CN104965017B - 水蛭素抗凝血酶活性的测定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种水蛭素抗凝血酶活性的测定方法，将已知一定质量的含有未知活性的水蛭素与足量的凝血酶反应后，在交联剂BS3作用下进行交联反应，终止交联后得到含有水蛭素、凝血酶和水蛭素‑凝血酶化合物的第一混合体系，经电泳后采用光密度扫描，在已知蛋白带密度的对照物基础上根据水蛭素‑凝血酶化合物的蛋白带密度得到水蛭素‑凝血酶化合物的质量，根据水蛭素与凝血酶以质量比为1∶5结合得到水蛭素‑凝血酶化合物得出参与反应的有效凝血酶的质量，再根据凝血酶中有效凝血酶的质量分数以及水蛭素的质量计算得出该一定质量的水蛭素抑制凝血酶的活性值即为水蛭素抗凝血酶的活性值。本发明的方法操作简单、准确性好、投入和设备要求低。
Description
技术领域
本发明涉及医药检验领域，具体涉及一种水蛭素抗凝血酶活性的测定方法。
背景技术
由于心脏和脑血管疾病的增加，水蛭素作为一种有效的抗血栓药物，在抑制凝血酶方面表现出的巨大潜力，已经吸引了越来越多的关注，天然水蛭素可以从养殖水蛭(Hirudo medicinalis)的唾液中提取。为了满足日益增长的需求，自1986年以来开展了重组水蛭素的研究。
水蛭素是一种酸性多肽，具有64-69个氨基酸，分子量为7千道尔顿，等电点为3.8。水蛭素性状类似蝌蚪，具有两个功能域：n端为头部和c为端尾，在c端第49-65氨基酸处有丰富的带负电的残留物。凝血酶有三个功能域：催化部位、疏水性部位(接近催化部位)和识别部位，凝血酶识别的部位富有阳性残留物。水蛭素对凝血酶结合包括两个步骤。首先，水蛭素的c端通过大量的离子键与凝血酶的识别位点结合，使凝血酶的结构发生改变，从而诱发了第二步：水蛭素的N端结构域通过结构匹配与凝血酶的疏水部位结合，在第二步中，凝血酶的催化部位由于与疏水性部位相邻而被水蛭素阻塞。这样的结合是快速且稳定的，可以灭活凝血酶，因为所有凝血酶功能域的屏蔽。因此，结合水蛭素的活动也可以描述为其抗凝血酶活性。
目前，有很多方法来测试水蛭素活性。这些方法可以分为：(1)滴定法：采用纤维蛋白原或其他试剂被用作滴定和测试水蛭素结合活性的指标，该方法简易、省时、经济简便、应用广泛，但重复性和准确度不理想，受环境影响比较大。(2)光谱学法：在凝聚后或添加了放射追踪凝血酶底物后光散射的变化用于评估水蛭素的活性，光散射的变化后凝固或之后添加radio-labeled凝血酶底物用于评估水蛭素活性，该方法准确、稳定，但需要使用昂贵的专业散色荧光仪，且标准曲线的建立有可能产生误差。(3)免疫测定方法：水蛭素活性通过免疫沉淀反应和免疫印迹的方法被测量，该方法准确、稳定，有一定的再现性，但部分药品需要进口，价格昂贵。
发明内容
作为各种广泛且细致的研究和实验的结果，本发明的发明人发现通过交联剂BS3固定水蛭素与凝血酶反应产生的水蛭素-凝血酶化合物，并通过SGS-PAGE与光密度扫描得出水蛭素-凝血酶化合物的蛋白带密度变化可以准确计算水蛭素抗凝血酶的活性。基于这种发现，完成了本发明。
本发明的一个目的是解决至少上述问题和/或缺陷，并提供至少后面将说明的优点。
本发明还有一个目的是提供一种通过交联剂BS3固定水蛭素与凝血酶反应产生的水蛭素-凝血酶化合物，根据SGS-PAGE与光密度扫描计算水蛭素抗凝血酶活性的测定方法，本发明的方法准确性好，检测使用的水蛭素样本量小、检测浓度低，本发明的方法操作简单，投入和设备要求都较低。
