DE60024977T2

DE60024977T2 - Klonierung und expression von haemophilus somnus transferrin-bindenden proteinen

Info

Publication number: DE60024977T2
Application number: DE60024977T
Authority: DE
Inventors: A. Andrew POTTER; Clement Rioux; B. Anthony SCHRYVERS
Original assignee: University of Saskatchewan
Current assignee: University of Saskatchewan
Priority date: 1999-03-10
Filing date: 2000-03-10
Publication date: 2006-09-28
Anticipated expiration: 2020-03-11
Also published as: AU775996B2; WO2000053765A1; EP1159426A1; US6391316B1; DE60024977D1; US6887686B2; HUP0200162A3; ATE313628T1; CA2365799A1; HUP0200162A2; NZ514027A; ES2255488T3; EP1159426B1; DK1159426T3; AU3138700A; US20030007981A1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein bakterielle Antigene und derselben codierende Gene. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung die Klonierung, Expression und Charakterisierung von Transferrin-Bindeproteinen von Haemophilus somnus (H. somnus) und die Verwendung derselben in Vakzinzusammensetzungen.
Haemophilus somnus ist ein Gram-negatives Bakterium, das mehrere Krankheitssymptome bei Rindern verursacht, die zusammengefasst als bovine Hämophilose bezeichnet sind. Das Bakterium ist normalerweise mit der thromboembolischen Meningoenzephalitis (ITEME), Myokarditis, Sepsis, Arthritis und Pneumonie assoziiert (Corbeil, L.B. (1990) Can. Vet. Res. 54:S57–S62; Harns und Janzen (1990) Can. Vet. J. 30:816–822; Humphrey und Stephens (1993) Vet. Bull. 53:987–1004). Diese Krankheiten verursachen signifikante Verluste in der Landwirtschaft.
Herkömmliche Vakzine gegen Haemophilus somnus Infektionen basieren entweder auf abgetöteten ganzen Zellen oder auf einer Proteinfraktion, die an äußeren Membranproteinen (OMGs) angereichert ist. Allerding enthalten Bakterienvakzine mit ganzen Zellen und Oberflächenproteinextrakten häufig immunsuppremierende Komponenten, die die Tiere für eine Infektion anfälliger machen können. Rekombinante Vakzine, die Haemophilus somnus Lipoproteine, LppA, LppB und LppC enthalten, sind beschrieben worden. Siehe z.B. Internationale Publikation WO 93/21323, veröffentlicht am 28. Oktober 1993. Allerdings bleibt weiterhin ein Bedarf an wirksamen Spaltvakzinen gegen eine Haemophilus somnus Infektion.
Eisen ist ein essentielles Element für das Wachstum der meisten Mikroorganismen. Weinberg, E.D. (1978) Microbiol. Rev. 42:45–66. Selbst wenn Eisen innerhalb von Säugergeweben reichlich vorhanden ist, ist praktisch das gesamte Eisen innerhalb des Säugerkörpers intrazellulär als Ferritin oder als Häm-Verbindungen gebunden, also in Pools, die im Allgemeinen für eindringende Organismen nicht zugänglich sind. Zusätzlich sind die in extrazellulären Räumen vorhandenen kleinen Eisenmengen von hochaffinen Eisen-bindenden Glycoproteinen des Wirts, wie Transferrin, das in Serum und Lymphe vorhanden ist, oder Lactoferrin, das in Sekreten und Milch vorhanden ist, effektiv komplexiert. Otto et al. (1992) Crit. Rev. Microbiol. 18:217–233.
Daher haben bakterielle Pathogene spezifische Eisenaufnahmemechanismen entwickelt. In vielen Bakterienarten umfassen diese Mechanismen die Synthese und Sekretion kleiner Verbindungen, sogenannter Siderophore, die eine hohe Affinität für das Eisenion (FeIII) zeigen. Siderophore sind in der Lage, Transferrin-gebundenes Eisen aufzunehmen, um Ferrisiderophor-Komplexe zu bilden, die dann wieder von spezifischen Eisen-reprimierbaren Membranrezeptoren erkannt und in das Bakterium aufgenommen werden, wo das Eisen freigesetzt wird. Crosa, J.H. (1989) Microbiol. Rev. 53:517–530. Einige Gram-negative Bakterien sezernieren keine detektierbaren Siderophore, wenn sie in einer Eisenmangel-Umgebung wachsen, bilden aber äußere Membranproteine, die an Transferrin direkt und spezifisch binden, und dadurch einen Eisentransport in die Bakterienzelle erlauben.
Transferrin-Bindeproteine neigen dazu, hochspezifisch für das Transferrin ihres natürlichen Wirts zu sein. Die Fähigkeit von Mikroorganismen, Transferrin als einzige Eisenquelle zu binden und nutzen, wie auch die Korrelation zwischen Virulenz und der Fähigkeit, Eisen vom Wirt aufzunehmen, ist gezeigt worden (Archibald und DeVoe (1979) FEMS Microbiol. Lett. 6:159–162; Archibald und DeVoe (1980) Infect. Immun. 27:322–334; Herrington und Sparling (1985) Infect. Immun. 48:248–251; Weinberg, E.D. (1978) Microbiol. Rev. 42:45–66).
Zwei Transferrin-Bindeproteine, als Transferrin-Bindeprotein 1 beziehungsweise Transferrin-Bindeprotein 2 (Tbp1 und Tbp2) bezeichnet, sind in äußeren Bakterienmembranen identifiziert worden. Gonzales et al. (1990) Mol. Microbiol. 4:1173–1179, beschreibt ein 105 und 56 kDa Protein von Actinobacillus pleuropneumoniae, als porcines Transferrin-Bindeprotein 1 (pTfBP1) beziehungsweise porcines Transferrin-Bindeprotein 2 (pTfBP2) bezeichnet. U.S. Patente Nr. 5.417.971, 5.521.072 und 5.801.018 beschreiben die Klonierung und Expression zweier Transferrin-Bindeproteine von A. pleuropneumoniae wie auch die Verwendung der Proteine in Vakzinzusammensetzungen. Schryvers, A.B. (1989) J. Med. Microbiol. 29:121–130 beschreibt zwei aus Haemophilus influenza isolierte mutmaßliche Transferrin-Bindeproteine. U.S. Patent Nr. 5.708.149 und Internationale Publikation Nr. WO 95/13370, veröffentlicht am 18. Mai 1995, beschreiben die rekombinante Produktion von H. influenza Tbp1 und Tbp2. U.S. Patent Nr. 5.141.743 und 5.292.869 und Internationale Publikation Nr. WO 90/12591 beschreiben die Isolierung von Transferrin-Rezeptorproteinen aus Neisseria meningitidis und die Verwendung der isolierten Proteine in Vakzinzusammensetzungen. Die Internationale Publikation Nr. WO 95/33049, veröffentlicht am 7. Dezember 1995, und die Europäische Publikation Nr. EP 586.266 beschreiben DNA, die N. meningitidis Transferrin-Bindeproteine codiert. Schließlich beschreiben Ogunnariwo et al. (1990) Microbiol. Path. 9:397–406 die Isolierung zweier Transferrin-Bindeproteine aus H. somnus.
Allerdings sind bis heute die Transferrin-Bindeproteine von H. somnus nicht rekombinant hergestellt worden.
Die vorliegende Erfindung basiert auf der Entdeckung von H. somnus Transferrin-Bindeproteine codierenden Genen und deren Charakterisierung. Die von den Genen codierten Proteine sind rekombinant hergestellt worden und diese Proteine, immunogenen Fragmente und Analoga davon und/oder chimären Proteine, einschließlich derselben, können entweder allein oder in Kombination mit anderen H. somnus Antigenen in neuartigen Spaltvakzinen verwendet sein, um einen Schutz gegen eine bakterielle Infektion in einem Säuger bereitzustellen. Die betreffende Erfindung betrifft:

1. Eine Vakzinzusammensetzung im Wesentlichen bestehend aus einem pharmazeutisch verträglichen Vehikel, einem Adjuvans und einem isolierten immunogenen H. somnus Transferrin-Bindeprotein ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus (a) einem H. somnus Transferrin-Bindeprotein 1 mit mindestens etwa 90% Sequenzidentität zu der zusammenhängenden Sequenz der Aminosäuren gezeigt an den Aminosäurepositionen 1–971, inklusive, von 3, (b) einem H. somnus Transferrin-Bindeprotein 1 mit mindestens etwa 90% Sequenzidentität zu der zusammenhängenden Sequenz der Aminosäuren gezeigt an den Aminosäurepositionen 29–971, inklusive, von 3, (c) einem H. somnus Transferrin-Bindeprotein 2 mit mindestens etwa 90% Sequenzidentität zu der zusammenhängenden Sequenz der Aminosäuren gezeigt an den Aminosäurepositionen 1–662, inklusive, von 4, und (d) einem H. somnus Transferrin-Bindeprotein 2 mit mindestens etwa 90% Sequenzidentität zu der zusammenhängenden Sequenz der Aminosäuren gezeigt an den Aminosäurepositionen 20–662, inklusive, von 4.
2. Die Vakzinzusammensetzung nach Anspruch 1, wobei , das Transferrin-Bindeprotein die an Aminosäurepositionen 1–971, inklusive, von 3 gezeigte Aminosäuresequenz umfasst.
3. Die Vakzinzusammensetzung nach Anspruch 1, wobei das Transferrin-Bindeprotein die an Aminosäurepositionen 29–971, inklusive, von 3 gezeigte Aminosäuresequenz umfasst.
4. Die Vakzinzusammensetzung nach Anspruch 1, wobei das Transferrin-Bindeprotein die an Aminosäurepositionen 1–662, inklusive, von 4 gezeigte Aminosäuresequenz umfasst.
5. Die Vakzinzusammensetzung nach Anspruch 1, wobei das Transferrin-Bindeprotein die an Aminosäurepositionen 20–662, inklusive, von 4 gezeigte Aminosäuresequenz umfasst.
6. Die Vakzinzusammensetzung nach einem der Ansprüche 1–5, umfassend ein H. somnus Transferrin-Bindeprotein 1 und ein H. somnus Transferrin-Bindeprotein 2.
7. Ein Verfahren zur Herstellung einer Vakzinzusmmensetzung umfassend:
(a) zur Verfügung stellen eines isolierten immunogenen H. somnus Transferrin-Bindeproteins ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus (a) einem H. somnus Transferrin-Bindeprotein 1 mit mindestens etwa 90% Sequenzidentität zu der zusammenhängenden Sequenz der Aminosäuren gezeigt an den Aminosäurepositionen 1–971, inklusive, von 3, (b) einem H. somnus Transferrin-Bindeprotein 1 mit mindestens etwa 90% Sequenzidentität zu der zusammenhängenden Sequenz der Aminosäuren gezeigt an den Aminosäurepositionen 29–971, inklusive, von 3, (c) einem H. somnus Transferrin-Bindeprotein 2 mit mindestens etwa 90% Sequenzidentität zu der zusammenhängenden Sequenz der Aminosäuren gezeigt an den Aminosäurepositionen 1–662, inklusive, von 4, und (d) einem H. somnus Transferrin-Bindeprotein 2 mit mindestens etwa 90% Sequenzidentität zu der zusammenhängenden Sequenz der Aminosäuren gezeigt an den Aminosäurepositionen 20–662, inklusive, von 4, und
(b) kombinieren des Transferrin-Bindeproteins mit einem pharmazeutisch verträglichem Vehikel und einem Adjuvans..
8. Verwendung eines immunogenen H. somnus Transferrin-Bindeproteins zur Herstellung einer Vakzinzusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 1–6 zur Behandlung oder Prävention einer Infektion eines Säugetiers mit H. somnus.
9. Ein immunodiagnostischer Testkit zum Nachweis einer Haemophilus somnus-Infektion, wobei der Testkit umfasst: ein immunogenes H. somnus Transferrin-Bindeprotein ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus (a) einem H. somnus Transferrin-Bindeprotein 1 mit mindestens etwa 90% Sequenzidentität zu der zusammenhängenden Sequenz der Aminosäuren gezeigt an den Aminosäurepositionen 1–971, inklusive, von 3, (b) einem H. somnus Transferrin-Bindeprotein 1 mit mindestens etwa 90% Sequenzidentität zu der zusammenhängenden Sequenz der Aminosäuren gezeigt an den Aminosäurepositionen 29–971, inklusive, von 3, (c) einem H. somnus Transferrin-Bindeprotein 2 mit mindestens etwa 90% Sequenzidentität zu der zusammenhängenden Sequenz der Aminosäuren gezeigt an den Aminosäurepositionen 1–662, inklusive, von 4, und (d) einem H. somnus Transferrin-Bindeprotein 2 mit mindestens etwa 90% Sequenzidentität zu der zusammenhängenden Sequenz der Aminosäuren gezeigt an den Aminosäurepositionen 20–662, inklusive, von 4 und Anweisungen zur Durchführung des immunodiagnostischen Tests.
10. Verwendung eines immunogenen H. somnus Transferrin-Bindeproteins ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus (a) einem H. somnus Transferrin-Bindeprotein 1 mit mindestens etwa 90% Sequenzidentität zu der zusammenhängenden Sequenz der Aminosäuren gezeigt an den Aminosäurepositionen 1–971, inklusive, von 3, (b) einem H. somnus Transferrin-Bindeprotein 1 mit mindestens etwa 90% Sequenzidentität zu der zusammenhängenden Sequenz der Aminosäuren gezeigt an den Aminosäurepositionen 29–971, inklusive, von 3, (c) einem H. somnus Transferrin-Bindeprotein 2 mit mindestens etwa 90% Sequenzidentität zu der zusammenhängenden Sequenz der Aminosäuren gezeigt an den Aminosäurepositionen 1–662, inklusive, von 4, und (d) einem H. somnus Transferrin-Bindeprotein 2 mit mindestens etwa 90% Sequenzidentität zu der zusammenhängenden Sequenz der Aminosäuren gezeigt an den Aminosäurepositionen 20–662, inklusive, von 4 zur Herstellung eines diagnostischen Reagenz zum Nachweis von Haemophilus somnus Antikörpern in einer biologischen Probe.

1A–1B zeigen die Nukleotisdequenzen der H. somnus tbp1 und tbp2-Gene (SEQ ID NR: 1). Das tbp1-Gen ist an den Positionen 2891–5803 und das tbp2-Gen ist an den Positionen 708–2693 gefunden.
2 ist eine Genkarte der H. somnus tbp-Region. Restriktionsstellen sind gezeigt.
3 zeigt die vollständige Aminosäuresequenz von H. somnus Tbp1 (SEQ ID NR: 2).
4 zeigt die vollständige Aminosäuresequenz von H. somnus Tbp2 (SEQ ID NR: 3).
5 zeigt die als Antikörpertiter gemessene Tbp1-spezifische serologische Antwort, auf Vakzine, die rekombinant produzierte H. somnus Transferrin-Bindeproteine enthalten. Blut 1 wurde vor der Immunisierung entnommen; Blut 2 wurde zum Zeitpunkt der Boost-Immunisierung entnommen; Blut 3 wurde vor einer Challenge entnommen.
6 zeigt die als Antikörpertiter gemessene Tbp2-spezifische serologische Antwort, auf Vakzine, die rekombinant produzierte H. somnus Transferrin-Bindeproteine enthalten. Blut 1 wurde vor der Immunisierung entnommen; Blut 2 wurde zum Zeitpunkt der Boost-Immunisierung entnommen; Blut 3 wurde vor einer Challenge entnommen.
