DE60131982T2

DE60131982T2 - Veränderte borrelia burgdorferi ospa

Info

Publication number: DE60131982T2
Application number: DE60131982T
Authority: DE
Inventors: Benjamin J. East Setauket LUFT; John J. Bellport DUNN; Catherine I. Pisacataway LAWSON; Shohei Chicago KOIDE
Original assignee: Brookhaven Science Associates LLC; University of Rochester; Research Foundation of the State University of New York
Current assignee: Brookhaven Science Associates LLC; University of Rochester; Research Foundation of the State University of New York
Priority date: 2000-08-18
Filing date: 2001-08-17
Publication date: 2008-12-11
Anticipated expiration: 2021-08-18
Also published as: DE60131982D1; US20090326200A1; EP1311540B1; ATE381575T1; US8992936B2; WO2002016421A8; WO2002016421A9; US20040023325A1; EP1311540A2; PT1311540E; DK1311540T3; AU2001285049A1; US20140030285A1; WO2002016421A2; ES2298249T3; US8680236B2; WO2002016421A3

Description

VERWANDTE ANMELDUNGEN
Diese Anmeldung beansprucht die Rechte der am 18. August 2000 eingereichten U. S. Provisional Application No. 60/226,484 , deren Lehre hiermit vollständig als Referenz einbezogen wird.
UNTERSTÜTZUNG DURCH DIE REGIERUNG
Die Erfindung wurde ganz oder teilweise mit der Konzession 2R01A137256-05A1 vom National Institute of Allergy and Infectious Diseases unterstützt. Die Regierung besitzt bestimmte Rechte an der Erfindung.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Die Lyme-Krankheit (Lyme Borreliosis) ist in Nordamerika und Europa die häufigste von Zecken herrührende Infektionskrankheit und war auch in Russland, Japan, China und Australien anzutreffen. Die Lyme-Krankheit nimmt ihren Anfang an der Stelle eines Zeckenbisses und ruft dort eine Primärinfektion hervor, welche sich im Organismus im Verlauf der Infektion zu Sekundärstellen ausbreitet. Der diese Krankheit auslösende bakterielle Krankheitserreger ist die Spirochäte Borrelia burgdorferi, die zum ersten Mal im Jahre 1982 isoliert und kultiviert wurde (Burgdorferi, W. A. et al., Science 216: 1317–1319 (1982); Steere, A. R. et al., N. Engl. J. Med. 308: 733–740 (1983)).
Es sind drei pathogene Genospezies von Borrelia beschrieben worden, B. burgdorferi sensu stricto (B. burgdorferi oder B. b. s. s.), B. afzelii und B. garinii (Baranton, G. et al., Int. J. Syst. Bacteriol. 42: 378–383 (1992)). Diese sind Mitglieder eines Spezies-Komplexes B. burgdorferi sensu lato, welcher mindestens aus 10 unterschiedlichen Genspezies besteht (Piken, R. N. et al., J. Invest. Dermatol., 110: 211–214 (1998); Postic, D. et al., Int. J. Syst. Bacteriol. 44: 743–752 (1994); Valsangiacomo, C. T. et al., Int. J. Syst. Bacteriol. 47: 1–10 (1997)). Die drei Genspezies B. burgdorferi sensu stricto, B. afzelii und B. garinii werden alle als pathogen angesehen und sind in Europa anzutreffen.
B. burgdorferi weist eine äußere Membran auf, deren Hauptproteinbausteine die äußeren Oberflächeproteine A und B (OspA und OspB) sind. OspA ist ein basisches Lipoprotein von ungefähr 31 kD, welches zusammen mit OspB, einem basischen Lipoprotein von ungefähr 34 kD, auf einem großen linearen Plasmid codiert wird (Szcepanski, A. und J. L. Benach, Microbiol. Rev. 55: 21 (1991)). Die Immunantwort gegen diese Proteine auf der äußeren Oberfläche neigt dazu, wenn überhaupt, zu einem späten Zeitpunkt der Krankheit in Erscheinung zu treten (Craft, J. E. et al., J. Clin. Invest. 78: 934–939 (1986); Dattwyler, R. J. und B. J. Luft; Rheum. Clin. North Am. 15: 727–734 (1989)). Darüber hinaus reagieren mit B. burgdorferi akut und chronisch infizierte Patienten unterschiedlich auf die verschiedenen Antigene, einschließlich OspA, OspB, OspC, OspD, p39, p41 und p93.
Derzeit wird die Lyme-Krankheit mit einer Reihe von Antibiotika behandelt, z. B. mit Tetracyclinen, Penicillin und Cephalosporinen. Eine derartige Behandlung ist jedoch bei der Beseitigung der Infektion nicht immer erfolgreich. Die Behandlung wird in Folge einer Fehldiagnose oft verzögert, was die nachteilige Wirkung zur Folge hat, dass die Infektion bis zu einem chronischen Zustand fortschreitet, bei dem eine Behandlung mit Antibiotika oft nutzlos ist. Einer der Faktoren, die zu einer verzögerten Behandlung beitragen, ist das Fehlen wirksamer diagnostischer Mittel.
Es ist versucht worden, Impfstoffe gegen die Lyme-Borreliosis herzustellen. Ein Impfstoff jedoch, der aus rekombinantem OspA besteht, kann häufige Booster-Immunisierungen erfordern. Eine zusätzliche Sache von auf OspA basierenden Impfstoffen ist die kürzliche Identifizierung einer vermeintlichen autoreaktiven OspA-Domäne mit einem hohen Grad an Ähnlichkeit mit einer Region des humanen-Leukozyten-Funktion-assoziierten Antigens-1 (hLFA-1) (Gross, D. M. et al., Science, 281: 703–706 (1998)).
Es sollte daher von Vorteil sein, modifizierte OspA-Proteine mit herabgesetzter Kreuzreaktivität gegen hLFA-1 zu entwickeln, um mögliche Nebenwirkungen eines OspA-Impfstoffs zurückzudrängen. Die Entwicklung von OspA-Proteinen mit verminderter Kreuzreaktivität gegen hLFA-1, welche die Immunreaktivität gegen mehr als ein Mitglied des Borrelia-Komplexes beibehalten oder sie steigern, wäre ebenfalls erwünscht. Um als Impfstoff von Nutzen zu sein, muss die Konformation dieser modifizierten Proteine ausreichend stabil sein, um bestimmte strukturelle Merkmale des OspA beizubehalten, die benötigt werden, um eine schützende Immunantwort auszulösen. OspA-Proteine mit diesen Merkmalen würden eine Verbesserung bei der Diagnose und/oder Impfung gegen alle oder die meisten Borrelia-Stämme gestatten, welche die Lyme-Krankheit auslösen.
Eine Analyse des Immunzustands von mit OspA immunisierten Individuen ergab, dass man mit der gesamten quantitativen Immunantwort einen Schutz nicht voraussagen kann, sondern dass eher die Reaktivität mit einem spezifischen Epitop des OspA-Lipoproteins direkt mit einer schützenden Immunität korreliert ist. Der monoklonale Anti-OspA-Antikörper LA-2 (Kramer et al., 1990) definiert ein Epitop des Lipoproteins, das offensichtlich für eine schützende Immunität nach einer OspA-Impfung benötigt wird. Beispielsweise führt eine passive Immunisierung von Mäusen mit diesem Antikörper zum Schutz gegen eine Infektion durch die Spirochäte (Schaible et al., 1993). Darüber hinaus sagt eine Immunisierung von Mäusen und Hunden mit OspA, die zu signifikanten Titern von LA-2 äquivalenten Serumantikörpern führt, genau den Schutz vor einer durch Zecken übertragenen Infektion voraus (Golde, 1997). Ungenügende Konzentrationen von LA-2 äquivalenten Antikörpern haben trotz hoher Titer von Serumantikörpern gegen OspA das Ausbleiben eines Schutzes zur Folge (Johnson et al., 1995).
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung ist auf veränderte Formen des OspA aus Borrelia burgdorferi gerichtet, welche eine erhöhte Konformationsstabilität aufweisen, während mindestens ein Teil der Antigenizität des Wildtyp-OspA beibehalten wird. In einigen Ausführungsformen weist das veränderte OspA-Polypeptid im Vergleich mit dem entsprechenden nicht veränderten OspA-Polypeptid eine verminderte Kreuzreaktivität mit hLFA-1 auf. Die veränderten OspA-Polypeptide können fast das gesamte oder nur einen Teil des nativen OspA- Polypeptids umfassen. In einigen Ausführungsformen kann das veränderte Polypeptid Teil eines Cocktails sein, welcher eines oder mehrere andere Proteine wie z. B. andere Polypeptide von Borrelia burgdorferi enthält, einschließlich OspA, OspB, OspC, OspD, p93 und p41. In anderen Ausführungsformen kann das veränderte OspA-Polypeptid Teil eines chimären Proteins sein, wie z. B. die in dem US-Patent 6,248,562 beschriebenen, dessen gesamte Lehre hiermit als Referenz einbezogen wird.
Die veränderten OspA-Polypeptide der vorliegenden Erfindung umfassen eine Aminosäuresequenz des OspA-Proteins aus Borrelia burgdorferi von etwa dem Rest 139 bis zu etwa dem Rest 273, wobei die Sequenz alle Veränderungen umfasst, die ausgewählt sind aus der Gruppe: Rest 139 verändert zu Methionin, Rest 160 verändert zu Tyrosin, Rest 189 verändert zu Methionin und Kombinationen derselben. In anderen Ausführungsformen umfassen die veränderten OspA-Polypeptide der vorliegenden Erfindung eine Aminosäuresequenz des OspA-Proteins aus Borrelia burgdorferi von etwa dem Rest 131 bis zu etwa dem Rest 273 oder von etwa dem Rest 17 bis zu etwa dem Rest 273. Die Nummerierung der Reste entspricht der der Nummerierung der SEQ ID NO: 7 (OspA aus B31).
Die Polypeptide der vorliegenden Erfindung umfassen Polypeptide, die ausgewählt sind aus der Gruppe: SEQ ID NO: 104 und 116.
Die vorliegende Erfindung ist auch auf Polynucleotide gerichtet, welche die hier beschriebenen Aninosäuresequenzen codieren, wie z. B. Polynucleotide, die OspA-Polypeptide aus Borrelia burgdorferi ab etwa dem Rest 131 bis zu etwa dem Rest 273 codieren, wobei die Sequenzen alle Veränderungen codieren, die ausgewählt sind aus der Gruppe: Codon 139 codiert Methionin, Codon 160 codiert Tyrosin, Codon 189 codiert Methionin und Kombinationen derselben. Die die OspA-Polypeptide der vorliegenden Erfindung codierenden Polynucleotide können längere oder kürzere Fragmente des OspA-Proteins codieren. Die Nummerierung der Reste entspricht der Nummerierung der SEQ ID NO: 7.
Die Polynucleotide der vorliegenden Erfindung umfassen Polynucleotide, die ausgewählt sind aus der Gruppe: SEQ ID NO: 103 und 115.
Die vorliegende Erfindung ist auch auf ein Verfahren zur Gewinnung eines veränderten OspA-Polypeptids aus Borrelia burgdorferi mit im Vergleich zu dem entsprechenden nicht veränderten OspA-Polypeptid aus Borrelia burgdorferi erhöhter Konformationsstabilität gerichtet. Das Verfahren umfasst die Auswahl eines Polynucleotids, das ein die Reste 139, 160 und 189 umfassendes OspA-Polypeptid von Borrelia burgdorferi codiert, wobei die Nummerierung der Nummerierung der SEQ ID NO: 7 entspricht. Das Polynucleotid wird so verändert, dass die folgenden Veränderungen vorkommen: Rest 139 ist verändert zu Methionin, Rest 160 ist verändert zu Tyrosin, Rest 189 ist verändert zu Methionin. Das veränderte Polynucleotid wird exprimiert, wodurch ein verändertes OspA-Polypeptid aus Borrelia burgdorferi mit im Vergleich zu dem entsprechenden nicht veränderten OspA-Polypeptid von Borrelia burgdorferi erhöhter Konformationsstabilität erzeugt wird.
Die vorliegende Erfindung ist auch auf einen Expressionsvektor gerichtet, der eine ein verändertes OspA-Protein von Borrelia codierende isolierte DNA umfasst. Die vorliegende Erfindung umfasst auch eine Wirtszelle, welche eine rekombinante Nucleinsäure umfasst, die wie hier beschrieben ein verändertes OspA-Protein codiert.
Die vorliegende Erfindung ist auch auf ein Verfahren zur Verabreichung der hier beschriebenen veränderten OspA-Polypeptide von Borrelia gerichtet. In einer Ausführungsform umfasst das Verfahren die Verabreichung des veränderten OspA-Polypeptids in einem physiologisch verträglichen Träger an ein Individuum. Als Ergebnis der Verabreichung des veränderten OspA-Proteins entwickelt das Individuum zumindest eine schwache Immunreaktion gegen das Protein. Beispielsweise erzeugt das Individuum eine humorale Immunantwort, wobei von dem Individuum Antikörper produziert werden, welche mindestens einen Abschnitt des Polypeptids erkennen. In einer bevorzugten Ausführungsform erzeugt das Individuum eine schützende Immunantwort, indem z. B. Antikörper erzeugt werden, die das LA-2-Epitop erkennen.
Die vorliegende Erfindung kann auch in einem Verfahren zur Verabreichung einer Nucleinsäure eingesetzt werden, welche ein hier beschriebenes OspA-Polypeptid codiert. In einer Ausführungsform umfasst das Verfahren die Verabreichung der Nucleinsäure in einem physiologisch verträglichen Träger an ein Individuum. Als Ergebnis der Verabreichung der Nucleinsäure wird das veränderte OspA-Polypeptid zumindest vorübergehend exprimiert und das Individuum entwickelt zumindest eine schwache Immunantwort, vorzugsweise eine schützende Immunantwort, gegen das von der Nucleinsäure codierte OspA-Protein. Beispielsweise erzeugt das Individuum eine humorale Immunantwort, wo bei von dem Individuum Antikörper produziert werden, welche mindestens einen Abschnitt des von der Nucleinsäure produzierten veränderten OspA-Polypeptids erkennen. In einer bevorzugten Ausführungsform erzeugt das Individuum eine schützende Immunantwort, indem z. B. Antikörper erzeugt werden, die das LA-2-Epitop erkennen.
Die Erfindung umfasst auch Verfahren zur Verwendung der hier beschriebenen Proteine in diagnostischen Assays. In einer Ausführungsform kann das Verfahren zum Nachweis des Vorkommens von OspA-spezifischen Antikörpern in einer in Frage kommenden Probe eines Wirts benutzt werden. Das Verfahren umfasst das in Kontakt Bringen einer in Frage kommenden Probe eines Wirts mit dem veränderten Protein unter Bedingungen, bei welchen sich die Antikörper, falls welche in der Probe des Wirts enthalten sind, an das veränderte Protein binden und Antigen-Antikörper-Komplexe bilden. Die Antigen-Antikörper-Komplexe werden dann mit Hilfe von im Stand der Technik bekannten Verfahren nachgewiesen.
Die vorliegende Erfindung kann einen diagnostischen Kit bilden, welcher die hier beschriebenen veränderten Polypeptide umfasst. Der Kit umfasst ein wie hier beschriebenes verändertes OspA-Protein von Borrelia burgdorferi. Der Kit enthält auch Reagenzien zum Nachweis von Antigen-Antikörper-Komplexen, die zwischen dem veränderten OspA-Protein und Antikörpern gebildet werden, welche in der vom Anwender zur Verfügung gestellten Probe eines Wirts vorkommen.
Als Ergebnis der vorliegenden Erfindung stehen zur Verwendung in der Forschung, in Impfstoffen und/oder diagnostischen Assays OspA-Proteine oder Fragmente derselben zur Verfügung, welche entweder eine erhöhte Konformationsstabilität aufweisen, während mindestens eine schwache Antigenizität beibehalten wird, oder sie verfügen über eine verminderte Kreuzreaktivität mit hLFA-1. Ferner stehen als Ergebnis der vorliegenden Erfindung Nucleinsäuren für die Forschung und für Impfstoffe zur Verfügung, welche OspA-Polypeptide mit verminderter Kreuzreaktivität mit hLFA-1 codieren. Man erwartet, dass die veränderten OspA-Polypeptide der vorliegenden Erfindung verbesserte Impfstoffe mit weniger Nebenwirkungen gestatten.
Für ein besseres Verständnis der vorliegenden Erfindung zusammen mit anderen weiteren Gegenständen wird auf die folgende Beschreibung zusammen mit den beigefügten Zeichnungen Bezug genommen.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 fasst die mittels proteolytischer und chemischer Fragmentierung von OspA lokalisierten Peptide und antigenen Domänen zusammen.
2 ist ein Vergleich der in 1 wiedergegebenen antigenen Domänen für OspA in neun Stämmen von B. burgdorferi.
3 ist eine graphische Darstellung, in welcher für 14 OspA-Varianten der gewichtete Polymorphismus gegen die Aminosäure-Position aufgetragen ist. Die gekennzeichneten Peaks sind: a) die Aminosäuren 132-145; b) die Aminosäuren 163-177; c) die Aminosäuren 208-221. Die untere Linie beim Polymorphismus-Wert 1,395 bezeichnet statistisch signifikante Überschüsse an Polymorphismus bei p = 0,05. Die obere Linie beim Polymorphismus-Wert 1,520 ist die gleiche mit der Ausnahme, dass die ersten 29 Aminosäuren des monomorphen N-Terminus aus den ursprünglichen Analysen entfernt worden sind.
4 zeigt das Aminosäure-Alignment der Reste 200 bis 220 für OspAs aus den Stämmen B31 und K48 sowie für die ortsgerichteten Mutanten 613, 625, 640, 613/625 und 613/640. Der Pfeil zeigt Trp216. Die Aminosäure-Änderungen sind unterstrichen.
5 zeigt einen phylogenetischen Baum für die in Tabelle I beschriebenen Stämme von Borrelia. Die Stämme sind wie folgt: 1 = B31; 2 = pKa1; 3 = ZS7; 4 = N40; 5 = 25015; 6 = K48; 7 = DK29; 8 = PHei; 9 = Ip90; 10 = PTrob; 11 = ACAI; 12 = PGau; 13 = Ip3; 14 = PBo: 15 = PKo.
Die 6A und 6B zeigen die Nucleinsäuresequenz von OspA-B31 (SEQ ID NO: 6) sowie die codierte Proteinsequenz (SEQ ID NO: 7).
Die 7A, 7B und 7C zeigen die Nucleinsäuresequenz von OspA-K48 (SEQ ID NO: 8) sowie die codierte Proteinsequenz (SEQ ID NO: 9).
Die 8A, 8B und 8C zeigen die Nucleinsäuresequenz von OspA-PGau (SEQ ID NO: 10) sowie die codierte Proteinsequenz (SEQ ID NO: 11).
Die 9A und 9B zeigen die Nucleinsäuresequenz eines Abschnitts eines OspA Gens (SEQ ID NO: 127) sowie dessen codierte Proteinsequenz (SEQ ID NO: 128).
Die 10A, 10B und 10C zeigen die Nucleinsäuresequenz der OspA-K48/OspA-PGau-Chimäre (SEQ ID NO: 28) sowie die codierte chimäre Proteinsequenz (SEQ ID NO: 29).
Die 11A, 11B und 11C zeigen die Nucleinsäuresequenz der OspA-B31/OspA-PGau-Chimäre (SEQ ID NO: 30) sowie die codierte chimäre Proteinsequenz (SEQ ID NO: 31).
Die 12A und 12B zeigen die Nucleinsäuresequenz der OspA-B31/OspA-K48-Chimäre (SEQ ID NO: 32) sowie die codierte chimäre Proteinsequenz (SEQ ID NO: 33).
Die 13A, 13B und 13C zeigen die Nucleinsäuresequenz der OspA-B31/OspA-25015-Chimäre (SEQ ID NO: 34) sowie die codierte chimäre Proteinsequenz (SEQ ID NO: 35).
Die 14A, 14B und 14C zeigen die Nucleinsäuresequenz der OspA-K48/OspA-B31/OspA-K48-Chimäre (SEQ ID NO: 36) sowie die codierte chimäre Proteinsequenz (SEQ ID NO: 37).
Die 15A, 15B und 15C zeigen die Nucleinsäuresequenz der OspA-B31/OspA-K48/OspA-B31/OspA-K48-Chimäre (SEQ ID NO: 38) sowie die codierte chimäre Proteinsequenz (SEQ ID NO: 39).
Die 16A, 16B und 16C zeigen die Nucleinsäuresequenz der OspA-B31/OspA-B31-Chimäre (SEQ ID NO: 40) sowie die codierte chimäre Proteinsequenz (SEQ ID NO: 41).
Die 17A, 17B, 17C, 17D, 17E, 17F, 17G, 17H, 17I, 17J, 17K, 17L, 17M, 17N, 17O und 17P zeigen ein Alignment der Nucleinsäuresequenzen für OspA-B31 (SEQ ID NO. 6), OspA-PKa1 (SEQ ID NO: 42), OspA-N40 (SEQ ID NO: 43), OspA-ZS7 (SEQ ID NO: 44), OspA-25015 (SEQ ID NO: 12), OspA-PTrob (SEQ ID NO: 45), OspA-K48 (SEQ ID NO. 8), OspA-Hei (SEQ ID NO: 46), OspA-DK29 (SEQ ID NO: 21), OspA-Ip90 (SEQ ID NO: 22), OspA-PBo (SEQ ID NO: 23), OspA-Ip3 (SEQ ID NO: 24), OspA-PKo (SEQ ID NO: 25), OspA-ACAI (SEQ ID NO: 26) und OspA-PGau (SEQ ID NO: 10). Nucleinsäuren, die mit denen in der Nucleinsäure-Leadsequenz (hier OspA-B31) identisch sind, sind durch einen Punkt (.) dargestellt; abweichende Nucleinsäuren sind in Kleinbuchstaben wiedergegeben.
Die 18A und 18B zeigen die Nucleinsäuresequenz der OspA-Tro/OspA-Bo-Chimäre (SEQ ID NO: 47), welche die chimäre Proteinsequenz (SEQ ID NO: 48) codiert.
Die 19A und 19B zeigen die Nucleinsäuresequenz der OspA-PGau/OspA-Bo-Chimäre (SEQ ID NO: 49), welche die chimäre Proteinsequenz (SEQ ID NO: 50) codiert.
Die 20A und 20B zeigen die Nucleinsäuresequenz der OspA-B31/OspA-PGau/OspA-B31/OspA-K48-Chimäre (SEQ ID NO: 53), welche die chimäre Proteinsequenz (SEQ ID NO: 54) codiert.
Die 21A und 21B zeigen die Nucleinsäuresequenz der OspA-PGau/OspA-B31/OspA-K48-Chimäre (SEQ ID NO: 51), welche die chimäre Proteinsequenz (SEQ ID NO: 52) codiert.
22 ist ein Balkendiagramm, welches die Reaktivität (gemessen mittels eines ELISA) der Seren aus Mäusen zeigt, die mit dem angegebenen Borrelia-Protein (OspA oder OspC) oder dem rekombinanten chimären Protein (OspC2-OspA) (X-Achse) gegen die angegebenen OspA- oder OspC-Antigene (Legende) aus dem Stamm B31 (Borrelia burgdorferi sensu stricto) immunisiert worden waren.
23 ist ein Balkendiagramm, welches die Reaktivität (gemessen mittels eines ELISA) der Seren aus Mäusen zeigt, die mit dem angegebenen Borrelia-Protein (OspA oder OspC) oder dem rekombinanten chimären Protein (OspC2-OspA) (X-Achse) gegen die angegebenen OspA- oder OspC-Antigene (Legende) aus dem Stamm B31 (Borrelia burgdorferi sensu stricto) immunisiert worden waren. Für die ELISA-Ergebnisse zu dem B31 OspA-Antigen wurde ein gereinigtes Fragment von B31 OspA (Aminosäuren 18–139) im Überschuss den Seren zugesetzt, so dass die nachgewiesene Immunantwort spezifisch für die C-terminale Region des OspA war.
24 ist ein Balkendiagramm, welches die Reaktivität der Seren aus Mäusen zeigt, die mit dem angegebenen chimären Borrelia-Protein (lipOspA/Bo, lipOspAB/P oder OspC-OspAB/P) (X-Achse) gegen die angegebenen OspA-Antigene (Legende) aus den Stämmen B31 (Borrelia burgdorferi sensu stricto), K48 (Borrelia garinii) und PGau (Borrelia afzelii) immunisiert worden waren.
25 ist ein Balkendiagramm, welches die Reaktivität der Seren aus Mäusen zeigt, die mit dem angegebenen chimären Borrelia-Protein (lipOspAP/Bo, lipOspAB/P oder OspC-OspAB/P) (X-Achse) gegen das angegebene OspA (Legende) aus den Stämmen B31 (Borrelia burgdorferi sensu stricto), K48 (Borrelia garinii) und PGau (Borrelia afzelii) immunisiert worden waren. In allen Fällen wurde ein gereinigtes Fragment von B31 OspA (Aminosäuren 18-139) im Überschuss den Seren zugesetzt, so dass die nachgewiesene Immunantwort spezifisch für die C-terminale Region des OspA ist.
26 ist ein Balkendiagramm, welches die Reaktivität der Seren aus Mäusen zeigt, die mit dem angegebenen chimären Borrelia-Protein (OspCB31-OspAB31, OspC2-OspAB31 oder lipOspC-B31) (X-Achse) gegen das angegebene OspC-Antigen (Legende) aus dem Stamm B31 (Borrelia burgdorferi sensu stricto) immunisiert worden waren.
27 ist ein Balkendiagramm, welches die Reaktivität der Seren aus Mäusen zeigt, die mit dem angegebenen chimären Borrelia-Protein (OspCB31-OspAB31, OspC2-OspAB31 oder LipOspAK/T) (X-Achse) gegen die angegebenen OspA-Antigene (Legende) aus den Stämmen B31 (Borrelia burgdorferi sensu stricto), K48 (Borrelia garinii) und PGau (Borrelia afzelii) immunisiert worden waren.
28 ist ein Balkendiagramm, welches die Reaktivität der Seren aus Mäusen zeigt, die mit dem angegebenen chimären Borrelia-Protein (OspCB31-OspAB/P, OspCB31-OspABPBP oder OspCB31-OspAB31) (X-Achse) gegen die angegebenen OspA-Antigene (Legende) aus den Stämmen B31 (Borrelia burgdorferi sensu stricto), K48 (Borrelia garinii) und PGau (Borrelia afzelii) immunisiert worden waren.
29 ist ein Balkendiagramm, welches die Reaktivität der Seren aus Mäusen zeigt, die mit dem angegebenen chimären Borrelia-Protein (OspCB31-OspAB/P, OspCB31-OspABPBP oder OspCB31-OspAB31) (X-Achse) (gegen das angegebene OspA (Legende) aus den Stämmen B31 (Borrelia burgdorferi sensu stricto), K48 (Borrelia garinii) und PGau (Borrelia afzelii) immunisiert worden waren. In allen Fällen wurde ein gereinigtes Fragment von B31 OspA (Aminosäuren 18–139) im Überschuss den Seren zugesetzt, so dass die nachgewiesene Immunantwort spezifisch für die C-terminale Region des OspA ist.
Die 30A, 30B und 30C zeigen die Nucleinsäuresequenz der OspC-B31 (bp 55-633)/OspA-B31 (bp 52-822)-Chimäre (SEQ ID NO: 55) und die codierte chimäre Proteinsequenz (SEQ ID NO: 56).
Die 31A, 31B und 31C zeigen die Nucleinsäuresequenz der OspC-B31 (bp 55-624)/OspA-B31 (bp 52-822)-Chimäre (SEQ ID NO: 57) und die codierte chimäre Proteinsequenz (SEQ ID NO: 58).
Die 32A, 32B und 32C zeigen die Nucleinsäuresequenz der OspC-C2 (bp 55-612)/OspA-B31 (bp 52-822)-Chimäre (SEQ ID NO: 59) und die codierte chimäre Proteinsequenz (SEQ ID NO: 60).
Die 33A, 33B und 33C zeigen die Nucleinsäuresequenz der OspC-B31 (bp 55-633)/OspA-B31 (bp 52-651)/OspA-K48 (bp 652-820)-Chimäre (SEQ ID NO: 61) und die codierte chimäre Proteinsequenz (SEQ ID NO: 62).
Die 34A, 34B und 34C zeigen die Nucleinsäuresequenz der OspC-C2 (bp 55-612)/OspA-B31 (bp 52-651)/OspA-K48 (bp 652-820)-Chimäre (SEQ ID NO: 63) und die codierte chimäre Proteinsequenz (SEQ ID NO: 64).
Die 35A, 35B und 35C zeigen die Nucleinsäuresequenz der OspC-B31 (bp 55-612)/OspA-B31 (bp 52-651)/OspA-PKo (bp 652-820)-Chimäre (SEQ ID NO: 65) und die codierte chimäre Proteinsequenz (SEQ ID NO: 66).
Die 36A, 36B und 36C zeigen die Nucleinsäuresequenz der OspC-C2 (bp 55-612)/OspA-B31 (bp 52-651)/OspA-PKo (bp 652-820)-Chimäre (SEQ ID NO: 67) und die codierte chimäre Proteinsequenz (SEQ ID NO: 68).
Die 37A, 37B und 37C zeigen die Nucleinsäuresequenz der OspC-B31 (bp 55-633)/OspA-K48 (bp 52-654)/OspA-Tro (bp 655-819)-Chimäre (SEQ ID NO: 69) und die codierte chimäre Proteinsequenz (SEQ ID NO: 70).
Die 38A, 38B und 38C zeigen die Nucleinsäuresequenz der OspC-C2 (bp 55-612)/OspA-K48 (bp 52-654)/OspA-Tro (bp 655-819)-Chimäre (SEQ ID NO: 71) und die codierte chimäre Proteinsequenz (SEQ ID NO: 72).
Die 39A, 39B und 39C zeigen die Nucleinsäuresequenz der OspC-C12 (bp 55-612)/OspA-B31 (bp 88-492)/OspA-PKo (bp 493-537)/OspA-B31 (bp 538-822)-Chimäre (SEQ ID NO: 73) und die codierte chimäre Proteinsequenz (SEQ ID NO: 74).
Die 40A, 40B und 40C zeigen die Nucleinsäuresequenz der OspC-PKo (bp 55-639)/OspA-B31 (bp 88-450)/OspA-PKo (bp 451-537)/OspA-B31 (bp 538-651)/OspA-K48 (bp 652-825)-Chimäre (SEQ ID NO: 75) und die codierte chimäre Proteinsequenz (SEQ ID NO: 76).
Die 41A, 41B und 41C zeigen die Nucleinsäuresequenz der OspC-Tro (bp 55-624)/OspA-B31 (bp 88-450)/OspA-PKo (bp 451-537)/OspA-B31 (bp 538-651)/OspA-PKo (bp 652-822)-Chimäre (SEQ ID NO: 77) und die codierte chimäre Proteinsequenz (SEQ ID NO: 78).
Die 42A, 42B und 42C zeigen die Nucleinsäuresequenz der OspC-B31 (bp 55-633)/OspA-B31 (bp 394-820)-Chimäre (SEQ ID NO: 79) und die codierte chimäre Proteinsequenz (SEQ ID NO: 80).
Die 43A, 43B und 43C zeigen die Nucleinsäuresequenz der OspC-B31 (bp 55-631)/OspA-B31 (bp 394-651)/OspA-K48 (bp 652-820)-Chimäre (SEQ ID NO: 81) und die codierte chimäre Proteinsequenz (SEQ ID NO: 82).
Die 44A, 44B und 44C zeigen die Nucleinsäuresequenz der OspC-B31 (bp 55-633)/OspA-B31 (bp 394-651)/OspA-PKo (bp 652-820)-Chimäre (SEQ ID NO: 83) und die codierte chimäre Proteinsequenz (SEQ ID NO: 84).
Die 45A, 45B und 45C zeigen die Nucleinsäuresequenz der OspC-B31 (bp 55-633)/OspA-K48 (bp 394-654)/OspA-Tro (bp 655-819)-Chimäre (SEQ ID NO: 85) und die codierte chimäre Proteinsequenz (SEQ ID NO: 86).
Die 46A, 46B und 46C zeigen die Nucleinsäuresequenz der OspC-B31 (bp 55-633)/OspA-B31 (bp 88-450)/OspA-PKo (bp 451-537)/OspA-B31 (bp 541-651)/OspA-PKo (bp 652-822)-Chimäre (SEQ ID NO: 87) und die codierte chimäre Proteinsequenz (SEQ ID NO: 88).
Die 47A, 47B und 47C zeigen die Nucleinsäuresequenz der OspC-C2 (bp 55-612)/OspA-B31 (bp 88-450)/OspA-PKo (bp 451-537)/OspA-B31 (bp 541-651)/OspA-PKo (bp 652-822)-Chimäre (SEQ ID NO: 89) und die codierte chimäre Proteinsequenz (SEQ ID NO: 90).
Die 48A und 48B zeigen die Nucleinsäure und die codierte Proteinsequenz eines veränderten R139M OspA (SEQ ID NO: 95 und 96).
Die 49A und 49B zeigen die Nucleinsäure und die codierte Proteinsequenz eines veränderten E160Y OspA (SEQ ID NO: 97 und 98).
Die 50A und 50B zeigen die Nucleinsäure und die codierte Proteinsequenz eines veränderten R139M, E160Y OspA (SEQ ID NO: 99 und 100).
Die 51A und 51B zeigen die Nucleinsäure und die codierte Proteinsequenz eines veränderten E160Y OspA (SEQ ID NO: 101 und 102).
Die 52A und 52B zeigen die Nucleinsäure und die codierte Proteinsequenz eines veränderten R139M, E160Y, K189M OspA (SEQ ID NO: 103 und 104).
