CN110423795A - 一种凝血酶抑制活性的测定方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种凝血酶抑制活性的测定方法，取纤维蛋白原溶液和待测试样溶液混合，加入含有磁珠的血凝杯中，作为检测组；使用等体积的缓冲液替代所述检测组中的待测试样溶液，作为空白组；将所述检测组和空白组分别置于37℃放置60～300s，加入步骤S1所述凝血酶溶液，使用全自动凝血分析仪检测血凝杯中溶液的凝固时间，使用t检验对凝固时间进行显著性分析，如果检测组的凝固时间显著大于空白组(P＜0.05)，则认为待测试样具有凝血酶抑制活性。本发明对缓冲液的组分及检测手段进行了优化和改进，有效的避免现了有方法进行检测时出现假阳性结果；并且扩大了可检测样品的范围，为检测提供更大、更准确的样本空间。

Description

一种凝血酶抑制活性的测定方法

技术领域

本发明涉及抗凝血技术领域，具体涉及一种凝血酶抑制活性的测定方法。

背景技术

由于现代人们工作压力大、生活节奏快，以及睡眠不足、过度饮食、嗜烟和酗酒等不良的生活习惯的影响，心脑血管疾病中的血栓性疾病现已成为人类的头号杀手。目前，心血管疾病在欧洲每年造成几百万人过早死亡，在我国心血管病患病率处于持续上升阶段。推算心血管疾病现患病人数2.9亿，并且今后10年心血管病患病人数仍将快速增长。据调查，心血管病死亡占城乡居民总死亡原因的首位，农村为45.01％，城市为42.61％，且患病率随年龄升高而增加，我国每年有近350万人死于心血管疾病，占总死亡人数的41％以上。

目前血栓性疾病属于主要危害我国居民生活健康的心脑血管疾病之一。凝血酶作为人体内凝血过程中的关键酶，一直受到广泛研究。目前较为常见且高效的抗血栓药物，如：比伐卢定，阿加曲班，肝素等，都是直接或间接抑制凝血酶活性从而达到抗血栓的目的。然而，这些药物虽效果较好但是都存在一定的副作用，如血小板减少和引起出血等。认识到这些药物的缺点，寻找新的抗血栓药物迫在眉睫。在这种背景下，准确快速且便捷的凝血酶抑制剂活性检测方法就显得尤为重要

目前，已有且较为成熟的体外检测抗凝血酶抑制剂活性的方法有：发色底物法、凝血酶时间法(TT)、纤维蛋白原凝固时间法等。前者通过比较吸光度大小差异来表征凝血酶抑制剂活性，后两个则是通过比较凝固时间的不同来表征凝血酶抑制剂的活性。而目前较为常用且灵敏度较高的检测方法为发色底物法与凝血四项法。该方法能具有快速，简便，灵敏等优点。同时，该方法还可以准确判断抑制剂是否与凝血酶活性中心结合从而产生抑制效果。但此方法存在的问题是仅能准确表征与凝血酶活性中心相互结合的抑制剂，而对于与凝血酶其它位点结合的抑制剂表征效果不理想。而在2007年，由杨万根等人提出的通过检测纤维蛋白原凝块吸光度的变化判断抑制剂的活性。该方法虽然可以用来检测抑制剂是否与凝血酶外置位点结合，但仍存在一些缺陷。因此，需要一种新的凝血酶抑制剂的检测方法，来更完善更准确的对抑制剂活性进行表征。

发明内容

本发明的目的是为了解决现有凝血酶抑制剂检测方法适应范围较窄，无法考虑到凝血酶外置位点，从而提供一种新的，适用范围更广的凝血酶抑制活性的测定方法。

为了达到上述目的，本发明提供一种凝血酶抑制活性的测定方法，包括步骤：

S1、分别使用缓冲液溶解纤维蛋白原、凝血酶和待测试样，配置成纤维蛋白原溶液、凝血酶溶液和待测试样溶液；所述纤维蛋白原溶液放置37℃备用，凝血酶溶液放置于4℃中备用；其中所述缓冲液为缓冲液A或缓冲液B；所述缓冲液A：咪唑浓度为0.05mol/L、氯化钠浓度为0.1～0.15mol/L、氯化钙浓度为0.001～0.002mol/L，余量为水，pH为7.35～7.45；所述缓冲液B：Tris浓度为0.05mol/L、氯化钠浓度为0.1～0.15mol/L、氯化钙浓度为0.001～0.002mol/L，余量为水，pH为7.35～7.45；

