CN115343402B

CN115343402B - 游离睾酮的检测方法

Info

Publication number: CN115343402B
Application number: CN202210899980.8A
Authority: CN
Inventors: 赵蓓蓓; 佘旭辉; 陈秀如; 董衡; 李卓阳; 韦兰清; 梁嘉威
Original assignee: Guangzhou Kingmed Diagnostics Central Co Ltd
Current assignee: Guangzhou Kingmed Diagnostics Central Co Ltd
Priority date: 2022-07-28
Filing date: 2022-07-28
Publication date: 2024-07-23
Anticipated expiration: 2042-07-28
Also published as: CN115343402A

Abstract

本发明公开了一种游离睾酮的检测方法，在包括底板和平衡透析膜的平衡透析系统中，加入待测血清样品、生理盐水和透析缓冲液，封膜后进行透析；透析结束后，在透析液中加入内标工作液，加入甲基叔丁基醚，振荡后离心；冷冻后取上清，氮气吹干，复溶，进行液相色谱‑质谱检测。本发明的检测游离睾酮的方法不仅可以减少取样量，减少透析平衡时间，提高样本处理通量，无需衍生化即具有高灵敏度，可检测低至＜1pmol/L的浓度水平，且可以有效分离多种内源与外源干扰物，确保方法定量的精准性。

Description

游离睾酮的检测方法

技术领域

本发明属于分析领域，特别是涉及一种游离睾酮的检测方法。

背景技术

在循环血液中，睾酮以三种形式循环：①与性激素结合球蛋白(SHBG)紧密结合；②与白蛋白(ALB)松散结合；③非蛋白结合或游离睾酮(free testosterone，FT)。三种形式的睾酮中，只有游离睾酮(1％～2％)能够穿透细胞膜与雄激素受体相互作用，调节雄激素反应靶基因的表达，因此，游离睾酮被认为是最具生理活性的部分，其精准检测对于男性雄激素缺乏症和女性雄激素分泌过多的疾病诊断和管理具有重要的临床应用价值。

目前，游离睾酮检测存在多种方法，主要分为间接测定和直接测定，常见的间接测定有模拟免疫分析法和基于总睾酮测定的公式计算法，直接测定法是指经平衡透析(Equilibrium Dialysis，ED)和超滤(Ultrafiltration，UF)前处理后，再直接测定游离睾酮的含量。

模拟免疫分析法操作简单，但对游离睾酮的特异性较差，SHBG水平波动对结果有显著影响，不推荐临床诊断使用；公式计算法通过测定总睾酮、SHBG、白蛋白的浓度和它们的特定解离常数，计算游离睾酮的浓度，但该方法在白蛋白浓度相对较低的孕妇和白蛋白水平异常的疾病，如肾脏和肝脏疾病中，并不成立，有研究表明，公式计算法可能会导致游离睾酮的高估，且不同的实验室不同的算法所得的结果大相径庭，在未经充分验证前，不推荐临床应用。

平衡透析法被公认为测定游离睾酮的有效方法，是通过半透膜对样品进行一段时间的透析，将游离睾酮从蛋白结合的睾酮中分离出来。但该技术在临床实践中很少应用，主要因为技术要求非常高，具体包括如下几点：

第一，人体内游离睾酮浓度非常低，检测时存在样本体积大，需衍生化提高灵敏度，检测下限难以突破(一般在5～10pmol/L)，同时，人体内存在较多内源性和外源性的结构类似的干扰物，检测技术难度大；检测通量低，而且耗材成本高；

第二，透析过程中蛋白泄露导致的样品污染难以控制和识别，通过衍生化高温导致蛋白质变性产生的沉淀可以进行蛋白泄露的识别，但该操作只能识别到严重的蛋白污染问题，对于轻度的蛋白泄露，无法观察到蛋白沉淀现象，并且该现象在实验后期才能发现，重处理样本工作量大；

第三，游离睾酮前处理(血清在37℃、透析缓冲液中进行透析)复杂，处理时间一般在20小时以上；

第四，方法性能极易受分析条件的影响，进而导致较高的分析变异性，同时，该方法存在各种误差来源，受技术员操作影响较大，导致方法充满了潜在的问题，包括精密度差、特异性差等问题；

第五，常规的平衡透析缓冲液，为避免或抑制细菌生长，一般采用临用现配或者添加叠氮钠进行抑菌保鲜，透析液配制流程复杂，临用现配不能满足实验室快速生产需求，而叠氮钠属于危险化学品管控试剂，是一种剧毒品，遇高热或剧烈震动能强烈爆炸，使用过程中存在安全隐患，不能满足实验室安全的检验需求。