7 zeigt die Mortalität in Tiergruppen, denen Vakzine verbreicht wurden, die rekombinant produzierte H. somnus Transferrin-Bindeproteine enthalten.
8 zeigt die durchschnittliche Temperatur, die bei Tieren, denen rekombinant produzierte H. somnus Transferrin-Bindeproteine enthaltende Vakzine verabreicht wurden, und bei Tieren gemessen wurde, die Placebos erhielten, wie es in den Beispielen beschrieben ist. Ergebnisse nach einer Challenge mit H. somnus sind gezeigt.
9 zeigt Depressionsbewertungen bei Tieren, denen rekombinant produzierte H. somnus Transferrin-Bindeproteine enthaltende Vakzine verabreicht wurden, und bei Tieren, die Placebos erhielten, wie es in den Beispielen beschrieben ist. Es sind die Berwertungen von den Tagen 5–8 nach einer Challenge mit H. somnus gezeigt.
10 zeigt die durchschnittliche Krankheitsbewertungen bei Tieren, denen rekombinant produzierte H. somnus Transferrin-Bindeproteine enthaltende Vakzine verabreicht wurden, und bei Tieren, die Placebos erhielten, wie es in den Beispielen beschrieben ist. Es sind die Bewertungen von den Tagen 5–8 nach einer Challenge mit H. somnus gezeigt.
11A–11C stellen ein chromosomales Fragment (SEQ ID NR: 4) dar, das das H. somnus lppB-Gen an den Positionen 872–1906 der Figur vorkommend umfasst, und die entsprechende LppB-Aminosäuresequenz (SEQ ID NR: 5) zeigt.
12 stellt das Hopp/Woods-Antigenitätsprofil von reifem H. somnus Tbp1 dar.
13 stellt das Kyte-Doolittle-Hydropathiediagramm (unten in der Figur) und Argos Transmembranhelices (oben in der Figur) von reifem H. somnus Tbp1 dar.
14 stellt das Hopp/Woods-Antigenitätsprofil von reifem H. somnus Tbp2 dar.
15 stellt das Kyte-Doolittle-Hydropathiediagramm von reifem H. somnus Tbp2 dar.
Bei der praktischen Umsetzung der vorliegenden Erfindung werden, außer anderes ist angegeben, herkömmliche Techniken der Molekularbiologie, Mikrobiologie, rekombinante DNA-Technologie und Immunologie eingesetzt, die im Rahmen der Fachkenntnisse liegen. Derartige Techniken sind in der Literatur ausgiebig erklärt. Siehe z. B., Sambrook, Fritsch & Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Vols. I, II und III, zweite Ausgabe (1989); Perbal, B., A Practical Guide to Molecular Cloning (1984); die Schriftreihen, Methods In Enzymology (S. Colowick und N. Kaplan eds., Academic Press, Inc.); und Handbook of Experimental Immunology Vols. I–IV (D.M. Weir und C.C. Blackwell eds., 1986, Blackwell Scientific Publications).

Die folgenden Aminosäure Abkürzungen sind innerhalb des Textes verwendet:

Alanin: Ala (A)	Arginin: Arg (R)
Asparagin: Asn (N)	Asparaginsäure: Asp (D)
Cystein: Cys (C)	Glutamin: Gln (Q)
Glutaminsäure: Glu (E)	Glycin: Gly (G)
Histidin: His (H)	Isoleucin: Ile (I)
Leucin: Leu (L)	Lysin: Lys (K)
Methionin: Met (M)	Phenylalanin: Phe (F)
Prolin: Pro (P)	Serin: Ser (S)
Threonin: Thr (T)	Tryptophan: Trp (W)

Tyrosin: Tyr (Y)

Valin: Val (V)

A. Definitionen
Bei der Beschreibung der vorliegenden Erfindung sind die folgenden Ausdrücke verwendet und sollen wie unten angegeben definiert sein.
Es ist anzumerken, dass, wie in dieser Beschreibung und den anhängigen Ansprüchen verwendet, die Singularformen „ein", „eine" und „der", „die", „das" die Pluralformen umfassen, außer der Inhalt gebietet eindeutig anderes. Folglich umfasst zum Beispiel der Verweis auf „ein H. somnus Transferrin-Bindeprotein" eine Mischung aus zwei oder mehreren derartigen Proteinen und ähnliches.
Die Ausdrücke „Transferrin-Bindeprotein", TF-Bindeprotein" und „Tbp" (hier austauschbar verwendet) oder eine dieselben codierende Nukleotidsequenz sollen ein Protein beziehungsweise eine Nukleotidsequenz bezeichnen, die von einem H. somnus tbp-Gen stammt. Die Nukleotidsequenz zweier repräsentativer H. somnus tbp-Gene, hier „tbp1" und „tbp2" genannt, und die entsprechende Aminosäuresequenz der von diesen Genen codierten Tbp-Proteine sind in den Figuren dargestellt. Insbesondere zeigen 1A–1B (SEQ ID NR: 1) die Nukleotidsequenz des vollständigen tbp1 (vorkommend an Nukleotidpositionen 2891–5803, inklusive) und tbp2 (vorkommend an Nukleotidpositionen 708–2693, inklusive) und 3 (SEQ ID NR: 2) und 4 (SEQ ID NR: 3) zeigen die vollständigen Aminosäuresequenzen von Tbp1 beziehungsweise Tbp2. Allerdings ist ein H. somnus Transferrin-Bindeprotein, wie es hier definiert ist, nicht auf die dargestellten Sequenzen beschränkt, da mehrere Subtypen von H. somnus bekannt sind und Variationen der Transferrin-Bindeproteine unter den Stämmen von H. somnus vorkommen.
Außerdem müssen das abgeleitete Protein oder die abgeleiteten Nukleotidsequenzen nicht physisch von dem oben beschriebenen Gen abgeleitet sein, sondern können auf beliebige Art und Weise erzeugt sein, einschließlich zum Beispiel chemischer Synthese, Isolierung (z.B. von H. somnus) oder mittels rekombinanter Herstellung, basierend auf den hier gelieferten Informationen. Zusätzlich soll der Ausdruck Proteine umfassen, die im Wesentlichen homologe Aminosäuresequenzen (wie oben definiert) zu den von den Genen codierten zusammenhängenden Aminosäuresequenzen besitzen, die eine immunologische und/oder Transferrin-bindende Aktivität zeigen.
Folglich sollen die Ausdrücke vollständige wie auch immunogene, verkürzte und partielle Sequenzen und aktive Analoga und Vorläuferformen der Proteine umfassen. Ebenfalls umfasst dieser Ausdruck Nukleotidfragmente des Gens, die wenigstens etwa 8 zusammenhängende Basenpaare, bevorzugter wenigstens etwa 10–20 zusammenhängende Basenpaare und am bevorzugtesten wenigstens etwa 25 bis 50 oder mehr zusammenhängende Basenpaare des Gens enthalten. Derartige Fragmente sind als Sonden und in Diagnoseverfahren zweckdienlich, was unten noch ausgiebiger diskutiert wird.
Die Ausdrücke umfassen ebenfalls diejenigen Formen, die die Signalsequenz besitzen oder nicht besitzen, wie auch die hierfür codierenden Nukleinsäuresequenzen. Zusätzlich soll der Ausdruck Formen der Transferrin-Bindeproteine, denen die Membranankerregion fehlt, und Nukleinsäuresequenzen umfassen, die Proteine mit derartigen Deletionen codieren. Derartige Deletionen können in Systemen erwünscht sein, die nicht für eine Sekretion des Proteins sorgen. Außerdem können die Transferrin-bindenden Domänen der Proteine vorhanden sein oder nicht vorhanden sein. Folglich wird zum Beispiel die Transferrin-bindende Domäne im Allgemeinen behalten, wenn das Transferrin-Bindeprotein zur Reinigung von Transferrin verwendet werden soll. Falls das Protein in Vakzinzusammensetzungen verwendet werden soll, sind immunogene Epitope vorhanden, die die Transferrin-bindende Domäne enthalten oder nicht enthalten.
Die Ausdrücke umfassen ebenfalls Proteine in neutraler Form oder in Form basischer oder saurer Additionssalze, abhängig von der Herstellungsweise. Derartige Additionssalze können freie Aminogruppen umfassen und basische Salze können mit freien Carboxylgruppen gebildet sein. Pharmazeutisch verträgliche Träger und basische und saure Additionssalze sind weiter unten diskutiert. Zusätzlich können die Proteine durch Verknüpfen mit anderen biologischen Materialien, wie Lipiden (beide dieser kommen mit dem Molekül oder anderen Lipiden, die die immunologische Aktivität nicht zerstören, natürlicherweise vor) und Sacchariden, oder mittels Seitenkettenmodifikation, wie Acetylierung von Aminogruppen, Phosphorylierung von Hydroxylseitenketten, Oxidation von Sulfhydrylgruppen, Glycosylierung von Aminosäureresten, wie auch anderer Modifikationen der codierten primären Sequenz, modifiziert sein.
Die Proteine der vorliegenden Erfindung sind normalerweise verbunden mit Lipidresten vorgefunden. Es ist wahrscheinlich, dass der vorhandene Fettsäurerest ein Palmitinsäurederivat ist. Die Antigene der vorliegenden Erfindung, selbst wenn sie von Lipoproteinen stammende Epitope tragen, erfordern nicht das Vorhandensein des Lipidrests. Außerdem muss, falls das Lipid vorhanden ist, es nicht ein Lipid sein, das üblicherweise mit dem Lipoprotein verbunden ist, solange die geeignete Immunantwort hervorgerufen wird. Auf jeden Fall können geeignete Fettsäuren, wie beispielsweise, aber hierauf nicht beschränkt, Palmitinsäure oder Palmitinsäure-Analoga bequemerweise an die erwünschte Aminosäuresequenz während der Synthese unter Anwendung von Standardverfahren addiert werden. Zum Beispiel ist Palmitoyl, gebunden an S-Glyceryl-L-Cys (Pam₃-Cys) im Handel erhältlich (z.B. von Boehringer Mannheim, Dorval, Quebec) und kann leicht in eine Aminosäuresequenz während der Synthese eingebaut werden. Siehe z.B. Deres et al. (1989) Nature 342:561. Dies ist ein besonders bequemes Verfahren zur Herstellung, wenn relativ kurze Aminosäuresequenzen verwendet sind. Ähnlich können rekombinante Systeme verwendet sein, die die exprimierten Proteine durch Addition geeigneter Fettsäuren verarbeiten. Repräsentative Systeme zur rekombinanten Herstellung sind weiter unten diskutiert.
Der Ausdruck soll deshalb Deletionen, Additionen und Substitutionen der Sequenz umfassen, solange das Peptid seine Funktion beibehält, eine Immunantwort zu erzeugen, wie sie hier definiert ist. In dieser Hinsicht sind bevorzugte Substitutionen im Allgemeinen konservativer Natur, d.h. jene Substitutionen, die innerhalb einer Aminosäurefamilie stattfinden. Zum Beispiel werden Aminosäuren allgemein in vier Familien eingeteilt: (1) saure -- Aspartat und Glutamat; (2) basische -- Lysin, Arginin, Histidin; (3) unpolare – Alanin, Valin, Leucin, Isoleucin, Prolin, Phenylalanin, Methionin, Tryptophan; und (4) nicht geladene polare – Glycin, Asparagin, Glutamin, Cystein, Serin, Threonin, Tyrosin. Phenylalanin, Tryptophan und Tyrosin werden manchmal als aromatische Aminosäuren klassifiziert. Zum Beispiel ist es verständlicherweise vorhersagbar, dass ein isoliertes Ersetzen von Leucin durch Isoleucin oder Valin oder umgekehrt; ein Aspartat durch ein Glutamat oder umgekehrt; ein Threonin durch ein Serin oder umgekehrt; oder ein ähnlich konservatives Ersetzen einer Aminosäure durch eine strukturverwandte Aminosäure keine große Wirkung auf die biologische Aktivität besitzen wird. Proteine mit im Wesentlichen der gleichen Aminosäuresequenz wie das Referenzmolekül, die aber minimale Aminosäuresubstitutionen besitzen, die nicht wesentlich die Immunogenität des Proteins beeinflussen, liegen deshalb innerhalb der Definition des Referenzpolypeptids.
Zum Beispiel kann das Polypeptid von Interesse bis zu etwa 5–10 konservative oder nicht konservative Aminosäuresubstitutionen oder sogar bis zu etwa 15–25 konservative oder nicht konservative Aminosäuresubstitutionen besitzen, solange die erwünschte Funktion des Moleküls intakt bleibt. In dieser Hinsicht beeinflussen Substitutionen, die in der transmembranbindenden Domäne und der Signalsequenz vorkommen, normalerweise nicht die Immunogenität. Der Fachmann kann ohne weiteres weitere Regionen des Moleküls von Interesse, die eine Änderung tolerieren, unter Bezugnahme auf Hopp/Woods und Kyte-Dolittle Diagramme bestimmen, die hier in 12–15 gezeigt sind.
Ein „isoliertes" Nukleinsäuremolekül ist ein von dem gesamten Organismus separates und getrenntes Nukleinsäuremolekül, mit dem das Molekül in der Natur vorgefunden ist; oder ist ein Nukleinsäuremolekül, das, vollständig oder teilweise, frei von Sequenzen ist, mit denen es normalerweise in der Natur assoziiert ist; oder ist eine Sequenz, wie sie in der Natur vorkommt, aber heterologe Sequenzen (wie sie unten definiert sind) assoziiert besitzt.
Mit „Spaltvakzinzusammensetzung" ist eine Zusammensetzung gemeint, die wenigstens ein immunogenes Polypeptid aber nicht alle Antigene enthält, das von einem Antigen eines Pathogens von Interesse abstammt oder zu diesem homolog ist. Eine derartige Zusammensetzung ist im Wesentlichen frei von intakten Pathogenzellen oder Pathogenpartikeln oder ist das Lysat derartiger Zellen oder Partikel. Folglich ist eine „Spaltvakzinzusammensetzung" aus wenigstens partiell gereinigten (vorzugsweise im Wesentlichen gereinigten) immunogenen Polypeptiden des Pathogens oder rekombinanten Analoga davon. Eine Spaltvakzinzusammensetzung kann die Untereinheit des Antigens oder der Antigene von Interesse im Wesentlichen frei von anderen Antigenen oder Polypeptiden des Pathogens umfassen.
Der Ausdruck „Epitop" bezeichnet die Stelle auf einem Antigen oder Hapten, auf die spezifische B-Zellen und/oder T-Zellen antworten. Der Ausdruck ist ebenfalls mit „antigene Determinante" oder „antigene Determinantenstelle" austauschbar verwendet. Antikörper, die dasselbe Epitop erkennen, können in einem einfachen Immunoassay identifiziert werden, der die Fähigkeit des einen Antikörpers zeigt, die Bindung des anderen Antikörpers an das Zielantigen zu blockieren.