Die 53A und 53B zeigen die Nucleinsäure und die codierte Proteinsequenz eines veränderten Y165F OspA (SEQ ID NO: 105 und 106).
Die 54A und 54B zeigen die Nucleinsäure und die codierte Proteinsequenz eines veränderten Y165F, V166T OspA (SEQ ID NO: 107 und 108).
Die 55A und 55B zeigen die Nucleinsäure und die codierte Proteinsequenz eines veränderten V166T OspA (SEQ ID NO: 109 und 110).
Die 56A und 56B zeigen die Nucleinsäure und die codierte Proteinsequenz eines veränderten V166T, T170K OspA (SEQ ID NO: 111 und 112).
Die 57A und 57B zeigen die Nucleinsäure und die codierte Proteinsequenz eines veränderten Y165F, V166T, T170K OspA (SEQ ID NO: 113 und 114).
Die 58A und 58B zeigen die Nucleinsäure und die codierte Proteinsequenz eines veränderten R139M, E160Y, K189M, Y165F, V166T, T170K OspA (SEQ ID NO: 115 und 116).
GENAUE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung ist auf veränderte Formen des OspA aus Borrelia burgdorferi gerichtet, welche eine erhöhte Konformationsstabilität aufweisen, während mindestens ein Teil der Antigenizität des Wildtyp-OspA beibehalten wird, wie dies z. B. durch die Fähigkeit gezeigt wird, vom monoklonalen Antikörper LA-2 gebunden zu werden. In einigen Ausführungsformen weisen die veränderten OspA-Polypeptide auch eine verminderte Kreuzreaktivität mit hLFA-1 auf. Die veränderten OspA-Polypeptide können das gesamte Wildtyp-OspA-Polypeptid (mit Ausnahme der hier beschriebenen Veränderungen) oder einen Teil, wie z. B. den C-terminalen Abschnitt desselben, umfassen. Die Anmelder haben herausgefunden, dass einige Formen des OspA-Proteins, wie z. B. eingekürzte Versionen von OspA, keine starke immunprotektive Antwort auslösen, wenn sie einem Tier verabreicht werden, selbst wenn das OspA-Polypeptid über die immunprotektive Sequenz des LA-2-Epitops verfügt.
Die Struktur des rekombinanten OspA- ist in einem binären Komplex mit dem Fab-Fragment des nicht-protektiven mAb184.1 der Maus, welcher mit dem OspA-Terminus reagiert, bei einer Auflösung von 1,95 ermittelt worden (Li et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 94: 3584–3589 (1997)). Das OspA-Polypeptid ist in 21 aufeinander folgende antiparallele β-Stränge gefaltet, gefolgt von einer C-terminalen α-Helix. Die Struktur wird gewöhnlich als zwei diskret gefaltete Domänen beschrieben, eine N-terminale Sandwich-Domäne und eine C-terminale Zylinder-Domäne, welche über eine lange zentral gelegene β-Faltblattstruktur miteinander verbunden sind. Ein Satz der hier beschriebenen veränderten Polypeptide ist so konzipiert, dass abgeschirmte Ladungen und/oder Salzbrücken im C-terminalen Abschnitt des OspA entfernt werden und sie durch Reste ersetzt werden, welche hyrophobe Wechselwirkungen begünstigen.
Nach einer Ausführungsform umfassen die veränderten OspA-Polypeptide der vorliegenden Erfindung ein verändertes OspA-Protein oder Polypeptide aus Borrelia burgdorferi von etwa dem Rest 139 bis zu etwa dem Rest 273, wobei die Sequenz alle Veränderungen umfasst, die ausgewählt sind aus der Gruppe: Rest 139 verändert zu Methionin, Rest 160 verändert zu Tyrosin, Rest 189 verändert zu Methionin. Die Nummerierung der Reste entspricht der Nummerierung der SEQ ID NO: 7. Das veränderte OspA-Polypeptid weist ein Methionin an der Restposition 139, ein Tyrosin an der Restposition 160 und ein Methionin an der Restposition 189 auf. In anderen Ausführungsformen verfügt das veränderte OspA-Polypeptid sowohl über eine erhöhte Konformationsstabilität als auch über eine verminderte Kreuzreaktivität gegen das hLFA-1-Protein.
Für die Veränderungen an den Positionen 139, 160 und 189 kann die veränderte OspA-Sequenz von jedem Lyme-Borreliose-Stamm von Borrelia burgdorferi stammen, wie z. B. Stämmen von Borrelia burgdorferi sensu stricto, Borrelia afzelii und Borrelia garinii. Stämme von Borrelia burgdorferi sind dem Fachmann gut bekannt. Beispielsweise umfas sen die Stämme von Borrelia burgdorferi sensu stricto den Stamm B31, die Stämme von Borrelia afzelii die Stämme Pgau und Pko und die Stämme von Borrelia garinii den Stamm K48.
Die veränderten OspA-Polypeptide umfassen alle hier beschriebenen Veränderungen. In dieser Ausführungsform hat das veränderte OspA-Polypeptid ein Methionin an der Restposition 139, ein Tyrosin an der Restposition 160, ein Methionin an der Restposition 189, ein Phenylalanin an der Restposition 165, ein Threonin an der Restposition 166 und ein Lysin an der Restposition 170.
Die Erfindung betrifft auch Polypeptide, welche die SEQ ID NO: 104 oder 116 umfassen. Die veränderten OspA-Polypeptide der Erfindung können zum Teil oder im Wesentlichen gereinigt sein (z. B. bis zur Homogenität) und/oder sie können im Wesentlichen frei von anderen Proteinen sein.
Die vorliegende Erfindung ist auch auf Polynucleotide gerichtet, welche die hier beschriebenen Aminosäuresequenzen codieren. Der hier gebrauchte Ausdruck "Polynucleotid" betrifft ein Nucleotid-Multimer oder -Oligomer, welches aus Desoxyribonucleotiden oder Ribonucleotiden oder einer Kombination derselben zusammengesetzt ist und wenige, z. B. 2–20 bis zu vielen, z. B. 20 bis einige Tausend oder mehr Nucleotide aufweist. Als solche enthalten die Polynucleotide Nucleinsäuren jeder Länge und umfassen ferner sowohl natürlich vorkommende als auch synthetische Oligonucleotide und Polynucleotide.
Die Polynucleotide der vorliegenden Erfindung umfassen Polynucleotide, welche die OspA-Polypeptide von Borrelia burgdorferi ab etwa dem Rest 139 bis zu etwa dem Rest 189 codieren, wobei die Sequenz alle Veränderungen codiert, die ausgewählt sind aus der Gruppe: Codon 139 codiert Methionin, Codon 160 codiert Tyrosin, Codon 189 codiert Methionin und Kombinationen derselben. Die Nummerierung der Reste entspricht der Nummerierung der SEQ ID NO: 7. Wie oben für die Polypeptide beschrieben, kann im Falle von Veränderungen an den Positionen 139, 160 und 189 das Polynucleotid, welches die veränderte OspA-Sequenz codiert, von jedem Lyme-Borreliose-Stamm von Borrelia burdorferi sein.
Die Polynucleotide der vorliegenden Erfindung umfassen Polynucleotide, die ausgewählt sind aus der Gruppe: SEQ ID NO: 103 und 115.
Die veränderten OspA-Polypeptide der vorliegenden Erfindung können von OspA-Molekülen abstammen, welche Fragmente, Derivate, Analoge, Varianten und Mutanten des OspA-Proteins (modifiziertes OspA) umfassen oder sie können fragmentiert, derivatisiert oder anderweitig verändert sein, nachdem die hier beschriebenen Veränderungen in sie insertiert worden sind. Diese modifizierten OspA-Moleküle verfügen über eine OspA-Antigen-Aktivität.
Die vorliegende Erfindung ist auch auf ein Verfahren zur Gewinnung eines veränderten OspA-Polypeptids aus Borrelia burgdorferi mit im Vergleich zu dem entsprechenden nicht veränderten OspA-Polypeptid aus Borrelia burgdorferi erhöhter Konformationsstabilität gerichtet. Das Verfahren umfasst die Auswahl eines Polynucleotids, das ein die Reste 139, 160 und 189 umfassendes OspA-Polypeptid von Borrelia burgdorferi codiert, wobei die Nummerierung der Nummerierung der SEQ ID NO: 7 entspricht. Das Polynucleotid wird so verändert, dass Rest 139 Methionin, Rest 160 Tyrosin und Rest 189 Methionin sind. Das veränderte Polynucleotid wird exprimiert, wodurch ein verändertes OspA-Polypeptid aus Borrelia burgdorferi mit im Vergleich zu dem entsprechenden nicht veränderten OspA-Polypeptid von Borrelia burgdorferi erhöhter Konformationsstabilität erzeugt wird. Verfahren zur Veränderung eines Polynucleotids werden weiter unten und in den Beispielen beschrieben und sind dem Fachmann gut bekannt. Verfahren zur Expression der veränderten Polypeptide der vorliegenden Erfindung werden ebenfalls weiter unten und in den Beispielen beschrieben und sind dem Fachmann gut bekannt.
Die Reste 165–173 auf dem β-Strang 13 des OspA wurden mit der Induktion der Lymeassoziierten Arthritis in Zusammenhang gebracht (Gross D. M. et al., Science 281: 703–706 (1998)). Dieser Abschnitt weist mit den Resten 332–340 von hLFA-1 eine Homologie auf, was nahe legt, dass dieses Protein mit dem T-Zell-Epitop kreuz-reaktiv ist (YVLEGTLTA-B31 (SEQ ID NO: 129) bzw. YVLBGTSKQ-hLFA-1 (SEQ ID NO: 130). Obwohl man im Allgemeinen glaubt, dass B. burgdorferi sensu stricto arthritogener ist als andere Borrelia-Stämme, weist eine jüngere Studie über OspA-Allele in der Synovialflüssigkeit von Patienten mit Lyme-Arthritis daraufhin, dass B. garinii und B. afzelii ebenfalls Arthritis verursachen können (Eiffert, L. F. et al., Scand. J. Infect. Dis. 30: 265–268) (1998)).
Eine Möglichkeit, die kreuz-reaktive Sequenz zu eliminieren, besteht darin, die β-13-Region des OspA-B31 (YVLEGTLTA, (SEQ ID NO: 129)) durch eine analoge Region aus einem Stamm zu ersetzen, welcher die gleiche Sequenz nicht enthält, wie z. B. aus dem B. afzelii-Stamm, z. B. Pgau oder Pko (am 7. August 2001 eingereichte US-Patent-Anmeldung mit dem Titel "Recombinant Constructs of Borrelia burgdorferi" von Luft et al., deren gesamte Lehre hiermit als Referenz eingeführt wird).
In einer anderen Ausführungsform wird ein verändertes OspA-Polypeptid mit verminderter Kreuzreaktivität mit hLFA-1 erzeugt, während die Fähigkeit beibehalten wird, von LA-2 gebunden zu werden. In dieser Ausführungsform sind z. B. der Rest 130 Methionin, der Rest 160 Tyrosin, der Rest 165 Phenylalanin, der Rest 166 Threonin, der Rest 170 Lysin und der Rest 189 Methionin. Die das OspA-Polypeptid von Borrelia burgdorferi codierenden Polynucleotide lassen sich wie hier beschrieben auswählen.
In einer Ausführungsform umfasst das veränderte OspA-Polypeptid die die Positionen der Veränderungen enthaltende Minimalsequenz. Beispielsweise kann das veränderte Polypeptid das OspA ab etwa dem Rest 139 bis etwa zum Rest 189 umfassen, wobei die Nummerierung der SEQ ID NO: 7 entspricht. Die veränderten OspA-Polypeptide der vorliegenden Erfindung enthalten auch größere Fragmente des OspA. Beispielsweise umfassen die veränderten OspA-Polypeptide, jedoch nicht ausschließlich, veränderte OspA-Polypeptide, die OspA ab etwa dem Rest 160 bis etwa zum Rest 170, OspA ab etwa dem Rest 150 bis etwa zum Rest 180, OspA ab etwa dem Rest 131 bis etwa zum Rest 273 oder OspA ab etwa dem Rest 17 bis etwa zum Rest 273 umfassen. Verfahren zur Erzeugung und Expression von OspA-Fragmenten unterschiedlicher Größe, welche eine oder mehrere der hier beschriebenen Veränderungen einbauen, werden weiter unten beschrieben und sind dem Fachmann gut bekannt.
Wie hier beschrieben, kann die zur Erzeugung des veränderten OspA-Polypeptids verwendete OspA-Sequenz selbst ein chimäres OspA-Polypeptid mit zwei oder mehr von OspA-Proteinen aus unterschiedlichen Genospezies oder Stämmen von Borrelia stammenden Segmenten sein. Je nach dem zur Erzeugung des veränderten OspA-Polypeptids eingesetzten Verfahren und/oder dem Zweck, für welchen es erzeugt wird, kann die Größe des veränderten OspA-Polypeptids variieren und solcherart veränderte chimäre OspA-Polypeptide können Fragmente des OspA enthalten. Das veränderte Polypeptid kann Teil eines größe ren Polypeptids sein, einschließlich zusätzlicher OspA-Sequenzen am N-Terminus, C-Terminus oder beiden. Ein Fragment eines OspA-Proteins kann Polypeptide umfassen, die nur einen Teil des OspA-Proteins mit voller Länge darstellen. Solche OspA-Fragmente enthalten typischerweise mindestens einen der hier beschriebenen veränderten Reste und verfügen mindestens über einen Teil der Antigenizität des Wildtyp-OspA. OspA-Fragmente lassen sich sowohl mittels Deletionen am Amino- und/oder Carboxylende als auch mittels interner Deletionen herstellen. Die Fragmente können auch mit Hilfe eines enzymatischen Verdaus hergestellt werden. Solcherart modifizierte OspA-Moleküle können auf ihre antigene Aktivität getestet werden, wie dies hier beschrieben wird oder indem im Stand der Technik bekannte Verfahren eingesetzt werden.
In einigen Ausführungsformen kann das veränderte OspA-Polypeptid Teil eines Cocktails mit einem oder mehreren anderen Proteinen sein, wie z. B. anderen Polypeptiden von Borrelia burgdorferi, einschließlich aber nicht ausschließlich, OspA, OspB, OspC, OspD, p93 und p41. In anderen Ausführungsformen kann das veränderte OspA-Polypeptid Teil eines größeren Moleküls, wie z. B. eines chimären Polypeptids sein, wie dies z. B. in dem US-Patent 6,248,562 und der am 7. August 2001 eingereichten US-Patentanmeldung mit dem Titel "Recombinant Constructs of Borrelia burgdorferi" von Luft et al. beschrieben wird. Derartige größere Polypeptide können Aminosäuresequenzen von anderen Proteinen, einschließlich aber nicht ausschließlich anderen Proteinen von Borrelia burgdorferi enthalten, welche für die Erzeugung von Fusionsproteinen für einen Impfstoff und/oder für immundiagnostische Verfahren von Nutzen sind. Zusätzliche Komponenten, z. B. Marker (ein Radioisotop, ein Epitop-Marker (Tag) (z. B. ein Hämagglutinin (HA)-Epitop, ein Hexahistidin-Tag), ein Affinitätsmarker (z. B. Biotin, Avidin), ein Spin-Marker, ein Enzym-Marker, eine fluoreszierende Gruppe, eine chemolumineszente Gruppe) können in die veränderten OspA-Polypeptide der Erfindung eingebaut werden, um bei der Isolierung und/oder Reinigung des Polypeptids zu helfen. Beispielsweise würde ein Hexahistidin-Tag die rasche Reinigung mittels Nickel-Chromatographie gestatten. Diese und andere Komponenten können auch in die veränderten OspA-Polypeptide der Erfindung eingebaut werden, um die Halbwertszeit der Polypeptide zu verlängern. Dem Fachmann sind Verfahren zum Einbau derartiger Komponenten in die Polypeptide der Erfindung gut bekannt.
In einer Ausführungsform ist das veränderte OspA-Polypeptid der Erfindung ein chimäres Polypeptid. In einer besonderen Ausführungsform umfasst das veränderte OspA- Polypeptid die folgenden Elemente: a) eine Aminosäuresequenz eines ersten OspA-Polypeptids ab etwa dem Rest 1 bis etwa zu dem Rest 164 aus einem ersten Stamm von Borrelia burgdorferi; b) eine Aminosäuresequenz eines zweiten OspA-Polypeptids ab etwa dem Rest 165 bis etwa zu dem Rest 179 aus einem zweiten Stamm von Borrelia burgdorferi, wobei der zweite Stamm sich von dem ersten Stamm unterscheidet; c) eine Aminosäuresequenz eines dritten OspA-Polypeptids ab etwa dem Rest 180 bis etwa zu dem Rest 216 aus einem dritten Stamm von Borrelia burgdorferi, wobei der dritte Stamm sich von dem zweiten Stamm unterscheidet; d) eine Aminosäuresequenz eines vierten OspA-Polypeptids ab etwa dem Rest 217 bis etwa zu dem Rest 273 aus einem vierten Stamm von Borrelia burgdorferi, wobei der vierte Stamm sich von dem dritten Stamm unterscheidet; wobei die Sequenz alle Veränderungen, ausgewählt aus der Gruppe: Rest 139 ist Methionin, Rest 160 ist Tyrosin, Rest 189 ist Methionin und Kombinationen derselben umfasst, wobei die Nummerierung der Nummerierung der SEQ ID NO: 7 entspricht.
Die hier beschriebenen Polypetide können aus natürlich vorkommenden Quellen isoliert, chemisch synthetisiert oder rekombinant produziert sein. Die veränderten OspA-Polypeptide der vorliegenden Erfindung können von natürlich vorkommenden OspA-Molekülen oder von Nucleinsäuren stammen, welche derartige Moleküle codieren. Die OspA-Polypeptide der vorliegenden Erfindung können Fragmente, Derivate, Analoge, Varianten und Mutanten eines OspA-Proteins (modifiziertes OspA) umfassen und/oder sie können nach einer Insertion der hier beschriebenen Veränderungen fragmentiert, derivatisiert oder anderweitig verändert sein (auch als modifizierte OspA bezeichnet). Derartige modifizierte OspA-Moleküle verfügen über mindestens eine gewisse antigene OspA-Aktivität. Erfindungsgemäß kann die Aminosäuresequenz der veränderten OspA-Polypeptide der Erfindung die eines natürlich vorkommenden Proteins sein oder sie kann zusätzliche Modifikationen aufweisen. Derartige zusätzliche Modifikationen umfassen konservative und/oder nicht-konservative Aminosäuresubstitutionen, Additionen von einer oder mehreren Aminosäuren und/oder Deletionen von einer oder mehreren Aminosäuren. Derartige zusätzliche Modifikationen sollten auch zumindest eine gewisse Aktivität des codierten Proteins oder Polypeptids bewahren. Beispielsweise sollte das weiter modifizierte Polypeptid oder Protein im Vergleich mit dem entsprechenden veränderten OspA-Polypeptid (d. h. dem OspA-Polypeptid, welches eine oder mehrere der hier beschriebenen Veränderungen, jedoch nicht die weitere(n) Modifikation(en) aufweist) über eine ähnliche oder eine verbesserte Konformationsstabilität, eine ähnliche oder eine verbesserte immunprotektive Aktivität oder eine verminderte Kreuzreaktivität zu hLFA-1 verfügen.
Beispielsweise bewahren die weitere(n) Modifikation(en) vorzugsweise die dreidimensionale Konfiguration einer Antikörper-Bindungsstelle des nativen Proteins, wie z. B. die LA-2-Bindungsstelle. Das Vorkommen oder Fehlen einer biologischen Aktivität oder von biologischen Aktivitäten kann, wie hier beschrieben, mit verschiedenen funktionellen Assays oder mit Hilfe von im Stand der Technik bekannten Verfahren ermittelt werden, z. B. der Erkennung mit einem ELISA-Assay oder der Auslösung einer Immunantwort (z. B. einer immunprotektiven Antwort) in einem Tier. Geeignete Veränderungen der Aminosäuren können auf der Grundlage von einigen Kriterien wie der Hydrophobizität, dem basischen oder sauren Charakter, der Ladung, der Polarität, der Größe, dem Vorliegen oder Fehlen einer funktionellen Gruppe (z. B. -SH oder einer Glykosylierungsstelle) und dem aromatischen Charakter erfolgen, vorausgesetzt, dass das erhaltene Molekül mindestens eine der hier beschriebenen Veränderungen aufweist und die erhöhte Konformationsstabilität und/oder verminderte Kreuzreaktivität zu hLFA-1 beibehält. Eine Zuordnung von verschiedenen Aminosäuren zu ähnlichen Gruppen auf der Grundlage der obigen Eigenschaften kann der Fachmann leicht vornehmen; weiter geeignete Veränderungen von Aminosäuren finden sich auch bei Bowie (Science, 247: 1306–1310 (1990)).
"Varianten" und "Mutanten" von OspA lassen sich mit Hilfe von dem Fachmann gut bekannten in vitro- und/oder in vivo-Techniken herstellen, z. B. mit einer ortsgerichteten Mutagenese und einer Oligonucleotid-Mutagenese. Manipulationen der Polypeptidsequenz von OspA können auch auf der Stufe des Proteins erfolgen. Chemische Modifikationen können mit Hilfe bekannter Techniken durchgeführt werden, einschließlich aber nicht ausschließlich einer spezifischen chemischen Spaltung mit Bromcyan, Trypsin und/oder Papain. OspA lässt sich auch strukturell modifizierten und/oder denaturieren, z. B. mit Hitze. Im Allgemeinen können Mutationen konservative oder nicht-konservative Aminosäuresubstitutionen, Aminosäureinsertionen oder Aminosäuredeletionen sein.
Beispielsweise kann eine ein modifiziertes OspA-Polypeptid codierende Nucleinsäure (z. B. DNA) mittels ortsgerichteter Mutagenese der Nucleinsäure (z. B. DNA) gewonnen werden, welche ein Wildtyp-OspA codiert. Eine ortsgerichtete (ortspezifische) Mutagenese gestattet die Produktion von OspA-Varianten über den Einsatz von spezifischen Oligo nucleotidsequenzen, welche die DNA-Sequenz der gewünschten Mutation (z. B. Veränderung, Deletion, Insertion) sowie eine ausreichende Anzahl von angrenzenden Nucleotiden codieren, um eine Primersequenz von ausreichender Größe und Sequenzkomplexität zur Verfügung zu stellen, um auf beiden Seiten der gewünschten Mutation einen stabilen Duplex zu bilden. Typischerweise wird ein Primer mit einer Länge von etwa 20 bis 25 Nucleotiden bevorzugt, wobei etwa 5 bis 10 komplementäre Reste auf beiden Seiten der Mutation der Sequenz verändert werden. Im Allgemeinen sind die Techniken einer ortsspezifischen Mutagenese im Stand der Technik gut bekannt, was durch Veröffentlichungen wie die von Edelman et al., DNA, 2: 183, 1983 belegt wird. Beispielsweise kann in einer ortsspezifischen Mutagenese-Technik ein Phagenvektor eingesetzt werden, der sowohl in einzelsträngiger als auch doppelsträngiger Form vorkommt. Typische Vektoren, die bei einer ortsgerichteten Mutagenese von Nutzen sind, sind Vektoren wie z. B. der M13-Phage, was von Messing et al., Third Cleveland Symposium an Macromolecules and Recombinant DNA, A. Walton, Hrg., Elsevier, Amsterdam, 1981 beschrieben wird. Dieser und andere Phagenvektoren sind im Handel erhältlich und ihre Verwendung ist dem Fachmann gut bekannt. Eine vielseitig verwendbare und effiziente Vorschrift für die Konstruktion von Oligonucleotid-gerichteten ortsspezifischen Mutationen in DNA-Fragmenten mit Hilfe von Vektoren, die von M13 abstammen, wurde von Zoller, M. J. und Smith, M., Nucleic Acids Res., 10: 6487–6500, 1982 veröffentlicht. Zusätzlich lassen sich Plamidvektoren einsetzen, die einen einzelsträngigen Phagen-Replikationsursprung enthalten, um eine einzelsträngige DNA zu erhalten (siehe z. B. Veira et al., Meth. Enzymol., 153: 3, (1987)).
Alternativ lassen sich über eine Synthese der passenden DNA-Fragmente in vitro und deren Amplifikation mit Hilfe von im Stand der Technik bekannten PCR-Verfahren Nucleotidsubstitutionen einführen.
Im Allgemeinen lässt sich eine ortsspezifische Mutagenese durchführen, indem zunächst ein einzelsträngiger Vektor erhalten wird, der in seiner Sequenz eine DNA-Sequenz enthält, die das jeweilige Protein codiert. Ein die gewünschte mutierte Sequenz tragender Oligonucleotid-Primer wird im Allgemeinen synthetisch hergestellt, beispielsweise nach dem Verfahren von Crea et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 75: 5765, 1978. Dieser Primer kann dann mit dem die einzelsträngige Nucleotidsequenz enthaltenden Vektor hybridisiert und DNA polymerisierenden Enzymen ausgesetzt werden, z. B. dem Klenow-Fragment der DNA-Polymerase I von E. coli, um die Synthese des die Mutation tragenden Stranges zu vervollständigen. Somit wird ein Heteroduplex gebildet, in welchem ein Strang die urprüngliche nicht-mutierte Sequenz und der zweite Strang die gewünschte Mutation enthält. Dieser Heteroduplex-Vektor kann dann eingesetzt werden, um geeignete Wirtszellen wie z. B. JM 101-Zellen zu transformieren und es lassen sich Klone aussuchen, die die rekombinanten Vektoren enthalten, welche die mutierte Sequenzanordnung tragen. Danach kann die mutierte Region entfernt und in einen geeigneten Expressionsvektor für die Proteinproduktion eingesetzt werden.
Bei der Erzeugung von Aminosäure-Sequenzvarianten des OspA kann die PCR-Technik eingesetzt werden. Wenn in einer PCR kleine Mengen an Matrizen-DNA als Startmaterial verwendet werden, können Primer eingesetzt werden, die sich in ihrer Sequenz geringfügig von der entsprechenden Region in einer Matrizen-DNA unterscheiden, um relativ große Mengen eines spezifischen DNA-Fragments zu erzeugen, welches sich von der Sequenz der Matrize nur an den Positionen unterscheidet, wo sich die Primer von der Matrize unterscheiden. Zum Einführen einer Mutation in eine Plasmid-DNA kann einer der Primer do konzipiert sein, dass er die Position der Mutation überlappt und die Mutation enthält; die Sequenz des anderen Primers ist vorzugsweise identisch mit einem Abschnitt der Sequenz des Gegenstranges des Plamids, diese Sequenz kann sich aber irgendwo längs der Plasmid-DNA befinden. Es ist jedoch bevorzugt, dass sich die Sequenz des zweiten Primers innerhalb von 500 Nucleotiden von der des ersten Primers befindet, so dass sich am Ende die gesamte amplifizierte Region der von den Primern gebundenen DNA leicht sequenzieren lässt. Eine PCR-Amplifikation mit Hilfe eines Primerpaares wie dem gerade beschriebenen führt zu einer Population von DNA-Fragmenten, die sich an der Endposition der von dem Primer spezifizierten Mutation unterscheiden.
Die produzierten die gewünschte Mutation aufweisenden DNA-Fragmente können dazu verwendet werden, um unter Einsatz der Standard-DNA-Technologie die entsprechende Region in dem Plasmid zu ersetzen, das als PCR-Matrize diente. Mutationen an separaten Positionen können gleichzeitig eingeführt werden, indem entweder ein mutanter zweiter Primer verwendet wird oder eine zweite PCR mit unterschiedlichen mutanten Primern durchgeführt wird und die zwei resultierenden PCR-Fragmente gleichzeitig in einer dreiteiligen (oder mehrteiligen) Ligation an das Vektorfragment ligiert werden.
Ein zusätzliches Verfahren zur Herstellung von Varianten, die Kassetten-Mutagenese, beruht auf den von Wells et al., Gene, 34: 315, 1985 beschriebenen Techniken. Das Startmaterial kann das Plasmid (oder der Vektor) sein, welches (welcher) die zu mutierende OspA-DNA enthält. Das (die) Codon(s) innerhalb des zu mutierenden OspA werden identifiziert. Auf jeder Seite der identifizierten Mutationsstelle(n) muss es spezifische Restriktions-endonuclease-Stellen geben. Falls es keine solchen Restriktionsstellen gibt, können sie mit Hilfe des oben beschriebenen Oligonucleotid-vermittelten Mutageneseverfahrens erzeugt werden, um sie an geeigneten Stellen in die OspA-DNA einzuführen oder sie können unter Einsatz der PCR und den gewünschten Primern wie in den Beispielen beschrieben erzeugt werden. Nach Einführung der Restriktionsstellen in das Plasmid wird das Plasmid an diesen Stellen geschnitten, um es zu linearisieren. Mit Hilfe von Standardverfahren wird ein doppelsträngiges Oligonucleotid synthetisiert, das die Sequenz der DNA zwischen den Restriktionsstellen codiert aber die gewünschte(n) Mutation(en) enthält. Unter Einsatz von Standardtechniken werden die beiden Stränge getrennt synthetisiert und dann zusammen hybridisiert. Dieses doppelsträngige Oligonucleotid wird als Kassette bezeichnet. Diese Kassette ist so konzipiert, dass sie 3'- und 5'-Enden hat, welche mit den Enden des linearisierten Plasmids kompatibel sind, so dass sie direkt an das Plasmid ligiert werden kann. Das Plasmid enthält nun die mutierte OspA-DNA-Sequenz und kann subkloniert und/oder exprimiert werden, um das modifizierte OspA-Polypeptid oder -Protein zu produzieren.
Die OspA codierenden Nucleinsäuremoleküle (z. B. Polynucleotide) der vorliegenden Erfindung weisen mindestens eine der hier beschriebenen Veränderungen auf und hybridisieren im Allgemeinen unter hoch stringenten Hybridisierungsbedingungen an eine ein Polynucleotid codierende OspA-Nucleinsäure oder ein Fragment derselben aus einem sensu stricto-Stamm von Borrelia burgdorferi, z. B. SEQ ID NO: 7. In einer Ausführungsform hybridisieren die OspA codierenden Nucleinsäuremoleküle (z. B. Polynucleotide) der vorliegenden Erfindung unter hoch stringenten Hybridisierungsbedingungen an eine ein Polynucleotid codierende OspA-Nucleinsäure oder ein Fragment derselben aus Borrelia afzelii, z. B. SEQ ID NO: 10. In einer anderen Ausführungsform hybridisieren die OspA codierenden Nucleinsäuremoleküle (z. B. Polynucleotide) der vorliegenden Erfindung unter hoch stringenten Hybridisierungsbedingungen an eine ein Polynucleotid codierende OspA-Nucleinsäure oder ein Fragment derselben aus Borreliagarinii, z. B. SEQ ID NO: B. Somit umfassen die Polynucleotide und Polypeptide der vorliegenden Erfindung, wie hier beschrieben, modifizierte Versionen des OspA.
