ES2298249T3 - Ospa modificada de borrelia burgdorferi. - Google Patents
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Abstract
Un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos de una proteína OspA de Borrelia burgdorferi, desde el resto 139 hasta el resto 273 de una proteína OspA de Borrelia burgdorferi, en el que la secuencia incluye todas las modificaciones constituidas por el resto 139 que es metionina, el resto 160 que es tirosina y el resto 189 que es metionina, en el que la numeración se corresponde con la numeración de la SEC ID Nº: 7.
Description
OspA modificada de Borrelia
burgdorferi.
Esta solicitud reivindica el beneficio de la
Solicitud Provisional de Estados unidos Nº 60/226.484, presentada
el 18 de agosto de 2000, cuyas enseñanzas se incorporan en este
documento por referencia en su totalidad.
La invención se financió, en su totalidad o en
parte, mediante la subvención 2R01AI37256-05A1 del
National Institute of Allergy and Infectious Diseases (Instituto
Nacional de la Alergia y de las Enfermedades Infecciosas). El
Gobierno (de Estados Unidos) tiene ciertos derechos en la
invención.
La enfermedad de Lyme (borreliosis de Lyme) es
la enfermedad infecciosa transmitida por garrapatas más común en
Norteamérica y Europa, y se ha encontrado en Rusia, Japón, China y
Australia. La enfermedad de Lyme comienza en el sitio de una
mordedura de garrapata, produciendo una infección primaria que se
extiende por el organismo a sitios secundarios durante el curso de
la infección. El agente bacteriano causal de esta enfermedad es la
espiroqueta Borrelia burgdorferi, que se aisló y se cultivó
por primera vez en 1982 (Burgdorferi, W. A. y col., Science 216:
1317-1319 (1982); Steere, A. R. y col., N. Engl. J.
Med., 308: 733-740 (1983)).
Se han descrito tres genoespecies patógenas de
Borrelia, B. burgdorferi sensu stricto (B.
burgdorferi o B. b. s. s.), B. afzelii y B.
garinii (Baranton, G., y col., Int. J. Syst. Bacteriol., 42:
378-383 (1992)). Éstas son miembros de un complejo
de especies, B. burgdorferi sensu lato, constituido por al
menos 10 genoespecies diferentes (Piken, R. N. y col., J. Invest.
Dermatol., 110: 211-214 (1998); Prostic, D. y col.,
Int. J. Syst. Bacteriol., 44: 743-752 (1994);
Valsangiacomo, C. T. y col., Int. J. Syst. Bacteriol., 47:
1-10 (1997)). Se piensa que las tres genoespecies,
B. burgdorferi sensu stricto, B. afzelii y B.
garinii, son patógenas y todas se encuentran en Europa.
B. burgdorferi tiene una membrana externa
cuyos constituyentes proteicos principales son las proteínas A y B
de la superficie externa (OspA y OspB). OspA es una lipoproteína
básica de aproximadamente 31 kd, que está codificada en un plásmido
lineal grande junto con OspB, una lipoproteína básica de
aproximadamente 34 kd (Szczepanski, A., y J. L. Benach, Microbiol.
Rev., 55: 21 (1991)). La respuesta inmune a estas proteínas de la
superficie externa tiende a producirse tarde en la enfermedad, si es
que se produce (Craft, J. E. y col., J. Clin. Invest. 78:
934-939 (1986); Dattwyler, R. J. y B. J. Luft,
Rheum. Clin. North Am., 15: 727-734 (1989)).
Además, los pacientes infectados de forma aguda y de forma crónica
con B. burgdorferi responden de forma variable a los
diferentes antígenos, incluyendo OspA, OspB, OspC, OspD, p39, p41 y
p93.
Actualmente, la enfermedad de Lyme se trata con
una variedad de antibióticos, por ejemplo, tetraciclinas,
penicilina y cefalosporinas. Sin embargo, dicho tratamiento no
siempre es eficaz para eliminar la infección. Con frecuencia, el
tratamiento se retrasa debido a un diagnóstico inapropiado, con el
efecto perjudicial de que la infección avanza hacia una afección
crónica, en la que el tratamiento con antibióticos es frecuentemente
inútil. Uno de los factores que contribuyen a un tratamiento
retrasado es la falta de herramientas diagnósticas eficaces.
Se ha intentado generar vacunas contra la
borreliosis de Lyme. Sin embargo, una vacuna constituida por OspA
recombinante puede requerir frecuentes inmunizaciones de refuerzo.
Una preocupación adicional de las vacunas basadas en OspA es la
reciente identificación de un dominio OspA autorreactivo potencial,
con un alto grado de similitud con una región del antígeno 1
asociado a la función leucocitaria humana (hLFA-1)
(Gross, D. M. y col., Science, 281: 703-706
(1998)).
Por lo tanto, será ventajoso desarrollar
proteínas OspA modificadas que tengan una reactividad cruzada
disminuida con hLFA-1, para reducir los efectos
secundarios potenciales de una vacuna de OspA. También es deseable
el desarrollo de proteínas OspA, con una reactividad cruzada
disminuida con hLFA-1, que conserven o tengan una
inmunorreactividad aumentada contra más de un miembro del complejo
Borrelia. Para ser útiles como vacunas, las conformaciones
de estas proteínas modificadas deben ser suficientemente estables
para conservar ciertas características estructurales de OspA, que
se requieren para desencadenar una respuesta inmune protectora. Las
proteínas OspA con estas características permitirán mejoras en la
diagnosis y/o la vacunación contra todas, o la mayoría, de las
Borrelia que causan la enfermedad de Lyme.
El análisis del estado inmune de individuos
inmunizados con OspA reveló que la respuesta cuantitativa total no
es predictiva de la protección, sino que la reactividad con un
epítope específico de la lipoproteína OspA se correlaciona
directamente con la inmunidad protectora. El anticuerpo monoclonal
anti-OspA, LA-2 (Kramer y col.,
1990) define un epítope de la lipoproteína que aparentemente es
necesario para una inmunidad protectora después de la vacunación
con OspA. Por ejemplo, la inmunización pasiva de ratones con este
anticuerpo conduce a la protección frente a la infección con la
espiroqueta (Schaible y col., 1993). Además, la inmunización de
ratones y caninos con OspA, que da como resultado títulos
significativos de anticuerpo equivalente LA-2 en
suero, predice con precisión la protección frente a la transmisión
de la infección por garrapatas (Golde, 1997). Los niveles
insuficientes de anticuerpo equivalente LA-2 dan
como resultado una falta de protección, en oposición a títulos
elevados de anticuerpo en suero contra OspA (Johnson y col.,
1995).
La presente invención se refiere a formas
modificadas de OspA de Borrelia burgdorferi que tienen una
estabilidad conformacional aumentada, aunque conservan, al menos en
parte, la antigenicidad de la OspA de tipo silvestre. En algunas
realizaciones, el polipéptido OspA modificado tiene una reactividad
cruzada disminuida con hLFA-1, en comparación con
el polipéptido OspA no modificado correspondiente. Los polipéptidos
OspA modificados pueden comprender casi todo o sólo una porción del
polipéptido OspA nativo. En algunas realizaciones, el polipéptido
OspA modificado puede ser parte de una combinación que incluye una o
más de otras proteínas, tal como, por ejemplo, otros polipéptidos
de Borrelia burgdorferi incluyendo OspA, OspB, OspC, OspD,
p93 y p41. En otras realizaciones, el polipéptido OspA modificado
puede ser parte de una proteína quimérica, tal como las descritas
en la Patente de Estados Unidos Nº 6.248.562, cuyas enseñanzas se
incorporan en este documento por referencia en su totalidad.
Los polipéptidos OspA modificados de la presente
invención comprenden una secuencia de aminoácidos de la proteína
OspA de Borrelia burgdorferi desde aproximadamente el resto
139 hasta aproximadamente el resto 273, en los que la secuencia
incluye todas las modificaciones seleccionadas del grupo constituido
por: resto 139 cambiado por metionina, resto 160 cambiado por
tirosina, resto 189 cambiado por metionina y combinaciones de los
mismos. En otras realizaciones, los polipéptidos OspA modificados
de la presente invención comprenden una secuencia de aminoácidos de
una proteína OspA de Borrelia burgdorferi desde
aproximadamente el resto 131 hasta aproximadamente el resto 273, o
desde aproximadamente el resto 17 hasta aproximadamente el resto
273. Los polipéptidos OspA de la presente invención pueden
comprender fragmentos más largos o más cortos de la proteína OspA.
La numeración de los restos se corresponde con la numeración de la
SEC ID Nº: 7 (OspA de B31).
Los polipéptidos de la presente invención
incluyen polipéptidos seleccionados del grupo constituido por las
SEC ID Nº: 104 y 116.
La presente invención también se refiere a
polinucleótidos que codifican las secuencias de aminoácidos que se
describen en este documento, tales como polinucleótidos que
codifican los polipéptidos OspA de Borrelia burgdorferi
desde aproximadamente el resto 131 hasta aproximadamente el resto
273, en los que la secuencia codifica todas las modificaciones
seleccionadas del grupo constituido por: codón 139 que codifica
metionina, codón 160 que codifica tirosina, codón 189 que codifica
metionina y combinaciones de los mismos. El polinucleótido que
codifica polipéptidos OspA de la presente invención puede codificar
fragmentos más largos o más cortos de la proteína OspA. La
numeración de los restos se corresponde con la numeración de la SEC
ID Nº: 7.
Los polinucleótidos de la presente invención
incluyen un polinucleótido seleccionado del grupo constituido por:
SEC ID Nº: 103 y 115.
La presente invención también se refiere a un
procedimiento para generar un polipéptido OspA de Borrelia
burgdorferi modificado con una estabilidad conformacional
aumentada, en comparación con el polipéptido OspA de Borrelia
burgdorferi no modificado correspondiente. El procedimiento
comprende seleccionar un polinucleótido que codifica un polipéptido
OspA de Borrelia burgdorferi,que incluye los restos 139, 160
y 189, en el que la numeración se corresponde con la numeración de
la SEC ID Nº: 7. El polinucleótido se modifica de tal modo que
estén presentes las siguientes modificaciones: el resto 139 se
cambia por metionina, el resto 160 se cambia por tirosina y el
resto 189 se cambia por metionina. El polinucleótido modificado se
expresa, generando de este modo un polipéptido OspA de Borrelia
burgdorferi modificado con una estabilidad conformacional
aumentada, en comparación con el polipéptido OspA de Borrelia
burgdorferi no modificado correspondiente.
La presente invención también se refiere a un
vector de expresión que comprende un ADN aislado que codifica una
proteína OspA de Borrelia modificada. La presente invención
también incluye una célula huésped que comprende un ácido nucleico
recombinante que codifica una proteína OspA modificada, como se
describe en este documento.
La presente invención también se refiere a un
procedimiento para administrar los polipéptidos OspA de
Borrelia modificados que se describen en este documento. En
una realización, el procedimiento comprende administrar el
polipéptido OspA modificado en un vehículo fisiológicamente
aceptable a un individuo. Como resultado de la administración de la
proteína OspA modificada, el individuo desarrolla al menos cierta
respuesta inmune contra la proteína. Como ejemplo, el individuo
genera una respuesta inmune humoral, en la que el individuo produce
anticuerpos que reconocen al menos una porción de dicho polipéptido.
En una realización preferida, el individuo genera una respuesta
inmunoprotectora, por ejemplo, mediante la generación de anticuerpos
que reconozcan el epítope LA-2.
La presente invención también puede usarse en un
procedimiento para administrar un ácido nucleico que codifica un
polipéptido OspA modificado que se describe en este documento. En
una realización, el procedimiento comprende administrar el ácido
nucleico en un vehículo fisiológicamente aceptable a un individuo.
Como resultado de la administración del ácido nucleico, el
polipéptido OspA modificado se expresa, al menos de forma
transitoria, y el individuo desarrolla al menos cierta respuesta
inmune, preferiblemente, una respuesta inmunoprotectora contra la
proteína OspA modificada codificada por el ácido nucleico. Como
ejemplo, el individuo genera una respuesta inmune humoral, en la
que el individuo produce anticuerpos que reconocen al menos una
porción del polipéptido OspA modificado producido a partir del
ácido nucleico. En una realización preferida, el individuo genera
una respuesta inmunoprotectora, por ejemplo, mediante la generación
de anticuerpos que reconozcan el epítope LA-2.
La invención también incluye procedimientos para
usar las proteínas que se describen en este documento en ensayos
diagnósticos. En una realización, el procedimiento puede usarse para
detectar la presencia de anticuerpos específicos de OspA en una
muestra de un huésped de interés. El procedimiento comprende poner
en contacto una muestra del huésped de interés con la proteína
modificada en condiciones en las que los anticuerpos, si están
presentes en la muestra del huésped, se unen a la proteína
modificada formando complejos antígeno-anticuerpo.
Después, los complejos antígeno-anticuerpo se
detectan usando procedimientos convencionales conocidos en la
técnica.
La presente invención puede formar un kit
diagnóstico que comprenda los polipéptidos modificados que se
describen en este documento. El kit comprende una proteína OspA de
Borrelia burgdorferi modificada, como se describe en este
documento. El kit también incluye reactivos para detectar los
complejos anticuerpo-antígeno que se forman entre
la proteína OspA modificada y los anticuerpos que están presentes en
la muestra de huésped suministrada por el usuario.
Como resultado de la presente invención, están
disponibles proteínas OspA, o fragmentos de las mismas, que tienen
una estabilidad conformacional aumentada aunque conservan al menos
cierta antigenicidad, o que tienen una reactividad cruzada reducida
con hLFA-1, para su uso en investigación, vacunas
y/o ensayos diagnósticos. Además, como resultado de la presente
invención, están disponibles ácidos nucleicos, que codifican
polipéptidos OspA, que tienen una reactividad cruzada reducida con
hLFA-1, para su uso en investigación y vacunas. Se
espera que los polipéptidos OspA modificados de la presente
invención permitan obtener vacunas mejoradas que tengan menores
efectos secundarios.
Para una mejor interpretación de la presente
invención, junto con otros y adicionales objetos, se hace referencia
a la siguiente descripción y a los dibujos que la acompañan.
La Figura 1 resume péptidos y dominios
antigénicos localizados mediante fragmentación proteolítica y
química de OspA.
La Figura 2 es una comparación de los dominios
antigénicos representados en la Figura 1, para OspA en nueve cepas
de B. burgdorferi.
La Figura 3 es un gráfico que representa un
gráfico del polimorfismo ponderado frente a la posición de un
aminoácido en 14 variantes de OspA. Los picos señalados son: a)
aminoácidos 132-145; b) aminoácidos
163-177; c) aminoácidos 208-221. La
línea de puntos inferior en el valor de polimorfismo 1,395 demarca
excesos estadísticamente significativos de polimorfismo a p = 0,05.
La línea de puntos superior en 1,520 es la misma, excepto porque se
han eliminado los primeros 29 aminoácidos del análisis original del
extremo terminal monomórfico.
La Figura 4 representa el alineamiento de
aminoácidos desde el resto 200 hasta el 220 para OspA de las cepas
B31 y K48, así como para los mutantes dirigidos 613, 625, 640,
613/625 y 613/640. La flecha indica el Trp216. Los cambios de
aminoácidos están subrayados.
La Figura 5 representa un árbol filogenético
para las cepas de Borrelia descritas en la Tabla I. Las cepas
son las siguientes: 1 = B31; 2 = PKaI; 3 = ZS7; 4 = N40; 5 = 25015;
6 = K48; 7 = DK29; 8 = PHei; 9 = Ip90; 10 = PTrob; 11 = ACAI; 12 =
PGau; 13 = Ip3; 14 = PBo; 15 = Pko.
Las Figuras 6A y 6B representan la secuencia de
ácido nucleico de OspA-B31 (SEC ID Nº: 6) y la
secuencia de la proteína codificada (SEC ID Nº: 7).
Las Figuras 7A, 7B y 7C representan la secuencia
de ácido nucleico de OspA-K48 (SEC ID Nº: 8) y la
secuencia de la proteína codificada (SEC ID Nº: 9).
Las Figuras 8A, 8B y 8C representan la secuencia
de ácido nucleico de OspA-PGau (SEC ID Nº: 10) y la
secuencia de la proteína codificada (SEC ID Nº: 11).
Las Figuras 9A y 9B representan la secuencia de
ácido nucleico de un gen de OspA (SEC ID Nº: 127) y su secuencia
proteica codificada (SEC ID Nº:128).
Las Figuras 10A, 10B y 10C representan la
secuencia de ácido nucleico de la quimera
OspA-K48/OspA-PGau (SEC ID Nº: 28)
y la secuencia de la proteína quimérica codificada (SEC ID Nº:
29).
Las Figuras 11A, 11B y 11C representan la
secuencia de ácido nucleico de la quimera
OspA-B31/OspA-PGau (SEC ID Nº: 30)
y la secuencia de la proteína quimérica codificada (SEC ID Nº:
31).
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Las Figuras 12A y 12B representan la secuencia
de ácido nucleico de la quimera
OspA-B31/OspA-K48 (SEC ID Nº: 32) y
la secuencia de la proteína quimérica codificada (SEC ID Nº:
33).
Las Figuras 13A, 13B y 13C representan la
secuencia de ácido nucleico de la quimera
OspA-B31/OspA-25015 (SEC ID Nº 34)
y la secuencia de la proteína quimérica codificada (SEC ID Nº:
35).
Las Figuras 14A, 14B y 14C representan la
secuencia de ácido nucleico de la quimera
OspA-K48/OspA-B31/OspA-K48
(SEC ID Nº 36) y la secuencia de la proteína quimérica codificada
(SEC ID Nº 37).
Las Figuras 15A, 15B y 15C representan la
secuencia de ácido nucleico de la quimera
OspA-B31/OspA-K48/OspA-B31/OspA-K48
(SEC ID Nº: 38) y la secuencia de la proteína quimérica codificada
(SEC ID Nº: 39).
Las Figuras 16A, 16B y 16C representan la
secuencia de ácido nucleico de la quimera
OspA-B31/OspB-B31 (SEC ID Nº: 40) y
la secuencia de la proteína quimérica codificada (SEC ID Nº:
41).
Las Figuras 17A, 17B, 17C, 17D, 17E, 17F, 17G,
17H, 17I, 17J, 71K, 17L, 17M, 17N, 17O y 17P representan un
alineamiento de las secuencias de ácidos nucleicos para
OspA-B31 (SEC ID Nº: 6), OspA-pKa1
(SEC ID Nº: 42), OspA-N40 (SEC ID Nº: 43),
OspA-ZS7 (SEC ID Nº: 44); OspA-25015
(SEC ID Nº: 12), OspA-pTrob (SEC ID Nº: 45),
OspA-K48 (SEC ID Nº: 8), OspA-Hei
(SEC ID Nº: 46); OspA-DK29 (SEC ID Nº: 21),
OspA-Ip90 (SEC ID Nº: 22), OspA-pBo
(SEC ID Nº: 23), OspA-Ip3 (SEC ID Nº: 24),
OspA-Pko (SEC ID Nº: 25), OspA-ACAI
(SEC ID Nº: 26) y OspA-PGau (SEC ID Nº: 10). Los
ácidos nucleicos que son idénticos a los de la secuencia de ácido
nucleico principal (aquí, OspA-B31) se representan
por un punto (.); los ácidos nucleicos diferentes se muestran en
letras minúsculas.
Las Figuras 18A y 18B representan la secuencia
de ácido nucleico de la quimera
OspA-Tro/OspA-Bo (SEC ID Nº: 47) y
la secuencia de la proteína quimérica codificada (SEC ID Nº:
48).
Las Figuras 19A y 19B representan la secuencia
de ácido nucleico de la quimera
OspA-PGau/OspA-Bo (SEC ID Nº: 49) y
la secuencia de la proteína quimérica codificada (SEC ID Nº:
50).
Las Figuras 20A y 20B representan la secuencia
de ácido nucleico de la quimera
OspA-B31/OspA-PGau/OspA-B31/OspA-K48
(SEC ID Nº: 53) y la secuencia de la proteína quimérica codificada
(SEC ID Nº: 54).
Las Figuras 21A y 21B representan la secuencia
de ácido nucleico de la quimera
OspA-PGau/OspA-B31/OspA-K48
(SEC ID Nº: 51) y la secuencia de proteína quimérica codifica (SEC
ID Nº: 52).
La Figura 22 es un gráfico de barras que muestra
la reactividad (medida por ELISA) de sueros de ratones inmunizados
con la proteína de Borrelia indicada (OspA u OspC) o con
proteína quimérica recombinante (OspC2-OspA) (eje
X) contra los antígenos OspA u OspC indicados (leyenda) de la cepa
B31 (Borrelia burgdorferi sensu stricto).
La Figura 23 es un gráfico de barras que muestra
la reactividad (medida por ELISA) de sueros de ratones inmunizados
con la proteína de Borrelia indicada (OspA u OspC) o con
proteína quimérica recombinante (OspC2-OspA) (eje
X) contra los antígenos OspA u OspC indicados (leyenda) de la cepa
B31 (Borrelia burgdorferi sensu stricto). Para los
resultados de ELISA contra el antígeno OspA de B31, se añadió en
exceso al suero un fragmento purificado de OspA de B31 (aminoácidos
18-139), de tal modo que la respuesta inmune
detectada fuera específica de la región C-terminal
de OspA.
La Figura 24 es un gráfico de barras que muestra
la reactividad de sueros de ratones inmunizados con la proteína
quimérica de Borrelia indicada (lipOspA/Bo, lipOspAB/P u
OspC-OspAB/P) (eje X) contra los antígenos OspA
indicados (leyenda) de las cepas B31 (Borrelia burgdorferi sensu
stricto), K48 (Borrelia garinii) y Pgau (Borrelia
afzelii).
