으로 비가역적이기 때문에 후속의 피브리노겐 측정은 더이상 불가능하다.
따라서, 피브리노겐의 존재하에 트롬빈의 활성을 정확하게 측정하고, 트롬빈의 존재하에 피브리노겐의 기능성을 측정하는 방법이 요구된다.
[도면의 상세한 설명]
도 1은 회복된 트롬빈 활성에 대해 불활성화 용액의 pH가 미치는 영향을 보여준다.
[발명의 개요]
본 발명은 (a) 제1 반응 성분을 가역적으로 억제하여, 불활성화된 제1 반응 성분과 제2 반응 성분을 함유하는 혼합물을 수득하는 단계, (b) 제1 반응 성분의 활성을 평가할 때에는 과량의 제2 반응 성분을 혼합물에 첨가하고, 제2 반응 성분의 활성을 평가할 때에는 과량의 제1 반응 성분을 혼합물에 첨가하는 단계, (c) 제1 반응 성분을 가역적으로 활성화하는 단계, (d) 제1 반응 성분이 혼합물 중의 제2 반응 성분 및 과량의 제2 반응 성분과 반응하게 하거나, 제1 반응 성분이 혼합물 중의 제2 반응 성분 및 과량의 제1 반응 성분과 반응하게 하는 단계, 및 (e) 건조 혼합물 중에 본래 존재하던 제1 또는 제2 반응 성분의 활성 또는 기능성을 측정하는 단계를 포함하는, 제1 반응 성분과 제2 반응 성분의 혼합물 중의 제1 반응 성분 또는 제2 반응 성분의 활성 또는 기능성을 측정하는 방법이다.
앞서 논의한 바와 같이, 분말 형태 또는 에탄올 현탁액과 같은 비수성 현탁액의 트롬빈과 피브리노겐의 미반응 혼합물 중의 트롬빈 활성을 측정하기 위해서는 트롬빈 활성의 정확한 측정을 위하여 단백질들을 재수화하고 트롬빈과 피브리노겐을 수화 매질에 용해시킬 필요가 있다. 그러나, 일단 혼합물이 수화 매질과 접촉하게 되면, 용해된 트롬빈과 피브리노겐이 반응하여 즉시 응괴를 형성할 것이며, 이용가능한 트롬빈은 응괴에 결합하여 트롬빈 측정에 자유롭게 이용되지 못할 것이다.
한 양태에서는 미반응 혼합물의 트롬빈 활성을 일시적으로 억제하거나 가역적으로 억제함으로써 트롬빈과 피브리노겐이 완전히 용해되기 전까지 피브린 응괴의 형성을 방지한다. 트롬빈 활성을 억제함으로써 즉각적인 응괴 형성이 방지되고 트롬빈은 수성의 수화 매질에 유리 상태로 용해되며 측정에 이용될 수 있게 된다.
트롬빈 활성의 일시적 또는 가역적 억제는 예를 들면 트롬빈의 알칼리 환경을 조절함으로써 달성할 수 있다. 예를 들면, 이것은 트롬빈과 피브리노겐의 미반응 혼합물을 억제 용액 또는 불활성화 용액, 즉 pH가 약 8.5 내지 11.5, 바람직하게는 약 9.5 내지 10.5, 더욱 바람직하게는 약 10인 알칼리 용액으로 재구성하거나 수화시켜서 제1 용액을 형성함으로써 달성할 수 있다. 도 1은 회복된 트롬빈 활성에 미치는 pH의 영향을 보여준다. 불활성화 용액의 알칼리도가 pH 10일 때 최대의 회복된 트롬빈 활성이 관찰된다. pH 9.5 내지 10.5의 범위에서 최대의 회복된 트롬빈 활성의 80% 이상이 달성된다. 9.5 미만과 10.5 초과의 pH 수준에서는 pH 수준이 10에서 벗어날수록 최대의 회복된 트롬빈 활성이 감소한다. 9.25 이하의 pH 수준에서는 수화 중에 응괴 형성의 증거가 관찰되고 이것은 중성 조건에 근접하는 보다 낮은 pH 수준에서 최대의 회복된 트롬빈 활성의 감소를 설명할 수 있다. pH 4 및 5와 같은 산성 조건에서는 최대의 회복된 트롬빈 활성이 알칼리 조건에서 관찰된 것보다 훨씬 더 작은데, 이것은 트롬빈의 비가역적 불활성화의 결과일 수 있다.