为了实现根据本发明的这些目的和其它优点，提供了一种水蛭素抗凝血酶活性的测定方法，将已知一定质量的含有未知活性的水蛭素与足量的凝血酶反应后，在交联剂作用下进行交联反应，终止交联后得到含有水蛭素、凝血酶和水蛭素-凝血酶化合物的第一混合体系，其中，所述交联剂为BS3，所述第一混合体系经电泳后采用光密度扫描，在已知蛋白带密度的对照物基础上根据水蛭素-凝血酶化合物的蛋白带密度得到水蛭素-凝血酶化合物的质量，根据水蛭素与凝血酶以质量比为1:5结合得到水蛭素-凝血酶化合物得出参与反应的有效凝血酶的质量，再根据凝血酶中有效凝血酶的质量分数以及水蛭素的质量计算得出该一定质量的水蛭素抑制所述凝血酶的活性值即为水蛭素抗凝血酶的活性值。
优选的是，所述的水蛭素抗凝血酶活性的测定方法，所述凝血酶中有效凝血酶的质量分数的测定方法如下：将足量的水蛭素与已知一定质量的凝血酶反应后，在交联剂BS3作用下进行交联反应，终止交联后得到含有水蛭素、凝血酶和水蛭素-凝血酶化合物的第二混合体系，经电泳后采用光密度扫描，在已知蛋白带密度的对照物基础上根据第二混合体系中水蛭素-凝血酶化合物的蛋白带密度得到水蛭素-凝血酶化合物的质量，进而得到有效凝血酶的质量，其与已知一定质量的凝血酶的质量比即为所述凝血酶中有效凝血酶的质量分数。
优选的是，所述的水蛭素抗凝血酶活性的测定方法，将多组不同质量的含有未知活性的水蛭素与恒定量且足量的凝血酶反应后得到一一对应的多组第一混合体系，从而得出多组水蛭素抗凝血酶的活性值，求其均值，即得水蛭素抗凝血酶的活性。
本发明还提供了一种方案，一种水蛭素抗凝血酶活性的测定方法，将一系列梯度质量的含有未知活性的水蛭素与恒定量的凝血酶反应后，在交联剂BS3作用下进行交联反应，终止交联后得到一一对应的含有水蛭素、凝血酶和水蛭素-凝血酶化合物的第三混合体系，经电泳后根据未反应的水蛭素、未反应的凝血酶以及水蛭素-凝血酶化合物的蛋白带的变化确定水蛭素抗凝血酶活性的范围。
本发明还提供了一种方案，一种水蛭素抗凝血酶活性的测定方法，包括以下步骤：
步骤一、向标记为1-8的管中依次添加结合缓冲液10.5μL、9.5μL、8.5μL、7.5μL、6.5μL、5.5μL、4.5μL和3.5μL，再依次添加水蛭素溶液1μL、2μL、3μL、4μL、5μL、6μL、7μL和8μL，于8个管中分别加入2μL凝血酶溶液，混匀后，将其均置于37℃下水浴5min，所述结合缓冲液为质量分数为0.9％的氯化钠溶液；所述水蛭素溶液的浓度为0.2mg/mL，所述凝血酶溶液是以质量分数为0.9％氯化钠溶液为溶剂配制的凝血酶蛋白浓度为4.8mg/mL即3NIH/μL的溶液；
步骤二、向8个管中分别加入1.5μL交联剂BS3溶液，于室温下交联反应30min，所述交联剂BS3溶液由12.5mmol BS3和20mmol磷酸钠溶解于1.5μL 0.9％的氯化钠溶液得到的溶液；
步骤三、向8个管中分别加入1μL终止缓冲溶液，反应15min以终止交联反应，所述终止缓冲溶液由0.8mmolTris和0.8mmol甘氨酸溶解于1μL 0.9％的氯化钠溶液中，并用盐酸调节其pH为7.5；
步骤四、向8个管中分别加入4μL的5％SDS-PAGE蛋白上样缓冲液，混匀后每管取10μL进行SDS-PAGE分析，得出标记为6-8的管中样品经SDS-PAGE分析得出的水蛭素-凝血酶化合物的蛋白带的密度未发生变化，因此得出水蛭素抗凝血酶的活性范围在标记为5的管与标记为6的管之间，即抑制3NIH凝血酶需要的水蛭素的质量为0.5-0.6μg，即水蛭素抗凝血酶的活性为5000-6000ATU/mg。
优选的是，所述的水蛭素抗凝血酶活性的测定方法，在8个管中的样品进行SDS-PAGE分析后以0.1μg和1μg牛血清白蛋白作为对照，进行光密度扫描检测得到8个管中对应的水蛭素-凝血酶化合物的质量依次为0.45μg、0.91μg、1.36μg、1.82μg、2.27μg、2.4μg、2.4μg和2.4μg，由标记为6-8的管中水蛭素-凝血酶化合物的质量得出凝血酶溶液中有效凝血酶的质量分数为41.7％，由此得出标记为1-5的管中水蛭素抗凝血酶的活性为5625ATU/mg、5687.5ATU/mg、5666.7ATU/mg、5687.5ATU/mg和5675ATU/mg，求其平均值得到水蛭素抗凝血酶的活性为5668ATU/mg。