La Figura 25 es un gráfico de barras que muestra
la reactividad de sueros de ratones inmunizados con la proteína
quimérica de Borrelia indicada (lipOspAP/Bo, lipOspAB/P u
OspC-OspAB/P) (eje X) contra las OspA indicadas
(leyenda) de las cepas B31 (Borrelia burgdorferi sensu
stricto), K48 (Borrelia garinii) y Pgau (Borrelia
afzelii). En todos los casos se añadió en exceso al suero un
fragmento purificado de OspA de B31 (aminoácidos
18-139), de tal modo que la respuesta inmune
detectada es específica para la región C-terminal de
OspA.
La Figura 26 es un gráfico de barras que muestra
la reactividad de sueros de ratones inmunizados con la proteína
quimérica de Borrelia indicada
(OspCB31-OspAB31, OspC2-OspAB31 o
lip OspC-B31) (eje X) contra el antígeno OspC
indicado (leyenda) de la cepa B31 (Borrelia burgdorferi sensu
stricto).
La Figura 27 es un gráfico de barras que muestra
la reactividad de sueros de ratones inmunizados con la proteína
quimérica de Borrelia indicada
(OspCB31-OspAB31, OspC2-OspAB31 o
Lip OspA K/T) (eje X) contra los antígenos OspA indicados (leyenda)
de las cepas B31 (Borrelia burgdorferi sensu stricto), K48
(Borrelia garinii) y Pgau (Borrelia afzelii).
La Figura 28 es un gráfico de barras que muestra
la reactividad de sueros de ratones inmunizados con la proteína
quimérica de Borrelia indicada
(OspCB31-OspAB/P, OspCB31-OspABPBP u
OspCB31-OspAB31) (eje X) contra los antígenos OspA
indicados (leyenda) de las cepas B31 (Borrelia burgdorferi sensu
stricto), K48 (Borrelia garinii) y Pgau (Borrelia
afzelii).
La Figura 29 es un gráfico de barras que muestra
la reactividad de sueros de ratones inmunizados con la proteína
quimérica de Borrelia indicada
(OspCB31-OspAB/P, OspCB31-OspABPBP u
OspCB31-OspAB31) (eje X) contra la OspA indicada
(leyenda) de las cepas B31 (Borrelia burgdorferi sensu
stricto), K48 (Borrelia garinii) y Pgau (Borrelia
afzelii). En todos los casos se añadió en exceso al suero un
fragmento purificado de OspA de B31 (aminoácidos
18-139), de tal modo que la respuesta inmune
detectada es específica para la región C-terminal
de OspA.
Las Figuras 30A, 30B y 30C representan la
secuencia de ácido nucleico de la quimera OspC-B31
(pb 55-633)/OspA-B31 (pb
52-822) (SEC ID Nº: 55) y la secuencia de la
proteína quimérica codificada (SEC ID Nº: 56).
Las Figuras 31A, 31B y 31C representan la
secuencia de ácido nucleico de la quimera OspC-B31
(pb 55-624)/OspA-B31 (pb
52-822) (SEC ID Nº:57) y la secuencia de la proteína
quimérica codificada (SEC ID Nº 58).
Las Figuras 32A, 32B y 32C representan la
secuencia de ácido nucleico de la quimera OspC-C2
(pb 55-612)/OspA-B31 (pb
52-822) (SEC ID Nº: 59) y la secuencia de la
proteína quimérica codificada (SEC ID Nº: 60).
Las Figuras 33A, 33B y 33C representan la
secuencia de ácido nucleico de la quimera OspC-B31
(pb 55-633)/OspA-B31 (pb
52-651)/OspA-K48 (pb
652-820) (SEC ID Nº: 61) y la secuencia de la
proteína quimérica codificada (SEC ID Nº: 62).
Las Figuras 34A, 34B y 34C representan la
secuencia de ácido nucleico de la quimera OspC-C2
(pb 55-612)/OspA-B31 (pb
52-651)/OspA-K48 (pb
652-820) (SEC ID Nº: 63) y la secuencia de la
proteína quimérica codificada (SEC ID Nº: 64).
Las Figuras 35A, 35B y 35C representan la
secuencia de ácido nucleico de la quimera OspC-B31
(pb 55-633)/OspA-B31 (pb
52-651)/OspA-Pko (pb
652-820) (SEC ID Nº: 65) y la secuencia de la
proteína quimérica codificada (SEC ID Nº: 66).
Las Figuras 36A, 36B y 36C representan la
secuencia de ácido nucleico de la quimera OspC-C2
(pb 55-612)/OspA-B31 (pb
52-651)/OspA-Pko (pb
652-820) (SEC ID Nº: 67) y la secuencia de la
proteína quimérica codificada (SEC ID Nº: 68).
Las Figuras 37A, 37B y 37C representan la
secuencia de ácido nucleico de la quimera OspC-B31
(pb 55-633)/OspA-K48 (pb
52-654)/OspA-Tro (pb
655-819) (SEC ID Nº: 69) y la secuencia de la
proteína quimérica codificada (SEC ID Nº: 70).
Las Figuras 38A, 38B y 38C representan la
secuencia de ácido nucleico de la quimera OspC-C2
(pb 55-612)/OspA-K48 (pb
52-654)/OspA-Tro (pb
655-819) (SEC ID Nº: 71) y la secuencia de la
proteína quimérica codificada (SEC ID Nº: 72).
Las Figuras 39A, 39B y 39C representan la
secuencia de ácido nucleico de la quimera OspC-C12
(pb 55-612)/OspA-B31 (pb
88-450)/OspA-Pko (pb
451-537)/OspA-B31 (pb
538-822) (SEC ID Nº: 73) y la secuencia de la
proteína quimérica codificada (SEC ID Nº: 74).
Las Figuras 40A, 40B y 40C representan la
secuencia de ácido nucleico de la quimera OspC-Pko
(pb 55-639)/OspA-B31 (pb
88-450)/OspA-Pko (pb
451-537)/OspA-B31 (pb
538-651)/OspA-K48 (pb
652-825) (SEC ID Nº: 75) y la secuencia de la
proteína quimérica codificada (SEC ID Nº: 76).
Las Figuras 41A, 41B y 41C representan la
secuencia de ácido nucleico de la quimera OspC-Tro
(pb 55-624)/OspA-B31 (pb
88-450)/OspA-Pko (pb
451-537)/OspA-B31 (pb
538-651)/OspA-Pko (pb
652-822) (SEC ID Nº: 77) y la secuencia de la
proteína quimérica codificada (SEC ID Nº: 78).
Las Figuras 42A y 42B representan la secuencia
de ácido nucleico de la quimera OspC-B31 (pb
55-633)/OspA-B31 (pb
394-820) (SEC ID Nº: 79) y la secuencia de la
proteína quimérica codificada (SEC ID Nº: 80).
Las Figuras 43A y 43B representan la secuencia
de ácido nucleico de la quimera OspC-B31 (pb
SS-631)/OspA-B31 (pb
394-651)/OspA-K48 (pb
652-820) (SEC ID Nº: 81) y la secuencia de la
proteína quimérica codificada (SEC ID Nº: 82).
Las Figuras 44A y 44B representan la secuencia
de ácido nucleico de la quimera OspC-B31 (pb
55-633)/OspA-B31 (pb
394-651)/OspA-Pko (pb
652-820) (SEC ID Nº: 83) y la secuencia de la
proteína quimérica codificada (SEC ID Nº: 84).
Las Figuras 45A y 45B representan la secuencia
de ácido nucleico de la quimera OspC-B31 (pb
55-633)/OspA-K48 (pb
394-654)/OspA-Tro (pb
655-819) (SEC ID Nº: 85) y la secuencia de la
proteína quimérica codificada (SEC ID Nº: 86).
Las Figuras 46A, 46B y 46C representan la
secuencia de ácido nucleico de la quimera OspC-B31
(pb 55-633)/OspA-B31 (pb
88-450)/OspA-Pko (pb
451-537)/OspA-B31 (pb
541-651)/OspA-Pko (pb
652-822) (SEC ID Nº: 87) y la secuencia de proteína
quimérica codificada (SEC ID Nº: 88).
Las Figuras 47A, 47B y 47C representan la
secuencia de ácido nucleico de la quimera OspC-C2
(pb 55-612)/OspA-B31 (pb
88-450)/OspA-Pko (pb
451-537)/OspA-B31 (pb
541-651)/OspA-Pko (pb
652-822) (SEC ID Nº: 89) y la secuencia de proteína
quimérica codificada (SEC ID Nº: 90).
Las Figuras 48A y 48B representan la secuencia
de ácido nucleico y de la proteína codificada de una OspA modificada
R139M (SEC ID Nº: 95 y 96).
Las Figuras 49A y 49B representan la secuencia
de ácido nucleico y de la proteína codificada de una OspA modificada
E160Y (SEC ID Nº: 97 y 98).
Las Figuras 50A y 50B representan la secuencia
de ácido nucleico y de la proteína codificada de una OspA modificada
R139M y E160Y (SEC ID Nº: 99 y 100).
Las Figuras 51A y 51B representan la secuencia
de ácido nucleico y de la proteína codificada de una OspA modificada
E160Y (SEC ID Nº: 101 y 102).
Las Figuras 52A y 52B representan la secuencia
de ácido nucleico y de la proteína codificada de una OspA modificada
R139M, E160Y y K189M (SEC ID Nº: 103 y 104).
Las Figuras 53A y 53B representan la secuencia
de ácido nucleico y de la proteína codificada de una OspA modificada
Y165F (SEC ID Nº: 105 y 106).
Las Figuras 54A y 54B representan la secuencia
de ácido nucleico y de la proteína codificada de una OspA modificada
Y165F y V166T (SEC ID Nº: 107 y 108).
Las Figuras 55A y 55B representan la secuencia
de ácido nucleico y de la proteína codificada de una OspA modificada
V166T (SEC ID Nº: 109 y 110).
Las Figuras 56A y 56B representan la secuencia
de ácido nucleico y de la proteína codificada de una OspA modificada
V166T y T170K (SEC ID Nº: 111 y 112).
Las Figuras 57A y 57B representan la secuencia
de ácido nucleico y de la proteína codificada de una OspA modificada
Y165F, V166T y T170K (SEC ID Nº: 113 y 114).
Las Figuras 58A y 58B representan la secuencia
de ácido nucleico y de la proteína codificada de una OspA modificada
R139M, E160Y, K189M, Y165F, V166T y T170K (SEC ID Nº: 115 y
116).
La presente invención se refiere a formas
modificadas de OspA de Borrelia burgdorferi que tienen una
estabilidad conformacional aumentada aunque conservan la
antigenicidad, como se indica, por ejemplo, por la capacidad de
unirse al anticuerpo monoclonal LA-2. En algunas
realizaciones, los polipéptidos OspA modificados también tienen una
reactividad cruzada disminuida con hLFA-1. Los
polipéptidos OspA modificados pueden comprender todo (a excepción
de las modificaciones que se describen en este documento) o una
porción, tal como la porción C-terminal, de un
polipéptido OspA de tipo silvestre. Los solicitantes han descubierto
que algunas formas de la proteína OspA, tales como versiones
truncadas de OspA, no desencadenan una respuesta inmunoprotectora
potente cuando se administran a un animal, aun cuando el polipéptido
OspA tiene la secuencia inmunoprotectora del epítope
LA-2.
La estructura de la OspA recombinante se ha
determinado a una resolución de 1,95 \ring{A} en un complejo
binario con el fragmento Fab del mAb184.1 no protector de ratón,
que es reactivo con el extremo terminal de OspA (Li y col., Proc.
Natl. Acad. Sci. USA, 94: 3584-3589 (1997)). El
polipéptido OspA se pliega en 21 hebras \beta antiparalelas
consecutivas seguidas de una hélice \alpha
C-terminal. La estructura se describe
convenientemente como dos dominios plegados separados, un dominio
sándwich N-terminal y un dominio barril
C-terminal, conectados por una larga hoja \beta
central. Se diseña un conjunto de polipéptidos modificados, que se
describen en este documento, para eliminar cargas enterradas y/o
puentes salinos en la porción C-terminal de OspA y
reemplazarlos por restos que promuevan las interacciones
hidrófobas.
Por consiguiente, en una realización, los
polipéptidos OspA modificados de la presente invención comprenden
una proteína o polipéptidos OspA modificados de Borrelia
burgdorferi desde aproximadamente el resto 139 hasta
aproximadamente el resto 273, en los que la secuencia incluye todas
las modificaciones seleccionadas del grupo constituido por: resto
139 cambiado por metionina, resto 160 cambiado por tirosina y resto
189 cambiado por metionina. La numeración de los restos se
corresponde con la numeración de la SEC ID Nº: 7. El polipéptido
OspA modificado tiene una metionina en el resto de la posición 139,
una tirosina en el resto de la posición 160 y una metionina en el
resto de la posición 189. En otras realizaciones, los polipéptidos
OspA modificados tienen tanto una estabilidad conformacional
aumentada como una reactividad cruzada reducida con la proteína
hLFA-1.
Para las modificaciones en las posiciones 139,
160 y 189, la secuencia de OspA modificada puede ser de cualquier
cepa de borreliosis de Lyme de Borrelia burgdorferi, tal como
las cepas de Borrelia burgdorferi sensu stricto, Borrelia
afzelii y Borrelia garinii. Los especialistas en la
técnica conocen bien las cepas de Borrelia burgdorferi. Por
ejemplo, las cepas de Borrelia burgdorferi sensu stricto
incluyen a B31, las cepas de Borrelia afzelii incluyen a
Pgau y Pko y las cepas de Borrelia garinii incluyen a
K48.
El polipéptido OspA modificado incluye todas las
modificaciones que se describen en este documento. En esta
realización, el polipéptido OspA modificado tiene una metionina en
el resto de la posición 139, una tirosina en el resto de la
posición 160, un metionina en el resto de la posición 189, una
fenilalanina en el resto de la posición 165, una treonina en el
resto de la posición 166 y una lisina en el resto de la posición
170.
Esta invención también se refiere a polipéptidos
que comprenden las SEC ID Nº: 104 ó 116. Los polipéptidos OspA
modificados de la invención pueden estar parcialmente o
sustancialmente purificados (por ejemplo, purificados hasta la
homogeneidad) y/o sustancialmente libres de otras proteínas.
La presente invención también se refiere a
polinucleótidos que codifican las secuencias de aminoácidos que se
describen en este documento. Como se define en este documento, el
término "polinucleótido" se refiere a un multímero u oligómero
de nucleótidos que está compuesto por desoxirribonucleótidos o
ribonucleótidos, o por una combinación de los mismos, que tiene
desde pocos, por ejemplo, 2-20, hasta muchos, por
ejemplo, de 20 a varios miles o más, nucleótidos. Y así, los
polinucleótidos incluyen ácidos nucleicos de cualquier longitud e
incluyen además oligonucleótidos y polinucleótidos tanto de origen
natural como sintéticos.
Los polinucleótidos de la presente invención
incluyen polinucleótidos que codifican polipéptidos OspA de
Borrelia burgdorferi desde aproximadamente el resto 139
hasta aproximadamente el resto 189, en los que la secuencia
codifica todas las modificaciones seleccionadas del grupo
constituido por: codón 139 que codifica metionina, codón 160 que
codifica tirosina, codón 189 que codifica metionina y combinaciones
de los mismos. La numeración de los restos se corresponde con la
numeración de la SEC ID Nº: 7. Como se ha descrito anteriormente
para los polipéptidos, en el caso de las modificaciones en las
posiciones 139, 160 y 189, el polinucleótido que codifica la
secuencia OspA modificada puede ser de cualquier cepa de borreliosis
de Lyme de Borrelia burgdorferi.
Los polinucleótidos de la presente invención
incluyen polinucleótidos seleccionados del grupo constituido por
las SEC ID Nº: 103 y 115.
Los polipéptidos OspA modificados de la presente
invención pueden obtenerse a partir de moléculas de OspA que
comprenden fragmentos, derivados, análogos, variantes y mutantes de
la proteína OspA (OspA modificada) o pueden fragmentarse,
derivatizarse o modificarse de otra forma después de insertarse las
modificaciones que se describen en este documento. Estas moléculas
de OspA modificadas poseen la actividad antigénica de OspA.
La presente invención también se refiere a un
procedimiento para generar un polipéptido OspA de Borrelia
burgdorferi modificado con una estabilidad conformacional
aumentada, en comparación con el polipéptido OspA de
Borrelia burgdorferi no modificado correspondiente. El
procedimiento comprende seleccionar un polinucleótido que codifica
un polipéptido OspA de Borrelia burgdorferi que
incluye los restos 139, 160 y 189, en el que la numeración se
corresponde con la numeración de la SEC ID Nº: 7. El polinucleótido
se modifica de tal modo que el resto 139 es metionina, el resto 160
es tirosina y el resto 189 es metionina. El polinucleótido
modificado se expresa, generando de este modo un polipéptido OspA de
Borrelia burgdorferi modificado con una estabilidad
conformacional aumentada, en comparación con el polipéptido OspA de
Borrelia burgdorferi no modificado correspondiente.
Se describen, a continuación y en la Ejemplificación, procedimientos
para modificar un polinucleótido y que conocen bien los
especialistas en la técnica. También se describen, a continuación y
en la Ejemplificación, procedimientos para expresar los polipéptidos
modificados de la invención y que conocen bien los especialistas en
la técnica.
Se han implicado los restos
165-173 de la hebra \beta 13 de OspA en la
inducción de la artritis relacionada con Lyme (Gross D. M. y col.,
Science 181: 703-706 (1998)). Esta región tiene
homología con los restos 332-340 de
hLFA-1, sugiriendo que esta proteína tiene una
reactividad cruzada con el epítope de células T
(YVLEGTLTA-B31 (SEC ID Nº: 129) y
YVIEGTSKQ-hLFA-1 (SEC ID Nº: 130),
respectivamente). Aunque generalmente se piensa que B.
burgdorferi sensu stricto es más artritogénica que otras
cepas de Borrelia, un estudio reciente de alelos de
ospA en líquido sinovial de pacientes con artritis de Lyme
indica que B. garinii y B. afzelii también pueden
causar artritis (Eiffert, L. F. y col., Scand. J. Infect. Dic. 30:
265-268 (1998)).
Una manera de eliminar la secuencia con
reactividad cruzada es reemplazar la región
\beta-13 de OspA-B31 (YVLEGTLTA
(SEC ID Nº: 129)) por una región análoga de una cepa que no posea la
misma secuencia, tal como la de una cepa de B. Afzelii, por
ejemplo, Pgau o Pko (Solicitud de Patente de Estados Unidos titulada
"Recombinant Constructs of Borrelia burgdorferi" por
Luft y col., presentada el 7 de agosto de 2001, cuyas
enseñanzas se incorporan en este documento como referencia en su
totalidad).
En otra realización, se genera un polipéptido
OspA modificado que tiene una reactividad cruzada reducida con
hLFA-1, aunque conserva la capacidad de unirse a
LA-2. En esa realización, por ejemplo, el resto 130
es metionina, el resto 160 es tirosina, el resto 165 es
fenilalanina, el resto 166 es treonina, el resto 170 es lisina y el
resto 189 es metionina. Pueden seleccionarse polinucleótidos que
codifican polipéptidos OspA de Borrelia burgdorferi,
como se describe en este documento.
En una realización, el polipéptido OspA
modificado incluye la secuencia mínima, que incluye las posiciones
de las modificaciones. Por ejemplo, el polipéptido modificado puede
comprender una OspA desde aproximadamente el resto 139 hasta
aproximadamente el resto 189, en la que la numeración se corresponde
con la SEC ID Nº: 7. Los polipéptidos OspA modificados de la
presente invención también incluyen fragmentos mayores de OspA. Por
ejemplo, los polipéptidos OspA modificados incluyen, pero sin
limitación, polipéptidos OspA modificados que comprenden una OspA
desde aproximadamente el resto 160 hasta aproximadamente el resto
170, una OspA desde aproximadamente el resto 150 hasta el 180, una
OspA desde aproximadamente el resto 131 hasta el 273 o una OspA
desde aproximadamente el resto 17 hasta el 273. A continuación se
describen procedimientos para generar y expresar fragmentos de
tamaño variable de OspA, que incorporan una o más de las
modificaciones que se describen en este documento, y que conocen
bien los especialistas en la técnica.
Como se describe en este documento, la secuencia
de OspA que se usa para generar el polipéptido OspA modificado
puede ser un polipéptido OspA quimérico en sí, que tenga dos o más
segmentos obtenidos a partir de proteínas OspA de diferentes
genoespecies o cepas de Borrelia. El tamaño del polipéptido
OspA modificado puede variar dependiendo del procedimiento usado
para generar el polipéptido modificado y/o del propósito para el que
se genera, y dichos polipéptidos OspA quiméricos modificados pueden
incluir fragmentos de OspA. El polipéptido modificado puede ser una
parte de un polipéptido más grande, incluyendo secuencias de OspA
adicionales en el extremo N-terminal, el extremo
C-terminal o en ambos extremos. Un fragmento de una
proteína OspA puede incluir polipéptidos que sean solamente una
parte de la proteína OspA de longitud completa. Dichos fragmentos
de OspA incluyen, típicamente, al menos uno de los restos
modificados que se describen en este documento y poseen al menos
parte de la antigenicidad de la OspA de tipo silvestre. Pueden
producirse fragmentos de OspA mediante deleciones amino y/o
carboxilo terminales, así como mediante deleciones internas. También
pueden producirse fragmentos mediante digestión enzimática. Tales
moléculas de OspA modificadas pueden ensayarse para determinar su
actividad antigénica, como se describe en este documento o usando
procedimientos conocidos en la técnica.
