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CN114703252B - 一种用于检测血浆中水蛭素、比伐卢定、达比加群含量的试剂盒 - Google Patents

一种用于检测血浆中水蛭素、比伐卢定、达比加群含量的试剂盒 Download PDF

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CN114703252B CN202210621396.6A CN202210621396A CN114703252B CN 114703252 B CN114703252 B CN 114703252B CN 202210621396 A CN202210621396 A CN 202210621396A CN 114703252 B CN114703252 B CN 114703252B
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Abstract

本发明公开了一种用于检测血浆中水蛭素、比伐卢定、达比加群含量的试剂盒，包括R1试剂、R2试剂、稀释试剂、水蛭素校准品、比伐卢定校准品以及达比加群校准品；R1试剂包括凝血酶、第一缓冲液和第一辅料，R2试剂包括发色底物、第二缓冲液和第二辅料，稀释试剂包括第三缓冲液和第三辅料；水蛭素校准品包括水蛭素，比伐卢定校准品包括比伐卢定，达比加群校准品包括达比加群；本发明试剂灵敏度高、稳定性好，能快速、准确的检测血浆中水蛭素、比伐卢定、达比加群含量，可同时实现对水蛭素、比伐卢定及达比加群用药情况的检测，且能够快速、有效地了解到患者药物残留浓度，能够精准评估患者体内的出血或血栓风险。

Description

一种用于检测血浆中水蛭素、比伐卢定、达比加群含量的试 剂盒
技术领域
本发明涉及免疫分析技术领域，尤其涉及一种用于检测血浆中水蛭素、比伐卢定、达比加群含量的试剂盒。
背景技术
现有多种商业化的直接凝血酶抑制剂（抗Ⅱa活性“DTI”）可用于血栓性疾病的治疗，但是并未出现一种统一的、有效的、便捷的药物监测方法，无法精准的了解患者体内药物的残留浓度，无法确切的评估患者的出血或血栓风险，存在极大的用药不确定性。临床上现常用的直接凝血酶抑制剂包含水蛭素、比伐卢定、达比加群等药物，随着该类药物临床应用的日益普及，在多种临床复杂状态时(尤其是合并多种疾病、高龄及危急重症患者) ，有针对性地进行药物浓度及抗凝效果监测有助于提高治疗的安全性和改善预后。针对不同类型的直接凝血酶抑制剂，常规推荐使用包括PT、APTT、ACT、ECT、dTT及LC-MS/MS在内的多种方法进行用药监测，但是以上方法均存在不同程度的局限性。抗Ⅱa活性测定是监测水蛭素、比伐卢定和达比加群抗凝效果的推荐检测方法，在抗Ⅱa活性测定的方法学中，发色底物法的灵敏度高、准确性好，能够精准地反映病人体内抗Ⅱa活性，且适用于多种自动化分析仪器，在临床中应用的前景广阔；但现有的基于发色底物法的试剂盒多存在以下问题：只能检测单一类型的直接凝血酶抑制剂，不能同时检测不同类型的直接凝血酶抑制剂（水蛭素、比伐卢定和达比加群）的问题，检测多种类型的直接凝血酶抑制剂（水蛭素、比伐卢定和达比加群）时检测效果差；试剂灵敏度差、稳定性不好，易受血浆中其他物质的干扰。
发明内容
本发明要解决的技术问题在于，针对现有技术的缺陷，提供一种用于检测血浆中水蛭素、比伐卢定、达比加群含量的试剂盒，试剂灵敏度高、稳定性好，能快速、准确的检测血浆中水蛭素、比伐卢定、达比加群含量。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：一种用于检测血浆中水蛭素、比伐卢定、达比加群含量的试剂盒，包括R1试剂、R2试剂、稀释试剂、水蛭素校准品、比伐卢定校准品以及达比加群校准品；
所述R1试剂包括凝血酶、第一缓冲液和第一辅料，所述R2试剂包括发色底物、第二缓冲液和第二辅料，所述稀释试剂包括第三缓冲液和第三辅料；
水蛭素校准品包括水蛭素，比伐卢定校准品包括比伐卢定，达比加群校准品包括达比加群。
