JPS6336143A - 安定型糖化ヘモグロビン測定方法および装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、臨床検査における安定型糖化ヘモグロビンを
迅速に測定する方法およびそれに使用される装置に関す
るものである。

〔従来の技術〕

糖化ヘモグロビンとは血液中の糖がその濃度に比例して
赤血球に入った後に、ヘモグロビンと結合して生成した
ものであり、その濃度は過去２〜３力月間の血液中の平
均的な糖濃度を反映すると言われている。更に、血糖値
や尿糖値と比べ生理的要因に左右され難いということも
あり糖尿病の診断ある（・は糖尿病患者の経過観察の最
適な指標として広く測定されている。

この糖化ヘモグロビンの主成分は、ヘモグロビンのβ鎖
Ｎ末端にグルコースが結合したもので、その生成は非酵
素的反応により二段階の反応で進行する。すなわち、一
段階目の反応では生成した糖化ヘモグロビンの一部が可
逆反応により遊離型に戻る、いわゆる不安定型糖化ヘモ
グロビンが生成するのに対し、二段階目の反応は不可逆
反応であり、安定型糖化ヘモグロビンが生成する。より
正確な糖尿病の指標としては、この安定型糖化へモグロ
ビンを測定することが望ましいことは言５までもない。

ヘモグロビンを糖化ヘモグロビンを分離するためには、
その電気的性質の差に基づく方法が多く、電気泳動法、
イオン交換クロマトグラフィー法などがあり、特に高速
液体クロマトグラフィー法に基づく専用機も市販されて
いる。しかし、これらの方法は通常のヘモグロビンと糖
化ヘモグロビンの区別はできるものの不安定型糖化ヘモ
グロビンと安定型糖化ヘモグロビンの区別はできない。

そこで、安定型糖化ヘモグロビンだけを測定するために
は、あらかじめ前処理により不安定型糖化ヘモグロビン
を除去する方法がとられる。

その従来法としては、赤血球を生理食塩水中あるいはセ
ミカルバジドとアニリンを含む緩衝液中でふ置する方法
、また、ホウ酸などを含む溶血剤で全血を溶血後ふ置す
る方法などである。例えば、生理食塩水法はふ置に先立
ち赤血球を同液で数回洗浄する必要があるばかりでなく
、３７℃でのふ置時間が４時間以上必要である（スベン
セン他、ダイアベトロシア、Ｐ、Ａ−５ｖｅｎｄｓｅｎ
　ｅｔａｌ。

Ｄｉａ’ｂｅｔｏｌｏｇｉａ、　１９．１３０　（１９
８０）　）　。また、セミカルバジド−アニリン法は試
薬溶液が不安定であるため使用時毎の用時調製が必要で
あり、３７°Ｃでのふ置時間も３０分から１時間を要す
る（ナタン他、クリニカルケミストリー、Ｄ、　Ｍ、　
Ｎａｔｈａｎ。

ｅｔａｌ、０１ｉｎ、Ｏｈｅｍ、、２８．５１２　（ｊ
９８２））。一方、市販の不安定型糖化ヘモグロビン除
去試薬は安定性の点では問題ないものの前例同様に３７
℃で３０分前後のふ置時間が必要であるなどいずれの方
法も試料の前処理が煩雑であったり、迅速処理に問題が
あった。

〔発明が解決しよ５とする問題点〕 以上のべたごとく、従来方法では安定型糖化ヘモグロビ
ンのみを測定できなかったり、測定する為の不安定型糖
化ヘモグロビンの除去処理操作が煩雑で、長時間を要す
るといった問屋をかかえていた。

本発明の目的は、このような従来の方法よりもより簡単
な方法で短時間に安定型糖化ヘモグロビンを測定する方
法およびその際使用される装置を提供することにある。

〔問題を解決するだめの手段〕

本発明の要旨は、不安定型糖化ヘモグロビンの除去試薬
を含有する溶血剤（以下、除去試薬添加溶血剤という）
で希釈した試料を高速液体クロマトグラフィー用分離カ
ラムに注入する前に加熱処理することにより、不安定型
糖化ヘモグロビンを除去する安定型糖化ヘモグロビンの
測定方法および加熱の為の加熱部分を設けた高速液体ク
ロマトグラフィーによる安定型糖化ヘモグロビンの測定
装置な提供することにある。

以下、その詳細を説明する。

本発明で使用される不安定型糖化ヘモグロビンの除去試
薬としては、ホウ酸、フタル酸カリウムなどの他に界面
活性剤や防腐剤を含む一般に市販されているものをその
まま使うことができる。

また、溶血剤とは、同様に一般に市販されているものを
使えるが、それにホウ酸またはフタル酸カリウムなどを
添加して使用しても何らさしつかえない。

安定型糖化ヘモグロビンの分離に供される分離カラムは
、糖化ヘモグロビン分析用に開発された陽イオン交換樹
脂または陰イオン交換樹脂を充填したものが使われるが
、市販のものが使える。