因此，现有的平衡透析法检测游离睾酮存在所需样本体积大、前处理复杂、方法通量低、需衍生化、检测下限难以突破、易受结果类似物干扰、透析过程难以监控污染情况、方法精密度差、特异性差等问题，难以满足不同情况的临床样品的检测。

发明内容

基于此，本发明的目的之一是提供一种游离睾酮的检测方法，所述检测方法简单高效、耗时短、通量高、无需衍生化、检测限低、精密度好、特异性强。

实现上述发明目的的具体技术方案包括如下：

一种游离睾酮的检测方法，包括以下步骤：

(1)、在包括底板和平衡透析膜的平衡透析系统中，加入待测血清样品、生理盐水和透析缓冲液，封膜后进行透析；

(2)、透析结束后，在透析液中加入内标工作液，加入甲基叔丁基醚，振荡后离心；冷冻后取上清，氮气吹干，复溶，进行液相色谱-质谱检测。

在其中一些实施例中，步骤(1)中所述待测血清样品占待测血清样品与生理盐水体积和的50％～90％；和/或所述血清样品和生理盐水的体积和，与所述透析缓冲液的体积比为1：0.9～1.1。

在其中一些实施例中，所述待测血清样品占待测血清样品与生理盐水体积和的50％～60％。

在其中一些实施例中，步骤(2)中所述液相色谱条件包括：

色谱柱：Phenomenex Kinetex 2.6μm C18；进样量为：45μL～55μL，流速为：0.3ml/min～0.5ml/min；柱温：30.0±2℃；流动相A为甲醇，流动相B为质谱级水；所述液相色谱的洗脱程序为：

0～4.5min，流动相A48-65％，流动相B 52-35％；

4.5～5.8min，流动相A 65％，流动相B 35％；

5.8～5.81min，流动相A65％→100％，流动相B 35％→0％；

5.81～6.50min，流动相A 100％，流动相B 0％；

6.50～6.51min，流动相A 100％→58％，流动相B 0％→42％；

6.51～8.00min，流动相A 58％，流动相B 42％。

在其中一些实施例中，步骤(1)中所述透析缓冲液包括以下浓度的组分：HEPES12.5±0.5g/L，NaCl 0.9±0.1g/L，NaOH 5.4±0.1g/L，KH₂PO₄0.2±0.1g/L，KCl 0.2±0.1g/L，MgSO₄·7H₂O 0.3±0.1g/L，尿素0.3±0.1g/L，CaCl₂·2H₂O 0.3±0.1g/L，pH7.3～7.5，所述透析缓冲液的制备方法包括：配制透析缓冲液后，采用≤0.22μm的水相针式过滤器进行过滤。

在其中一些实施例中，步骤(1)中所述底板的材质为聚四氟乙烯；和/或所述底板的清洗方法包括：流动的自来水反复冲洗底板，再使用去离子水超声清洗12分钟～18分钟，使用45％～55％乙醇水(V:V)超声清洗25分钟～35分钟，再使用纯乙醇反复冲洗2次～4次，自然晾干。

在其中一些实施例中，步骤(2)中，在透析结束后，还包括监测透析液是否存在蛋白泄露的步骤；所述监测透析液是否存在蛋白泄露的方法包括：观察透析液是否有颜色变化；和/或观察透析液是否存在气泡，以及所述气泡通过静置是否消除。

在其中一些实施例中，步骤(2)中，所述质谱检测的离子源为电喷雾离子源，在正离子模式下，采用多反应监测模式；

游离睾酮定量离子对的质荷比为：母离子289.2，子离子97.0；

游离睾酮定性离子对的质荷比为：母离子289.2，子离子109.0；

内标离子对1的质荷比为：母离子292.2，子离子100.042；

内标离子对2的质荷比为：母离子292.2，子离子112.047。

在其中一些实施例中，步骤(1)中所述平衡透析膜的分子截断量为6KDa～10KDa。

在其中一些实施例中，步骤(1)中所述透析包括：35℃～38℃，200rpm～300rpm条件下，恒温孵育3h～5h。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

1、在本发明中，通过利用生理盐水对待检测血清样本进行一定倍数的稀释再进行透析处理，液液萃取，再结合液相色谱、质谱方法的全面优化，在此构思下，本发明的检测游离睾酮的方法不仅可以减少取样量，降低成本，减少透析平衡时间，提高样本处理通量，无需衍生化即具有高灵敏度，可检测低至＜1pmol/L的浓度水平，且可以有效分离多种内源与外源干扰物，确保方法定量的精准性。