S2、取步骤S1所述纤维蛋白原溶液和待测试样溶液混合，加入血凝杯中(杯中已添加磁珠，磁珠静置于血凝杯中)，作为检测组；置于37℃放置60～300s，再加入步骤S1所述凝血酶溶液，以所述纤维蛋白原溶液中纤维蛋白原的总量和所述凝血酶溶液中凝血酶的总量计，每0.5～3mg纤维蛋白原添加6～12U凝血酶；使用全自动凝血分析仪检测血凝杯中溶液的凝固时间(即所述纤维蛋白原凝固所需时间)，从加入所述凝血酶溶液开始计时，直至血凝杯中磁珠开始转动时停止计时，所记时间为凝固时间；所述磁珠开始转动时判定为凝固；使用等体积的步骤S1所述缓冲液替代检测组中的待测试样溶液，其余各样品的浓度、体积及检测条件均与检测组相同，作为空白组；所述空白组溶液的凝固时间记为空白凝固时间；

S3、通过比较步骤S2所述凝固时间来判定是否有凝血酶抑制活性，将检测组的凝固时间与步骤S2所述空白凝固时间进行比较，使用IBM SPSS Statistics19.0对结果进行显著性分析，分析方法使用t检验分析法；以空白组的凝固时间为参比标准，若检测组的凝固时间长于空白组，并且检测组与空白组凝固时间存在显著性差异，即p＜0.05，则认为待测试样具有凝血酶抑制活性；通过检测组凝固时间的长短，来判定凝血酶抑制剂的活性强弱，凝固时间越长，则凝血酶抑制活性越强；通过待测试样浓度升高时检测组凝固时间的变化来判断凝血酶抑制活性是否依浓度升高而增加，若检测组的凝固时间随待测试样的浓度升高而显著延长，即p＜0.05，则认为所述待测试样凝血酶抑制活性随其浓度的升高而增大；反之，若检测组的凝固时间随待测试样的浓度升高而无显著延长，即显著性分析结果显示p＞0.05，则认为试样抑制凝血酶活性的能力不随浓度的升高而增大。

优选方式下，所述凝血酶抑制剂活性的测定方法，包括步骤：

S1、分别使用缓冲液溶解纤维蛋白原、凝血酶和待测试样，配置成浓度为1～1.5mg/ml的纤维蛋白原溶液、浓度为8～12U/mL的凝血酶溶液和待测试样溶液；所述纤维蛋白原溶液放置37℃备用，凝血酶溶液放置于4℃中备用；其中所述缓冲液为缓冲液A或缓冲液B，所述缓冲液A：咪唑浓度为0.05mol/L、氯化钠浓度为0.1mol/L、氯化钙浓度为0.002mol/L，余量为水，pH为7.35～7.45；所述缓冲液B：Tris浓度为0.05mol/L、氯化钠浓度为0.1mol/L、氯化钙浓度为0.002mol/L，余量为水，pH为7.35～7.45；

S2、取步骤S1所述浓度为1～1.5mg/ml的纤维蛋白原溶液和待测试样溶液，按体积比2:1混合加入血凝杯中(杯中已添加磁珠)，作为检测组；37℃放置60～300s，再加入步骤S1所述浓度为6～12U/mL的凝血酶溶液，使用全自动凝血分析仪检测纤维蛋白原凝固所需时间，从加入步骤S1所述凝血酶溶液开始计时，磁珠转动时停止计时，所记时间为凝固时间；所述凝血酶溶液与所述纤维蛋白原溶液的体积比为1:2；使用等体积的步骤S1所述缓冲液替代检测组中的待测试样溶液，其余各样品的浓度、体积及检测条件均与检测组相同，作为空白组；所述空白组溶液的凝固时间记为空白凝固时间；

S3、通过比较步骤S2所述凝固时间来判定是否有凝血酶抑制活性，将检测组的凝固时间与步骤S2所述空白凝固时间进行比较，使用IBM SPSS Statistics19.0对结果进行显著性分析，分析方法使用t检验分析法；以空白组的凝固时间为参比标准，若检测组的凝固时间长于空白组、并且检测组与空白组凝固时间存在显著性差异，即p＜0.05，则认为待测试样具有凝血酶抑制活性；通过检测组凝固时间的长短，来判定凝血酶抑制剂的活性强弱，凝固时间越长，则凝血酶抑制活性越强；通过待测试样浓度升高时检测组凝固时间的变化来判断凝血酶抑制活性是否依浓度升高而增加，若检测组的凝固时间随待测试样的浓度升高而延长显著延长，即p＜0.05，则认为所述待测试样凝血酶抑制活性随其浓度的升高而增大；反之，若检测组的凝固时间随待测试样的浓度升高而无显著延长，即显著性分析结果显示p＞0.05，则认为试样抑制凝血酶活性的能力不随浓度的升高而增大。