Eine „immunologische Antwort" auf eine Zusammensetzung oder Vakzin ist die Entwicklung einer zellulären und/oder Antikörper-vermittelten Immunantwort auf die Zusammensetzung oder das Vakzin von Interesse in einem Wirt. Normalerweise umfasst eine „immunologische Antwort" eine oder mehrere der folgenden Wirkungen, ist aber hierauf nicht beschränkt: Die Produktion von Antikörpern, B-Zellen, T-Helferzellen, Suppressor-T-Zellen und/oder cytotoxischen T-Zellen und/oder γδ T-Zellen, die gegen ein Antigen oder Antigene spezifisch gerichtet sind, die in der Zusammensetzung oder dem Vakzin von Interesse enthalten sind. Vorzugsweise zeigt der Wirt entweder eine therapeutische oder protektive immunologische Antwort, so dass die Resistenz der Milchdrüse gegen eine neue Infektion verstärkt ist und/oder die klinische Schwere der Erkrankung vermindert ist. Ein derartiger Schutz wird entweder durch eine Verringerung oder Ausbleiben von Symptomen, die von dem infizierten Wirt normalerweise gezeigt werden, und/oder einer rascheren Gesundungszeit demonstriert.
Die Ausdrücke „immunogenes" Protein oder Polypeptid bezeichnen eine Aminosäuresequenz, die eine immunologische Antwort, wie oben beschrieben, hervorruft. Ein „imunogenes" Protein oder Polypeptid, wie hier verwendet, umfasst die vollständige Sequenz des fraglichen Transferrin-Bindeproteins, mit oder ohne Signalsequenz, Membranankerdomäne und/oder Transferrin-Bindedomäne, Analoga davon, oder immunogene Fragmente davon. Mit „immunogenes Fragment" ist ein Fragment eines Transferrin-Bindeproteins gemeint, das ein oder mehrere Epitope umfasst und folglich die oben beschriebene immunologische Antwort hervorruft. Derartige Fragmente können unter Anwendung beliebiger, in der Technik gut bekannter Epitop-Kartierungstechniken identifiziert sein. Siehe z.B. Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66 (Glenn E. Morris, Ed., 1996) Humana Press, Totowa, New Jersey. Zum Beispiel können lineare Epitope bestimmt werden z.B. durch gleichzeitiges Synthetisieren einer großen Anzahl an Peptiden auf festen Trägern, wobei die Peptide Teilen des Proteinmoleküls entsprechen, und Reaktion der Peptide mit Antikörpern, während die Peptide noch an ihren Träger gebunden sind. Derartige Verfahren sind in der Technik bekannt und beschrieben z.B. in U.S. Patent Nr. 4.708.871; Geysen et al. (1984) Proc. natl. Acad. Sci. USA 81:3998–4002; Geysen et al. (1986) Molec. Immunol. 23:709–715. Ähnlich sind Konformationsepitope ohne weiteres durch Bestimmung ihrer räumlichen Konformation von Aminosäuren wie z.B. mit Röntgenkristallographie und zweidimensionaler magnetischer Kernresonanz identifiziert. Siehe z.B. Epitope Mapping Protocols, supra. Antigene Bereiche von Proteinen können ebenfalls unter Verwendung von Antigenitäts- und Hydropathie-Standarddiagrammen identifiziert sein, wie diejenigen, die unter Verwendung des Omiga Version 1.0 Softwareprogramms, das von der Oxford Molecular Group erhältlich ist, errechnet werden. Dieses Computerprogramm nutzt das Hopp/Woods-Verfahren, Hopp et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1981) 78:3824–3828 zur Bestimmung von Antigenitätsprofilen und die Kyte-Doolittle Technik, Kyte et al., J. Mol. Biol. (1982) 157:105–132 für die Hydropathiediagramme. 12–14 stellen Hopp/Woods und Kyte-Doolittle-Profile für repräsentative Proteine dar und sind von der Erfindung umfasst.
Immunogene Fragmente im Sinne der vorliegenden Erfindung umfassen normalerweise wenigstens etwa 3 Aminosäuren, bevorzugt wenigstens etwa 5 Aminosäuren, bevorzugter wenigstens etwa 10–15 Aminosäuren, am bevorzugtesten 25 oder mehr Aminosäuren des elterlichen Transferrin-Bindeproteinmoleküls. Es gibt keine kritische Obergrenze für die Länge des Fragments, das fast die vollständige Proteinsequenz oder sogar ein Fusionsprotein umfassen kann, das zwei oder mehr Epitope von Tbp1 und/oder Tbp2 umfasst.
„Native" Proteine oder Polypeptide bezeichnen Proteine oder Polypeptide, die aus der Quelle isoliert sind, in der die Proteine natürlicherweise vorkommen. „Rekombinante" Polypeptide bezeichnen Polypeptide, die mit rekombinanten DNA-Techniken hergestellt sind, z.B. von Zellen produziert sind, die mit einem das erwünschte Polypeptid codierenden exogenen DNA-Konstrukt transformiert sind. „Synthetische" Polypeptide sind mit Hilfe einer chemischen Synthese hergestellte Peptide.
Ein „Vektor" ist ein Replikon, wie ein Plasmid, Phage oder Cosmid, an dem ein anderer DNA-Abschnitt gebunden sein kann, um die Replikation des gebundenen Abschnittes zu bewerkstelligen.
Eine DNA „codierende Sequenz" oder eine „Nukleotidsequenz, codierend" ein bestimmtes Protein, ist eine DNA-Sequenz, die in ein Polypeptid in vitro oder in vivo transkribiert und translatiert wird, wenn sie unter der Kontrolle geeigneter regulatorischer Elemente ist. Die Grenzen der codierenden Sequenz sind durch ein Startcodon an dem 5'-(Amino)-Terminus und einem Translationsstopcodon an dem 3'-(Carboxy)-Terminus festgelegt. Eine codierende Sequenz kann prokaryotische Sequenzen, cDNA von eukaryotischer mRNA, genomische DNA-Sequenzen von eukaryotischer (z.B. Säuger)-DNA und sogar synthetische DNA umfassen, ist aber hierauf nicht beschränkt. Eine Transkriptionsterminationssequenz befindet sich normalerweise 3' zur codierenden Sequenz.
DNA „Kontrollelemente" bezeichnet insgesamt Promotoren, Ribosombindungsstellen, Polyadenylierungssignale, Transktiptionsterminationssequenzen, stromaufwärts liegende regulatorische Domänen, Enhancer und ähnliches, die gemeinsam für die Transkription und Translation einer codierenden Sequenz in einer Wirtszelle sorgen. Nicht alle dieser Kontrollsequenzen müssen immer in einem rekombinanten Vektor vorliegen, solange das erwünschte Gen in der Lage ist, transkribiert und translatiert zu werden.
„Funktionsfähig verknüpft" bezeichnet eine Anordnung von Elementen, worin die beschriebenen Komponenten so angeordnet sind, so dass sie ihre normale Funktion erfüllen. Folglich sind mit einer codierenden Sequenz funktionsfähig verknüpfte Kontrollelemente in der Lage, die Expression der codierenden Sequenz zu bewirken. Die Kontrollelemente müssen nicht an die codierende Sequenz grenzen, solange wie sie zur Steuerung der Expression von diesen dienen. Folglich können dazwischenliegende nichttranslatierte und sogar transkribierte Sequenzen zwischen einem Promotor und der codierenden Sequenz vorhanden sein und die codierende Sequenz und der Promotor können noch als „funktionsfähig verknüpft" mit der codierenden Sequenz betrachtet sein.
Ein Kontrollelement wie ein Promotor „steuert die Transkription" einer codierenden Sequenz in einer Zelle, wenn die RNA-Polymerase den Promotor bindet und die codierende Sequenz in mRNA transkribiert, die dann in das Polypeptid translatiert wird, das von der codierenden Sequenz codiert ist.
Eine „Wirtszelle" ist eine Zelle, die von einem exogenen Nukleinsäuremolekül transformiert worden ist oder in der Lage ist, transformiert zu werden.
Eine Zelle ist mit exogener DNA „transformiert" worden, wenn derartige exogene DNA innerhalb der Zellmembran eingeführt worden ist. Exogene DNA kann oder kann nicht in die chromosomale DNA integriert (kovalent gebunden) sein, die das Genom der Zelle bildet. In Prokaryonten und Hefen zum Beispiel kann die exogene DNA in einem episomalen Element, wie einem Plasmid, untergebracht sein. Bezogen auf eukaryotische Zellen ist eine stabil transformierte Zelle eine Zelle, in der die exogene DNA in das Chromosom integriert worden ist, so dass sie an Tochterzellen über die Chromosomenreplikation vererbt wird. Diese Stabilität wird durch die Fähigkeit der eukaryotischen Zelle demonstriert, Zelllinien oder Klone zu etablieren, die aus einer Population an Tochterzellen bestehen, die die exogene DNA enthalten.
„Homologie" bezeichnet die prozentuale Identität zwischen zwei Polynukleotid- oder zwei Polypeptidresten. Zwei DNA- oder zwei Polypeptidsequenzen sind „im Wesentlichen homolog" zueinander, wenn die Sequenzen wenigstens etwa 80%–85%, bevorzugt wenigstens etwa 90% und am bevorzugtesten wenigstens etwa 95%–98% Sequenzidentität über eine definierte Länge der Moleküle zeigen. Wie hier verwendet, bezeichnet im Wesentlichen homolog auch Sequenzen, die eine vollständige Identität mit der spezifizierten DNA- oder Polypeptidsequenz zeigen.
Im Allgemeinen bezeichnet „Identität" eine genaue Übereinstimmung von Nukleotid-zu-Nukleotid oder von Aminosäure-zu-Aminosäure zweier Polynukleotid- beziehungsweise Polypeptidsequenzen. Die prozentuale Identität kann durch einen direkten Vergleich der Sequenzinformation zwischen zwei Molekülen mittels Abgleich der Sequenzen, Zählen der genauen Anzahl an Paarungen zwischen zwei abzugleichenden Sequenzen, Teilen durch die Länge der kürzeren Sequenz und Multiplizieren des Ergebnisses mit 100 bestimmt sein. Leicht erhältliche Computerprogramme können für eine Unterstützung der Analyse eingesetzt sein, wie ALIGN, Dayhoff, M.O. in Atlas of Protein Sequence and Structure M.O. Dayhoff ed., 5 Suppl. 3:353–358, National biomedical Research Foundation, Washington, DC, das den lokalen Homologiealgorithmus von Smith und Waterman (1981) Advances in Appl. Math. 2:482–489 für die Peptidanalyse anpasst. Programme für eine Bestimmung der Nukleotidsequenzidentität sind im Wisconsin Sequence Analysis Package, Version 8 (von Genetics Computer Group, Madison, WI, erhältlich) erhältlich, zum Beispiel die BESTFIT, FASTA und GAP Programme, die ebenfalls auf dem Algorithmus von Smith und Waterman beruhen. Diese Programme werden einfach mit den vom Hersteller empfohlenen Fehlerparametern verwendet und sind in dem oben bezeichneten Wisconsin Sequence Analysis Package beschrieben. Zum Beispiel kann die prozentuale Identität einer bestimmten Nukleotidsequenz zu einer Referenzsequenz unter Anwendung des Homologiealgorithmus von Smith und Waterman mit einer Fehlerbewertungstabelle und einem „Gap Penalty" von sechs Nukleotidpositionen bestimmt sein.
Ein weiteres Verfahren zur Festlegung der prozentualen Identität im Kontext mit der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung von Programmen des MPSRCH Package, Copyright der Univerity of Edinburgh, die von John F. Collins und Shane S. Sturrok entwickelt und von IntelliGenetics, Inc. (Mountain View, CA) vertrieben sind. Von dieser Reihe Packages kann der Algorithmus von Smith und Waterman verwendet sein, wo die Fehlerparameter für die Bewertungstabelle genutzt sind (zum Beispiel gap open penalty von 12, gap extension von eins und ein gap von sechs). Der aus diesen Daten erzeugte „Paarungswert" gibt die „Sequenzidentität" wider. Andere geeignete Programme zur Berechnung der prozentualen Identität oder Ähnlichkeit zwischen Sequenzen sind in der Technik bekannt, zum Beispiel ist ein weiteres Alignmentprogramm BLAST, das mit Fehlerparametern verwendet ist. Zum Beispiel können BLASTN und BLASTP unter Verwendung der folgenden Fehlerparameter verwendet sein: genetischer Code = Standard; Filter = ohne; Strang = beide; Cutoff = 60; Erwartet = 10; Matrix = BLOSUM62; Beschreibungen = 50 Sequenzen; sortiert von = HIGH SCORE; Datenbanken = nicht redundant; GenBank + EMBL + DDBJ + PDB + GenBank CDS Translationen + Swiss Protein + Spupdate + PIR. Details dieser Programme können unter der folgenden Internetadresse gefunden werden: http://www.ncbi.nlm.gov/cgi-bin/BLAST.
Alternativ kann die Homologie durch Hybridisierung von Polynukleotiden unter Bedingungen bestimmt sein, die stabile Duplices zwischen homologen Regionen bilden und einem anschließenden Verdau mit einzelsträngiger-spezifischer/n Nuklease(n) und Größenbestimmung der verdauten Fragmente, DNA-Sequenzen, die im Wesentlichen homolog sind, können in einem Southern-Blot Hybridisierungsexperiment unter zum Beispiel stringenten Bedingungen, wie für dieses bestimmte System definiert, identifiziert werden. Die Definition geeigneter Hybridisierungsbedingungen liegt im Rahmen der Fachkenntnisse. Siehe z.B. Sambrook et al., supra; DNA Cloning, supra; Nucleic Acid Hybridization, supra.
Mit dem Ausdruck „degenerierte Variante" soll ein Änderungen in seiner Nukleinsäuresequenz enthaltendes Polynukleotid bezeichnet sein, das ein Polypeptid mit derselben Aminosäuresequenz wie das Polypeptid codiert, das von dem Polynukleotid codiert ist, von dem die degenerierte Variante abstammt.
Der Ausdruck „funktionell äquivalent" soll bedeuten, dass die Aminosäuresequenz eines Transferrin-Bindeproteins eine Sequenz ist, die eine im Wesentlichen äquivalente oder verstärkte wie oben definierte immunologische Antwort hervorruft, im Vergleich zu der Antwort, die von einem Transferrin-Bindeprotein, das mit dem Transferrin-Referenzbindeprotein identisch ist, oder einem immunogenen Teil davon hervorgerufen ist.
Eine „heterologe" Region eines DNA-Konstrukts ist ein identifizierbarer DNA-Abschnitt, der innerhalb eines anderen DNA-Moleküls liegt oder daran gebunden ist und nicht natürlicherweise in Verbindung mit dem anderen Molekül gefunden wird. Wenn die heterologe Region ein bakterielles Gen codiert, wird folglich das Gen normalerweise von DNA flankiert sein, die das bakterielle Gen im Genom des Ursprungsbakterium nicht flankiert. Ein weiteres Beispiel für die heterologe codierende Sequenz ist ein Konstrukt, wo die codierende Sequenz selbst nicht in der Natur vorgefunden wird (z.B. synthetische Sequenzen mit anderen Codons wie die native Sequenz). Allelvariationen oder natürlich vorkommende Mutationsereignisse ergeben keine heterologe DNA-Region, wie sie hier verwendet ist.
Der Ausdruck „Behandlung", wie er hier verwendet ist, bezeichnet entweder (i) die Prävention einer Infektion oder Reinfektion (Prophylaxe) oder (ii) die Verringerung oder Eliminierung von Symptomen der Krankheit von Interesse (Therapie).
