CN107226862A - 特异性人ews‑fli1融合蛋白抗体的制备方法及在制备尤文肉瘤诊断抗体试剂的应用 - Google Patents
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Abstract
特异性人EWS‑FLI1融合蛋白抗体的制备方法及在制备尤文肉瘤诊断抗体试剂的应用：1）多肽设计：两组每组三条，组1：多肽1：Cys‑SSSYGQQNPSYDSVR；多肽2：SSSYGQQ‑Cys；多肽3：Cys‑PSYDSVR；组2：多肽4：Cys‑SSSYGQQSSLLAYN；多肽5同多肽2；多肽6：Cys‑SSLLAYN；2）多肽合成；3）抗原制备：将多肽1、4与KLH偶联，偶联物作为抗原用于免疫动物；4）免疫；5）抗体纯化：抗体经三步多肽层析柱亲和纯化得到特异性抗体；6）浓缩；7）抗体鉴定：证明目标抗体特异性。本发明能够实现规模化工业生产，所制备的抗体在尤文肉瘤诊断中应用。
Description
技术领域
本发明专利涉及一种人类融合蛋白的抗体制备及应用方法。具体涉及到一种特异性人EWS-FLI1融合蛋白抗体的制备方法及其在制备恶性肿瘤--尤文肉瘤诊断抗体试剂中的应用。本方法制备的抗体，只对人EWS与FLI1蛋白融合后的人EWS-FLI1融合蛋白有特异反应，对人EWS或FLI1蛋白无反应。
技术背景
尤文肉瘤是一种高度恶性骨肿瘤，其发病率在儿童及青少年原发恶性骨肿瘤中仅次于骨肉瘤。尤文肉瘤根治术后较高的复发与转移率已成为制约尤文肉瘤（Ewing'ssarcoma）疗效提高的关键性障碍。目前发现，尤文肉瘤具有特异的染色体易位t（11；22）（q24；q12），重排的22号染色体上EWS基因的3’端与FLI1基因的5’端相结合，产生一个新的融合基因，编码的融合蛋白EWS-FLI1诱导一系列基因的异常表达导致了尤文肉瘤的发生和发展。95%的尤文肉瘤家族具有特异的融合蛋白EWS-FLI1，此蛋白是尤文肉瘤发生、发展的关键，同时也是治疗尤文肉瘤理想的特异性靶点。实验证实EWS-FLI1基因修饰的树突状细胞对尤文肉瘤细胞具有特异性杀伤作用，提示EWS-FLI1可能是EWS细胞的特异性抗原成分。
EWS-FLI1融合蛋白是由EWS的氨基末端和FLI1的羧基末端组合而成，作为调节异常的转录因子EWS-FLI1发挥着强大的致癌基因作用。除了EWS氨基末端的反式激活结构域之外，富含脯胺酸结构域的FLI1羧基末端能显著增强EWS-FLI1融合蛋白的转录活性（RekhiB, et al. J Postgrad Med, 2010, 56(3): 201-205.）。然而目前对于EWS-FLI1融合蛋白的非转录功能还缺乏研究。研究表明，EWS-FLI1的致癌过程是与DNA结合而非依赖的方式来实现的，因为在尤文肉瘤细胞中发现EWS-FLI1与DNA结合并不能增加前者的致癌潜能。另外有研究发现，EWS-FLI1还能结合靶基因启动子的GGAA卫星重复序列（GGAA-microsatelliterepeat sequences），CAV1和GSTM4参与EWS-FLI1介导的肿瘤形成，进一步证实在尤文肉瘤的肿瘤形成过程中，EWS-FLI1的转录活性是通过卫星重复序列来完成的。 EWS-FLI1融合蛋白有多种类型（type），其中两种占绝大多数。其中最普通的类型为型1（EWS-FLI1 type 1），约占60%。与其它的融合类型相比，EWS-FLI1 型1编码功能较弱的反式激活因子，对预后有利。 其次是型2（EWS-FLI1 type 2），约占25%，编码功能较强的反式激活因子，对预后不利。
融合基因是指将两个或多个基因的编码区首尾相连．置于同一套调控序列（包括启动子、增强子、核糖体结合序列、终止子等）控制之下，构成的嵌合基因，融合基因的表达产物为融合蛋白。融合基因大部分在肿瘤中被发现，并在肿瘤诊断中占有重要的意义。比如早期发现的bcr-abl融合基因在白血病分型中就极为重要。目前，融合基因的检测方法，主要通过在位杂交荧光(FISH)，反转录PCR（RT-PCR）等方法。这些方法主要基于分子生物学法，无法检测表达产物即融合蛋白。而在生物体内，正是其表达产物即融合蛋白在起着生物学效应。本发明基于免疫学方法，可以对表达产物，即融合后的蛋白进行准确地鉴定，可以定性或定量，特异性好，与未融合的蛋白无反应，可以为尤文肉瘤的科研、诊断与治疗提供新的工具。