进一步地，优选所述凝血酶为牛凝血酶、重组人凝血酶中的至少一种，所述凝血酶的浓度为1-3IU/mL。
进一步地，优选所述发色底物为发色底物S-2238、发色底物PA2493中的至少一种，所述发色底物的浓度为0.5-1.5 mmol/L。
进一步地，优选所述第一缓冲液、第二缓冲液、第三缓冲液均为Tris缓冲液、Hepes缓冲液、MES缓冲液、MOPS缓冲液、柠檬酸缓冲液或者PBS缓冲液中的至少一种，所述第一缓冲液、第二缓冲液、第三缓冲液的pH均为7.2-7.6。
进一步地，优选所述第一辅料包括第一稳定剂，所述第一稳定剂包括氯化钠、甘氨酸、蔗糖、半乳糖、聚乙二醇4000、Span-40、明胶、吐温-20、海藻糖、葡萄糖、β-环糊精、甘露醇和氯化钾中的一种或几种。
进一步地，优选所述第一稳定剂包括组分：氯化钠、甘氨酸、蔗糖、PEG-4000、Span-40，且上述组分在所述R1试剂中的质量百分比为：0.5-1.5%氯化钠、2-6%甘氨酸、3-5%蔗糖、0.5-1.5% PEG-4000、0.1-1% Span-40。
进一步地，优选所述第二辅料包括第二稳定剂，所述第二稳定剂包括甘氨酸、半乳糖、聚乙烯吡咯烷酮、Span-40、明胶、吐温-20、海藻糖、葡萄糖、β-环糊精、甘露醇和氯化钾中的至少一种。
进一步地，优选所述第二稳定剂包括组分：甘氨酸、半乳糖、聚乙烯吡咯烷酮、Span-40，且上述组分在所述R2试剂中的质量百分比为：2-6%甘氨酸、3-5%半乳糖、0.5-1.5%聚乙烯吡咯烷酮、0.1-1% Span-40。
进一步地，优选所述第三辅料包括第三稳定剂，所述第三稳定剂包括氯化钠、明胶、吐温-20、海藻糖、葡萄糖、β-环糊精、甘露醇和氯化钾中的一种或几种。
进一步地，优选所述第三稳定剂包括氯化钠，且在稀释试剂中的质量百分比为0.5-1.5%。
进一步地，优选所述R1试剂、R2试剂、稀释试剂均包括防腐剂，所述防腐剂均为苯甲酸钠、叠氮化钠、Proclin-300、庆大霉素以及亚硝酸盐中的至少一种。
进一步地，优选所述R1试剂包括肝素酶，所述肝素酶的浓度为1-3 IU/mL。
进一步地，优选所述R1试剂、所述R2试剂均包括蛋白酶保护剂，所述蛋白酶保护剂为BSA、HAS、Prionex中的至少一种，所述蛋白酶保护剂在所述R1试剂、所述R2试剂的质量百分比均为1-3%。
进一步地，优选所述水蛭素校准品包括第一赋形剂、第一保护剂；所述比伐卢定校准品包括第二赋形剂、第二保护剂；所述达比加群校准品包括第三赋形剂、第三保护剂。
进一步地，优选所述第一赋形剂、第二赋形剂、第三赋形剂均为羟乙基淀粉、甘氨酸、甘露醇、脯氨酸、酪蛋白中的至少一种。
进一步地，优选所述第一保护剂、第二保护剂、第三保护剂均为麦芽糖、蔗糖、葡萄糖、海藻糖、精氨酸、赖氨酸中的至少一种。
进一步地，优选所述水蛭素校准品中的水蛭素的含量为5 ug/mL，所述比伐卢定校准品中比伐卢定的含量为5 ug/mL，所述达比加群校准品中达比加群的含量为500 ng/mL。
本发明的有益效果：本发明提供的一种用于检测血浆中水蛭素、比伐卢定、达比加群含量的试剂盒；本发明的试剂盒试剂为液态，使用方便、成本低廉、灵敏度高、线性范围宽、抗干扰能力强、稳定性好，可以实现对进口抗Ⅱa活性测定试剂盒的替代，充分满足临床检验的需求，还能降低医院购买检测试剂的成本，同时减少病人的检测费用，降低负担；通过使用特定的缓冲体系来提高试剂的灵敏度，增加不同浓度样本的区分度，有利于定标操作、线性范围建立以及临床样本测试；本发明的试剂盒包括含有凝血酶的R1试剂、含有发色底物的R2试剂，并搭配水蛭素校准品、比伐卢定校准品及达比加群校准品，试剂灵敏度高、稳定性好，能快速、准确的检测血浆中水蛭素、比伐卢定、达比加群含量，可同时实现对水蛭素、比伐卢定及达比加群用药情况的检测，且能够快速、有效地了解到患者体内水蛭素、比伐卢定、达比加群的药物残留浓度，能够精准评估患者体内的出血或血栓风险。
附图说明
下面将结合附图及实施例对本发明作进一步说明，附图中：
图1是本发明实施例1和参比试剂检测水蛭素临床样本的相关性结果图；