억제 용액 또는 불활성화 용액은 카보네이트, TRIS 염기, 보레이트, 글리신, 포스페이트, 메틸아민, 2-(사이클로헥실아미노)에탄설폰산(CHES), 3-(사이클로헥실아미노)-1-프로판설폰산(CAPS) 또는 3-(사이클로헥실아미노)-2-하이드록시-1-프로판설폰산(CAPSO)의 용액을 비제한적으로 포함하는 알칼리 용액 또는 알칼리 완충 용액일 수 있다.
트롬빈과 피브리노겐이 억제 용액 또는 불활성화 용액에 완전히 용해되면, pH를 약 8.5 내지 11.5, 바람직하게는 약 9.5 내지 10.5, 더욱 바람직하게는 약 10으로 유지하면서 제1 용액 또는 이의 일부분을 제2 용액 중의 기지량의 피브리노겐, 바람직하게는 과량의 피브리노겐과 함께 배합하여 제3 용액을 형성할 수 있다. 과량의 피브리노겐을 사용함으로써 혼합물 내의 트롬빈이 피브린 응괴 형성에서의 속도 제한 반응물이 되어 트롬빈의 활성이 응괴 형성 속도와 강하게 상관됨이 보장된다. 피브리노겐이 과량이 아닐 경우, 응괴 형성 속도는 트롬빈과 피브리노겐 둘 모두에 의존하게 될 것이다.
이어서, 제3 용액의 pH를 트롬빈 활성이 더이상 억제되지 않는 범위, 즉 약 6.0 내지 8.5 미만, 바람직하게는 약 7.0 내지 8.5 미만, 더욱 바람직하게는 약 7.5로 조절함으로써 트롬빈 활성을 역전시킬 수 있다. 또는, 용해된 단백질 또는 이의 일부분을 함유하는 불활성화 용액, 즉 제1 용액을 제2 용액 중의 기지량의 피브리노겐, 바람직하게는 과량의 피브리노겐과 함께 배합하여 제3 용액을 형성함으로써 트롬빈 활성의 억제를 동시에 역전시킬 수도 있다. 제2 용액의 예로는 TRIS-HCl, 이미다졸, 4-(2-하이드록시에틸)피페라진-1-에탄설폰산(HEPES), 포스페이트, 바르비탈(barbital), 4-모르폴린프로판설폰산(MOPS), 3-모르폴리노-2-하이드록시프로판설폰산(MOPSO), 1,4-피페라진디에탄설폰산(PIPES), N,N-비스(2-하이드록시에틸)-2-아미노에탄설폰산(BES), 시트레이트 또는 카보네이트를 위한 완충 용액이 비제한적으로 포함된다.
제2 용액의 용적 및 완충 용량은 제1 용액에 첨가시 pH가 약 6.0 내지 8.5 미만, 바람직하게는 약 7.0 내지 8.5 미만, 더욱 바람직하게는 약 7.5인 제3 용액을 생성하기에 충분해야 한다. 예를 들면, 제2 용액이 몰농도 약 25mM 내지 500mM의 TRIS-HCl 완충액, 바람직하게는 약 100mM 내지 150mM의 TRIS-HCl 완충액인 경우, 제1 용액과 제2 용액의 용적비는 전형적으로 약 1:1 내지 1:20, 바람직하게는 약 1:4 내지 1:10 범위이다.
트롬빈 활성은 응괴 형성을 검측하기 위한 기계적 종말점 검측 장치를 갖는 응고 분석기(예: Diagnostica Stago ST4 응고 분석기), 또는 피브린 응괴 형성으로 인한 탁도 변화를 측정하는 장치를 사용하여 측정할 수 있다. 불활성화 용액에 용해된 단백질들을 이들 장치 중 어느 하나에서 제2 용액과 배합하고 응고 시간을 측정한 후 이것을 기지의 트롬빈 활성에 대한 응괴 형성 시간과 상관시킬 수 있다.