优选的是，所述的水蛭素抗凝血酶活性的测定方法，所述5％SDS-PAGE蛋白上样缓冲液由蒸馏水、30％的Acr-Bis、1molpH为8.8的Tris、10％SDS、10％过硫酸铵和TEMED以1.4:0.33:0.25:0.02:0.02:0.002组成，其中Acr-Bis中Acr与Bis的比为29:1。
本发明所述的水蛭素抗凝血酶活性的测定方法，操作简单、设备要求低、准确性好，检测使用的水蛭素样本量小、检测浓度低。
本发明所述的水蛭素抗凝血酶活性的测定方法，选用交联剂BS3作为反应的交联剂，其水溶性好，具有双功能基团，可以修复蛋白质变性和电泳处理，使水蛭素与凝血酶以离子键结合形成的水蛭素-凝血酶化合物能够经受后期的变性处理、电泳处理的过程，而不会分离成两个独立的蛋白，为后期电泳和光密度扫描测定水蛭素抗凝血酶的活性奠定了基础。
本发明所述的水蛭素抗凝血酶活性的测定方法，可以通过梯度浓度的水蛭素与凝血酶反应得到的多个梯度的第三混合体系，采用电泳分析可以粗略估计水蛭素抗凝血酶的活性范围，如本发明的方案中，由标记为6-8的管中得到的水蛭素-凝血酶化合物的量是恒定的，可以得出水蛭素抗凝血酶的活性值介于管5至管6之间，即抑制3NIH凝血酶所需的水蛭素的质量介于0.5-0.6μg之间。
本发明所述的水蛭素抗凝血酶活性的测定方法，通过不同浓度的水蛭素与凝血酶反应得到的多个第一混合体系，采用光密度扫描电泳后得到的蛋白带，以牛血清白蛋白为对照物，可以准确计算得到水蛭素抗凝血酶的活性为5668ATU/mg。
附图说明
图1为本发明的实施例1中得到的混合体系的电泳图；
图2为本发明的实施例2中得到的混合体系的电泳图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
下文将结合具体实施例详细描述本发明。应当注意的是，下述实施例中描述的技术特征或者技术特征的组合不应当被认为是孤立的，它们可以被相互组合从而达到更好的技术效果。
实施例1：
将从左向右排列的四个管中依次分别加入11.5μL、10.5μL、1.5μL、1.5μL的结合缓冲液，再依次加入0μL、1μL、10μL、10μL的水蛭素溶液，向四个管中分别加入2μL的凝血酶溶液，混合后，将四个管均在37℃下水浴5min，向从左至右的前3个管中均加入1.5μL交联剂BS3溶液，第四个管中加入1.5μL交联缓冲液，交联反应30min后，向四个管中加入1μL终止缓冲溶液在室温下反应15min终止交联，然后向四个管中加入4μL的5％SDS-PAGE蛋白上样缓冲液，混匀后，每管取10μL样品用于SDS-PAGE分析和光密度扫描，并以0.1μg和1.0μg的牛血清白蛋白(BSA)为对照，该凝胶电泳是采用考马斯亮蓝染色的，得到如图1的电泳图，其中，所述结合缓冲液为质量分数为0.9％的氯化钠溶液；所述水蛭素溶液的浓度为0.2mg/mL，所述凝血酶溶液是以质量分数为0.9％氯化钠溶液为溶剂配制的凝血酶蛋白浓度为4.8mg/mL即3NIH/μL的溶液；所述交联剂BS3溶液由12.5mmol BS3和20mmol磷酸钠溶解于1.5μL 0.9％的氯化钠溶液得到的溶液；所述交联缓冲液是由20mmol磷酸钠溶解于1.5μL 0.9％的氯化钠溶液得到的溶液；所述终止缓冲溶液由0.8mmolTris和0.8mmol甘氨酸溶解于1μL 0.9％的氯化钠溶液中，并用盐酸调节其pH为7.5；