Geeignete selektive Stringenzbedingungen sind dem Fachmann bekannt und lassen sich in Standardschriften wie den Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N. Y. (1989), 6.3.1–6.3.6 auffinden. Stringente Hybridisierungsbedingungen weisen z. B. eine Natriumionen-Komzentration von höchstens 1 M und eine Temperatur von mindestens 25°C auf. In einer Ausführungsform sind Bedingungen von 5 × SSPE (750 ml NaCl, 50 mM NaPhosphat, 5 mM EDTA, pH 7,4) und eine Temperatur von 25–30°C oder äquivalente Bedingungen geeignet für eine spezifische Hybridisierung. Äquivalente Bedingungen lassen sich ermitteln, indem, wie im Stand der Technik bekannt, einer oder mehrere der Parameter variiert werden, während ein ähnlicher Grad an Identität oder eine Ähnlichkeit zwischen dem Nucleinsäure-Zielmolekül und dem Primer oder der verwendeten Sonde aufrecht erhalten werden. Hybridisierbare Nucleinsäuremoleküle sind als Sonden und Primer für diagnostische Anwendungen von Nutzen.
Dementsprechend betrifft die Erfindung Nucleinsäuremoleküle, welch eine wesentliche Identität mit den die hier beschriebenen veränderte OspA-Polypeptide codierenden Nucleinsäuremolekülen aufweisen, wobei die Nucleinsäure eine oder mehrere der hier beschriebenen Veränderungen codiert; besonders bevorzugt sind Nucleinsäuremoleküle, welche mindestens etwa 90%, mehr bevorzugt mindestens etwa 95% und am meisten bevorzugt mindestens etwa 98% Identität mit den hier beschriebenen Nucleinsäuremolekülen aufweisen, wobei die Nucleinsäure eine der hier beschriebenen Veränderungen codiert. Eine Sequenzidentität lässt sich mit Hilfe von in der Öffentlichkeit oder im Handel erhältlichen Sequenz-Alignment-Algorithmen ermitteln, indem z. B. Default-Parameter benutzt werden.
Somit sind DNA-Moleküle, welche eine Sequenz umfassen, die sich von dem natürlich vorkommenden Nucleinsäuremolekül unterscheidet, die aber in Folge der Degenerierung des genetischen Codes das gleich Protein oder Polypeptid codiert, von der vorliegenden Erfindung mit umfasst. Die Erfindung umfasst auch Variationen der Nucleinsäuremoleküle der Erfindung wie z. B. jene codierenden Abschnitte, Analoge oder Derivate des codierten Proteins oder Polypeptids. Solche Variationen können natürlich vorkommen wie im Falle von Allel-Variationen oder sie sind nicht natürlich vorkommend wie die von verschiede nen Mutagenen oder mutagenen Prozessen ausgelösten, solange nur das Nucleinsäuremolekül mindestens eine der hier beschriebenen Veränderungen codiert und das codierte Protein entweder über eine erhöhte Konformationsstabilität und/oder eine verminderte Kreuzreaktivität mit hLFA-1 verfügt (im Vergleich mit dem entsprechenden nicht veränderten Protein), die von den hier beschriebenen Veränderungen verursacht wurden. Beabsichtigte Variationen sind, jedoch nicht ausschließlich, eine Addition, eine Deletion und/oder eine Substitution von einem oder mehreren Nucleotiden, welche zu konservativen oder nicht-konservativen Aminosäure-Veränderungen führen können, unter Einschluss von Additionen und Deletionen. Vorzugsweise sind derartige Nucleotid- oder Aminosäure-Variationen stille Variationen; d. h., dass sie nicht eine oder mehrere Eigenschaften oder die Aktivität des codierten veränderten OspA-Proteins oder -Polypeptids verändern. Der hier verwendete Ausdruck des codierten Proteins oder Polypeptids" umfasst, jedoch nicht ausschließlich, die Bindungsfunktion, die antigene Funktion und die Konformationsstabilität.
Die Erfindung stellt auch Expressionsvektoren zur Verfügung, welche eine hier beschriebene Nucleinsäuresequenz enthalten, die funktionsfähig an mindestens eine regulatorische Sequenz gebunden ist. Viele derartige Vektoren sind im Handel erhältlich und andere geeignete Vektoren lassen sich leicht vom Fachmann herstellen. "Funktionsfähig gebunden" soll bedeuten, dass das Nucleinsäuremolekül an eine regulatorische Sequenz auf eine Art und Weise gebunden ist, welche die Expression der Nucleinsäuresequenz gestattet. Regulatorische Sequenzen sind im Stand der Technik bekannt und werden ausgesucht, um das codierte Polypeptid oder Protein zu produzieren. Demgemäß umfasst der Ausdruck "regulatorische Sequenz" Promotoren, Enhancer und andere Kontrollelemente der Expression, die in Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990) beschrieben werden. Beispielsweise können native regulatorische Sequenzen oder für die transformierte Wirtszelle native regulatorische Sequenzen verwendet werden. Selbstverständlich kann die Konzeption des Expressionsvektors von solchen Faktoren wie der Wahl der zu transformierenden Wirtszelle und/oder dem Proteintyp abhängen, der exprimiert werden soll. Beispielsweise lassen sich die Polypeptide der vorliegenden Erfindung herstellen, indem das klonierte Gen oder ein Teil desselben in einen Vektor ligiert werden, der zur Expression in entweder prokaryotischen Zellen, eukaryotischen Zellen oder beiden geeignet ist (siehe z. B. Broach et al., Experimental Manipulation of Gene Expression, Hrg. M. Inouye (Academic Press, 1983) S. 83; Molecular Clo ning: A Laborstory Manual, 2. Ausgabe, Hrg. Sambrook et al., (Cold Spring Harbor Laborstory Press, 1989) Kapitel 16 und 17). Typischerweise enthalten Expressionskonstrukte einen oder mehrere selektierbare Marker, einschließlich aber nicht ausschließlich das Gen, welches die Dihydrofolat-Reduktase codiert und die Gene, welche Resistenz gegen Neomycin, Tetracyclin, Ampicillin, Chloramphenicol, Kanamycin oder Streptomycin verleihen.
Mit den beschriebenen Vektoren transfizierte prokaryotische und eukaryotische Wirtszellen werden von dieser Erfindung ebenfalls zur Verfügung gestellt. Beispiele für Zellen, die mit den Vektoren der vorliegenden Erfindung transfiziert werden können, sind, jedoch nicht ausschließlich, Bakterienzellen wie E. coli (z. B. die K12-, BL21-, DH5α-Stämme von E. coli), Streptomyces, Pseudomonas, Serratia marescens und Salmonella typhimurium, Indektenzellen (baculovirus) einschließlich Drosophila, Pilzzellen wie z. B. Hefezellen, Pflanzenzellen und Säugerzellen wie Thymozyten, Eizellen vom chinesischen Hamster (CHO) und COS-Zellen.
Somit kann ein Nucleinsäuremolekül, das z. B. die SEQ ID NO: 6 mit mindestens einer der hier beschriebenen spezifischen Veränderungen oder eine Nucleinsäuremolekül, das z. B. die SEQ ID NO: 7 mit mindestens einer der hier beschriebenen spezifischen Veränderungen codiert, eingesetzt werden, um über mikrobielle oder eukaryotische Zellprozesse eine rekombinante Form des Proteins zu produzieren. Das Ligieren des Nucleinsäuremoleküls (z. B. eines Polynucleotids) in ein Genkonstrukt wie z. B. einen Expressionsvektor und das Transformieren in entweder eukaryotische (Hefe-, Affen-, Insekten-, Pflanzen- oder Säuger-) oder prokaryotische (bakterielle) Wirtszellen sind Standardverfahren, welche bei der Produktion anderer gut bekannter Proteine zum Einsatz kommen. Ähnliche Verfahren oder Modifikationen derselben können eingesetzt werden, um mit mikrobiellen Mitteln oder der Zellkultur-Technologie erfindungsgemäße rekombinante Proteine herzustellen. Demgemäß betrifft die Erfindung die Produktion codierter Proteine oder Polypeptide mit Hilfe der rekombinanten Technologie.
Die Proteine und Polypeptide der vorliegenden Erfindung lassen sich aus einer rekombinanten Zellkultur mit verschiedenen verfahren isolieren oder reinigen (z. B. bis zur Homogenität). Diese Verfahren sind, aber nicht ausschließlich, die Kationen- oder Anionenaustauscher-Chromatographie, die Ethanol-Fällung, die Affinitätschromatographie und die Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie (HPLC). Das eingesetzte besondere Verfahren hängt von den Eigenschaften des Polypeptids und der Wahl der Wirtszelle ab; die hierfür geeigneten Verfahren sind dem Fachmann geläufig.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch pharmazeutische Zusammensetzungen mit den hier beschriebenen Polypeptiden und andern Verbindungen. Beispielsweise lässt sich ein Polypeptid oder Protein der vorliegenden Erfindung mit einem physiologisch verträglichen Medium formulieren, um eine pharmazeutische Zusammensetzung herzustellen. Das besondere physiologische Medium kann, jedoch nicht ausschließlich, aus Wasser, gepufferter Saline, Polyolen (z. B. Glycerin, Propylenglykol, flüssiges Polyethylenglykol) und Dextrose-Lösungen bestehen. Die optimale Konzentration des (der) aktiven Inhaltsstoffs (Inhaltsstoffe) in dem ausgewählten Medium lässt sich nach gut bekannten Verfahren empirisch ermitteln und hängt von der gewünschten endgültigen pharmazeutischen Formulierung ab. Verfahren zum Einführen von exogenen Polypeptiden am Behandlungsort umfassen, jedoch nicht ausschließlich, eine intradermale, intramuskuläre, intraperitoneale, intravenöse, subkutane, orale oder intranasale Verabreichung. Andere geeignete Verfahren zum Einführen können auch eine Gentherapie, wiederbefüllbare oder biologisch abbaubare Vorrichtungen und polymere Vorrichtungen für eine langsame Abgabe umfassen. Die pharmazeutischen Zusammensetzungen dieser Erfindung können auch als Teil einer Kombinationstherapie mit anderen Wirkstoffen verabreicht werden.
Die hier beschriebenen veränderten OspA-Proteine können so hergestellt werden, dass sie hoch löslich sind, in E. coli überexprimiert werden und nicht lipidiert sind. Darüber hinaus können die veränderten OspA-Proteine so konzipiert sein, dass sie mit einem geeigneten Affinitäts-Tag (z. B. einem His-Tag) anfangen oder enden, um die Reinigung zu erleichtern. Die hier beschriebenen rekombinanten Proteine sind konstruiert worden, um hohe Grade an Antigenizität und eine verbesserte Konformationsstabilität beizubehalten.
Die veränderten OspA-Proteine der vorliegenden Erfindung sind insofern von Vorteil, als sie mindestens eine gewisse spezifische Reaktivität gegenüber monoklonalen und/oder polyklonalen Antikörpern gegen Wildtyp-Proteine von Borrelia beibehalten, immunogen sind und in vitro das Wachstum von Borrelia hemmen oder deren Lyse veranlassen. Die Proteine sind besonders in immundiagnostischen Assays von Nutzen. Die Proteine der vorliegenden Erfindung können z. B. als Wirkstoffe in Assays eingesetzt werden, um das Vorkommen von Antikörpern gegen native Borrelia in potentiell infizierten Individuen nachzuweisen. Diese Proteine lassen sich auch als immundiagnostische Reagenzien z. B. in Dot-Blots, Western-Blots, ELISAs (Enzyme-linked Immunosorbent Assays) oder Agglutinations-Assays einsetzen. Die veränderten OspA-Proteine der vorliegenden Erfindung können mit bekannten Techniken hergestellt werden, wie z. B. mittels rekombinanter Methodik, mit der Polymerase-Kettenreaktion oder mittels Mutagenese.
Ferner sind die Proteine der vorliegenden Erfindung als Impfstoff-Immungene gegen eine Infektion durch Borrelia von Nutzen. Eines oder mehrere der veränderten Proteine können mit einem physiologisch verträglichen Träger kombiniert und an ein Vertebraten-Tier mittels Standardmethoden (z. B. intravenös oder intramuskulär) verabreicht werden.
Die hier beschriebenen veränderten Formen der OspA-Proteine wurden biologisch so bearbeitet, dass mindestens eine immunprotektive Domäne des Proteins erhalten blieb. Wie hier beschrieben, bezieht sich antigen auf die Fähigkeit einer Verbindung, sich an die Produkte einer Immunantwort wie z. B. Antikörper, T-Zell-Rezeptoren oder beides zu binden. Derartige Antworten lassen sich mittels standardisierter Antikörper-Nachweis-Assays wie z. B. ELISAs oder standardisierten T-Zell-Aktivierungs-Assays messen. In einer bevorzugten Ausführungsform lösen die hier beschriebenen veränderten Formen des OspA eine immunprotektive Antwort aus, indem sie z. B. die Bildung von Antikörpern auslösen, welche das LA-2-Epitop erkennen.
Selbstverständlich können die Nucleinsäuren, welche die das veränderte OspA-Protein umfassenden Polypeptide codieren, zusätzliche Nucleotide oder weniger Nucleotide enthalten, um die Konstruktion des das chimäre Polypeptid codierenden Gens zu vereinfachen, um z. B. die Verwendung von gut geeigneten Restriktionsendonuclease-Stellen zu gestatten oder die Ligierung der Genfragmente so zu gestatten, dass eine zusammenhängende Codierungsregion geschaffen wird. Auf Grundlage der hier gegebenen Anleitung wäre ein Fachmann leicht in der Lage, Nucleotide an den Enden der die Polypeptide des OspA-Proteins codierenden Genfragmente anzufügen oder zu entfernen, um die veränderten OspA-Proteine der vorliegenden Erfindung ohne Herumexperimentieren oder nur mit routinemäßigem Herumexperimentieren zu erzeugen. Die veränderten OspA-Polypeptide der vorliegenden Erfindung können lipidiert oder nicht-lipidiert sein.
Um die Antigenizität der veränderten OspA-Polypeptide zu testen, können Mäuse mit OspA-Polypeptiden oder -Proteinen, welche die Polypeptidsequenzen in Aluminiumhydroxid enthalten, immunisiert werden. Den Mäusen wird sodann Blut entnommen und auf Antikörperreaktionen gegen OspA hin untersucht, das von verschiedenen Borrelia-Stämmen stammte. In zusätzlichen Experimenten können diese immunisierten Mäuse einem Angriff von mit Borrelia burgdorferi infizierten Zecken ausgesetzt werden und die Übertragung der Infektion kann wie in den Beispielen beschrieben, in denen OspA-, OspC- und chimäre OspC/OspA-Moleküle eingesetzt wurden, beurteilt werden. Die Ergebnisse eines solchen Zeckenangriffs zeigen, ob das Tier eine protektive Immunantwort entwickelt hat. Beispielsweise hat ein immunisiertes Tier, das in Reaktion auf einen nachfolgenden Zeckenangriff nicht serokonvertiert hat, wahrscheinlich eine immunprotektive Reaktion gegen die Immunisierung ausgebildet.
Die immunogenen Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung können verwendet werden, um Tiere, einschließlich Menschen, zu immunisieren. Unter Immunisierung versteht man das Auslösen spezifischer immunogener Reaktionen, vorzugsweise, wie oben beschrieben, immunprotektiver Reaktionen. Wie hier beschrieben, umfasst eine immunogene Antwort Reaktionen, die in dem behandelten Tier zumindest bis zu einem gewissen Grad von Immunantwort führen, wenn das Tier zuvor mit einer Zusammensetzung behandelt wurde, die mindestens ein verändertes OspA-Polypeptid der vorliegenden Erfindung umfasst.
Unter Immunität, wie sie hier beschrieben wird, versteht man die Fähigkeit des behandelten Tieres, einer Infektion zu widerstehen, einer systemischen Infektion zu widerstehen oder eine Infektion, wie z. B. eine systemische Infektion, im Vergleich mit nicht immunisierten oder nicht behandelten Individuen leichter oder schneller zu besiegen. Immunität kann auch eine verbesserte Befähigung des behandelten Tieres umfassen, eine Infektion mit weniger oder keinen klinischen Symptomen einer systemischen Infektion zu ertragen. Das Individuum kann mit den veränderten OspA-Proteinen der vorliegenden Erfindung entweder proaktiv, z. B. einmal pro Jahr, oder alternativ, nach Erleiden eines Zeckenbisses behandelt werden.
In einer Ausführungsform wird das veränderte OspA-Protein der vorliegenden Erfindung zusammen mit anderen geeigneten Vehikeln und/oder Adjuvanzien einem Tier so verab reicht, dass das Tier eine Immunantwort gegen das OspA-Polypeptid der Zusammensetzung ausbildet. Die pharmazeutische Zusammensetzung kann auch mit anderen für eine in vitro- und/oder in vivo-Verwendung geeigneten Komponenten verabreicht werden. Diese zusätzlichen Komponenten umfassen Puffer, Trägerproteine, Adjuvanzien, Konservierungsmittel und Kombinationen derselben. In einer bevorzugten Ausführungsform entwickelt das Individuum eine immunprotektive Reaktion, indem es z. B. Antikörper erzeugt, welche das LA-2-Epitop erkennen.
Die vorliegende Erfindung ist auch auf eine physiologische Zuammensetzung mit einem veränderten OspA-Protein gerichtet. Die Zusammensetzung ist für die Verabreichung an ein Tier von Nutzen, um eine Immunantwort zu erzeugen oder für die hier beschriebenen diagnostischen Verfahren.
Bei einem Einsatz als Impfstoff kann die Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung geeignete im Stand der Technik gut bekannte Adjuvanzien enthalten, um die Immunogenizität, die Wirksamkeit oder die Halbwertszeit der chimären Proteine in dem behandelten Tier zu erhöhen. Adjuvanzien und ihre Verwendung sind im Stand der Technik gut bekannt (siehe z. B. die PCT-Veröffentlichung WO 96/40290 , deren gesamte Lehre hiermit als Referenz eingeführt wird). Die Zusammensetzung lässt sich nach bekannten Verfahren zur Herstellung von Impfstoffen herstellen. Die hier beschriebenen veränderten OspA-Polypeptide können z. B. nach bekannten Techniken, wie z. B. der Größenausschlusschromatographie, der Ionenaustauscherchromatographie, der Affinitätschromatographie, der präparativen Elektrophorese, der selektiven Fällung oder Kombinationen derselben, isoliert und/oder gereinigt werden. Die hergestellten Proteine können, wie oben beschrieben, mit geeigneten anderen Reagenzien vermischt werden, wobei das Protein in geeigneter Konzentration vorliegt. Die Dosierung des Proteins variiert und hängt vom Alter, Gewicht und/oder dem physischen Befinden des zu behandelnden Tieres ab. Die optimale Dosierung kann über Routine-Optimierungstechniken unter Einsatz geeigneter Tiermodelle ermittelt werden.
Die als Impfstoff einzusetzende Zusammensetzung kann nach jeder geeigneten Technik verabreicht werden. In einer Ausführungsform erfolgt die Verabreichung mittels Injektion, z. B. einer subkutanen, einer intramuskulären, einer intravenösen oder einer intraperitonealen Injektion. In einer anderen Ausführungsform wird die Zusammensetzung der Mucosa verabreicht, z. B. indem die Nasenmucosa Nasentropfen ausgesetzt wird, welche die Proteine der chimäre Proteine der vorliegenden Erfindung enthalten. In einer anderen Ausführungsform wird die immunogene Zusammensetzung oral verabreicht. In einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden die chimären Proteine mittels DNA-Immunisierung unter Einsatz von Nucleinsäuren verabreicht, welche ein verändertes OspA-Polypeptid codieren.
Die vorliegende Erfindung ist auch auf einen die hier beschriebenen veränderten OspA-Polypeptide enthaltenden diagnostischen Kit gerichtet. Der Kit enthält auch Reagenzien zum Nachweis von Antigen-Antikörper.Komplexen, die von dem OspA-Protein und Antikörpern gebildet werden, welche in einer Probe vorhanden sind, z. B. einer vom Anwender zur Verfügung gestellten Probe eines Wirts.
Die vorliegende Erfindung ist auch auf Verfahren zum Nachweis einer Immunreaktion gegen die Lyme-Krankheit verursachende Borrelia in einer Probe des Wirts gerichtet. Das Verfahren umfasst das in Kontakt Bringen einer Wirtsprobe mit einem veränderten OspA-Protein derart, dass sich Anti-OspA-Antikörper, falls in der Probe vorhanden, an dieses OspA-Protein binden. Die Menge der Antikörper, die sich an dieses OspA-Protein gebunden haben, wird gemessen, wodurch eine Immunreaktion gegen die Lyme-Krankheit verursachende Borrelia nachgewiesen wird.
BEISPIELE
Beispiel 1. Reinigung des äußeren Oberflächenproteins A von Borrelia burgdorferi und Analyse der Antikörper-Bindungs-Domänen
Dieses Beispiel beschreibt genau ein Verfahren zur Reinigung großer Mengen des nativen äußeren Oberflächenproteins A (OspA) bis zur Homogenität und beschreibt das Kartieren der antigenen Spezifitäten einiger Anti-OspA-mAbs. OspA wurde bis zur Homogenität gereinigt, indem sein Widerstand gegen einen Trypsin-Verdau ausgenutzt wurde. Eine innere Markierung mit ¹⁴C-Palmitinsäure bestätigte, dass OspA lipidiert war und ein Teilverdau ergab eine Lipidierung des amino-endständigen Cysteins des Moleküls.
Die Reaktivität von sieben murinen monoklonalen Anti-OspA-Antikörpern gegen neun unterschiedliche Borrelia-Isolate wurde mittels Western-Blot-Analyse bestätigt. Die Reaktivität der hier beschriebenen veränderten OspA-Polypeptide gegen 15 mit Hilfe ähnliche Methoden getestet. Das gereinigte OspA wurde mittels enzymatischer oder chemischer Spaltung fragmentiert und die monoklonalen Antikörper waren in der Lage, vier unterschiedliche immunogene Domänen zu definieren (siehe 1). Domäne 3, welche die Reste 190-220 von OspA enthielt, reagierte mit protektiven Antikörpern, von denen bekannt war, dass sie den Organismus in vitro agglutinieren, und wies bestimmte Spezifitäten auf, von denen einige nicht auf einen Gentyp von B. burgdorferi beschränkt waren.
A. Reinigung von nativem OspA
Die Solubilisierung von B. burgdorferi mit dem Detergens streift die äußeren Oberflächenproteine ab und ergibt teilweise gereinigte Präparate mit sowohl OspA als auch dem äußeren Oberflächenprotein B (OspB) (Barbour, A. G. et al., Infect. Immun., 52 (5): 549–554 (1986); Coleman, J. L. et al., J. Infect. Dis. 155 (4): 756–765 (1987); Cunningham, T. M. et al., Ann. NY Acad. Sci. 539: 376–378 (1988); Brandt, M. E. et al., Infect. Immun. 58: 983–991 (1990); Sambri, V. und R. Cevenini, Microbiol. 14: 307–314 (1991)). Obwohl sowohl OspA als auch OspB gegen einen Proteinase K-Verdau empfindlich sind, ist OspA im Gegensatz zu OspB gegen eine Spaltung mit Trypsin resisitent (Dunn, J. et al., Prot. Exp. Purif. 1: 159–168 (1990); Barbour, A. G. et al., Infect. Immun., 45: 94–100 (1984)). Angesichts der Tatsache, dass OspB A einen hohen Gehalt an Lysin (16% für B31) aufweist, ist die relative Unempfindlichkeit gegen Trypsin erstaunlich und kann mit der relativen Konfiguration von OspB A und B in der Außenmembran zusammenhängen.
Intrinsische radioaktive Markierung von Borrelia
Die Markierung der Lipoproteine erfolgte wie bei Brandt et al. (Brandt et al., Infect. Immun. 58: 983–991 (1990)) beschrieben. ¹⁴C-Palmitinsäure (ICN, Irvine, Kalifornien) wurde dem BSK II-Medium bis zu einer Endkonzentration von 0,5 μCi pro Milliliter (ml) zugesetzt. In diesem Medium wurden die Organismen bei 34°C in Kultur gehalten bis eine Dichte von 10⁸ Zellen pro ml erreicht war.
Reinigung des OspA-Proteins aus dem Borrelia-Stamm B31
Entweder mit ¹⁴C-Palmitinsäure markierte oder nicht markierte Borrelia burgdorferi wurden geerntet und wie beschrieben gewaschen (Brandt, M. E. et al., Infect. Immun. 58: 983–991 (1990)). Die ganzen Organismen wurden nach der Vorschrift von Barber et al. (Infect. Immun. 45: 94–100 (1984)) mit einigen Modifikationen trypsinisiert. Das Pellet wurde in phosphatgepufferter Saline (PBS, 10 mM, pH 7,2) suspendiert, welche 0,8% mit Tosyl-Lphenylalaninchiormethylketon (TPCK)-behandeltes Trypsin (Sigma, St. Louis, Missouri) enthielt, letzteres in einem Anteil von 1 μg pro 10⁸ Zellen. Die Reaktion erfolgte bei 25°C über einen Zeitraum von 1 Stunde, wonach die Zellen abzentrifugiert wurden. Das Pellet wurde in PBS mit 100 μg/ml Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF) gewaschen. Die Partitionierung des Pellets mit Triton X-114 wurde wie bei Brandt et al. beschrieben durchgeführt (Brandt et al., Infect. Immun. 58: 983–991 (1990)). Nach der Trypsin-Behandlung wurden die Zellen in eiskaltem 2% (v/v) Triton X-114 mit 10⁹ Zellen pro ml resuspendiert. Die Suspension wurde über Nacht bei 4°C rotieren gelassen und die unlösliche Fraktion nach einer Zentrifugation bei 10.000 g über einen Zeitraum von 15 Minuten bei 4°C als Pellet entfernt. Der Überstand (lösliche Fraktion) wurde bei 37°C 15 Minuten lang inkubiert und bei Raumtemperatur bei 1000 g 15 Minuten lang zentrifugiert, um die Wasser- und Detergensphase voneinander zu trennen. Die wässrige Phase wurde dekantiert und zu der unteren Triton-Phase wurde eiskalte PBS gegeben, vermischt, auf 37°C erwärmt und erneut bei 1000 g 15 Minuten lang zentrifugiert. Der Waschvorgang wurde zwei weitere Male wiederholt. Schließlich wurde das Detergens aus dem Präparat mit Hilfe einer Spin-Säule mit Bio-Beads SM2 (BioRad, Melville, New York) wie beschrieben entfernt (Holloway, P. W., Anal. Biochem. 53: 304–308 (1973)).
Wie von Dunn et al. (Dunn et al., Prot. Exp. Purif. 1: 159–168 (1990)) beschrieben wurde mit geringfügigen Abänderungen eine Ionenaustauscherchromatographie durchgeführt. Rohes OspA wurde in Puffer A (1% Triton X-100, 10 mM Phosphatpuffer (pH 5,0)) gelöst und auf ein mit Puffer A bei 25°C voräquilibriertes SP Sepharose-Harz (Pharmacia, Piscataway, New Jersey) aufgetragen. Nach Waschen der Säule mit 10 Bettvolumina Puffer A wurde das gebundene OspA mit Puffer B (1% Triton X-100, 10 mM Phosphatpuffer (pH 8,0)) eluiert. Die OspA-Fraktionen wurden mit einem Protein-Assay unter Verwendung der BCA-Methode (Pierce, Rockford, Illinois) oder als Radioaktivität nachgewiesen, wenn das intrinsisch markierte Material fraktioniert wurde. Triton X-100 wurde mit Hilfe einer Spin-Säule aus Bio-Beads SM2 entfernt.
Diese Methode reinigt OspA aus einem Präparat einer äußeren Oberflächenmembran. Ohne eine Trypsin-Behandlung waren OspA und B die Hauptkomponenten der nach der Triton-Partitionierung des Stammes B31 erhaltenen löslichen Fraktion. Wurde die Triton-Extraktion nach der Trypsin-Behandlung durchgeführt, war im Gegensatz dazu keine OspB-Bande zu sehen. Eine weitere Reinigung von OspA-B31 auf einer SP Sepharose-Säule führte mittels SDS-PAGE zu einer einzelnen Bande. Die Ausbeute nach Entfernung des Detergens betrug ungefähr 2 mg pro Liter Kultur. Dieses Verfahren der Reinigung von OspA, wie es hier für Stamm 31 beschrieben wurde, kann genau so gut für andere Isolate von Borrelia eingesetzt werden. Für Stämme wie Stamm K48, denen OspB fehlt, kann die Behandlung mit Trypsin entfallen.
Ort der Lipidierung von OspA-B31
Mit ¹⁴C-Palmitinsäure markiertes OspA aus dem Stamm B31 wurde wie oben beschrieben gereinigt und teilweise mit Endoproteinase-Asp-N verdaut. Nach dem Verdau war mittels SDS-PAGE eine neue niedermolekulare Bande zu erkennen, von der durch direkte aminoterminale Sequenzierung gefunden wurde, dass sie bei Asp₂₅ beginnt. Diese Bande wies in der Autoradiographie keine Spur von Radioaktivität auf. OspA und B enthalten eine Signalsequenz (L-X-Y-C) ähnlich der für Lipoproteine von E. coli beschriebenen Konsensus-Sequenz und es ist vorausgesagt worden, dass der Lipidierungsort von OspA und B das aminoterminale Cystein sein sollte (Brandt, M. E. et al., Infect. Immun. 58: 983–991 (1990)). Die hier vorgestellten Ergebnisse stützen diese Voraussage.
B. Vergleich der OspA-Antikörper-Bindungsregionen in neun Stämmen von Borrelia burgdorferi
Die Verfügbarkeit der Aminosäuresequenz für OspA aus verschiedenen Isolaten in Kombination mit einer Peptid-Kartierung und Western-Blot-Analyse erlaubte die Identifizie rung der von monoklonalen Antikörpern (mAbs) erkannten antigenen Domänen und gestattete die Folgerung der für die spezifische Antikörper-Reaktivität verantwortlichen hauptsächlichen Aminosäurereste.
Stämme von Borrelia burgdorferi