加熱処理方法としては、分離カラムに試料を注入する前
に加熱せねばならないが、オンライン。

オフラインどちらでもさしつかえない。オンラインの場
合の該加熱処理の場所としては、試料容器を並べるオー
トサンプラーのテーブル全体を加熱する、あるいは特定
の場所を加熱する、例えば試料容器の中へ加熱用素子を
挿入するまたは、試料の一部を吸引後加熱する、などに
よることが考えられる。加熱効率、試料の安定性、装置
の簡略性。

操作ｑよどの点からすると試料の一部を吸引後加熱処理
するのが好ましい。

加熱方法としては、試料液を念速に温度上昇させること
のできるものであれば何でも使うことができる。

加熱温度は、４５〜７０℃の範囲が好ましい。

該加熱温度が高い程短い時間で不安定型糖化ヘモグロビ
ンの除去が可能であるが、７０℃をこえると試料中のヘ
モグロビンの変性あるいは分解が起こり、分離カラムに
よる分離が充分でなくなるので好ましくない。一方、４
５℃より低い温度では不安定型糖化ヘモグロビンの除去
に時間がかかりすぎ、本発明の効果を期待できない。

加熱処理により不安定型糖化ヘモグロビンを除去した後
の安定型糖化ヘモグロビンの測定は、分離された各成分
を検出器で４１５ｎｍおよび６９０　ｎｍにおける吸光
を測定し、得られたクロマドグ２ムから計算することが
できる。

本発明装置の実施態様例を第一図に示す。該装置は、高
速液体クロマトグラフを基本とし、オートサンプラーの
試料の吸σ］注入装置と分離カラムへの試料導入装置と
の間に加熱装置を設けたものである。

以下、第一図により本発明を具体的に説明する。

除去試薬添加溶血剤により希釈された試料をセットする
サンプルテーブル（６）、試料の吸引を行う吸引ノズル
（７）、試料を加熱するヒートブロック（８）。

試料計量用サンプルループ■、試料および溶離液（１）
を分離カラムα◆へ注入するための試料導入装置（ロ）
および検出器α峰から成り、さらに溶離液（１）を試料
導入装置（イ）へ導くデガッサー（２）、弁（３）およ
び圧送ポンプ（４）、プレフィルタ−（２）、データプ
ロセッサーまたは記録計（ロ）など通常の高速液体クロ
マトグラフで使用される部分から成りたっている。

加熱の為のヒートブロック（８）は、平板サンドイッチ
型ヒーター、溝のある平板型ヒーター、棒状ヒーターな
どのヒーターα〔が適宜選ばれる。ヒーター材質として
は、アルミニウム、銅などの熱伝導性の良いものであれ
ば特に制限はない。また、温度制御の為に温度センサー
（９）とコントローラー輔が設けられている。

試料は、まずサンプルテーブル（６）にセットされ、次
いで試料吸引ノズル（７）により、ヒートプロ、り（８
）までの試料輸送管曽が試料で満たされる量吸引される
。そしてヒートプロ、り（８）部分で加熱処理され、そ
の後加熱処理された試料の一部が試料計量用サンプルル
ープ（ｌ埠に導かれ、試料導入装置（２）から分離力２
ムａ◆へと注入されていく。これらの動作はコントロー
ラー（ロ）により制御することができる。以後、分離カ
ラムａ◆で分離されたものを検出器ａ峰で検出し、定量
する。

試料吸引ノズル（７）から試料導入装置（イ）までの間
の試料輸送管−としては、テフロン管の他、ステンレス
管のような耐薬品性があり、熱伝導性の良いものが好ま
しく用いられる。テフロン管を用いる場合は、加熱効率
をよくする為内薄管が好ましいが、試料吸引の際の抵抗
の問題や加工性の点からすると内径０．２〜２．ａｍが
好ましい。

〔発明の効果〕

以上の説明から明らかなように、本発明によれば、 （１）不安定型糖化ヘモグロビンの除去を簡単な処理方
法で短時間にすることができ、 （２）装置としても、非常に簡単な加熱装置を設けるだ
けで糖尿病の指標として有用な安定型糖化・ヘモグロビ
ンを測定することができる。

〔実施例〕

以下、本発明を実施例によりさらに説明するが、本発明
はこれらに限定されるものではない。

（実施例１） 試料は、抗凝固剤としてエチレンジアミン四酢酸ナトリ
ウム塩を添加して採血した新鮮血および不安定型糖化ヘ
モグロビンをＩｎ　ｖｉｔｒｏで生成させるために新鮮
血にグルコースを添加（１０■／ゴ新鮮血）Ｌ、、３７
℃で３０分間ふ置したものを用いた。ホウ酸を除去試薬
とする［Ｌ１％ポリオキシエーテル−ホウ酸緩衝液の溶
血剤で試料を２００倍に希釈し、第一図に示したサンプ
ルテーブル（６）にセットした。分離カラムα◆には、
ＴＳＫゲルＧｌｙｃｏ　４．０１ｃＬＸ　１５０ｇ　（
東洋曹達工業社製）を用い、２３℃の分離温度とした。