优选方式下，步骤S1所述纤维蛋白原为牛纤维蛋白原；所述凝血酶为牛凝血酶。

与现有技术相比，本发明一种凝血酶抑制剂活性的测定方法包含以下有益效果：

1、本发明中所述的方法采用凝固时间作为检测指标，与传统缓冲液相比，该方法缓冲液中添加钙离子，减小了离子浓度因素与溶液不完全均一对实验结果的影响。

2、本发明采用纤维蛋白原作为凝血酶切割底物，与传统方法，如显色底物法比，底物更稳定，更便宜且对实验环境要求更低。

3、本发明放弃吸光光度法(杨万根等人提出)中采用测定吸光度为检测指标，改用测定凝固时间为检测指标，避免了具有金属离子螯合能力的物质对检测方法的影响，提高检测方法准确度。

4、本发明所涉及的一种凝血酶抑制剂活性的检测方法，简单易行，灵敏度高，适用范围广，具备实际开发的应用前景。

综上所述，本发明对缓冲液的组分及检测手段进行了优化和改进，有效的避免现了有方法进行检测时出现假阳性结果；并且扩大了可检测样品的范围，为后续检测提供更大、更准确的样本空间。

附图说明

图1为本发明实施例1测定不同待测试样凝血酶抑制活性能力的强弱结果；

图2为本发明实施例2测定不同待测试样凝血酶抑制活性能力的强弱结果；

图3为本发明实施例3测定不同浓度待测试样凝血酶抑制活性能力的强弱结果；

图4为本发明对比例1钙离子浓度对测定结果的影响图；

图5为本发明对比例2发色底物法检测不同抑制剂抗凝活性图；

图6为本发明对比例3吸光光度法检测不同抑制剂抗凝活性图。

具体实施方式

本发明一种凝血酶抑制剂活性测定方法按以下步骤实现：

一、配置缓冲液，配置咪唑浓度为0.05mol/L，氯化钠浓度为0.1mol/L，氯化钙浓度为0.002mol/L或Tris浓度为0.05mol/L，氯化钠浓度为0.1mol/L，氯化钙浓度为0.002mol/L的缓冲液。用盐酸调节缓冲液pH为7.4±0.05；

二、将待测抑制剂，纤维蛋白原，凝血酶用缓冲液溶解。纤维蛋白原溶液放置37℃环境中，凝血酶溶液放置于4℃境中备用；

三、将200μL纤维蛋白原溶液与100μL抑制剂或缓冲溶液加入血凝杯中，37℃育温，然后在血凝杯中加入100μL凝血酶溶液，检测纤维蛋白原凝固所需时间；

四、通过比较凝固时间的长短，来判定凝血酶抑制剂的活性强弱，并且通过抑制剂浓度不同来判断抑制剂活性是否依浓度增加。

本发明一种凝血酶抑制剂活性的检测方法可以用于检测凝血酶抑制剂的体外活性，并且可以对非凝血酶活性中心抑制剂进行检测。

本发明一种凝血酶抑制剂活性的检测方法，是以纤维蛋白原为凝血酶切割底物，经凝血酶切割后会形成不溶行的纤维蛋白凝块导致溶液凝固。而凝固时间的长短与凝血酶的活性有直接关系，因此可以通过比较凝固时间的长短来测定凝血酶抑制剂的活性强弱。本发明对凝血酶抑制剂的活性检测具有重要的意义。

具体实施方式一：本实施方式一种凝血酶抑制剂活性的检测方法按以下步骤实现：

一、配置缓冲液，配置咪唑浓度为0.05mol/L，氯化钠浓度为0.1mol/L，氯化钙浓度为0.002mol/L或Tris浓度为0.05mol/L，氯化钠浓度为0.1mol/L，氯化钙浓度为0.002mol/L的缓冲液。用盐酸调节缓冲液pH为7.4±0.05；

二、将待测抑制剂，纤维蛋白原，凝血酶用咪唑缓冲液溶解。纤维蛋白原溶液放置37℃环境中，凝血酶溶液放置于4℃境中备用；

三、将200μL纤维蛋白原溶液与100μL抑制剂或缓冲溶液加入血凝杯中，37℃育温，然后像血凝杯中加入100μL凝血酶溶液，检测纤维蛋白原凝固所需时间；

四、通过比较凝固时间的长短，来判定凝血酶抑制剂的活性强弱，并且通过抑制剂浓度不同来判断抑制剂活性是否依浓度增加。

具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一不同的是步骤二中纤维蛋白原溶液浓度为1～1.5mg/mL。其它步骤及参数与具体实施方式一相同。

具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式一或二不同的是步骤二凝血酶溶液浓度为8～12U/mL。其它步骤及参数与具体实施方式一或二相同。