Neun Stämme von Borrelia, einschließlich sieben europäischen und zwei nordamerikanischen Stämmen, wurden in dieser Untersuchung der Antikörper-Bindungsdomänen verschiedener Proteine eingesetzt. Die Information zu den Stämmen ist unten in Tabelle I zusammengestellt. Tabelle I. Repräsentative Borrelia-Stämme

Stamm	Vorkommen und Quelle	Literatur zum Stamm
K48	Czechoslowakei, Ixodes ricinus	keine
pGAU	Deutschland, humane ACA	Wilske, B. et al., J. Clin. Microbiol. 32: 340–350 (1993)
DK29	Dänemark, humane EM	Wilske, B. et al.
Pko	Deutschland, humane EM	Wilske, B. et al.
PTrob	Deutschland, humane Haut	Wilske, B. et al.
Ip3	Khabarovsk, Russland, I. persulcatus	Asbrink, E. et al., Acta Derm. Venereol. 64: 506–512 (1984)
Ip90	Khabarovsk, Russland, I. persulcatus	Asbrink, E. et al.
25015	Millbrook, N. Y., I. persulcatus	Barbour, A. G. et al., Curr. Micribiol. 8: 123–126 (1983)
B31	Shelter Island, NY, I. scapularis	Luft, B. J. et al., Infect. Immun. 60: 4309–4321 (1992); ATCC 35210
PKa1	Deutschland, humane CSF	Wilske, B. et al.
ZS7	Freiburg, Deutschlans, I. ricinus	Wallich, R. et al., Nucl. Acids Res. 17: 8864 (1989)
N40	Westchester Co., NY	Fikrig, E. et al., Science 250: 553–556 (1990)
PHei	Deutschland, humane CSF	Wilske, B. et al.
ACAI	Schweden, humane ACA	Luft, B. J. et al., FEMS Microbiol. Lett. 93: 73–68 (1992)
PBo	Deutschland, humane CSF	Wilske, B. et al.