2、本发明通过对透析底板材质的筛选，发现PTFE材质的底板对睾酮不存在吸附作用，可用于游离睾酮的检测；且经特殊的清洗程序后，底板上未见有睾酮残留，不会对下一次实验产生干扰，因此，可以重复使用底板，可在确保耗材本底满足需求的同时显著降低本发明检测游离睾酮的耗材成本，有利于批量样本的制备和游离睾酮项目在临床上的推广使用。

3、针对平衡透析所用的透析液，目前通过添加叠氮钠进行除菌保鲜，存在安全风险，本发明改善了透析缓冲液的组分，并对透析缓冲液进行≤0.22μm的水相针式过滤器过滤除菌，安全系数高、有效除菌保鲜，且透析缓冲液可以稳定储存。

4、本发明针对平衡透析过程中蛋白的泄漏难以控制和识别，或仅能在实验后期发现严重的蛋白泄露，轻度蛋白泄露无法识别的缺陷，提供了一种可以有效识别蛋白泄露的方法，通过观察实验过程中的特定的实验现象，可以监测蛋白泄露，有效率达100％，且该方法可以在实验前期识别蛋白泄露，减少在实验后期重处理样本的工作量。

附图说明

图1为本发明实施例2中的标准工作曲线。

图2为本发明实施例2中睾酮内源性干扰物的干扰测试结果。

图3为本发明实施例2中采用未添加剂采血管采集的样本，不同离子对色谱图。

图4为本发明实施例2中采用分离胶采血管采集的样本，不同离子对色谱图。

图5为本发明实施例3中判断透析液是否存在蛋白泄露的结果。

图6为本发明实施例3中不同样本稀释倍数对睾酮(女性样本)检测结果的影响。

图7为本发明实施例3中不同样本稀释倍数对睾酮(男性样本)检测结果的影响。

图8为本发明实施例3中低浓度样本平衡透析时间的优化结果。

图9为本发明实施例3中高浓度样本平衡透析时间的优化结果。

图10为本发明实施例4中不同材质96孔板对睾酮峰面积的影响结果。

图11为本发明实施例5中经清洗后聚四氟乙烯底板的本底测试结果。

具体实施方式

本发明下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。

除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不用于限制本发明。

在本发明中，提供了一种检测游离睾酮的方法，具体包括以下步骤：

(1)、清洗底板

流动的自来水反复冲洗96孔底板(聚四氟乙烯材质)，再使用去离子水超声清洗12分钟～18分钟，使用45％～55％乙醇水(V:V)超声清洗25分钟～35分钟，再使用纯乙醇反复冲洗2次～4次，自然晾干；采用PTFE(聚四氟乙烯)材质的96孔板，对睾酮不存在吸附作用，可用于游离睾酮的检测；且经特殊的清洗程序后，底板上未见有睾酮残留，不会对下一次实验产生干扰，因此，可以重复使用底板，可在确保耗材本底满足需求的同时显著降低本发明检测游离睾酮的耗材成本，有利于批量样本的制备和游离睾酮项目在临床上的推广使用；

(2)、在使用步骤(1)的程序清洁过的底板和分子截断量为6KDa～10KDa的平衡透析膜的平衡透析系统中，加入血清样品、生理盐水和透析缓冲液，封膜后于35℃～38℃，200rpm～300rpm条件下，恒温孵育3h～5h；所述血清样品占血清样品与生理盐水体积和的50％～90％(优选为50％～60％)，所述血清样品和生理盐水的体积和，与所述透析缓冲液的体积比为1：0.9～1.1(优选为1：1)；

在本发明中，透析缓冲液体系组成：HEPES、NaCl、NaOH、KH₂PO₄、KCl、MgSO₄·7H₂O、尿素、CaCl₂·2H₂O，采用HCl和NaOH调整pH7.3～7.5，采用≤0.22μm的水相针式过滤器，对缓冲体系进行过滤除菌后-80℃冷冻保存，缓冲液存放6个月后，其pH维持不变，用其检测的样本结果稳定，说明本发明的透析缓冲液可以稳定储存，且本发明通过采用≤0.22μm的水相针式过滤器对缓冲体系进行过滤除菌，可以替代原来的危险品叠氮钠。