具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式一至三之一不同的是步骤三在37℃下育温60s。其它步骤及参数与具体实施方式一至三之一相同。

下述各例使用的纤维蛋白原：博尔西(北京)、B1019；凝血酶：博尔西(北京)、B1016；全自动凝血分析仪：厂商：Merlin,Germany，型号：MC 4。

实施例1：

一种凝血酶抑制剂活性的测定方法按以下步骤实现：

S1、配制溶液：

使用缓冲液溶解纤维蛋白原配置成浓度为1mg/ml的纤维蛋白原溶液；

使用缓冲液溶解凝血酶，配置成浓度为10U/mL的凝血酶溶液；

使用缓冲液溶解待测试样，分别配制待测试样溶液，包括浓度为5mg/mL的无活性肽(无凝血酶抑制剂活性)溶液、0.0075mol/L的EDTA溶液(无凝血酶抑制活性金属离子螯合剂)、5mg/mL的水蛭素原溶液(凝血酶外置位点-1抑制剂、水蛭素末端十二肽)、1mg/mL的比伐卢定溶液(凝血酶二价抑制剂)；所述无活性肽为：合成肽经过多次反复冻融，并85℃、5分钟处理，破坏原有肽空间构象，使肽失活，称无活性肽；

所述纤维蛋白原溶液放置37℃备用，凝血酶溶液放置于4℃中备用；其中所述缓冲液为：咪唑浓度为0.05mol/L、氯化钠浓度为0.1mol/L、氯化钙浓度为0.002mol/L，余量为水，pH为7.35～7.45；

S2、将200μL步骤S1所述浓度为1mg/ml的纤维蛋白原溶液与100μL待测试样溶液混合，加入含有磁珠的血凝杯A中，作为检测组；将200μL步骤S1所述浓度为1mg/ml的纤维蛋白原溶液与100μL步骤S1所述缓冲液混合，加入含有磁珠的血凝杯B中，作为空白组；将所述检测组和空白组置于37℃放置育温60s，然后再向所述血凝杯A和血凝杯B中加入100μL步骤S1所述浓度为10U/mL的凝血酶溶液，使用全自动凝血分析仪检测空白组和检测组的纤维蛋白原凝固所需时间(即血凝杯B和血凝杯A中溶液凝固的时间)，从加入凝血酶溶液开始计时，磁珠转动时停止计时，所记时间为凝固时间；所述空白组即血凝杯B中溶液的凝固时间记为空白凝固时间；

S3、通过比较步骤S2所述凝固时间来判定是否有凝血酶抑制活性，将检测组的凝固时间与步骤S2所述空白凝固时间进行比较，使用IBM SPSS Statistics19.0对结果进行显著性分析，分析方法使用t检验分析法，以空白组的凝固时间为参比标准，若检测组的凝固时间长于空白组，并且检测组与空白组凝固时间存在显著性差异，即p＜0.05，则认为待测试样具有凝血酶抑制活性；通过凝固时间的长短，来判定凝血酶抑制剂的活性强弱，凝固时间越长，则凝血酶抑制剂活性越强；通过抑制剂浓度的升高时凝固时间的变化来判断抑制剂活性是否依浓度升高而增加，若试样的凝固时间随试样的浓度升高而延长，则认为试样抑制凝血酶活性的能力随浓度的升高而增大；反之，若试样的凝固时间随试样的浓度升高而无显著延长，即显著性分析结果显示p＞0.05，则认为试样抑制凝血酶活性的能力不随浓度的升高而增大。

本实施例检测不同物质抑制凝血酶活性能力强弱如图1所示，图1为本实施例测定不同物质抑制凝血酶活性能力的强弱，图中a、b、c表示显著性差异结果，不同字母间代表具有显著性差异。以缓冲液的凝固时间作为参照标准，显著性分析显示水蛭素原与比伐卢定具有良好的抑制凝血酶活性，而无活性肽，EDTA则无抑制凝血酶活性；由于比伐卢定的凝固时间远远长于水蛭素原的凝固时间，因此认为比伐卢定的抑制凝血酶活性效果更好。说明本发明的测定方法具有高灵敏性与广泛适用性。

实施例2：

一种凝血酶抑制剂活性的测定方法按以下步骤实现：

S1、配制溶液：

使用缓冲液溶解纤维蛋白原配置成浓度为1mg/ml的纤维蛋白原溶液；

使用缓冲液溶解凝血酶，配置成浓度为10U/mL的凝血酶溶液；

使用缓冲液溶解待测试样，分别配制待测试样溶液，包括浓度为5mg/mL的无活性肽(无凝血酶抑制剂活性)溶液、0.0075mol/L的EDTA溶液(无凝血酶抑制活性金属离子螯合剂)、5mg/mL的水蛭素原溶液(凝血酶外置位点-1抑制剂、水蛭素末端十二肽)、1mg/mL的比伐卢定溶液(凝血酶二价抑制剂)；所述无活性肽为：合成肽经过多次反复冻融，并85℃、5分钟处理，破坏原有肽空间构象，使肽失活，称无活性肽；