图1中T为凝血酶的条带，H为水蛭素的条带，C为水蛭素-凝血酶化合物的条带，其中Marker为标记带，图1中标记为1-4的管中的样品经电泳后的蛋白条带如图1中从左往右一一对应，最右端的两个蛋白条带分别为0.1μg和1.0μg牛血清白蛋白(BSA)的蛋白条带。
由图1可以通过肉眼观察可以得出，未添加交联剂BS3的第四个管中，未见有水蛭素-凝血酶化合物的产生，因此，选用交联剂BS3能较好的固定水蛭素-凝血酶化合物，防止电泳过程中其发生解离而无法通过电泳或光密度扫描得出其质量，从而无法得到水蛭素抗凝血酶的活性。
由图1还可以得出，添加0.1μg水蛭素后，部分凝血酶结合形成水蛭素-凝血酶化合物，其分子量42kDa；水蛭素添加到1μg时，水蛭素-凝血酶化合物的蛋白条带变得更强。在图1中水蛭素的条带略高于12kDa蛋白质的条带，假定该分子量二聚体的分子量为14kDa，符合先前的报道的结论。二聚体的形成是通过水蛭素N端内部三个二硫键，对于结合凝血酶是必不可少的，然而水蛭素的C端，仍然被暴漏在二聚体之外，因此能在二聚体的条件下保证水蛭素的结合活性。
实施例2：
步骤一、向标记为1-8的管中依次添加结合缓冲液10.5μL、9.5μL、8.5μL、7.5μL、6.5μL、5.5μL、4.5μL和3.5μL，再依次添加水蛭素溶液1μL、2μL、3μL、4μL、5μL、6μL、7μL和8μL，于8个管中分别加入2μL凝血酶溶液，混匀后，将其均置于37℃下水浴5min，所述结合缓冲液为质量分数为0.9％的氯化钠溶液；所述水蛭素溶液的浓度为0.2mg/mL，所述凝血酶溶液是以质量分数为0.9％氯化钠溶液为溶剂配制的凝血酶蛋白浓度为4.8mg/mL即3NIH/μL的溶液；
步骤二、向8个管中分别加入1.5μL交联剂BS3溶液，于室温下交联反应30min，所述交联剂BS3溶液由12.5mmol BS3和20mmol磷酸钠溶解于1.5μL 0.9％的氯化钠溶液得到的溶液；
步骤三、向8个管中分别加入1μL终止缓冲溶液，反应15min以终止交联反应，所述终止缓冲溶液由0.8mmolTris和0.8mmol甘氨酸溶解于1μL 0.9％的氯化钠溶液中，并用盐酸调节其pH为7.5；
步骤四、向8个管中分别加入4μL的5％SDS-PAGE蛋白上样缓冲液，混匀后每管取10μL进行SDS-PAGE分析，所述5％SDS-PAGE蛋白上样缓冲液由蒸馏水、30％的Acr-Bis、1molpH为8.8的Tris、10％SDS、10％过硫酸铵和TEMED以1.4:0.33:0.25:0.02:0.02:0.002组成，其中Acr-Bis中Acr与Bis的比为29:1。
标记为9的管中的样品为对照组。标记为9的管中，添加结合缓冲液3.5μL，添加水蛭素溶液8μL，加入2μL凝血酶溶液，混匀后，将其均置于37℃下水浴5min，加入1.5μL交联缓冲液，于室温下交联反应30min，加入1μL终止缓冲溶液，反应15min以终止交联反应，加入4μL的5％SDS-PAGE蛋白上样缓冲液，混匀后取10μL进行SDS-PAGE分析。所述交联缓冲液是由20mmol磷酸钠溶解于1.5μL 0.9％的氯化钠溶液得到的溶液。
得到标记为1-9的管中样品经电泳后得到的电泳图如图2中从左往右一一对应，其中Marker为标记带，非标记为1-9的管中的样品的电泳蛋白条带。由图2可知，标记为8的管与标记为9的管中，由于标记为9的管中没有添加交联剂BS3，因此得到的电泳条带上没有水蛭素-凝血酶化合物(C)的条带。