Wie hier verwendet, bezeichnet eine „biologische Probe" eine Gewebe- oder Flüssigkeitsprobe, die aus einem Tier isoliert ist, einschließlich, aber hierauf nicht beschränkt, zum Beispiel Blut, Plasma, Serum, Faeces, Urin, Knochenmark, Galle, Spinalflüssigkeit, Lymphe, Hautproben, externe Absonderungen der Haut, der Atemwege, des Verdauungstrakts, des Urogenitaltrakts, Tränen, Speichel, Milch, Blutzellen, Organe, Biopsien und ebenfalls Proben von in vitro Zellkulturbestandteilen, einschließlich, aber hierauf nicht beschränkt, konditionierten Medien, die aus dem Zellwachstum und Geweben in Kulturmedium, z.B. rekombinanten Zellen und Zellkomponenten, resultieren.
Wie hier verwendet, bezeichnen die Ausdrücke „Markierung" und „detektierbare Markierung" ein Molekül, das detektiert werden kann, einschließlich, aber hierauf nicht beschränkt, radioaktiver Isotope, Fluoreszierer, chemilumineszenter Moleküle, Enzyme, Enzymsubstrate, Enzym-Cofaktoren, Enzyminhibitoren, Chromophore, Farbstoffe, Metallionen, Metallsole, Liganden (z.B. Biotin oder Haptene) und ähnlicher. Der Ausdruck „Fluoreszierer" bezeichnet eine Substanz oder ein Teil davon, der zur Fluoreszenz in einem detektierbaren Bereich fähig ist. Besondere Beispiele für Markierungen, die in der Erfindung verwendet sein können, umfassen Fluoreszein, Rhodamin, Dansyl, Umbelliferon, Texas red, Luminol, NADPH und α-β-Galactosidase.
B. Allgemeine Verfahren
Im Zentrum der vorliegenden Erfindung steht die Entdeckung von Genen, die zwei H. somnus Transferrin-Bindeproteine codieren, die hier als „Tbp1" beziehungsweise „Tbp2" bezeichnet sind. Insbesondere sind die Gene für H. somnus Transferrin-Bindeprotein 1 („tbp1") und H. somnus Transferrin-Bindeprotein 2 („tbp2") isoliert, sequenziert und charakterisiert worden und die davon abgeleiteten Proteinsequenzen für Tbp1 und Tbp2. Die vollständigen DNA-Sequenzen sind in 1A–1B gezeigt und die Proteinsequenzen für Tbp1 und Tbp2 sind in 3 (SEQ ID NR: 2) beziehungsweise 4 (SEQ ID NR: 3) gezeigt.
Wie in den Beispielen beschrieben, codiert das vollständige tbp1, dargestellt an den Nukleotidpositionen 2891–5803, inklusive, von 1A–1B, das vollständige Tbp1-Potein von ungefähr 971 Aminosäuren, die als Aminosäuren 1–971, inklusive, in 3 (SEQ ID NR: 2) gezeigt sind. Das Protein besitzt ein vorhergesagtes Molekulargewicht von etwa 109.725 kDa. Die vollständige Sequenz umfasst ein Signalpeptid von 28 Aminosäuren, die die Positionen 1 bis 28 von 3 einnehmen. Folglich ist die reife Tbp1-Sequenz von den Aminosäuren 29 bis 971, inklusive, von 3 dargestellt und ist von der an Positionen 2975 bis 5803, inklusive, von 1A–1B dargestellten Nukleotidsequenz codiert. 12 zeigt das Hopp/Woods Antigenitätsprofil von reifem H. somnus Tbp1. 13 stellt das Kyte-Doolittle-Hydropathie-Diagramm (in der Figur unten) und Argos Transmembranhelices (in der Figur oben) von reifem H. somnus Tbp1 dar.
Das vollständige tbp2, an den Nukleotidpositionen 708–2693, inklusive, von 1A–1B dargestellt, codiert das vollständige Tbp2-Potein von ungefähr 662 Aminosäuren, die als Aminosäuren 1–662, inklusive, in 4 (SEQ ID NR: 3) gezeigt sind. Das Protein besitzt ein vorhergesagtes Molekulargewicht von etwa 71.311 kDa. Die vollständige Sequenz umfasst ein Signalpeptid von 19 Aminosäuren, die die Positionen 1 bis 19 von 4 einnehmen. Folglich ist die reife Tbp2-Sequenz mit Aminosäuren 20 bis 662, inklusive, von 4 dargestellt und ist von der an Positionen 765 bis 2683, inklusive, von 1A–1B dargestellten Nukleotidsequenz codiert. 14 zeigt das Hopp/Woods-Antigenitätsprofil von reifem H. somnus Tbp2. 15 stellt das Kyte-Doolittle-Hydropathiediagramm von reifem H. somnus Tbp2 dar. Anders als bei Tbp1 ist keine transmembranbindende Domäne in dem Tbp1-Molekül vorhanden.
Die H. somnus Transferrin-Bindeproteine, immunogene Fragmente davon oder chimäre Proteine, die ein oder mehrere Epitope von Tbp1 und Tbp2 umfassen, können entweder allein oder in Kombination in Spaltvakzinzusammensetzungen bereitgestellt sein, um von H. somnus verursachte bakterielle Infektionen zu behandeln oder zu verhindern, einschließlich, aber hierauf nicht beschränkt, Hämophilose, thromboembolischer Meningoenzephalitis (ITEME), Sepsis, Arthritis und Pneumonie (Corbeil, L.B. (1990) Can. Vet. Res. 54:S57–S62; Harris, F.W. und Janzen, E.D. (1990) Can. Vet. J. 30:816–822; Humphrey, J.D. und Stephens, L.R., (1993) Vet. Bull. 53:987–1004), wie auch Myokarditis, Perikarditis, spontaner Abort, Unfruchtbarkeit und Mastitis.
Zusätzlich zur Verwendung in Vakzinzusammensetzungen können die Proteine und Fragmente davon, Antikörper hierfür, und dafür codierende Gene als diagnostische Reagenzien verwendet sein, um das Vorliegen einer Infektion in einem Säuger nachzuweisen. Ähnlich können die Gene, die Proteine codieren, geklont werden und zur Herstellung von Sonden zum Nachweis und zur Isolierung homologer Gene in anderen Bakterienstämme verwendet sein. Zum Beispiel finden Fragmente, die wenigstens etwa 15–20 Nukleotide, bevorzugter wenigstens etwa 20–50 Nukleotide und am bevorzugtesten wenigstens etwa 60–100 oder mehr Nukleotide umfassen, Verwendung in diesen Anwendungsformen. Die H. somnus Transferrin-Bindeproteine finden ebenfalls bei Reinigung von Transferrinen von H. somnus Spezies und von rekombinanten Wirtszellen, die dieselben exprimieren, Verwendung.
H. somnus Transferrin-Bindeproteine können in Vakzinzusammensetzungen entweder allein oder zusammen mit weiteren bakteriellen, fungalen, viralen, protozoischen Antigenen verwendet sein. Diese Antigene können separat oder sogar als Fusionsproteine bereitgestellt sein, die ein oder mehrere Epitope der Transferrin-Bindeproteine umfassen, die miteinander und/oder an eines oder mehrere der obigen Antigene fusioniert sind. Zum Beispiel können weitere immunogene Proteine von H. somnus in den betreffenden Vakzinen verwendet sein, einschließlich, aber hierauf nicht beschränkt, H. somnus LppA-, LppB- und/oder LppC-Polypeptide, H. somnus Hämin-bindendes Protein und H. somnus Hämolysin. Alle diese H. somnus Proteine sind in der Internationalen Publikation Nr. WO 93/21323, veröffentlicht am 28. Oktober 1993, beschrieben. Zum Beispiel zeigen 11A–11C das H. somnus LppB-Protein (SEQ ID NR: 5) und das hierfür codierende Gen (Positionen 872–1906 von SEQ ID NR: 4). Das H. somnus LppB-Präprotein ist von Nukleotidpositionen 872 bis 1906 (Aminosäurereste 1 bis 345) codiert und das reife Protein ist von Nukleotidpositionen 920 bis 1906 (Aminosäurereste 17 bis 345) codiert. Das gesamte LppB-Protein oder Fragmente, die immunogene Polypeptide des Proteins umfassen, können bei Vakzinzusammensetzungen zusammen entweder mit einem oder beiden H. somnus Transferrin-Bindeproteinen verwendet sein.
Herstellung von Transferrin-Bindeproteinen
Die oben beschriebenen Transferrin-Bindeproteine und aktive Fragmente, Analoga und chimäre Proteine, die von denselben abstammen, können mit einer Reihe an Verfahren hergestellt sein. Speziell können Transferrin-Bindeproteine direkt aus Bakterien isoliert sein, die das Protein exprimieren. Die Proteine können direkt von H. somnus aus Präparaten der Außenmembran unter Anwendung von Reinigungsstandardtechniken isoliert sein. Siehe z.B. Theisen und Potter (1992) Infect. Immun. 60:826–831. Die erwünschten Proteine können dann noch weiter aufgereinigt sein, z.B. mit Hilfe von Säulenchromatographie, HPLC, Immunadsorptionsverfahren oder anderen herkömmlichen in der Technik gut bekannten Verfahren.
Alternativ können die Proteine rekombinant hergestellt sein, wie es hier beschrieben ist. Wie oben dargelegt, können diese rekombinanten Produkte die Form partieller Proteinsequenzen, vollständiger Sequenzen, Signalsequenzen umfassende Vorläuferformen, reife Formen ohne Signale oder sogar Fusionsproteine einnehmen (z.B. mit einem geeigneten Leader für den rekombinanten Wirt oder mit einer weiteren Untereinheit der Antigensequenz für H. somnus oder einem anderen Pathogen).
Die tbp-Gene der vorliegenden Erfindung können, basierend auf der Fähigkeit der Proteinprodukte, Transferrin zu binden, unter Verwendung von Transferrin-Bindungsassays isoliert sein, wie es unten beschrieben ist. Folglich können Genbibliotheken konstruiert werden und die resultierenden Klone werden zur Transformierung einer geeigneter Wirtszelle eingesetzt. Kolonien können vereint und auf Klone mit Transferrin-bindender Aktivität durchmustert werden. Kolonien können auch unter Verwendung eines polyklonalen Serums oder monoklonaler Antikörper auf das Transferrin-Bindeprotein durchmustert werden.
Alternativ können, sobald die Aminosäuresequenzen bestimmt sind, Oligonukleotidsonden, die die Codons für einen Teil der bestimmten Aminosäuresequnenzen enthalten, hergestellt werden und für eine Durchmusterung genomischer oder cDNA-Bibliotheken auf Gene, die die betreffenden Proteine codieren, verwendet sein. Die grundlegenden Strategien für die Herstellung von Oligonukleotidsonden und DNA-Bibliotheken wie auch ihre Durchmusterung mittels Nukleinsäurehybridisierung sind dem Fachmann gut bekannt. Siehe z.B. DNA Cloning: Vol. I, supra; Nucleic Acid Hybridization, supra; Oligonucleotide Synthesis, supra; Sambrook et al., supra. Sobald ein Klon von der durchmusterten Bibliothek mit einer positiven Hybridisierung identifiziert worden ist, kann durch eine Restriktionsenzymanalyse und DNA-Sequenzierung bestätigt werden, dass das bestimmte Bibliothekinsert ein Gen für ein Transferrin-Bindeprotein oder ein Homolog davon enthält. Die Gene können dann unter Anwendung von Standardtechniken weiter isoliert werden und, falls erwünscht, PCR-Ansätze oder Restriktionsenzyme für eine Deletion der vollständigen Sequenz eingesetzt werden.
Ähnlicherweise können Gene aus Bakterien unter Anwendung bekannter Techniken, wie Phenolextraktion, direkt isoliert und die Sequenz weiter manipuliert werden, um jede erwünschte Änderung zu ergeben. Siehe z.B. Sambrook et al., supra für eine Beschreibung der zur Gewinnung und Isolierung von DNA eingesetzten Techniken.
Alternativ können DNA-Sequenzen, die die Proteine von Interesse codieren, eher synthetisch als kloniert hergestellt sein. Die DNA-Sequenzen können mit den geeigneten Codons für die bestimmte Aminosäuresequenz gestaltet sein. Im Allgemeinen wird man bevorzugte Codons für den erwünschten Wirt auswählen, falls die Sequenz zur Expression verwendet wird. Die vollständige Sequenz wird aus überlappenden Oligonukleotiden zusammengefügt, die mit Standardverfahren präpariert sind und zu einer vollständigen codierenden Sequenz zusammengefügt werden. Siehe z.B. Edge (1981) Nature 292:756; Nambair et al. (1984) Science 223:1299; Jay et al. (1984) J. Biol. Chem. 29:6311.
Sobald die codierenden Sequenzen für die erwünschten Proteine präpariert oder isoliert worden sind, können sie in jeden geeigneten Vektor oder Replikon kloniert werden. Zahlreiche Klonierungsvektoren sind dem Fachmann bekannt und die Auswahl eines geeigneten Klonierungsvektors ist ein Gegenstand der Wahl. Beispiele für rekombinante DNA-Vektoren zur Klonierung und Wirtszellen, die sie transformieren können, umfassen den Bakteriophagen λ (E. coli), pBR322 (E. coli), pACYC177 (E. coli), pKT230 (Gram-negative Bakterien), pGV1106 (Gram-negative Bakterien), pLAFR1 (Gram-negative Bakterien), pME290 (nicht-E. coli Gram-negative Bakterien), pHV14 (E. coli und Bacillus subtilis), pBD9 (Bacillus), pIJ61 (Streptomyces), pUC6 (Streptomyces), YIp5 (Saccharomyces), YCp19 (Saccharomyces) und bovines Papillomavirus (Säugerzellen). Siehe Sambrook et al., supra; DNA Cloning, supra; B. Perbal, supra.
Das Gen kann unter der Kontrolle eines Promotors, eine Ribosombindungsstelle (für eine bakterielle Expression) und, gegebenenfalls, einen Operator (gemeinsam hier als „Kontroll"-Elemente bezeichnet) so dass die das erwünschte Protein codierende DNA-Sequenz in RNA in der Wirtszelle transkribiert wird, die von einem dieses Expressionskonstrukt enthaltenden Vektor transformiert ist. Die codierende Sequenz kann ein Signalpeptid oder Leadersequenz enthalten oder auch nicht. Falls eine Signalsequenz enthalten ist, kann sie entweder eine native, homologe oder heterologe Sequenz sein. Zum Beispiel kann die Signalsequenz für das bestimmte H. somnus Transferrin-Bindeprotein für dessen Sekretion verwendet sein, wie es auch mehrere andere in der Technik bekannte Signalsequenzen sein können. Leadersequenzen können von dem Wirt bei einer posttranslationalen Verarbeitung entfernt werden. Siehe z.B. U.S. Patente Nr. 4.431.739; 4.425.437; 4.338.397.
Weitere regulatorische Sequenzen können ebenfalls erwünscht sein, die eine Regulation der Expression der Proteinsequenzen abhängig vom Wachstum der Wirtszelle erlauben. Regulatorische Sequenzen sind dem Fachmann bekannt und Beispiele umfassen diejenigen, die die Expression eines Gens, das als Reaktion auf einen chemischen oder physikalischen Stimulus, einschließlich der Anwesenheit einer regulatorischen Verbindung, ein- oder ausgeschaltet werden soll. Weitere Arten regulatorischer Elemente können ebenfalls in einem Vektor vorliegen, zum Beispiel Enhancer-Sequenzen.
