ES2219657T3 - Proteinas quimericas que comprenden polipeptidos de borrelia: usos para las mismas. - Google Patents
Proteinas quimericas que comprenden polipeptidos de borrelia: usos para las mismas.Info
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Abstract
SE PRESENTAN NUEVOS ACIDOS NUCLEICOS QUIMERICOS, QUE CODIFICAN PROTEINAS QUIMERICAS DE "BORRELIA" DE AL MENOS DOS POLIPEPTIDOS ANTIGENICOS DE LAS PROTEINAS CORRESPONDIENTES Y/O NO CORRESPONDIENTES DE LA MISMA Y/O DE ESPECIES DIFERENTES DE LA "BORRELIA". TAMBIEN SE PRESENTAN LAS PROTEINAS QUIMERICAS CODIFICADAS POR LAS SECUENCIAS DE ACIDOS NUCLEICOS. LAS PROTEINAS QUIMERICAS SON UTILES COMO INMUNOGENOS DE VACUNA CONTRA LA BORRELIOSIS ASI COMO PARA REAGENTES DE INMUNODIAGNOSTICO.
Description
Proteínas quiméricas que comprenden polipéptidos
de Borrelia: usos para las mismas.
La borreliosis de Lyme es la enfermedad
infecciosa portada por ácaros más común en Norte América, Europa y
el norte de Asia. El agente bacteriano causante de esta enfermedad,
Borrelia burgdorferi, se aisló y cultivó por primera vez en
1982 (Burgdorferi, W.A. et al., Science 216:
1317-1319 (1982); Steere, A. R. et al., N. Engl.
J. Med. 308: 733-740 (1983)). Con ese
descubrimiento, un amplio conjunto de síndromes clínicos, descritos
tanto en la bibliografía europea como americana desde principios
del Siglo XX, pudo atribuirse a la infección por B.
burgdorferi (Afzelius, A., Acta Derm. Venereol. 2:
120-125 (1921); Bannwarth, A., Arch. Psychiatr.
Nervenkrankh. 117: 161-185 (1944); Garin, C. y
A. Bujadouz, J. Med. Lyon 71: 765-767 (1922);
Herxheimer, k. y K. Hartmann, Arch. Dermatol. Syphilol. 61:
57-76, 255-300 (1902)).
La respuesta inmunológica a B. burgdorferi
se caracteriza por una respuesta humoral temprana, prominente y
persistente hacia el extremo de la proteína flagelar, p41 (fla), y
a un constituyente proteínico del cilindro protoplásmico, p93
(Szczepanski, A., y J. L. Benach, Microbiol. Rev. 55: 21
(1991)). El antígeno de la flagelina p41 es una proteína
inmunodominante; sin embargo, comparte una homología significativa
con flagelinas de otros microorganismos y, por lo tanto, es muy
reactiva de forma cruzada. El antígeno p93 es el antígeno
inmunodominante mayor de B. burgdorferi. Tanto las proteínas
p41 como p93 son antígenos físicamente crípticos, cubiertos del
sistema inmune por una membrana exterior, cuyos constituyentes
proteínicos principales son las proteínas de la superficie exterior
A y B (OspA y OspB). OspA es una lipoproteína básica de
aproximadamente 31 kd, que es codificada sobre un plásmido lineal
grande junto con OspB, una lipoproteína básica de aproximadamente
34 kd (Szczepanski, A., y J. L. Benach, Microbiol. Rev. 55:
21 (1991)). El análisis de materiales aislados de B.
burgdorferi, obtenidos de Norte América y Europa, ha demostrado
que OspA tiene una variabilidad antigénica, y que varios grupos
distintos pueden ser definidos serológica y genotípicamente (Wilske,
B., et al., World J. Microbiol. 7: 130 (1991)). Otras
proteínas de Borrelia demuestran una variabilidad antigénica
similar. Sorprendentemente, la respuesta inmunológica a estas
proteínas de la superficie exterior tiende a producirse, si es que
lo hace, en una fase tardía de la enfermedad (Craft, J. E. et
al., J. Clin Invest. 78: 934-939 (1986);
Dattwyler, R. J. y B. J. Luft, Rheum. Clin. North Am. 15:
727-734 (1989)). Además, pacientes infestados de
modo agudo y crónico con B. burgdorferi responden de forma
variable a los diferentes antígenos, incluidos OspA, OspB, OspC,
OspD, p39, p41 y p93.