对于普通的人EWS或FLI1蛋白的抗体，现有技术中已有标准的生产程序，但是，所生产的这些抗体只能识别未融合前的人EWS或FLI1蛋白，或者只能在识别融合前的EWS或FLI1蛋白的众多异构体的同时，附带识别EWS-FLI1融合蛋白，造成检测结果不可靠，非特异性极高。在报道中，EWS至少有6种异构体，FLI1至少4种异构体，EWS-FLI1融合蛋白至少有12种异构体。同时，因为无法准确识别EWS-FLI1融合蛋白的类型，就无法对临床提供准确的预后的判断。
发明内容
本发明的目的是提供一种特异性人EWS-FLI1融合蛋白抗体的制备方法。本发明还将提供这种特异性人EWS-FLI1融合蛋白抗体在制备恶性肿瘤--尤文肉瘤诊断抗体中的应用。本发明针对融合蛋白的特定拼接方式，来进行多肽抗原设计，制备的抗体是针对融合后的人EWS-FLI1蛋白。目标抗体经过融合前EWS或FLI1蛋白序列的纯化过滤后，可以达到只对EWS-FLI1融合蛋白有特异性，检测中做到结果准确可靠，有利于诊断应用。具体可以通过免疫学检测的手段，如酶联免疫法（ELISA）、免疫印迹法（WB）、免疫组化法（IHC）等方法将本发明抗体进行应用。本发明任务还包括，该制备方法能够实现规模化工业生产。
完成上述发明任务的技术方案是一种特异性人EWS-FLI1融合蛋白抗体的制备方法，共提供两种类型（EWS-FLI1 type 1与type 2）的制备方法，步骤如下：
1）多肽设计：设计两组多肽序列，每组三条，分别为：
组1：多肽1：Cys-SSSYGQQNPSYDSVR；多肽2：SSSYGQQ-Cys；多肽3：Cys-PSYDSVR；
组2：多肽4：Cys-SSSYGQQSSLLAYN；多肽5同多肽2；多肽6：Cys-SSLLAYN；
说明：
a)多肽1为15aa肽，对应人EWS-FLI1 type 1融合蛋白位置aa264-278。多肽序列选择恰为人EWS-FLI1 type 1融合蛋白的拼接位置，其中SSSYGQQ序列来自人EWS，PSYDSVR序列来自人FLI1，中间N为拼接位点。多肽序列在N端人为添加一个Cys（半胱氨酸）用于抗原偶联。人EWS-FLI1 type 1融合蛋白信息如图1所示。
b)多肽2为7aa肽，对应融合前人EWS融合蛋白aa258-264，对应多肽1的N端序列，并在多肽2的C端人为添加一个Cys（半胱氨酸）用于抗原偶联。人EWS蛋白信息如图2所示。
c)多肽3为7aa肽，对应融合前人FLI1融合蛋白aa220-226，对应多肽1的C端序列，并在多肽3的N端人为添加一个Cys（半胱氨酸）用于抗原偶联。人FLI1蛋白信息如图3所示。
d)多肽4为14aa肽，对应人EWS-FLI1 type 2融合蛋白位置aa264-278。多肽序列选择恰为人EWS-FLI1 type 2融合蛋白的拼接位置，其中SSSYGQQ序列来自人EWS，SSLLAYN序列来自人FLI1。多肽序列在N端人为添加一个Cys（半胱氨酸）用于抗原偶联。人EWS-FLI1type 2融合蛋白信息如图4所示。
e)多肽5序列同多肽 2，对应多肽4的N端序列。
f)多肽6为7aa肽，对应融合前人FLI1融合蛋白aa197-203，对应多肽4的C端序列，并在多肽6的N端人为添加一个Cys（半胱氨酸）用于抗原偶联。人FLI1蛋白信息如图3所示。
g)其中多肽2与多肽3，多肽5与多肽6的Cys（半胱氨酸）添加在多肽上的位置不同，以便于抗体纯化。
2）多肽合成：多肽纯度≥85%，分子量正确。通常在免疫实验中，对多肽纯度的要求可以降低至70%。
3）抗原制备：将多肽1、多肽4分别与KLH偶联，偶联物作为抗原用于免疫动物。KLH使用琥珀酰亚胺基4-[N-马来酰亚胺甲基]环己烷-1-羧化物（SMCC）双功能偶联剂预先活化成KLH-SMCC，通过Cys（半胱氨酸）与多肽1相联接。