트롬빈 활성을 측정할 수 있는 다른 방법은 트롬빈을 위한 발색성 또는 형광성 펩타이드 기질을 사용한다. 이 방법에서는 용해된 트롬빈을 과량의 발색성 또는 형광성 기질과 배합한다. 트롬빈은 기질을 개열시켜 발색단 또는 형광물질을 방출시키는데 이것을 분광 분석계 또는 형광계로 모니터할 수 있다. 발색성 또는 형광성 기질의 예로는 각각 β-Ala-Gly-Arg-p-니트로아닐리드 디아세테이트 및 Z-Gly-Pro-Arg-AMC[Z=벤질옥시카보닐; AMC=7-아미노-4-메틸쿠마린]가 포함된다. 발색단 또는 형광물질의 방출 속도를 트롬빈의 활성과 상관시킬 수 있다.
다른 양태에서, 트롬빈과 혼합된 미반응 혼합물 중의 피브리노겐의 기능성을, 트롬빈의 알칼리 환경을 조절하여 트롬빈 활성을 억제함으로써 측정할 수 있다. 예를 들면, 이것은 트롬빈과 피브리노겐의 혼합물을 억제 용액 또는 불활성화 용액, 즉 pH가 약 8.5 내지 11.5, 바람직하게는 약 9.5 내지 10.5, 더욱 바람직하게는 약 10인 알칼리 용액으로 재구성하거나 수화시켜서 제1 용액을 형성함으로써 달성할 수 있다. 억제 용액 또는 불활성화 용액은 카보네이트, TRIS(트리스(하이드록시메틸)아미노메탄) 염기, 보레이트, 글리신, 포스페이트, 메틸아민, 2-(사이클로헥실아미노)에탄설폰산(CHES), 3-(사이클로헥실아미노)-1-프로판설폰산(CAPS) 또는 3-(사이클로헥실아미노)-2-하이드록시-1-프로판설폰산(CAPSO)의 용액을 비제한적으로 포함하는 알칼리 용액 또는 알칼리 완충 용액일 수 있다. 또한, 억제 용액 또는 불활성화 용액 또는 제1 용액에 비발리루딘(Bivalirudin, Angiomax)과 같은 트롬빈 억제제를 임의로 첨가하여 트롬빈 활성의 최대 억제를 달성함으로써 후속 시험을 위해 대부분의 피브리노겐을 용해시킬 수 있다. 트롬빈 억제제의 다른 예로는 안티트롬빈, 헤파린, 저분자량 헤파린, 저분자량 헤파린 동족체, 아르가트로반, 멜라가트란, 에페가트란, 이노가트란, 다비가트란, 히루단, 및 레피루딘 및 데시루딘과 같은 히루단 유도체가 포함된다.
일단 트롬빈 활성이 억제되면, pH를 약 8.5 내지 11.5, 바람직하게는 약 9.5 내지 10.5, 더욱 바람직하게는 약 10으로 유지하면서 기지량의 트롬빈을 갖는, 바람직하게는 과량의 트롬빈을 갖는 제1 용액 또는 이의 일부분을 제2 용액과 함께 배합하여 제3 용액을 형성함으로써 피브리노겐의 기능성을 측정할 수 있다. 과량의 트롬빈을 사용함으로써 혼합물 중의 피브리노겐의 양이 피브린 응괴 형성에서의 속도 제한 반응물이 되어 피브리노겐의 농도가 응괴 형성 속도와 강하게 상관됨이 보장된다. 트롬빈이 과량이 아닐 경우, 응괴 형성 속도는 트롬빈과 피브리노겐 둘 모두에 의존하게 될 것이다.