En algunas realizaciones, el polipéptido OspA
modificado puede ser parte de una combinación con una o más de
otras proteínas, tales como otros polipéptidos de Borrelia
burgdorferi, incluyendo, pero sin limitación, OspA, OspB, OspC,
OspD, p93 y p41. En otras realizaciones el polipéptido OspA
modificado puede ser parte de una molécula más grande, tal como un
polipéptido quimérico, por ejemplo, como se describe en la Patente
de Estados Unidos Nº 6.248.562 y en la Solicitud de Patente de
Estados Unidos titulada "Recombinant Constructs of Borrelia
burgdorferi" por Luft y col., presentada el 7 de agosto de
2001. Dichos polipéptidos más grandes pueden incluir secuencias de
aminoácidos de otras proteínas incluyendo, pero sin limitación,
otras proteínas de Borrelia burgdorferi y/o otras proteínas
útiles para generar proteínas de fusión para procedimientos de
vacunas y/o de inmunodiagnóstico. Pueden incorporarse componentes
adicionales, por ejemplo, marcadores (un radioisótopo, un marcador
de epítope (señal) (por ejemplo, un epítope de hemaglutinina (HA) o
una señal de hexahistidina), un marcador de afinidad (por ejemplo,
biotina o avidina), un marcador de espín, un marcador enzimático,
un grupo fluorescente o un grupo quimioluminiscente), en los
polipéptidos OspA modificados de la invención, para facilitar el
aislamiento y/o la purificación del polipéptido. Por ejemplo, una
señal de hexahistidina permite una fácil purificación mediante
cromatografía de níquel. Estos y otros componentes pueden
incorporarse también en los polipéptidos OspA modificados de la
invención para aumentar la semivida de los polipéptidos. Los
especialistas en la técnica conocen bien procedimientos para
incorporar dichos componentes en los polipéptidos de la
invención.
En una realización, el polipéptido OspA
modificado de la invención es un polipéptido quimérico. En una
realización particular, el polipéptido OspA modificado comprende lo
siguiente: a) una secuencia de aminoácidos de un primer polipéptido
OspA desde aproximadamente el resto 1 hasta aproximadamente el resto
164 de una primera cepa de Borrelia burgdorferi; b) una
secuencia de aminoácidos de un segundo polipéptido OspA desde
aproximadamente el resto 165 hasta aproximadamente el resto 179 de
una segunda cepa de Borrelia burgdorferi, en la que dicha
segunda cepa es una cepa diferente de dicha primera cepa; c) una
secuencia de aminoácidos de un tercer polipéptido OspA desde
aproximadamente el resto 180 hasta aproximadamente el resto 216 de
una tercera cepa de Borrelia burgdorferi, en la que dicha
tercera cepa es una cepa diferente de dicha segunda cepa; d) una
secuencia de aminoácidos de un cuarto polipéptido OspA desde
aproximadamente el resto 217 hasta aproximadamente el resto 273 de
una cuarta cepa de Borrelia burgdorferi, en la que dicha
cuarta cepa es una cepa diferente de dicha tercera cepa; en el que
la secuencia incluye todas las modificaciones seleccionadas del
grupo constituido por el resto 139 que es metionina, el resto 160
que es tirosina, el resto 189 que es metionina y combinaciones de
los mismos, en el que la numeración se corresponde con la numeración
de la SEC ID Nº: 7.
Los polipéptidos que se describen en este
documento pueden aislarse a partir de fuentes de origen natural,
sintetizarse químicamente o producirse de manera recombinante. Los
polipéptidos OspA modificados de la presente invención pueden
obtenerse a partir de moléculas de OspA de origen natural o a partir
de ácidos nucleicos que codifican dichas moléculas. Los
polipéptidos OspA de la presente invención pueden comprender
fragmentos, derivados, análogos, variantes y mutantes de una
proteína OspA (OspA modificada) y/o pueden fragmentarse,
derivatizarse o modificarse de otra forma después de insertarse las
modificaciones que se describen en este documento (también
denominadas como OspA modificadas). Dichas moléculas de OspA
modificadas poseen al menos cierta actividad antigénica de OspA. De
acuerdo con la invención, la secuencia de aminoácidos de los
polipéptidos OspA modificados de la invención puede ser la de una
proteína de origen natural o puede comprender modificaciones
adicionales. Dichas modificaciones adicionales incluyen
sustituciones de aminoácidos conservativas y/o no conservativas,
adiciones de uno o más aminoácidos y/o deleciones de uno o más
aminoácidos. Dichas modificaciones adicionales conservarán también
al menos cierta actividad de la proteína o polipéptido codificado.
Por ejemplo, el polipéptido o proteína modificado tendrá
adicionalmente una estabilidad conformacional similar o mejorada,
una actividad inmunoprotectora similar o mejorada o una reactividad
cruzada reducida con hLFA-1, en comparación con el
polipéptido OspA modificado correspondiente (es decir, el
polipéptido OspA que comprende una o más de las modificaciones que
se describen en este documento pero que no comprende la modificación
o modificaciones adicionales).
Por ejemplo, la modificación o modificaciones
adicionales, preferiblemente, conservan la configuración
tridimensional de un sitio de unión a anticuerpo de la proteína
nativa, tal como el sitio de unión a LA-2. La
presencia o ausencia de actividad o actividades biológicas puede
determinarse mediante diversos ensayos funcionales, como se
describe en este documento, o usando los procedimientos que se
conocen en la técnica, por ejemplo, el reconocimiento usando un
ensayo de ELISA o el desencadenamiento de una respuesta inmune (por
ejemplo, una respuesta inmunoprotectora) en un animal. Pueden
realizarse modificaciones de aminoácidos apropiadas, que se incluyen
dentro del alcance de la invención, en base a varios criterios que
incluyen hidrofobicidad, carácter básico o ácido, carga, polaridad,
tamaño, presencia o ausencia de un grupo funcional (por ejemplo, -SH
o un sitio de glicosilación) y carácter aromático, con tal de que
la molécula resultante tenga al menos una de las modificaciones que
se describen en este documento y conserve una estabilidad
conformacional aumentada y/o una reactividad cruzada reducida con
hLFA-1. La asignación de diversos aminoácidos a
grupos similares en base a las propiedades anteriores será
fácilmente evidente para el especialista; también pueden encontrarse
cambios de aminoácidos apropiados adicionales en Bowie (Science,
247: 1306-1310 (1990)).
Pueden generarse "variantes" y
"mutantes" de OspA usando técnicas in vitro y/o
in vivo bien conocidas por los especialistas en la técnica,
por ejemplo, la mutagénesis específica de sitio y la mutagénesis con
oligonucleótidos. También pueden realizarse manipulaciones de la
secuencia polipeptídica de OspA a nivel proteico. Pueden realizarse
modificaciones químicas usando técnicas conocidas incluyendo, pero
sin limitación, la escisión química específica usando bromuro de
cianógeno, tripsina y/o papaína. La OspA también puede modificarse
estructuralmente y/o desnaturalizarse, por ejemplo, usando calor.
En general, las mutaciones pueden ser sustituciones de aminoácidos
conservativas o no conservativas, inserciones de aminoácidos o
deleciones de aminoácidos.
Por ejemplo, puede prepararse un ácido nucleico
(por ejemplo, ADN) que codifica un polipéptido OspA modificado
mediante mutagénesis dirigida del ácido nucleico (por ejemplo, ADN)
que codifica una OspA de tipo silvestre. La mutagénesis dirigida
(específica de sitio) permite la producción de variantes de OspA
mediante el uso de secuencias oligonucleotídicas específicas que
codifican la secuencia de ADN de la mutación deseada (por ejemplo,
modificación, deleción o inserción), así como un número suficiente
de nucleótidos adyacentes para proporcionar una secuencia de un
cebador de tamaño y complejidad de secuencia suficientes para formar
un dúplex estable a ambos lados de la mutación deseada.
Típicamente, se prefiere un cebador de aproximadamente 20 a 25
nucleótidos de longitud, con aproximadamente 5 a 10 restos
complementarios a ambos lados de la mutación de la secuencia que se
modifica. En general, las técnicas de mutagénesis dirigida se
conocen bien en la técnica, como se ejemplifican en publicaciones
tales como Edelman y col., DNA, 2: 183, 1983. Por ejemplo, una
técnica de mutagénesis específica de sitio puede emplear un vector
de fago que exista en forma tanto monocatenaria como bicatenaria.
Los vectores típicos útiles en la mutagénesis dirigida incluyen
vectores tales como el fago M13, por ejemplo, como se describe en
Messing y col., Third Cleveland Symposium on Macromolecules and
Recombinant DNA, A. Walton, ed., Elsevier, Ámsterdam, 1981. Éste y
otros vectores de fagos están disponibles en el mercado y los
especialistas en la técnica conocen bien su uso. Un procedimiento
versátil y eficaz para la producción de mutaciones específicas de
sitio dirigidas con oligonucleótidos en fragmentos de ADN, usando
vectores derivados de M13, se publicó en Zoller, M. J. y Smith, M.,
Nucleic Acids Res., 10: 6487-6500, 1982. Además,
pueden emplearse vectores plasmídicos que contienen un origen de
replicación de fago monocatenario para obtener ADN monocatenario
(véase, por ejemplo, Veira y col., Meth Enzymol., 153: 3
(1987)).
Como alternativa, pueden introducirse
sustituciones de nucleótidos mediante la síntesis del fragmento de
ADN apropiado in vitro y su amplificación usando
procedimientos de PCR conocidos en la técnica.
En general, la mutagénesis específica de sitio
puede realizarse mediante la obtención, en primer lugar, de un
vector monocatenario que incluye dentro de su secuencia una
secuencia de ADN que codifica la proteína pertinente. Se prepara un
oligonucleótido cebador que lleva la secuencia mutada deseada,
generalmente, de forma sintética, por ejemplo, mediante el
procedimiento de Crea y col., Proc Natl Acad Sci USA., 75: 5765,
1978. Después, este cebador puede hibridarse con el vector
monocatenario que contiene la secuencia de la proteína y someterse
a enzimas de polimerización del ADN, por ejemplo, al fragmento
Klenow de la polimerasa I de E. coli, para completar la
síntesis de la hebra que lleva la mutación. De este modo, se forma
un heterodúplex en el que una hebra codifica la secuencia original
no mutada y la segunda hebra lleva la mutación deseada. Después,
este vector de heterodúplex puede usarse para transformar células
huésped apropiadas, tales como células JM 101, y pueden
seleccionarse los clones que incluyan los vectores recombinantes que
lleven la disposición de la secuencia mutada. A partir de entonces,
la región mutada puede eliminarse y colocarse en un vector de
expresión apropiado para la producción de la proteína.
La técnica de PCR puede usarse para generar
variantes de la secuencia de aminoácidos de OspA. Cuando se usan
pequeñas cantidades de molde de ADN como material de partida en una
PCR, pueden usarse cebadores que difieran ligeramente en la
secuencia de la región correspondiente en un molde de ADN, para
generar cantidades relativamente grandes de un fragmento de ADN
específico que difiera de la secuencia molde solamente en las
posiciones en las que los cebadores difieran del molde. Para la
introducción de una mutación en un plásmido de ADN, uno de los
cebadores puede diseñarse para que solape con la posición de la
mutación y para que contenga la mutación; la secuencia del otro
cebador es preferiblemente idéntica a una extensión de secuencia de
la hebra opuesta del plásmido, pero esta secuencia puede
localizarse en cualquier región del plásmido de ADN. Sin embargo,
se prefiere que la secuencia del segundo cebador se localice dentro
de los 500 nucleótidos siguientes a la del primero, de tal modo que
al final pueda secuenciarse fácilmente la región de ADN completa
amplificada que se une a los cebadores. La amplificación por PCR,
usando una pareja de cebadores como la que se acaba de describir,
da como resultado una población de fragmentos de ADN que difieren en
la posición final de la mutación determinada por el cebador.
Los fragmentos de ADN producidos que llevan la
mutación deseada pueden usarse para reemplazar a la región
correspondiente en el plásmido que sirvió como molde de PCR, usando
tecnología de ADN convencional. Pueden introducirse simultáneamente
mutaciones en posiciones diferentes mediante el uso de un segundo
cebador mutante o la realización de una segunda PCR con cebadores
mutantes diferentes y la ligación de los dos fragmentos de PCR
resultantes simultáneamente en el fragmento de vector, en una
ligación de tres (o más) partes.
Un procedimiento adicional para preparar
variantes, la mutagénesis con casete, se basa en la técnica descrita
por Wells y col., Gene, 34: 315, 1985. El material de partida puede
ser el plásmido (o vector) que comprende el ADN de OspA a mutar. Se
identifican el codón o codones dentro de la OspA a mutar. Tienen que
existir sitios de endonucleasas de restricción únicos a cada lado
del sitio o sitios de mutación identificados. Si no existen dichos
sitios de restricción, pueden generarse usando el procedimiento de
mutagénesis mediada por oligonucleótidos descrito anteriormente
para introducirlos en localizaciones apropiadas del ADN de OspA, o
pueden generarse usando PCR y los cebadores deseados, como se
describe en la Ejemplificación. Después de que se hayan introducido
los sitios de restricción en el plásmido, el plásmido se corta en
estos sitios para linealizarlo. Se sintetiza un oligonucleótido
bicatenario, que codifica la secuencia del ADN entre los sitios de
restricción, pero que contiene la mutación o mutaciones deseadas,
usando procedimientos convencionales. Las dos hebras se sintetizan
por separado y después se hibridan juntas usando técnicas
convencionales. Este oligonucleótido bicatenario se denomina
casete. Este casete se diseña para que tenga extremos 3' y 5' que
sean compatibles con los extremos del plásmido linealizado, de tal
modo que pueda ligarse directamente con el plásmido. El plásmido
contiene ahora la secuencia de ADN de la OspA mutada y puede
subclonarse y/o expresarse para producir el polipéptido o la
proteína OspA modificada.
Las moléculas de ácido nucleico que codifican
una OspA (por ejemplo, polinucleótidos) de la presente invención
tienen al menos una de las modificaciones que se describen en este
documento y, generalmente, hibridan en condiciones de hibridación
de alta rigurosidad con un ácido nucleico de OspA que codifica un
polinucleótido, o con un fragmento del mismo, de una cepa sensu
stricto de Borrelia burgdorferi, por ejemplo, la SEC ID
Nº: 7. En una realización, las moléculas de ácido nucleico que
codifican OspA (por ejemplo, polinucleótidos) de la presente
invención hibridan en condiciones de hibridación de alta rigurosidad
con un polinucleótido que codifica una OspA, o con un fragmento del
mismo, de Borrelia afzelii, por ejemplo, la SEC ID Nº: 10.
En otra realización, las moléculas de ácido nucleico que codifican
una OspA (por ejemplo, polinucleótidos) de la presente invención
hibridan en condiciones de hibridación de alta rigurosidad con un
polinucleótido que codifica una OspA, o con un fragmento del mismo,
de Borrelia garinii, por ejemplo, la SEC ID Nº: 8. Por lo
tanto, los polinucleótidos y polipéptidos de la presente invención
incluyen versiones modificadas de OspA, como se describe en este
documento.
Los especialistas en la técnica conocen bien las
condiciones de rigurosidad selectivas apropiadas, o pueden
encontrarse en textos convencionales tales como Current Protocols in
Molecular Biology, John Wiley & Sons, N. Y. (1989),
6.3.1-6.3.6. Por ejemplo, las condiciones de
hibridación rigurosas incluyen una concentración de ión sodio de no
más de 1 M y una temperatura de al menos 25ºC. En una realización,
son adecuadas para la hibridación específica condiciones de SSPE 5X
(NaCl 750 nM, fosfato de Na 50 mM, EDTA 5 mM, pH 7,4) y una
temperatura de 25-30ºC, o condiciones equivalentes.
Pueden determinarse condiciones equivalentes mediante la variación
de uno o más de los parámetros, como se conoce en la técnica,
mientras que se mantenga un grado similar de identidad o de
similitud entre la molécula de ácido nucleico diana y el cebador o
sonda usada. Las moléculas de ácido nucleico capaces de hibridar
son útiles como sondas y cebadores para aplicaciones
diagnósticas.
Por consiguiente, la invención se refiere a
moléculas de ácido nucleico que tienen una identidad considerable
con las moléculas de ácido nucleico que codifican los polipéptidos
OspA modificados que se describen en este documento, en las que el
ácido nucleico codifica una o más de las modificaciones que se
describen en este documento; se prefieren particularmente moléculas
de ácido nucleico que tengan al menos aproximadamente el 90%, más
preferiblemente, al menos aproximadamente el 95% y, más
preferiblemente, al menos aproximadamente el 98% de identidad con
las moléculas de ácido nucleico que se describen en este documento,
en las que el ácido nucleico codifica al menos una de las
modificaciones que se describen en este documento. La identidad de
secuencia puede determinarse usando algoritmos de alineamiento de
secuencias disponibles públicamente o en el mercado, usando, por
ejemplo, los parámetros por defecto.
Por lo tanto, se incluyen en la presente
invención moléculas de ADN que comprenden una secuencia que es
diferente de la molécula de ácido nucleico de origen natural pero
que, debido a la degeneración del código genético, codifica la
misma proteína o polipéptido. La invención también incluye
variaciones de las moléculas de ácido nucleico de la invención,
tales como las porciones, análogos o derivados codificantes de la
proteína o polipéptido codificado. Dichas variaciones pueden ser de
origen natural, como en el caso de la variación alélica, o de
origen no natural, como las inducidas por diversos mutágenos y
procedimientos mutágenos, siempre que la molécula de ácido nucleico
codifique al menos una de las modificaciones que se describen en
este documento y que la proteína codificada tenga una estabilidad
conformacional aumentada y/o una reactividad cruzada disminuida con
hLFA-1 (en comparación con la proteína no modificada
correspondiente), que se confieren mediante las modificaciones que
se describen en este documento. Las variaciones que se pretenden
incluyen, pero sin limitación, la adición, deleción y/o sustitución
de uno o más nucleótidos, que pueden dar como resultado cambios de
aminoácidos conservativos o no conservativos, incluyendo adiciones
y deleciones. Preferiblemente, dichas variaciones de nucleótidos o
aminoácidos son silenciosas; es decir, no alteran una o más
características o la actividad de la proteína o polipéptido OspA
modificado codificado. Como se usan en este documento, las
actividades de la proteína o polipéptido codificado incluyen, pero
sin limitación, la función de unión, la función antigénica y la
estabilidad conformacional.
La invención también proporciona vectores de
expresión que contienen una secuencia de ácido nucleico que se
describe en este documento, unida operativamente con al menos una
secuencia reguladora. Muchos de dichos vectores están disponibles
en el mercado, y otros vectores adecuados pueden prepararse
fácilmente por el especialista. Se pretende que la expresión
"unida operativamente" signifique que la molécula de ácido
nucleico está unida a una secuencia reguladora de tal modo que
permite la expresión de la secuencia de ácido nucleico. Las
secuencias reguladoras están reconocidas en la técnica y se
seleccionan para producir el polipéptido o la proteína codificada.
Por consiguiente, el término "secuencia reguladora" incluye
promotores, potenciadores y otros elementos de control de la
expresión que se describen en Goeddel, Gene Expression Technology:
Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990).
Por ejemplo, pueden emplearse las secuencias nativas reguladoras o
las secuencias reguladoras nativas de la célula huésped
transformada. Se entenderá que el diseño del vector de expresión
puede depender de factores como la selección de la célula huésped a
transformar y/o el tipo de proteína que se desea expresar. Por
ejemplo, los polipéptidos de la presente invención pueden producirse
mediante la ligación del gen clonado, o de una porción del mismo,
en un vector adecuado para la expresión en células procariotas,
células eucariotas o ambas (véase, por ejemplo, Broach, y col.,
Experimental Manipulation of Gene Expression, ed. M. Inouye
(Academic Press, 1983), pág. 83; Molecular Cloning: A Laboratory
Manual, 2ª Ed., ed. Sambrook y col., (Cold Spring Harbor Laboratory
Press, 1989), Capítulos 16 y 17). Típicamente, las construcciones de
expresión contienen uno o más marcadores de selección, incluyendo,
pero sin limitación, el gen que codifica la dihidrofolato reductasa
y los genes que confieren resistencia a neomicina, tetraciclina,
ampicilina, cloranfenicol, kanamicina o estreptomicina.
También se proporcionan en esta invención
células huésped procariotas y eucariotas transfectadas por los
vectores descritos. Por ejemplo, las células que pueden
transfectarse con los vectores de la presente invención incluyen,
pero sin limitación, células bacterianas tales como E. coli
(por ejemplo, cepas K12, BL21 y DH5\alpha de E. coli),
Streptomyces, Pseudomonas, Serratia
marcescens y Salmonella typhimurium, células
de insecto (baculovirus) incluyendo Drosophila, células
fúngicas tales como células de levadura, células de planta y
células de mamífero, tales como timocitos, células de ovario de
hámster chino (CHO) y células COS.
Por lo tanto, una molécula de ácido nucleico que
comprende, por ejemplo, la SEC ID Nº: 6 con al menos una de las
modificaciones específicas que se describen en este documento, o una
molécula de ácido nucleico que codifica, por ejemplo, la SEC ID Nº:
7 con al menos una de las modificaciones específicas que se
describen en este documento, pueden usarse para producir una forma
recombinante de la proteína mediante procedimientos celulares
microbianos o eucariotas. La ligación de la molécula de ácido
nucleico (por ejemplo, un polinucleótido) en una construcción
génica, tal como un vector de expresión, y la transformación o
transfección en huéspedes, ya sean eucariotas (levaduras, aves,
insectos, plantas o mamíferos) o procariotas (células bacterianas),
son procedimientos convencionales usados en la producción de otras
proteínas bien conocidas. Pueden emplearse procedimientos
similares, o modificaciones de los mismos, para preparar proteínas
recombinantes de acuerdo con la presente invención por medios
microbianos o de tecnología de cultivo tisular. Por consiguiente, la
invención se refiere a la producción de proteínas o polipéptidos
codificados mediante tecnología recombinante.