4）免疫：选用新西兰兔，每只兔子以300μg剂量进行基础免疫，以后每隔21天进行一次加强免疫，在经过三次加强免疫后，再经7天，取血样，对血清进行ELISA检测。收集经ELISA检测阳性的兔子血清。
5） 抗体纯化：
a. 组1层析柱制备：多肽与胶的剂量按2mg：2mg，将多肽1、多肽2与多肽3分别偶联在预先活化好的巯基琼脂糖凝胶(sulfolink-Gel)上，制备一组共三根亲和层析柱。
b. 组1纯化：
血清按10：1体积比例加入1 M Tris·HCl pH7.5 缓冲液调节pH值，再用0.45μm膜过滤。处理过血清再与多肽1偶联的层析柱室温下混匀反应2小时。用10mM PBS pH7.4清洗层析柱后，再用100 mM 甘氨酸(glycine) pH2.8缓冲液洗脱，收集OD280≥0.2部分洗脱液。收集液立即用 1M Tris·HCl pH7.5缓冲液调节pH。
将收集液与多肽2偶联的层析柱室温下混匀反应2小时，收集穿透液，此步骤可以重复1到3次，直至穿透液被多肽2抗原吸收完全。
再将经多肽2纯化过的收集液与多肽3偶联的层析柱室温下混匀反应2小时，收集穿透液，此步骤可以重复1到3次，直至穿透液被多肽3抗原吸收完全。
穿透液即含有纯化组1目标抗体（EWS-FLI1 type 1抗体）。
c. 组2的层析柱制备与纯化的步骤与组1类似，不同的是多肽1，2，3对应换成多肽4，5，6，最后得到纯化组2目标抗体（EWS-FLI1 type 2抗体）。
6）浓缩：将纯化好的穿透液浓缩成特定浓度目标抗体浓液，通常1mg/ml以上。可根据各种应用的需要调制相应浓度。
7）抗体鉴定：制备的目标抗体经过酶联免疫法（ELISA）、斑点杂交法（Dot-Blot）法鉴定，证明组1目标抗体只对多肽1有特异反应，对其它多肽均无反应。组2目标抗体只对多肽4有特异反应，对其它多肽均无反应。检测方法如下：
a. 间接酶联免疫法（ELISA）：将所设计的多肽分别偶联BSA的偶联物同作为检测抗原。以5μg/ml，每孔100μl包被96孔板。经间接ELISA检测，证明组1目标抗体只对多肽1有极强反应，对其它多肽均无反应。组2目标抗体只对多肽4有极强反应，对其它多肽均无反应。结果如图5所示。
b．斑点杂交法（Dot-Blot）：将多肽与BSA的偶联物作为检测抗原。经Dot-Blot法检测，证明组1目标抗体只对多肽1有极强反应，对其它多肽均无反应。组2目标抗体只对多肽4有极强反应，对其它多肽均无反应。结果如图6所示。
本发明工艺流程图如图6所示。
完成本申请第二个发明目的的技术方案是，上述特异性人EWS-FLI1融合蛋白抗体在制备恶性肿瘤--尤文肉瘤诊断抗体试剂中的应用。具体方法是：
免疫；通常选用BALB/c小鼠以10μg/只的剂量进行基础免疫，以后每隔21天进行一次加强免疫，在经过三次加强免疫后，再经3天，取血样，对血清进行ELISA检测。
细胞融合：取经ELISA检测阳性血清的小鼠，取小鼠脾细胞，与小鼠骨髓瘤细胞SP20进行融合，制备杂交瘤细胞。
选择培养：将杂交瘤细胞用96孔板铺板培养，再加选择培养基进行选择培养。
筛选克隆：对杂交瘤细胞进行筛选，使杂交瘤细胞克隆化，形成单克隆细胞株。
单克隆抗体的鉴定：
a. 间接酶联免疫法（ELISA）：将所设计的多肽分别偶联BSA，偶联物作为检测抗原。单克隆抗体采用间接ELISA检测，对多肽1有反应，对其它多肽无反应的抗体即为EWS-FLI1type 1目标抗体。对多肽4有反应，对其它多肽无反应的抗体即为EWS-FLI1 type 2目标抗体。
b．斑点杂交法（Dot-Blot）：采用多肽与BSA的偶联物作为检测抗原。单克隆抗体经Dot-Blot法检测，对多肽1有反应，对其它多肽无反应的抗体即为EWS-FLI1 type 1目标抗体。对多肽4有反应，对其它多肽无反应的抗体即为EWS-FLI1 type 2目标抗体。