加入生理盐水对血清样本进行稀释，不仅可以减少取样量，且有利于增加血清样本与透析膜的接触面积，减少透析平衡时间，达到快速透析的目的，提高样本处理通量。

(3)、孵育结束后，取出300μL透析液至2.0mL离心管中，同步观察透析液是否有颜色改变，若变黄，则提示透析过程存在蛋白泄露，需对样本进行重新处理，重复步骤(1)～(3)；若透析液颜色正常，则观察透析液是否存在气泡，通过静置10分钟可消除的气泡为正常实验现象，若静置10分钟气泡仍未消除，则提示透析过程存在蛋白泄露，需对样本进行重新处理，重复步骤(1)～(3)；本发明针对平衡透析过程中蛋白的泄漏难以控制和识别，或仅能在实验后期发现严重的蛋白泄露，轻度蛋白泄露无法识别的缺陷，验证通过观察实验过程中的实验现象，可以有效识别污染(监测蛋白泄露有效率100％)，且可以在实验前期进行蛋白泄露的监控。

(4)、取300μL的曲线工作液(10个浓度水平)、300μL质控品(3个浓度水平)、300μL上述透析液至2.0mL的离心管中；

(5)、加入内标工作液，振荡；

(6)、加入甲基叔丁基醚(MTBE)，振荡后离心；

(7)、将样品放置到冷冻(-70℃以下)冰箱中冷冻；

(8)、转移上清于60℃下氮气吹干；

(9)、加入复溶液(50％甲醇水溶液)，振荡，上机，进行液相色谱-质谱检测，通过液相色谱洗脱程序的优化，以及质谱条件的优化，使得可以无需衍生化、高灵敏度地检测血清样本中游离睾酮的含量。

以下实施例中，未作说明的原料或试剂，均来源于市售。

以下结合附图和具体实施例对本发明作进一步详细的说明。

实施例1一种检测游离睾酮的方法

包括以下步骤：

1、试剂配制

储备液配制：用甲醇配制浓度为1.000mg/mL的睾酮储备液及浓度为3.470μmol/L的¹³C3-睾酮内标储备液。

透析缓冲液配制：

称量HEPES：12.5g，NaCl：0.9g，NaOH：5.4g，KH₂PO₄：0.2g，KCl：0.2g，MgSO₄·7H₂O：0.3g，尿素：0.3g，CaCl₂·2H₂O：0.3g，溶解于1升的去离子水中，充分溶解后，采用HCl和NaOH调整pH至7.40，采用0.22μm的水相针式过滤器进行过滤，-80℃冷冻保存。

曲线工作液配制：使用容量瓶，用透析缓冲液稀释睾酮储备液，配制成一系列浓度的标准工作液，浓度分别为0.869pmol/L、3.476pmol/L、6.952pmol/L、13.90pmol/L、27.81pmol/L、55.62pmol/L、111.2pmol/L、222.5pmol/L、444.9pmol/L、889.9pmol/L。

内标工作液配制：用30％乙腈水稀释内标储备液，配制浓度为3.470nmol/L的内标工作液。

质控品：在透析缓冲液中加入不同浓度的睾酮标准品，配制成浓度分别为6.50pmol/L、54.00pmol/L、420.00pmol/L的质控品。

2、样品处理

(1)、流动的自来水反复冲洗聚四氟乙烯底板，再使用去离子水超声清洗15分钟，使用50％乙醇水(V:V)超声清洗30分钟，再使用纯乙醇反复冲洗3次，自然晾干；

(2)、在使用步骤(1)的程序清洁过的底板和分子截断量为8kDa的平衡透析膜的平衡透析系统中，加入200μL血清样品、200μL生理盐水和400μL的透析缓冲液，封膜后于37℃250rmp条件下，恒温孵育3h；

(3)、孵育结束后，取出300μL透析液至2.0mL离心管中，同步观察透析液是否有颜色改变，若变黄，则提示透析过程存在蛋白泄露，需对样本进行重新处理，重复步骤(1)～(3)；若透析液颜色正常，则观察透析液是否存在气泡，通过静置10分钟可消除的气泡为正常实验现象，若静置10分钟气泡仍未消除，则提示透析过程存在蛋白泄露，需对样本进行重新处理，重复步骤(1)～(3)；