Se han ensayado vacunas contra la borreliosis de
Lyme. Ratones inmunizados con una forma recombinante de OspA están
protegidos del enfrentamiento con la misma cepa de B.
burgdorferi de la que se obtuvo la proteína (Fikrig, E. et
al., Science 250: 553-556 (1990)). Además,
anticuerpos monoclonales (acms) anti-OspA,
pasivamente transferidos, han demostrado ser protectores en
ratones, y la vacunación con una proteína recombinante indujo una
inmunidad protectora contra la subsiguiente infección con la cepa
homóloga de B. burgdorferi (Simon, M.M., et al., J.
Infect. Dis. 164: 123 (1991)). Desgraciadamente, la
inmunización con una proteína procedente de una cepa no confiere
necesariamente resistencia a una cepa heteróloga (Fikrig, E. et
al., J. Immunol. 7: 2256-1160 (1992)), sino más
bien se limita a las "especies" homólogas de las que se
preparó la proteína. Además, la inmunización con una proteína
sencilla procedente de una cepa particular de Borrelia no
conferirá resistencia a esa cepa en todos los individuos. Existe una
variaciación considerable exhibida en OspA y OspB, así como p93,
que incluye las regiones que confieren antigenicidad. Por lo tanto,
el grado y la frecuencia de protección que proceden de la
vacunación con una proteína procedente de una cepa sencilla
dependen de la respuesta del sistema inmunológico a la variación
particular, así como la frecuencia de variación genética en B.
burgdorferi. Actualmente existe la necesidad de una vacuna que
proporcione inmunogenicidad a través de las especies y a más
epítopos dentro de una especie, así como inmunogenicidad contra más
de una proteína.
Rosa et al. (Molec. Biol. 6:
3031-3040 (1992)), describen el aislamiento de
cepas clonales de B. burgdorferi, en las que la recombinación
se ha producido dentro del operón ospA/ospB.
La presente invención pertenece a proteínas
quiméricas de Borrelia que incluyen dos o más polipéptidos
de Borrelia antigénicos que no se producen de forma natural
(en la naturaleza) en la misma proteína en Borrelia, así
como a los ácidos nucleicos que codifican proteínas quiméricas de
este tipo. Los polipéptidos antigénicos incorporados en las
proteínas quiméricas se derivan de cualquier proteína de
Borrelia procedente de cualquier cepa de Borrelia, e
incluyen las proteínas de la superficie exterior (Osp)A,
OspB, OspC, OspD, p12, p39, p41, p66 y p93. Las proteínas de las
que se derivan los polipéptidos antigénicos pueden proceder de la
misma cepa de Borrelia, de diferentes cepas o de
combinaciones de proteínas procedentes de la misma o de diferentes
cepas. Si las proteínas de las que se derivan los polipéptidos
antigénicos son OspA u OspB, el polipéptido antigénico se puede
derivar de la porción de la proteína OspA u OspB presente entre el
extremo amino y triptófano conservado de la proteína (al que se
alude como una porción proximal) o la porción de la proteína OspA u
OspB presente entre el triptófano conservado de la proteína y el
extremo carboxi (al que se alude como porción distal). En las
figuras 23-37 y 43-46 se recogen
proteínas quiméricas particulares y las secuencias de nucleótidos
que las codifican.
Las proteínas quiméricas de la presente invención
proporcionan polipéptidos antigénicos de una diversidad de cepas de
Borrelia y/o proteínas dentro de una proteína sencilla.
Proteínas de este tipo son particularmente útiles en análisis
inmunodiagnósticos para detectar la presencia de anticuerpos contra
Borrelia nativa en individuos potencialmente infectados, así
como para medir la reactividad de células T y, por lo tanto, se
pueden utilizar como reactivos inmunodiagnósticos. Las proteínas
quiméricas de la presente invención son adicionalmente útiles como
inmunógenos de vacuna contra la infección por Borrelia.