成分の分離は、ＨＬＯ−７２５ＧＨｂ用溶離液（日本ケ
ミファ社製）を１．６　ｄ　／　ｍｉｎで１．１分、２
．４分。

五６分でのステップワイズグラジェント法によった。加
熱処理のための第一段の試料吸引は１５０μｔとし、内
径１６１）Ｊ　、外径１　／　１６１ｎｃｈのテフロン
管を試料輸送管として用いた。加熱部分は、テフロン試
料輸送管を、アルミニウム製棒状ヒーター（８）（外径
１．６！、長さ６ｃ！ｎ）に約２０ｃｒｎ巻きつゆ、更
に外側をアルミブロック（８）で覆った。加熱処理後、
２０μｔをサンプリングし分離に供し、検出器α時で４
　ｊ　５　ｎｍ　と６９０ｎｍ（バッタグラウンド測定
用）における吸光値を測定し、安定型糖化ヘモグロビン
を求めた。

加熱処理の温度と時間を変えて、不安定型糖化ヘモグロ
ビンの除去効果をみ、その結果を第二図に示す。白丸は
グルコース無添加の結果、黒丸はグルコース添加の結果
であるが、グルコースを添加し、不安定型糖化ヘモグロ
ビンをｉｎ　ｖｉｔｒｏで生成させた試料でさえ、５０
℃加熱の場合８分で、６５℃では１分で不安定型糖化ヘ
モグロビンが除去されている。無添加生新鮮血試料では
、５０℃加熱でも２分で良く、従来の３７℃３０分以上
というふ置による除去に比べ、非常に短時間に処理でき
ることがわかる。

（実施例２） 本法と生理的食塩水による処理法である従来法と測定値
の比較を行った。試料は健常人および糠尿病患者の抗凝
固剤の入った新鮮面を用いた。

本法の測定条件は、ヒートブロック加熱温度６５℃、加
熱時間１．５分以外の条件は実施例１と同じとした。生
理食塩水法は、試料の前処理として全血に対して約１０
倍量の生理食塩水を添加し攪拌後、遠心分離し上澄を捨
てた。この操作を２回繰り返した後、約１０倍蓋の生理
食塩水を添加し、３７°Ｃで４ｈｒふ置した。その後遠
心分離を行い、血球量とほぼ同量の上澄を残し余分の上
澄を捨てた。この全血をＨＬＯ−７２５ＧＨｂ用溶血剤
（０，１％トリトンＸ−１００，１）％エチレンジアミ
ン四酢酸ナトリウム、１）％アジ化ナトリウム）で２０
０倍に希釈し測定した。この場合、ヒートブロックをつ
けていない装置で測定し、測定条件をヒートブロック方
式と同一にして行った。

６５例について測定した結果を第３図に示すが、本発明
方法と生理食塩水法との相関係数がＣｌ３９４０、相関
式がＹを本法、Ｘを生理食塩水法とした場合、Ｙ＝１．
０３　ｆ　Ｘ−Ｃｌ５０８と非常

【図面の簡単な説明】

第一図は、本発明の加熱装置を設けた測定装置の一実施
態様例である。 第二図は、本発明方法による不安定型糖化ヘモグロビン
の除去と加熱温度９時間の関係を示すグラフである。 第三図は、本発明方法と従来法としての生理食塩水処理
法による相関関係を示す図である。 （り溶離液　　　　　　　（７）吸引ノズル（２）　　
デガッサ−（８）　　ヒートブロック（３）　　三方電
磁弁　　　　　（９）湿度センサー（４）圧送ポンプ　
　　　　α１　ヒーター（５）　　オートサンプラー　
　αや　サンプルループ（６）サンプルテーブル　　０
■　試料導入装置（６）　プレフィルタ−α力　データ
プロセッサー０４　　分離カラム　　　　　（至）　コ
ントローラー唇　カラムオーブン　　　０場　廃液タン
クαＱ　検出器　　　　　　　曽　試料輸送管特許出願
人　東洋曹達工業株式会社 第−図 第二図 ＋２３４５６７８ 力ｌＩ熱時間　（分）

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）不安定型糖化ヘモグロビンの除去試薬を含む溶血
   剤で希釈した試料を分離カラムに注入する前に、加熱処
   理して不安定型糖化ヘモグロビンを除去することを特徴
   とする高速液体クロマトグラフィーによる安定型糖化ヘ
   モグロビンの測定方法。
2. （２）分離カラムに試料を注入する前に、加熱装置を設
   けてなることを特徴とする高速液体クロマトグラフィー
   による安定型糖化ヘモグロビンの測定装置。