Die Kontrollsequenzen und weitere regulatorische Sequenzen können an die codierende Sequenz vor der Insertion in einen Vektor, wie bei den oben beschriebenen Klonierungsvektoren, ligiert werden. Alternativ können die codierenden Sequenzen direkt in einen Expressionsvektor kloniert werden, der bereits die Kontrollsequenzen und eine geeignete Restriktionsstelle enthält.
In einigen Fällen kann es erforderlich sein, die codierende Sequenz zu modifizieren, so dass sie an die Kontrollsequenz in der geeigneten Orientierung gebunden werden kann, d.h. um dem korrekten Leserahmen zu erhalten. Es kann ebenfalls erwünscht sein, Mutanten oder Analoga des Transferrin-Bindeproteins herzustellen. Mutanten oder Analoga können durch die Deletion eines Teils der das Protein codierenden Sequenz, durch Insertion einer Sequenz und/oder durch Substitution eines oder mehrerer Nukleotide innerhalb der Sequenz hergestellt, sein. Techniken zur Modifizierung von Nukleotidsequenzen, wie ortsgerichtete Mutagense, sind z.B. in Sambrook et al., supra; DNA Cloning, supra; Nucleic Acid Hybridization, supra; beschrieben.
Der Expressionsvektor wird dann verwendet, um eine geeignete Wirtszelle zu transformieren. Mehrere Säugerzelllinien sind in der Technik bekannt und umfassen immortalisierte Zelllinien, die von der American Type Culture Collection (ATCC) erhältlich sind, wie, aber hierauf nicht beschränkt, Chinesische Hamster Ovarien-(CHO)-Zellen, HeLa-Zellen, Baby-Hamster-Nieren-(BHK)-Zellen, Affennierenzellen (COS), humane hepatozelluläre Carcinomzellen (z.B. Hep G2), Madin-Darby-Rindernieren-(„MDBK")-Zellen wie auch andere. Ähnlich finden bakterielle Wirte, wie E. coli, Bacillus subtilis und Streptococcus spp., mit den vorliegenden Expressionskonstrukten Verwendung. In der vorliegenden Erfindung zweckdienliche Hefe-Wirte umfassen, inter alia, Saccharomyces cerevisiae, Candida albicans, Candida maltosa, Hansenula polymorpha, Kluyveromyces fragilis, Kluyveromyces lactis, Pichia guillerimondii, Pichia pastoris, Schizosaccharomyces pombe und Yarrowia lipolytica.
Insektenzellen für die Verwendung mit Baculovirus Expressionsvektoren umfassen, inter alia, Aedes aegypti, Autographa californica, Bombyx mori, Drosophila melanogaster, Spodoptera frugiperda und Trichoplusia ni.
Abhängig vom Expressionssystem und dem ausgewählten Wirt sind die Proteine der vorliegenden Erfindung durch Kultivierung der mit einem oben beschriebenen Expressionsvektor transformierten Wirtszellen unter Bedingungen hergestellt, wodurch das Protein von Interesse exprimiert wird. Das Protein wird dann aus den Wirtszellen isoliert und gereinigt. Falls das Expressionssystem das Protein in die Wachstumsmedien sezerniert, kann das Protein direkt aus den Medien gereinigt werden. Falls das Protein nicht sezerniert wird, wird es aus den Zelllysaten isoliert. Die Auswahl der geeigneten Wachstumsbedingungen und Wiedergewinnungsverfahren liegen im Rahmen der Fachkenntnisse.
Die Proteine der vorliegenden Erfindung können ebenfalls mittels chemischer Synthese wie Festphasen-Peptidsynthese unter Verwendung bekannter Aminosäuresequenzen oder Aminosäuresequenzen, die von der DNA-Sequenz der Gene von Interesse abgeleitet sind, hergestellt sein. Derartige Verfahren sind dem Fachmann bekannt. Siehe z.B. J.M. Stewart und J.D. Young, Solid Phase Peptide Synthesis 2. Ed., Pierce Chemical Co., Rockford, IL (1984) und G. Barany und R.B. Merrifield, The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology, Herausgeber E. Gross und J. Meienhofer, Vol. 2, Academic Press, New York, (1980), Seiten 3–254, für Festphasen-Synthesetechniken; und M. Bodansky, Principles of Peptide Synthesis, Springer-Verlag, Berlin (1984) und E. Gross und J. Meienhofer, Herausgeber, The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology, supra, Vol. I für klassische Synthese in Lösung. Die chemische Synthese von Peptiden kann bevorzugt sein, falls ein kleines Fragment des fraglichen Antigens in der Lage ist, eine immunologische Antwort in einem Tier von Interesse hervorzurufen.
Die Transferrin-Bindeproteine der vorliegenden Erfindung oder ihre Fragmente können zur Herstellung von sowohl polyklonalen als auch monoklonalen Antikörpern, verwendet sein. Falls polyklonale Antikörper erwünscht sind, wird ein ausgewähltes Tier (z.B. Maus, Kaninchen, Ziege, Pferd, etc.) mit einem Antigen der vorliegenden Erfindung oder dessen Fragment oder einem mutierten Antigen immunisiert. Das Serum von dem immunisierten Tier wird gesammelt und nach bekannten Verfahren behandelt. Siehe z.B. Jurgens et al. (1985) J. Chrom. 348:363–370. Falls polyklonale Antikörper enthaltendes Serum verwendet ist, können die polyklonalen Antikörper mittels Immunaffinitätschromatographie unter Anwendung bekannter Verfahren gereinigt werden.
Monoklonale Antikörper für die Transferrin-Bindeproteine und für Fragmente davon können ebenfalls ohne weiteres vom Fachmann hergestellt sein. Die allgemeine Methodologie zur Herstellung monoklonaler Antikörper unter Anwendung der Hybridom-Technologie ist gut bekannt. Immortale Antikörper-produzierende Zelllinien können durch eine Zellfusion und auch mit anderen Techniken, wie direkte Transformation von B-Lymphocyten mit onkogener DNA oder Transfektion mit Epstein-Barr-Virus, hergestellt sein. Siehe z.B. M. Schreier et al., Hybridoma Techniques (1980); Hammerling et al., Monoclonal Antibodies and T-cell Hybridomas (1981); Kenett et al., Monoclonal Antibodies (1980); siehe ebenfalls U.S. Patente Nr. 4.341.761; 4.399.121; 4.427.783; 4.444.887; 4.452.570; 4.466.917; 4.472.500; 4.491.632 und 4.493.890. Panels monoklonaler Antikörper, die gegen die Transferrin-Bindeproteine oder Fragmente davon hergestellt sind, können auf verschiedene Eigenschaften, d.h. auf Isotyp, Epitop, Affinität, etc. durchmustert werden. Monoklonale Antikörper sind für die Reinigung von den einzelnen Antigenen, gegen die sie gerichtet sind, unter Anwendung von Immunaffinitätstechniken zweckdienlich. Sowohl polyklonale als auch monoklonale Antikörper können ebenfalls für eine passive Immunisierung oder können gemeinsam mit Spaltvakzinzusammensetzungen eingesetzt sein, um die Immunantwort zu verstärken. Polyklonale und monoklonale Antikörper sind auch für diagnostische Zwecke einsetzbar.
Vakzinformulierungen und Verabreichung
Die Transferrin-Bindeproteine der vorliegenden Erfindung können in Vakzinzusammensetzungen entweder allein oder gemeinsam und/oder mit weiteren Antigenen für eine Verwendung bei der Immunisierung von Tieren formuliert sein, wie es unten beschrieben ist. Verfahren zur Zubereitung derartiger Formulierungen sind z.B. in Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania, 18 Edition, 1990, beschrieben. Typischerweise sind die Vakzine der vorliegenden Erfindung entweder als flüssige Lösungen oder Suspensionen injizierbar zubereitet. Es können auch feste Formen, die für eine Lösung oder Suspension in flüssigen Vehikeln geeignet sind, vor einer Injektion zubereitet sein. Das Präparat kann ebenfalls emulgiert sein oder der aktive Bestandteil kann in Liposomen-Vehikeln verpackt sein. Der aktive immunogene Bestandteil ist im Allgemeinen mit einem verträglichen pharmazeutischen Vehikel, wie zum Beispiel Wasser, Saline, Dextrose, Glycerin, Ethanol oder ähnlichen und Kombinationen davon, gemischt. Zusätzlich kann, falls es erwünscht ist, das Vehikel kleinere Mengen an Hilfsstoffen, wie Befeuchtungsmittel oder Emulgatoren, und pH-Puffermittel enthalten.
Adjuvantien, die die Wirksamkeit des Vakzins verstärken, können ebenfalls zu der Formulierung gegeben sein. Adjuvantien können zum Beispiel Muramyldipeptide, Avridin, Aluminiumhydroxid, Dimethyldioctadecylammoniumbromid (DDA), Öle, Öl-in-Wasser-Emulsionen, Saponine, Cytokine und andere in der Technik bekannte Substanzen umfassen.
Die Transferrin-Bindeproteine können an einen Träger gebunden sein, um deren Immunogenität zu erhöhen. Geeignete Träger umfassen große, langsam metabolisierte Makromoleküle, wie Proteine, einschließlich Serumalbumine, Keyhole-Limpet-Hämocyanin, Immunoglobulin-Moleküle, Thyroglobulin, Ovalbumin und andere dem Fachmann gut bekannte Proteine; Polysaccharide, wie Sepharose, Agarose, Cellulose, Cellulose-Kügelchen und ähnliche; polymere Aminosäuren, wie Polyglutaminsäure, Polylysin und ähnliche; Aminosäure-Copolymere; und inaktive Viruspartikel.
Die Transferrin-Bindeproteine können in ihrer nativen Form verwendet sein oder ihr Gehalt an funktionellen Gruppen kann modifiziert sein, zum Beispiel durch Succinylierung von Lysinresten oder Reaktion mit Cys-Thiolacton. Eine Sulihydrylgruppe kann ebenfalls in den Träger (oder Antigen) zum Beispiel durch Reaktion von Amino-Funktionen mit 2-Iminothiolan oder dem N-Hydroxysuccinimidester von 3-(4-Dithiopyridyl)propionat eingebaut sein. Geeignete Träger können ebenfalls modifiziert sein, um Seitenketten (wie Hexamethylendiamin oder andere bifunktionelle Moleküle ähnlicher Größe) für ein Anheften der Peptide einzubauen.
Andere geeignete Träger für Transferrin-Bindeproteine der vorliegenden Erfindung umfassen VP6-Polypeptide von Rotaviren oder funktionelle Fragmente davon, wie in U.S. Patent Nr. 5.071.651 offen gelegt. Ebenfalls ist ein Fusionsprodukt aus einem viralen Protein und den betreffenden Immunogenen zweckdienlich, das mit den in U.S. Patent Nr. 4.722.840 offen gelegten Verfahren hergestellt ist. Noch andere geeignete Träger umfassen Zellen, wie Lymphocyten, da eine Präsentierung in dieser Form die natürliche Art der Präsentierung in dem Tier nachahmt, die den immunisierten Zustand hervorruft. Alternativ können die Proteine der vorliegenden Erfindung an Erythrocyten, vorzugsweise an die eigenen Erythrocyten des Tiers, gekoppelt sein. Verfahren zur Kopplung von Peptiden an Proteine oder Zellen sind dem Fachmann bekannt.
Außerdem können die Transferrin-Bindeproteine (oder Komplexe davon) in Vakzinzusammensetzungen entweder in neutraler Form oder Salzform formuliert sein. Pharmazeutisch verträgliche Salze umfassen die Säureadditionssalze (mit den freien Aminogruppen der aktiven Polypeptide gebildet) und die mit anorganischen Säuren, wie zum Beispiel Salz- oder Phosphorsäure, oder mit organischen Säuren wie Essig-, Oxal-, Wein-, Mandelsäure gebildet sind. Salze, die von freien Carboxylgruppen gebildet sind, können ebenfalls von anorganischen Basen, wie zum Beispiel Natrium-, Kalium-, Ammonium-, Calcium-, oder Eisenhydroxyden, und derartigen organischen Basen, wie Isopropylamin, Trimethylamin, 2-Ethylaminoethanol, Histidin, Procain und ähnlichen, derivatisiert sein.
Vakzinformulierungen enthalten eine „therapeutisch wirksame Menge" des aktiven Bestandteils, das heißt, eine Menge, die in der Lage ist, eine Immunantwort in einem Tier hervorzurufen, dem die Zusammensetzung verabreicht ist. Bei der Behandlung und Prävention einer H. somnus Infektion wäre zum Beispiel eine „therapeutisch wirksame Menge" vorzugsweise eine Menge, die den Widerstand des fraglichen Säugers gegen eine neue Infektion verstärkt und/oder die klinische Schwere der Krankheit vermindert. Ein derartiger Schutz wird entweder durch eine Verminderung oder Fehlen von Symptomen, die normalerweise von einem infizierten Wirt gezeigt werden, und/oder durch eine schnellere Rekonvaleszenz demonstriert.
Die genaue Menge kann ohne weiteres vom Fachmann mit Hilfe von Standardtests bestimmt sein. Die Konzentration an Transferrin-Bindeproteinen liegt typischerweise im Bereich von etwa 1% bis etwa 95% (w/w) der Zusammensetzung, oder auch höher oder niedriger, falls es zweckmäßig ist. Bei den vorliegenden Vakzinformulierungen sollten 5 bis 500 μg aktiver Bestandteil pro ml injizierter Lösung, bevorzugt 10 bis 100 μg aktiver Bestandteil pro ml, hinreichend sein, um eine immunologische Antwort hervorzurufen, wenn eine Dosis von 1 bis 3 ml pro Tier verabreicht ist.
Zur Immunisierung eines Tiers wird das Vakzin im Allgemeinen parenteral, normalerweise als eine intramuskuläre Injektion, verabreicht. Andere Verabreichungsarten, wie eine subkutane, intraperitoneale und intravenöse Injektion, sind allerdings ebenfalls möglich. Die zu verabreichende Menge hängt vom zu behandelnden Tier, der Fähigkeit des tierischen Immunsystems, Antikörper zu synthetisieren, und dem Ausmaß an erwünschtem Schutz ab. Wirksame Dosierungen können ohne weiteres vom Fachmann mit Hilfe von Routinetests, mit denen Dosis-Antwort-Kurven erstellt werden, ermittelt sein. Das Tier wird durch Verabreichung des Vakzins in wenigstens einer Dosis, und vorzugsweise in zwei Dosen, immunisiert. Darüber hinaus können dem Tier so viele Dosen verabreicht werden, wie es für die Aufrechterhaltung eines immunen Zustands gegen eine Infektion erforderlich ist.