图2是本发明实施例1和参比试剂检测比伐卢定临床样本的相关性结果图；
图3是本发明实施例1和参比试剂检测达比加群临床样本的相关性结果图；
图4是本发明实施例2和参比试剂检测水蛭素临床样本的相关性结果图；
图5是本发明实施例2和参比试剂检测比伐卢定临床样本的相关性结果图；
图6是本发明实施例2和参比试剂检测达比加群临床样本的相关性结果图；
图7是本发明实施例3和参比试剂检测水蛭素临床样本的相关性结果图；
图8是本发明实施例3和参比试剂检测比伐卢定临床样本的相关性结果图；
图9是本发明实施例3和参比试剂检测达比加群临床样本的相关性结果图。
具体实施方式
为了对本发明的技术特征、目的和效果有更加清楚的理解，现详细说明本发明的具体实施方式。
一种用于检测血浆中水蛭素、比伐卢定、达比加群含量的试剂盒，包括R1试剂、R2试剂、稀释试剂、水蛭素校准品、比伐卢定校准品以及达比加群校准品；R1试剂包括凝血酶、第一缓冲液和第一辅料，R2试剂包括发色底物、第二缓冲液和第二辅料，稀释试剂包括第三缓冲液和第三辅料；水蛭素校准品包括水蛭素，比伐卢定校准品包括比伐卢定，达比加群校准品包括达比加群。
本发明的工作原理：使用水蛭素校准品、比伐卢定校准品以及达比加群校准品对R1试剂、R2试剂、稀释试剂进行校准，通过向待测血浆中添加含过量的凝血酶Ⅱa，在病人血浆中残存的直接凝血酶抑制剂（水蛭素、比伐卢定、达比加群）成比例地消耗已加入的Ⅱa，剩余的Ⅱa作用于含有发色底物，裂解出显色基团（释放出的pNA在一定范围内检测），显色程度与剩余Ⅱa的量呈正相关，而与血浆中直接凝血酶抑制剂（水蛭素、比伐卢定以及达比加群）含量呈负相关，进而实现快速检测水蛭素、比伐卢定以及达比加群的含量。
本发明的试剂盒试剂为液态，使用方便、成本低廉、灵敏度高、线性范围宽、抗干扰能力强、稳定性好，可以实现对进口抗Ⅱa活性测定试剂盒的替代，充分满足临床检验的需求，还能降低医院购买检测试剂的成本，同时减少病人的检测费用，降低负担；通过使用特定的缓冲体系来提高试剂的灵敏度，增加不同浓度样本的区分度，有利于定标操作、线性范围建立以及临床样本测试；本发明的试剂盒包括含有凝血酶的R1试剂、含有发色底物的R2试剂，并搭配水蛭素校准品、比伐卢定校准品及达比加群校准品，试剂灵敏度高、稳定性好，能快速、准确的检测血浆中水蛭素、比伐卢定、达比加群含量，可同时实现对水蛭素、比伐卢定及达比加群用药情况的检测，且能够快速、有效地了解到患者体内水蛭素、比伐卢定、达比加群的药物残留浓度，能够精准评估患者体内的出血或血栓风险。
凝血酶的来源不做限制，优选凝血酶为牛凝血酶、重组人凝血酶中的至少一种，凝血酶的浓度为1-3IU/mL；发色底物S-2238、发色底物PA2493中的至少一种，发色底物的浓度为0.5-1.5 mmol/L；优选凝血酶为重组人凝血酶，优选发色底物为发色底物PA2493，使用重组人凝血酶和发色底物PA2493来制备试剂，分别搭配水蛭素校准品、比伐卢定校准品、达比加群校准品来检测血浆中直接凝血酶抑制剂（水蛭素，比伐卢定，达比加群）的浓度，搭配使用时，切割效率高，反应信号强，反应速度快，其试剂灵敏度更高，线性范围更宽，所需的反应时间更短，检测效果更好，为病人的抗凝治疗提供有效监测。
第一缓冲液、第二缓冲液、第三缓冲液为Tris缓冲液、Hepes缓冲液、MES缓冲液、MOPS缓冲液、柠檬酸缓冲液中的至少一种，第一缓冲液、第二缓冲液、第三缓冲液的pH均为7.2-7.6，本发明可以采用的缓冲液的类型不做具体限制，根据本发明的具体实例，优选第一缓冲液、第二缓冲液、第三缓冲液为Tris缓冲液作为缓冲体系，Tris缓冲液的浓度为60-100mmol/L，通过采用该缓冲体系能够有效地将该R1试剂、R2试剂、R3试剂维持在预定的范围内，即7.2-7.6，并且，通过采用该缓冲体系，不会对待检测样品中的水蛭素、比伐卢定、达比加群含量测定造成不利的影响，在该缓冲体系下，凝血酶和发色底物可以发挥最大效率，提高试剂的灵敏度，增加不同浓度样本的区分度，有利于定标操作、线性范围建立以及临床样本测试。