所述纤维蛋白原溶液放置37℃备用，凝血酶溶液放置于4℃中备用；其中所述缓冲液为：Tris浓度为0.05mol/L、氯化钠浓度为0.1mol/L、氯化钙浓度为0.002mol/L，余量为水，pH为7.35～7.45；

S2、将200μL步骤S1所述浓度为1mg/ml的纤维蛋白原溶液与100μL待测试样溶液混合，加入含有磁珠的血凝杯A中，作为检测组；将200μL步骤S1所述浓度为1mg/ml的纤维蛋白原溶液与100μL步骤S1所述缓冲液混合，加入含有磁珠的血凝杯B中，作为空白组；将所述检测组和空白组置于37℃放置育温60s，然后再向所述血凝杯A和血凝杯B中加入100μL步骤S1所述浓度为10U/mL的凝血酶溶液，使用全自动凝血分析仪检测空白组和检测组的纤维蛋白原凝固所需时间(即血凝杯B和血凝杯A中溶液凝固的时间)，从加入凝血酶溶液开始计时，磁珠转动时停止计时，所记时间为凝固时间；所述空白组即血凝杯B中溶液的凝固时间记为空白凝固时间；

S3、通过比较步骤S2所述凝固时间来判定是否有凝血酶抑制活性，将检测组的凝固时间与步骤S2所述空白凝固时间进行比较，使用IBM SPSS Statistics19.0对结果进行显著性分析，分析方法使用t检验分析法，以空白组的凝固时间为参比标准，若检测组的凝固时间长于空白组，并且检测组与空白组凝固时间存在显著性差异，即p＜0.05，则认为待测试样具有凝血酶抑制活性；通过凝固时间的长短，来判定凝血酶抑制剂的活性强弱，凝固时间越长，则凝血酶抑制剂活性越强；通过抑制剂浓度的升高时凝固时间的变化来判断抑制剂活性是否依浓度升高而增加，若检测组的凝固时间随待测试样的浓度升高而增大，则认为所述待测试样抑制凝血酶活性的能力随浓度的升高而增大；反之，若待测试样的凝固时间随试样的浓度升高而无明显延长，即显著性分析结果显示p＞0.05，则认为试样抑制凝血酶活性的能力不随浓度的升高而增大。

本实施例检测不同物质抑制凝血酶活性能力强弱如图2所示，图2为本实施例测定不同物质抑制凝血酶活性能力的强弱，图中a、b、c表示显著性差异结果，不同字母间代表具有显著性差异。以缓冲液的凝固时间作为参照标准，显著性分析显示水蛭素原与比伐卢定具有良好的抑制凝血酶活性，而无活性肽、EDTA则无抑制凝血酶活性；说明本发明的测定方法具有高灵敏性与广泛适用性。

实施例3：

一种凝血酶抑制剂活性的测定方法按以下步骤实现：

S1、配制溶液：

使用缓冲液溶解纤维蛋白原配置成浓度为1mg/ml的纤维蛋白原溶液；

使用缓冲液溶解凝血酶，配置成浓度为10U/mL的凝血酶溶液；

使用缓冲液溶解待测试样，分别配制不同浓度(浓度分别为0.004mol/L、0.008mol/L、0.012mol/L、0.016mol/L)的待测试样溶液；所述待测试样为具有凝血酶抑制活性的多肽PICA，下述文献公开了所述多肽PICA：H.Liu,M.Tu,S.Cheng,H.Chen,Z.Wangand M.Du,An anticoagulant peptide from beta-casein:identification,structureand molecular mechanism,Food&function,2019,10,886-892.；

所述纤维蛋白原溶液放置37℃备用，凝血酶溶液放置于4℃中备用；其中所述缓冲液为：咪唑浓度为0.05mol/L、氯化钠浓度为0.1mol/L、氯化钙浓度为0.002mol/L，余量为水，pH为7.35～7.45；

S2、将200μL步骤S1所述浓度为1mg/ml的纤维蛋白原溶液分别与100μL不同浓度待测试样溶液混合，加入含有磁珠的血凝杯A中，作为检测组；将200μL步骤S1所述浓度为1mg/ml的纤维蛋白原溶液与100μL步骤S1所述缓冲液混合，加入含有磁珠的血凝杯B中，作为空白组；将所述检测组和空白组置于37℃放置育温60s，然后再向所述血凝杯A和血凝杯B中加入100μL步骤S1所述浓度为10U/mL的凝血酶溶液，使用全自动凝血分析仪检测空白组和检测组的纤维蛋白原凝固所需时间(即血凝杯B和血凝杯A中溶液凝固的时间)，从加入凝血酶溶液开始计时，磁珠转动时停止计时，所记时间为凝固时间；所述空白组即血凝杯B中溶液的凝固时间记为空白凝固时间；