(4)、分别取300μL的曲线工作液(10个浓度水平)、300μL质控品(3个浓度水平)、300μL上述透析液于2.0mL离心管；

(5)、加入50.0μL的内标工作液，振荡3min；

(6)、加入1500μL甲基叔丁基醚(MTBE)，振荡5min，离心5min；

(7)、将样品放置到冷冻(-70℃以下)冰箱中，冷冻1h；

(8)、转移上清于60℃下氮气吹干；

(9)、加入70.0μL复溶液(50％的甲醇水溶液)，振荡5min，上机，进行液相色谱-质谱检测。

其中

A、液相条件

色谱柱采用Phenomenex Kinetex 2.6μm C18100×2.1mm；流动相A(有机相)为甲醇，流动相B(水相)为质谱级水，柱温为30.0℃，进样量为50μL。液相洗脱程序如表1所示。

表1液相条件

B、质谱条件

使用电喷雾离子源(ESI)，在正离子模式下，多反应监测模式(MRM)。质谱条件如表2所示，源参数如表3所示。

表2质谱条件

表3源参数

实施例2本发明的游离睾酮的检测方法的性能验证

1、线性范围

使用容量瓶，用透析缓冲液稀释睾酮储备液，配制成一系列浓度的标准工作液，浓度分别为0.869pmol/L、3.476pmol/L、6.952pmol/L、13.90pmol/L、27.81pmol/L、55.62pmol/L、111.2pmol/L、222.5pmol/L、444.9pmol/L、889.9pmol/L，每个浓度的样本每天平行处理2个，测定3天。结果如图1所示，从图1可知，线性良好，相关系数在0.99以上，回收率在90.35％～109.08％之间，满足定量要求。

2、精密度

对本发明方法的精密度验证针对A和B两个体系，分别进行验证，A体系反映出液液萃取环节+液相质谱方法的方法精密度，B体系反映出平衡透析+液液萃取环节+液相质谱方法的方法精密度。

A体系：使用透析缓冲液，配制游离睾酮浓度分别为6.50pmol/L、54.00pmol/L、420.00pmol/L的三个样本，按照实施例1步骤2样本处理步骤(4)～(9)中方法进行处理，批内精密度为每个样本重复测定20次。批间精密度为每批测定2次，连续测定10天，共20次测量。

B体系：取游离睾酮浓度分别为6.50pmol/L、36.00pmol/L、240.00pmol/L的三个血清样本，按照实施例1步骤2的样本处理方法进行处理，批内精密度为每个样本重复测定20次。批间精密度为每批测定2次，连续测定10天，共20次测量。

结果如表4所示。

表4精密度验证数据

从表4结果可知，本发明的游离睾酮的检测方法精密度良好，A体系精密度＜7.0％，B体系(经透析后的血清样本)精密度＜6.0％，具有良好的精密度。

3、准确度

在透析缓冲液中加入不同浓度的睾酮标准品配制成低、中、高三个浓度水平的样本，浓度分别为6.50pmol/L、54.00pmol/L、420.00pmol/L，进行加标回收率实验，加标后的样本，每个样本平行处理3个，计算加标后样本结果回收率。结果如表5所示。

表5准确度验证数据

从表5可知，回收率均在85.0％～115％范围内，满足要求。

4、样本稳定性

样本稳定性，包括样本处理后稳定性及血清样本透析后透析液中样本稳定性。

(1)、样本处理后稳定性

选取游离睾酮浓度分布为低、中、高的血清样本3个，每个样品经实施例1方法平行处理3次，处理后的样品，分别于2℃～8℃放置0、24、48以及72h后分别测定，以0h检测结果为参考靶值，其它时间的检测结果与0h结果相比，回收率在85.0～115％之间，则证明样品在该时间段内可稳定存放。实验结果如表6所示，从表6可知，处理后的样品可在冷藏条件下稳定存放72h。

表6样本处理后稳定性数据

(2)、血清样本透析后透析液中样本稳定性

选取低、中、高病人样本，每个样品经实施例1样本处理步骤(1)～(3)平行处理3次后，收集透析液于2℃～8℃放置0、24、48以及72h后，再进行实施例1样本处理步骤(4)～(9)平行处理3次后上机测定，以0h检测结果为参考靶值，其它时间的检测结果与0h结果相比，回收率在85.0％～115％之间，则证明透析液中样品在该时间段内可稳定存放。实验结果如表7所示，从表7可知，血清样本经平衡透析后的透析液中样本，可在冷藏条件下稳定存放72h。

表7血清样本透析后透析液中样本稳定性数据

5、抗干扰性

在本实施例中，在血清样本中加入17羟基孕酮、雄烯二酮、双氢睾酮、脱氧皮质酮等多个内源性干扰物，按照实施例1的方法处理后上机检测，结果如图2所示，从图2可知，本发明的方法可实现睾酮与内源性干扰物的色谱分离。