进一步地， 第一辅料还包括第一稳定剂，第一稳定剂包括氯化钠、甘氨酸、蔗糖、半乳糖、聚乙二醇4000、Span-40、明胶、吐温-20、海藻糖、葡萄糖、β-环糊精、甘露醇和氯化钾中的一种或几种，第一稳定剂的加入可提高试剂的稳定性，可以在不影响反应体系敏感性的前提下，抑制体系中的非特异性吸附，更重要的是，还可有效保护凝血酶的活性，提高凝血酶的稳定性的作用；氯化钠、氯化钾等无机盐，无机盐的加入可以用于调节该具有凝血酶溶液的渗透压，从而可以提高该凝血酶在测定蛭素、比伐卢定、达比加群含量时的效率；添加Span-40、吐温-20等可起到表面活性剂的作用，进一步提高试剂稳定性；添加聚乙二醇4000等多羟基醇，可提高试剂的粘度，有利于凝血酶均匀的悬浮于第一缓冲液中，不易沉降，从而起到较好的稳定性作用；同时第一稳定剂对蛋白酶也能起到一定的保护作用，以提高试剂盒的稳定性。
在一些实施例中第一稳定剂包括氯化钠、甘氨酸、蔗糖、PEG-4000、Span-40，且上述组分在所述R1试剂中的质量百分比为：0.5-1.5%氯化钠、2-6%甘氨酸、3-5%蔗糖、0.5-1.5% PEG-4000、0.1-1% Span-40。上述配比下，有利于试剂盒准确度高、稳定性好。
进一步地， 第二辅料还包括第二稳定剂，第二稳定剂包括甘氨酸、半乳糖、聚乙烯吡咯烷酮、Span-40、明胶、吐温-20、海藻糖、葡萄糖、β-环糊精、甘露醇和氯化钾中的至少一种。第二稳定剂的加入可提高试剂的稳定性，可以在不影响反应体系敏感性的前提下，抑制体系中的非特异性吸附，更重要的是，提高试剂的稳定性的作用；氯化钾等无机盐加入可以用于调节该具有发色底物溶液的渗透压，从而可以提高该发色底物在测定蛭素、比伐卢定、达比加群含量时的效率。
在一具体的实施例中，第二稳定剂包括甘氨酸、半乳糖、聚乙烯吡咯烷酮、Span-40，且上述组分在R2试剂中的质量百分比为：2-6%甘氨酸、3-5%半乳糖、0.5-1.5%聚乙烯吡咯烷酮、0.1-1% Span-40。上述配比下，有利于试剂盒准确度高、稳定性好。
进一步地，第三辅料还包括第三稳定剂，第三稳定剂包括氯化钠、明胶、吐温-20、海藻糖、葡萄糖、β-环糊精、甘露醇和氯化钾中的一种或几种，以提高试剂盒的稳定性。
在一具体实施例中，第三稳定剂包括氯化钠，且其在所述稀释试剂中的质量百分比为 0.5-1.5%。
进一步地， R1试剂、R2试剂、稀释试剂均包括防腐剂，防腐剂为苯甲酸钠、叠氮化钠、Proclin-300、庆大霉素以及亚硝酸盐中的至少一种。添加防腐剂达到防腐效果，防止由于微生物污染而导致试剂盒失效，有利于延长试剂盒的储存有效期。
进一步地， R1试剂包括肝素酶，肝素酶的浓度为1-3 IU/mL。通过添加肝素酶来检测水蛭素、比伐卢定、达比加群含量时降低血浆中残存肝素的影响，防止肝素与抗凝血酶III结合灭活试剂中的凝血酶，进而避免抗Ⅱa活性测量不准的情况的发生，增强抗凝血酶Ⅲ灭活凝血酶的能力，提高试剂盒的抗干扰能力。本发明的试剂盒中通过肝素酶替代现有技术中的聚凝胺和鱼精蛋白，虽然肝素酶与聚凝胺、鱼精蛋白都能降低血浆中残存肝素的影响，但是作用机制并不相同。具体地，聚凝胺和鱼精蛋白减小肝素影响的机制为：聚凝胺和鱼精蛋白为强碱性阳离子物质，通过静电结合的方式与肝素阴离子以1:1的比例结合，从而达到中和肝素的作用。而肝素酶减小肝素影响的机制为：肝素酶是一类作用于肝素或者乙酰肝素分子的多糖裂解酶，可选择地剪切硫酸化肝素聚糖中葡萄糖胺和糖醛酸之间α（1-4）糖苷键，使得肝素失活。由此可见，肝素酶与聚凝胺、鱼精蛋白的作用机理不同，且使用肝素酶中和肝素的效果要优于聚凝胺和鱼精蛋白。
进一步地， R1试剂、R2试剂均包括蛋白酶保护剂，蛋白酶保护剂为BSA、HAS、Prionex中的至少一种，蛋白酶保护剂用于延长试剂盒中的R1试剂、R2试剂的稳定性，有利于试剂盒的长期使用和存储，有利于保护酶的活性，防止凝血酶变性，通过提高溶液中蛋白质的浓度，对凝血酶起保护作用。防止酶的分解和非特异性吸附，能减轻有些酶的变性，减轻不利环境因素如加热，表面张力及化学因素引起的变性的。蛋白酶保护剂在R1试剂、R2试剂的质量百分比均为1-3%，优选蛋白酶保护剂为Prionex。