Para una mejor comprensión de la presente
invención junto con otros y adicionales objetos se hace referencia a
la siguiente descripción, considerada junto con los dibujos que se
acompañan.
La figura 1 resume péptidos y dominios
antigénicos localizados por fragmentación proteolítica y química de
OspA.
La figura 2 es una comparación de los dominios
antigénicos representados en la figura 1, para OspA en nueve cepas
de B. burgdorferi.
La figura 3 es una gráfica que muestra una
representación de polimorfismo ponderado frente a la posición del
aminoácido entre 14 variantes de OspA. Los picos marcados son: a)
aminoácidos 132-145; b) aminoácidos
163-177; c) aminoácidos 208-221. La
línea discontinua inferior en el valor del polimorfismo 1.395
denota excesos estadísticamente significativos de polimorfismo a p =
0,05. La línea discontinua superior a 1.520 es la misma, excepto
que los primeros 29 aminoácidos en el extremo N monomórfico han
sido retirados del análisis original.
La figura 4 muestra la alineación de aminoácidos
de los residuos 200 a 220 para OspAs procedentes de las cepas B31 y
K48, así como para los mutantes 613, 625, 640, 613/625 y 613/640
dirigidos al lugar. La flecha indica Trp216. Los cambios en los
aminoácidos están subrayados.
La figura 5 es una proyección de rueda helicoidal
de los residuos 204-217 de OspA B31. Las letras en
mayúscula indican residuos hidrófobos; las letras minúsculas
indican residuos hidrófilos; +/- indican residuos
positiva/negativamente cargados. La línea discontinua indica la
división de la hélice alfa en el arco hidrófobo (por encima de la
línea) y el arco polar (por debajo de la línea). Adaptado de France
et al. (Biochem. Biophys. Acta 1120: 59 (1992)).
La figura 6 describe un árbol filogénico para las
cepas de Borrelia descritas en la Tabla I. Las cepas son
como sigue: 1 = B31; 2 = Pka1; 3 = ZS7; 4 = N40; 5 = 25015; 6 =
K48; 7 = DK29; 8 = PHei; 9 = Ip90; 10 = PTrob; 11 = ACAI; 12 =
PGau; 13 = Ip3; 14 = PBo; 15 = PKo.
La figura 7 muestra la secuencia de ácidos
nucleicos de OspA-B31 (SEQ ID NO. 6) y la secuencia
de la proteína codificada (SEQ ID NO. 7).
La figura 8 muestra la secuencia de ácidos
nucleicos de OspA-K48 (SEQ ID NO. 8) y la secuencia
de la proteína codificada (SEQ ID NO. 9).
La figura 9 muestra la secuencia de ácidos
nucleicos de OspA-PGau (SEQ ID NO. 10) y la
secuencia de la proteína codificada (SEQ ID NO. 11).
La figura 10 muestra la secuencia de ácidos
nucleicos de OspA-25015 (SEQ ID NO. 12) y la
secuencia de la proteína codificada (SEQ ID NO. 13).
La figura 11 muestra la secuencia de ácidos
nucleicos de OspB-B31 (SEQ ID NO. 21) y la
secuencia de la proteína codificada (SEQ ID NO. 22).
La figura 12 muestra la secuencia de ácidos
nucleicos de OspC-B31 (SEQ ID NO. 29) y la
secuencia de la proteína codificada (SEQ ID NO. 30).
La figura 13 muestra la secuencia de ácidos
nucleicos de OspC-K48 (SEQ ID NO. 31) y la
secuencia de la proteína codificada (SEQ ID NO. 32).
La figura 14 muestra la secuencia de ácidos
nucleicos de OspC-PKo (SEQ ID NO. 33) y la
secuencia de la proteína codificada (SEQ ID NO. 34).
La figura 15 muestra la secuencia de ácidos
nucleicos de OspC-pTrob (SEQ ID NO. 35) y la
secuencia de la proteína codificada (SEQ ID NO. 36).