电泳结果如图2所示，得到标记为6-8的管中样品经SDS-PAGE分析得出的水蛭素-凝血酶化合物的蛋白带的密度未发生变化，因此得出水蛭素抗凝血酶的活性范围在标记为5的管与标记为6的管之间，由于取样量为10μL，每个管中的样本总量为20μL，水蛭素溶液的浓度为0.2mg/mL，因此得出每管取样量中对应的水蛭素的质量为0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8μg，由于每个管中的凝血酶溶液加样量为2μL，其浓度为4.8mg/mL，电泳和光密度扫描分析使用量为10μL，即得出每管取样量中对应的凝血酶的活性为3NIH，即抑制3NIH凝血酶需要的水蛭素的质量为0.5-0.6μg，即水蛭素抗凝血酶的活性为5000-6000ATU/mg。
实施例3：
在实施例2的基础上，在8个管中的样品进行SDS-PAGE分析后以0.1μg和1μg牛血清白蛋白作为对照进行光密度扫描检测。
由光密度扫描检测得到8个管中对应的水蛭素-凝血酶化合物的质量依次为0.45μg、0.91μg、1.36μg、1.82μg、2.27μg、2.4μg、2.4μg和2.4μg，由标记为6-8的管中水蛭素-凝血酶化合物的质量，可以得出有效凝血酶的质量为2.0μg(即2.4μg的5/6)，因此得出凝血酶溶液中有效凝血酶的质量分数为41.7％(2.0/4.8×100％)，由于标记为1-5的管中水蛭素是反应完全的，由此得出标记为1-5的管中水蛭素抗凝血酶的活性为5625ATU/mg、5687.5ATU/mg、5666.7ATU/mg、5687.5ATU/mg和5675ATU/mg，求其平均值得到水蛭素抗凝血酶的活性为5668ATU/mg，在此，对标记为1的管中水蛭素抗凝血酶的活性进行计算，过程如下：
水蛭素-凝血酶化合物的质量为：0.45μg；
有效凝血酶的质量为：0.45×5/6＝0.375μg；
标记为1的管中水蛭素的质量为0.1μg，凝血酶的质量为0.375/41.7％＝0.899μg，即0.1μg的水蛭素可与0.899μg的凝血酶反应；
由于3NIH凝血酶的质量为4.8μg，因此可以得出3NIH凝血酶可以反应0.5333μg的水蛭素；
经单位换算得出，水蛭素抗凝血酶的活性为：
3×1000/0.5333＝5625ATU/mg。
本发明的实施例中使用的原料来源如下：
凝血酶样品是从Solarbio购买(上海)的牛a凝血酶，其活性为250NIH/mg，蛋白浓度为40％。凝血酶用0.9％的氯化钠溶液配成4.8毫克/毫升(3NIH/μL)的浓度；
水蛭素样品标记为H，H是从Pichia Pastoris体内纯化的重组水蛭素。它是由昆明大学生物学系慷慨地提供的。水蛭素的蛋白质浓度使用布拉德福德法确定，浓度调整至0.2毫克/毫升。
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。
Claims (7)
1.一种水蛭素抗凝血酶活性的测定方法，其特征在于，将已知一定质量的含有未知活性的水蛭素与足量的凝血酶反应后，在交联剂作用下进行交联反应，终止交联后得到含有水蛭素、凝血酶和水蛭素-凝血酶化合物的第一混合体系，其中，所述交联剂为BS3，所述第一混合体系经电泳后采用光密度扫描，在已知蛋白带密度的对照物基础上根据水蛭素-凝血酶化合物的蛋白带密度得到水蛭素-凝血酶化合物的质量，根据水蛭素与凝血酶以质量比为1:5结合得到水蛭素-凝血酶化合物得出参与反应的有效凝血酶的质量，再根据凝血酶中有效凝血酶的质量分数以及水蛭素的质量计算得出该一定质量的水蛭素抑制所述凝血酶的活性值即为水蛭素抗凝血酶的活性值。
2.如权利要求1所述的水蛭素抗凝血酶活性的测定方法，其特征在于，所述凝血酶中有效凝血酶的质量分数的测定方法如下：将足量的水蛭素与已知一定质量的凝血酶反应后，在交联剂BS3作用下进行交联反应，终止交联后得到含有水蛭素、凝血酶和水蛭素-凝血酶化合物的第二混合体系，经电泳后采用光密度扫描，在已知蛋白带密度的对照物基础上根据第二混合体系中水蛭素-凝血酶化合物的蛋白带密度得到水蛭素-凝血酶化合物的质量，进而得到有效凝血酶的质量，其与已知一定质量的凝血酶的质量比即为所述凝血酶中有效凝血酶的质量分数。