S3、通过比较步骤S2所述凝固时间来判定是否有凝血酶抑制活性，将检测组的凝固时间与步骤S2所述空白凝固时间进行比较，使用IBM SPSSStatistics19.0对结果进行显著性分析，分析方法使用t检验分析法，以空白组的凝固时间为参比标准，若检测组的凝固时间长于空白组的凝固时间，并且检测组与空白组凝固时间存在显著性差异，即p＜0.05，则认为待测试样具有凝血酶抑制活性；通过凝固时间的长短，来判定凝血酶抑制剂的活性强弱，凝固时间越长，则凝血酶抑制剂活性越强；通过抑制剂浓度的升高时凝固时间的变化来判断抑制剂活性是否依浓度升高而增加，若检测组的凝固时间随待测试样的浓度升高而延长，则认为待测试样抑制凝血酶活性的能力随浓度的升高而增大；反之，若检测组的凝固时间随待测试样的浓度升高而无显著延长，即显著性分析结果显示p＞0.05，则认为试样抑制凝血酶活性的能力不随浓度的升高而增大。

图3为本实施例测定同一待测试样不容浓度抑制凝血酶活性能力的强弱，图中a、b、c、d表示显著性差异结果，不同字母间代表具有显著性差异。以缓冲液的凝固时间作为参照标准，结果显示凝固时间随浓度的增大而显著增大，说明该试样(即多肽PICA)抑制凝血酶的活性是依浓度的升高而增加。

对比例1：

钙离子浓度对凝固时间影响的测定，按以下步骤实现：

S1、配制溶液：

使用缓冲液分别溶解纤维蛋白原配置成浓度为1mg/ml的纤维蛋白原溶液；

使用缓冲液溶解凝血酶，配置成浓度为10U/mL的凝血酶溶液；

使用缓冲液溶解氯化钙，配置成不同浓度(0.002mol/L、0.02mol/L)的氯化钙溶液；

所述纤维蛋白原溶液与氯化钙溶液放置37℃备用，凝血酶溶液放置于4℃中备用；其中所述缓冲液：Tris浓度为0.05mol/L、氯化钠浓度为0.1mol/L、余量为水，pH为7.35～7.45；

S2、将200μL步骤S1所述浓度为1mg/ml的纤维蛋白原溶液与100μL缓冲液加入血凝杯(已加入磁珠)中，37℃放置育温60s，然后再向所述血凝杯中加入100μL步骤S1所述浓度为10U/mL的凝血酶溶液，使用全自动凝血分析仪检测纤维蛋白原(即血凝杯中溶液)凝固所需时间，从加入凝血酶溶液开始计时，磁珠转动时停止计时，所记时间为凝固时间；

S3、将200μL步骤S1所述浓度为1mg/ml的纤维蛋白原溶液与100μL步骤S1所述浓度为0.002mol/L氯化钙溶液加入血凝杯(已加入磁珠)中，37℃放置育温60s，然后再向所述血凝杯中加入100μL步骤S1所述浓度为10U/mL的凝血酶溶液，使用全自动凝血分析仪检测纤维蛋白原(即血凝杯中溶液)凝固所需时间，从加入凝血酶溶液开始计时，磁珠转动时停止计时，所记时间为凝固时间；

S4、将200μL步骤S1所述浓度为1mg/ml的纤维蛋白原溶液与100μLS1所述浓度为0.02mol/L氯化钙溶液加入血凝杯(已加入磁珠)中，37℃放置育温60s，然后再向所述血凝杯中加入100μL步骤S1所述浓度为10U/mL的凝血酶溶液，使用全自动凝血分析仪检测纤维蛋白原(即血凝杯中溶液)凝固所需时间，从加入凝血酶溶液开始计时，磁珠转动时停止计时，所记时间为凝固时间；

S5、通过比较步骤S2(无钙离子)、S3(钙离子终浓度0.0004mol/L)、S4(钙离子终浓度0.004mol/L)所述纤维蛋白原凝固时间的长短，来比较钙离子对凝固时间的影响。

本对比例钙离子对凝固时间的影响如图4所示，结果显示，钙离子浓度逐渐增加可以缩短凝固时间(即缩短空白组的凝固时间)并减少实验误差。说明钙离子会显著影响凝固时间长短与检测稳定性。