La figura 16 muestra la secuencia de ácidos
nucleicos de p93-B31 (SEQ ID NO. 65) y la secuencia
de la proteína codificada (SEQ ID NO. 66).
La figura 17 muestra la secuencia de ácidos
nucleicos de p93-K48 (SEQ ID NO. 67).
La figura 18 muestra la secuencia de ácidos
nucleicos de p93-Pbo (SEQ ID NO. 69).
La figura 19 muestra la secuencia de ácidos
nucleicos de p93-pTrob (SEQ ID NO. 71).
La figura 20 muestra la secuencia de ácidos
nucleicos de p93-pGau (SEQ ID NO. 73).
La figura 21 muestra la secuencia de ácidos
nucleicos de p93-25015 (SEQ ID NO. 75).
La figura 22 muestra la secuencia de ácidos
nucleicos de p93-pKo (SEQ ID NO. 77).
La figura 23 muestra la secuencia de ácidos
nucleicos de la quimera
OspA-K48/OspA-PGau (SEQ ID NO. 85)
y la secuencia de la proteína quimérica codificada (SEQ ID NO.
86).
La figura 24 muestra la secuencia de ácidos
nucleicos de la quimera
OspA-B31/OspA-PGau (SEQ ID NO. 88)
y la secuencia de la proteína quimérica codificada (SEQ ID NO.
89).
La figura 25 muestra la secuencia de ácidos
nucleicos de la quimera
OspA-B31/OspA-K48 (SEQ ID NO. 91) y
la secuencia de la proteína quimérica codificada (SEQ ID NO.
92).
La figura 26 muestra la secuencia de ácidos
nucleicos de la quimera
OspA-B31/OspA-25015 (SEQ ID NO. 94)
y la secuencia de la proteína quimérica codificada (SEQ ID NO.
95).
La figura 27 muestra la secuencia de ácidos
nucleicos de la quimera
OspA-K48/OspA-B31/OspA-K48
(SEQ ID NO. 97) y la secuencia de la proteína quimérica codificada
(SEQ ID NO. 98).
La figura 28 muestra la secuencia de ácidos
nucleicos de la quimera
OspA-B31/OspA-K48/OspA-B31/OspA-K48
(SEQ ID NO. 100) y la secuencia de la proteína quimérica
codificada (SEQ ID NO. 101).
La figura 29 muestra la secuencia de ácidos
nucleicos de la quimera
OspA-B31/OspB-B31 (SEQ ID NO. 103)
y la secuencia de la proteína quimérica codificada (SEQ ID NO.
104).
La figura 30 muestra la secuencia de ácidos
nucleicos de la quimera
OspA-B31/OspB-B31/OspC-B31
(SEQ ID NO. 106) y la secuencia de la proteína quimérica codificada
(SEQ ID NO. 107).
La figura 31 muestra la secuencia de ácidos
nucleicos de la quimera
OspC-B31/OspA-B31/OspB-31
(SEQ ID NO. 109) y la secuencia de la proteína quimérica codificada
(SEQ ID NO. 110).
La figura 32 muestra la secuencia de ácidos
nucleicos de la quimera
OspA-B31/p93-B31 (SEQ ID NO. 111) y
la secuencia de la proteína quimérica codificada (SEQ ID NO.
112).
La figura 33 muestra la secuencia de ácidos
nucleicos de la quimera
OspB-B31/p41-B31
(122-234) (SEQ ID NO. 113) y la secuencia de la
proteína quimérica codificada (SEQ ID NO. 114).
La figura 34 muestra la secuencia de ácidos
nucleicos de la quimera
OspB-B31/p41-B31
(122-295) (SEQ ID NO. 115) y la secuencia de la
proteína quimérica codificada (SEQ ID NO. 116).
La figura 35 muestra la secuencia de ácidos
nucleicos de la quimera
OspB-B31/p41-B31
(140-234) (SEQ ID NO. 117) y la secuencia de la
proteína quimérica codificada (SEQ ID NO. 118).
La figura 36 muestra la secuencia de ácidos
nucleicos de la quimera
OspB-B31/p41-B31
(140-295) (SEQ ID NO. 119) y la secuencia de la
proteína quimérica codificada (SEQ ID NO. 120).