Weitere Vakzinformulierungen, die für andere Verabreichungsarten geeignet sind, umfassen Suppositorien und, in manchen Fällen, aerosole, intranasale, orale Formulierungen und Depot-Formulierungen. Bei Suppositorien enthält die Vehikelzusammensetzung herkömmliche Bindemittel und Träger, wie polyalkalische Glycole oder Triglyceride. Derartige Suppositorien können aus Gemischen geformt sein, die den aktiven Bestandteil in einem Bereich zwischen etwa 0,5% bis etwa 10% (w/w), vorzugsweise etwa 1% bis etwa 2%, enthalten. Orale Vehikel umfassen solche üblicherweise verwendeten Vehikel wie zum Beispiel Mannit, Lactose, Stärke, Magnesium, Stearat, Natriumsaccharincellulose, Magnesiumcarbonat und ähnliches in pharmazeutischer Qualität. Diese oralen Vakzinzusammensetzungen können in Form von Lösungen, Suspensionen, Tabletten, Pillen, Kapseln, Depot-Formulierungen oder Pulvern eingenommen werden und enthalten etwa 10% bis etwa 95% des aktiven Bestandteils, vorzugsweise etwa 25% bis etwa 70%.
Intranasale Formulierungen enthalten normalerweise Vehikel, die weder die nasale Schleimhaut reizen noch die Zilienfunktion signifikant stören. Verdünnungsmittel, wie Wasser, wässrige Saline oder andere bekannte Substanzen, können mit der betreffenden Erfindung eingesetzt sein. Die nasalen Formulierungen können ebenfalls Konservierungsmittel, wie, aber hierauf nicht beschränkt, Chlorbutanol und Benzalkoniumchlorid, enthalten. Eine oberflächenaktive Substanz kann für eine Verbesserung der Adsorption der betreffenden Proteine durch die nasale Schleimhaut vorhanden sein.
Formulierungen für eine kontrollierte Freisetzung oder Depot-Formulierungen können durch Einbau des Proteins in Träger oder Vehikel, wie Liposomen, nichtresorbierbare impermeable Polymere, wie Ethylenvinylacetat-Copolymere und Hytrel^® Copolymere, quellbare Polymere, wie Hydrogele, oder resorbierbare Polymere, wie Kollagen und bestimmte Polysäuren oder Polyester, wie diejenigen, die zur Herstellung resorbierbarer Strukturen verwendet sind, hergestellt sein. Die Transferrin-Bindeproteine können ebenfalls mit Hilfe in der Technik bekannter implantierter Minipumpen bereitgestellt sein.
Die Transferrin-Bindeproteine der vorliegenden Erfindung können ebenfalls über einen Trägervirus, der dieselben exprimiert, verabreicht sein. Trägerviren, die mit der vorliegenden Erfindung Verwendung finden, umfassen, sind aber hierauf nicht beschränkt, Vaccinia und andere Pockenviren, Adenovirus und Herpesvirus. Beispielsweise können rekombinante Vaccinia-Viren, die die neuartigen Proteine exprimieren, folgendermaßen konstruiert werden. Die DNA, die das bestimmte Protein codiert, wird zuerst in einen geeigneten Vektor inseriert, so dass sie an einen Vaccinia-Promotor und flankierenden Vaccinia-DNA-Sequenzen, wie die Thymidinkinase (TK) codierende Sequenz, angrenzt. Dieser Vektor wird dann zur Transfektion von Zellen verwendet, die gleichzeitig mit Vaccinia infiziert sind. Eine homologe Rekombinationen dient dazu, den Vaccinia-Promotor plus das Gen, das das betreffende Protein codiert, in das virale Genom einzufügen. Die resultierende TK-Rekombinante kann dann durch Kultivieren der Zellen in Gegenwart von 5-Bromdesoxyuridin und Picken der dafür resistenten viralen Plaques selektiert werden.
Ein alternativer Verabreichungsweg umfasst eine Gentherapie oder Nukleinsäure-Immunisierung. Folglich können Nukleotidsequenzen (und begleitende regulatorische Elemente), die die betreffenden Transferrin-Bindeproteine codieren, direkt an ein Tier für eine in vivo Translation dieser Nukleotidsequenzen verabreicht sein. Alternativ kann ein Gentransfer durch Transfizieren der Zellen oder Gewebe des Tiers ex vivo und wiedereinführen des transformierten Materials in den Wirt durchgeführt sein. DNA kann direkt in den Wirtsorganismus eingeführt sein, d.h. durch Injektion (siehe U.S. Patent, Nr. 5.580.859 und 5.589.466; Internationale Publikation Nr, WO 90/11092; und Wolff et al. (1990) Science 247:1465–1468). Liposomen-vermittelter Gentransfer kann ebenfalls unter Anwendung bekannter Verfahren durchgeführt sein. Siehe z.B. U.S. Patent Nr. 5.703.055; Hazinski et al. (1991) Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 4:206–209; Brigham et al. (1989) Am. J. Med. Sci. 298:278–281; Canonico et al. (1991) Clin. Res. 39:219 und Nabel et al. (1990) Science 249:1285–1288. Zielende Agentien, wie Antikörper, die gegen auf spezifischen Zelltypen exprimierte Oberflächenantigene gerichtet sind, können an die Liposomenoberfläche kovalent konjugiert sein, so dass die Nukleinsäure zu spezifischen Geweben und Zellen überbracht sein können, die für eine Infektion empfindlich sind.
Diagnostische Assays
Wie oben erklärt, können die Transferrin-Bindeproteine der vorliegenden Erfindung ebenfalls als Diagnostika verwendet sein, um das Vorhandensein reaktiver Antikörper gegen H. somnus in einer biologischen Probe nachzuweisen und somit das Vorliegen einer H. somnus Infektion zu bestimmen. Zum Beispiel kann das Vorhandensein von Antikörpern, die mit Transferrin-Bindeproteinen reaktieren, unter Anwendung elektrophoretischer und immunodiagnostischer Standardtechniken, einschließlich Immunoassays, wie Kompetitions-, Direktreaktions- oder Sandwichassays, nachgewiesen werden. Derartige Assays umfassen, sind aber hierauf nicht beschränkt, Western-Blots, Agglutinationstests, Enzym-markierte und Enzym-vermittelte Tests, wie ELISA, Assays des Typs Biotin/Avidin, Radioimmunoassays, Immunelektrophorese, Immunpräzipitation, etc. Die Reaktionen umfassen im Allgemeinen anzeigende Markierungen, wie fluoreszierende, chemilumineszierende, radioaktive, enzymatische Markierungen oder Farbstoffmoleküle oder andere Verfahren zum Nachweis eines Komplexes zwischen dem Antigen und dem Antikörper oder damit reagierten Antikörpern.
Die zuvor erwähnten Assays umfassen im Allgemeinen die Abtrennung ungebundener Antikörper in einer Flüssigphase von einem Festphasenträger, an dem die Antigen-Antikörper-Komplexe gebunden sind. Feste Träger, die bei der praktischen Umsetzung der Erfindung verwendet sein können, umfassen Substrate, wie Nitrocellulose (z.B. als Membran oder Mikrotiterplatte), Polyvinylchlorid (z.B. Folien oder Mikrotiterplattenvertiefungen), Polystyrol- Latex (z.B. Kügelchen oder Mikrotiterplatten), Polyvinylfluorid, diazotiertes Papier, Nylonmembranen, aktivierte Kügelchen, magnetisierbare Kügelchen und ähnliches.
Typischerweise wird ein fester Träger zuerst mit einer Festphasenkomponente (z.B. ein oder mehrer Transferrin-Bindeproteine) unter für ein Binden geeigneten Bedingungen reagieren gelassen, so dass die Komponente an dem Träger hinreichend immobilisiert wird. Manchmal kann die Immobilisierung des Antigens an dem Träger durch eine erste Kopplung des Antigens an ein Protein mit besseren Bindungseigenschaften verbessert werden. Geeignete Kopplungsproteine umfassen, sind aber hierauf nicht beschränkt, Makromoleküle wie Serumalbumine, einschließlich bovines Serumalbumin (BSA), Keyhole-Limpet-Hämocyanin, Immunoglobulin-Moleküle, Thyroglobulin, Ovalbumin und andere dem Fachmann gut bekannte Proteine. Andere Moleküle; die zum Binden der Antigene an den Träger verwendet sein können, umfassen Polysaccharide, Polymilchsäuren, Polyglycolsäuren, polymere Aminosäuren, Aminosäure-Copolymere und ähnliche. Derartige Moleküle und Verfahren zur Kopplung dieser Moleküle an die Antigene sind dem Fachmann gut bekannt. Siehe z.B. Brinkley, M.A. Bioconjugate Chem. (1992) 3:2–13; Hashida et al., J. Appl. Biochem. (1984) 6:56–63 und Anjaneyulu und Staros, International J. of Peptide and Protein Res. (1987) 30:117–124.
Nach Reaktion des festen Trägers mit der Festphasenkomponente werden sämtliche nicht-immobilisierten Festphasenkomponenten von dem Träger durch Waschen entfernt und die Träger-gebundene Komponente wird dann unter geeigneten Bindungsbedingungen mit einer biologischen Probe in Kontakt gebracht, die mutmaßlich Ligandenkomponenten (z.B. Antikörper gegen die immobilisierten Antigene) enthält. Nach Waschen, um sämtliche nicht-gebundenen Liganden zu entfernen, wird eine zweite bindende Komponente unter geeigneten Bindungsbedingungen zugegeben, wobei die zweite bindende Komponente in der Lage ist, selektiv mit dem gebundenen Liganden zu binden. Das Vorhandensein der zweiten bindenden Komponente kann dann unter Anwendung in der Technik bekannter Verfahren nachgewiesen werden.
Insbesondere kann ein ELISA-Verfahren angewandt sein, worin die Vertiefungen einer Mikrotiterplatte mit einem Transferrin-Bindeprotein beschichtet sind. Eine biologische Probe, die anti-Transferrin-Bindeprotein-Immunoglobulin-Moleküle enthält oder mutmaßlich enthält, wird dann zu den beschichteten Vertiefungen gegeben. Nach einer hinreichenden Inkubationszeit, um ein Binden von Antikörpern an das immobilisierte Antigen zu erlauben, wird/werden die Platte(n) gewaschen, um nicht-gebundene Komponenten zu entfernen, und ein detektierbar markiertes zweites bindendes Molekül wird zugegeben. Das zweite bindende Molekül kann mit jedem beliebigen eingefangenen Probenantikörper reagieren, die Platte wird gewaschen und das Vorhandensein des zweiten bindenden Moleküls wird unter Anwendung in der Technik gut bekannter Verfahren nachgewiesen.
Folglich kann in einer besonderen Anwendungsform der vorliegenden Erfindung das Vorhandensein gebundener anti-Transferrin-bindender Antigenliganden von einer biologischen Probe unter Verwendung einer zweiten bindenden Komponente, die einen gegen die Antikörper-Liganden gerichteten Antikörper umfasst, einfach nachgewiesen werden. Mehrere anti-bovine Immunoglobulin-(Ig)-Moleküle sind in der Technik bekannt, die ohne weiteres an eine detektierbare Enzymmarkierung, wie Meerrettich-Peroxidase, alkalische Phosphatase oder Urease, unter Anwendung dem Fachmann bekannter Verfahren konjugiert werden können. Ein geeignetes Enzymsubstrat wird dann verwendet, um ein detektierbares Signal zu erzeugen. In anderen verwandten Anwendungsformen können kompetitive ELISA-Verfahren unter Anwendung dem Fachmann bekannter Verfahren durchgeführt sein.
Assays können auch in Lösung durchgeführt sein, so dass die Transferrin-Bindeproteine und für diese Proteine spezifische Antikörper Komplexe unter Präzipitierungsbedingungen bilden. In einer besonderen Anwendungsform können Transferrin-Bindeproteine an einem Festphasenpartikel (z.B. ein Agarose-Kügelchen oder ähnliches) unter Anwendung in der Technik bekannter Kopplungsverfahren, wie durch direkte chemische oder indirekte Kopplung, gebunden sein. Das Antigen-beschichtete Partikel wird dann unter geeigneten Bindungsbedingungen mit einer biologischen Probe in Kontakt gebracht, die mutmaßlich Antikörper für die Transferrin-Bindeproteine enthält. Eine Vernetzung zwischen gebundenen Antikörpern verursacht die Bildung von Partikel-Antigen-Antikörper Komplexaggregaten, die mittels Waschen und/oder Zentrifugation aus der Probe gefällt und abgetrennt werden können. Die Reaktionsmischung kann dann analysiert werden, um die Anwesenheit oder Abwesenheit von Antikörper-Antigen-Komplexen unter Anwendung einer beliebigen Anzahl an Standardverfahren, wie die oben beschriebenen immunodiagnostischen Verfahren, zu bestimmen.
In einer noch weiteren Anwendungsform kann eine Immunaffinitätsmatrix bereitgestellt sein, worin eine polyklonale Population an Antikörpern von einer biologischen Probe, die mutmaßlich anti-Transferrin-Bindemoleküle enthält, auf einem Substrat immobilisiert ist. In dieser Hinsicht kann eine erste Affinitätsreinigung der Probe unter Verwendung immobilisierter Antigene durchgeführt werden. Das resultierende Probenpräparat wird folglich nur anti-H. somnus Komponenten enthalten, was mögliche unspezifische bindende Eigenschaften in dem Affinitätsträger vermeidet. Mehrere Verfahren zur Immobilisierung von Immunoglobulinen (entweder intakt oder in spezifischen Fragmenten) mit einer hohen Ausbeute und einer guten Beibehaltung einer Antigen-bindenden Aktivität sind in der Technik bekannt. Ohne Einschränkung durch ein beliebiges Verfahren können immobilisiertes Protein A oder Protein G zur Immobilisierung von Immunoglobulinen verwendet sein.
Demgemäß werden, sobald die Immunoglobulin-Moleküle immobilisiert worden sind, um eine Immunaffinitätsmatrix bereitzustellen, markierte Transferrin-Bindeproteine mit den gebundenen Antikörpern unter geeigneten Bindungsbedingungen in Kontakt gebracht. Nachdem jedes unspezifisch gebundenes Antigen von dem Immunaffinitätsträger gewaschen worden ist, kann das Vorhandensein von gebundenem Antigen durch Testen auf die Markierung unter Anwendung in der Technik bekannten Verfahren bestimmt werden.
Zusätzlich können eher die gegen Transferrin-Bindeproteine gezüchteten Antikörper als die Transferrin-Bindeproteine selbst in den oben beschriebenen Assays verwendet sein, um das Vorhandensein von Antikörpern gegen die Proteine in einer gegebenen Probe nachzuweisen. Diese Assays sind im Wesentlichen, wie es oben beschrieben ist, durchgeführt und dem Fachmann bekannt.
Die oben beschriebenen Assay-Reagenzien, einschließlich Transferrin-Bindeproteine oder Antikörper hierfür, können in Kits mit geeigneten Anleitungen und weiteren erforderlichen Reagenzien bereitgestellt sein, um Immunoassays wie oben beschrieben durchzuführen. Der Kit kann ebenfalls, in Abhängigkeit des bestimmten angewandten Immunoassays, geeignete Markierungen und weitere abgepackte Reagenzien und Materialien (d.h. Waschpuffer und ähnliches) enthalten. Standardimmunoassays, wie die oben beschriebenen, können unter Verwendung dieser Kits durchgeführt werden.
Unten folgen Beispiele für spezifische Anwendungsformen für die Durchführung der vorliegenden Erfindung. Diese Beispiele dienen nur zur Veranschaulichung und sollen den Rahmen der vorliegenden Erfindung in keiner Weise einschränken.
C. Versuche
Beispiel 1
Isolierung und Klonierung von H. somnus tbp1 und tbp2
Material und Methoden
Bakterienstämme, Plasmide und Wachstumsbedingungen.