进一步地，水蛭素校准品包括第一赋形剂、第一保护剂；比伐卢定校准品包括第二赋形剂、第二保护剂；达比加群校准品包括第三赋形剂、第三保护剂。第一赋形剂、第二赋形剂、第三赋形剂分别用于水蛭素校准品、比伐卢定校准品、达比加群校准品冻干过程中形态的维持，可承受较大的温度范围变化，有利于保持粉饼状结构，并且用量极少，第一赋形剂、第二赋形剂、第三赋形剂均可为羟乙基淀粉、甘氨酸、甘露醇、脯氨酸、酪蛋白中的至少一种，在一具体实施例中，第一赋形剂、第二赋形剂、第三赋形剂均为羟乙基淀粉，质量百分比为3%。第一保护剂、第二保护剂、第三保护剂分别用于水蛭素校准品、比伐卢定校准品、达比加群校准品冻干过程中主药物质的保护，减少水蛭素、比伐卢定以及达比加群在冻干过程中的损失，维持水蛭素、比伐卢定以及达比加群应有的含量和活性，使得校准品冻干后的检测结果在预期接受范围内，符合校准品要求。进一步地，第一保护剂、第二保护剂、第三保护剂均可为麦芽糖、蔗糖、葡萄糖、海藻糖、精氨酸、赖氨酸中的至少一种，在一具体实施例中，第一保护剂、第二保护剂、第三保护剂均为麦芽糖，质量百分比为3%。
进一步地，水蛭素校准品中的水蛭素的含量为5 ug/mL，比伐卢定校准品中比伐卢定的含量为5 ug/mL，达比加群校准品中达比加群的含量为500 ng/mL；本发明的试剂与水蛭素校准品、比伐卢定校准品以及达比加群校准品搭配使用，可以同时实现对水蛭素、比伐卢定以及达比加群含量的测定。
以下通过具体实施方式对本发明做进一步解释说明。
实施例1
一种试剂盒，包括R1试剂、R2试剂、稀释试剂、水蛭素校准品、比伐卢定校准品以及达比加群校准品，具体组分见下表：
表1.实施例1的试剂盒的各试剂组分
Figure 458035DEST_PATH_IMAGE001
注：“/”表示不含此成分。
实施例2
一种试剂盒，包括R1试剂、R2试剂、稀释试剂、水蛭素校准品、比伐卢定校准品以及达比加群校准品，具体组分见下表：
表2.实施例2的试剂盒的各试剂组分
Figure 578437DEST_PATH_IMAGE002
注：“/”表示不含此成分。
实施例3
一种试剂盒，包括R1试剂、R2试剂、稀释试剂、水蛭素校准品、比伐卢定校准品以及达比加群校准品，具体组分见下表：
表3.实施例3的试剂盒的各试剂组分
Figure 358175DEST_PATH_IMAGE003
注：“/”表示不含此成分。
对比例1
对比例1中R1试剂、R2试剂、稀释试剂中的缓冲液为PB缓冲液，其他组分及用量均与实施例1相同。
对比例2
对比例2中不含肝素酶，其他组分及用量均与实施例1相同。
对比例3
对比例3中将对比例1中的肝素酶替换为聚凝胺，其他组分及用量均与实施例1相同。
对比例4
对比例4中将对比例1中的肝素酶替换为鱼精蛋白，其他组分及用量均与实施例1相同。
对比例5
对比例5中R1试剂、R2试剂、稀释试剂中不含蛋白酶保护剂Prionex，其他均与实施例1相同。
对实施例1-3以及对比例1-5的抗Ⅱa活性测定试剂盒进行定标、空白限、准确度、线性范围、重复性、稳定性以及临床相关性测试。
1.定标及其结果
采用实施例1-3以及对比例1的抗Ⅱa活性测定试剂盒在全自动凝血分析仪上搭配水蛭素校准品、比伐卢定校准品及达比加群校准品，完成水蛭素、比伐卢定及达比加群项目的校准。每个项目校准品包含C0、C1、C2、C3、C4、C5共5个浓度水平（C0-C5浓度依次升高），定标结果如表4-7所示。定标结果应符合要求：定标曲线的线性回归方程r≥0.980。
表4. 实施例1的试剂盒的定标结果
Figure 18963DEST_PATH_IMAGE004
表5. 实施例2的试剂盒的定标结果
Figure 36598DEST_PATH_IMAGE005
表6. 实施例3的试剂盒的定标结果
Figure 859060DEST_PATH_IMAGE006
表7. 对比例1的试剂盒的定标结果
Figure 391673DEST_PATH_IMAGE007