이어서, 제3 용액의 pH를 트롬빈 활성이 더이상 억제되지 않는 범위, 즉 약 6.0 내지 8.5 미만, 바람직하게는 약 7.0 내지 8.5 미만, 더욱 바람직하게는 약 7.5로 조절함으로써 트롬빈 활성을 역전시킬 수 있다. 또는, 용해된 단백질 또는 이의 일부분을 함유하는 불활성화 용액, 즉 제1 용액을 제2 용액 중의 기지량의 트롬빈, 바람직하게는 과량의 트롬빈과 함께 배합하여 제3 용액을 형성함으로써 트롬빈 활성의 억제를 동시에 역전시킬 수도 있다. 제2 용액의 예로는 TRIS-HCl, 이미다졸, 4-(2-하이드록시에틸)피페라진-1-에탄설폰산(HEPES), 포스페이트, 바르비탈, 4-모르폴린프로판설폰산(MOPS), 3-모르폴리노-2-하이드록시프로판설폰산(MOPSO), 1,4-피페라진디에탄설폰산(PIPES), N,N-비스(2-하이드록시에틸)-2-아미노에탄설폰산(BES), 시트레이트 또는 카보네이트를 위한 pH 약 7.5의 완충 용액이 비제한적으로 포함된다.
피브리노겐의 기능성은 응괴 형성을 검측하기 위한 기계적 종말점 검측 장치를 갖는 응고 분석기(예: Diagnostica Stago ST4 응고 분석기), 또는 피브린 응괴 형성으로 인한 탁도 변화를 측정하는 장치를 사용하여 측정할 수 있다. 불활성화 용액에 용해된 단백질들을 이들 장치 중 어느 하나에서 제2 용액과 배합하고 응고 시간을 측정한 후 이것을 기지의 피브리노겐 기능성에 대한 응괴 형성 시간과 상관시킬 수 있다.
또는, 피브리노겐 기능성은 비발리루딘(Angiomax)과 같은 트롬빈 억제제를 사용하여 트롬빈 활성을 억제함으로써 측정할 수도 있다. 임의로, 트롬빈 억제제의 사용과 함께 트롬빈의 알칼리 환경을 조절할 수 있다. 트롬빈 억제제의 다른 예로는 안티트롬빈, 헤파린, 저분자량 헤파린, 저분자량 헤파린 동족체, 아르가트로반, 멜라가트란, 에페가트란, 이노가트란, 다비가트란, 히루단, 및 레피루딘 및 데시루딘과 같은 히루단 유도체가 포함된다. 일단 트롬빈 활성이 억제되면, 피브리노겐에 작용하여 응괴를 형성할 수 있으면서도 트롬빈 억제제의 영향은 받지 않는 트롬빈-유사 효소를 사용하여 피브리노겐 기능성을 측정할 수 있다. 트롬빈-유사 효소의 예로는 바트록소빈(Batroxobin, 남아메리카 독사인 보트롭스 아트록스(Bothrops atrox)의 독에서 유래) 및 안크로드(Ancrod, 칼로셀라스마 로도스토마(Calloselasma rhodostoma)의 독에서 유래)가 비제한적으로 포함된다.
단백질들이 예를 들면 건조된 분말 형태의 단백질 혼합물과 같은 미반응 혼합물로 존재하고 캐리어, 기질 또는 의료 장치 위에 로딩된 경우, 재수화 및 용해 전에 HFE-7000, HFE7001, HFE7003, HFE-7300 및 PF-5060(제조원: 3M, Minnesota)과 같은 퍼플루오르화 하이드로카본, 및 단백질이 용해되지 않는 다른 임의의 캐리어 유체를 비제한적으로 포함하는 비수성 액체를 사용하여 단백질을 추출함으로써, 단백질을 분리시키는 단계를 수행할 수 있다. 일단 비수성 용매를 사용하여 단백질을 추출하고 나면, 상술된 바와 같이 트롬빈 활성 또는 피브리노겐 기능성을 측정할 수 있다.
또는, 단백질이 캐리어, 기질 또는 의료 장치 위에 로딩된 경우, 트롬빈 활성 또는 피브리노겐 기능성을 단백질의 분리 없이 상술된 바와 같이 측정할 수도 있다. 예를 들면, 단백질이 로딩된 캐리어, 기질 또는 의료 장치를 억제 용액 또는 불활성화 용액에 직접 넣어서 단백질을 수화시키고 이것을 시료로 채취하여 상술된 바와 같이 트롬빈 활성 또는 피브리노겐 기능성에 대해 시험할 수 있다.