E. coli DH5αF'IQ[Φ80lacZΔM15 endA1 recA1 hsdR17 (r_K ^–m_K ⁺) supE44 thi-1λ^– gyrA96 relA1 Δ(lacZYA-argF)U169/F' lacl^q proAB⁺ lacZΔM15 zzf:: Tn5 (Km^r)] (im Handel erhältlich z.B. von Stratagene) und JM105 (Sambrook, Fritsch & Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Vols I, II und III zweite Ausgabe (1989)) stammten aus der Laborsammlung. Die E. coli Stämme wurden aerob bei 37°C in Luria-Bertani (LB) oder in definiertem M63-Medium, das 0,5% (vol/vol) Glycerin, supplementiert mit 2% (wt/vol) Casaminosäuren, enthielt, angezogen. Ampicillin wurde mit 50 μg/ml verwendet. Der H. sommnus Stamm HS25, von dem gezeigt worden ist, dass er experimentelle Hämophilose in Kälbern hervorruft, wurde aus der Lunge eines an Pneumonie verstorbenen Kalbes erhalten. Die Bedingungen für die Lagerung und das Wachstum von H. somnus sind zuvor beschrieben worden. Theisen und Potter (1992) J. Bacteriol. 174:17–23. Flüssigkulturen wurden in Brain-Heart-Infusion-Broth (Difco Laboratories, Detroit, MI), supplementiert mit 0,1% (wt/vol) Tris-Base und 0,001 % (wt/vol) Thiaminmonophosphat (BHI-TT) hergestellt. Ein Wachstum unter Eisenmangel-Bedingungen wurde durch Zugabe des Eisen-Chelators 2,2'-Dipyridyl mit einer Endkonzentration von 300 μM in dem BHI-TT Medium erhalten.
Die Expressionsbibliothek bestand aus 2 bis 7 kb partiellen Sau3A1-Restriktionsfragmenten aus genomischer H. somnus DNA, ligiert in die BamHI-Restriktionsschnittstelle von pGH432 (siehe Theisen und Potter (1992) J. Bacteriol. 174:17–23), was In-Leserahmen-Fusionen mit einem künstlichen Leader-Peptid erlaubt, dessen Expression von einem lacO kontrollierten tac-Promotor induziert sein kann (Advanced Vectors, Hopkins, MN).
Präparation der nativen Transferrin-Rezeptoren von H. somnus und spezifischer Antisera
Transferrin-Bindeproteine (Tbp) aus dem H. somnus Stamm HS25 wurden mittels Affinitätschromatographie mit Hilfe von bovinem Transferrin, wie von Ogunnariwo et al. (1990) Microbiol. Path. 9:397–406 beschrieben, isoliert. In Kürze, ganze Membranen von H. somnus wurden mit biotinyliertem bovinem Transferrin vor Solubilisieren mit EDTA-Sarkosyl und der Addition an Streptavidin-Agarose gemischt. Das affinitätsgebundene Material wurde durch Waschen mit verschiedenen Puffern freigesetzt. Ein spezifisches Antiserum gehen die Transferrin-Bindeproteine wurde mit Hilfe herkömmlicher Verfahren in einem Kaninchen gezüchtet.
PAGE und Immunoblotting
SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese (PAGE) der Proteine wurde unter Verwendung des von Laemmli (Laemmli, U.K. (1970) Nature 227:680–685) beschriebenen Verfahrens durchgeführt. Das Immunoblotting wurde mit Hilfe der vom Hersteller der Elektroblot-Apparatur (BioRad Laboratories) beschriebenen Standardtechniken durchgeführt. Das erste Antiserum war gegen H. somnus Tbp gezüchtetes Kaninchenserum, das mit Affinitätschromatographie gereinigt war, oder gegen lebenden H. somnus HS25 gezüchtetes bovines Hyperimmunserum (Theisen und Potter (1992) J. Bacteriol. 174:17–23). Die seroreaktiven Proteine wurden mit an alkalischer Phosphatase gekoppeltem Ziege-anti-Kaninchen-Immunoglobulin G (PhoA) oder mit an PhoA gekoppeltem Ziege-anti-Rind-Immunoglobulin G (Kirkegaard & Perry Laboratories, Inc., Gaithersburg, Md.) detektiert. Die PhoA-Aktivität wurde mit Hilfe des Nitroblau-Tetrazolium-BCIP-Systems (Promega, Madison, WI) visualisiert.
Kolonie-Immunoblot einer genomischen H. somnus Bibliothek
Die Plasmid-Expressionsbibliothek von H. somnus HS25 tragende JM105 Zellen wurden auf Agarplatten ausgestrichen und auf die Produktion von Tbp mit Hilfe des Kolonie-Blot-Verfahrens (French et al. (1986) Anal. Biochem. 156:417–423) unter Verwendung von gegen affinitäsgereinigtes H. somnus gezüchtetes Kaninchenserum Tbp getestet.
DNA-Techniken
Standardverfahren wurden für die DNA-Manipulationen (Sambrook, supra) angewandt. Die DNA-Restriktionsenzymverdaue wurden in T4-DNA-Polymerasepuffer (Sambrook, supra) mit 1 mM Dithiothreitol und supplementiert mit 3 mM Spermidin durchgeführt. Alle synthetischen Oligonukleotide wurden mit einem Gene Assembler Plus DNA Synthesizer (Pharmacia LKB Biotechnology, Uppsala Schweden) hergestellt. Die DNA-Sequenzierung wurde nach dem Didesoxy-Kettenabruchverfahren (Sanger et al. (1977) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74:5463–5467); T7 Sequencing kit (Pharmacia)) an einzelsträngiger DNA, die sich von mittels Exonuclease III-Behandlung hergestellten nested Deletionen ableitete (Henikoff, S. (1977) Gene 28:351–359; Double-stranded nested Deletion Kit (Pharmacia)), oder mit doppelsträngiger DNA als Template durchgeführt. Die Sequenzen wurden mit dem PCGENE Software Package (IntelliGenetics, Mountain View, Calif.) analysiert.
Inverse PCR, basierend auf dem Verfahren von Ochman et al., (Ochman et al., (1990) „Amplification of flanking sequences by inverse PCR." in PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications. Academic Press), wurde zur tbp2-Klonierung aus H. somnus HS25 eingesetzt.
Anreicherung von in E. coli rekombinant produzierten Tbp1 und Tbp2.
Für Tbp1 wurden die Bakterien in einem Liter L-Broth, supplementiert mit 50 μg/ml Ampicillin, bis zur mittleren log-Phase angezogen. Wenn die Absorption bei 600 nm 0,6 erreichte, wurde Isopropyl-β,D-thiogalactosid (IPTG) mit einer Endkonzentration von 1 mM zugefügt und die Kulturen wurden mit kräftigem Schütteln für 2 h bei 37°C inkubiert. Die Bakterien wurden mittels Zentrifugation geerntet, in 40 ml 25% Sucrose/50 mM Tris-HCl-Puffer (pH 8) resuspendiert und bei –70°C eingefroren. Die eingefrorenen Zellen wurden bei Raumtemperatur aufgetaut und 10 ml Lysozym (10 mg/ml in 250 mM Tris-HCl, pH 8) wurde zugefügt. Nach 15 Minuten auf Eis wurden 300 ml Detergensmischung (5 Teile 20 mM Tris-HCl, pH 7,4/300 mM Natriumchlorid/2% Desoxycholsäure/2% Nonidet-P40 und 4 Teile 100 mM Tris-HCl, pH 8/50 mM EDTA/2% Triton X-100) zugefügt. Die Viskosität wurde mittels Beschallung vermindert und Proteinaggregate wurden durch 15-minütige Zentrifugation bei 27.000 × g geerntet. Die Pellets wurden in einem minimalen Volumen von 4 M Guanidinhydrochlorid gelöst. Die Proteine wurden mittels Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamidgelelektrophorese analysiert und die Proteinkonzentration wurde durch Vergleich der Intensität der Coomassie-Blau gefärbten Banden mit einem Rinderserumalbumin-Standard geschätzt.
Tbp2 wurde aus den gesamten äußeren Membranen mit Sarkosyl gereinigt. In Kürze, die Bakterien wurden in einem Liter L-Broth, supplementiert mit 50 μg/ml Ampicillin, bis zur mittleren log-Phase angezogen. Wenn die Absorption bei 600 nm annähernd 0,6 erreichte, wurde IPTG mit einer Endkonzentration von 1 mM zugefügt und die Kulturen wurden mit kräftigem Schütteln 2–4 h bei 37°C inkubiert. Die Bakterien wurden mittels Zentrifugation geerntet, in Tris-EDTA-Puffer, pH 8 resuspendiert und mit Lysozym, wie oben beschrieben, behandelt. Die Zellen wurden mittels Beschallung aufgebrochen und die unlöslichen Zelltrümmer wurden durch Zentrifugation entfernt. Der Überstand wurde auf einen Sucrose-Gradienten geschichtet und die Proteinbande der äußeren Membran wurde nach einer Zentrifugation über Nacht mit einer Spritze abgezogen. Im Anschluss an die Dialyse wurden die Lipoproteine, einschließlich Tbp2, selektiv durch Mischen der Membranfragmente mit Sarkosyl solubilisiert. In Gegenwart dieses Detergens bleiben Lipid-modifizierte Proteine löslich, während die äußeren Membranfragmente gefällt werden und mittels Ultrazentrifugation entfernt werden können.
Markierung der Proteine mit [³H]Palmitat und Globomycin-Behandlung.
Exponentiell gewachsene Zellen (4 × 10⁸ Zellen pro ml) vom H. somnus Stamm HS25 in BHI-TT und von E.coli DH5αF'IQ, das die spezifischen Plasmide enthält, in definiertem M63-Medium wurden 2 h bei 37°C mit [³H]Palmitat mit einer Endkonzentration von 50 μCi/ml, in Anwesenheit oder Abwesenheit von Globomycin (100 μg/ml), einem spezifischen Inhibitor der Prolipoprotein-Signalpeptidase II (Dev et al., (1985) J. Biol. Chem. 260:5891–5894) wie bereits beschrieben (Theisen et al., (1992) Infect. Immun. 62:826–831), inkubiert. Das Markieren wurde durch Fällung mit Trichloressigsäure (10% wt/vol) für 30 Min. auf Eis beendet. Die Proteine wurden mittels Zentrifugation mit 15.000 × g 20 Min. pelletiert und zweimal mit Methanol gewaschen, um Lipide zu entfernen. Die im Probenpuffer resuspendierten Proteine wurden mittels SDS-PAGE analysiert und die radioaktiv markierten Proteinbanden in dem getrockneten Gel wurden mittels Fluorographie nachgewiesen.
Fraktionierung der H. somnus Zellen und Präparation der äußeren Membranen
Exponentiell gewachsene H. somnus HS25 Zellen wurden mittels zweier Passagen durch eine French-Druckzelle lysiert. Die Trennung der verschiedenen zellulären Fraktionen, einschließlich der Sarkosyl-unlöslichen äußeren Membranen (Filip et al. (1973) J. Bacteriol. 115:717–722), wurde mittels differentieller Zentrifugation, wie zuvor beschrieben (Rioux et al. (1992) Gene 116:13–20), durchgeführt. Die Proteine aus den Zelllysaten und verschiedenen Fraktionen wurden mit 10% (wt/vol) Trichloressigsäure für 40 Min. auf Eis gefällt, mittels Zentrifugation bei 15.000 × g 20 Min. pelletiert und zweimal mit Methanol gewaschen, um die Lipide vor der SDS-Page Analyse zu entfernen.
Ergebnisse
Um Klone zu identifizieren, die Tbp-Epitope exprimieren, wurde eine Expressionsbibliothek vom H. somnus Stamm HS25 in E. coli mit polyklonalen Antiserum, das gegen affinitätsgereinigtes Tbp1 und Tbp2 aus H. somnus gezüchtet war, durchmustert. Diese anti-Tbp-Antiserum reagierte mit Proteinen mit relativen Molekulargewichten von 80.000 beziehungsweise 115.000 (hier als Tbp2 beziehungsweise Tbp1 bezeichnet).
Ein Klon, der ein 4,1 kb DNA-Insert enthielt, wurde erhalten. Die Analyse der Nukleotidsequenz des DNA-Inserts zeigte das Vorhandensein eines verkürzten offenen Leserahmens, der für ein vorhergesagtes Protein codiert, das zu der Carboxylregion der vorhergesagten Tbp1-Polypeptide von Neisseria meningitidis und Neisseria gonorrhoeae ähnlich ist. Ein Polypeptid mit einem Molekulargewicht von annähernd 110.000 wurde von diesem Klon produziert; dieses Polypeptid wurde vom bovinen Hyperimmunserum gegen lebende H. somnus HS25 erkannt.
Die DNA-Region, die für den Amino-Terminus von H. somnus Tbp1 codiert, wurde mit Hilfe der inversen Polymerase-Kettenreaktion erhalten. Der vollständige tbp1-ORF codiert für ein 971 Aminosäuren-Polypeptid mit dem vorhergesagten Molekulargewicht von 109.725. Der Leserahmen und eine mutmaßliche Schnittstelle der Signalpeptidase I wurden durch die partiellen Aminosäuresequenz bestätigt, die durch eine N-terminale Mikrosequenzierung der reifen Form vom nativen H. somnus Tbp1 erhalten wurde. Das Molekül umfasst ein Signalpeptid von 28 Aminosäuren.
Die tbp1-Genregion, die für das reife Tbp1 codiert, wurde in einen E. coli Expressionsvektor pGH432, der einen tac-Promotor enthält, subkloniert, um Plasmid pCRR41 (ATCC Hinterlegungsnr. 98810) zu ergeben, welches das H. somnus Tbp1-Protein als unlösliche Einschlusskörper nach einer Induktion mit IPTG exprimiert, und Tbp1 wurde mittels Aggregatpräparation teilgereinigt.
Das Gen, das für Tbp2 codiert, wurde mittels inverser PCR isoliert und die Sequenz, die für das gesamte Tbp2-Peptid, einschließlich der Signalsequenz, codiert, wurde in dem gleichen Vektor, wie oben beschrieben, exprimiert. Das Plasmid wurde als pCRR90 (ATCC Hinterlegungsnr. 98811) bezeichnet. Im Anschluss an die IPTG-Induktion wurde das Tbp2-Protein aus den gesamten äußeren E. coli Membranen mit Sarkosyl, wie oben beschrieben, extrahiert. Im Gegensatz zu anderen Membranproteinen verblieb Tbp2 aufgrund seiner Lipidmodifikationen in diesem Detergens löslich.
Die für Tbp1 und Tbp2 codierenden Gene plus flankierender DNA sind in 1A–1B gezeigt. Zwei offene Leserahmen wurden gefunden, der eine beginnt bei Nukleotid 708 und endet an Position 2693 (Tbp2) und der zweite beginnt bei Nukleotid 2891 und endet an Position 5803 (Tbp1) (siehe 2). Die vorhergesagten Aminosäuresequenzen dieser beiden Proteine sind in 3 (Tbp1) und 4 (Tbp2) gezeigt. Die vollständige Tbp1-Sequenz umfasst ein Signalpeptid von 28 Aminosäuren, die an den Positionen 1 bis 28 in 3 vorliegen. Folglich wird die reife Tbp1-Sequenz von den Aminosäuren 29 bis 971, inklusive, in 3 repräsentiert und ist von der Nukleotidsequenz codiert, die an den Positionen 2975 bis 5803, inklusive, der 1A–1B dargestellt ist.