La figura 37 muestra la secuencia de ácidos
nucleicos de la quimera
OspB-B31/p41-B31
(122-234)/OspC-B31 (SEQ ID NO. 121)
y la secuencia de la proteína quimérica codificada (SEQ ID NO.
122).
La figura 38 muestra una alineación de la
secuencia de ácidos nucleicos para OspC-B31 (SEQ ID
NO. 29), OspC-PKo (SEQ ID NO. 33),
OspC-pTrob (SEQ ID NO. 35) y
OspC-K48 (SEQ ID NO.31). Los ácidos nucleicos que
son idénticos a los que aparecen en la secuencia de ácidos
nucleicos conductora (aquí, OspC-B31) están
representados por un punto (.); los ácidos nucleicos que difieren se
muestran en letras minúsculas.
La figura 39 muestra una alineación de la
secuencia de ácidos nucleicos para OspD-pBo (SEQ ID
NO. 123), OspD-PGau (SEQ ID NO. 124),
OspD-DK29 (SEQ ID NO. 125) y
OspD-K48 (SEQ ID NO. 126). Los ácidos nucleicos que
son idénticos a los que aparecen en la secuencia de ácidos
nucleicos conductora (aquí, OspD-pBo) están
representados por un punto (.); los ácidos nucleicos que difieren se
muestran en letras minúsculas.
La figura 40 muestra la secuencia de ácidos
nucleicos de p41-B31 (SEQ ID NO. 127) y la
secuencia de la proteína codificada (SEQ ID NO. 128).
La figura 41 muestra una alineación de la
secuencia de ácidos nucleicos para p41-B31 (SEQ ID
NO. 127), p41-pKa1 (SEQ ID NO. 129),
p41-PGau (SEQ ID NO. 51), p41-PBo
(SEQ ID NO. 130), p41-DK29 (SEQ ID NO. 53) y
p41-PKo (SEQ ID NO. 131). Los ácidos nucleicos que
son idénticos a los que aparecen en la secuencia de ácidos
nucleicos conductora (aquí, p41-B31) están
representados por un punto (.); los ácidos nucleicos que difieren
se muestran en letras minúsculas.
La figura 42 muestra una alineación de la
secuencia de ácidos nucleicos para OspA-B31 (SEQ ID
NO. 6), OspA-pKa1 (SEQ ID NO. 132),
OspA-N40 (SEQ ID NO. 133), OspA-ZS7
(SEQ ID NO. 134), OspA-25015 (SEQ ID NO. 12),
OspA-pTrob (SEQ ID NO. 135),
OspA-K48 (SEQ ID NO. 8), OspA-Hei
(SEQ ID NO. 136), OspA-DK29 (SEQ ID NO. 49),
OspA-Ip90 (SEQ ID NO. 50), OspA-pBo
(SEQ ID NO. 55), OspA-Ip3 (SEQ ID NO. 56),
OspA-PKo (SEQ ID NO. 57), OspA-ACAI
(SEQ ID NO. 58) y OspA-PGau (SEQ ID NO. 10). Los
ácidos nucleicos que son idénticos a los que aparecen en la
secuencia de ácidos nucleicos conductora (aquí,
OspA-B31) están representados por un punto (.); los
ácidos nucleicos que difieren se muestran en letras minúsculas.
La figura 43 muestra la secuencia de ácidos
nucleicos de la quimera
OspA-Tro/OspA-Bo (SEQ ID NO. 137) y
la secuencia de la proteína quimérica codificada (SEQ ID NO.
138).
La figura 44 muestra la secuencia de ácidos
nucleicos de la quimera
OspA-PGau/OspA-Bo (SEQ ID NO. 139) y
la secuencia de la proteína quimérica codificada (SEQ ID NO.
140).
La figura 45 muestra la secuencia de ácidos
nucleicos de la quimera
OspA-B31/OspA-PGau/OspA-B31/OspA-K48
(SEQ ID NO. 141) y la secuencia de la proteína quimérica codificada
(SEQ ID NO. 142).