分别采用未添加剂采血管和分离胶采血管采集同一个人的样本，分别按照实施例1的方法处理后上机检测，结果如图3和4所示，未添加剂采血管采集的样本色谱峰未见干扰，且信号响应较高，分离胶采血管样本色谱峰出现未知干扰，信号响应较低，可知该未知干扰物来源于采血管中的分离胶，为外源性未知干扰物。

提取睾酮289.2/109.1和289.2/97.1两个离子对，发现不同的离子对抗干扰能力不同，离子对289.2/97.1可实现睾酮和外源性未知干扰物的质谱分离，离子对289.2/109.1不能实现睾酮和外源性未知干扰物的质谱分离(图4)，由此说明289.2/97.1能更好地实现对样本的精准检测。

因此，本发明的方法通过对液相方法的优化(包括对液相梯度的优化，不同的有机相和水相比例的调整，以及色谱柱、柱温的条件)，结合质谱离子对的选择优化，能同时实现对内源性和外源性干扰物的分离，确保方法定量的精准性，抗干扰能力强，可有效分离多种内源性和外源性的干扰物。

实施例3平衡透析过程中的条件优化

影响平衡透析效果的主要因素包括：平衡时间、样本稀释倍数、蛋白泄漏、透析缓冲液的组成及配制流程等。

1、平衡透析中的蛋白泄露监控

在平衡透析过程中，由于透析膜破裂或者微渗、操作不当等，会导致蛋白泄露，从而导致样品污染难以控制和识别。在目前的平衡透析法中，通过衍生化高温导致蛋白质变性产生的沉淀进行蛋白泄露的识别，但该操作只能识别到严重的蛋白污染问题，对于轻度的蛋白泄露，无法观察到蛋白沉淀现象，并且该现象在实验后期才能发现，重处理样本工作量大。

本实施例中，采用已知浓度的三个不同浓度水平的样本300个，按照实施例1进行样本处理，通过观察实验现象，与上机检测的浓度对比，判断通过观察特殊的实验现象是否能够监测蛋白泄露。300个样本的蛋白泄露监测数据如表8所示。

表8蛋白泄露监测数据

从表8结果可知，上机检测游离睾酮的浓度时，有蛋白泄露的样本，会引起游离睾酮浓度的显著增高，而通过观察透析液的颜色变化和气泡产生情况，同样可以监测到蛋白泄露，有效率达100％。具体为：若蛋白泄露严重，可引起透析液的颜色变化(白色→黄色)，这时需对样本重新进行处理，若轻微的蛋白泄露，一般不会引起透析液的颜色变化，但会引起透析液产生难以消除的气泡。通过静置10min，气泡可自然消除，提示处理过程不存在蛋白泄露；若静置10min及以上，也不能使气泡自然消除，提示透析过程存在蛋白泄露(如图5)，需对样本重新进行处理，可通过此实验现象在实验前期进行蛋白泄露的监控。

2、平衡透析中的样本稀释倍数验证

本实施例中，采用男性、女性样本各一例，血清和平衡透析液初始比例为1:1，取样体积400μL，使用0.9％生理盐水，按照100％血清(未稀释样本)、90％血清、80％血清、70％血清、60％血清、50％血清、40％血清进行稀释，经透析、前处理后，上机检测，以100％血清检测结果为参考靶值，除了40％血清稀释度外，其它稀释的检测结果与100％血清结果相比，回收率在85.0％～115％之间，则证明样品可采用生理盐水进行稀释检测。

实验结果如图6～7所示，从图6和图7可知，透析前样品可采用生理盐水进行稀释，最大稀释倍数不应超过50％血清，即本发明的取样量可从平衡透析一般采用的样本量400μL减少至200μL血清。

本实施例进一步探索样本处理过程中，加入生理盐水对结果的影响，①按照本发明实施例1的加样方式，200μL血清+200μL生理盐水；②比对组：直接加入200μL血清；