本发明专利的方法可以应用于各种融合蛋白特异性抗体的制备。具体为依据本发明中的方法，选择融合蛋白拼接位置左右两端的序列进行多肽设计，再根据本发明中多肽合成，抗原制备，免疫，ELISA检测，收集血清步骤，再根据本发明中纯化原理与方法，采用设计的多肽分别制备的层析柱进行亲和层析，得到目标抗体。
本发明专利制备产生的抗体，采用但不限于以下多种免疫学检测方法进行应用。结果可以用于定性或定量实验，用于科研或诊断用途。
1)夹心酶联免疫法（ELISA）
采用本发明专利制备产生的抗体，再选取人EWS-FLI融合蛋白或EWS蛋白或FLI1蛋白抗体进行配对，形成一对夹心ELISA抗体。可以应用于尤文肉瘤相关细胞或组织的裂解液，细胞培养液，患者血样及体液等样品进行夹心ELISA检测。
2) 免疫印迹法（WB）
采用本发明专利制备产生的抗体，可以应用于尤文肉瘤相关细胞或组织的裂解液，表达蛋白等样品进行免疫印迹法（WB）检测。
3) 免疫组化法（IHC）
采用本发明专利制备产生的抗体，可以应用于尤文肉瘤相关细胞或组织进行免疫组化法（IHC）检测。
4) 免疫沉淀法（IP）
采用本发明专利制备产生的抗体，可以应用于尤文肉瘤相关细胞或组织，患者血样及体液进行免疫沉淀法（IP）检测。
5) 免疫荧光法（IF）
采用本发明专利制备产生的抗体，通过直接荧光标记，或通过荧光标记二抗法，可以应用于尤文肉瘤相关细胞或组织，患者血样及体液进行免疫荧光法（IF）检测。
6) 流式细胞术（FCM）
采用本发明专利制备产生的抗体，通过流式细胞术（FCM），可以应用于尤文肉瘤相关细胞或组织，患者血样及体液进行检测。
在分子生物学检测法中，因只能检测融合基因而无法检测具体发挥功能作用的EWS-FLI1融合蛋白，故无法对表达产物即融合蛋白表达与否及表达量进行分析，鉴定结果明显有缺陷。本发明能克服与弥补这些缺陷。本发明还克服了现有技术生产方法所制备的人EWS或FLI1蛋白的抗体，只能识别未融合前的人EWS或FLI1蛋白，或者只能在识别EWS或FLI1蛋白的众多异构体的同时，附带识别EWS-FLI1融合蛋白，造成检测结果不可靠，非特异性极高等不足；本发明专利制备的抗体，针对融合蛋白的特定拼接方式进行多肽抗原设计，制备的抗体是针对融合后的人EWS-FLI1蛋白。目标抗体经过融合前EWS或FLI1蛋白序列的纯化过滤后，可以达到只对EWS-FLI1融合蛋白有特异性，检测中做到结果准确可靠，有利于诊断应用。同时，本发明能够进一步明确鉴定出EWS-FLI1融合蛋白的类型，给临床预后提供了有力的依据。
表1为ELISA检测结果。
基于本发明目标抗体直接测定的是融合后的人EWS-FLI1蛋白，且具有高准确率与特异性的检测结果的优势，大大提高了应用的方便性与检测速度。通常抗体诊断应用中，一次性得到检测结果。比如在应用于患者细胞或组织的免疫印迹（WB）、免疫组化（IHC）或免疫荧光（IF）检测中体现尤其明显，通过本发明抗体的检测就可以一次性得到明确结果。这对于普通的人EWS或FLI1蛋白抗体的检测是无法做到的。本发明的工艺步骤经过严格生产程序与鉴定程序的标准化，可以应用于规模化工业生产。
附图说明
图1为人EWS-FLI1 type 1蛋白信息；
图2为人EWS蛋白信息；
图3为人FLI1蛋白信息；
图4为 人EWS-FLI1 type 2蛋白信息
图5 为Dot-Blot检测结果；
图6为本发明工艺流程图。
具体实施方式
本发明专利可以应用于单克隆抗体的制备，具体实施方式为：
实施例1，一种特异性人EWS-FLI1融合蛋白抗体的制备方法
A、提供两种类型EWS-FLI1融合蛋白（type 1与type 2）的制备方法，步骤如下：
1)多肽设计：设计两组多肽序列，每组共三条，分别为：
组1：多肽1：Cys-SSSYGQQNPSYDSVR；多肽2：SSSYGQQ-Cys；多肽3：Cys-PSYDSVR；
组2：多肽4：Cys-SSSYGQQSSLLAYN；多肽5：同多肽2；多肽6：Cys-SSLLAYN；
说明:
a.多肽1为15aa肽，对应人EWS-FLI1 type 1融合蛋白位置aa264-278。多肽序列选择恰为人EWS-FLI1 type 1融合蛋白的拼接位置，其中SSSYGQQ序列来自人EWS，PSYDSVR序列来自人FLI1，中间N为拼接位点。多肽序列在N端人为添加一个Cys（半胱氨酸）用于抗原偶联。人EWS-FLI1 type 1融合蛋白信息如图1所示。
b.多肽2为7aa肽，对应融合前人EWS融合蛋白aa258-264，对应多肽1的N端序列，并在多肽2的C端人为添加一个Cys（半胱氨酸）用于抗原偶联。人EWS蛋白信息如图2所示。
c.多肽3为7aa肽，对应融合前人FLI1融合蛋白aa220-226，对应多肽1的C端序列，并在多肽3的N端人为添加一个Cys（半胱氨酸）用于抗原偶联。人FLI1蛋白信息如图3所示。
d.多肽4为14aa肽，对应人EWS-FLI1 type 2融合蛋白位置aa264-278。多肽序列选择恰为人EWS-FLI1 type 2融合蛋白的拼接位置，其中SSSYGQQ序列来自人EWS，SSLLAYN序列来自人FLI1。多肽序列在N端人为添加一个Cys（半胱氨酸）用于抗原偶联。人EWS-FLI1type 2融合蛋白信息如图4所示。
e.多肽5序列同多肽 2，对应多肽4的N端序列。
f.多肽6为7aa肽，对应融合前人FLI1融合蛋白aa197-203，对应多肽4的C端序列，并在多肽6的N端人为添加一个Cys（半胱氨酸）用于抗原偶联。人FLI1蛋白信息如图3所示。
g.其中多肽2与多肽3，多肽5与多肽6的Cys（半胱氨酸）添加在多肽上的位置不同，以便于抗体纯化。
2) 多肽合成：多肽纯度≥85%，分子量正确。通常在免疫实验中，对多肽纯度的要求可以降低至70%。
3) 抗原制备：将多肽1、多肽4分别与KLH偶联，偶联物作为抗原用于免疫动物。KLH使用琥珀酰亚胺基4-[N-马来酰亚胺甲基]环己烷-1-羧化物（SMCC）双功能偶联剂预先活化成KLH-SMCC，通过Cys（半胱氨酸）与多肽1相联接。
4)免疫：选用新西兰兔，每只兔子以300μg剂量进行基础免疫，以后每隔21天进行一次加强免疫，在经过三次加强免疫后，再经7天，取血样，对血清进行ELISA检测。收集经ELISA检测阳性的兔子血清。
5)抗体纯化：
a. 组1层析柱制备：多肽与胶的剂量按2mg：2mg，将多肽1、多肽2与多肽3分别偶联在预先活化好的巯基琼脂糖凝胶(sulfolink-Gel)上，制备一组共三根亲和层析柱。
b. 组1纯化：
血清按10：1体积比例加入1 M Tris·HCl pH7.5 缓冲液调节pH值，再用0.45μm膜过滤。处理过血清再与多肽1偶联的层析柱室温下混匀反应2小时。用10mM PBS pH7.4清洗层析柱后，再用100 mM 甘氨酸(glycine) pH2.8缓冲液洗脱，收集OD280≥0.2部分洗脱液。收集液立即用 1M Tris·HCl pH7.5缓冲液调节pH。
将收集液与多肽2偶联的层析柱室温下混匀反应2小时，收集穿透液，此步骤可以重复1到3次，直至穿透液被多肽2抗原吸收完全。
再将经多肽2纯化过的收集液与多肽3偶联的层析柱室温下混匀反应2小时，收集穿透液，此步骤可以重复1到3次，直至穿透液被多肽3抗原吸收完全。
穿透液含有纯化组1目标抗体。
组2的层析柱制备与纯化的步骤与组1类似，不同的是多肽1，2，3对应换成多肽4，5，6，最后得到纯化组2目标抗体。具体操作是：
c. 组2的层析柱制备：多肽与胶的剂量按2mg：2mg，将多肽4、多肽5与多肽6分别偶联在预先活化好的巯基琼脂糖凝胶上，制备一组共三根亲和层析柱；
d. 组2的纯化：
血清按10：1体积比例加入1 M Tris·HCl pH7.5 缓冲液调节pH值，再用0.45μm膜过滤；处理过血清再与多肽4偶联的层析柱室温下混匀反应2小时；用10mM PBS pH7.4清洗层析柱后，再用100 mM 甘氨酸pH2.8缓冲液洗脱，收集OD280≥0.2部分洗脱液；收集液立即用1M Tris·HCl pH7.5缓冲液调节pH；
将收集液与多肽5偶联的层析柱室温下混匀反应2小时，收集穿透液，此步骤重复1到3次，直至穿透液被多肽5抗原吸收完全；