La figura 46 muestra la secuencia de ácidos
nucleicos de la quimera
OspA-PGau/OspA-B31/OspA-K48
(SEQ ID NO. 143) y la secuencia de la proteína quimérica codificada
(SEQ ID NO. 144).
La presente invención pertenece a proteínas
quiméricas que comprenden polipéptidos de Borrelia
antigénicos que no se producen en la naturaleza en la misma
proteína de Borrelia. La proteínas quiméricas son una
combinación de dos o más polipéptidos antigénicos derivados de
proteínas de Borrelia. Los polipéptidos antigénicos se
pueden derivar de diferentes proteínas de la misma especie de
Borrelia, o proteínas diferentes de diferentes especies de
Borrelia, así como de correspondientes proteínas procedentes
de diferentes especies. Tal como se utiliza en esta memoria, la
expresión "proteína quimérica" describe una proteína que
comprende dos o más polipéptidos que se derivan de una proteína de
Borrelia nativa correspondiente y/o no correspondiente. Un
polipéptido "derivado de" una proteína nativa de
Borrelia es un polipéptido que tiene una secuencia de
aminoácidos igual a una secuencia de aminoácidos presente en una
proteína de Borrelia, una secuencia de aminoácidos
equivalente a la secuencia de aminoácidos de una proteína de
Borrelia que se produce de modo natural, o una secuencia de
aminoácidos sustancialmente similar a la secuencia de aminoácidos
de una proteína de Borrelia que se produce de forma natural
(por ejemplo, difiriendo en unos pocos aminoácidos) tal como cuando
un ácido nucleico que codifica una proteína se somete a una
mutagénesis dirigida al lugar. Proteínas "correspondientes"
son proteínas equivalentes procedentes de diferentes especies o
cepas de Borrelia, tal como la proteína de la superficie
exterior A (OspA) procedente de la cepa B31 y OspA procedente de la
cepa K48. La invención pertenece adicionalmente a ácidos nucleicos
que codifican estas proteínas quiméricas.
Como se describe a continuación, las solicitantes
han identificado dos dominios antigénicos separados de OspA y OspB
que flanquean al único triptófano conservado presente en OspA y en
OspB. Estos dominios comparten una reactividad cruzada con
diferentes geno-especies de Borrelia. Los
aminoácidos precisos responsables de la variabilidad antigénica se
determinaron a través de mutagénesis dirigida al lugar, de modo que
proteínas con sustituciones específicas de aminoácidos están
disponibles para el desarrollo de proteínas quiméricas. Además, las
solicitantes han identificado dominios hipervariables
inmunológicamente importantes en las proteínas OspA, tal como se
describe a continuación en el Ejemplo 2. El primer dominio
hipervariable de interés para las proteínas quiméricas, el dominio
A, incluye los residuos de aminoácidos 120-140 de
OspA, el segundo dominio hipervariable, el dominio B, incluye los
residuos 150-180, y el tercer dominio hipervariable,
el dominio C, incluye los residuos 200-216 ó 217
(dependiendo de la posición del residuo triptófano único conservado
en la OspA de esa especie particular de Borrelia) (véase la
figura 3). Además, las solicitantes han secuenciado los genes para
varias proteínas de Borrelia.
Estos descubrimientos han ayudado al desarrollo
de nuevas proteínas recombinantes de Borrelia que incluyen
dos o más regiones o secuencias de aminoácidos que no se producen
en la misma proteína de Borrelia en la naturaleza. Las
proteínas recombinantes comprenden polipéptidos procedentes de una
diversidad de proteínas de Borrelia, que incluyen pero no se
limitan a OspA, OspB, OspC, OspD, p12, p39, p41, p66 y p93.
Polipéptidos antigénicamente relevantes procedentes de cada una de
un cierto número de proteínas se reúnen en una proteína quimérica
única.