从表4-7的测试结果发现实施例1-3定标曲线性回归方程的r均≥0.980，符合要求，证明实施例1-3均能得到较好的定标曲线。对比例1定标曲线性回归方程的r均＜0.980，不符合要求，相邻校准品的OD值差异较小，影响试剂的灵敏度和定标曲线的绘制，进一步说明在Tris缓冲液下，凝血酶和发色底物可以发挥最大效率，提高试剂的灵敏度，增加不同浓度样本的区分度，有利于定标操作、线性范围建立以及临床样本测试。
2.空白限测试及其结果
采用实施例1-3的试剂盒测定空白样本20次，按照以下的公式（1）和公式（2）计算 平均值（
Figure 590573DEST_PATH_IMAGE008
）、标准差（SD）以及空白限（
Figure 462714DEST_PATH_IMAGE008
＋2SD），测试结果如表8-10所示。测试结果应符合要 求：水蛭素和比伐卢定项目的空白限应≤0.2 μg/mL，达比加群项目的空白限应≤20 ng/ mL。
Figure 721657DEST_PATH_IMAGE009
式中：
Figure 475986DEST_PATH_IMAGE010
——测试结果的平均值；
Figure 665528DEST_PATH_IMAGE011
——每次的实测值；
n——测试的次数；
i——测试的序号；
B——相对偏差；
SD——标准差。
表8. 实施例1的试剂盒的空白限测试结果
Figure 188913DEST_PATH_IMAGE012
表9.实施例2的试剂盒的空白限测试结果
Figure 884337DEST_PATH_IMAGE013
表10.实施例3的试剂盒的空白限测试结果
Figure 125962DEST_PATH_IMAGE014
从表8-10的测试结果发现，实施例1-3均符合所规定的空白限要求。
3.准确度测试及其结果
采用实施例1-3以及对比例2的试剂盒分别测定含外源添加肝素的水蛭素校准品（C1、C4）、比伐卢定校准品（C1、C4）、达比加群校准品（C1、C4），每个校准品重复测试3次，按照上述公式（1）和（3）计算相对偏差，测试结果如表11-16所示。测试结果应符合要求：相对偏差应在±15%范围内。
公式（3）：
Figure 604348DEST_PATH_IMAGE015
式中：
T——校准品标示值；
B——相对偏差。
表11.实施例1的试剂盒的准确度测试结果
Figure 247819DEST_PATH_IMAGE016
表12. 实施例2的试剂盒的准确度测试结果
Figure 848565DEST_PATH_IMAGE017
表13.实施例3的试剂盒的准确度测试结果
Figure 577486DEST_PATH_IMAGE018
表14.对比例2的试剂盒的准确度测试结果
Figure 656301DEST_PATH_IMAGE019
表15.对比例3的试剂盒的准确度测试结果
Figure 357541DEST_PATH_IMAGE020
表16.对比例4的试剂盒的准确度测试结果
Figure 129187DEST_PATH_IMAGE021
从表11-16的测试结果发现，实施例1-3的相对偏差比较小，证明实施例1-3都具有很好的准确性，对比例2-4的相对偏差不符合均在±15%范围内的要求，由实施例1与对比例2-4的检测结果可知，通过添加肝素酶来降低检测水蛭素、比伐卢定、达比加群含量时血浆中残存肝素的影响，防止肝素与抗凝血酶III结合灭活试剂中的凝血酶，进而避免抗Ⅱa活性测量不准的情况的发生，增强抗凝血酶Ⅲ灭活凝血酶的能力，提高试剂盒的抗干扰能力。对比例2-4受样本中游离肝素的干扰，导致切割PA2493底物的凝血酶变少，显色强度变弱，测试结果偏高。因此，对比例2-4的准确性不如实施例1-3，进一步说明使用肝素酶降低肝素干扰的效果要优于聚凝胺和鱼精蛋白。
4.线性范围测试及其结果
将接近试剂盒线性范围上限的水蛭素、比伐卢定及达比加群高值样本，分别稀释成5个不同浓度的样本，对每个浓度的样本测试3次，以理论浓度为（xi），实测结果均值为(yi)，求出线性回归方程，计算线性回归的相关系数（r），测试结果如表17-19所示。测试结果应符合要求：水蛭素在0.2-5 μg/mL，比伐卢定在0.2-5 μg/mL及达比加群在30-500 ng/mL的线性范围内时，线性相关系数r≥0.990。