再将经多肽5纯化过的收集液与多肽6偶联的层析柱室温下混匀反应2小时，收集穿透液，此步骤重复1到3次，直至穿透液被多肽6抗原吸收完全；
穿透液含有纯化组2目标抗体。
6）浓缩：将纯化好的穿透液浓缩成特定浓度目标抗体浓液，通常1mg/ml以上。可根据各种应用的需要调制相应浓度。
7）抗体鉴定：制备的目标抗体经过酶联免疫法（ELISA）、斑点杂交法（Dot-Blot）法鉴定，证明组1目标抗体只对多肽1有特异反应，对其它多肽均无反应。组2目标抗体只对多肽4有特异反应，对其它多肽均无反应。检测方法如下：
a. 间接酶联免疫法（ELISA）：将所设计的多肽分别偶联BSA的偶联物同作为检测抗原。以5μg/ml，每孔100μl包被96孔板。经间接ELISA检测，证明组1目标抗体只对多肽1有极强反应，对其它多肽均无反应。组2目标抗体只对多肽4有极强反应，对其它多肽均无反应。结果如图5所示。
b．斑点杂交法（Dot-Blot）：将多肽与BSA的偶联物作为检测抗原。经Dot-Blot法检测，证明组1目标抗体只对多肽1有极强反应，对其它多肽均无反应。组2目标抗体只对多肽4有极强反应，对其它多肽均无反应。结果如图6所示。
B、免疫；通常选用BALB/c小鼠以10μg/只的剂量进行基础免疫，以后每隔21天进行一次加强免疫，在经过三次加强免疫后，再经3天，取血样，对血清进行ELISA检测。
C、细胞融合：取经ELISA检测阳性血清的小鼠，取小鼠脾细胞，与小鼠骨髓瘤细胞SP20进行融合，制备杂交瘤细胞。
D、选择培养：将杂交瘤细胞用96孔板铺板培养，再加选择培养基进行选择培养。
E、筛选克隆：对杂交瘤细胞进行筛选，使杂交瘤细胞克隆化，形成单克隆细胞株。
F、单克隆抗体的鉴定：
a. 间接酶联免疫法（ELISA）：将多肽分别偶联BSA，偶联物作为检测抗原。单克隆抗体采用间接ELISA检测，对多肽1有反应，对其它多肽无反应的抗体即为EWS-FLI1 type 1抗体；对多肽4有反应，对其它多肽无反应的抗体即为EWS-FLI1 type 2抗体。
b．斑点杂交法（Dot-Blot）：采用多肽与BSA的偶联物作为检测抗原。单克隆抗体经Dot-Blot法检测，对多肽1有反应，对其它多肽无反应的抗体即为EWS-FLI1 type 1抗体；对多肽4有反应，对其它多肽无反应的抗体即为EWS-FLI1 type 2抗体。
本发明专利的方法可以应用于各种特异性融合蛋白抗体的制备。具体为依据本发明中的方法，选择融合蛋白拼接位置左右两端的序列进行多肽设计，再根据本发明中多肽合成，抗原制备，免疫，ELISA检测，收集血清步骤，再根据本发明中纯化原理与方法，采用设计的多肽分别制备的亲和柱进行亲和层析，得到目标抗体。
本发明专利制备产生的抗体，采用但不限于以下多种免疫学检测方法进行应用。结果可以用于定性或定量实验，用于科研或诊断用途。
1)夹心酶联免疫法（ELISA）
采用本发明专利制备产生的抗体，再选取人EWS-FLI1融合蛋白或EWS蛋白或FLI1蛋白抗体进行配对，形成一对夹心ELISA抗体。可以应用于尤文肉瘤相关细胞或组织的裂解液，细胞培养液，患者血样及体液等样品进行夹心ELISA检测。
2) 免疫印迹法（WB）
采用本发明专利制备产生的抗体，可以应用于尤文肉瘤相关细胞或组织的裂解液，表达蛋白等样品进行免疫印迹法（WB）检测。
3) 免疫组化法（IHC）
采用本发明专利制备产生的抗体，可以应用于尤文肉瘤相关细胞或组织进行免疫组化法（IHC）检测。
4) 免疫沉淀法（IP）
采用本发明专利制备产生的抗体，可以应用于尤文肉瘤相关细胞或组织，患者血样及体液进行免疫沉淀法（IP）检测。
5) 免疫荧光法（IF）
采用本发明专利制备产生的抗体，通过直接荧光标记，或通过荧光标记二抗法，可以应用于尤文肉瘤相关细胞或组织，患者血样及体液进行免疫荧光法（IF）检测。
6) 流式细胞术（FCM）
采用本发明专利制备产生的抗体，通过流式细胞术（FCM），可以应用于尤文肉瘤相关细胞或组织，患者血样及体液进行检测。
Claims (9)