Claims (33)
- (a) 트롬빈을 가역적으로 억제하여, 불활성화된 트롬빈과 피브리노겐을 함유하는 혼합물을 수득하는 단계,(b) 상기 트롬빈의 활성을 평가할 때에는 기지량의 상기 피브리노겐을 상기 혼합물에 첨가하고, 상기 피브리노겐의 활성을 평가할 때에는 기지량의 상기 트롬빈을 상기 혼합물에 첨가하는 단계,(c) 상기 트롬빈을 가역적으로 활성화하는 단계,(d) 상기 트롬빈이 상기 혼합물 중에 본래 존재하던 피브리노겐 및 상기 기지량의 피브리노겐과 반응하게 하거나, 상기 트롬빈이 상기 혼합물 중에 본래 존재하던 피브리노겐 및 상기 기지량의 트롬빈과 반응하게 하는 단계, 및(e) 혼합물 중에 본래 존재하던 트롬빈 또는 피브리노겐의 활성 또는 기능성(functionality)을 측정하는 단계를 포함하는, 트롬빈과 피브리노겐의 미반응 혼합물 중의 트롬빈 또는 피브리노겐의 활성 또는 기능성을 측정하는 방법.
- 삭제
- 제1항에 있어서, 상기 트롬빈은 재조합되거나 동물 또는 사람의 공급원으로부터 유래하고, 상기 피브리노겐은 재조합되거나 동물 또는 사람의 공급원으로부터 유래하는, 방법.
- 제1항에 있어서, 단계 (b) 및 (c)가 동시에 수행되는, 방법.
- 제4항에 있어서, 상기 혼합물이 분말 형태를 갖고, 상기 트롬빈을 가역적으로 억제하는 단계가 트롬빈과 피브리노겐의 상기 혼합물을 pH 8.5 내지 11.5의 억제 용액 또는 제1 용액으로 재구성시킴을 포함하는, 방법.
- 제5항에 있어서, 상기 억제 용액 또는 상기 제1 용액의 pH가 9.5 내지 10.5인, 방법.
- 제6항에 있어서, 상기 억제 용액 또는 상기 제1 용액의 pH가 10인, 방법.
- 제5항에 있어서, 상기 억제 용액 또는 상기 제1 용액이, 카보네이트, TRIS(트리스(하이드록시메틸)아미노메탄) 염기, 보레이트, 글리신, 포스페이트, 메틸아민, 2-(사이클로헥실아미노)에탄설폰산(CHES), 3-(사이클로헥실아미노)-1-프로판설폰산(CAPS) 또는 3-(사이클로헥실아미노)-2-하이드록시-1-프로판설폰산(CAPSO)으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 성분의 알칼리 용액을 포함하는, 방법.
- 제8항에 있어서, 상기 기지량의 피브리노겐이, 상기 불활성화된 트롬빈 및 상기 피브리노겐을 함유하는 상기 억제 용액 또는 제1 용액의 pH를 6.0 내지 8.5 미만으로 저하시킬 수 있는 제2 용액 중에 존재하는, 방법.
- 제9항에 있어서, 상기 기지량의 피브리노겐이, 상기 불활성화된 트롬빈 및 상기 피브리노겐을 함유하는 상기 억제 용액 또는 제1 용액의 pH를 7.0 내지 8.5 미만으로 저하시킬 수 있는 제2 용액 중에 존재하는, 방법.
- 제10항에 있어서, 상기 기지량의 피브리노겐이, 상기 불활성화된 트롬빈 및 상기 피브리노겐을 함유하는 상기 억제 용액 또는 제1 용액의 pH를 7.5로 저하시킬 수 있는 제2 용액 중에 존재하는, 방법.