ACA: = Patient mit Acrodermatitis chronica atrophicans;
EM: = Patient mit Erythema migrans;
CSF: = cerebrospinale Flüssigkeit eines Patienten mit Lyme-Krankheit.

Die Stämme K48., PGau und DK29 wurden von R. Johnson, University of Minnesota zur Verfügung gestellt; PKo und PTrob wurden von P. Wilske und V. Preac-Mursic vom Pettenkofer-Institut, München, Deutschland geliefert und Ip3 und Ip90 wurden von L. Mayer vom Center of Disease Control, Atlanta, Georgia zur Verfügung gestellt. Die nordamerikanischen Stämme umfassten den von J. Anderson vom Connecticut Department of Agriculture zur Verfügung gestellten Stamm 25015 sowie Stamm B31 (ATCC 35210).
Monoklonale Antikörper
In dieser Untersuchung wurden sieben monoklonale Antikörper (mAbs) eingesetzt. Fünf der mAbs (12, 13, 15, 83 und 336) wurden aus Hybridoma gewonnen, welche wie zuvor beschrieben geklont und subgeklont wurden (Schubach, W. H. et al., Infect. Immun. 59(6): 1911–1915 (1991)). Der mAb H5332 (Barbour, A. G. et al., Infect Immun. 41: 795–804 (1983)) war eine Spende von Drs. Alan Barbour, University of Texas und der mAb CIII. 78 (Sears, J. E. et al., J. Immunol. 147(6): 1995–2000 (1991)) war eine Spende von Richard A. Flavell, Yale University. Die mAbs 12 und 15 wurden gegen beschallte ganze B3 gezüchtet; der mAb 336 wurde gegen ganze PGau produziert und die mAbs 13 und 83 wurden gegen eine eingekürzte Form von OspA gezüchtet, das aus dem K48-Stamm geklont und unter Einsatz des T7 RNA-Polymerase-Systems (McGrath, B. C. et al., Vaccines, Cold Spring Harbor Laborstory Press, Plainview, New York, S. 365–370 (1993)) in E. coli exprimiert wurde. Alle mAbs wurden dem Immunglobulin G (IgG)-Typ zugeordnet.
Verfahren zur Spaltung von Proteinen, zum Western-Blotting und zur aminoterminalen Sequenzierung
Die Voraussage der verschiedenen Spaltstellen wurde in Kenntnis der primären Aminosäuresequenz erreicht, die aus den vollständigen Nucleotidsequenzen von OspA, von denen derzeit viele zur Verfügung stehen (siehe unten Tabelle II), abgeleitet wurden. Die Spaltstellen lassen sich auch auf Grundlage der Peptidsequenz von OspA voraussagen, welche sich mit Hilfe von Standardtechniken nach Isolierung und Reinigung von OspA nach den oben beschriebenen Verfahren ermitteln lässt. Es wurde eine Spaltung von einigen OspA- Isolaten durchgeführt, um den Ort der Bindung der Proteine an die monoklonalen Antikörper zu ermitteln.
Die Hydroxylamin-HCl (HA)-, N-Chlorsuccinimid (NCS)- und Bromcyan-Spaltung von OspA wurden nach den von Bornstein (Biochem. 9(12): 2408–2421 (1970)), Shechter et al. (Biochem. 15(23): 5071–5075 (1976)) bzw. Gross in Hirs, C. H. W. (Hrg.): Methods in Enzymology, (N. Y. Acad. Press), 11: 238–255 (1967)) beschriebenen Verfahren durchgeführt. Die Protease-Spaltung mit Endoproteinase, Asp-N (Boehringer Mannheim, Indianapolis, Indiana) erfolgte wie von Cleveland D. W. et al. beschrieben (J. Biol. Chem. 252: 1102–1106 (1977)). Für jede Reaktion wurden 10 μg OspA eingesetzt. Das Verhältnis von Enzym zu OspA betrug ungefähr 1 zu 10 (w/w).
Die durch Spaltung gewonnenen Proteine und Peptide wurden mittels SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) (Laemmli, U. K., Nature (London) 227: 680–685 (1970)) aufgetrennt und auf Immobilon-Polyvinylidendifluorid (PVDF)-Membranen (Plaskal, M. G. et al., Biotechniques 4: 272–283 (1986)) einem Elektroblotting unterzogen. Sie wurden mittels Amidoschwarz-Färbung oder durch Immunfärbung mit murinen mAbs gefolgt von mit alkalischer Phosphatase konjugierten anti-Maus-IgG der Ziege nachgewiesen. Die spezifische Bindung wurde mit Hilfe eines 5-Brom-4-chlor-3-indoylphosphat (BCIP)/Nitroblau-Tetrazolium (NBT)-Entwickler-Systems (KPL, Inc., Gathersburg, Maryland) nachgewiesen.
Zusätzlich wurde an einigen Spaltungsprodukten eine aminoterminale Aminosäure-Sequenzanalyse wie bei Luft et al. beschrieben (Infect. Immun. 57: 3637–3645 (1989)) durchgeführt. Die Amidoschwarz-gefärbten Banden wurden aus den PVDF-Blots ausgeschnitten und mittels Edman-Abbau unter Einsatz eines Biosystems-Model 475A-Sequenators mit einem Model-120A-PTH-Analyzer und einem Model-900A-Control/data-Analyzer sequenziert.
Spaltungsprodukte der Isolate des äußeren Oberflächenproteins A
Mit ¹⁴C-Palmitinsäure markiertes gereinigtes OspA-B31 wurde mit Hydroxylamin-HCl (HA) in zwei Peptide mit der Bezeichnung HA1 und HA2 fragmentiert (Daten nicht ange geben). Die HA1-Bande migrierte bei 27 kD und behielt ihre Radioaktivität bei, was zeigt, dass das Peptid die Lipidierungsstelle am N-Terminus des Moleküls enthielt (Daten nicht wiedergegeben). Wegen der vorausgesagten Spaltungsstelle sollte HA1 den Resten 1 bis 251 von OspA-B31 entsprechen. HA2 wies ein mittels SDS-PAGE ermitteltes Molekulargewicht von 21,6 kD auf, wobei eine Analyse ergab, dass die aminoterminale Sequenz bei Gly72 beginnt, d. h. die Reste 72 bis 273 des OspA-B31 umfasst. Im Gegensatz dazu spaltete HA das OspA-K48 in drei Peptide mit der Bezeichnung HA1, HA2 und HA3 mit offensichtlichen Molekulargewichten von 22 kD, 16 kD bzw. 12 kD. Die Sequenzierung des N-Terminus ergab, dass HA1 bei Gly72 und HA 3 bei Gly143 begannen. Es wurde gefunden, dass HA2 einen blockierten N-Terminus aufwies, wie dies auch für die volle Länge des OspA-Moleküls beobachtet wurde. Es wurde vorausgesagt, dass HA1, 2 und 3 von OspA-K48 die Reste 72-274, 1-141 bzw. 142-274 umfassten.
N-Chlorsuccinimid (NCS) spaltet Tryptophan (W), welches sich an Position 216 von OspA-B31 oder an Position 217 von OspA-K48 befindet (Daten nicht gezeigt). NCS spaltete OspA-B31 in zwei Fragmente, nämlich NCS1 mit den Resten 1-216 des Proteins und einem MG von 23 kD und in NCS2 mit den Resten 217-273 und einem MG von 6,2 kD (Daten nicht gezeigt). Ähnlich wurde das K48-OspA in zwei Stücke zerlegt, nämlich NCS1 mit den Resten 1-217 und NCS2 mit den Resten 218-274 (Daten nicht gezeigt).
Die Spaltung von OspA durch Bromcyan (CNBr) findet an der Carboxyseite des Methionins, Rest 39, statt. Das mit der aminoterminalen Aminosäure-Sequenzanalyse gefundene Hauptfragment CNBr1 mit den Resten 39-274 weist ein MG von 25,7 kD auf (Daten nicht gezeigt). Das CNBr2 (etwa 4 kD) ließ sich mit einer Amidoschwarz-Färbung nicht sichtbar machen; stattdessen wurden leicht gefärbte Banden für ein MG von etwa 20 kD gesehen. Diese Banden reagierten mit anti-OspA-mAbs und waren höchstwahrscheinlich durch Spaltung mit Ameisensäure hervorgerufene Abbauprodukte.
Bestimmung der Antikörper-Bindungsdomänen für monoklonale anti-OspA-Antikörper
Die Spaltungsprodukte von OspA-B31 und OspA-K48 wurden mit einem Western-Blot analysiert, um ihre Fähigkeit zu bewerten, sich an die sechs unterschiedlichen mAbs zu binden. Eine vorausgehende Western-Blot-Analyse der Spaltungsprodukte zeigte, dass die Stämme K48 und DK29 ähnliche Reaktivitätsmuster aufwiesen wie Ip3, PGau und PKo. Das OspA des Stammes PTrob unterschied sich immunologisch von den anderen, was nur von mAb 336 erkannt wurde. Von mAb 12 wurden nur die beiden nordamerikanischen Stämme B31 und 25015 erkannt. Wurden die Isolate in Gengruppen aufgeteilt, war es beachtenswert, dass alle mAbs mit Ausnahme von mAb 12 sich überkreuzten, um mit multiplen Gengruppen zu reagieren.
Der für OspA-B31 spezifische mAb 12 band sich sowohl an HA1 als auch an HA2 von OspA-B31. Die Spaltung von OspA-B31 durch NCS am Rest Trp216 erzeugte jedoch Fragmente, die nicht mit mAb 12 reagierten, was nahe legt, dass die relevante Domäne in der Nähe dieses Restes liegt oder strukturell von ihm abhängig ist (Daten nicht gezeigt). Der mAb 13 band sich nur an OspA-K48 sowie an Peptide, welche den Amino-Terminus dieses Moleküls enthielten (z. B. HA2; NCS1). Er wurde nicht an die CNBr1-Reste 39 bi 274 gebunden. Somit ist die von mAb 13 erkannte Domäne das aminoterminale Ende von OspA-K48 in der Nähe von Met38.
Der mAb 15 reagiert sowohl mit dem OspA das Stammes B31 als auch mit dem OspA das Stammes K48 sowie mit Peptiden, die den N-Terminus von OspA enthalten, wie z. B. HA1 von OspA-B31 und NCS1), aber nicht mit den Peptiden HA2 von OpsA-B31 und HA1 von OspA-K48 (Daten nicht gezeigt). Beide Peptide enthalten den Rest 72 aus dem C-Terminus der Moleküle. Der mAb 15 wurde an das CNBr1 von OspA-K48 gebunden, was darauf hinweist, dass die Domäne für diesen Antikörper aus den Resten 39 bis 72 besteht, speziell in der Nähe von Gly72 (Daten nicht gezeigt).
Der mAb 83 wird an OspA-K48 gebunden sowie an Peptide, welche den C-terminalen Anteil des Moleküls enthalten, wie z. B. HA1. Sie werden nicht an HA2 von OspA-K48 gebunden, höchstwahrscheinlich weil der C-Terminus des HA2 von OspA-K48 bei Rest 141 endet. Ähnlich wie bei mAb 12 und OspA-B31 wird die Bindung der mAbs 83 und CIII. 78 durch die Spaltung von OspA am Tryptophanrest unterbunden. Somit hängt die Bindung der mAbs 12, 83 und CIII. 78 an OspA von der strukturellen Unversehrtheit des Trp₂₁₆-Restes ab, welcher für die Antigenizität kritisch zu sein scheint. Obwohl diese Antikörper sich an gewöhnliche antigene Domänen binden, ist es auch offensichtlich, dass die genauen Epitope, welche sie erkennen, sich angesichts der unter den Stämmen herrschen den unterschiedlichen Kreuzreaktivitätsgrade gegen diese mAbs voneinander unterscheiden.
Obwohl es mit der Spaltung an Trp₂₁₆ einen ähnlichen Verlust der Bindungsaktivität des mAb 336 gibt, bindet sich dieser mAb nicht an HA1 des OspA-B31, was nahe legt, dass die Domäne für diesen Antikörper das carboxyterminale Ende des Moleküls enthält, einschließlich der Reste 251 bis 273. Die niedermolekularen Peptide von OspA-K48, wie z. B. HA3 (10 kD) und NCS2 (6 kD) binden sich beim Western-Blotting nicht an diesen Antikörper. Um diese Beobachtung zu bestätigen, testeten wir die Bindung dieser 6 mAbs mit dem rekombinanten Fusionskonstrukt p3A/EC, welches ein mit den Resten 217 bis 273 des OspA-B31 fusioniertes trpE-Leaderprotein enthält (Schubach, W. H. et al., Infect. Immun. 59(6): 1911–1915 (1991)). Nur der mAb 336 reagierte mit diesem Konstrukt (Daten nicht gezeigt). Die durch Fragmentierung des OspA lokalisierten Peptide und antigenen Domänen werden in 1 zusammengefasst.
Beispiel 2 Ortsgerichtete Mutagenese innerhalb der hypervariablen Domänen A (Reste 120-140), B (Reste 150-180) und C (Reste 200-216 oder 217)
Es wurde eine ortsgerichtete Mutagenese durchgeführt, um die Reste innerhalb der Domäne 204-219 des rekombinanten B31-OspA in die analogen Reste einer europäischen OspA-Variante, K48, umzuwandeln. In der OspA-Region zwischen den Resten 204 und 219 gibt es zwischen OspA-B31 und OspA-K48 sieben Aminosäure-Unterschiede. Es wurden drei Oligonucleotide erzeugt, von denen jedes Änderungen in den Nucleotiden enthielt, welche die Aminosäuren von K48 an ihren analogen Positionen in das OspA-Protein von B31 einbauen würden. Die zur Erzeugung der ortsgerichteten Mutanten eingesetzten Oligos waren:
Die ortsgerichtete Mutagenese erfolgte, indem die Mutagenese mit Paaren der obigen Oligonucleotide ausgeführt wurde. Es wurden drei ortsgerichtete Mutanten erzeugt, jede mit zwei Vertauschungen: OspA 613 (Thr204-Ser, Thr206-Ser), OspA 625 (Ala214-Gly, Ala215-Lys) und 640 (Asn217-Asp, Gly219-Lys). Es gab auch zwei Proteine mit vier Vertauschungen: OspA 613/625 (Thr204-Ser, Thr206-Ser, Ala214-Gly, Ala215-Lys) und OspA 613/640 (Thr204-Ser, Thr206-Ser, Asn217-Asp, Gly219-Lys).
Spezifität der Antikörper-Bindung an Epitope der nicht mutierten hypervariablen Region
Monoklonale Antikörper, die Spirochäten agglutinieren, einschließlich von einigen, die in vitro neutralisieren, erkennen Epitope, welche auf der hypervariablen Region um Trp216 anzutreffen sind (Barbour, A. G. et al., Infect. and Immun. 41: 759 (1983); Schubach, W. H. et al., Infect. and Immun. 59: 1911 (1991)). Eine Western-Blot-Analyse zeigte, dass eine chemische Spaltung von OspA aus dem Stamm B31 bei Trp216 die Reaktivität des Proteins mit dem agglutinierenden mAb 105, einem gegen B31-Spirochäten gezüchteten monoklonalen Antikörper, zerstört. Das Reagens N-Chlorsuccinimid (NCS) spaltet OspA bei Trp216 und bildet ein Fragment von 23,2 kD und ein Peptid von 6,2 kD, das nach der Übertragung auf eine Imobilon-P-Membran nicht zurückgehalten wird. Das nicht gespaltene Material bindet sich an mAb 105; das Fragment von 23,2 kD ist jedoch nicht reaktiv. Ähnliche Western-Blots mit einem TrpE-OspA-Fusionsprotein, welches den carboxyterminalen Abschnitt von OspA enthält, zeigten, dass das kleine Stück von 6,2 kD ebenfalls nicht an mAb 105 bindet (Schubach, W. H. et al., Infect. and Immun. 59: 1911 (1991)).
Mittels Immunfluoreszenz ist gezeigt worden, dass die monoklonalen Antikörper H5332 und H3TS (Barbour, A. G. et al., Infect. and Immun. 41: 759 (1983) auf der Oberfläche von fixierten Spirochäten sitzen (Wilske, B. et al., World J. Microbiol. 7: 130 (1991)). Diese monoklonalen Antikörper hemmen auch das Wachstum des Organismus in Kultur. Eine Epitop-Kartierung mit Fusionsproteinen hat bestätigt, dass die Epitope, welche sich an diese mAbs binden, eine bestimmte Konformation aufweisen und in der Carboxy-Hälfte des Proteins sitzen. Der mAb H5332 ist unter allen bekannten phylogenetischen Gruppen kreuz-reaktiv, während der mAb H3TS und der mAb 105 spezifisch gegen den Stamm B31 zu sein scheinen, gegen welchen sie konzipiert wurden. Wie beim mAb 105 werden die Reaktivitäten von H5332 und H3TS gegen OspA durch eine Fragmentierung des Proteins bei Trp216 unterbunden (Daten nicht gezeigt). Der mAb 336 wurde gegen ganze Spirochäten des Stammes PGau gezüchtet. Er kreuz-reagiert mit OspA aus Gruppe 1 (die Gruppe, zu der B31 gehört) aber nicht mit Gruppe 2 (zu welcher K48 gehört). Frühere Untersuchungen mit Fusionsproteinen und chemischer Spaltung haben gezeigt, dass dieser Antikörper eine Domäne von OspA in der Region zwischen Rest 217 und 273 erkennt (Daten nicht gezeigt). Alle diese mAbs agglutinieren die Spirochäte B31.
Western-Blot-Analyse der Antikörper-Bindung an mutierte hypervariable Regionen
Die mAbs wurden für eine Western-Blot-Analyse der ortsgerichteten OspA-Mutanten eingesetzt, welche unter Einsatz des T7-Expressionssystems in E. coli induziert worden waren (Dunn, J. J. et al., Protein Expression and Purification I: 159 (1990)). Die E. coli-Zellen, welche pET9c-Plasmide mit einem Insert einer ortsgerichteten OspA-Mutante enthielten, wurden bei Wachstum in der mid-log-Phase mit IPTG vier Stunden lang bei 37°C induziert. Durch Kochen eines Aliquots der induzierten Kulturen in SDS-Gel-Logding-Dye wurden Zelllysate hergestellt und dieses Material dann auf ein 12% SDS-Gel (BioRad mini-Protean II) aufgetragen und einer Elektrophorese unterzogen. Die Proteine wurden dann auf Imobilon-P-Membranen (Millipore) 70 V, 2 Stunden bei 4°C unter Einsatz des BioRad mini-Transfer-Systems transferiert. Wie von Schubach et al. beschrieben (Infect. Immun. 59: 1911 (1991)) wurde eine Western-Analyse durchgeführt.
Die Western-Blot-Analyse zeigte, dass nur die 625-Mutante (Ala214-Gly und Ala215-Lys) die Bindung an den agglutinierenden monoklonalen H3TS-Antikörper beibehielt. Die 613/625-Mutante, welche zusätzliche Veränderungen am Amino-Terminus von Trp216 (Ser204-Thr und Thr206-Ser) aufwies, band diesen monoklonalen Antikörper jedoch nicht. Sowohl das 640-OspA als auch das 613/640-OspA, welche die Änderungen Asn217-Asp und Gly219-Lys an der Carboxy-terminalen Seite von Trp216 aufweisen, banden den mAb H3TS ebenfalls nicht. Dies wies daraufhin, dass das Epitop von OspA-B31, welches den mAb H3TS bindet, in den Aminosäure-Seitenketten zu beiden Seiten von Trp216 vorkommt.
Die Mutante 613/625 band die mAbs 105 und H5332 nicht, während die anderen Mutanten ihre Fähigkeit, diese mAbs zu binden, beibehielten. Dies ist wichtig angesichts der Daten, bei denen Fusionsproteine verwendet werden, welche zeigen, dass sich der mAb 105, was seine Serotyp-Spezifität und Bindung an OspA anbelangt, ähnlich wie der mAb H3TS verhalt (Wilske, B. er al., Med. Microbiol. Immunol. 181: 191 (1992)). Das 613/625-Protein weist zusätzlich zu den Unterschieden an den Resten Ser204 und Ser206 Veränderungen unmittelbar aminoterminal zum Trp216 auf (Ala214-Gly und Ala215-Lys). Der Abfall der Reaktivität der mAbs 105 und H5332 gegen dieses Protein zeigte, dass die Epitope von OspA, welche diese monoklonalen Antikörper binden, Reste auf der aminoterminalen Seite des Trp216 umfassen.
Die beiden Proteine, welche die Ersetzungen Asn217-Asp und Gly219-Lys auf der Carboxy-terminalen Seite von Trp216 enthalten (OspAs 640 und 613/640) erhielten die Bindung an die mAbs 105 und H5332 aufrecht; sie reagierten jedoch nicht mit dem mAb 336, einem monoklonalen Antikörper, welcher mit den TrpE-OspA-Fusionsproteinen und mittels chemischer Spaltung einer mehr Carboxy-terminalen Domäne zugeordnet worden ist. Dieses Ergebnis vermag zu erklären, warum der mAb 336 den K48-Typ von OspA (Gruppe 2) nicht erkannte.
Es ist klar, dass die Aminosäuren Ser204 und Thr206 eine wichtige Rolle bei den agglutinierenden Epitopen in der Region des das Trp216 flankierenden OspA-B31 spielen. Ein Austausch dieser beiden Reste veränderte die Epitope von OspA, welche die mAbs 105, H3TS und H5332 binden. Die Fähigkeit der 640-Veränderungen allein, die Reaktivität des mAb 336 zu zerstören, zeigte, dass Thr204 und Ser206 nicht an der direkten Wechselwirkung mit dem mAb 336 beteiligt sind.
Die Ergebnisse zeigten, dass die Epitope des OspA, welche für die mAbs, die Spirochäten agglutinieren verfügbar sind, mindestens zum Teil aus Aminosäuren in der unmittelbaren Nachbarschaft zu Trp216 bestehen. Da jüngste Analysen mit Circulardichroismus darauf hindeuteten, dass die Strukturen von OspA-B31 und -K48 sich in dieser Domäne nur wenig unterscheiden, ist es unwahrscheinlich, dass die durch Mutation hervorgerufenen Ver änderungen die Gesamtstruktur des OspA-Proteins radikal veränderten (France, L. L. et al., Biochem. Biophys. Acta 1120: 59 (1992) und France et al., Biochem. Biophys. Acta, eingereicht (1993)). Diese Hypothese wird von dem Befund gestützt, dass das rekombinante mutante OspA die gleichen Löslichkeits- und Reinigungs-Eigenschaften zeigt wie das Elternprotein B31 (Daten nicht gezeigt).
Zusammenfassend sind die Aminosäure-Seitenketten bei Ser204 und Thr206 für viele der agglutinierenden Epitope von Bedeutung. Eine beschränkte Zahl von konservativen Veränderungen an diesen Stellen war jedoch nicht ausreichend, die Bindung aller agglutinierenden mAbs zu zerstören. Diese Ergebnisse legten nahe, dass die agglutinierenden Epitope des OspA verschieden sind, doch auch etwas überlappem können. Die Ergebnisse stützten auch die Hypothese, dass das an der Oberfläche exponierte Epitop um Trp216, von dem angenommen wird, dass es für eine Immunerkennung und Neutralisation wichtig ist, eine bestimmte Konformation aufweist und eine komplexe Domäne des OspA darstellt.
Beispiel 3 Borrelia-Stämme und -Proteine
A. Gene, die Borrelia-Proteine codieren