1.一种特异性人EWS-FLI1融合蛋白抗体的制备方法，其特征在于，步骤如下：
多肽设计， 设计两组多肽序列，每组共三条，分别为：
组1：多肽1：Cys-SSSYGQQNPSYDSVR；多肽2：SSSYGQQ-Cys；多肽3：Cys-PSYDSVR；
组2：多肽4：Cys-SSSYGQQSSLLAYN；多肽5：同多肽2；多肽6：Cys-SSLLAYN；
多肽合成：多肽纯度≥70%；
抗原制备：将多肽1与多肽4分别与KLH偶联，偶联物作为抗原用于免疫动物；KLH使用琥珀酰亚胺基4-[N-马来酰亚胺甲基]环己烷-1-羧化物双功能偶联剂预先活化成KLH-SMCC，通过半胱氨酸与多肽1相联接；
免疫：选用新西兰兔，每只兔子以300μg剂量进行基础免疫，以后每隔21天进行一次加强免疫，在经过三次加强免疫后，再经7天，取血样，对血清进行ELISA检测；收集经ELISA检测阳性的兔子血清；
抗体纯化；
浓缩：将纯化好的穿透液浓缩成特定浓度目标抗体浓液，1mg/ml以上；
7）抗体鉴定：制备的目标抗体经过酶联免疫法、斑点杂交法法鉴定，证明组1目标抗体只对多肽1有特异反应，对其它多肽均无反应；组2目标抗体只对多肽4有特异反应，对其它多肽均无反应。
2.根据权利要求1所述的特异性人EWS-FLI1融合蛋白抗体的制备方法，其特征在于，步骤1）所述的多肽具有以下特征：
a) 多肽1为15aa肽，对应人EWS-FLI1 type 1融合蛋白位置aa264-278；多肽序列选择恰为人EWS-FLI1 type 1融合蛋白的拼接位置，其中SSSYGQQ序列来自人EWS，PSYDSVR序列来自人FLI1，中间N为拼接位点；多肽序列在N端人为添加一个半胱氨酸用于抗原偶联；
b) 多肽2为7aa肽，对应融合前人EWS融合蛋白aa258-264，对应多肽1的N端序列，并在多肽2的C端人为添加一个半胱氨酸用于抗原偶联；
多肽3为7aa肽，对应融合前人FLI1融合蛋白aa220-226，对应多肽1的C端序列，并在多肽3的N端人为添加一个半胱氨酸用于抗原偶联；
多肽4为14aa肽，对应人EWS-FLI1 type 2融合蛋白位置aa264-278；多肽序列选择恰为人EWS-FLI1 type 2融合蛋白的拼接位置，其中SSSYGQQ序列来自人EWS，SSLLAYN序列来自人FLI1；多肽序列在N端人为添加一个半胱氨酸用于抗原偶联；
多肽5序列同多肽 2，对应多肽4的N端序列；
多肽6为7aa肽，对应融合前人FLI1融合蛋白aa197-203，对应多肽4的C端序列，并在多肽6的N端人为添加一个半胱氨酸用于抗原偶联。
3.根据权利要求1所述的特异性人EWS-FLI1融合蛋白抗体的制备方法，其特征在于，所述多肽2与多肽3，多肽5与多肽6的半胱氨酸添加在多肽上的位置不同，以便于抗体纯化。
4.根据权利要求1所述的特异性人EWS-FLI1融合蛋白抗体的制备方法，其特征在于，步骤2) 所合成的多肽纯度≥85%，分子量正确。
5.根据权利要求1所述的特异性人EWS-FLI1融合蛋白抗体的制备方法，其特征在于，步骤5）所述的抗体纯化具体操作方法是：
a. 组1层析柱制备：多肽与胶的剂量按2mg：2mg，将多肽1、多肽2与多肽3分别偶联在预先活化好的巯基琼脂糖凝胶上，制备一组共三根亲和层析柱；
b. 组1纯化：血清按10：1体积比例加入1 M Tris·HCl pH7.5 缓冲液调节pH值，再用0.45μm膜过滤；处理过血清再与多肽1偶联的层析柱室温下混匀反应2小时；用10mM PBSpH7.4清洗层析柱后，再用100 mM 甘氨酸pH2.8缓冲液洗脱，收集OD280≥0.2部分洗脱液；收集液立即用 1M Tris·HCl pH7.5缓冲液调节pH；
将收集液与多肽2偶联的层析柱室温下混匀反应2小时，收集穿透液，此步骤重复1到3次，直至穿透液被多肽2抗原吸收完全；
再将经多肽2纯化过的收集液与多肽3偶联的层析柱室温下混匀反应2小时，收集穿透液，此步骤重复1到3次，直至穿透液被多肽3抗原吸收完全；
穿透液含有纯化组1目标抗体；