Las proteínas y polipéptidos de la presente
invención pueden aislarse o purificarse (por ejemplo, hasta la
homogeneidad) a partir de un cultivo de células recombinantes
mediante una diversidad de procedimientos. Éstos incluyen, pero sin
limitación, cromatografía de intercambio aniónico o catiónico,
precipitación con etanol, cromatografía de afinidad y cromatografía
líquida de alto rendimiento (HPLC). El procedimiento usado en
particular dependerá de las propiedades del polipéptido y de la
selección de la célula huésped; los procedimientos apropiados serán
fácilmente evidentes para los especialistas en la técnica.
La presente invención también se refiere a
composiciones farmacéuticas que comprenden polipéptidos y otros
compuestos que se describen en este documento. Por ejemplo, un
polipéptido o proteína de la presente invención puede formularse
con un medio fisiológicamente aceptable para preparar una
composición farmacéutica. El medio fisiológico en particular puede
incluir, pero sin limitación, agua, solución salina tamponada,
polioles (por ejemplo, glicerol, propilenglicol o polietilenglicol
líquido) y soluciones de dextrosa. La concentración óptima del
ingrediente o ingredientes activos en el medio seleccionado puede
determinarse empíricamente, de acuerdo con procedimientos bien
conocidos, y dependerá en última instancia de la formulación
farmacéutica deseada. Los procedimientos para la introducción de
polipéptidos exógenos en el sitio de tratamiento incluyen, pero sin
limitación, la administración por vía intradérmica, intramuscular,
intraperitoneal, intravenosa, subcutánea, oral e intranasal. Otros
procedimientos adecuados para la introducción también pueden incluir
terapia génica, dispositivos recargables o biodegradables y
dispositivos poliméricos de liberación lenta. Las composiciones
farmacéuticas de esta invención también pueden administrarse como
parte de una terapia de combinación con otros agentes.
Las proteínas OspA modificadas que se describen
en este documento pueden producirse de tal modo que sean altamente
solubles, se hiperproduzcan en E. coli y no se
lipiden. Además, las proteínas OspA modificadas pueden diseñarse
para que comiencen o terminen con una señal de afinidad adecuada
(por ejemplo, una señal His) para facilitar la purificación. Las
proteínas recombinantes que se describen en este documento se han
construido para que mantengan altos niveles de antigenicidad y una
estabilidad conformacional mejorada.
Las proteínas OspA modificadas de la presente
invención son ventajosas por el hecho de que conservan al menos
cierta reactividad específica contra anticuerpos monoclonales y/o
policlonales contra proteínas de Borrelia de tipo silvestre,
son inmunógenas e inhiben el crecimiento o inducen la lisis de
Borrelia in vitro. Las proteínas son particularmente útiles
en ensayos inmunodiagnósticos. Por ejemplo, pueden usarse proteínas
de la presente invención como reactivos en ensayos para detectar la
presencia de anticuerpos contra Borrelia nativa en
individuos potencialmente infectados. Estas proteínas también pueden
usarse como reactivos inmunodiagnósticos, tal como en
transferencias puntuales, transferencias de Western, ensayos
inmunoabsorbentes ligados a enzimas o ensayos de aglutinación. Las
proteínas OspA modificadas de la presente invención pueden
producirse mediante técnicas conocidas, tal como mediante
metodología recombinante, reacción en cadena de la polimerasa o
mutagénesis.
Además, las proteínas de la presente invención
son útiles como inmunógenos de vacunas contra la infección por
Borrelia. Una o más de las proteínas modificadas pueden
combinarse con un vehículo fisiológicamente aceptable y
administrarse a un animal vertebrado mediante procedimientos
convencionales (por ejemplo, por vía intravenosa o
intramuscular).
Las formas modificadas de las proteínas OspA que
se describen en este documento se obtuvieron mediante ingeniería
genética, de tal modo que se mantuviera al menos un dominio
inmunoprotector de la proteína. Como se describe en este documento,
el término "antigénico" se refiere a la capacidad de un
compuesto de unirse a productos de una respuesta inmune, tales como
anticuerpos, receptores de células T o ambos. Dichas respuestas
pueden medirse usando ensayos de detección de anticuerpos
convencionales, tales como ensayos de ELISA o de activación de
células T convencionales. En una realización preferida, las formas
modificadas de OspA que se describen en este documento desencadenan
una respuesta inmunoprotectora, por ejemplo, mediante la producción
de anticuerpos que reconocen el epítope LA-2.
Se entiende que los ácidos nucleicos que
codifican los polipéptidos que comprenden la proteína OspA
modificada pueden incluir nucleótidos adicionales o menos
nucleótidos para simplificar la construcción del gen que codifica
el polipéptido quimérico, por ejemplo, para permitir el uso de
sitios de endonucleasas de restricción convenientes o para permitir
la ligación de fragmentos génicos de tal modo que se genere una
región codificante contigua. Basándose en las directrices
proporcionadas en este documento, un especialista en la técnica será
fácilmente capaz de añadir o eliminar nucleótidos de los extremos
de los fragmentos génicos que codifican los polipéptidos de la
proteína OspA, para generar las proteínas OspA modificadas de la
presente invención sin experimentación o usando sólo una
experimentación de rutina. Los polipéptidos OspA modificados de la
presente invención pueden lipidarse o no lipidarse.
Para analizar la antigenicidad de los
polipéptidos OspA modificados, pueden inmunizarse ratones con
polipéptidos o proteínas OspA que contienen la secuencias
polipeptídicas en hidróxido de aluminio. Después, se extrae sangre
de los ratones y se ensaya para determinar las respuestas de
anticuerpos contra OspA obtenidas a partir de diversas cepas de
Borrelia. En experimentos adicionales, estos ratones
inmunizados pueden exponerse a garrapatas infectadas con
Borrelia burgdorferi y puede evaluarse la transmisión de la
infección, como se describe en la Ejemplificación, usando moléculas
de OspA, OspC y OspC/OspA quiméricas. Los resultados de dicha
exposición a garrapatas revelan si el animal ha desarrollado una
respuesta inmune protectora. Por ejemplo, un animal inmunizado, que
no seroconvierte en respuesta a una exposición a garrapatas
posterior, probablemente ha generado una respuesta inmunoprotectora
a la inmunización.
Las composiciones inmunogénicas de la presente
invención pueden usarse para inmunizar animales, incluyendo seres
humanos. Se entiende por inmunización desencadenar respuestas
inmunogénicas específicas, preferiblemente respuestas
inmunoprotectoras, como se ha descrito anteriormente. Como se
describe en este documento, una respuesta inmunogénica incluye
respuestas que dan como resultado al menos cierto nivel de respuesta
inmune en el animal tratado, en la que el animal se había tratado
previamente con una composición que comprendía al menos un
polipéptido OspA modificado de la presente invención.
La inmunidad, como se describe en este
documento, se entiende que se refiere a la capacidad del animal
tratado de resistir a la infección, de resistir a la infección
sistémica o de superar una infección, tal como una infección
sistémica, más fácilmente o más rápidamente, en comparación con
individuos no inmunizados o no tratados. La inmunidad también puede
incluir una capacidad mejorada del individuo tratado de sufrir una
infección con síntomas clínicos reducidos o sin síntomas clínicos
de infección sistémica. El individuo puede tratarse con las
proteínas OspA modificadas de la presente invención de forma
proactiva, por ejemplo, una vez al año o, como alternativa, después
de sufrir una mordedura por garrapata.
En una realización, la proteína OspA modificada
de la presente invención, junto con excipientes y/o adyuvantes
adecuados, se administra a un animal de tal modo que el animal
desarrolla una respuesta inmune contra el polipéptido OspA de la
composición. La composición farmacéutica también puede administrarse
con otros componentes adecuados para el uso in vitro y/o
in vivo. Estos componentes adicionales incluyen tampones,
proteínas vehículo, adyuvantes, conservantes y combinaciones de los
mismos. En una realización preferida, el individuo genera una
respuesta inmunoprotectora, por ejemplo, mediante la generación de
anticuerpos que reconocen el epítope LA-2.
La presente invención también se refiere a una
composición fisiológica que comprende una proteína OspA modificada.
La composición es útil para su administración a un animal para
generar una respuesta inmune o en los procedimientos diagnósticos
que se describen en este documento.
Para su uso como una vacuna, la composición de
la presente invención puede incluir adyuvantes adecuados, bien
conocidos en la técnica, para potenciar la inmunogenicidad, la
potencia o la semivida de las proteínas quiméricas en el animal
tratado. Se conocen bien en la técnica los adyuvantes y su uso
(véase, por ejemplo la Publicación PCT WO 96/40290, cuyas
enseñanzas se incorporan en este documento como referencia en su
totalidad). La composición puede prepararse mediante procedimientos
conocidos de preparación de vacunas. Por ejemplo, los polipéptidos
OspA modificados que se describen en este documento pueden aislarse
y/o purificarse usando técnicas conocidas, tal como mediante
cromatografía de exclusión por tamaños, cromatografía de intercambio
iónico, cromatografía de afinidad, electroforesis preparativa,
precipitación selectiva o combinaciones de las mismas. Las proteínas
preparadas pueden mezclarse con otros reactivos adecuados, como se
han descrito anteriormente, en los que la proteína está en una
concentración adecuada. La dosificación de la proteína variará y
dependerá de la edad, el peso y/o la condición física del animal a
tratar. La dosificación óptima puede determinarse mediante técnicas
de optimización de rutina, usando modelos animales adecuados.
La composición a usar como vacuna puede
administrarse por cualquier técnica adecuada. En una realización,
la administración es por inyección, por ejemplo, por vía subcutánea,
intramuscular, intravenosa o por inyección intraperitoneal. En otra
realización, la composición se administra a una mucosa, por ejemplo,
mediante exposición de la mucosa nasal a gotas nasales que
contienen las proteínas o proteínas quiméricas de la presente
invención. En otra realización, la composición inmunogénica se
administra mediante administración por vía oral. En otra
realización de la presente invención, las proteínas quiméricas se
administran mediante inmunización de ADN usando ácidos nucleicos
que codifican un polipéptido OspA modificado.
La presente invención también se refiere a un
kit diagnóstico que comprende los polipéptidos OspA modificados que
se describen en este documento. El kit también incluye reactivos
para detectar los complejos anticuerpo-antígeno que
se forman entre la proteína OspA y los anticuerpos que están
presentes en una muestra, por ejemplo, una muestra de huésped
suministrada por el usuario.
La presente invención también se refiere a
procedimientos para detectar una respuesta inmune contra
Borrelia causante de enfermad de Lyme en una muestra de
huésped. El procedimiento comprende poner en contacto una muestra
de huésped con una proteína OspA modificada, de tal modo que los
anticuerpos anti-OspA, si están presentes en dicha
muestra, se unan a dicha proteína OspA. La cantidad de anticuerpos
que se han unido a dicha proteína OspA se miden, detectando de este
modo una respuesta inmune contra Borrelia causante de
enfermedad de Lyme.
Este ejemplo detalla un procedimiento para la
purificación de grandes cantidades de proteína A de la superficie
externa nativa (OspA) hasta la homogeneidad y describe el mapeo de
las especificidades antigénicas de diversos MAb
anti-OspA. Se purificó OspA hasta la homogeneidad
aprovechando su resistencia a la digestión con tripsina. El marcado
intrínseco con ácido palmítico-C^{14} confirmó que
OspA estaba lipidada y la digestión parcial localizó la lipidación
en la cisteína amino-terminal de la molécula.
Se determinó la reactividad de siete anticuerpos
monoclonales murinos anti-OspA contra nueve aislados
diferentes de Borrelia mediante el análisis mediante
transferencia de Western. La reactividad de los polipéptidos OspA
modificados que se describen en este documento se analiza usando
procedimientos similares. También puede ensayarse OspA intacta,
lipidada o no lipidada, y OspA modificada usando procedimientos
similares. La OspA purificada se fragmentó mediante escisión
enzimática o química y los anticuerpos monoclonales fueron capaces
de definir cuatro dominios inmunogénicos distintos (véase la Figura
1). El dominio 3, que incluía los restos 190-220 de
OspA, era reactivo con los anticuerpos protectores que se sabe que
aglutinan el organismo in vitro, e incluía distintas
especificidades, algunas de las cuales no se limitaban a un genotipo
de B. burgdorferi.
La solubilización con detergente de B.
burgdorferi desprende las proteínas de la superficie externa y
produce preparaciones parcialmente purificadas que contienen tanto
OspA como proteína B de la superficie externa (OspB) (Barbour, A.
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Acad. Sci., 539: 376-378 (1988); Brandt, M. E. y
col., Infect. Immun., 58: 983-991 (1990); Sambri, V.
y R. Cevenini, Microbiol., 14: 307-314 (1991)).
Aunque tanto OspA como OspB son sensibles a la digestión con
proteinasa K, al contrario que OspB, OspA es resistente a la
escisión por tripsina (Dunn, J. y col., Prot. Exp. Purif., 1:
159-168 (1990); Barbour, A. G. y col., Infect.
Immun., 45: 94-100 (1984)). La insensibilidad
relativa a la tripsina es sorprendente en vista del hecho de que
OspA tiene un elevado (16% para B31) contenido en lisina y puede
relacionarse con la configuración relativa de OspA y B en la
membrana externa.
\global\parskip1.000000\baselineskip
Se realizó el marcaje de lipoproteínas como se
describe en Brandt y col. (Brandt y col., Infect. Immun., 58:
983-991 (1990)). Se añadió ácido
palmítico-C^{14} (ICN, Irving, California) al
medio BSK II hasta una concentración final de 0,5 \muCi por
mililitro (ml). Los organismos se cultivaron a 34ºC en este medio
hasta que se alcanzó una densidad de 10^{8} células por ml.
Se recogieron Borrelia burgdorferi,
marcadas con ácido palmítico-C^{14} o no marcadas,
y se lavaron como se describe (Brandt, M. E. y col., Infect.
Immun., 58: 983-991 (1990)). Los organismos
completos se trataron con tripsina de acuerdo con el protocolo de
Barbour y col., (Infect. Immun., 45: 94-100 (1984))
con algunas modificaciones. El sedimento se suspendió en solución
salina tamponada con fosfato (PBS, 10 mM, pH 7,2), que contenía
tripsina tratada con
tosil-L-fenilalaninclorometilcetona
(TPCK) al 0,8% (Sigma, St. Louis, Missouri), esta última a una
proporción de 1 \mug por 10^{8} células. La reacción se realizó
a 25ºC durante 1 hora, después de la cual se centrifugaron las
células. El sedimento se lavó en PBS con fluoruro de
fenilmetilsulfonilo (PMSF) 100 \mug/ml. La separación del
sedimento con Tritón X-114 se realizó como se
describe en Brandt y col., (Brandt y col., Infect. Immun., 58:
983-991 (1990)). Después del tratamiento con
tripsina, las células se resuspendieron en Tritón
X-114 al 2% (v/v) enfriado en hielo en PBS a
10^{9} células por ml. La suspensión se mantuvo en agitación
durante una noche a 4ºC y la fracción insoluble se retiró como
sedimento después de la centrifugación a 10.000 X g durante 15
minutos a 4ºC. El sobrenadante (fracción soluble) se incubó a 37ºC
durante 15 minutos y se centrifugó a temperatura ambiente a 1000 X g
durante 15 minutos para separar las fases acuosa y del detergente.
Se decantó la fase acuosa y se añadió PBS enfriado en hielo para
disminuir la fase de Tritón, se mezcló y se calentó a 37ºC y se
centrifugó de nuevo a 1000 X g durante 15 minutos. Se repitió el
lavado dos veces más. Por último, se retiró el detergente de la
preparación usando una columna spin de Bio-beads
SM2 (BioRad, Melville, Nueva York) como se describe en (Holloway, P.
W. Anal. Biochem., 53: 304-308 (1973)).
Se realizó una cromatografía de intercambio
iónico como se describe en Dunn y col., (Dunn y col., Prot. Exp.
Purif., 1: 159-168 (1990)) con modificaciones
secundarias. Se disolvió OspA bruta en tampón A (Tritón
X-100 al 1%, tampón fosfato 10 mM (pH 5,0)) y se
cargó en una resina SP Sepharose (Pharmacia, Piscataway, Nueva
Jersey), preequilibrada con tampón A a 25ºC. Después de lavar la
columna con 10 volúmenes de lecho de tampón A, la OspA unida se
eluyó con tampón B (Tritón X-100 al 1%, tampón
fosfato 10 mM (pH 8,0)). Se detectaron las fracciones de OspA
mediante ensayo de proteína usando el procedimiento de BCA (Pierce,
Rockford, Illinois) o como radioactividad cuando se fraccionó el
material intrínsecamente marcado. Se retiró el Tritón
X-100 usando una columna spin de
Bio-beads SM2.
Este procedimiento purifica OspA a partir de una
preparación de membrana de la superficie externa. En ausencia de
tratamiento con tripsina, OspA y B fueron los componentes
principales de la fracción soluble obtenida después de la
separación con Tritón de la cepa B31. Por el contrario, cuando se
realizó la extracción con Tritón después del tratamiento con
tripsina, no se visualizó la banda de OspB. La purificación
adicional de OspA-B31 en una columna de SP
Sepharose dio como resultado una única banda mediante
SDS-PAGE. El rendimiento después de la eliminación
del detergente fue de aproximadamente 2 mg por litro de cultivo.
Este procedimiento de purificación de OspA, como se describe en
este documento para la cepa B31, también puede usarse para otros
aislados de Borrelia. Para cepas tales como la cepa K48, que
carece de OspB, puede omitirse el tratamiento con tripsina.
Se purificó OspA de la cepa B31 marcada con
ácido palmítico-C^{14}, como se ha descrito
anteriormente, y se digirió parcialmente con endoproteinasa
Asp-N. Después de la digestión, se visualizó una
nueva banda de menor peso molecular mediante
SDS-PAGE y se descubrió mediante secuenciación
amino-terminal directa que comenzaba en Asp_{25}.
Esta banda no tenía indicios de radioactividad mediante
autorradiografía. OspA y B contienen una secuencia de señal
(L-X-Y-C) similar a
la de consenso descrita para lipoproteínas de E. coli y se
ha predicho que el sitio de lipidación de OspA y B será la cisteína
amino-terminal (Brandt, M. E. y col., Infect.
Immun., 58: 983-991 (1990)). Los resultados que se
presentan en este documento apoyan esta predicción.
La disponibilidad de la secuencia de aminoácidos
para OspA de varios aislados diferentes, junto con el mapeo de
péptidos y el análisis mediante transferencia de Western,
permitieron la identificación de los dominios antigénicos
reconocidos por anticuerpos monoclonales (MAb) y permitió la
inferencia de los restos aminoacídicos clave responsables de la
reactividad específica a anticuerpos.
Se usaron nueve cepas de Borrelia,
incluyendo siete cepas europeas y dos cepas norteamericanas, en este
estudio de dominios de unión a anticuerpo de diversas proteínas. La
información concerniente a las cepas se resume en la Tabla I, a
continuación.
R. Johnson, de la Universidad de Minnesota,
suministró las cepas K48, PGau y DK29; B. Wilske y V.
Preac-Mursic, del Instituto Pettenkhofer, Munich,
Alemania, proporcionaron Pko y pTrob; y L. Mayer, del Centro para el
Control de Enfermedades, Atlanta, Georgia, suministró Ip3 e Ip90.
J. Anderson, del Departamento de Agricultura de Connecticut
proporcionó las cepas norteamericanas, incluyendo la cepa 25015; y
la cepa B31 (ATCC 35210).
\vskip1.000000\baselineskip
Se utilizaron siete anticuerpos monoclonales
(MAb) en este estudio. Cinco de los MAb (12, 13, 15, 83 y 336) se
produjeron a partir de hibridomas clonados y subclonados como se ha
descrito anteriormente (Schubach, W. H. y col., Infect. Immun., 59
(6): 1911-1915 (1991)). El MAb H5332 (Barbour, A. G.
y col., Infect. Immun., 41: 795-804 (1983)) se
obtuvo por cortesía del Dr. Alan Barbour, de la Universidad de
Texas, y el MAb CIII.78 (Sears, J. E. y col., J. Immunol., 147 (6):
1995-2000 (1991)) se obtuvo por cortesía de Richard
A. Flavell, de la Universidad de Yale. Los MAb 12 y 15 se generaron
contra B3 completa sonicada; el MAb 336 se produjo contra PGau
completa; y los MAb 13 y 83 se generaron contra una forma truncada
de OspA clonada a partir de la cepa K48 y expresada en E.
coli usando el sistema de ARN polimerasa T7 (McGrath, B. C. y
col., Vaccines, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview,
Nueva York, pág. 365-370 (1993)). Todos los MAb se
tipificaron como inmunoglobulinas G (IgG).
\vskip1.000000\baselineskip
La predicción de los diversos sitios de escisión
se consiguió mediante el conocimiento de la secuencia primaria de
aminoácidos, obtenida a partir de secuencias de nucleótidos
completas de OspA, muchas de las cuales están disponibles
actualmente (véase la Tabla II, a continuación). También pueden
predecirse sitios de escisión en base a la secuencia peptídica de
OspA, que puede determinarse mediante técnicas convencionales
después del aislamiento y la purificación de OspA mediante el
procedimiento descrito anteriormente. Se realizó una escisión de
varios aislados de OspA para determinar la localización de la unión
a anticuerpos monoclonales de las proteínas.
La escisión de OspA con
hidroxilamina-HCl (HA), N-clorosuccinimida
(NCS) y bromuro de cianógeno siguió los procedimientos descritos
por Bornstein (Biochem. 9 (12): 2408-2421 (1970)),
Shechter y col., (Biochem., 15 (23): 5071-5075
(1976)) y Gross (en Hirs, C. H. W. (ed.): Methods in Enzymology, (N.