表17.实施例1的试剂盒的线性范围测试结果
Figure 345405DEST_PATH_IMAGE022
表18.实施例2的试剂盒的线性范围测试结果
Figure 227911DEST_PATH_IMAGE023
表19.实施例3的试剂盒的线性范围测试结果
Figure 783657DEST_PATH_IMAGE024
从表17-19的测试结果发现，实施例1-3均符合上述线性范围要求。
5.重复性测试及其结果
采用实施例1-3的试剂盒，测试水蛭素低值和高值质控品、比伐卢定低值和高值质 控品、达比加群低值和高值质控品各10次。按照公式（1）和（2）计算测试结果平均值平均值（
Figure 726205DEST_PATH_IMAGE008
）和标准差（SD），按照公式（4）计算变异系数（CV），测试结果如表20-22所示。测试结果应符 合要求：水蛭素低值质控品、比伐卢定低值质控品、达比加群低值质控品变异系数（CV）≤ 10%；水蛭素高值质控品、比伐卢定高值质控品、达比加群高值质控品变异系数（CV）≤8%。
公式（4）：
Figure 164140DEST_PATH_IMAGE025
，式中：CV为变异系数。
表20.实施例1的试剂盒的重复性测试结果
Figure 850336DEST_PATH_IMAGE026
表21.实施例2的试剂盒的重复性测试结果
Figure 322905DEST_PATH_IMAGE027
表22.实施例3的试剂盒的重复性测试结果
Figure 888885DEST_PATH_IMAGE028
从表20-22的测试结果发现，实施例1-3均符合上述重复性要求。
6.稳定性测试及其结果
1)开瓶稳定性：将实施例1-3的试剂盒中的R1试剂、R2试剂、稀释试剂开瓶后置于2-8℃储存，在第0天、第30天、第50天、第55天、第60天、第65天进行准确度测试，测试结果如表23-25所示。测试结果应符合要求：试剂盒中R1试剂、R2试剂、稀释试剂开瓶后置于2-8℃储存可以稳定60天，即相对偏差应在±15%范围内。
表23.实施例1的试剂盒的开瓶稳定性测试结果
Figure 814116DEST_PATH_IMAGE029
表24.实施例2的试剂盒的开瓶稳定性测试结果
Figure 304003DEST_PATH_IMAGE030
表25.实施例3的试剂盒的开瓶稳定性测试结果
Figure 365500DEST_PATH_IMAGE031
从表23-25的测试结果发现，实施例1-3符合上述开瓶稳定性要求，即试剂盒中R1试剂、R2试剂、稀释试剂开瓶后置于2-8℃储存可以稳定65天。
2)加速稳定性：将实施例1-3以及对比例3试剂盒中的R1试剂、R2试剂、稀释试剂在未开封状态下置于37℃储存，在第0天、第8天、第10天、第12天进行准确度测试，测试结果如表26-29所示。测试结果应符合要求：试剂盒中R1试剂、R2试剂、稀释试剂在未开封状态下置于37℃储存可以稳定10天，即相对偏差应在±15%范围内。
表26.实施例1的试剂盒的加速稳定性测试结果
Figure 853113DEST_PATH_IMAGE032
表27.实施例2的试剂盒的加速稳定性测试结果
Figure 265640DEST_PATH_IMAGE033
表28.实施例3的试剂盒的加速稳定性测试结果
Figure 559218DEST_PATH_IMAGE034
表29.对比例3的试剂盒的加速稳定性测试结果
Figure 740800DEST_PATH_IMAGE035
从表26-29的测试结果发现，实施例1-3符合上述加速稳定性要求，即试剂盒中R1试剂、R2试剂、稀释试剂在未开封状态下置于37℃储存可以稳定10天，未添加蛋白酶保护剂的对比例3不符合上述加速稳定性要求，相比于对比例3，实施例1-3的试剂盒具有更高的加速稳定性。
7.临床相关性测试及其结果