Die veränderten OspA-Polypeptide der vorliegenden Erfindung können ein Teil eins Cocktails mit anderen Proteinen sein oder sie können mit anderen Proteinen verknüpft werden, um ein chimäres Protein zu bilden. Die anderen Polypeptide des Cocktails oder der Chimäre können von jedem Borrelia-Stamm abstammen. Repräsentative Proteine sind OspA, OspB, OspC, OspD, p12, p39, p41(fla), p66 und p93. Nucleinsäuresequenzen, die einige Borrelia-Proteine codieren, stehen zur Verfügung (siehe z. B. Tabelle II). Alternativ können Nucleinsäuresequenzen, die Borrelia-Proteine codieren, isoliert und charakterisiert werden, wobei Verfahren wie die unten beschriebenen eingesetzt werden. Tabelle II. Literatur über Nucleinsäuresequenzen für einige Proteine von Borrelia-Stämmen

Stamm	OspA
K48	X62624 (SID 8)
PGau	X62387 (SID 10)
DK29	X63412 (SID 21)
PKo	X65599 (SID 25)
PTrob	X65598 (SID 45)
Ip3	X70365 (SID 24)
Ip90	Kryuchechnikov, V. N. et al., J. Microbiol. Epid. Immunobiol. 12: 41–44 (1988) (SID 22) 1
25015	Fikrig, E. S. et al., J. Immunol. 7: 2256–2260 (1992) (SID 12)
B31	Bergstrom, S. et al., Mol. Microbiol. 3: 479–486 (1989) (SID 6)
PKa1	X69606 (SID 42)
ZS7	Jonsson, M. et al., Infect. Immun. 60: 1845–1853 (1992) (SID 44)
N40	Kryuchechnikov, V. N. et al., (SID 43)
PHei	X65600 (SID 46)
ACAI	Kryuchechnikov, V. N. et al., (SID 26)
PBo	X65605 (SD 23)

Zahlen mit dem Präfix "X" sind die Accession Numbers der Datenbank GenBank.
SID = SEQ ID NO.
B. Isolierung der Borrelia-Gene
Die Nucleinsäuresequenzen, welche die lipidierten Proteine in voller Länge aus bekannten Borrelia-Stämmen codieren, wurden mit Hilfe der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) wie unten beschrieben isoliert. Zusätzlich wurden Nucleinsäuresequenzen erzeugt, die einge kürzte Proteine codierten (Proteine, in welchen das Lipidierungssignal entfernt worden ist, wie z. B. durch Eliminierung der Nucleinsäuresequenz, welche die ersten 18 Aminosäuren codiert, was zu nicht lipidierten Proteinen führt). Es wurden andere Proteine erzeugt, welche Polypeptide eines besonderen Gens codierten (d. h., welche ein Segment des Proteins codieren, das eine unterschiedliche Anzahl von Aminosäuren aufweist wie das Protein in der Natur). Mit Hilfe ähnlicher Verfahren wie die unten beschriebenen, lassen sich aus bekannten Borrelia-Proteine codierenden Nucleinsäuresequenzen Primer erzeugen und dazu verwenden, andere Borrelia-Proteine codierende Gene zu isolieren. Es können Primer entworfen werden, um sowohl ein ganzes Gen zu amplifizieren als auch um eine Nucleinsäuresequenz zu amplifizieren, welche eingekürzte Proteinsequenzen wie die unten für OspC beschriebene codiert oder Nucleinsäuresequenzen, die ein von einem Borrelia-Protein stammendes Polypeptid codieren. Die Primer können auch so konzipiert werden, dass sie Restriktionsenzym-Spaltstellen mit Unique-Sequenz in die amplifizierten Nucleinsäuresequenzen einbauen. Mit Hilfe von Standardtechniken kann dann eine Sequenzanalyse der amplifizierten Nucleinsäuresequenzen durchgeführt werden.
Klonierung und Sequenzierung von OspA-Genen und relevanten Nucleinsäuresequenzen
Die Borrelia-OspA-Sequenzen wurden auf die folgende Weise isoliert: es wurden 100 μl Reaktionslösungen eingesetzt, welche 50 mM KCl, 10 mM TRIS-HCl (pH 8,3), 1,5 mM MgCl₂, jeweils 200 μM NTP, 2,5 Einheiten TaqI-DNA-Polymerase (Amplitaq, Perkin Elmer/Cetus) und jeweils 100 pM (der unten beschriebenen) 5'- und 3'-Primer enthielten. In einem Perkin-Elmer/Cetus-Thermal-Cycler wurde wie beschrieben eine Amplifizierung durchgeführt (Schubach, W. H. et al., Infect. Immun. 59: 1811–1915 (1991)). Mittels Ethidiumbromid-Färbung wurde das Amplicon auf einem Agarosegel sichtbar gemacht. 20 ng des mit Chloroform extrahierten PCR-Produkts wurden nach den Angaben des Herstellers direkt in den PC-TA-Vektor (Invitrogen) kloniert. Die das amplifizierte Fragment enthaltenden rekombinanten Kolonien wurden selektiert, die Plasmide wurden hergestellt und mit der Didesoxy-Kettenterminations-Technik unter Einsatz des Sequenase-Kits (United States Biochemical) die Aminosäuresequenz von jedem OspA ermittelt. Mit M13-Primern gefolgt von OspA-spezifischen Primer, die von Sequenzen stammen, welche zuvor mit M13-Primern erhalten wurden, wurde eine gerichtete Sequenzierung durchgeführt.
Weil die 5'- und 3'-Enden des OspA-Gens hoch konserviert sind (Fikrig, E. S. et al., J. Immunol. 7: 2256–2260 (1992); Bergstrom, S. et al., Mol. Microbiol. 3: 479–486 (1989); Zumstein, G. et al., Med. Microbiol. Immunol. 181: 57–70 (1992)), können der 5'- und 3'-Primer zum Klonieren auf jeder bekannten OspA-Sequenz basieren. Beispielsweise wurden die folgenden auf der OspA-Nucleinsäuresequenz von Stamm B31 basierenden Primer eingesetzt:
Die auf diese Weise isolierten OspA-Gene umfassen solche für die Stämme B31, K48, PGau und 25015; die Nucleinsäuresequenzen sind im Sequenzprotokoll als SEQ ID NO: 6 (OspA-B31), SEQ ID NO: 8 (OspA-K48), SEQ ID NO: 10 (OspA-PGau) und SEQ ID NO: 12 (OspA-25015) dargestellt. Ein Alignment dieser und anderer OspA-Nucleinsäuresequenzen wird in 17 gezeigt. Die Aminosäuresequenzen für die von diesen Nucleinsäuresequenzen codierten Proteine werden als SEQ ID NO: 7 (OspA-B31), SEQ ID NO: 9 (OspA-K48), SEQ ID NO: 11 (OspA-PGau) und SEQ ID NO: 13 (OspA-25015) wiedergegeben.
Es wurden die folgenden Primer verwendet, um spezifische Nucleinsäuresequenzen des OspA-Gens zu erzeugen:
C. Protein-Expression von Borrelia-Genen
Die oben beschriebenen Nucleinsäuresequenzen können mit Hilfe von Standardtechniken in Expressions-Plasmide eingebaut und in kompatible Wirtszellen transfiziert werden, um die von den Nucleinsäuresequenzen codierten Proteine zu exprimieren. Als Beispiel werden die Expression des p12-Gens und die Isolierung des p12-Proteins angegeben.
Die Amplifikation der Nucleinsäuresequenz von p12 wurde mit Primern durchgeführt, welche eine NdeI-Restriktionsstelle in die Nucleisäuresequenz einschlossen. Das PCR-Produkt wurde mit Phenol/Chloroform extrahiert und mit Ethanol gefällt. Das gefällte Produkt wurde einem Verdau unterzogen und wie folgt in ein Expressions-Plasmid ligiert: 15 μl (ungefähr 1 μg) PCR-DNA wurden mit 2 μl 10 × Restriktionspuffer für NdeI (Gibco/BRL), 1 μl NdeI (Gibco/BRL) und 2 ml destilliertem Wasser vereinigt und über Nacht bei 37°C inkubiert. Diese Mischung wurde sodann mit 3 μl 10 × Puffer (Puffer 3, New England BioLabs), 1 μl BamHI (NEB) und 6 μl destilliertem Wasser vereinigt und bei 37°C zwei Stunden lang inkubiert. Das erhaltene Material wurde mittels präparativer Gelelektrophorese mit Hilfe niedrig schmelzender Agarose gereinigt und die Bande unter langwelligem UV-Licht sichtbar gemacht und aus dem Gel ausgeschnitten. Das Gelstück wurde unter vom Hersteller empfohlenen Bedingungen mit Gelase behandelt (Epicentre Technologies). Das erhaltene DNA-Pellet wurde in 25–50 μl 10 mM Tris-CL (pH 8,0) und 1 mM EDTA (TE) resuspendiert. Ein Aliquot dieses Materials wurde in den pET9c-Expressionsvektor ligiert (Dunn, J. J. et al., Protein Expression and Purification 1: 159 (1990)).
Zum Ligieren des Materials in den pET9c-Expressionsvektor wurden 20–50 ng der wie oben beschrieben geschnittenen und gereinigten Nucleinsäuresequenzen mit 5 μl 10 One-Phor-All(OPA)-Puffer (Pharmacia), 30–60 ng mit NdeI und BamHI geschnittenem pET9c, 2,5 μl 20 mM ATP, 2 μl in 1 × OPA-Puffer 1:5 verdünnter T4-DNA-Ligase (Pharmacia) und ausreichend destilliertem Wasser vereinigt, um das Endvolumen auf 50 μl zu bringen. Die Mischung wurde bei 12°C über Nacht inkubiert.
Die erhaltenen Ligationen wurden in kompetente DH5-Alpha-Zellen transformiert und auf Nährstoff-Agarplatten, die 50 μg/ml Kanamycin enthielten, ausplattiert und über Nacht bei 37°C inkubiert. DH5-apha wird als "Speicher-Stamm" für die T7-Expressionsklone be nutzt, weil es RecA-defizient ist, so dass eine Rekombination und Concatenation kein Problem darstellen und weil ihm das T7-RNA-Polymerase-Gen fehlt, welches für die Expression des geklonten Gens benötigt wird. Die Verwendung dieses Stammes gestattet das Klonieren von potentiell toxischen Genprodukten, während es die Chance einer Deletion und/oder Umordnung der gewünschten Gene möglichst klein hält. Andere Zelllinien mit ähnlichen Eigenschaften können ebenfalls eingesetzt werden.
Gegen Kanamycin resistente Kolonien wurden einer Single-Colony-Reinigung auf mit 50 μg/ml Kanamycin supplementierten Nährstoff-Agarplatten unterzogen. Eine Kolonie aus jedem Isolat wurde in 3–5 ml 50 μg/ml Kanamycin enthaltendes Flüssigmedium überimpft und ohne Rühren bei 37°C inkubiert. Unter Einsatz einer heißen alkalischen Lyse wurde aus 1 ml von jedem Isolat Plasmid-DNA erhalten (Mantiatis, T. et al., Molecular Cloning: A Laborstory Manual, Cold Spring Harbor Laborstory, Cold Spring Harbor, NY (1982)).
Die Plasmid-DNA wurde mit EcoRI und BglII auf die folgende Weise verdaut: 15 μl Plasmid-DNA wurden mit 2 μl 10 × Puffer 3 (NEB), 1 μl EcoRI (NEB), 1 μl BglII (NEB) und 1 μl destilliertem Wasser vereinigt und zwei Stunden lang bei 37°C inkubiert. Das gesamte Reaktionsgemisch wurde auf einem analytischen Agarose-Gel einer Elektrophorese unterzogen. Die Plasmide, welche das p12-Insert enthielten, wurden durch das Vorkommen einer Bande identifiziert, die 925 Basenpaaren (volle Länge von p12) oder 875 Basenpaaren (nicht lipidiertes p12) entsprach. Eines oder zwei Plasmid-DNAs aus der vollen Länge und nicht lipidierte p12-Klone in pET9c wurden verwendet, um, wie bei Studier et al. (Methods in Enzymology, Goeddel, D. (Hrg.), Academic Press, 185: 60–89 (1990)) beschrieben, BL21(DE3) pLysS zu einer Resistenz gegen Kanamycin zu transformieren. Ein oder zwei Transformanten der Klone mit voller Länge und der nicht lipidierten Klone wurden auf Närstoff-Platten, die 25 μg/ml Chloramphenicol (zur Unterstützung von pLysS) und 50 μg/ml Kanamycin enthielten, bei 37°C einer Single-Colony-Reinigung unterzogen. Eine Kolonie von jedem Isolat wurde in ein mit Chloramphenicol und Kanamycin supplementiertes Fltissigmedium überimpft und über Nacht bei 37°C inkubiert. Die über Nacht gewachsene Kultur wurde am nächsten Morgen in 500 ml flüssige Nährbouillon mit Chloramphenicol (25 μg/ml) und Kanamycin (50 μg/ml) abgeimpft und unter Belüftung bei 37°C in einem Drehschüttler angezüchtet bis die Extinktion bei 600 nm bei 0,4–0,7 angekommen war. Zum Induzieren wurde Isopropylthiogalactosid (IPTG) bis zu ei ner Endkonzentration von 0,5 mM zugegeben und die Kultur 3 bis 4 Stunden lang bei 37°C wie zuvor inkubiert. Die induzierten Zellen wurden mittels Zentrifugation zu einem Pellet versammelt und in 25 ml 20 mM NaPO₄ (pH 7,7) resuspendiert. Ein kleines Aliquot wurde für eine Analyse mittels Gelelektrophorese entnommen. Die exprimierenden Klone produzierten Proteine, welche bis zur 12 kd-Position wanderten.
Aus der Kultur wurde, wie für das rekombinante OspA von Dunn, J. J. et al., (Protein Expression and Purification 1: 159 (1990)) beschrieben, ein rohes Zelllysat hergestellt. Das Rohlysat wurde zunächst über eine Q-Sepharose-Säule (Pharmacia) geschickt, welche in Puffer A: 10 mM NaPO₄ (pH 7,7), 10 mM NaCl, 0,5 mM PMSF voräquilibriert worden war. Die Säule wurde mit 10 mM NaPO₄, 50 mM NaCl und 0,5 mM PMSF gewaschen und dann wurde das p12 in 10 mM NaPO₄, 0,5 mM PMSF mit einem von 50–400 mM reichenden NaCl-Gradienten eluiert. Das p12 eluierte etwa in der Mitte des Gradienten zwischen 100 und 200 mM NaCl. Die Peak-Fraktionen wurden gepoolt und gegen 10 mM NaPO₄ (pH 7,7), 10 mM NaCl, 0,5 mM PMSF dialysiert. Das Protein wurde dann aufkonzentriert und auf eine Sephadex G50-Gelfiltrationssäule von etwa 50 ml Bettvolumen (Pharmacia) in 10 mM NaPO_4, 200 mM NaCl, 0,5 mM PMSF aufgetragen. Das p12 eluierte typischerweise kurz nach dem ausgeschlossenen Volumen-Marker. Die Peak-Fraktionen wurden ermittelt, indem man kleine Aliquots von allen Fraktionen über ein Gel laufen ließ. Der p12-Peak wurde gepoolt und in kleinen Aliquots bei –20°C aufbewahrt.
Beispiel 4 Erzeugung chimärer Nucleinsäuresequenzen und chimärer Proteine
A. Allgemeine Vorschrift zur Erzeugung chimärer Nucleinsäuresequenzen
Zur Erzeugung chimärer Nucleinsäuresequenzen wurden die Megaprimer-Methode der ortsgerichteten Mutagenese und deren Modifizierung verwendet (Sarkar und Sommer, Biotechniques 8(4): 404–407 (1990); Aiyar, A. und J. Leis, Biotechniques 14(3): 366–369 (1993)). Ein 5'-Primer für die erste Genom-Matrize sowie ein 3'-Fusions-Oligo werden eingesetzt, um die gewünschte Region zu amplifizieren. Der Fusions-Primer besteht aus einem 3'-Ende der ersten Matrize (DNA, welche das Amino-proximale Polypeptid des Fusionsproteins codiert), welches an ein 5'-Ende der zweiten Matrize (DNA, welche das Carboxy-proximale Polypeptid des Fusionsproteins codiert) gekoppelt ist.
Die PCR-Amplifikationen werden mit Hilfe der Taq-DNA-Polymerase, 10 × PCR-Puffer und MgCl₂ (Promega Corp., Madison, WI) sowie von Ultrapure-dNTPs (Pharmacia, Piscataway, NJ) durchgeführt. 1 μg der Genom-Matrize, 1,5 μl 10 mM 5'-Oligo und 5 μl 10 μM Fusions-Oligo werden mit den folgenden Stoffen in den angegebenen Endkonzentrationen vereinigt: 10 × Puffer (Mg-frei) (1 ×), MgCl₂ (2 mM), dNTP-Mix (jeweils 200 μM dNTP), Taq-DNA-Polymerase (2,5 Einheiten), Wasser, um zu einem Endvolumen von 100 μl zu gelangen. Es wurde ein Thermal Cycler (Perkin Elmer Cetus, Norwalk, CT) eingesetzt, um unter den folgenden Bedingungen zu amplifizieren: 35 Zyklen bei 95°C eine Minute lang, bei 55°C zwei Minuten lang und bei 72°C drei Minuten lang. Dieser Ablauf führt zu einem "Megaprimer".
Der erhaltene Megaprimer wird auf einem 1 × TAE, 4% niedrig schmelzendem Agarose-Gel laufen gelassen. Die Megaprimer-Bande wird aus dem Gel ausgeschnitten und mit Hilfe des Promega Magic Preps PCR-DNA-Reinigungssystems gereinigt. Der gereinigte Megaprimer wird sodann in einem zweiten PCR-Schritt verwendet. 1 μg genomische Matrize 2, ungefähr 0,5 μg des Megaprimers und 5 μl 10 μM 3'-Oligos werden einem Cocktail aus 10 × Puffer, MgCl₂, dNTPs und Taq in den gleichen Endkonzentration wie oben angegeben zugesetzt und mit Wasser auf 100 μl gebracht. Die PCR-Bedingungen waren die gleichen wie oben. Das aus dieser Amplifikation erhaltene Produkt wird ebenfalls unter Einsatz des Promega Magic Preps PCR-DNA-Reinigungssystems gereinigt.
Das Fusionsprodukt wird sodann in einen TA-Vektor ligiert und mit Hilfe des Invitrogen (San Diego, CA) TA Cloning-Kits in E. coli transformiert. Ungefähr 50 ng des PCR-Fusionsprodukts werden mit 1 × Ligationspuffer, 4 Einheiten T4-Ligase an 50 ng des pCRII-Vektors ligiert und mit Wasser auf 10 μl aufgefüllt. Dieses ligierte Produkt-Gemisch wird über Nacht bei 12°C (ungefähr 14 Stunden) inkubiert. 2 μl des Ligations-Produkt-Gemischs werden zu 50 μl kompetenten INC F-Zellen und 2 μl β-Mercaptoethanol gegeben. Die Zellen werden sodann 30 Minuten lang inkubiert, gefolgt von einer Hitzeschock-Behandlung bei 42°C über einen Zeitraum von 60 Sekunden sowie einem Abschrecken in Eis über einen Zeitraum von zwei Minuten. Sodann werden 450 μl erwärmtes SOC-Medium zu den Zellen gegeben, was zu einer transformierten Zellkultur führt, die bei 37°C 1 Stunde lang unter leichtem Schütteln inkubiert wird. 50 μl der transformierten Zellkultur werden auf LB + 50 μg/μl Ampicillin-Platten ausplattiert und über Nacht bei 37°C inkubiert. Einzelne weiße Kolonien werden herausgepickt und zu einzelnen über Nacht gewachsenen Kulturen gegeben, welche 3 ml LB mit Ampicillin (50 μg/μl) enthalten.
Die einzelnen über Nacht gewachsenen Kulturen werden mit Hilfe des Promega Magic Miniprep DNA-Reinigungssystems gewonnen. Eine kleine Menge der erhaltenen DNA wird mittels Restriktionsverdau als Kontrolle herausgeschnitten. Sodann wird unter Zuhilfenahme des United States (Cleveland, OH) Sequenase Version 2.0 DNA-Sequencing Kits eine Sequenzierung der DNA durchgeführt, um die Sequenz der Nucleinsäure-Fusionssequenz zu überprüfen. Pro Reaktion werden drei bis fünf μg Plasmid-DNA eingesetzt. Der DNA werden 2 μl 2 M NaOH/2 mM EDTA zugesetzt und das Volumen mit Wasser auf 20 μl aufgefüllt. Die Mischung wird sodann bei Raumtemperatur fünf Minuten lang inkubiert. Es werden 7 μl Wasser, 3 μl 3 M NaAc und 75 μl EtOH hinzugefügt. Das erhaltene Gemisch wird gevortext und zehn Minuten lang bei –70°C inkubiert und dann einer Mikrozentrifugation unterzogen. Nach zehnminütiger Mikrozentrifugation wird der Überstand abgezogen und das Pellet 30 Sekunden auf einer Speed-vac eingetrocknet. Sodann werden 6 μl Wasser, 2 μl Hybridisierungspuffer und 2 μl 10 μM der passenden Oligos zugegeben. Dieses Gemisch wird 10 Minuten lang bei 37°C inkubiert und dann bei Raumtemperatur 10 Minuten stehen gelassen. Danach werden zu jeder Probe der Mischung 5,5 μl des (oben beschriebenen) Markierungs-Cocktails gegeben, welche bei Raumtemperatur weitere fünf Minuten inkubiert werden. Jeder Probe werden dann 3,5 μl markierte DNA zugesetzt, welche dann fünf Minuten lang bei 37°C inkubiert wird. Sodann werden zu jedem Well 4 μl Stop-Lösung gegeben. Die DNA wird bei 95°C zwei Minuten lang denaturiert und dann auf Eis gegeben.
Die Klone mit den gewünschten Nucleinsäure-Fusionssequenzen werden dann im pET-Expressionssystem in der lipidierten (volle Länge) und nicht lipidierten Form (eingekürzt, d. h. ohne die ersten 17 Aminosäuren) im Leseraster exprimiert. Das Produkt wird unter Ausnutzung der in den PCR-Primern enthaltenen Restriktionsstellen amplifiziert. Der Vektor und das Produkt werden mit den gleichen Enzymen geschnitten und mit T4-Ligase zusammen ligiert. Das erhaltene Plasmid wird unter Einsatz von standardisierten Transformationstechniken in kompetente E. coli transformiert. Die Kolonien werden wie früher beschrieben gescreent und die positiven Klone in Expressionszelle wie z. B. E. coli BL21 zur Expression des Proteins mit IPTG zur Induktion transformiert. Das exprimierte Protein in Form seines Bakterienkultur-Lysats und/oder in gereinigter Form wird sodann zur Produktion von Antikörpern in Mäuse injiziert. Den Mäusen wird Blut entnommen und die Seren für einen Agglutinations-Test, einen in vitro-Test der Wachstumshemmung und einen Test der Komplement-abhängigen und -unabhängigen Lyse gesammelt.
Ein spezifisches Beispiel für chimäres OspA ist das folgende. Andere Chimären von OspA lassen sich herstellen, indem das gleiche Verfahren mit geeigneten Primern verwendet wird.
OspA-K48/OspA-PGau
Unter Einsatz des oben beschriebenen Verfahrens wurde eine Chimäre von OspA aus dem Stamm K48 (OspA-K48) und OspA aus dem Stamm PGau (OspA-PGau) erzeugt. Diese chimäre Nucleinsäuresequenz enthielt die bp 1-654 aus OspA-K48 gefolgt von den bp 655-820 aus OspA-PGau. Die eingesetzten Primer enthielten: die aminoterminale Sequenz des OspA-Primers #607 (SEQ ID NO: 16); den Fusions-Primer 5'-AAAGTAGAAGTTTTTGAATCCCATTTTCCAGTTTTTTT-3' (Minus-Strang-Primer #668-654) (SEQ ID NO: 27); die carboxyterminale Sequenz des OspA-Primers #586 (SEQ ID NO: 19) und die Sequenz der Primer #369 (SEQ ID NO: 14) und #357 (SEQ ID NO: 15). Die chimäre Nucleinsäuresequenz ist als SEQ ID NO: 28 wiedergegeben; das von dieser chimären Nucleisäuresequenz codierte chimäre Protein ist als SEQ ID NO: 29 wiedergegeben.
C. Reinigung der von den chimären Nucleinsäuresequenzen erzeugten Proteine
Die oben beschriebenen chimären Nucleinsäuresequenzen sowie die nach den oben beschriebenen Verfahren hergestellten chimären Nucleinsäuresequenzen werden verwendet, um von den Nucleinsäuresequenzen codierte chimäre Proteine zu produzieren. Es können Standardverfahren zur Expression von Proteinen aus Borrelia-Genen wie die oben in Beispiel 3 beschriebenen eingesetzt werden, um die Proteine in einem kompatiblen Wirtsorganismus zu exprimieren. Die chimären Proteine können dann unter Einsatz von Standardtechniken isoliert und gereinigt werden.
Eine Nucleinsäure, welche veränderte Versionen des OspA codiert, kann zur Erzeugung von OspA-Chimären benutzt werden. Zusätzlich lassen sich Nucleinsäuren, welche veränderte Versionen des OspA codieren dazu verwenden, die veränderten OspA-Polypeptide der vorliegenden Erfindung zu erzeugen.
Falls das chimäre Protein löslich ist, kann es auf einer Sepharose-Säule gereinigt werden. Unlösliche Proteine können in Guanidin in Lösung gebracht und auf einer Ni²⁺-Säule gereinigt werden; alternativ können sie in 10 mM NaPO₄ mit 0,1–1% TRIXON X 114 in Lösung gebracht werden und danach über eine S-Säule (Pharmacia) gereinigt werden. Die lipidierten Proteine wurden im Allgemeinen mit letzterer Methode gereinigt. Die Löslichkeit wurde ermittelt, indem sowohl die löslichen als auch die nicht-löslichen Fraktionen des Zelllysats auf einem 12% PAGE-Gel aufgetrennt und mittels Coomassie-Färbung oder über ein Western-Blotting mit monoklonalen gegen ein antigenes Polypeptid des chimären Proteins gerichteten Antikörpern auf die Lokalisierung des Proteins hin durchsucht wurden.
Beispiel 5 Erzeugung von OspC/OspA-chimären Nucleinsäuren und -chimären Proteinen
A. Allgemeine Vorschrift zur Erzeugung chimärer Nucleinsäuresequenzen
Es wurde eine große Zahl chimärer Nucleinsäuresequenzen erzeugt, welche Proteine mit mindestens einem ersten und einem zweiten Polypeptid aus Borrelia burgdorferi codieren. Diese chimären Nucleinsäuresequenzen wurden so hergestellt, dass die codierten chimären Proteine upstream von (oder N-terminal zu) einem Borrelia burgdorferi-OspA-Polypeptid ein Borrelia burgdorferi-OspC-Polypeptid aufwiesen. Die chimären Nucleinsäuresequenzen wurden auch so hergestellt, dass sich die ein Polypeptid codierende Nucleinsäure im selben Leseraster befand wie die Nucleinsäuresequenz, welche das nächste Polypeptid im chimären Protein codiert.
Die verwendete allgemeine Klonierungsstrategie zum Konstruieren der chimären Nucleinsäuresequenzen war folgendermaßen. Das gewünschte Fragment von OspC wurde amplifiziert, indem ein 5'-Primer mit einem zum Klonieren des erhaltenen Produkts in einen in Frage kommenden Vektor geeigneten Restriktionsort und ein 3'-Primer mit einer zum Ligieren des OspC-Fragments an das OspA-Fragment geeigneten Restriktionsstelle eingesetzt wurden. Das OspC-Produkt wird in einen geeigneten Vektor kloniert. Für den OspA-Abschnitt der chimären Nucleinsäure wurde das gewünschte OspA-Fragment amplifiziert, indem ein 5'-Primer mit einem Restriktionsort zum Ligieren des erhaltenen OspA-Fragments an das OspC-Fragment und ein 3'-Primer mit einem zum Klonieren des erhaltenen OspA-Produkts in den Vektor mit dem OspC-Produkt geeigneten Restriktionsort eingesetzt wurden. Die Verwendung einer Restriktionsstelle, um das Ligieren des OspC- und OspA-Fragments zu gestatten, führt zur Insertion von 0 bis etwa 3 Aminosäuren zwischen den OspC- und OspA-Fragmenten.
Es folgt ein spezielles Beispiel für eine derartige Konstruktion. Selbstverständlich könnten, lediglich mit routinemäßigem Herumexperimentieren, andere geeignete Restriktionsorte genutzt werden. Die erhaltenen OspC/OspA-Chimären könnten daher, je nach dem verwendeten Restriktionsort, 0 bis etwa 3 oder mehr zusätzliche Aminosäuren zwischen dem OspC- und OspA-Fragment verfügen.
Für die OspC-Abschnitte der chimären Nucleinsäuren wurden die gewünschten Fragmente der OspC-Gene aus verschiedenen Stämmen oder Genospezies mittels PCR amplifiziert, indem ein 5'-Primer mit einer NdeI-Schnittstelle und ein 3'-Primer mit einer NcoI- und einer BamHI-Schnittstelle eingesetzt wurden. Das amplifizierte OspC-Produkt wurde dann in die NdeI- und BamHI-Schnittstellen des von einem T7-Promotor angetriebenen Expressionsvektors pET9c geklont. Für den OspA-Abschnitt der chimären Nucleinsäure wurden die gewünschten Fragmente der OspA-Gene, eines in Frage kommenden Stammes oder einer in Frage kommenden Genospezies mittels der PCR amplifiziert, indem ein 5'-Primer mit einer NcoI-Schnittstelle und ein 3'-Primer mit einer BamHI-Schnittstelle eingesetzt wurden. Dieser OspA-Abschnitt konnte dann direkt in die NcoI- und BamHI-Schnittstellen des die gewünschte OspC-Sequenz enthaltenden pET9c-Vektors geklont werden, wodurch das gewünschte OspC-OspA-Konstrukt hergestellt wurde. Dadurch, dass die Sequenz für die NcoI-Restriktionsstelle in den Primern enthalten war, wurde eine Linkersequenz von 9 Nucleotiden, welche für die Aminosäuren Ser-Met-Ala codiert, an der Verbindung zwischen der N-terminalen OspC-Sequenz und der C-terminalen OspA-Sequenz produziert. Die Verwendung des NcoI-Restriktionsenzyms (CCATGG) in dieser Klonierungsstrategie war eine geeignete Wahl, da die DNA von Borrelia AT-reich ist und daher nur wenige NcoI-Schnittstellen im Genom aufweist. Ein Fachmann würde die zu verwendenden unterschiedlichen Restriktionsorte kennen und er würde wissen, wie er die chimären OspC/A-Konstrukte zum Einsatz in den nachfolgenden hier beschriebenen Veränderungen nur mit routinemäßigem Herumexperimentieren erzeugen könnte.
Als Beispiel wurden chimäre OspC-OspA-Nucleinsäuren, die nicht-lipidiertes OspC-B31 enthalten, unter Einsatz der folgenden Primer erzeugt:
Für die chimären OspC-OspA-Nucleinsäuren, die nicht-lipidiertes OspA-B31 enthalten, wurden die folgenden Primer verwendet:
Die lipidierten Versionen der OspC/A-Chimären können konstruiert werden, indem Primer konzipiert werden, um einen Abschnitt der Matrize zu amplifizieren, welcher die Lipidierungs-Signalsequenz enthält oder indem ein Nucleinsäure-Konstrukt mit einer geeigneten Lipidierungs-Signalsequenz erzeugt wird. Die ein Lipidierungssignal umfassende Leadersequenz kann z. B. von einem Gen sein, welches die OspA-, OspB- oder OspC-Polypeptide codiert.
B. Protein-Expression
Wie in den vorhergehenden Beispielen beschrieben, ist es möglich, Borrelia-Proteine wie z. B. OspA-Polypeptide, OspC-Polypeptide und chimäre OspC/OspA-Polypeptide, welche die hier beschriebenen Osp-A-Veränderungen enthalten, zu exprimieren und zu reinigen.
Dies wird erreicht, indem man die gewünschte Nucleinsäuresequenz, welche das Protein der Wahl codiert, unter Verwendung von Standardtechniken in ein Expressions-Plasmid einbaut. Dieses Expressions-Plasmid lässt sich dann in eine kompatible Wirtszelle transfizieren, um das gewünschte Protein zu exprimieren.
Die zur Immunisierung der Mäuse und in den unten beschriebenen ELISA-Tests verwendeten gereinigten chimären OspA-, OspC- oder OspC/OspA-Proteine wurden zum Beispiel erzeugt und gereinigt, indem jede der chimären Nucleinsäuresequenzen von OspA, OspC oder OspC/OspA im Leseraster in das pET-Expressionsplasmid kloniert wurde. Das Expressionsplasmid wurde sodann in die kompatible Expressionszelllinie Escherichia coli Stamm BL21 (pLysS) oder Stamm B834 (DE3) transfiziert. Die BL21- oder B834-Zellen wurden in 10 ml LB-Medium (5 g/l NaCl, 10 g/l Trypton, 5 g/l Hefeextrakt, 25 mg/l Chloramphenicol und 50 mg/l Ampicillin) bei 37°C unter Schütteln angezüchtet. Sobald die optische Dichte bei 600 λ 0,3–0,4 Einheiten erreichte, wurde die Expression des rekombinanten Proteins durch Zugabe von IPTG (Isopropyl B-D-thiogalactopyranosid) bis zu einer Endkonzentration von 0,5 mM induziert und die Zellen weitere drei Stunden wachsen gelassen. Durch Zentrifugation bei 3800 xg über einen Zeitraum von 5 Minuten wurden die Kulturen geerntet. Die Zellen wurden in 20 mM NaPO₄, pH 7,7, resuspendiert und bei –20°C über Nacht aufbewahrt. Waren die rohen Extrakte erst einmal aufgetaut, wurden sie mit DNAse (2 μg/ml) in Gegenwart von 2,5 mM MgCl₂ bei Raumtemperatur über einen Zeitraum von 30 Minuten inkubiert und dann bei 14.000 Upm (Eppendorf 5417C) 5 Minuten lang abzentrifugiert.
Zum Reinigen der unten beschriebenen OspC-Proteine wurden die Rohextrakte aus den OspC-exprimierenden Zellen auf eine Anionenaustauschersäule (Q Sepharose Fast Flow, 2,2 × 10 cm, Pharmacia) aufgetragen, die zuvor mit 20 mM Tris-Cl pH 9,3 äquilibriert worden war. Die Säule wurde mit dem gleichen Puffer (20 mM Tris-Cl pH 9,3) gewaschen, welcher das OspC-Protein eluierte. Die Waschfraktionen, welche das OspC enthielten, wurden mit Hilfe von Amicon 10 K aufkonzentriert und dann mit einer 20 mM NaPO₄ pH 8,0 und 250 mM NaCl enthaltenden Lösung dialysiert. Das teilweise gereinigte OspC wurde sodann über eine mit 20 mM NaPO₄ pH 8,0 und 250 mM NaCl äquilibrierte Ni²⁺-Metall-Affinitätssäule (Chelating Sepharose Fast Flow 2,2 × 10 cm, Pharmacia) geschickt. Die Säule wurde mit Hilfe eines abnehmenden pH-Gradienten von 20 mM Natriumacetat und 250 mM NaCl gewaschen und das gebundene OspC um einen pH von 5,7 herum eluiert. Die OspC-Fraktionen wurden dann mittels Ultrafiltration aufkonzentriert und bei –70°C aufbewahrt.
Zur Reinigung der OspA-Proteine wurde dem gleichen Verfahrensablauf gefolgt, mit der Ausnahme, dass der Schritt mit der Dialyse nach der Abtrennung mit Amicon 10 K in 20 mM NaPO₄, pH 6,0 erfolgte. Das teilweise gereinigte OspA wurde sodann auf eine mit 20 nM NapPO₄, pH 6,0 äquilibrierte Kationenaustauschersäule (S Sepharose Fast Flow 2,2 × 10 cm, Pharmacia) aufgetragen. Die Säule wurde mit Hilfe eines von 0 bis 100 mM anwachsenden NaCl-Gradienten gewaschen. Die OspA Fraktionen wurden dann mittels Ultrafiltration aufkonzentriert und bei –70°C aufbewahrt.
Wie zuvor gezeigt, wurden sowohl die lipidierten als auch die nicht-lipidierten (eingekürzten, d. h. ohne die ersten 17 Aminosäuren) Formen der chimären OspC-, OspA- und OspC/OspA-Proteine erzeugt.
Die oben beschriebenen Techniken wurden auch eingesetzt, um Proteine mit den veränderten OspA-Polypeptiden der vorliegenden Erfindung zu exprimieren.
C. Immunisierung der Mäuse und serologische Charakterisierung mit Hilfe eines ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay)
Immunisierung der Mäuse
Die Mäuse, entweder C3H-J oder ICR, wurden mit einer subkutanen (SC) Injektion von 3 μg lipidiertem chimärem OspC/OspA-Protein oder 6 μg nicht-lipidierten OspC/OspA-Chimären in 100 ml Aluminiumhydroxid-Adjuvans (Konzentration von 1,8 mg/ml) immunisiert. Als negative Kontrolle wurden Mäuse nur mit 100 ml Aluminiumhydroxid-Adjuvans immunisiert. Alle Mäuse erhielten insgesamt drei Injektionen, welche mit zweiwöchigen Intervallen verabreicht wurden. Eine Woche nach der abschließenden Immunisierung wurde jeder Maus (einschließlich den negativen Kontrollmäusen) Blut entnommen und das Serum mit Hilfe der unten beschriebenen ELISA-Methode auf IgG-Reaktivität für das Vorkommen von Anti-OspA-Antikörpern gegen drei verschiedene gereinigte OspA- Proteine (Borrelia burgdorferi sensu stricto (B31), Borrelia garinii (K48) und Borrelia afzelii (PgAU)) hin getestet. Die Seren wurden bei Verdünnungen von 1:1000 getestet.