- 제9항에 있어서, 상기 억제 용액 또는 상기 제1 용액의 pH를 저하시킬 수 있는 상기 제2 용액이, TRIS-HCl, 이미다졸, 4-(2-하이드록시에틸)피페라진-1-에탄설폰산(HEPES), 포스페이트, 바르비탈(barbital), 4-모르폴린프로판설폰산(MOPS), 3-모르폴리노-2-하이드록시프로판설폰산(MOPSO), 1,4-피페라진디에탄설폰산(PIPES), N,N-비스(2-하이드록시에틸)-2-아미노에탄설폰산(BES), 시트레이트 또는 카보네이트로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 성분의 용액인, 방법.
- 제12항에 있어서, 상기 억제 용액 또는 상기 제1 용액의 pH를 저하시킬 수 있는 상기 제2 용액이, 25mM 내지 500mM TRIS-HCl 완충액을 포함하는, 방법.
- 제13항에 있어서, 상기 억제 용액 또는 상기 제1 용액의 pH를 저하시킬 수 있는 상기 제2 용액이, 100mM 내지 150mM TRIS-HCl 완충액을 포함하는, 방법.
- 제9항에 있어서, 단계 (b)에서, 상기 불활성화된 트롬빈 및 상기 피브리노겐을 함유하는 상기 억제 용액 또는 상기 제1 용액에 피브리노겐을 기지의 과량으로 첨가하는, 방법.
- 제1항에 있어서, 단계 (b)가, 상기 기지량의 피브리노겐을 함유하는 제2 용액을 상기 불활성화된 트롬빈 및 상기 피브리노겐을 함유하는 상기 억제 용액 또는 상기 제1 용액에 첨가하여 pH 8.5 내지 11.5의 제3 용액을 형성함을 포함하는, 방법.
- 제16항에 있어서, 상기 트롬빈을 가역적으로 활성화하는 단계 (c)가, 상기 제3 용액의 pH를 6.0 내지 8.5로 조절하는 단계를 포함하는, 방법.
- 제9항에 있어서, 상기 혼합물 중에 본래 존재하던 트롬빈 또는 피브리노겐의 활성 또는 기능성이, 응고 시간을 측정하고 상기 응고 시간을 상기 트롬빈 또는 피브리노겐의 기지의 활성 또는 기능성과 상관시키는 동력학적 응괴 형성 분석(kinetic clotting assay)에 의해서 측정되는, 방법.
- 제18항에 있어서, 상기 트롬빈 또는 피브리노겐의 활성 또는 기능성을 활성 단위 또는 관능량으로 전환시키는, 방법.
- 제9항에 있어서, 상기 혼합물 중에 본래 존재하던 트롬빈 또는 피브리노겐의 활성 또는 기능성을 탁도 측정법, 네펠로법(nephelometry) 또는 점도 측정법, 또는 기계적 종말점 분석법을 사용하여 측정하는, 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 트롬빈과 피브리노겐의 상기 혼합물이, 분말 형태로 기질 상에 존재하고, 단계 (b)가, 상기 불활성화된 트롬빈과 피브리노겐의 상기 혼합물을 갖는 상기 기질을 기지량의 피브리노겐을 함유하는 제2 용액에 투입함으로써 수행되는, 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 트롬빈과 피브리노겐의 상기 혼합물이 비수성 현탁액인, 방법.
- 제22항에 있어서, 상기 비수성 현탁액이 알코올, 트롬빈 및 피브리노겐을 포함하는, 방법.
- 제23항에 있어서, 상기 알코올이 에탄올인, 방법.
- (a) 트롬빈과 피브리노겐의 혼합물을 pH 8.5 내지 11.5의 억제 용액 또는 제1 용액으로 재구성시킴으로써 상기 트롬빈을 억제하여, 불활성화된 트롬빈과 피브리노겐을 함유하는 혼합물을 수득하는 단계,(b) 상기 혼합물에, 불활성화된 트롬빈 및 피브리노겐을 함유하는 상기 억제 용액 또는 제1 용액의 pH를 6.0 내지 8.5 미만으로 저하시킬 수 있는 제2 용액 중의 기지량의 트롬빈을 첨가하는 단계,(c) 상기 트롬빈이 피브리노겐과 반응하게 하는 단계, 및(d) 상기 혼합물 중에 본래 존재하던 피브리노겐의 기능성을 측정하는 단계를 포함하는, 트롬빈과 피브리노겐의 미반응 혼합물 중의 피브리노겐의 기능성을 측정하는 방법.