选择低、中、高三个浓度水平的样本，按照实施例1的方法进行样本处理；分别平衡透析时间为3、4、5小时，结果如表9所示。

表9不同加样方式平衡透析时长比较

从表9结果可知，本发明采用的加样方式，经过3小时的平衡透析，样本已达到平衡，3、4、5小时测定结果无明显差异，比对组样本经过3小时的平衡透析，样本结果明显低于4、5小时平衡透析样本的结果，说明其在3小时仍未达到透析平衡，经过4小时平衡透析的样本结果，与本实施例加样方式处理的样本结果无明显差异，推断其经过4小时平衡透析达到平衡。因此，加入生理盐水对样本进行稀释，有利于增加血清样本与透析膜的接触面积，减少透析平衡时间，达到快速透析的目的，提高样本处理通量。

3、平衡透析中的平衡时间

在本实施例中，在250rpm的振荡幅度下，对平衡透析的时间进行优化，不同时间段采用高、低两个浓度水平的样品，平行测定三次结果的均值进行比较，结果如图8和图9所示。

从图8和图9可知，高、低浓度水平样本的结果趋势一致，样本在1.5～3.0小时，浓度呈现上升趋势，说明透析体系尚未达到平衡状态，3～8小时的时间范围内样本浓度稳定，说明体系已经达到平衡状态，且3组数据的精密度较好，CV均小于6.5％。

该结果表明，本发明的方法平衡透析时间最短可在3小时达到体系平衡，极大地缩短了样本前处理的时间，提高样本处理通量，且平行处理的样本CV＜6.5％，精密度好。

4、平衡透析中的透析缓冲液配制流程的优化

常用的透析缓冲液体系组成：

①HEPES、NaCl、KH₂PO₄、MgSO₄·7H₂O、尿素、CaCl₂*2H₂O、NaOH、NaN₃，采用HCl和NaOH调整pH至7.4

②HEPES、NaCl、Na₃PO₄、KCl、MgSO₄·7H₂O、尿素、CaCl₂·2H₂O、NaN₃，采用HCl和NaOH调整pH至7.4

本发明的方法透析缓冲液体系组成：

HEPES、NaCl、NaOH、KH₂PO₄、KCl、MgSO₄·7H₂O、尿素、CaCl₂·2H₂O，采用HCl和NaOH调整pH至7.4。

本发明采用0.22μm的水相针式过滤器，对缓冲体系进行过滤除菌，替代原来的危险品叠氮钠，并分装于10mL的离心管中，放置于-80℃冷冻保存，在配制后0天、1月、3月、6月，分别测定缓冲液pH，并用来检测3个不同浓度水平的病人样品，结果如表10所示，从表10可知，以0天的结果均值为参照靶值，1月、3月、6月的结果回收率均在85％-115％之间，缓冲液pH维持在7.4，说明缓冲液能稳定存放6个月以上，用其检测的样本结果稳定，未发生细菌所致的pH变化。

表10透析缓冲液稳定性验证

实施例4平衡透析底板的筛选

商品化的底板，有PP(聚丙烯)、DPE(聚乙烯)、PTFE(聚四氟乙烯)、PVC(聚氯乙烯)等等……底板的工艺和材质之间存在非常大的差异性，不同的材质所制作的96孔板有不同的化学兼容性。且有的材质接触血清、血浆等黏性物质后，难以清洗干净，不能重复使用，部分材质还可能对激素类的物质存在吸附，进而影响结果的准确性。

使用50％甲醇水配制浓度为300pmol/L的睾酮标准溶液，分别分装在材质为PP(聚丙烯)、DPE(聚乙烯)、PTFE(聚四氟乙烯)制备的96孔板中，静置12小时后，充分混匀20min，直接使用LC-MS/MS检测其中睾酮的响应信号，要求睾酮峰面积与标准溶液相比，偏倚＜5％，并采用非参数kruskal-Wallis test进行分析。

结果如图10和表11所示。

表11使用不同容器分装睾酮标准溶液的峰面积比较

从图10和表11可知，分装在PP(聚丙烯)、DPE(聚乙烯)的96孔板的睾酮标准溶液测定的峰面积与标准溶液的峰面积相比，存在显著性差异，且峰面积平均偏差＞5％，说明这两种材质的96孔板对睾酮存在一定的吸附作用，分装在PTFE(聚四氟乙烯)材质的96孔板的睾酮标准溶液测定的峰面积与标准溶液相比，不存在显著性差异，且峰面积平均偏移＜5％，说明PTFE材质的96孔板对睾酮不存在吸附作用，可用于游离睾酮的检测。

实施例5平衡透析底板的清洗方法的确定

常规平衡透析通常采用一次性底板，因为游离激素的浓度极低，一次性使用的底板可避免由于耗材清洗不彻底，微量残留导致结果受到影响，而一次性底板价格昂贵(一次性底板的价格一般在400元/块)，因此，检测成本高。