Y. Acad. Press), 11: 238-255 (1967)),
respectivamente. La escisión por proteasas, mediante endoproteinasa
Asp-N (Boehringer Mannheim, Indianápolis, Indiana),
se realizó como se describe en Cleveland D. W. y col., (J. Biol.
Chem., 252: 1102-1106 (1977)). Se usaron diez
microgramos de OspA para cada reacción. La proporción entre enzima y
OspA fue de aproximadamente 1 a 10 (p/p).
Las proteínas y péptidos generados por escisión
se separaron mediante SDS-electroforesis en gel de
poliacrilamida (SDS-PAGE) (Laemmli, U. K., Nature
(Londres) 227: 680-685 (1970)) y se
electrotransfirieron sobre membranas de difluoruro de
polivinilideno (PVDF) de Immobilon (Ploskal, M. G. y col.,
Biotechniques, 4: 272-283 (1986)). Se detectaron
mediante tinción con negro de amida o mediante inmunotinción con MAb
murinos, seguidos de anti-IgG de ratón de cabra
conjugados con fosfatasa alcalina. Se detectó la unión específica
usando un sistema de revelado de
5-bromo-4-cloro-3-indolilfosfato
(BCIP)/nitroazul de tetrazolio (NBT) (KPL Inc., Gathersburg,
Maryland).
Además, el análisis
amino-terminal de la secuencia de aminoácidos se
realizó en varios productos de escisión, como se describe en Luft y
col., (Infect. Immun., 57: 3637-3645 (1989)). Las
bandas teñidas con negro de amida se extrajeron de las
transferencias de PVDF y se secuenciaron mediante degradación de
Edman usando un secuenciador Biosystems modelo 475A con un
analizador modelo 120A PTH y un analizador de control/datos modelo
900A.
\vskip1.000000\baselineskip
Una OspA-B31 purificada, marcada
con ácido palmítico-C^{14}, se fragmentó con
hidroxilamina-HCl (HA) en dos péptidos, denominados
HA1 y HA2 (no se muestran los datos). La banda de HA1 migró a 27 kd
y conservó su radioactividad, indicando que el péptido incluía el
sitio de lipidación en el extremo N-terminal de la
molécula (no muestran los datos). Partiendo del punto de escisión
predicho, HA1 se correspondería con los restos 1 a 251 de
OspA-B31. HA2 tenía un PM de 21,6 kd mediante
SDS-PAGE, demostrando el análisis
amino-terminal de la secuencia que comenzaba en el
Gly72, es decir, restos 72 a 273 de OspA-B31. Por el
contrario, el HA escindió a OspA-K48 en tres
péptidos, denominados HA1, HA2 y HA3, con PM aparentes de 22 kd, 16
kd y 12 kd, respectivamente. La secuenciación
amino-terminal demostró que HA1 comenzaba en Gly72 y
HA3 en Gly142. Se descubrió que HA2 tenía un extremo
amino-terminal bloqueado, como se había observado
para la proteína OspA de longitud completa. Se predijo que HA1, 2 y
3 de OspA-K48 eran los restos
72-274, 1 a 141 y 142 a 274, respectivamente.
La N-clorosuccinimida (NCS) escinde el
triptófano (W), es decir, en el resto 216 de
OspA-B31 o en el resto 217 de
OspA-K48 (no se muestran los datos). La NCS escindió
a OspA-B31 en 2 fragmentos, NCS1, con un PM de 23
kd, restos 1-216 de la proteína, y NCS2, con un PM
de 6,2 kd, restos 217 a 273 (no se muestran los datos). De manera
similar, la OspA de K48 se dividió en dos fragmentos, NCS1, de
restos 1-217, y NCS2, de restos 218 a 274 (no se
muestran los datos).
La escisión de OspA por bromuro de cianógeno
(CNBr) se produce en el extremo carboxi de la metionina, resto 39.
El fragmento principal, CNBr1, tiene un PM de 25,7 kd, restos
39-274, mediante análisis
amino-terminal de la secuencia de aminoácidos (no
se muestran los datos). No pudo visualizarse el CNBr2 (de
aproximadamente 4 kd) mediante tinción de negro de amida; en su
lugar, se observaron bandas ligeramente teñidas de aproximadamente
20 kd de PM. Estas bandas reaccionaron con los MAb
anti-OspA y, muy probablemente, eran productos de
degradación debidos a la escisión por ácido fórmico.
\vskip1.000000\baselineskip
Los productos de escisión de
OspA-B31 y OspA-K48 se analizaron
mediante transferencia de Western para evaluar su capacidad de
unión a seis MAb diferentes. El análisis preliminar mediante
transferencia de Western de los productos de escisión demostró que
las cepas K48 y DK29 tienen patrones de reactividad similares, al
igual que IP3, PGau y Pko. La OspA de la cepa PTrob era
inmunológicamente diferente de las demás, siendo reconocida
únicamente por el MAb 336. El MAb 12 reconoció solamente a las dos
cepas norteamericanas, B31 y 25015. Cuando los aislados se
dividieron en genogrupos, era sorprendente que todos los MAb,
excepto el MAb 12, presentaban reactividad cruzada con múltiples
genogrupos.
El MAb12, específico para
OspA-B31, se unió tanto a HA1 como a HA2 de
OspA-B31. Sin embargo, la escisión de
OspA-B31 por NCS en el resto Trp216 generó
fragmentos que no reaccionan con el MAb12, sugiriendo que el dominio
pertinente está próximo a o es estructuralmente dependiente de la
integridad de este resto (no se muestran los datos). El MAb 13 se
unió solamente a OspA-K48 y a los péptidos que
contienen el extremo amino-terminal de esa molécula
(por ejemplo, HA2; NCS1). No se unió a los restos 39 a 274 de CNBr1.
Por lo tanto, el dominio reconocido por MAb13 se encuentra en el
extremo amino-terminal de OspA-K48,
cerca de la Met38.
El MAb15 reacciona con la OspA de las cepas
tanto B31 como K48 y con los péptidos que contienen el extremo
N-terminal de OspA, tales como HA1 de
OspA-B31 y NCS1, pero no con los péptidos HA2 de
OspA-B31 y HA1 de OspA-K48 (no se
muestran los datos). Ambos péptidos incluyen del resto 72 al extremo
C-terminal de las moléculas. El MAb15 se unió a
CNBr1 de OspA-K48, indicando que el dominio para
este anticuerpo está en los restos 39 a 72, específicamente,
próximo a Gly72 (no se muestran los datos).
El MAb83 se une a OspA-K48 y a
los péptidos que contienen la porción C-terminal de
la molécula, tales como HA1. No se une a HA2 de
OspA-K48, muy probablemente, porque el extremo
C-terminal de HA2 de OspA-K48
termina en el 141. De forma similar a MAb12 y
OspA-B31, la unión de los MAb 83 y CIII.78 se
elimina mediante la escisión de OspA en el resto de triptófano. Por
lo tanto, la unión de los MAb 12, 83 y CIII.78 a OspA depende de la
integridad estructural del resto Trp_{216}, que parece ser crítico
para la antigenicidad. También es evidente que, aunque estos MAb se
unen a un dominio antigénico común, los epítopes exactos que
reconocen son diferentes de uno a otro, dado el grado de
variabilidad de la reactividad cruzada con estos MAb entre
cepas.
Aunque existe una pérdida similar de la
actividad de unión del MAb336 con la escisión en Trp_{216}, este
MAb no se une a HA1 de OspA-B31, sugiriendo que el
dominio para este anticuerpo incluye el extremo
carboxi-terminal de la molécula, incluyendo los
restos 251 a 273. Péptidos de bajo PM, tales como HA3 (10 kd) y NCS2
(6 kd) de OspA-K48, no se unen a este MAb en
transferencias de Western. Para confirmar esta observación, se
ensayó la unión de los 6 MAb con una construcción de fusión
recombinante p3A/EC que contiene una proteína líder trpE fusionada
con los restos 217 a 273 de OspA-B31 (Schubach, W.
H. y col., Infect. Immun., 59 (6): 1911-1915
(1991)). Solamente el MAb336 reaccionó con esta construcción (no se
muestran los datos). Los péptidos y los dominios antigénicos
localizados mediante fragmentación de OspA se resumen en la Figura
1.
\vskip1.000000\baselineskip
Se realizó mutagénesis dirigida para sustituir
los restos del dominio 204-219 de la OspA
recombinante de B31 con los restos análogos de una variante europea
de OspA, K48. En la región de OspA entre los restos 204 y 219, hay
siete diferencias de aminoácidos entre OspA-B31 y
OspA-K48. Se generaron tres oligonucleótidos,
conteniendo cada uno cambios de nucleótidos que incorporaban los
aminoácidos de K48 en sus posiciones análogas en la proteína
OspA-B31. Los oligonucleótidos usados para generar
los mutantes dirigidos fueron:
5'-CTTAATGACTCTGACACTAGTGC-3'
(Nº 613, que cambia la treonina de la posición 204 por serina y la
serina de la posición 206 por treonina (Thr204-Ser
y Thr206-Ser)) (SEC ID Nº: 1);
5'-GCTACTAAAAAAACCGGGAAATGGAATTCA-3'
(Nº 625, que cambia la alanina en 214 por glicina y la alanina en
215 por lisina (Ala214-Gly y
Ala215-Lys)) (SEC ID Nº: 2); y
5'-GCAGCTTGGGATTCAAAAACATCCACTTTAACA-3'
(Nº 640, que cambia la asparagina en 217 por aspartato y la glicina
en 219 por lisina (Asn217-Asp y
Gly219-Lys)) (SEC ID Nº: 3).
La mutagénesis dirigida se llevó a cabo mediante
la realización de mutagénesis con parejas de los oligonucleótidos
anteriores.
Se generaron tres mutantes dirigidos, cada uno
con dos cambios: OspA 613 (Thr204-Ser y
Thr206-Ser), OspA 625 (Ala214-Gly y
Ala215-Lys) y 640 (Asn217-Asp y
Gly219-Lys). También había dos proteínas con cuatro
cambios:
OspA 613/625 (Thr204-Ser, Thr206-Ser, Ala214-Gly y Ala215-Lys) y OspA 613/640 (Thr240-Ser, Thr206-Ser, Asn217-Asp y Gly219-Lys).
OspA 613/625 (Thr204-Ser, Thr206-Ser, Ala214-Gly y Ala215-Lys) y OspA 613/640 (Thr240-Ser, Thr206-Ser, Asn217-Asp y Gly219-Lys).
\vskip1.000000\baselineskip
Los anticuerpos monoclonales que aglutinan
espiroquetas, incluyendo varios que son neutralizantes in
vitro, reconocen epítopes que mapean en la región hipervariable
próxima a Trp216 (Barbour, A. G. y col., Infect. and Immun., 41:
759 (1983); Schubach, W. H. y col., Infect. and Immun., 59: 1911
(1991)). El análisis mediante transferencia de Western demostró que
la escisión química de OspA de la cepa B31 en el Trp216 suprime la
reactividad de la proteína con el MAb 105 aglutinante, un
monoclonal generado contra espiroquetas B31. El reactivo,
n-clorosuccinimida (NCS), escinde a OspA en el Trp216,
formando un fragmento de 23,2 kd y un péptido de 6,2 kd que no se
retiene en la membrana de Immobilon P después de la transferencia.
El material no escindido se une al MAb 105; sin embargo, el
fragmento de 23,2 kd no es reactivo. Transferencias de Western
similares con una proteína de fusión TrpE-OspA, que
contiene la porción carboxi-terminal de la proteína
OspA, demostraron que el fragmento pequeño de 6,2 kd tampoco se une
al MAb 105 (Schubach, W. H. y col., Infect. and Immun., 59: 1911
(1991)).
Se ha demostrado mediante inmunofluorescencia
que los anticuerpos monoclonales H5332 y H3TS (Barbour, A. G. y
col., Infect. and Immun., 41: 759 (1983)) decoran la superficie de
espiroquetas fijadas (Wilske, B. y col., World J. Microbiol., 7:
130 (1991)). Estos anticuerpos monoclonales también inhiben el
crecimiento del organismo en cultivo. El mapeo de epítopes con
proteínas de fusión ha confirmado que los epítopes que se unen a
estos MAb están determinados conformacionalmente y residen en la
mitad carboxi de la proteína. El MAb H5332 presenta reactividad
cruzada con todos los grupos filogenéticos conocidos, mientras que
el MAb H3TS y el MAb 105 parecen ser específicos de la cepa B31
contra la que se generaron. Como para el MAb 105, la reactividad de
H5332 y H3TS contra OspA se anula mediante la fragmentación de la
proteína en el Trp216. El MAb 336 se generó contra todas las
espiroquetas de la cepa PGau. Presenta reactividad cruzada con OspA
del grupo 1 (el grupo al que pertenece B31) pero no con el grupo 2
(del que es miembro K48). Estudios previos usando proteínas de
fusión y escisión química han indicado que este anticuerpo reconoce
un dominio de OspA en la región entre los restos 217 y 273. Todos
estos MAb aglutinan la espiroqueta B31.
\vskip1.000000\baselineskip
Se usaron MAb para el análisis mediante
transferencia de Western de los mutantes de OspA dirigidos inducidos
en E. coli usando el sistema de expresión T7 (Dunn, J. J. y
col., Protein Expression and Purification, 1: 159 (1990)). Las
células de E. coli que llevaban plásmidos pET9c, que tenían
un inserto de un mutante OspA dirigido, se indujeron a una fase
logarítmica de crecimiento medio con IPTG durante cuatro horas a
37ºC. Se realizaron lisados celulares mediante el calentamiento
hasta la ebullición de un alícuota de los cultivos inducidos en
colorante de carga de gel SDS y, después, este material se cargó en
un gel de SDS al 12% (BioRad mini-Protean II) y se
sometió a electroforesis. Después, las proteínas se transfirieron a
membranas de Immobilon-P (Millipore) a 70V, 2 horas
a 4ºC, usando el sistema de mini- transferencia de BioRad. Los
análisis de Western se realizaron como se describe en Schubach y
col., (Infect. Immun., 59: 1911 (1991)).
El análisis mediante transferencia de Western
indicó que solamente el mutante 625 (Ala214-Gly y
Ala215-Lys) conservaba la unión al monoclonal
aglutinante H3TS. Sin embargo, el mutante 613/625, que tiene
modificaciones adicionales en el extremo
amino-terminal del Trp216
(Ser204-Thr y Thr206-Ser) no se unió
a este monoclonal. Las OspA tanto 640 como 613/640, que tienen los
cambios Asn217-Asp y Gly219-Lys en
el lado carboxi-terminal del Trp216, tampoco se
unieron al MAb H3TS. Esto indicaba que el epítope de la OspA de B31
que se une a H3TS está constituido por las cadenas laterales de
aminoácidos a ambos lados del Trp216.
El mutante 613/625 no se unió a los MAb 105 y
H5332, mientras que otros mutantes conservaron su capacidad de
unión a estos MAb. Esto es importante a la luz de los datos
obtenidos usando proteínas de fusión, que indican que el MAb 105 se
comporta más como el MAb H3TS en términos de su especificidad de
serotipo y de su unión a OspA (Wilske, B. y col., Med. Microbiol.
Immunol., 181: 191 (1992)). La proteína 613/625 tiene, además de
las diferencias en los restos Thr204 y Ser206, cambios
inmediatamente amino-terminales a Trp216
(Ala214-Gly y Ala215-Lys). La
anulación de la reactividad de los MAb 105 y H5332 con esta proteína
indicaba que los epítopes de OspA que se unen a estos anticuerpos
monoclonales están constituidos por los restos del lado
amino-terminal de Trp216.
Las dos proteínas que llevan los reemplazos
Asn217-Asp y Gly219-Lys en el lado
carboxi-terminal de Trp216 (OspA 640 y 613/640)
conservaron la unión a los MAb 105 y H5332; sin embargo, no
reaccionaron con el MAb 336, un monoclonal que se ha mapeado, con
proteínas de fusión TrpE-OspA y mediante escisión
química, en un domino más carboxi-terminal. Este
resultado puede explicar por qué el MAb 336 no reconocía el tipo K48
de OspA
(Grupo 2).
(Grupo 2).
Está claro que los aminoácidos Ser204 y Thr206
desempeñan un papel importante en los epítopes aglutinantes de la
región de la OspA de B31 que flanquea el Trp216. El reemplazo de
estos dos restos modificó los epítopes de OspA que se unen a los
MAb 105, H3TS y H5332. La capacidad de los cambios en 640 en
solitario para suprimir la reactividad del MAb 336 indicaba que
Thr204 y Ser206 no están implicados en la interacción directa con
el
MAb 336.
MAb 336.
Los resultados indicaron que los epítopes de
OspA que están disponibles para los MAb que aglutinan espiroquetas
están comprendidos, al menos en parte, por los aminoácidos en la
proximidad inmediata del Trp216. Puesto que el análisis del
dicroísmo circular indicó que las estructuras de OspA de B31 y de
K48 difieren muy poco en este dominio, es poco probable que los
cambios realizados mediante mutación hayan modificado radicalmente
la estructura global de la proteína OspA (France, L. L. y col.,
Biochem. Biophys. Acta., 1120: 59 (1992); y France y col., Biochem,
Biophys Acta, presentada (1993)). El descubrimiento de que las OspA
recombinantes mutantes presentan la misma alta solubilidad y
propiedades de purificación que la proteína B31 parental apoya esta
hipótesis (no se muestran los datos).
En resumen, las cadenas laterales de aminoácidos
en las posiciones Ser204 y Thr206 son importantes para muchos de
los epítopes aglutinantes. Sin embargo, un conjunto limitado de
cambios conservativos en estos sitios no fueron suficientes para
suprimir la unión de todos los MAb aglutinantes. Estos resultados
sugieren que los epítopes aglutinantes de OspA son distintos,
aunque pueden tener cierto solapamiento. Los resultados también
apoyan la hipótesis de que el epítope expuesto en la superficie
próximo a Trp216, que se piensa que es importante para el
reconocimiento y la neutralización inmunes, es un dominio complejo
de OspA determinado conformacionalmente.
\vskip1.000000\baselineskip
Los polipéptidos de OspA modificados de la
presente invención pueden ser parte de una combinación con otras
proteínas o pueden estar unidos a otras proteínas para formar una
proteína quimérica. Los otros polipéptidos de la combinación o
quimera pueden obtenerse a partir de cualquier Borrelia. Las
proteínas representativas incluyen OspA, OspB, OspC, OspD, p12,
p39, p41 (fla), p66 y p93. Están disponibles secuencias de ácidos
nucleicos que codifican varias proteínas de Borrelia (véanse
los ejemplos de la Tabla II); como alternativa, pueden aislarse
secuencias de ácidos nucleicos que codifican proteínas de
Borrelia y caracterizarse usando procedimientos tales como
los que se describen a continuación.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Se aislaron secuencias de ácidos nucleicos, que
codificaban proteínas lipidadas de longitud completa, a partir de
cepas conocidas de Borrelia usando la reacción en cadena de
la polimerasa (PCR), como se describe a continuación. Además, se
generaron secuencias de ácidos nucleicos que codifican proteínas
truncadas (proteínas en las que se ha eliminado la señal de
lipidación, tal como mediante la eliminación de la secuencia de
ácido nucleico que codifica los primeros 18 aminoácidos, dando como
resultado proteínas no lipidadas). Se generaron otras proteínas que
codificaban polipéptidos de un gen en particular (es decir, que
codificaban un segmento de la proteína que tiene un número de
aminoácidos diferente al de la proteína en la naturaleza). Usando
procedimientos similares a los que se describen a continuación,
pueden generarse cebadores a partir de secuencias conocidas de
ácidos nucleicos que codifican proteínas de Borrelia y usarse
para aislar otros genes que codifican proteínas de Borrelia.
Pueden diseñarse cebadores para amplificar todo un gen, así como
para amplificar una secuencia de ácido nucleico que codifica
secuencias de proteínas truncadas, tal como se describe a
continuación para OspC, o secuencias de ácidos nucleicos que
codifican un polipéptido obtenido a partir de una proteína de
Borrelia. También pueden diseñarse cebadores para incorporar
sitios de escisión para enzimas de restricción únicos en las
secuencias de ácidos nucleicos amplificadas. Después, puede
realizarse el análisis de secuencia de las secuencias de ácidos
nucleicos amplificadas usando técnicas convencionales.
Se aislaron secuencias de OspA de
Borrelia de la manera siguiente: se usaron mezclas de
reacción de 100 \mul que contenían KCl 50 mM,
TRIS-HCl 10 mM (pH 8,3), MgCl_{2} 1,5 mM, 200
\muM de cada NTP, 2,5 unidades de ADN polimerasa TaqI (Amplitaq,
Perkin-Elmer/Cetus) y 100 pmol de cada uno de los
cebadores 5' y 3' (que se describen a continuación). Se realizó la
amplificación en un termociclador
Perkin-Elmer/Cetus, como se ha descrito (Schubach,
W. H. y col., Infect. Immun., 59: 1811-1915 (1991)).
El amplicón se visualizó en un gel de agarosa mediante tinción con
bromuro de etidio. Se clonaron veinte nanogramos del producto de PCR
extraído con cloroformo directamente en el vector
PC-TA (Invitrogen) siguiendo las instrucciones del
fabricante. Se seleccionaron colonias recombinantes que contenían
el fragmento amplificado, se prepararon los plásmidos y se
determinó la secuencia de ácido nucleico de cada OspA mediante la
técnica dideoxi de terminación de cadena usando el kit Sequenase
(United States Biochemical). Se realizó la secuenciación directa con
cebadores M13, seguidos de cebadores específicos de OspA obtenidos
a partir de las secuencias, previamente obtenidos con cebadores
M13.