对比例2：

发色底物法测定凝血酶抑制剂的活性，按以下步骤实现:

S1、配置溶液：

使用缓冲液溶解凝血酶显色底物S-2238配置成浓度为0.0015mol/L的显色底物溶液；

使用缓冲液溶解凝血酶，配置成浓度为10U/mL的凝血酶溶液；

使用缓冲液溶解待测试样，分别配制待测试样溶液，包括5mg/mL的水蛭素原溶液(凝血酶外置位点-1抑制剂、水蛭素末端十二肽)、1mg/mL的比伐卢定溶液(凝血酶二价抑制剂)

所述显色底物溶液，凝血酶放置于4℃中备用；其中所述缓冲液为：Tris浓度为0.05mol/L，氯化钠浓度为0.15mol/L，EDTA浓度为0.0075mol/L，余量为水，pH为7.35～7.45；

S2、将20μL步骤S1所述浓度为10U/L的凝血酶溶液与140μL待测试样溶液或缓冲液(作为空白对照)加入96孔板中，37℃放置育温180s，然后在向所述96孔板中加入20μL步骤S1所述浓度为0.0075mol/L的显色底物溶液，使用多功能酶标仪检测405nm下吸光度；

S3、通过比较步骤S2所述吸光度的变化与最终大小来判定凝血酶抑制剂的活性强弱，并且通过抑制剂不同浓度来判断抑制剂活性是否依赖浓度增加。

本对比例检测不同物质抑制凝血酶活性能力强弱如附图5所示，图5为对比例2测定不同物质抑制凝血酶活性能力的强弱，结果显示水蛭素原与缓冲液吸光度相近，无明显抑制活性，比伐卢定则显示出明显抑制活性；

如下述文献所示，水蛭素原为公认的具有凝血酶抑制活性的物质，因此本对比例所述方法无法检测出单独抑制凝血酶外置位点-1的抑制剂。说明发色底物法无法准确检测出所有类型的抑制剂。

所述文件如下：

N.Howard,C.Abell,W.Blakemore,G.Chessari,M.Congreve,S.Howard,H.Jhoti,C.W.Murray,L.C.A.Seavers and R.L.M.v.Montfort,Application of FragmentScreening and Fragment Linking to the Discovery of Novel Thrombin Inhibitors,Journal of Medicinal Chemistry,2006,49,1346-1355.

T.Myles and L.L.Leung,Thrombin hydrolysis of human osteopontin isdependent on thrombin anion-binding exosites,The Journal of biologicalchemistry,2008,283,17789-17796.

对比例3：

分光光度法测定凝血酶抑制剂的活性按以下步骤实现：

S1、配制溶液：

使用缓冲液溶解纤维蛋白原配置成浓度为1mg/ml的纤维蛋白原溶液；

使用缓冲液溶解凝血酶，配置成浓度为12U/mL的凝血酶溶液；

使用缓冲液溶解待测试样，分别配制待测试样溶液，包括0.0075mol/L的EDTA溶液(无凝血酶抑制活性金属离子螯合剂)、1mg/mL的比伐卢定溶液(凝血酶二价抑制剂)

所述纤维蛋白原溶液放置37℃备用，凝血酶溶液放置于4℃中备用；其中所述缓冲液为：Tris浓度为0.05mol/L、氯化钠浓度为0.00012mol/L、余量为水，pH为7.2；

S2、将140μL步骤S1所述浓度为1mg/ml的纤维蛋白原溶液与40μL待测凝血酶抑制剂溶液或缓冲液(作为空白凝固时间)加入96孔板中，37℃放置育温300s，然后再向所述血凝杯中加入10μL步骤S1所述浓度为12U/mL的凝血酶溶液，震荡混匀8s后使用多功能酶标仪检测405nm处吸光度；

S3、通过比较步骤S2所述405nm处吸光度值的不同，来判定凝血酶抑制剂的活性强弱，并且通过抑制剂浓度不同来判断抑制剂活性是否依浓度增加。

本对比例检测不同物质抑制凝血酶活性能力强弱如附图6所示，无凝血酶抑制活性的金属离子螯合剂EDTA溶液吸光度远远小于添加缓冲液(对照组)的吸光度，凝血酶二价抑制剂比伐卢定的效果与EDTA溶液相似，表明EDTA与比伐卢定均具有凝血酶的抑制活性，说明分光光度法在检测某些具有金属离子螯合能力的物质时，会出现假阳性结果。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (4)