本试验例在平衡透析实验结束后，立刻采用实施例1中的步骤(1)进行清洗。经过清洗后的聚四氟乙烯底板，每个样品孔加入纯乙醇300uL，2500rmp振荡20分钟，吸取100uL纯乙醇至1.5mL EP管中，使用氮气吹干后，加入70.0μL复溶液(50％甲醇水溶液)，振荡5min后将复溶液从离心管中转移至进样小瓶中，上机检测。

从图11的色谱图中可见，清洗后的底板上未见有睾酮残留，不会对下一次实验产生干扰，通过本发明的清洗平衡透析底板的方法，可以重复使用底板，可在确保耗材本底满足需求的同时显著降低本发明检测游离睾酮的耗材成本，有利于批量样本的制备和游离睾酮项目在临床上的推广使用。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims

1.一种游离睾酮的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

所述待测血清样品占待测血清样品与生理盐水体积和的50％～90％；所述血清样品和生理盐水的体积和，与所述透析缓冲液的体积比为1：0.9～1.1；

所述透析包括：35℃～38℃，200rpm～300rpm条件下，恒温孵育3h～5h；

(2)、透析结束后，在透析液中加入内标工作液，加入甲基叔丁基醚，振荡后离心；冷冻后取上清，氮气吹干，复溶，进行液相色谱-质谱检测；

所述液相色谱的条件包括：色谱柱：C18柱；流动相A为甲醇，流动相B为质谱级水；所述液相色谱的洗脱程序为：

0～4.5min，流动相A48-65％，流动相B 52-35％；

4.5～5.8min，流动相A 65％，流动相B 35％；

5.8～5.81min，流动相A65％→100％，流动相B 35％→0％；

5.81～6.50min，流动相A 100％，流动相B 0％；

6.50～6.51min，流动相A 100％→58％，流动相B 0％→42％；

6.51～8.00min，流动相A 58％，流动相B42％；

所述质谱检测的离子源为电喷雾离子源，在正离子模式下，采用多反应监测模式；

游离睾酮定量离子对的质荷比为：母离子289.2，子离子97.0；

游离睾酮定性离子对的质荷比为：母离子289.2，子离子109.0；

内标离子对1的质荷比为：母离子292.2，子离子100.042；

内标离子对2的质荷比为：母离子292.2，子离子112.047。

2.根据权利要求1所述的游离睾酮的检测方法，其特征在于，所述待测血清样品占待测血清样品与生理盐水体积和的50％～60％。

3.根据权利要求1所述的游离睾酮的检测方法，其特征在于，步骤(2)中所述液相色谱条件还包括：进样量为：45μL～55μL，流速为：0.3ml/min～0.5ml/min；柱温：30.0±2℃。

4.根据权利要求1～3任一项所述的游离睾酮的检测方法，其特征在于，步骤(1)中所述透析缓冲液包括以下浓度的组分：HEPES12.5±0.5g/L，NaCl 0.90±0.10g/L，NaOH 5.4±0.1g/L，KH₂PO₄0.2±0.1g/L，KCl 0.20±0.1g/L，MgSO₄·7H₂O0.3±0.1g/L，尿素0.3±0.1g/L，CaCl₂·2H₂O 0.3±0.1g/L，pH7.3～7.5，所述透析缓冲液的制备方法包括：配制透析缓冲液后，采用≤0.22μm的水相针式过滤器进行过滤。

5.根据权利要求1～3任一项所述的游离睾酮的检测方法，其特征在于，步骤(1)中所述底板的材质为聚四氟乙烯。

6.根据权利要求5所述的游离睾酮的检测方法，其特征在于，所述底板的清洗方法包括：流动的自来水反复冲洗底板，再使用去离子水超声清洗12分钟～18分钟，使用45％～55％乙醇水超声清洗25分钟～35分钟，再使用纯乙醇反复冲洗2次～4次，自然晾干。

7.根据权利要求1～3任一项所述的游离睾酮的检测方法，其特征在于，步骤(2)中，在透析结束后，还包括监测透析液是否存在蛋白泄露的步骤；所述监测透析液是否存在蛋白泄露的方法包括：观察透析液是否有颜色变化；和/或观察透析液是否存在气泡，以及所述气泡通过静置是否消除。

8.根据权利要求1～3任一项所述的游离睾酮的检测方法，其特征在于，步骤(1)中所述平衡透析膜的分子截断量为6KDa～10KDa。