Debido a que los extremos 5' y 3' del gen de
OspA están muy conservados (Fikrig, E. S. y col., J. Immunol., 7:
2256-2260 (1992); Bergstrom, S. y col., Mol.
Microbiol. 3: 479-486 (1989); Zumstein, G. y col.,
Med. Microbiol. Immunol., 181: 57-70 (1992)), los
cebadores 5' y 3' para la clonación pueden basarse en cualquiera de
las secuencias de OspA conocidas. Por ejemplo, se usaron los
siguientes cebadores basados en la secuencia de ácido nucleico de
OspA de la cepa B31:
5'-GGAGAATATATTATGAAA-3'
(de -12 a + 6) (SEC ID Nº: 4); y
5'-CTCCTTATTTTAAAGCG-3' (de +826 a +
809) (SEC ID Nº: 5). (Schubach, W. H. y col., Infect. Immun, 59:
1811-1915 (1991)).
Los genes de OspA aislados de esta forma
incluyen los de las cepas B31, K48, PGau y 25015; las secuencias de
ácidos nucleicos se representan en la lista de secuencias como SEC
ID Nº: 6 (OspA-B31), SEC ID Nº: 8
(OspA-K48); SEC ID Nº: 10
(OspA-PGau) y SEC ID Nº: 12
(OspA-25015). Se muestra un alineamiento de estas y
otras secuencias de ácidos de nucleicos de OspA en la Figura 17.
Las secuencias de aminoácidos de las proteínas codificadas por
estas secuencias de ácidos nucleicos se representan como SEC ID Nº:
7 (OspA-B31), SEC ID Nº. 9
(OspA-K48), SEC ID Nº: 11
(OspA-PGau) y SEC ID Nº: 13
(OspA-25015).
Se usaron los siguientes cebadores para generar
secuencias de ácidos nucleicos específicas del gen de OspA:
\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\+#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
5'-GTCTGCAAAAACCATGACAAG-3' \+
(cebador de la hebra positiva Nº 369) (SEC ID Nº 14)\cr
\+\cr 5' - GTCATCAACAGAAGAAAAATTC - 3'
\+ (cebador de la hebra positiva Nº 357) (SEC ID Nº
15)\cr \+\cr
5' - CCGGATCCATATGAAAAAATATTTATTGGG - 3'
\+ (cebador de la hebra positiva Nº 607) (SEC ID Nº
16)\cr \+\cr
5' - CCGGGATCCATATGGCTAAGCAAAATGTTAGC - 3'
\+ (cebador de la hebra positiva Nº 584) (SEC ID Nº
17)\cr \+\cr
5' - GCGTTCAAGTACTCCAGA - 3' \+ (cebador
de la hebra negativa Nº 200) (SEC ID Nº 18)\cr \+\cr
5' - GATATCTAGATCTTATTTTAAAGCGTT - 3' \+
(cebador de la hebra negativa Nº 586) (SEC ID Nº 19);\cr
y\+\cr \+\cr
5' - GGATCCGGTGACCTTTTAAAGCGTTTTTAAT - 3'
\+ (cebador de la hebra negativa Nº 1169) (SEC ID Nº
20)\cr}
\vskip1.000000\baselineskip
Las secuencias de ácidos nucleicos descritas
anteriormente pueden incorporarse en plásmidos de expresión usando
técnicas convencionales y transfectarse en células huésped
compatibles para expresar las proteínas codificadas por las
secuencias de ácidos nucleicos. Como ejemplo, se explica la
expresión del gen de p12 y el aislamiento de la proteína p12.
Se dirigió la amplificación de la secuencia de
ácido nucleico de p12 con cebadores que incluían un sitio de
restricción NdeI en la secuencia de ácido nucleico. El producto de
PCR se extrajo con fenol/cloroformo y se precipitó con etanol. El
producto precipitado se digirió y se ligó en un plásmido de
expresión de la siguiente manera: 15 \mul (aproximadamente 1
\mug) de ADN de PCR se combinaron con 2 \mul de tampón de
restricción 10X para NdeI (Gibco/BRL), 1 \mul de NdeI (Gibco/BRL)
y 2 \mul de agua destilada y se incubaron durante una noche a
37ºC. Esta mezcla se combinó posteriormente con 3 \mul de tampón
10X (tampón 3, New England BioLabs), 1 \mul de BamHI (NEB) y 6
\mul de agua destilada y se incubó a 37ºC durante dos horas. El
material resultante se purificó mediante una electroforesis en gel
preparativo usando agarosa de bajo punto de fusión, se visualizó la
banda bajo luz ultravioleta de alta longitud de onda y se escindió
del gel. El trozo de gel se trató con Gelase usando las condiciones
recomendadas por el fabricante (Epicentre Technologies). El
sedimento de ADN resultante se resuspendió en 25-50
\mul de TRIS-Cl 10 mM (pH 8,0) y EDTA 1 mM (TE).
Se ligó una alícuota de este material con el vector de expresión
pET9c (Dunn, J. J. y col., Protein Expression and Purification, 1:
159 (1990)).
Para ligar el material con el vector de
expresión pET9c, se combinaron 20-50 ng de
secuencias de ácidos nucleicos de p12 cortadas y purificadas, como
se ha descrito anteriormente, con 5 \mul de tampón 10
One-Phor-All (OPA) (Pharmacia),
30-60 ng de pET9c cortado con NdeI y BamHI, 2,5
\mul de ATP 20 mM, 2 \mul de ADN ligasa T4 (Pharmacia) diluida
1:5 en tampón OPA 1X y suficiente agua destilada para llevar la
mezcla a un volumen final de 50 \mul. La mezcla se incubó a 12ºC
durante una noche.
Las ligaciones resultantes se transformaron en
células competentes DH5-alfa y se sembraron en
placas sobre placas de agar con nutrientes, que contenían
kanamicina 50 \mug/ml, y se incubaron durante una noche a 37ºC.
La DH5-alfa se usa como una "cepa de
almacenamiento" para clones de expresión de T7 porque es
deficiente en RecA, de tal modo que la recombinación y la
concatenación no suponen un problema, y porque carece del gen de la
ARN polimerasa T7, necesaria para expresar el gen clonado. El uso de
esta cepa permite la clonación de productos génicos potencialmente
tóxicos, minimizando al mismo tiempo la probabilidad de deleción y/o
de reorganización de los genes deseados. También pueden usarse
otras líneas celulares que tengan propiedades similares.
Las colonias resistentes a kanamicina se
purificaron individualmente en placas de agar con nutrientes
suplementadas con kanamicina a 50 \mug/ml. Se inoculó una colonia
de cada aislado en 3-5 ml de medio líquido que
contenía kanamicina 50 \mug/ml y se incubaron a 37ºC sin
agitación. Se obtuvo el ADN plasmídico a partir de 1 ml de cada
aislado usando un procedimiento de lisis alcalina en caliente
(Maniatis, T. y col., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold
Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1982)).
El ADN plasmídico se digirió con EcoRI y BgIII
de la manera siguiente: se combinaron 15 \mul de ADN plasmídico
con 2 \mul de tampón 3 10X (NEB), 1 \mul de EcoRI (NEB), 1
\mul de BgIII (NEB) y 1 \mul de agua destilada y se incubó
durante dos horas a 37ºC. La mezcla de reacción completa se sometió
a electroforesis en un gel de agarosa analítico. Se identificaron
los plásmidos que llevaban el inserto p12 por la presencia de una
banda que se corresponde con 925 pares de bases (longitud completa
de p12) u 875 pares de bases (p12 no lipidada). Se usaron uno o dos
ADN plasmídicos de los clones de p12 de longitud completa y no
lipidada en pET9c para transformar BL21 DE3 pLysS para resistencia
a kanamicina, como se describe en Studier y col., (Methods in
Enzymology, Goeddel, D. (Ed.), Academic Press, 185:
60-89 (1990)). Se purificaron individualmente uno o
dos transformantes de los clones de longitud completa y no lipidada
en placas de nutrientes que contenían cloranfenicol 25 \mug/ml
(para mantener pLysS) y kanamicina 50 \mug/ml a 37ºC. Se inoculó
una colonia de cada aislado en medio líquido suplementado con
cloranfenicol y kanamicina y se incubaron durante noche a 37ºC. El
cultivo de una noche se subcultivó a la mañana siguiente en 500 ml
de caldo de cultivo líquido con cloranfenicol (25 \mug/ml) y
kanamicina (50 \mug/ml) y se cultivó en aerobiosis a 37ºC en un
agitador orbital con aireación hasta que la absorbancia a 600 nm
alcanzó un valor de 0,4-0,7. Se añadió
isopropil-tio-galactósido (IPTG) a
una concentración final de 0,5 mM para la inducción y el cultivo se
incubó durante 3-4 horas a 37ºC, como
anteriormente. Las células inducidas se sedimentaron por
centrifugación y se resuspendieron en 25 ml de NaPO_{4} 20 mM (pH
7,7). Se retiró una pequeña alícuota para su análisis mediante
electroforesis en gel. Los clones que expresaban produjeron
proteínas que migraban a la posición de 12 kd.
Se preparó un lisado celular bruto a partir del
cultivo, como se describe para OspA recombinante en Dunn, J. J.
et al., (Protein Expression and Purification, 1: 159 (1990)).
El lisado bruto se hizo pasar primero por una columna de
Q-Sepharose (Pharmacia) que se había preequilibrado
en tampón A: NaPO_{4} 10 mM (pH 7,7), NaCl 10 mM y PMSF 0,5 mM.
La columna se lavó con NaPO_{4} 10 mM, NaCl 50 mM y PMSF 0,5 mM y
después se eluyó la p12 en NaPO_{4} 10 mM y PMSF 0,5 mM con un
gradiente de NaCl de 50-400 mM. La p12 se eluía
aproximadamente hacia la mitad del gradiente de NaCl entre 100 y
200 mM. Las fracciones máximas se combinaron y se dializaron contra
NaPO_{4} 10 mM (pH 7,7), NaCl 10 mM y PMSF 0,5 mM. Después, la
proteína se concentró y se aplicó a una columna de filtración en
gel de Sephadex G50 de aproximadamente 50 ml de volumen de lecho
(Pharmacia), en NaPO_{4} 10 mM, NaCl 200 mM y PMSF 0,5 mM.
Típicamente, la p12 se eluiría poco después del marcador de volumen
de exclusión. Las fracciones máximas se determinaron corriendo
pequeñas alícuotas de todas las fracciones en un gel. El máximo de
p12 se combinó y se almacenó en pequeñas alícuotas a -20ºC.
\vskip1.000000\baselineskip
Se usó el procedimiento de mutagénesis dirigida
del megacebador, y una modificación, para generar secuencias de
ácidos nucleicos quiméricas (Sarkar y Sommer, Biotechniques, 8 (4):
404-407 (1990); Aiyar, A. y J. Leis, Biotechniques,
14 (3): 366-369 (1993)). Se usa un cebador 5' para
el primer molde genómico y un oligo de fusión 3' para amplificar la
región deseada. El cebador de fusión está constituido por un extremo
3' del primer molde (ADN que codifica el polipéptido
amino-proximal de la proteína de fusión) acoplado a
un extremo 5' del segundo molde (ADN que codifica el polipéptido
carboxi-proximal de la proteína de fusión).
Las amplificaciones por PCR se realizan usando
ADN polimerasa Taq, tampón de PCR 10X y MgCl_{2} (Promega Corp.,
Madison, WI) y dNTP Ultrapure (Pharmacia, Piscataway, NJ). Un \mug
de molde genómico con 1,5 \mul de oligo 5' 10 \muM y 5 \mul
de oligo de fusión 10 \muM se combinan con los siguientes
reactivos a las concentraciones finales indicadas: tampón sin Mg
10X (1X), MgCl_{2} (2mM), mezcla de dNTP (200 \muM de cada
dNTP), ADN polimerasa Taq (2,5 unidades) y agua para llevar la
mezcla a un volumen final de 100 \mul. Se usa un termociclador
Thermal Cycler (Perkin Elmer Cetus, Norwalk, CT) para amplificar en
las siguientes condiciones: 35 ciclos a 95ºC durante 1 minuto, 55ºC
durante dos minutos y 72ºC durante tres minutos. Este procedimiento
da como resultado un "megacebador".
El megacebador resultante se corre en un gel de
agarosa de bajo punto de fusión al 4% en TAE 1X. La banda del
megacebador se corta del gel y se purifica usando el sistema de
purificación de ADN Promega Magic PCR Preps. Después, el
megacebador purificado se usa en una segunda etapa de PCR. Se añade
un \mug de molde genómico 2, aproximadamente 0,5 \mug del
megacebador y 5 \mul de oligo 3' 10 \muM a una combinación de
tampón 10X, MgCl_{2}, dNTP y Taq, a las mismas concentraciones
finales que se han indicado anteriormente, y se lleva a 100 \mul
de volumen con agua. Las condiciones de PCR son las mismas que se
han indicado anteriormente. El producto de fusión resultante de
esta amplificación también se purifica usando el sistema de
purificación de ADN Promega Magic PCR Preps.
Después, el producto de fusión se liga con un
vector TA y se transforma en E. coli usando el kit de
Invitrogen (San Diego, CA) TA Cloning Kit. Se ligan aproximadamente
50 ng de producto de PCR de fusión con 50 ng de vector pCRII con
tampón de ligación 1X y 4 unidades de ligasa T4 y se lleva a un
volumen de 10 \mul con agua. Esta mezcla de producto ligado se
incuba a 12ºC durante una noche (aproximadamente 14 horas). Se
añaden dos \mul de la mezcla de producto de ligación a 50 \mul
de células INC F' competentes y 2 \mul de
beta-mercaptoetanol. Después, las células se
incuban durante 30 minutos, seguidos de un tratamiento de choque
térmico a 42ºC durante 60 segundos y un enfriamiento en hielo de
dos minutos. Después, se añaden 450 \mul de medio SOC calentado a
las células, dando como resultado un cultivo de células
transformadas que se incuba a 37ºC durante una hora con agitación
ligera. Se siembran en placas 50 \mul del cultivo de células
transformadas sobre placas de LB + ampicilina 50 \mug/\mul y se
incuban durante una noche a 37ºC. Se seleccionan colonias blancas
individuales y se añaden a cultivos individuales, que contienen 3
ml de LB con ampicilina (50 \mug/\mul), durante una noche.
Los cultivos individuales de una noche se
preparan usando el sistema de purificación de ADN Promega's Magic
Miniprep. Se corta una pequeña cantidad del ADN resultante mediante
el uso de una digestión de restricción como comprobación. Después,
se realiza la secuenciación del ADN para comprobar la secuencia de
la secuencia de ácido nucleico de fusión, usando el kit de
secuenciación United States Biochemical (Cleveland, OH) Sequenase
Versión 2.0. Se usan de tres a cinco \mug de ADN plasmídico por
reacción. Se añaden al ADN 2 \mul de NAOH 2M/EDTA 2 mM y el
volumen se lleva a 20 \mul con agua. Después, la mezcla se incuba
a temperatura ambiente durante cinco minutos. Se añaden 7 \mul de
agua, 3 \mul de NaAc 3M y 75 \mul de etanol. La mezcla
resultante se mezcla mediante agitación vorticial y se incuba
durante diez minutos a -70ºC y, después, se somete a
microcentrifugación. Después de una microcentrifugación de diez
minutos, el sobrenadante se retira por aspiración y el sedimento se
seca en un evaporador por centrifugación de tipo speed vac durante
30 segundos. Después, se añaden 6 \mul de agua, 2 \mul de
tampón de hibridación y 2 \mul del oligo adecuado 10 \muM. Esta
mezcla se incuba durante 10 minutos a 37ºC y después se deja
reposar a temperatura ambiente durante 10 minutos. Posteriormente,
se añaden 5,5 \mul de la combinación de marcaje (descrita
anteriormente) a cada muestra de la mezcla, que se incuban a
temperatura ambiente durante cinco minutos adicionales. Después, se
añaden 3,5 \mul de ADN marcado a cada muestra, que después se
incuba durante cinco minutos a 37ºC. Se añaden 4\mul de solución
de parada a cada pocillo. El ADN se desnaturaliza a 95ºC durante dos
minutos y después se coloca en hielo.
Después, se vuelven a clonar los clones con las
secuencias de ácidos nucleicos de fusión deseadas en la fase de
lectura del sistema de expresión pET, en forma lipidada (longitud
completa) y no lipidada (truncada, es decir, sin los 17 primeros
aminoácidos). El producto se amplifica usando sitios de restricción
contenidos en los cebadores de PCR. El vector y el producto se
cortan con las mismas enzimas y se ligan juntos con ligasa T4. El
plásmido resultante se transforma en E. coli competentes,
usando técnicas de transformación convencionales. Las colonias se
seleccionan, como se ha descrito anteriormente, y los clones
positivos se transforman en células de expresión, tales como E.
coli BL21, para la expresión de proteína con IPTG para la
inducción. La proteína expresada, en su forma de lisado de cultivo
bacteriano y/o en forma purificada, se inyecta después en ratones
para la producción de anticuerpos. A los ratones se les extrae
sangre y los sueros se recogen para los ensayos de aglutinación, de
inhibición del crecimiento in vitro y de lisis dependiente e
independiente del complemento.
Un ejemplo específico de OspA quimérica es el
siguiente. Pueden generarse otras quimeras de OspA usando el mismo
procedimiento con cebadores adecuados.
Se generó una quimera de la OspA de la cepa K48
(OspA-K48) y de la OspA de la cepa PGau
(OspA-PGau) usando el procedimiento descrito
anteriormente. Esta secuencia de ácido nucleico quimérica incluía
las pb 1-654 de OspA-K48, seguidas
de las pb 655-820 de OspA-PGau. Los
cebadores usados incluían: el cebador de la secuencia
amino-terminal de OspA Nº 607 (SEC ID Nº: 16); el
cebador de fusión,
5'-AAAGTAGAAGTTTTTGAATCCCATTTTCCAGTTTTTTT-3'
(cebador de la hebra negativa Nº 668-654) (SEC ID
Nº: 27); el cebador de la secuencia carboxi-terminal
de OspA Nº 586 (SEC ID Nº: 19); y los cebadores de la secuencia Nº
369 (SEC ID Nº: 14) y Nº 357 (SEC ID Nº: 15). La secuencia de ácido
nucleico quimérica se presenta como SEC ID Nº: 28; la proteína
quimérica codificada por esta secuencia de ácido nucleico quimérica
se presenta como SEC ID Nº: 29.
Las secuencias de ácidos nucleicos quiméricas
descritas anteriormente, así como las secuencias de ácidos nucleicos
quiméricas producidas mediante los procedimientos descritos
anteriormente, se usan para producir proteínas quiméricas
codificadas por las secuencias de ácidos nucleicos. Pueden usarse
procedimientos convencionales, como los descritos anteriormente en
el Ejemplo 3, en lo que se refiere a la expresión de proteínas de
genes de Borrelia, para expresar las proteínas en un
organismo huésped compatible. Después, las proteínas quiméricas
pueden aislarse y purificarse usando técnicas convencionales.
Pueden usarse ácidos nucleicos que codifican
versiones modificadas de OspA para generar quimeras de OspA.
Además, pueden usarse ácidos nucleicos que codifican quimeras de
OspA para generar los polipéptidos de OspA modificados de la
presente invención.
Si la proteína quimérica es soluble, puede
purificarse en una columna de sefarosa. Las proteínas insolubles
pueden solubilizarse en guanidina y purificarse en una columna de
Ni^{2+}; como alternativa, pueden solubilizarse en NaPO_{4} 10
mM con TRIXON X 114 al 0,1-1% y, posteriormente,
purificarse en una columna S (Pharmacia). Las proteínas lipidadas
se purificaron generalmente mediante este último procedimiento. La
solubilidad se determinó mediante la separación de las fracciones
tanto soluble como insoluble del lisado celular en un gel de PAGE
al 12% y la comprobación de la localización de la proteína mediante
tinción de Coomassie o mediante transferencia de Western con
anticuerpos monoclonales dirigidos contra un polipéptido antigénico
de la proteína quimérica.
\vskip1.000000\baselineskip
Se generó un gran número de secuencias de ácidos
nucleicos quiméricas que codificaban proteínas que comprendían al
menos un primer y un segundo polipéptido de Borrelia
burgdorferi. Estas secuencias de ácidos nucleicos quiméricas se
produjeron de tal modo que la proteína quimérica que codificaban
comprendía un polipéptido OspC de Borrelia burgdorferi
cadena arriba de (o N-terminal a) un polipéptido
OspA de Borrelia burgdorferi. Las secuencias de ácidos
nucleicos quiméricas también se produjeron de tal modo que el ácido
nucleico que codificaba un polipéptido estaba en la misma fase de
lectura que la secuencia de ácido nucleico que codificaba el
siguiente polipéptido en la proteína quimérica.
La estrategia general de clonación usada para
construir las secuencias de ácidos nucleicos quiméricas fue la
siguiente. El fragmento deseado de OspC se amplificó usando un
cebador 5', que contenía un sitio de restricción adecuado para la
clonación del producto resultante en un vector de interés, y un
cebador 3', que contenía un sitio de restricción adecuado para la
ligación del fragmento de OspC con el fragmento de OspA. El producto
de OspC se clonó en un vector adecuado. Para la porción de OspA del
ácido nucleico quimérico, el fragmento de OspA deseado se amplificó
usando un cebador 5', que contenía un sitio de restricción para la
ligación del fragmento de OspA resultante con el fragmento de OspC,
y un cebador 3', que contenía un sitio de restricción adecuado para
la clonación del producto de OspA resultante en el vector con el
producto de OspC. El uso de un sitio de restricción para permitir
la ligación de los fragmentos de OspC y OspA da como resultado la
inserción de 0 a aproximadamente 3 aminoácidos entre los fragmentos
de OspC y OspA.