Die Mäuse wurden mit den in Tabelle III beschriebenen chimären Proteinen immunisiert. Tabelle III. Zur Immunisierung der Mäuse eingesetzte chimäre Proteine

Name	Beschreibung (Aminosäure)	SEQ ID NO: (Nucleinsäure	SEQ ID NO: (Polypeptid)	Figur Nr.
OspA	OspA-B31(18-273)	6	7	22, 23
OspC	OspC-B31(19-211)	*	*	22, 23
OspC2-OspA	OspC-C2(19-204)/OspA-B31(18-273)	59	60	22, 23
¹lipOspAPBo	OspA-PGau(1-217)/OspA-Bo(218-273)	49	50	24, 25
¹lipOspAB/P	OspA-B31(1-216)/OspAPKo(217-273)	*	*	24, 25
OspC-OspAB/P	OspC-B31(19-211)/OspA-B31(18-216)/OspA-PKo(217-273)	65	66	24, 25, 27, 28, 29
OspCB31-OspAB31	OspC-B31(19-211)/OspA-B31(18-273)	55	56	26, 27 28, 29
OspC2-OspAB31	OspC-C2(19-204)/OspA-B31(18-273)	59	60	26, 27
¹lipOspA K/T	OspA-K48(1-217)/OspA-Tro(218-273)	*	*	27
¹lipOspC-B31	OspC-B31(1-211)	*	*	26
OspCB31-OspABPBP	OspC-B31(19-211)/OspA-B31/30-150)/OspA-PKo(151-179)/OspA-B31(180-216) (190 N Deletion)/OspA-PKo(217-273) B31/B31/PKo	87	88	28, 29

¹"lip" bedeutet, dass das chimäre Protein sein natives N-terminales Lipidierungssignal enthält.