采用第三方购买的参比试剂盒（法国Hyphen）和实施例1-3的试剂盒同时测试一组覆盖线性范围的临床样本（40例），以参比试剂盒的实测值为X轴，实施例1-3试剂盒的实测值为Y轴，做线性回归分析，测试结果如表30-32和附图1-9所示。测试结果应符合要求：线性回归分析应符合线性回归方程的斜率k在0.9-1.1之间且相关系数r≥0.975。
表30. 实施例1与参比试剂测试临床样本的相关性结果
Figure 133736DEST_PATH_IMAGE036
表31.实施例2与参比试剂测试临床样本的相关性结果
Figure 33558DEST_PATH_IMAGE037
表32.实施例3与参比试剂测试临床样本的相关性结果
Figure 865248DEST_PATH_IMAGE038
从表30-32以及附图1-9所示的测试结果可知，实施例1-3的试剂盒与参比试剂盒试剂的测试临床样本的结果做线性回归分析，线性回归方程的斜率k及相关性r均符合要求，证明实施例1-3的试剂盒与参比试剂具有良好的相关性。
以上数据及附图表明，使用本发明的试剂盒进行相关性能测试，所得结果均符合接受标准。通过上述具体实施例来验证本发明的可行性与合理性，该实施例仅为本发明可供选择的个别实施例说明，但并不局限于此。对于本领域的技术人员而言，凡是根据本发明申请的专利范围所进行的变化，修改和替换均应包含在本专利的权利要求范围内，皆属于本发明的保护范畴。

Claims (5)

1.一种用于检测血浆中水蛭素、比伐卢定、达比加群含量的试剂盒，其特征在于，包括R1试剂、R2试剂、稀释试剂、水蛭素校准品、比伐卢定校准品以及达比加群校准品；
所述R1试剂由凝血酶、第一缓冲液、肝素酶、蛋白酶保护剂和第一辅料组成，所述凝血酶为重组人凝血酶，所述重组人凝血酶的浓度为1-3 IU/mL，所述肝素酶的浓度为1-3 IU/mL，所述第一辅料由氯化钠、甘氨酸、蔗糖、PEG-4000和Span-40组成，且上述组分在所述R1试剂中的质量百分比为： 0.5-1.5%氯化钠、2-6%甘氨酸、3-5%蔗糖、0.5-1.5% PEG-4000、0.1-1% Span-40；
所述R2试剂由发色底物、第二缓冲液、蛋白酶保护剂和第二辅料组成，所述发色底物为发色底物PA2493，所述第二辅料由甘氨酸、半乳糖、聚乙烯吡咯烷酮和Span-40组成，且上述组分在所述R2试剂中的质量百分比为：2-6%甘氨酸、3-5%半乳糖、0.5-1.5%聚乙烯吡咯烷酮、0.1-1% Span-40；
所述稀释试剂由第三缓冲液和第三辅料组成，所述第三辅料为氯化钠，且氯化钠在所述稀释试剂中的质量百分比为 0.5-1.5%；
所述第一缓冲液、第二缓冲液、第三缓冲液为Tris缓冲液，所述Tris缓冲液的浓度为60mmol/L-100 mmol/L ，所述第一缓冲液、第二缓冲液、第三缓冲液的pH均为7.2-7.6；
所述蛋白酶保护剂为BSA、HSA、Prionex中的任意一种，所述蛋白酶保护剂在所述R1试剂、所述R2试剂的质量百分比均为1-3%；
所述水蛭素校准品包括水蛭素，所述比伐卢定校准品包括比伐卢定，所述达比加群校准品包括达比加群。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述发色底物PA2493的浓度为0.5-1.5mmol/L。
3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述R1试剂、R2试剂、稀释试剂均包括防腐剂，所述防腐剂为苯甲酸钠。
4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述水蛭素校准品包括羟乙基淀粉和麦芽糖，所述比伐卢定校准品包括羟乙基淀粉和麦芽糖；所述达比加群校准品包括羟乙基淀粉和麦芽糖。
5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述水蛭素校准品中的水蛭素的含量为5 ug/mL，所述比伐卢定校准品中比伐卢定的含量为5 ug/mL，所述达比加群校准品中达比加群的含量为500 ng/mL。
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