Un ejemplo específico de dicha construcción es
el siguiente. Se entiende que pueden usarse otros sitios de
restricción adecuados sin ninguna experimentación o con sólo
experimentación de rutina. La quimera OspC/OspA resultante puede
tener, por lo tanto, la adición de 0 a aproximadamente 3 aminoácidos
o más entre los fragmentos de OspC y OspA, dependiendo del sitio de
restricción usado.
Para las porciones de OspC de los ácidos
nucleicos quiméricos, se amplificaron por PCR los fragmentos
deseados de genes de OspC de diversas cepas o genoespecies usando
un cebador 5', que contenía un sitio NdeI, y un cebador 3', que
contenía un sitio NcoI y un sitio BamHI. El producto de OspC
amplificado se clonó después en los sitios NdeI y BamHI del vector
de expresión pET9c, dirigido por el promotor T7. Para la porción de
OspA del ácido nucleico quimérico, se amplificaron por PCR los
fragmentos deseados de los genes de OspA de una cepa de interés, o
de una genoespecie de interés, usando un cebador 5', que contenía un
sitio NcoI, y un cebador 3', que contenía un sitio BamHI. Después,
esta porción de OspA podía clonarse directamente en los sitios NcoI
y BamHI del vector pET9c, que contenía la secuencia de OspC
deseada, produciendo de este modo la construcción
OspC-OspA deseada. Mediante la inclusión de la
secuencia del sitio de restricción NcoI en los cebadores, se produjo
una secuencia de engarce de nueve nucleótidos que codificaba los
aminoácidos Ser-Met-Ala en la unión
entre la secuencia N-terminal de OspC y la
secuencia C-terminal de OspA. El uso de la enzima de
restricción NcoI (CCATGG) en esta estrategia de clonación era una
selección adecuada ya que Borrelia es un organismo rico en AT
que posee solamente unos pocos sitios NcoI en su genoma. Un
especialista en la técnica sabrá que pueden utilizarse diferentes
sitios de restricción y sabrá cómo generar las construcciones
quiméricas OspC/A para su uso en las modificaciones posteriores que
se describen en este documento, sin ninguna experimentación o con
sólo experimentación de rutina.
Como un ejemplo, los ácidos nucleicos quiméricos
de OspC-OspA, que contienen OspC de B31 no lipidada,
se generaron usando los siguientes cebadores:
| (5'OspC-NdeI): | 5'-GT CAT ATG GCT TGT AAT AAT TCA GGG AAA GA-3' | (SEC ID Nº: 91); y |
| (3'OspC-NcoI): | 5'-T TTC CAT GGA AGG TTT TTT TGG ACT TTC TG-3' | (SEC ID Nº: 92). |
Para los ácidos nucleicos quiméricos de
OspC-OspA, que contienen OspA de B31 no lipidada, se
usaron los siguientes cebadores:
| (5'OspA-NcoI): | 5'-TT TCC ATG GCC AAG CAA AAT GTT AGC AGC C-3' | (SEC ID Nº: 93); y |
| (3'OspA-BamHI): | 5'-TAA GGA TCC TTA TTT TAA AGC GTT TTT-3' | (SEC ID Nº: 94). |
Pueden construirse versiones lipidadas de las
quimeras OspC/OspA mediante el diseño de cebadores para amplificar
la porción del molde que incluye la secuencia de señal de lipidación
o mediante la generación de una construcción de ácido nucleico con
una secuencia de señal de lipidación adecuada. La secuencia líder
que comprende una señal de lipidación puede ser, por ejemplo, de un
gen que codifica los polipéptidos de OspA, OspB u OspC.
Como se ha descrito en los ejemplos anteriores,
es posible expresar y purificar proteínas o polipéptidos de
Borrelia, por ejemplo, polipéptidos de OspA, polipéptidos de
OspC, polipéptidos quiméricos de OspC/OspA y polipéptidos que
comprenden las modificaciones de OspA que se describen en este
documento. Esto se consigue mediante la incorporación de la
secuencia de ácido nucleico deseada, que codifica la proteína de
elección, en un plásmido de expresión, por ejemplo, usando técnicas
convencionales. Después, este plásmido de expresión puede
transfectarse en una célula huésped compatible para expresar la
proteína deseada.
Por ejemplo, las proteínas OspA, OspC u
OspC/OspA quimérica purificadas, que se usaron para inmunizar
ratones y en los ensayos de ELISA que se describen a continuación,
se generaron y se purificaron mediante la clonación de las
secuencias de ácidos nucleicos de OspA, OspC o de OspC/OspA
quimérica en la fase de lectura abierta del plásmido de expresión
pET. Después, el plásmido de expresión se transfectó en la línea
celular de expresión compatible de la cepa BL21 (pLysS) o de la
cepa B834 (DE3) de Escherichia coli. Las células BL21 o B834
se cultivaron en 10 ml de medio LB (NaCl 5 g/l, triptona 10 g/l,
extracto de levadura 5 g/l, cloranfenicol 25 mg/l y ampicilina 50
mg/l) a 37ºC con agitación. Cuando la densidad óptica a 600\lambda
alcanzó 0,3-0,4 unidades, se indujo la expresión de
proteína recombinante mediante la adición de IPTG
(\beta-D-tiogalactopiranósido de
isopropilo) hasta una concentración final de 0,5 mM y las células se
cultivaron durante tres horas adicionales. Los cultivos se
recogieron mediante centrifugación a 3800 x g durante cinco minutos.
Las células se resuspendieron en NaPO_{4} 20 mM, pH 7,7, y se
almacenaron a -20ºC durante una noche. Una vez descongelados, los
extractos brutos se incubaron con ADNasa (2 \mug/ml) en presencia
de MgCl_{2} 2,5 mM a temperatura ambiente durante treinta minutos
y después se centrifugaron a 14.000 rpm (Eppendorf 5417C) durante
cinco minutos.
Para purificar las proteínas OspC que se
describen a continuación, los extractos brutos de las células que
expresan OspC se cargaron en una columna de intercambio aniónico (Q
Sepharose Fast Flow, 2,2 x 10 cm, Pharmacia) que se había
preequilibrado con Tris-Cl 20 mM a pH 9,3. La
columna se lavó en el mismo tampón (Tris-Cl 20 mM,
pH 9,3) que eluyó la proteína OspC. Las fracciones de lavado que
contenían OspC se concentraron usando un Amicon 10K y después se
dializaron con una solución que contenía NaPO_{4} 20 mM, pH 8,0, y
NaCl 250 mM. Después, se hizo pasar la OspC parcialmente purificada
por una columna de afinidad de metal Ni^{2+} (Chelating Sepharose
Fast Flow 2,2 x 10cm) equilibrada con NaPO_{4} 20 mM, pH 8,0, y
NaCl 250 mM. La columna se lavó usando un gradiente decreciente de
pH de ácido sódico acético 20 mM y NaCl 250 mM y la OspC unida se
eluyó a un pH de aproximadamente 5,7. Después, las fracciones de
OspC se concentraron mediante ultrafiltración y se almacenaron a
-70ºC.
Para la purificación de proteínas OspA, se
siguió el mismo procedimiento excepto por que la etapa de diálisis,
después de la separación con Amicon 10 K, se realizó en NaPO_{4}
20 mM, pH 6,0. Después, la OspA parcialmente purificada se aplicó a
una columna de intercambio catiónico (S Sepharose Fast Flow 2,2 x 10
cm, Pharmacia) equilibrada con NaPO_{4} 20 nM, pH 6,0. La columna
se lavó usando un gradiente creciente de NaCl de 0 a 100 mM. Las
fracciones que contenían OspA se concentraron mediante
ultrafiltración y se almacenaron a -70ºC.
Como se ha indicado anteriormente, se generaron
formas tanto lipidadas como no lipidadas (por ejemplo, truncadas,
que carecen de los 17 primeros aminoácidos) de las proteínas OspC,
OspA y OspC/OspA quimérica.
Las técnicas descritas anteriormente también se
usaron para expresar proteínas que comprendían los polipéptidos
OspA modificados de la presente invención.
Se inmunizaron ratones C3H-J o
ICR con 3 \mug de proteína quimérica OspC/OspA lipidada o con 6
\mug de la quimera OspC/OspA no lipidada en 100 ml de adyuvante
de hidróxido de aluminio (concentración de 1,8 mg/ml) mediante
inyección por vía subcutánea (SC). Como control negativo, se
inmunizaron ratones únicamente con 100 ml de adyuvante de hidróxido
de aluminio. Todos los ratones recibieron un total de tres
inyecciones que se administraron a intervalos de dos semanas. Una
semana después de la inmunización final, se extrajo sangre de cada
ratón (incluyendo los ratones de control negativo) y el suero se
analizó para determinar la reactividad de IgG, usando el
procedimiento de ELISA que se describe a continuación para
determinar la presencia de anticuerpos anti-OspA
contra tres proteínas OspA diferentes purificadas (Borrelia
burgdorferi sensu stricto (B31), Borrelia garinii (K48)
y Borrelia afzelii (PGau)). Los sueros se ensayaron a una
dilución 1:1000.
Los ratones se inmunizaron con las proteínas
quiméricas que se describen en la Tabla III.
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Se añadió una solución de proteína OspC u OspA
recombinante purificada de cada una de las cepas de Borrelia
burgdorferi B31 (Borrelia burgdorferi sensu
stricto), K48 (Borrelia garinii) y PGau (Borrelia
afzelii) a tampón fosfato sódico, pH 9,0, y se usó para revestir
una placa de micropocillos comercial (MaxiSorp®, Nunc). El
procedimiento de revestimiento fue de la manera siguiente: se
añadieron 100 \mul de una solución que contenía la proteína OspA
u OspC apropiada (preparada a una concentración de 250 ng/ml en el
siguiente tampón de revestimiento:
Bis-Tris-propano 100 mM, pH 9,7) a
cada pocillo de una placa de microtitulación que se incubó durante
una hora a 37ºC. La solución de antígeno se retiró de los pocillos,
la placa se lavó tres veces con solución salina tamponada con
fosfato (PBS) a pH 9,0 y se añadieron 300 \mul de solución de
tampón de bloqueo (leche en polvo al 3%, polioxietilensorbitán al
0,1% (denominado en este documento como Tween 20^{TM}) y
NaN_{3} al 0,02% en
Bis-Tris-propano 100 nM, pH 9,7).
Después de una hora de incubación a 37ºC, la placas se lavaron
cuatro veces con tampón de lavado TBS-Tween
20^{TM} (Tris-Cl 20 mM a pH 7,5, NaCl 136 mM,
Tween 20^{TM} al 0,1% y NaN_{3} al 0,02%) y después se dejaron
secar. Después, las placas se envolvieron en plástico y se
almacenaron a 4ºC hasta su uso.
El procedimiento convencional para los ensayos
de ELISA fue de la manera siguiente: se diluyó suero de ratón
1:1000 en tampón de dilución de muestras (leche en polvo al 1%, NaCl
136 mM, Tween 20^{TM} al 0,1%, NaN_{3} al 0,02% en
Tris-Cl 20 mM, pH 7,5) y se añadieron 100 \mul del
suero diluido a los pocillos de la placa de microtitulación de
ELISA, que se habían revestido con el antígeno como se ha descrito
anteriormente. Después de la incubación durante 1 hora a 37ºC, las
muestras se retiraron y las placas se lavaron cuatro veces en
TBS-Tween^{TM} (Tris-Cl 20 mM, pH
7,5; NaCl 136 mM; Tween 20^{TM} al 0,1% y NaN_{3} al 0,02%).
Para el anticuerpo secundario, se diluyó antisuero de cabra
anti-ratón conjugado con fosfatasa alcalina
específico para IgM (Fc) o IgG (Fab) (Jackson Immuno Research
Laboratories) 1:750 en tampón de dilución de muestras (leche en
polvo al 1%, NaCl 136 mM, Tween 20^{TM} al 0,1%, NaN_{3} al
0,02% en Tris-Cl 20 mM, pH 7,5) y se añadieron 100
\mul del anticuerpo secundario diluido a cada pocillo. Después de
la incubación durante treinta minutos a 37ºC, las placas se lavaron
tres veces con TBS-Tween^{TM} y se añadieron a
cada pocillo 100 \mul de solución de sustrato de fosfatasa (5 mg
de comprimidos de p-nitrofenilfosfato disueltos en tampón de
sustrato de dietanolamina 1X para producir una solución 2 mg/ml -
Kirkegaard Perry Laboratory). Las placas se incubaron durante
treinta minutos a 37ºC y se añadieron a cada pocillo 100 \mul de
solución de parada (EDTA al 5%). Se leyó la absorbancia a 405 nm en
un lector de microplacas (Dynatech). Una muestra se consideraba
positiva si producía una absorbancia media superior a la media de
los controles negativos más tres desviaciones típicas.
Trabajos anteriores han demostrado que es la
región carboxi-terminal de OspA la que contiene los
sitios antigénicos que proporcionan la respuesta inmunoprotectora.
Por lo tanto, además del ensayo de ELISA descrito anteriormente, se
realizó un ELISA modificado (denominado en este documento como
ensayo de ELISA protector), en el que la región
N-terminal (aminoácidos 18-139) de
OspA de B31 purificada se usó en exceso para bloquear cualquier
anticuerpo presente en el suero de ratón que tuviera especificidad
por esta región N-terminal de OspA. Estos ensayos
de ELISA protector se realizaron como se ha descrito anteriormente,
excepto por que se añadieron 80 \mug/ml de un fragmento de OspA
de B31 purificado (aminoácidos 18-139) al suero de
ratón diluido antes de añadir los sueros a los pocillos de la placa
de microtitulación de ELISA revestidos con antígeno.
Usando los ensayos de ELISA descritos
anteriormente, se demostró que los ratones inmunizados con una
proteína quimérica OspC/OspA no lipidada
(OspC2-OspA compuesta por OspC (aminoácidos
19-204 de la cepa C2)/OspA (aminoácidos
18-273 de la cepa B31) (SEC ID Nº: 60) produjeron
una respuesta inmune tanto para OspA como para OspC que era
comparable a la respuesta inmune generada contra proteínas de
control OspA no lipidadas (OspA - aminoácidos
18-273 de la cepa B31) y OspC no lipidadas (OspC -
aminoácidos 19-211 de la cepa B31) (Figura 22). Como
se indica en la Figura 22 y se ha descrito anteriormente, los
ratones se inmunizaron con proteínas OspA, OspC u
OspC2-OspA y las respuestas inmunes de los sueros se
midieron contra el antígeno OspA de B31 (barras de puntos) y el
antígeno OspC de B31 (barras rellenas).
Usando el ensayo de ELISA protector descrito
anteriormente, también se demostró que los ratones inmunizados con
la misma proteína quimérica OspC/OspA no lipidada
(OspC2-OspA compuesta por OspC (aminoácidos
19-204 de la cepa C2)/OspA (aminoácidos
18-273 de la cepa B31) (SEC ID Nº: 60) produjeron
una respuesta inmune contra la porción C-terminal
de OspA que fue comparable a la respuesta inmune generada contra la
porción C-terminal de una proteína de control OspA
no lipidada (OspA - aminoácidos 18-273 de la cepa
B31) (Figura 23). Como se indica en la Figura 23, los ratones se
inmunizaron con proteínas OspA, OspC u OspC2-OspA y
las respuestas inmunes de los sueros se midieron contra el antígeno
OspA de B31. La respuesta de anticuerpos protectora contra el
antígeno OspA de B31 se indica en las barras punteadas.
Por lo tanto, estos resultados demuestran
claramente que las proteínas quiméricas OspC/OspA no lipidadas son
capaces de inducir respuestas inmunes en ratones que son comparables
a la respuesta inmune generada contra proteínas de control OspC y
OspA no lipidadas.
Anteriormente se pensaba que las señales de
lipidación que están presentes en las proteínas de la superficie
externa de Borrelia burgdorferi eran necesarias para la
inmunogenicidad y que las proteínas OspC y OspA que carecían de
esta señal de lipidación eran menos o no inmunogénicas. Para evaluar
esta idea, se inmunizaron ratones con una proteína quimérica
OspC/OspA no lipidada (OspC-OspAB/P compuesta por
OspC (aminoácidos 19-211 de la cepa B31)/OspA
(aminoácidos 18-216 de la cepa B31)/OspA
(aminoácidos 217-273 de la cepa Pko) (SEC ID Nº:
66), así como con dos proteínas OspA lipidadas, lipOspAP/Bo
(compuesta por OspA (aminoácidos 1-217 de la cepa
PGau)/OspA (aminoácidos 218-273 de la cepa Bo)) y
lipOspAB/P (compuesta por OspA (aminoácidos 1-216
de la cepa B31)/OspA (aminoácidos 217-273 de la cepa
Pko)), y se sometieron a ensayos de ELISA. Los ratones inmunizados
con la proteína quimérica OspC/OspA no lipidada
(OspC-OspAB/P) produjeron una respuesta inmune
contra OspA de cada una de las cepas de Borrelia burgdorferi
B31 (Borrelia burgdorferi sensu stricto), K48 (Borrelia
garinii) y PGau (Borrelia afzelii), que era equivalente o
superior a la respuesta inmune generada contra las dos proteínas de
control OspA lipidadas (lipOspAP/Bo y lipOspAb/P) (Figura 24).
Se obtuvieron resultados similares a éstos
usando el ensayo de ELISA protector descrito anteriormente. Los
ratones inmunizados con la proteína quimérica OspC/OspA no lipidada
(OspC-OspAB/P) produjeron una respuesta inmune
contra la región C-terminal de OspA de cada una de
las cepas de Borrelia burgdorferi B31 (Borrelia
burgdorferi sensu stricto), K48 (Borrelia garinii) y PGau
(Borrelia afzelii), que era equivalente o superior a la
respuesta inmune generada contra la región
C-terminal de OspA de las dos proteínas de control
OspA lipidadas (lipOspAP/Bo y lipOspAb/P) (Figura 25).
Además de las comparaciones entre proteínas
quiméricas OspC/OspA no lipidadas y proteínas de control OspA
lipidadas, también se realizaron experimentos para comparar
proteínas quiméricas OspC/OspA no lipidadas con una proteína de
control OspC lipidada (Figura 26). Los ratones que se inmunizaron
con la proteína quimérica OspC/OspA no lipidada
OspC31-OspAB31 (compuesta por OspC (aminoácidos
19-211 de la cepa B31)/OspA (aminoácidos
18-273 de la cepa B31) (SEC ID Nº: 56) o con la
proteína quimérica OspC/OspA no lipidada
OspC2-OspAB31 (compuesta por OspC (aminoácidos
19-204 de la cepa C2)/OspA (aminoácidos
18-273 de la cepa B31) (SEC ID Nº: 60) produjeron
una respuesta inmune contra OspC obtenida a partir de la cepa B31 de
Borrelia burgdorferi que era comparable a la respuesta
inmune producida por una proteína de control OspC lipidada
(lipOspC-B31 - compuesta por OspC (aminoácidos
1-211 de la cepa B31)) (Figura 26).
Por lo tanto, estos resultados demuestran
claramente que las proteínas quiméricas OspC/OspA no lipidadas son
capaces de inducir respuestas inmunes contra OspA y OspC que son
comparables a la respuesta inmune generada contra OspA y OspC
usando proteínas de control OspA u OspC lipidadas. El uso de formas
no lipidadas de estas proteínas como inmunógenos vacunales o como
antígenos diagnósticos es muy deseable porque el rendimiento de
producto es mucho mayor y las proteínas son mucho más fáciles de
purificar. Por estas razones, la producción de estas proteínas es
menos costosa.
Las proteínas quiméricas OspC/OspA de la
presente invención también son capaces de generar respuestas inmunes
contra proteínas OspA que se obtienen a partir de cepas que no
están representadas en la proteína quimérica. Los ratones
inmunizados con las proteínas quiméricas OspC/OspA
OspCB31-OspAB31 (SEC ID Nº: 56) y
OspC2-OspAB31 (SEC ID Nº: 60) no sólo son capaces
de generar respuestas inmunes que reconocen OspA obtenidas a partir
de la cepa B31 (Borrelia burgdorferi sensu stricto), sino
que también reconocen OspA obtenidas a partir de la cepa K48
(Borrelia garinii) y de la cepa PGau (Borrelia
afzelii) (Figura 27). Con fines comparativos, los ratones
también se inmunizaron con la proteína quimérica OspA lipidada
lipOspAK/T (compuesta por OspA (aminoácidos 1-217
de la cepa K48)/OspA (aminoácidos 218-273 de la cepa
Tro)) (Figura 27).
Los sueros de ratones inmunizados con otras
proteínas quiméricas OspC/OspA también presentan respuestas de
anticuerpos adicionales contra OspA obtenidas a partir de la cepa
B31 (Borrelia burgdorferi sensu stricto), de la cepa K48
(Borrelia garinii) y de la cepa PGau (Borrelia
afzelii). Por lo tanto, la Figura 28 presenta los resultados de
ELISA de ratones inmunizados con OspCB31-OspAB/P
(SEC ID Nº: 66), OspCB31-OspABPBP (SEC ID Nº: 88) u
OspCB31-OspAB31 (SEC ID Nº: 56). En cada caso, se
ensayaron sueros de los ratones inmunizados contra OspA obtenidas a
partir de cada una de las cepas B31 (Borrelia burgdorferi sensu
stricto), K48 (Borrelia garinii) y PGau (Borrelia
afzelii). En todos los casos, se generó una fuerte respuesta
inmune (Figura 28). Como con las proteínas quiméricas OspC/OspA
descritas anteriormente, las tres proteínas quiméricas OspC/OspA
usadas para inmunizar los ratones de la Figura 27 también
desencadenaron una fuerte respuesta inmune contra la región
C-terminal de OspA, al examinarse usando el ensayo
de ELISA protector descrito anteriormente (Figura 29).
Las técnicas descritas anteriormente también se
usaron para inmunizar ratones y para caracterizar serológicamente
la respuesta inmune contra las proteínas que comprenden los
polipéptidos de OspA modificados de la presente invención.