3.如权利要求2所述的水蛭素抗凝血酶活性的测定方法，其特征在于，将多组不同质量的含有未知活性的水蛭素与恒定量且足量的凝血酶反应后得到一一对应的多组第一混合体系，从而得出多组水蛭素抗凝血酶的活性值，求其均值，即得水蛭素抗凝血酶的活性。
4.一种水蛭素抗凝血酶活性的测定方法，其特征在于，将一系列梯度质量的含有未知活性的水蛭素与恒定量的凝血酶反应后，在交联剂BS3作用下进行交联反应，终止交联后得到一一对应的含有水蛭素、凝血酶和水蛭素-凝血酶化合物的第三混合体系，经电泳后根据未反应的水蛭素、未反应的凝血酶以及水蛭素-凝血酶化合物的蛋白带的变化确定水蛭素抗凝血酶活性的范围。
5.一种水蛭素抗凝血酶活性的测定方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一、向标记为1-8的管中依次添加结合缓冲液10.5μL、9.5μL、8.5μL、7.5μL、6.5μL、5.5μL、4.5μL和3.5μL，再依次添加水蛭素溶液1μL、2μL、3μL、4μL、5μL、6μL、7μL和8μL，于8个管中分别加入2μL凝血酶溶液，混匀后，将其均置于37℃下水浴5min，所述结合缓冲液为质量分数为0.9％的氯化钠溶液；所述水蛭素溶液的浓度为0.2mg/mL，所述凝血酶溶液是以质量分数为0.9％氯化钠溶液为溶剂配制的凝血酶蛋白浓度为4.8mg/mL即3NIH/μL的溶液；
步骤二、向8个管中分别加入1.5μL交联剂BS3溶液，于室温下交联反应30min，所述交联剂BS3溶液由12.5mmol BS3和20mmol磷酸钠溶解于1.5μL 0.9％的氯化钠溶液得到的溶液；
步骤三、向8个管中分别加入1μL终止缓冲溶液，反应15min以终止交联反应，所述终止缓冲溶液由0.8mmolTris和0.8mmol甘氨酸溶解于1μL 0.9％的氯化钠溶液中，并用盐酸调节其pH为7.5；
步骤四、向8个管中分别加入4μL的5％SDS-PAGE蛋白上样缓冲液，混匀后每管取10μL进行SDS-PAGE分析，得出标记为6-8的管中样品经SDS-PAGE分析得出的水蛭素-凝血酶化合物的蛋白带的密度未发生变化，因此得出水蛭素抗凝血酶的活性范围在标记为5的管与标记为6的管之间，即抑制3NIH凝血酶需要的水蛭素的质量为0.5-0.6μg，即水蛭素抗凝血酶的活性为5000-6000ATU/mg。
6.如权利要求5所述的水蛭素抗凝血酶活性的测定方法，其特征在于，在8个管中的样品进行SDS-PAGE分析后以0.1μg和1μg牛血清白蛋白作为对照，进行光密度扫描检测得到8个管中对应的水蛭素-凝血酶化合物的质量依次为0.45μg、0.91μg、1.36μg、1.82μg、2.27μg、2.4μg、2.4μg和2.4μg，由标记为6-8的管中水蛭素-凝血酶化合物的质量得出凝血酶溶液中有效凝血酶的质量分数为41.7％，由此得出标记为1-5的管中水蛭素抗凝血酶的活性为5625ATU/mg、5687.5ATU/mg、5666.7ATU/mg、5687.5ATU/mg和5675ATU/mg，求其平均值得到水蛭素抗凝血酶的活性为5668ATU/mg。
7.如权利要求5所述的水蛭素抗凝血酶活性的测定方法，其特征在于，所述5％SDS-PAGE蛋白上样缓冲液由蒸馏水、30％的Acr-Bis、1molpH为8.8的Tris、10％SDS、10％过硫酸铵和TEMED以1.4:0.33:0.25:0.02:0.02:0.002组成，其中Acr-Bis中Acr与Bis的比为29:1。
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