c. 组2的层析柱制备：多肽与胶的剂量按2mg：2mg，将多肽4、多肽5与多肽6分别偶联在预先活化好的巯基琼脂糖凝胶上，制备一组共三根亲和层析柱；
d. 组2的纯化：
血清按10：1体积比例加入1 M Tris·HCl pH7.5 缓冲液调节pH值，再用0.45μm膜过滤；处理过血清再与多肽4偶联的层析柱室温下混匀反应2小时；用10mM PBS pH7.4清洗层析柱后，再用100 mM 甘氨酸pH2.8缓冲液洗脱，收集OD280≥0.2部分洗脱液；收集液立即用1M Tris·HCl pH7.5缓冲液调节pH；
将收集液与多肽5偶联的层析柱室温下混匀反应2小时，收集穿透液，此步骤重复1到3次，直至穿透液被多肽5抗原吸收完全；
再将经多肽5纯化过的收集液与多肽6偶联的层析柱室温下混匀反应2小时，收集穿透液，此步骤重复1到3次，直至穿透液被多肽6抗原吸收完全；
穿透液含有纯化组2目标抗体。
6.根据权利要求1-5之一所述的特异性人EWS-FLI1融合蛋白抗体的制备方法，其特征在于，7）抗体鉴定中检测方法如下：
a. 间接酶联免疫法：将所设计的多肽分别偶联BSA的偶联物同作为检测抗原；以5μg/ml，每孔100μl包被96孔板；经间接ELISA检测，证明组1目标抗体只对多肽1有极强反应，对其它多肽均无反应；组2目标抗体只对多肽4有极强反应，对其它多肽均无反应；
b．斑点杂交法：将多肽与BSA的偶联物作为检测抗原；经Dot-Blot法检测，证明组1目标抗体只对多肽1有极强反应，对其它多肽均无反应；组2目标抗体只对多肽4有极强反应，对其它多肽均无反应。
7.权利要求1所述的特异性人EWS-FLI1融合蛋白抗体的制备方法所制备的特异性人EWS-FLI1融合蛋白抗体在制备恶性肿瘤--尤文肉瘤诊断抗体试剂中的应用。
8.权利要求1所述的特异性人EWS-FLI1融合蛋白抗体的制备方法所制备的特异性人EWS-FLI1融合蛋白抗体在制备恶性肿瘤--尤文肉瘤诊断抗体试剂中的应用，其特征在于，其中单克隆抗体的鉴定方法是：
a. 间接酶联免疫法：将所设计的多肽分别偶联BSA，偶联物作为检测抗原；单克隆抗体采用间接ELISA检测，对多肽1有反应，对其它多肽无反应的抗体即为EWS-FLI1 type 1抗体；对多肽4有反应，对其它多肽无反应的抗体即为EWS-FLI1 type 2抗体；
b．斑点杂交法：采用多肽与BSA的偶联物作为检测抗原；单克隆抗体经Dot-Blot法检测，对多肽1有反应，对其它多肽无反应的抗体即为EWS-FLI1 type 1抗体；对多肽4有反应，对其它多肽无反应的抗体即为EWS-FLI1 type 2抗体。
9.权利要求7或8所述的特异性人EWS-FLI1融合蛋白抗体的制备方法所制备的特异性人EWS-FLI1融合蛋白抗体在制备恶性肿瘤--尤文肉瘤诊断抗体试剂中的应用，其特征在于，用于定性或定量实验，用于科研或诊断用途；所述的应用为以下应用方法之一：
1)夹心酶联免疫法：
采用本发明专利制备产生的抗体，再选取人EWS-FLI1融合蛋白或EWS蛋白或FLI1蛋白抗体进行配对，形成一对夹心ELISA抗体；应用于尤文肉瘤相关细胞或组织的裂解液，细胞培养液，患者血样及体液等样品进行夹心ELISA检测；
2) 免疫印迹法：
采用本发明专利制备产生的抗体，应用于尤文肉瘤相关细胞或组织的裂解液，表达蛋白等样品进行免疫印迹法检测；
3) 免疫组化法：
采用本发明专利制备产生的抗体，应用于尤文肉瘤相关细胞或组织进行免疫组化法检测；
4) 免疫沉淀法：
采用本发明专利制备产生的抗体，应用于尤文肉瘤相关细胞或组织，患者血样及体液进行免疫沉淀法检测；
5) 免疫荧光法：
采用本发明专利制备产生的抗体，通过直接荧光标记，或通过荧光标记二抗法，应用于尤文肉瘤相关细胞或组织，患者血样及体液进行免疫荧光法检测；
6) 流式细胞术：
采用本发明专利制备产生的抗体，通过流式细胞术，应用于尤文肉瘤相关细胞或组织，患者血样及体液进行检测。
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