También se expusieron ratones
C3H-J o JCR, que se habían inmunizado como se ha
descrito anteriormente, a ninfas infectadas en laboratorio o a
ninfas de campo. Los ratones inmunizados se colocaron en jaulas de
aislamiento y cada ratón recibió 5-10 ninfas. Todas
las ninfas se recogieron y se contaron después de 6 días. Cuatro
semanas después de la exposición, se extrajo sangre de los ratones
y los sueros se analizaron usando tiras de transferencia de Western
disponibles en el mercado contra la cepa B31 de Borrelia
burgdorferi sensu stricto (MarDx strips) y/o Borrelia
garinii (MRL strips). Ocho semanas después de la exposición, se
extrajo sangre de los ratones, los sueros se analizaron de nuevo
mediante transferencia de Western y se cultivaron muestras de oreja
tomadas con sacabocados y de vejiga. Como control positivo, los
ratones que se habían inmunizado sólo con adyuvante de hidróxido de
aluminio, como se ha descrito anteriormente, se sometieron a la
misma exposición.
Los resultados de los estudios de exposición a
garrapatas (Tabla IV) demuestran que mientras que la inmunización
con proteína OspC lipidada era incapaz de proteger a los ratones,
como se demuestra mediante una señal positiva de transferencia de
Western (en 4 de 5 ratones), la inmunización con dos proteínas
quiméricas OspC/OspA diferentes (SEC ID Nº: 56 y SEC ID Nº: 62) sí
proporcionó protección, como indica la ausencia de señal en la
transferencia de Western (en 0 de 8 ratones y en 0 de 3 ratones)
(Tabla IV). Los controles positivos de tratamiento simulado
demostraron que la exposición a las garrapatas tuvo éxito en todos
los casos, como se demuestra por el 100% de señal positiva en las
transferencias de Western (Tabla IV). Los resultados de los
experimentos de exposición a garrapatas se muestran en la Tabla
IV.
\vskip1.000000\baselineskip
Las técnicas descritas anteriormente también se
usan para medir la capacidad de los ratones inmunizados con
proteínas que comprenden los polipéptidos OspA modificados de la
presente invención de resistir o responder a la transmisión de
Borrelia por garrapatas.
\vskip1.000000\baselineskip
Todas las construcciones se prepararon mediante
el uso del kit de mutagénesis dirigida Stratagene's QuikChange. La
mutagénesis dirigida se realizó usando la ADN polimerasa Pfu Turbo
II y un termociclador. La ADN polimerasa Pfu Turbo replica las dos
hebras del plásmido con alta fidelidad y sin desplazar los cebadores
oligonucleotídicos mutantes. El procedimiento básico usaba un
vector de ADN bicatenario superenrollado (pET 9c para todas las
construcciones) con un inserto de interés y dos cebadores
oligonucleotídicos sintéticos que contenían la mutación o
mutaciones deseadas. Los cebadores oligonucleotídicos, cada uno de
ellos complementario a hebras opuestas del vector, se extendían
durante el termociclado mediante la ADN polimerasa Pfu Turbo. La
incorporación de los cebadores oligonucleotídicos originaba un
plásmido mutado que contenía mellas escalonadas. Después del
termociclado, el producto lineal se trató con la enzima de
restricción Dpn I, que es específica para ADN metilado. El ADN
aislado de la mayoría de las cepas de E. coli está metilado
y, por lo tanto, es susceptible a la digestión con Dpn I. De este
modo, la digestión con Dpn I destruyó el molde de ADN original,
dejando solamente el ADN plasmídico mellado (que no estaba
metilado) que contenía la mutación o mutaciones deseadas. Este
vector de ADN mellado (que contenía la mutación o mutaciones
deseadas) se transformó después en E. coli competentes que
se sembraron en placas que contenían antibiótico. Las colonias que
contenían el plásmido (que codifica una resistencia a antibióticos
además del polipéptido OspA modificado) se cultivaron y los
plásmidos se purificaron y secuenciaron para confirmar que poseían
la mutación o mutaciones deseadas.
Las mutaciones que se describen en este
documento se realizan usando ácidos nucleicos (por ejemplo,
polinucleótidos) que codifican polipéptidos de OspA o fragmentos de
cualquier cepa de Borrelia causante de enfermedad de Lyme,
tal como Borrelia burgdorferi sensu stricto, Borrelia afzelii
o Borrelia garinii. Como un ejemplo, se describe a
continuación la generación de las mutaciones M3 en una quimera de
OspA, denominada "BPBP". La generación de la construcción OspA
BPBP M3 fue de la manera siguiente. BPBP es un polipéptido OspA
quimérico en el que los restos 1-164 son de OspA de
B31, los restos 165-179 son de OspA de Pko o de
PGau, los restos 180-216 son de OspA de B31 y los
restos 217-273 son de OspA de Pko (en los que la
numeración es como se muestra en la SEC ID
Nº: 7).
Nº: 7).
La primera etapa en la generación de esta
construcción era obtener la construcción BPBP M1. La mutación M1
está constituida por una mutación en el codón 139 (aga) de OspA
desde el aminoácido arginina hasta el aminoácido metionina (codón
atg). Se preparó una reacción de PCR, como se ha descrito
anteriormente, que contenía un polinucleótido que codificaba BPBP
como molde de ADN y los siguientes cebadores oligonucleotídicos:
| a) 5' R139M: | |
| 5' gaa aaa ata aca atg gca gac gga acc 3' | (SEC ID Nº: 117). |
| b) 3' R139M: | |
| 5' ggt tcc gtc tgc cat tgt tat tat ttt ttc 3' | (SEC ID Nº: 118) |
La reacción de PCR también contenía tampón de
reacción, 10 ng del molde de ADN BPBP, 125 ng de cada cebador
oligonucleotídico y la mezcla de dNTP. Los parámetros para la PCR
eran los que se describen en la Tabla V.
\vskip1.000000\baselineskip
Después de la PCR, el producto se transformó en
células E. coli XL1-Blue competentes. Las
colonias formadas en las placas de agar selectivas (que contenían
kanamicina) se cultivaron y los plásmidos se purificaron y se
secuenciaron para confirmar que poseían la mutación deseada.
Después, la construcción de BPBP M1 se usó como molde para generar
el plásmido BPBP M2, que además de la mutación R139M también
contenía una mutación que cambia el codón de ácido glutámico (gag)
de la posición 160 por un codón (tat) que codifica tirosina. Los
cebadores oligonucleotídicos usados para generar este plásmido
fueron:
| a) 5' E160Y | |
| 5' gga aaa gct aaa tat gtt tta aaa ggc 3' | (SEC ID Nº: 119) |
| b) 3' E160Y | |
| 5' gcc ttt taa aac ata ttt agc ttt tcc 3' | (SEC ID Nº: 120) |
Los parámetros para la PCR eran los que se
describen en la Tabla VII. La mutación final, M3, que modifica un
resto lisina en la posición 189 a un resto metionina, se realizó
usando BPBP M2 como molde de ADN. Los cebadores oligonucleotídicos
usados para generar este plásmido fueron:
| a) 5' K189M | |
| 5' gtt act tta agc atg aat att tca aaa tc 3' | (SEC ID Nº: 121) |
| b) 3' K189M | |
| 5' ga ttt tga att cat gct taa agt aac 3' | (SEC ID Nº: 122) |
Esta mutación final produjo la construcción
deseada, BPBP M3.
Los mutantes J1, J2, y J3 se generaron usando el
mismo protocolo descrito para la generación de los mutantes M1, M2
y M3. Dichos mutantes pueden generarse usando ácidos nucleicos (por
ejemplo, polinucleótidos) que codifican fragmentos de polipéptidos
de OspA a partir de cualquier cepa de Borrelia causante de
enfermedad de Lyme, tal como Borrelia burgdorferi sensu stricto,
Borrelia afzelii o Borrelia garinii.
Los cebadores oligonucleotídicos que se usaron
para generar la mutación J1 (que contiene una mutación Y165F (codón
tat a ttt) y una mutación V166T (codón gtt a act)) fueron los
siguientes:
| a) 5' B31 YV-FT | |
| 5' gag gtt tta aaa ggc ttt act ctt gaa gga act c 3' | (SEC ID Nº: 123) |
| b) 3' B31 YV-FT | |
| 5' gag ttc ctt caa gag taa agc ctt tta aaa cct g 3' | (SEC ID Nº: 124) |
Los cebadores oligonucleotídicos que se usaron
para generar la mutación J2 (que contiene una mutación T170K (codón
act a aag)) fueron los siguientes:
| a) 5' B31 T-K | |
| 5' tct tga agg aaa get aac tgc tg 3' | (SEC ID Nº: 125) |
| b) 3' B31 T-K | |
| 5' cag cag tta gct ttc ctt caa ga 3' | (SEC ID Nº: 126) |
Para generar el mutante J3 (que contiene una
mutación Y165F (codón tat a ttt), una mutación V166T (codón gtt a
act) y una mutación T170K (codón act a aag)), se usó el molde que
contiene las mutaciones J1 con los cebadores oligonucleotídicos
para generar la mutación J2 (5' B31 T-K (SEC ID Nº:
125) y B31 T-K (SEC ID Nº: 126)).
Los polipéptidos de OspA modificados que se
describen en este documento se expresan, se usan para inmunizar
ratones y se caracterizan usando un ELISA como se ha descrito en los
Experimentos anteriores.
\global\parskip0.000000\baselineskip
<110> Fundación de Investigación de la
Universidad Estatal de Nueva York Brookhaven Sciences Associates,
LLC
\hskip1cmUniversidad de Rochester
\hskip1cmBenjamin J. Luft
\hskip1cmJohn J. Dunn
\hskip1cmCatherine L. Lawson
\hskip1cmShohei Koide
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> OspA modificada de Borrelia
burgdorferi
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> 2631.2001005
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<140> 01 964 163.8
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
17-08-2001
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> PCT/US01/25852
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
17-08-2001
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> US 60/226.484
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
18-08-2000
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 130
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> FastSEQ para Windows Versión 4.0
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<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Cebador oligonucleotídico
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<400> 1
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\hskip-.1em\dddseqskipcttaatgact ctgacactag tgc
\hfill23
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<210> 2
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<211> 30
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Cebador oligonucleotídico
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<400> 2
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\hskip-.1em\dddseqskipgctactaaaa aaaccgggaa atggaattca
\hfill30
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<210> 3
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<211> 33
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Cebador oligonucleotídico
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\hskip-.1em\dddseqskipgcagcttggg attcaaaaac atccacttta aca
\hfill33
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<210> 4
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<211> 18
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Cebador oligonucleotídico
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\hskip-.1em\dddseqskipggagaatata ttatgaaa
\hfill18
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<210> 5
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<211> 17
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Cebador oligonucleotídico
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\hskip-.1em\dddseqskipctccttattt taaagcg
\hfill17
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<210> 6
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<211> 822
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<212> ADN
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<213> Borrelia burgdorferi
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<220>
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<221> CDS
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<222> (1)...(822)
\newpage
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<400> 6
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<210> 7
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<211> 273
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> Borrelia burgdorferi
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
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<211> 825
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Borrelia burgdorferi
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
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<222> (1)...(825)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 274
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> Borrelia burgdorferi
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 822
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Borrelia burgdorferi
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
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<222> (1)...(822)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 273
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> Borrelia burgdorferi
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 819
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Borrelia burgdorferi
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(819)
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 273
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> Borrelia burgdorferi
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
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\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 14
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<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador oligonucleotídico
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<400> 14
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgtctgcaaaa accatgacaa g
\hfill21
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador oligonucleotídico
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<400> 15
\vskip1.000000\baselineskip
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\hskip-.1em\dddseqskipgtcatcaaca gaagaaaaat tc
\hfill22
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<210> 16
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<211> 30
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Cebador oligonucleotídico
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<400> 16
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\hskip-.1em\dddseqskipccggatccat atgaaaaaat atttattggg
\hfill30
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<210> 17
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<211> 32
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Cebador oligonucleotídico
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\hfill32
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<210> 18
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<211> 18
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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\hskip-.1em\dddseqskipgcgttcaagt actccaga
\hfill18
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<210> 19
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<211> 27
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Cebador oligonucleotídico
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<400> 19
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\hskip-.1em\dddseqskipgatatctaga tcttatttta aagcgtt
\hfill27
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<210> 20
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<211> 31
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador oligonucleotídico
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<400> 20
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\hskip-.1em\dddseqskipggatccggtg accttttaaa gcgtttttaa t
\hfill31
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<210> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 825
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Borrelia burgdorferi
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<400> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 824
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Borrelia burgdorferi
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<400> 22
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<210> 23
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<211> 821
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Borrelia burgdorferi
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 821
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Borrelia burgdorferi
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 821
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Borrelia burgdorferi
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 822
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Borrelia burgdorferi
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 26
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 38
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador oligonucleotídico
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 27
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaaagtagaag tttttgaatc ccattttcca gttttttt
\hfill38
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 825
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Ácido nucleico quimérico
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(825)
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 28
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 274
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Proteína quimérica
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 822
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(822)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Ácido nucleico quimérico
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 273
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Proteína quimérica
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 822
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Ácido nucleico quimérico
\vskip1.000000\baselineskip
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<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(822)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 32
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<223> Ácido nucleico quimérico
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<221> CDS
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<213> Secuencia artificial
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<223> Ácido nucleico quimérico
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<220>
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<223> Proteína quimérica
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<223> Ácido nucleico quimérico
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Proteína quimérica
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Cebador oligonucleotídico
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador oligonucleotídico
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<211> 30
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador oligonucleotídico
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\vskip0.400000\baselineskip
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador oligonucleotídico
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<400> 94
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\vskip0.400000\baselineskip
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\hfill27
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 95
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<211> 822
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Ácido nucleico de OspA
modificada
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<221> CDS
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<222> (1)...(822)
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<210> 96
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 273
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Proteína OspA modificada
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 96
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<210> 97
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<211> 822
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Ácido nucleico de OspA
modificada
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(822)
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<211> 273
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Proteína OspA modificada
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<211> 822
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<223> Ácido nucleico de OspA
modificada
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<221> CDS
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<222> (1)...(822)
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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<223> Proteína OspA modificada
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<210> 101
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 822
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Ácido nucleico de OspA
modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(822)
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 101
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 102
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 273
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Proteína OspA modificada
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 102
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 103
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 822
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Ácido nucleico de OspA
modificada
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(822)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 103
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 104
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 273
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Proteína OspA modificada
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 104
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 105
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 822
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Ácido nucleico de OspA
modificada
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(822)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 105
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 106
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 273
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Proteína OspA modificada
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 106
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 107
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 822
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Ácido nucleico de OspA
modificada
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(822)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 107
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 108
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 273
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Proteína OspA modificada
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 108
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 109
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 822
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Ácido nucleico de OspA
modificada
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(822)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 109
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 110
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 273
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Proteína OspA modificada
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 110
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 111
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 822
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Ácido nucleico de OspA
modificada
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(822)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 111
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 112
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 273
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Proteína OspA modificada
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 112
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 113
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 822
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Ácido nucleico de OspA
modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(822)
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 113
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 114
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 273
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Proteína OspA modificada
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 114
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 115
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 822
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Ácido nucleico de OspA
modificada
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(822)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 115
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 116
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 273
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Proteína OspA modificada
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 116
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 117
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador oligonucleotídico
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 117
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgaaaaaataa taacaatggc agacggaacc
\hfill30
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 118
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador oligonucleotídico
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 118
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggttccgtct gccattgtta ttattttttc
\hfill30
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 119
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador oligonucleotídico
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 119
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggaaaagcta aatatgtttt aaaaggc
\hfill27
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 120
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador oligonucleotídico
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 120
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgccttttaaa acatatttag cttttcc
\hfill27
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 121
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador oligonucleotídico
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 121
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgttactttaa gcatgaatat ttcaaaatc
\hfill29
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 122
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador oligonucleotídico
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 122
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgattttgaaa tattcatgct taaagtaac
\hfill29
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 123
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 34
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador oligonucleotídico
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 123
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgaggttttaa aaggctttac tcttgaagga actc
\hfill34
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 124
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 34
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador oligonucleotídico
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 124
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgagttccttc aagagtaaag ccttttaaaa cctg
\hfill34
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 125
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador oligonucleotídico
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 125
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptcttgaagga aagctaactg ctg
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 126
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador oligonucleotídico
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 126
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcagcagttag ctttccttca aga
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 127
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 819
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Borrelia burgdorferi
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(819)
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 127
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 128
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 273
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Borrelia burgdorferi
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 128
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 129
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Restos 165-173 de
OspA de B31
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 129
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Tyr Val Leu Glu Gly Thr Leu Thr Ala}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 130
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Restos 332-340 de
hLFA-1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 130
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Tyr val Ile Glu Gly Thr Ser Lys Gln}
Claims (9)
1. Un polipéptido que comprende una secuencia de
aminoácidos de una proteína OspA de Borrelia burgdorferi,
desde el resto 139 hasta el resto 273 de una proteína OspA de
Borrelia burgdorferi, en el que la secuencia incluye todas
las modificaciones constituidas por el resto 139 que es metionina,
el resto 160 que es tirosina y el resto 189 que es metionina, en el
que la numeración se corresponde con la numeración de la SEC ID Nº:
7.
2. El polipéptido de la reivindicación 1, en el
que: (a) el polipéptido ha aumentado su estabilidad conformacional
en comparación con el polipéptido OspA no modificado
correspondiente; (b) el polipéptido comprende los restos 131 a 273
de la proteína OspA de Borrelia burgdorferi; (c) el
polipéptido comprende los restos 17 a 273 de la proteína OspA de
Borrelia burgdorferi y (d) el polipéptido se obtiene a partir
de una proteína OspA de una cepa sensu stricto de
Borrelia burgdorferi.
3. Un polinucleótido que codifica una secuencia
de aminoácidos de una proteína OspA de Borrelia burgdorferi
desde el resto 139 hasta el resto 273, en el que la secuencia
codifica todas las modificaciones constituidas por: codón 139 que
codifica metionina, codón 160 que codifica tirosina y codón 189 que
codifica metionina, en el que la numeración se corresponde con la
numeración de la SEC ID Nº: 7.
4. El polinucleótido de la reivindicación 3, en
el que: (a) el polipéptido codificado comprende los restos 131 a
273 de la proteína OspA de Borrelia burgdorferi; o (b) el
polipéptido codificado comprende los restos 17 a 273 de la proteína
OspA de Borrelia burgdorferi; o (c) el polipéptido codificado
se corresponde con la proteína OspA de una cepa sensu
stricto de Borrelia burgdorferi.
5. Un polinucleótido seleccionado del grupo
constituido por las SEC ID Nº: 103 y 115.
6. Un procedimiento para generar un polipéptido
OspA de Borrelia burgdorferi modificado con una estabilidad
conformacional aumentada en comparación con el polipéptido OspA de
Borrelia burgdorferi no modificado correspondiente, que
comprende:
a) seleccionar un polinucleótido que codifica un
polipéptido OspA de Borrelia burgdorferi que incluye los
restos 139, 160 y 189, en el que la numeración se corresponde con la
numeración de la SEC ID Nº: 7
b) modificar el polinucleótido de tal modo que
el resto 139 sea metionina, el resto 160 sea tirosina y el resto
189 sea metionina; y
c) expresar dicho polinucleótido modificado;
generando de este modo un polipéptido OspA de
Borrelia burgdorferi modificado con una estabilidad
conformacional aumentada en comparación con el polipéptido OspA de
Borrelia burgdorferi no modificado correspon-
diente.
diente.
7. Uso de un polipéptido OspA modificado para la
fabricación de un medicamento para inmunizar a un mamífero, por
ejemplo, un ser humano, contra la enfermedad de Lyme, en el que el
polipéptido OspA modificado com-
prende
prende
una secuencia de aminoácidos de una proteína
OspA de Borrelia burgdorferi, desde el resto 139 hasta el
resto 273 de la proteína OspA de Borrelia burgdorferi, en el
que la secuencia incluye todas las modificaciones constituidas por
el resto 139 que es metionina, el resto 160 que es tirosina, el
resto 189 que es metionina y combinaciones de los mismos, en la que
el polipéptido ha aumentado su estabilidad conformacional en
comparación con un polipéptido OspA de tipo silvestre
correspondiente, en la que la numeración se corresponde con la
numeración de la SEC ID Nº: 7.
8. Un polipéptido quimérico que comprende:
a) una secuencia de aminoácidos de un primer
polipéptido OspA desde el resto 1 hasta el resto 164 de una primer
cepa de Borrelia burgdorferi;
b) una secuencia de aminoácidos de un segundo
polipéptido OspA desde el resto 165 hasta el resto 179 de una
segunda cepa de Borrelia burgdorferi, en la que dicha segunda
cepa es una cepa diferente de dicha primera
cepa;
cepa;
c) una secuencia de aminoácidos de un tercer
polipéptido OspA desde el resto 180 hasta el resto 216 de una
tercera cepa de Borrelia burgdorferi; en la que dicha tercera
cepa es una cepa diferente de dicha segunda cepa;
d) una secuencia de aminoácidos de un cuarto
polipéptido OspA desde el resto 217 hasta el resto 273 de una
cuarta cepa de Borrelia burgdorferi, en la que dicha cuarta
cepa es una cepa diferente de dicha tercera cepa;
\newpage
en el que la secuencia incluye todas las
modificaciones constituidas por el resto 139 que es metionina, el
resto 160 que es tirosina, el resto 189 que es metionina y
combinaciones de los mismos, en el que la numeración se corresponde
con la numeración de la SEC ID Nº: 7.
9. Un polipéptido seleccionado del grupo
constituido por las SEC ID Nº: 104 ó 116.
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