- 제25항에 있어서, 상기 트롬빈을 억제하는 단계에서 트롬빈 억제제를 첨가함을 추가로 포함하는, 방법.
- 제26항에 있어서, 상기 트롬빈 억제제가 안티트롬빈, 헤파린, 저분자량 헤파린, 저분자량 헤파린 동족체, 폰다파리눅스, 아르가트로반, 멜라가트란, 에페가트란, 이노가트란, 다비가트란, 비발리루딘, 히루단, 및 레피루딘 및 데시루딘과 같은 히루단 유도체로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 방법.
- (a) 트롬빈과 피브리노겐의 혼합물을 pH 8.5 내지 11.5의 억제 용액 또는 제1 용액으로 재구성시킴으로써 상기 트롬빈을 억제하여, 불활성화된 트롬빈과 피브리노겐을 함유하는 혼합물을 수득하는 단계,(b) 상기 혼합물에 기지량의 트롬빈-유사 효소를 첨가하고, 임의로 불활성화된 트롬빈 및 피브리노겐을 함유하는 상기 억제 용액 또는 제1 용액의 pH를 6.0 내지 8.5 미만으로 저하시키는 단계,(c) 상기 트롬빈-유사 효소가 피브리노겐과 반응하게 하는 단계, 및(d) 상기 혼합물 중에 본래 존재하던 피브리노겐의 기능성을 측정하는 단계를 포함하는, 트롬빈과 피브리노겐의 미반응 혼합물 중의 피브리노겐의 기능성을 측정하는 방법.
- 제28항에 있어서, 상기 트롬빈을 억제하는 단계가 트롬빈 억제제를 첨가함을 추가로 포함하는, 방법.
- 제28항에 있어서, 상기 트롬빈 억제제가 안티트롬빈, 헤파린, 저분자량 헤파린, 저분자량 헤파린 동족체, 폰다파리눅스, 아르가트로반, 멜라가트란, 에페가트란, 이노가트란, 다비가트란, 비발리루딘, 히루단, 및 레피루딘 및 데시루딘과 같은 히루단 유도체로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 방법.
- 제28항에 있어서, 상기 트롬빈-유사 효소가 바트록소빈(Batroxobin) 또는 안크로드(Ancrod)인, 방법.
- (a) 트롬빈과 피브리노겐의 혼합물을 pH 8.5 내지 11.5의 억제 용액 또는 제1 용액으로 재구성시킴으로써 트롬빈을 가역적으로 억제하여, 불활성화된 트롬빈과 피브리노겐을 함유하는 혼합물을 수득하는 단계,(b) 상기 억제 용액 또는 제1 용액의 pH를 6.0 내지 8.5 미만으로 저하시킬 수 있는 제2 용액을 첨가하는 단계,(c) 상기 피브리노겐이 상기 트롬빈과 반응하게 하는 단계, 및(d) 응괴 형성을 분석하는 단계를 포함하는, 트롬빈과 피브리노겐의 미반응 혼합물 중의 트롬빈의 활성을 측정하는 방법.
- (a) 트롬빈을 가역적으로 억제하여, 불활성화된 트롬빈과 피브리노겐을 함유하는 혼합물을 수득하는 단계,(b) 기지량의 발색성 또는 형광성 트롬빈 기질을 혼합물에 첨가하는 단계,(c) 상기 트롬빈을 가역적으로 활성화하는 단계,(d) 상기 트롬빈이 상기 발색성 또는 형광성 트롬빈 기질과 반응하게 하는 단계, 및(e) 상기 혼합물 중에 본래 존재하던 트롬빈의 활성을 측정하는 단계를 포함하는, 트롬빈과 피브리노겐의 미반응 혼합물 중의 트롬빈의 활성을 측정하는 방법.
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