1.一种凝血酶抑制活性的测定方法，其特征在于，包括步骤：

S1、分别使用缓冲液溶解纤维蛋白原、凝血酶和待测试样，配置成纤维蛋白原溶液、凝血酶溶液和待测试样溶液；其中所述缓冲液为缓冲液A或缓冲液B；所述缓冲液A：咪唑浓度0.05mol/L、氯化钠浓度0.1～0.15mol/L、氯化钙浓度0.001～0.002mol/L，余量为水，pH为7.35～7.45；所述缓冲液B：Tris浓度0.05mol/L、氯化钠浓度0.1～0.15mol/L、氯化钙浓度为0.001～0.002mol/L，余量为水，pH为7.35～7.45；

S2、取步骤S1所述纤维蛋白原溶液和待测试样溶液混合，加入含有磁珠的血凝杯中，作为检测组；

使用等体积的步骤S1所述缓冲液替代所述检测组中的待测试样溶液，作为空白组；

将所述检测组和空白组分别置于37℃放置60～300s，再加入步骤S1所述凝血酶溶液，以所述纤维蛋白原溶液中纤维蛋白原的总量和所述凝血酶溶液中凝血酶的总量计，每0.5～3mg纤维蛋白原添加6～12U凝血酶；检测血凝杯中溶液的凝固时间，从加入所述凝血酶溶液开始计时，直至血凝杯中磁珠开始转动时停止计时，所记时间为凝固时间；

S3、将检测组的凝固时间与步骤S2所述空白组的凝固时间进行比较，使用t检验对凝固时间进行显著性分析；若检测组的凝固时间长于空白组凝固时间、且存在显著性差异，即p＜0.05，则认为待测试样具有凝血酶抑制活性，通过所述检测组凝固时间的长短，判定凝血酶抑制剂的活性强弱，凝固时间越长，则凝血酶抑制活性越强；通过所述待测试样浓度升高时检测组凝固时间的变化来判断凝血酶抑制活性是否依浓度升高而增加，若检测组的凝固时间随待测试样的浓度升高而显著延长，即p＜0.05，则所述待测试样凝血酶抑制活性随其浓度的升高而增大；若检测组的凝固时间随待测试样的浓度升高而无显著延长，即显著性分析结果显示p＞0.05，则试样抑制凝血酶活性的能力不随浓度的升高而增大。

2.根据权利要求1所述凝血酶抑制剂活性的测定方法，其特征在于，包括步骤：

S1、分别使用缓冲液溶解纤维蛋白原、凝血酶和待测试样，配置成浓度为1～1.5mg/ml的纤维蛋白原溶液、浓度为8～12U/mL的凝血酶溶液和待测试样溶液；其中所述缓冲液为缓冲液A或缓冲液B，所述缓冲液A：咪唑浓度0.05mol/L、氯化钠浓度0.1mol/L、氯化钙浓度0.002mol/L，余量为水，pH为7.35～7.45；所述缓冲液B：Tris浓度0.05mol/L、氯化钠浓度0.1mol/L、氯化钙浓度0.002mol/L，余量为水，pH为7.35～7.45；

S2、取步骤S1所述浓度为1～1.5mg/ml的纤维蛋白原溶液和待测试样溶液，按体积比2:1混合加入含有磁珠的血凝杯中，作为检测组；

使用等体积的步骤S1所述缓冲液替代所述检测组中的待测试样溶液，作为空白组；

将所述空白组和检测组分别于37℃放置60～300s，再加入步骤S1所述浓度为6～12U/mL的凝血酶溶液，使用全自动凝血分析仪检测纤维蛋白原凝固所需时间，从加入步骤S1所述凝血酶溶液开始计时，磁珠转动时停止计时，所记时间为凝固时间；所述凝血酶溶液与所述纤维蛋白原溶液的体积比为1:2；

S3、将检测组的凝固时间与步骤S2所述空白组的凝固时间进行比较，使用t检验对凝固时间进行显著性分析；若检测组的凝固时间长于空白组凝固时间、且存在显著性差异，即p＜0.05，则认为待测试样具有凝血酶抑制活性，通过检测组凝固时间的长短，来判定凝血酶抑制剂的活性强弱，凝固时间越长，则凝血酶抑制活性越强；通过待测试样浓度升高时检测组凝固时间的变化来判断凝血酶抑制活性是否依浓度升高而增加，若检测组的凝固时间随待测试样的浓度升高而显著延长，即p＜0.05，则所述待测试样凝血酶抑制活性随其浓度的升高而增大；若检测组的凝固时间随待测试样的浓度升高而无显著延长，即显著性分析结果显示p＞0.05，则试样抑制凝血酶活性的能力不随浓度的升高而增大。

3.根据权利要求1或2所述凝血酶抑制剂活性的测定方法，其特征在于，步骤S1所述纤维蛋白原为牛纤维蛋白原。

4.根据权利要求1或2所述凝血酶抑制剂活性的测定方法，其特征在于，步骤S1所述凝血酶为牛凝血酶。