Die vollständige Tbp2-Sequenz umfasst ein Signalpeptid von 19 Aminosäuren, die an den Positionen 1 bis 19 in 4 vorliegen. Folglich wird die reife Tbp2-Sequenz von den Aminosäuren 20 bis 662, inklusive, in 4 repräsentiert und ist von der Nukleotidsequenz codiert, die an den Positionen 765 bis 2683 in 1A–1B dargestellt ist.
Beispiel 2
Protektive Wirksamkeit von rekombinanten Transferrin-Bindeproteinen
Die Tbp1 und Tbp2-Proteine wurden rekombinant in E. coli als Einschlusskörper beziehungsweise als Membran-gebundene Proteine produziert. Wie oben erklärt, wurden Tbp1-Einschlusskörper mit Hilfe von Standardverfahren hergestellt, während lösliches Tbp2 aus den äußeren E. coli Membranen präpariert wurde. Dies Membranen wurden dann einer Sarkosyl-Extraktion unterzogen, um vorzugsweise Tbp2 zu solubilisieren.
Vakzine wurden unter Verwendung des Adjuvans VSA3 (einer Kombination aus DDA (Kodak) und Emulsigen-Plus (MVP Laboratories, Omaha, NE) formuliert, so dass das Volumen jeder Dosis 2cc betrug, die 50 μg eines jeden Antigens enthielt. Ein Placebovakzin wurde ebenfalls hergestellt, das anstatt Antigen ein steriles Verdünnungsmittel enthielt. Drei Gruppen wurden in den Versuch einbezogen, eine erste erhielt ein Placebo, eine zweite, die zwei Immunisierungen mit Tb2 erhielt, und eine dritte, die zwei Immunisierungen mit Tbp1 + Tbp2 erhielt. Jede Gruppe bestand aus acht Tieren und der Abstand zwischen erster und zweiter Immunisierung betrug drei Wochen. Alle Impfungen wurden auf einer Farm im südlichen Saskatchewan durchgeführt und die Impfungen erfolgten auf subkutan.
Zwei Wochen nach der zweiten Immunisierung wurden die Tiere einer Challenge mit bovinem Herpesvirus-1 unterzogen und vier Tage später wurden sie einer Aerosol-Exposition mit H. somnus unterzogen. Die Tiere wurden täglich von einem Veterinär und Tierpfleger untersucht und die folgende Daten wurden aufgezeichnet: Gewicht, Temperatur, nasale Bewertung, Depression, Stärke, Atemnot und Krankheit. Jedes dieser Kriterien, ausgenommen Gewicht und Temperatur, wurde auf einer Skala von 0–4 bewertet.
Die serologische Antwort auf die Impfung wurde mit Hilfe eines Enzymimmunoassays (ELISA) gemessen. Die Serumproben wurden zum Zeitpunkt der ersten und zweiten Immunisierung und am Tag der Challenge mit BHV-1 gesammelt. Die Titer sind als Kehrwert der Serumverdünnung dargestellt, die zu einer optische Dichte führte, die der des Hintergrunds plus zwei Standardabweichungen entsprach.
Keines dieser Tiere zeigte irgendeine ungünstige Antwort auf die Immunisierung mit irgendeiner der verwendeten Formulierungen. Die serologische Antwort auf die Impfung wurde mit Hilfe eines ELISA-Verfahrens, das die Serum-Antikörperspiegel gegen Tbp1 und Tbp2 misst, bestimmt. Ein H. somnus äußerer Membranextrakt wurde ebenfalls als ein Antigen eingesetzt, aber es wurde kein signifikanter Anstieg des Titers beobachtet. Dies ist nicht unerwartet, da der Gehalt an Eisen-regulierten äußeren Membranproteinen in diesem Antigenpräparat sehr gering ist.
Die Antikörpertiter gegen Tbp1 und Tbp2 sind in den 5 beziehungsweise 6 gezeigt. Es kann erkannt werden, dass die Tiere, die rekombinante Tbp2-Vakzine erhalten, gut auf dieses Antigen antworteten, ohne ein signifikante Differenz zwischen den Gruppen 2 und 3. Die Antwort gegen Tbp1 war minimal, wie es aufgrund unseres Versuchs mit diesem Antigen von unseren anderen Organismen erwartet wurde. Die Gruppe, die nur Tbp2 erhielt, hatte auch Serum-Antikörperspiegel gegen Tbp1, aber dies lag wahrscheinlich an den kontaminierenden E. coli Proteinen, die in dem für ELISA verwendeten Antigenpräparat vorhanden waren.
Die Mortalität in der Placebo-Gruppe lag bei 62,5%, knapp an einer erwarteten Rate von ungefähr 70%. Die Mortalität der Gruppe ist in 7 gezeigt und ist in Tabelle 1 tageweise aufgeführt. Es kann erkannt werden, dass eine Immunisierung mit Vakzinen, die rekombinantes Tbp2 enthalten, die Mortalität um 25% verringerte, während eine Immunisierung mit Vakzinen, die eine Kombination aus Tbp1 und Tbp2 umfassten, nur einen geringen Effekt verglichen mit dem Placebo hatten. Nekropsien wurden bei allen Tieren durchgeführt, die während des Versuchs starben, und in allen Fällen wurde H. somnus aus den Lungen kultiviert und der festgestellte pathologische Befund stimmte mit einer H. somnus Pneumonie überein.
Da die ELISA-Titer für Tbp2 in beiden Vakzin-Versuchsgruppen ähnlich waren, ist es überraschend, dass ein äquivalentes Ausmaß an Schutz nicht beobachtet wurde. Allerdings kann dies einfach eine effizientere Aufnahme von H. somnus durch phagocytische Zellen in der Tbp1 + Tbp2 Gruppe widerspiegeln, was eine erhöhte Vermehrung der Bakterien in einer intrazellulären Umgebung erlaubt.
Die klinischen Ergebnisse sind in Tabelle 1 zusammengefasst und die Ergebnisse für Temperatur, Depression und Krankheitsbewertung sind in den 8, 9 beziehungsweise 10 dargestellt. Diese Ergebnisse sind denjenigen ähnlich, die für Mortalität erhalten wurden, wobei die Tbp2-immunisierte Gruppe übereinstimmend geringere Bewertungen in praktisch allen Kategorien zeigte. Die in 8, 9 und 10 gezeigten Ergebnisse beinhalten nur die Tage 5 bis 8 des Versuchs, da die Tiere an Tag 4 einer Challenge mit H. somnus unterzogen wurden. Die klinischen Bewertungen waren praktisch bei allen drei Gruppen von Tag 1 bis Tag 4 gleich.
Hinterlegungen der für die praktische Umsetzung der Erfindung zweckdienlichen Stämme
Eine Hinterlegung biologisch reiner Kulturen der folgenden Stämme erfolgte bei der American Type Culture Collection, 1081 University Boulevard, Manassas. Die angegebene Hinterlegungsnummer wurde nach einer erfolgreichen Prüfung der Lebensfähigkeit zugewiesen und die geforderten Gebühren wurden bezahlt. Die Hinterlegungen erfolgten nach den Bestimmungen des Budapester Vertrags über die internationale Anerkennung der Hinterlegung von Mikroorganismen für die Zwecke von Patentverfahren und die zugrundeliegenden Regelungen (Budapester Vertrag). Dieses sichert die Unterhaltung lebensfähiger Kulturen für einen Zeitraum von dreißig (30) Jahren vom Tag der Hinterlegung an zu. Die Organismen sind bei der ATCC unter den Bestimmungen des Budapester Vertrages verfügbar, was eine ständige und unbeschränkte Verfügbarkeit der Nachkommen für einen vom U.S. Leiter des Patent- und Markenamtes gemäß 35 U.S.C. §122 und den hierfür entsprechenden Bestimmungen (einschließlich 37 C.F.R. §1.12 mit besonderem Bezug auf 886 OG 638) bestimmten Berechtigten. Nach Erteilung des Patents werden sämtliche Beschränkungen der Verfügbarkeit für die Öffentlichkeit der hinterlegten Kulturen unwiderruflich aufgehoben.
Diese Hinterlegungen sind zum Vorteil des Fachmanns bereitgestellt und sind kein Zugeständnis, dass eine Hinterlegung nach 35 U.S.C. §112 erforderlich ist. Die Nukleinsäuresequenzen dieser Gene wie auch die Aminosäuresequenzen der damit codierten Moleküle sind hier durch Quellenangabe eingefügt und sind im Falle eines Konflikts mit der Beschreibung hier maßgeblich:
Folglich sind die Klonierung, Expression und Charakterisierung von H. somnus Transferrin-Bindeproteine wie auch die Verfahren zur Verwendung derselben offen gelegt. Obwohl bevorzugte Anwendungsformen der betreffenden Erfindung ziemlich detailliert beschrieben worden sind, ist es zu verstehen, dass naheliegende Abänderungen gemacht werden können, ohne vom Sinn und dem Rahmen der Erfindung, wie sie in den anhängigen Ansprüchen definiert ist, abzuweichen.

Claims

Eine Vakzinzusammensetzung im Wesentlichen bestehend aus einem pharmazeutisch verträglichen Vehikel, einem Adjuvans und einem isolierten immunogenen H. somnus Transferrin-Bindeprotein ausgewählt aus (a) einem H. somnus Transferrin-Bindeprotein 1 mit mindestens 90% Sequenzidentität zu der zusammenhängenden Sequenz der Aminosäuren gezeigt an den Aminosäurepositionen 1–971, inklusive, von 3, (b) einem H. somnus Transferrin-Bindeprotein 1 mit mindestens 90% Sequenzidentität zu der zusammenhängenden Sequenz der Aminosäuren gezeigt an den Aminosäurepositionen 29–971, inklusive, von 3, (c) einem H. somnus Transferrin-Bindeprotein 2 mit mindestens 90% Sequenzidentität zu der zusammenhängenden Sequenz der Aminosäuren gezeigt an den Aminosäurepositionen 1–662, inklusive, von 4, und (d) einem H. somnus Transferrin-Bindeprotein 2 mit mindestens 90% Sequenzidentität zu der zusammenhängenden Sequenz der Aminosäuren gezeigt an den Aminosäurepositionen 20–662, inklusive, von 4.
Die Vakzinzusammensetzung nach Anspruch 1, wobei das Transferrin-Bindeprotein die an Aminosäurepositionen 1–971, inklusive, von 3 gezeigte Aminosäuresequenz umfasst.
Die Vakzinzusammensetzung nach Anspruch 1, wobei das Transferrin-Bindeprotein die an Aminosäurepositionen 29–971, inklusive, von 3 gezeigte Aminosäuresequenz umfasst.
Die Vakzinzusammensetzung nach Anspruch 1, wobei das Transferrin-Bindeprotein die an Aminosäurepositionen 1–662, inklusive, von 4 gezeigte Aminosäuresequenz umfasst.
Die Vakzinzusammensetzung nach Anspruch 1, wobei das Transferrin-Bindeprotein die an Aminosäurepositionen 20–662, inklusive, von 4 gezeigte Aminosäuresequenz umfasst.
Die Vakzinzusammensetzung nach einem der Ansprüche 1–5, umfassend ein H. somnus Transferrin-Bindeprotein 1 und ein H. somnus Transferrin-Bindeprotein 2.
Ein Verfahren zur Herstellung einer Vakzinzusmmensetzung umfassend: (a) zur Verfügung stellen eines isolierten immunogenen H. somnus Transferrin-Bindeproteins ausgewählt aus (a) einem H. somnus Transferrin-Bindeprotein 1 mit mindestens 90% Sequenzidentität zu der zusammenhängenden Sequenz der Aminosäuren gezeigt an den Aminosäurepositionen 1–971, inklusive, von 3, (b) einem H. somnus Transferrin-Bindeprotein 1 mit mindestens 90% Sequenzidentität zu der zusammenhängenden Sequenz der Aminosäuren gezeigt an den Aminosäurepositionen 29–971, inklusive, von 3, (c) einem H. somnus Transferrin-Bindeprotein 2 mit mindestens 90% Sequenzidentität zu der zusammenhängenden Sequenz der Aminosäuren gezeigt an den Aminosäurepositionen 1–662, inklusive, von 4, und (d) einem H. somnus Transferrin-Bindeprotein 2 mit mindestens 90% Sequenzidentität zu der zusammenhängenden Sequenz der Aminosäuren gezeigt an den Aminosäurepositionen 20–662, inklusive, von 4. und (b) kombinieren des Transferrin-Bindeproteins mit einem pharmazeutisch verträglichem Vehikel und einem Adjuvans..
Verwendung eines immunogenen H. somnus Transferrin-Bindeproteins zur Herstellung einer Vakzinzusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 1–6 zur Behandlung oder Prävention einer Infektion eines Säugetiers mit H. somnus.
Ein immunodiagnostischer Testkit zum Nachweis einer Haemophilus somnus-Infektion, wobei der Testkit umfasst: ein immunogenes H. somnus Transferrin-Bindeprotein ausgewählt aus (a) einem H. somnus Transferrin-Bindeprotein 1 mit mindestens 90% Sequenzidentität zu der zusammenhängenden Sequenz der Aminosäuren gezeigt an den Aminosäurepositionen 1–971, inklusive, von 3, (b) einem H. somnus Transferrin-Bindeprotein 1 mit mindestens 90% Sequenzidentität zu der zusammenhängenden Sequenz der Aminosäuren gezeigt an den Aminosäurepositionen 29–971, inklusive, von 3, (c) einem H. somnus Transferrin-Bindeprotein 2 mit mindestens 90% Sequenzidentität zu der zusammenhängenden Sequenz der Aminosäuren gezeigt an den Aminosäurepositionen 1–662, inklusive, von 4, und (d) einem H. somnus Transferrin-Bindeprotein 2 mit mindestens 90% Sequenzidentität zu der zusammenhängenden Sequenz der Aminosäuren gezeigt an den Aminosäurepositionen 20–662, inklusive, von 4 und Anweisungen zur Durchführung des immunodiagnostischen Tests.
Verwendung eines immunogenen H. somnus Transferrin-Bindeproteins ausgewählt aus (a) einem H. somnus Transferrin-Bindeprotein 1 mit mindestens 90% Sequenzidentität zu der zusammenhängenden Sequenz der Aminosäuren gezeigt an den Aminosäurepositionen 1–971, inklusive, von 3, (b) einem H. somnus Transferrin-Bindeprotein 1 mit mindestens 90% Sequenzidentität zu der zusammenhängenden Sequenz der Aminosäuren gezeigt an den Aminosäurepositionen 29–971, inklusive, von 3, (c) einem H. somnus Transferrin-Bindeprotein 2 mit mindestens 90% Sequenzidentität zu der zusammenhängenden Sequenz der Aminosäuren gezeigt an den Aminosäurepositionen 1–662, inklusive, von 4, und (d) einem H. somnus Transferrin-Bindeprotein 2 mit mindestens 90% Sequenzidentität zu der zusammenhängenden Sequenz der Aminosäuren gezeigt an den Aminosäurepositionen 20–662, inklusive, von 4 zur Herstellung eines diagnostischen Reagenz zum Nachweis von Haemophilus somnus Antikörpern in einer biologischen Probe.