Serologische Charakterisierung mittels eines ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay)
Immobilisierung eines Antigens auf ELISA-Platten
Eine Lösung eines gereinigten rekombinanten OspC- oder OspA-Proteins aus jedem der Stämme B31 (Borrelia burgdorferi), K48 (Borrelia garinii) und PGau (Borrelia afzelii) wurde zu einem Phosphatpuffer pH 9,0 gegeben und dazu verwendet, eine käufliche Mikrowell-Platte (MaxiSorp^®, Nunc) zu beschichten. Der Beschichtungsvorgang verlief wie folgt: 100 μl einer Lösung, die das passende OspA- oder OspC-Protein enthielt (zubereitet bei einer Konzentration von 250 ng/ml im folgenden Beschichtungspuffer: 100 mM Bis-Tris-Propan, pH 9,7) wurde jedem Well einer Mikrotiter-Platte zugesetzt, die eine Stunde lang bei 37°C inkubiert wurde. Die Antigen-Lösung wurde von den Wells entfernt, die Platte drei Mal mit Phosphat-gepufferter Saline (PBS) pH 9,0 gewaschen und 300 μl Blockierungspuffer-Lösung zugesetzt (3% Trockenmilch-Pulver, 0,1% Polyoxyethylensorbitan (hier als Tween 20^TM bezeichnet), 0,02% NaN₃ in 100 nM Bis-Tris-Propan pH 9,7). Nach einstündiger Inkubation bei 37°C wurden die Platten vier Mal mit TBS-Tween 20^TM-Waschpuffer (20 mM Tris-Cl pH 7,5, 136 mM NaCl, 0,1% Tween 20^TM und 0,02% NaN₃) gewaschen und dann trocknen gelassen. Die Platten wurden sodann in Plastik eingewickelt und bis zu ihrer Verwendung bei 4°C aufbewahrt.
ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay)-Tests
Der Standard-Vorgang für den ELISA war wie folgt: Das Mäuseserum wurde in einem Verdünnungspuffer für die Proben (1% Trockenmilch, 136 mM NaCl, 0,1% Tween 20^TM, 0,02% NaN₃ in 20 mM Tris-Cl pH 7,5) 1:1000 verdünnt und 100 μl des verdünnten Serums den ELISA-Mikrotiterplatten, die wie oben beschrieben mit dem Antigen beschichtet worden waren, zugesetzt. Nach einer Inkubation über einen Zeitraum von 1 Stunde bei 37°C wurden die Proben entfernt und die Platten vier Mal mit TBS-Tween 20^TM (20 mM Tris-Cl pH 7,5, 136 mM NaCl, 0,1% Tween 20^TM und 0,02% NaN₃) gewaschen. Für den sekundären Antikörper wurden Anti-Maus-Antiseren aus der Ziege, die spezifisch für entweder IgM (Fc) oder IgG (Fab) waren (Jackson Immun Research Laborstories) in Verdün nungspuffer für die Proben (1% Trockenmilch, 136 mM NaCl, 0,1% Tween 20^TM, 0,02% NaN₃ in 20 mM Tris-Cl pH 7,5) 1:750 verdünnt und jedem Well 100 μl des verdünnten sekundären Antikörpers zugesetzt. Nach einer Inkubation über einen Zeitraum von 30 Minuten bei 37°C wurden die Platten drei Mal mit TBS-Tween 20^TM gewaschen und jedem Well 100 μl einer Phosphat-Substrat-Lösung (5 mg p-Nitrophenylphosphat-Tabletten in 1 × Diethanolamin-Substrat-Puffer gelöst, um eine Lösung mit 2 mg/ml zu erhalten – Kirkegaard Perry Laboratory) zugesetzt. Die Platten wurden 30 Minuten lang bei 37°C inkubiert und jedem Well 100 μl Stop-Lösung (5% EDTA) zugegeben. Mit einem Mikroplatten-Leser (Dynatech) wurde die Extinktion bei 405 nm abgelesen. Eine Probe wurde als positiv angesehen, wenn sie eine mittlere Extinktion ergab, welche größer war als der Mittelwert der negativen Kontrollen plus drei Standardabweichungen.
Frühere Arbeiten haben gezeigt, dass es die carboxyterminale Region von OspA ist, die die antigenen Stellen enthält, welche für den immunprotektiven Schutz sorgen. Somit wurde zusätzlich zu dem oben beschriebenen ELISA ein modifizierter ELISA durchgeführt (im Folgenden als protektiver ELISA-Test bezeichnet), in welchem die gereinigte N-terminale Region des Osp-B31 (Aminosäuren 18-139) eingesetzt wurde, um alle in der Maus vorkommenden Antikörper mit Spezifität für diese N-terminale OspA-Region zu blockieren. Diese protektiven ELISA-Tests wurden wie oben beschrieben durchgeführt, mit der Ausnahme, dass vor Zugabe der Seren zu den antigenbeschichteten ELISA-Mikrotiterplatten-Wells 80 μg/ml eines gereinigten OspA-B31-Fragments (Aminosäuren 18-139) dem verdünnten Mäuseserum zugesetzt wurden.
Ergebnisse der ELISA-Tests
Mit Hilfe der oben beschriebenen ELISA-Tests wurde gezeigt, dass mit einem nicht-lipidierten chimären OspC/OspA-Protein (OspC2-OspA – zusammengesetzt aus OspC (as 19-204 aus Stamm C2)/OspA (as 18-273 aus Stamm B31) (SEQ ID NO. 60)) immunisierte Mäuse eine Immunantwort sowohl gegen OspA als auch gegen OspC produzierten, die der gegen nicht-lipidierte OspA-(OspA – as 18-273 aus dem Stamm B31) und gegen nicht-lipidierte OspC-(OspC – as 19-211 aus dem Stamm B31) Kontroll-Proteine erzeugten Immunantwort vergleichbar war (22). Wie in 22 gezeigt und oben beschrieben, wurden die Mäuse mit OspA-, OspC- oder OspC2-OspA-Proteinen immuni siert und die Immunantworten der Seren gegen das B31-OspA-Antigen (gepunktete Balken) und das B31-OspC-Antigen (gefüllte Balken) gemessen.
Mit Hilfe des oben beschriebenen protektiven ELISA-Tests wurde auch gezeigt, dass mit dem gleichen chimären nicht-lipidierten OspC/OspA-Protein (OspC2-OspA – zusammengesetzt aus OspC (as 19-204 aus Stamm C2)/OspA (as 18-273 aus Stamm B31) (SEQ ID NO. 60) immunisierte Mäuse eine Immunantwort gegen den C-terminalen Abschnitt von OspA entwickelten, welche der gegen den C-terminalen Abschnitt eines nicht-lipidierten OspA-(OspA – as 18-273 aus dem Stamm B31) Kontrollproteins entwickelten Immunantwort vergleichbar war (23). Wie in 23 gezeigt, wurden die Mäuse mit OspA-, OspC- oder OspC2-OspA-Proteinen immunisiert und die Immunantworten der Seren gegen das B31-OspA-Antigen gemessen. Die protektive Antikörper-Antwort gegen das B31-OspA-Antigen ist in den gepunkteten Balken angegeben.
Somit zeigen diese Ergebnisse klar, dass nicht-lipidierte chimäre OspC/OspA-Proteine in der Lage sind, in Mäusen Immunantworten zu induzieren, die den Immunantworten vergleichbar sind, welche gegen nicht-lipidierte OspC- und OspA-Kontrollproteine erzeugt wurden.
Man hat früher gedacht, dass die auf den äußeren Oberflächen-Proteinen von Borrelia burgdorferi vorkommenden Lipidierungssignale für die Immunogenizität benötigt werden und dass OspC- und OspA-Proteine, welche dieses Lipidierungssignal nicht aufwiesen, weniger oder nicht immunogen seien. Um diese Idee zu testen, wurden Mäuse mit einem nicht-lipidierten chimären OspC/OspA-Protein (OspC-OspAB/P – zusammengesetzt aus OspC (as 19-211 aus dem Stamm B31)/OspA (as 18-216 aus dem Stamm B31)/OspA (as 217-273 aus dem Stamm PKo) (SEQ ID NO. 66) sowie zwei lipidierten OspA-Proteinen, lip OspAP/Bo (zusammengesetzt aus OspA (as 1-217 aus dem Stamm PGau)/OspA (as 218-273 aus dem Stamm Bo)) und lipOspAB/P (zusammengesetzt aus OspA (as 1-216 aus dem Stamm B31)/OspA (as 217-273 aus dem Stamm PKo)) immunisiert und Elisa-Tests unterzogen. Die mit dem nicht-lipidierten chimären OspC/OspA-Protein (OspC-OspAB/P) immunisierten Mäuse entwickelten eine Immunantwort gegen das OspA von jedem der Borrelia-Stämme B31 (Borrelia burgdorferi sensu stricto), K48 (Borrelia garinii) und PGau (Borrelia afzelii), welche Immunantwort gleich oder größer war als die gegen die beiden lipidierten OspA-Kontrollproteine (lipOspAP/Bo und lipOspAb/P) erzeugte Immunantwort (24).
Ähnliche Ergebnisse wie diese wurden mit dem oben beschriebenen protektiven ELISA-Test erhalten. Mit dem nicht-lipidierten chimären OspC/OspA-Protein (OspC-OspAB/P) immunisierte Mäuse entwickelten eine Immunantwort gegen die C-terminale Region des OspA von jedem der Borrelia-Stämme B31 (Borrelia burgdorferi sensu stricto), K48 (Borrelia garinii) und PGau (Borrelia afzelii), welche gleich oder größer war als die gegen die C-terminale Region des OspA aus den beiden lipidierten OspA-Kontrollproteinen (lipOspAP/Bo und lipOspAb/P) erzeugte Immunantwort (25).
Zusätzlich zu den Vergleichen zwischen den nicht-lipidierten chimären OspC/OspA-Proteinen und den lipidierten OspA-Kontrollproteinen wurden auch Experimente zum Vergleich von nicht-lipidierten chimären OspC/OspA-Proteinen mit einem lipidierten OspC-Kontrollprotein durchgeführt (26). Mäuse, die entweder mit dem nicht-lipidierten chimären OspC/OspA-Protein OspCB31-OspAB31 (zusammengesetzt aus OspC (as 19-211 aus dem Stamm B31)/OspA (as 18-273 aus dem Stamm B31) (SEQ ID NO. 56) oder dem nicht-lipidierten chimären OspC/OspA-Protein OspC2-OspAB31 (zusammengesetzt aus OspC (as 19-204 aus dem Stamm C2)/OspA (as 18-273 aus dem Stamm B31) (SEQ ID NO. 60) immunisiert wurden, entwickelten eine Immunantwort gegen aus dem Borrelia burgdorferi-Stamm B31 stammendes OspC, welche der Immunantwort vergleichbar war, die von einem lipidierten OspC-Kontrollprotein (lipOspC-B31 – zusammengesetzt aus OspC (as 1-211 aus dem Stamm B31)) erzeugt wurde (26).
Somit weisen diese Ergebnisse klar daraufhin, dass nicht-lipidierte chimäre OspC/OspA-Proteine in der Lage sind, Immunantworten gegen OspA und OspC zu induzieren, die der gegen OspA und OspC mit lipidierten OspA- und OspC-Kontrollproteinen erzeugten Immunantwort vergleichbar sind. Der Einsatz der nicht-lipidierten Formen dieser Proteine als Impfstoff-Immungene oder diagnostische Antigene ist höchst wünschenswert, da die Produkt-Ausbeute viel größer ist und die Proteine viel leichter zu reinigen sind. Aus diesen Gründen ist die Produktion dieser Proteine billiger.
Die chimären OspC/OspA-Proteine der vorliegenden Erfindung sind auch in der Lage, Immunantworten gegen OspA-Proteine zu erzeugen, die von Stämmen stammen, welche nicht im chimären Protein repräsentiert sind. Die mit den chimären OspC/OspA-Proteinen OspCB31-OspAB31 (SEQ ID NO. 56) und OspC2-OspAB31 (SEQ ID NO. 60) immunisierten Mäuse sind nicht nur in der Lage, Immunantworten zu erzeugen, die das vom Stamm 31 (Borrelia burgdorferi sensu stricto) stammende OspA erkennen, sondern auch das OspA zu erkennen, das vom Stamm K48 (Borrelia garinii) und vom Stamm PGau (Borrelia afzelii) stammt (27). Zum Vergleich wurden auch Mäuse mit dem lipidierten chimären OspA-Protein LipOspA K/T (zusammengesetzt aus OspA (as 1-217 aus dem Stamm K48)/OspA (as 218-273 aus dem Stamm Tro)) immunisiert (27).
Zusätzliche Antikörperantworten gegen ein OspA, das aus den Stämmen B31 (Borrelia burgdorferi sensu stricto), K48 (Borrelia garinii) und PGau (Borrelia afzelii) stammte, werden auch Seren von mit anderen chimären OspC/OspA-Proteinen immunisierten Mäusen dargeboten. So zeigt 28 ELISA-Ergebnisse von Mäusen, die entweder mit OspCB31-OspAB/P (SEQ ID NO: 66), OspCB31-OspABPBP (SEQ ID NO.: 88) oder OspCB31-OspAB31 (SEQ ID NO: 56) immunisiert wurden. In jedem Falle wurden die Seren aus den immunisierten Mäusen gegen ein OspA getestet, das jeweils von den Stämmen B31 (Borrelia burgdorferi sensu stricto), K48 (Borrelia garinii) oder PGau (Borrelia afzelii) stammte. In allen Fällen wurde eine starke Immunantwort erzeugt (28). Wie bei den zuvor beschriebenen chimären OspC/OspA-Proteinen riefen die drei chimären OspC/OspA-Proteine, die zur Immunisierung der Mäuse in 27 eingesetzt wurden, auch eine starke Immunantwort gegen die C-terminale Region von OspA hervor, wenn sie mit dem oben beschriebenen protektiven ELISA-Test untersucht wurden (29).
Die oben beschriebenen Techniken werden auch eingesetzt, um Mäuse zu immunisieren und um die Immunantwort gegen die Proteine mit den veränderten OspA-Polypeptiden der vorliegenden Erfindung serologisch zu charakterisieren.
Zeckenangriff gegen immunisierte Mäuse
Die wie oben beschrieben immunisierten Mäuse, entweder C3H-J oder JCR, wurden auch einem Angriff von entweder im Laboratorium oder in der freien Natur infizierten Nymphen ausgesetzt. Die immunisierten Mäuse wurden in Isolierkäfige gesetzt und jede Maus erhielt 5–10 Nymphen. Nach 6 Tagen wurden alle Nymphen eingesammelt und nachge zählt. Vier Wochen nach dem Angriff wurde den Mäusen Blut entnommen und die Seren mit Hilfe von im Handel erhältlichen Western-Blot-Streifen für Borrelia burgdorferi sensu stricto Stamm 31 (MarDx-Streifen) und/oder Borrelia garinii (MRL-Streifen) untersucht.
Acht Wochen nach dem Angriff wurde den Mäusen Blut entnommen, die Seren wieder mittels Western-Blots untersucht und ausgestanzte Proben aus dem Ohr sowie Proben aus der Blase kultiviert. Als positive Kontrolle wurden Mäuse, die nur wie oben beschrieben mit Aluminiumhydroxid-Adjuvans immunisiert worden waren, dem gleichen Angriff ausgesetzt.

Die Ergebnisse der Untersuchungen mit dem Zeckenangriff (Tabelle IV) zeigen, dass, während eine Immunisierung mit lipidiertem OspC-Protein nicht in der Lage war, den Mäusen Schutz zu gewähren, was sich durch ein positives Western-Blot-Signal (bei 4 von 5 Mäusen) zu erkennen gab, eine Immunisierung mit zwei unterschiedlichen chimären OspC/OspA-Proteinen (SEQ ID NO. 56 und SEQ ID NO. 62) Schutz gewährte, was durch das Fehlen eines Western-Blot-Signals angezeigt wird (bei 0 von 8 Mäusen und 0 von 3 Mäusen) (Tabelle IV). Die positive Scheinkontrolle zeigte, dass der Angriff durch die Zecken in allen Fällen erfolgreich war, was sich durch ein 100% positives Signal in den Western-Blots zu erkennen gab (Tabelle IV). Die Ergebnisse der Experimente mit dem Zeckenangriff sind in Tabelle IV wiedergegeben. Tabelle IV. Wirkung einer Impfung auf die Übertragung von Borrelia durch Zecken

Impfstoff-Kandidat	Maus	Zeckennymphe	Serokonversion (Western-Blots) geimpft	Serokonversion (Western-Blots) Blindversuch
OspC1-OspAB31	C3H-J	Long Island	0+/8	8+/8
OspC2-OspAB31	C3H-J	Long Island	0+/3	4+/4
LipOspC12	ICR	Long Island	4+/5	6+/5

Die oben beschriebenen Techniken werden auch eingesetzt, um die Fähigkeit von Mäusen zu messen, die mit Proteinen immunisiert worden waren, welche die veränderten OspA-Polypeptide der vorliegenden Erfindung umfassen, um einer Übertragung von Borrelia durch Zecken zu widerstehen oder gegen sie zu reagieren.
Beispiel 6 Erzeugung von OspA M1-, M2-, M3-, J1- J2- und J3-Konstrukten mittels ortsgerichteter Mutagenese und PCR
Alle Konstrukte wurden mit Hilfe des ortsgerichteten Mutagenes-Kits QuikChange von Stratagene hergestellt. Die ortsgerichtete Mutagenese wurde unter Verwendung der Pfu-Turbo-DNA-Polymerase II und einem Temperatur-Cycler durchgeführt. Die Pfu-Turbo-DNA-Polymerase repliziert beide Plasmid-Stränge mit hoher Genauigkeit ohne die mutanten Oligonucleotid-Primer zu verschieben. In dem grundlegenden Verfahren wurde ein doppelsträngiger supercoiled DNA-Vektor (pET 9c für alle Konstrukte) mit einem in Fragen kommenden Insert und zwei die gewünschte(n) Mutation(en) enthaltenden synthetischen Oligonucleotid-Primern eingesetzt. Die zu den Gegensträngen des Vektors jeweils komplementären Oligonucleotid-Primer wurden während des Temperatur-Cyclings von der Pfu-Turbo-DNA-Polymerase verlängert. Der Einbau des Oligonucleotid-Primers erzeugte ein mutiertes Plamid, das versetzt angeordnete Schnittstellen aufwies. Nach dem Temperatur-Cycling wurde das lineare Produkt mit dem Restriktionsenzym Dpn I behandelt, welches für methylierte DNA spezifisch ist. Aus E. coli-Stämmen isolierte DNA ist dam-methyliert und daher einem Dpn I-Verdau zugänglich. Der Verdau mit Dpn I zerstörte daher die ursprüngliche Matrizen-DNA und hinterließ nur geschnittene Plasmid-DNA (die nicht methyliert war), welche die gewünschte(n) Mutation(en) enthielt. Diese (nur die gewünschte(n) Mutation(en) enthaltende) geschnittene Vektor-DNA wurde sodann in kompetente E. coli transformiert, welche auf Antibiotika enthaltenden Platten ausplattiert waren. Die Kolonien, welche das Plasmid (das außer dem veränderten OspA-Polypeptid auch für eine Antibiotika-Resistenz codiert) enthielten, wurden angezüchtet und die Plasmide gereinigt und sequenziert, um zu bestätigen, dass sie die gewünschte(n) Mutation(en) aufwiesen.
1) M1-, M2- und M3-Mutanten
Die hier beschriebenen Mutationen werden mit Hilfe von Nucleinsäuren (z. B. Polynucleotiden) erzeugt, welche die OspA-Polypeptide von jedem der die Lyme-Krankheit auslösenden Borrelia-Stämme, wie z. B. Borrelia burgdorferi sensu stricto, Borrelia afzelii oder Borrelia garinii codieren. Als Beispiel wird unten die Erzeugung der M3-Mutationen in einer als "BPBP" bezeichneten OspA-Chimäre beschrieben. Die Erzeugung des Konstrukts OspA-BPBP-M3 geschah wie folgt: BPBP ist ein chimäres OspA-Polypeptid, in welchem die Reste 1-164 vom OspA von B31, die Reste 165-179 vom OspA von Pko oder PGau, die Reste 180-216 vom OspA von B31 und die Reste 217-273 vom OspA von Pko stammen (wobei die Nummerierung wie in SEQ ID NO: 7 gezeigt erfolgt).
Der erste Schritt bei der Herstellung des Konstrukts bestand darin, das Konstrukt BPBP-M1 herzustellen. Die M1-Mutation besteht in einer Mutation des Codons 139 (aga) des OspA von der Aminosäure Arginin zu der Aminosäure Methionin (Codon atg). Wie oben beschrieben wurde eine PCR mit einem BPBP als Matrizen-DNA codierenden Polynucleotid und den folgenden Oligonucleotid-Primern durchgeführt:
Die PCR enthielt auch einen Reaktionspuffer, 10 ng der BPBP-DNA-Matrize, 125 ng von jedem Oligonucleotid-Primer und en dNTP-Mix. Die Parameter für die PCR waren wie in Tabelle V angegeben. Tabelle V. Parameter für die PCR

Segment Zyklen Temperatur Zeit

1 1 95°C 30 sec.

2 18 95°C 30 sec.

3 50°C 1 min.

4 68°C 12 min.
Nach der PCR wurde das Produkt in XL1-Blau kompetente Zellen von E. coli transformiert. Die auf den selektiven (Kanamycin enthaltenden) Agar-Platten gebildeten Kolonien wurden angezüchtet und die Plasmide gereinigt und sequenziert, um zu bestätigen, dass sie die gewünschte Mutation aufwiesen. Das Konstrukt BPBP-M1 wurde sodann als Matrize benutzt, um das Plamid BPBP-M2-herzustellen, welches zusätzlich zu der R139M-Mutation auch eine Mutation enthält, die das Codon für Glutaminsäure (gag) an Position 160 zum Codon (tat) umwandelt, welches Tyrosin codiert. Die zur Erzeugung dieses Plasmids eingesetzten Oligonucleoitid-Primer waren:
Die Parameter für die PCR waren wie in Tabelle VII angegeben. Die abschließende Mutation M3, welche einen Lysin-Rest an Position 189 in einen Methionin-Rest verwandelte, wurde mit Hilfe von BPBP-M2 als DNA-Matrize durchgeführt. Die zur Erzeugung dieses Plasmids eingesetzten Oligonucleoitid-Primer waren:
Diese abschließende Mutation ergab das gewünschte Konstrukt BPBP M3.
2) J1-, J2- und J3-Mutanten
Die J1-, J2- und J3-Mutanten wurden unter Verwendung der gleichen Vorschrift wie für die Erzeugung der M1-, M2- und M3-Mutanten beschrieben hergestellt. Derartige Mutanten lassen sich herstellen, indem Nucleinsäuren (z. B. Polynucleotide) eingesetzt werden, welche die OspA-Polypeptid-Fragmente von jedem der die Lyme-Krankheit auslösenden Borrelia-Stämme, wie z. B. Borrelia burgdorferi sensu stricto, Borrelia afzelii oder Borrelia garinii codieren.
Die Oligonucleotid-Primer, welche zur Erzeugung der J1-Mutation verwendet wurden (welche eine Y165F-Mutation (Codon tat zu ttt) und eine V166T-Mutation (Codon gtt zu act) enthalten) waren wie folgt:
Die Oligonucleotid-Primer, die zur Erzeugung der J2-Mutation eingesetzt wurden (welche eine T170K-Mutation (Codon act zu aag) enthält), waren wie folgt:
Zur Erzeugung der J3-Mutante (welche eine Y165F-Mutation (Codon tat zu ttt), eine V166T-Mutation (Codon gtt zu act) und eine T170K-Mutation (Codon act zu aag) enthält) wurde die die J1-Mutationen enthaltende Matrize mit den Oligonucleotid-Primern zur Erzeugung der J2-Mutationen (5' B31 T-K (SEQ ID NO: 125) und 3' B31 T-K (SEQ ID NO: 126)) eingesetzt.
Die hier beschriebenen OspA-Polypeptide werden exprimiert, zur Immunisierung von Mäusen eingesetzt und wie in den obigen Untersuchungen beschrieben mit Hilfe eines ELISA charakterisiert.

Claims

Polypeptid, welches eine Aminosäuresequenz des OspA-Proteins aus Borrelia burgdorferi ab dem Rest 139 bis zu dem Rest 273 des OspA-Proteins von Borrelia burgdorferi umfasst, wobei die Sequenz alle die Abänderungen enthält, welche darin bestehen, dass der Rest 139 Methionin, der Rest 160 Tyrosin und der Rest 189 Methionin sind, wobei die Nummerierung der Nummerierung von SEQ ID NO: 7 entspricht.
Polypeptid nach Anspruch 1, wobei (a) das Polypeptid im Vergleich mit dem entsprechenden unveränderten OspA-Polypeptid über eine höhere Konformations-Stabilität verfugt; (b) das Polypeptid die Reste 131 bis 273 des OspA-Proteins von Borrelia burgdorferi umfasst; (c) das Polypeptid die Reste 17 bis 273 des OspA-Proteins von Borrelia burgdorferi umfasst oder (d) das Polypeptid von einem OspA-Protein eines sensu stricto-Stammes von Borrelia burgdorferi stammt.
Polynucleotid, welches eine Aminosäuresequenz des OspA-Proteins aus Borrelia burgdorferi ab dem Rest 139 bis zu dem Rest 273 codiert, wobei die Sequenz alle die Abänderungen codiert, welche darin bestehen, dass der Rest 139 Methionin, der Rest 160 Tyrosin und der Rest 189 Methionin sind, wobei die Nummerierung der Nummerierung von SEQ ID NO: 7 entspricht.
Polynucleotid nach Anspruch 3, wobei (a) das codierte Polypeptid die Reste 131 bis 273 des OspA-Proteins von Borrelia burgdorferi umfasst; (b) das codierte Polypeptid die Reste 17 bis 273 des OspA-Proteins von Borrelia burgdorferi umfasst oder (c) das codierte Polypeptid dem OspA-Protein eines sensu stricto-Stammes von Borrelia burgdorferi entspricht.
Polynucleotid, welches ausgewählt ist aus der Gruppe SEQ ID NO: 103 und SEQ ID NO: 115.
Verfahren zur Erzeugung eines abgeänderten OspA-Polypeptids von Borrelia burgdorferi mit einer im Vergleich zu dem entsprechenden unveränderten Borrelia burgdorferi-OspA-Polypeptid erhöhten Konformations-Stabilität in den Schritten: a) Auswahl eines Polynucleotids, welches ein Borrelia burgdorferi-OspA-Polypeptid codiert, das die Reste 139, 160 und 189 enthält, wobei die Nummerierung der Nummerierung von SEQ ID NO: 7 entspricht; b) Abänderung des Polynucleotids derart, dass der Rest 139 Methionin, der Rest 160 Tyrosin und der Rest 189 Methionin sind und c) Expression des abgeänderten Polynucleotids, wodurch ein abgeändertes Borrelia burgdorferi-OspA-Polypeptid mit einer im Vergleich zu dem entsprechenden unveränderten Borrelia burgdorferi-OspA-Polypeptid erhöhten Konformations-Stabilität erzeugt wird.
Verwendung eines abgeänderten OspA-Polypeptids für die Herstellung eines Medikaments zur Immunisierung eines Säugers wie z. B. eines Menschen gegen die Lyme-Krankheit, wobei das abgeändete OspA-Polypeptid – eine Aminosäuresequenz des OspA-Proteins aus Borrelia burgdorferi ab dem Rest 139 bis zu dem Rest 273 des OspA-Proteins von Borrelia burgdorferi umfasst, wobei die Sequenz alle die Abänderungen enthält, welche darin bestehen, dass der Rest 139 Methionin, der Rest 160 Tyrosin, der Rest 189 Methionin und Kombinationen derselben sind, wobei das Polypeptid im Vergleich zu dem entsprechenden OspA-Polypeptid des Wildtyps über eine erhöhte Konformations-Stabilität verfügt und die Nummerierung der Nummerierung von SEQ ID NO: 7 entspricht.
Chimäres Polypeptid mit a) einer Aminosäuresequenz eines ersten OspA-Polypeptids ab dem Rest 1 bis zu dem Rest 164 aus einem ersten Borrelia burgdorferi-Stamm; b) einer Aminosäuresequenz eines zweiten OspA-Polypeptids ab dem Rest 165 bis zu dem Rest 179 aus einem zweiten Borrelia burgdorferi-Stamm, wobei der zweite Stamm ein vom ersten Stamm verschiedener Stamm ist; c) einer Aminosäuresequenz eines dritten OspA-Polypeptids ab dem Rest 180 bis zu dem Rest 216 aus einem dritten Borrelia burgdorferi-Stamm, wobei der dritte Stamm ein vom zweiten Stamm verschiedener Stamm ist; d) einer Aminosäuresequenz eines vierten OspA-Polypeptids ab dem Rest 217 bis zu dem Rest 273 aus einem vierten Borrelia burgdorferi-Stamm, wobei der vierte Stamm ein vom dritten Stamm verschiedener Stamm ist; wobei die Sequenz alle die Abänderungen enthält, welche darin bestehen, dass der Rest 139 Methionin, der Rest 160 Tyrosin, der Rest 189 Methionin und Kombinationen derselben sind, wobei die Nummerierung der Nummerierung von SEQ ID NO: 7 entspricht.
Polypeptid, das ausgewählt ist aus der Gruppe SEQ ID NO: 104 oder SEQ ID NO: 116.