En una realización de la presente invención,
están ahora disponibles quimeras que incluyen polipéptidos
antigénicos que flanquean un residuo triptófano. Los polipéptidos
antigénicos se derivan de la porción proximal desde el triptófano
(la porción de la proteína OspA u OspB presente entre el extremo
amino y el triptófano conservado de la proteína), o la porción
distal desde el triptófano (la porción de la proteína OspA u OspB
presente entre el triptófano conservado de la proteína y el extremo
carboxi) en OspA y/u OspB. Las quimeras resultantes pueden ser
quimeras OspA-OspA (es decir quimeras que incorporan
polipéptidos derivados de OspA procedentes de diferentes cepas de
Borrelia), quimeras OspA-OspB o quimeras
OspB-OspB, y se construyen de modo que los residuos
aminoácidos amino-proximales a un triptófano
invariable proceden de una proteína, y los residuos
carboxi-proximales al triptófano invariable proceden
de la otra proteína. Por ejemplo, una quimera disponible consiste
en un polipéptido derivado de la región
amino-proximal de OspA procedente de la cepa B31,
seguido del residuo triptófano, seguido de un polipéptido derivado
de la región carboxi-proximal de OspA procedente
de la cepa K48 (SEQ ID NO. 92). Otra quimera disponible incluye un
polipéptido derivado de la región amino-proximal de
OspA procedente de la cepa B31, y un polipéptido derivado de la
región carboxi-proximal de OspB procedente de la
cepa B31 (SEQ ID NO. 104). Si el polipéptido proximal al triptófano
de estas proteínas quiméricas se deriva de OspA, el polipéptido
proximal se puede subdividir, adicionalmente, en tres dominios
hipervariables (dominios A, B y C), cada uno de los cuales se puede
derivar de OspA procedente de una cepa diferente de Borrelia.
Estas proteínas quiméricas pueden comprender, además, polipéptidos
antigénicos procedentes de otra proteína, además de los
polipéptidos antigénicos que flanquean el residuo triptófano.
En otra realización de la presente invención,
están disponibles proteínas quiméricas que incorporan dominios
antigénicos de dos o más proteínas de Borrelia, tales como
proteínas Osp (Osp A, B, C y/o D), así como p12, p39, p41, p66 y/o
p93.
Las quimeras descritas en esta memoria se pueden
producir de modo que sean muy solubles, se
hiper-produzcan en E. coli, y no estén
lipidadas. Además, las proteínas quiméricas se pueden diseñar para
que terminen en una marca de afinidad (His-tag)
para facilitar la purificación. Las proteínas recombinantes
descritas en esta memoria han sido construidas para mantener altos
niveles de antigenicidad. Además, las proteínas recombinantes
específicas para las diversas geno-especies de
Borrelia que provocan la enfermedad de Lyme están ahora
disponibles, ya que han sido secuenciados los genes procedentes de
cada una de las geno-especies principales; en lo que
sigue se recogen las secuencias. Estas proteínas recombinantes con
sus nuevas propiedades biofísicas y antigénicas serán importantes
candidatos de reactivo diagnóstico y de vacuna.
Las proteínas quiméricas de la presente invención
son ventajosas, debido a que conservan una reactividad específica
hacia anticuerpos monoclonales y policlonales contra proteínas de
Borrelia de tipo salvaje, son inmunógenas e inhiben el
crecimiento o inducen la lisis de Borrelia in vitro.
Además, en algunas realizaciones, las proteínas proporcionan
dominios antigénicos de dos o más cepas de Borrelia y/o
proteínas dentro de una única proteína. Proteínas de este tipo son
particularmente útiles en ensayos inmunodiagnósticos. Por ejemplo,
las proteínas de la presente invención se pueden utilizar como
reactivos en ensayos para detectar la presencia de anticuerpos
contra Borrelia nativa en individuos potencialmente
infestados. Estas proteínas también se pueden utilizar como
reactivos diagnósticos, tales como en borrones de puntos,
transferencias Western, ensayo de inmunosorbente enlazado a enzima o
ensayos de aglutinación. Las proteínas quiméricas de la presente
invención se pueden producir por técnicas conocidas tales como por
metodología recombinante, reacción en cadena de la polimerasa o
mutagénesis.
Además, las proteínas de la presente invención
son útiles como inmunógenos de vacuna contra la infección por
Borrelia. Ya que Borrelia ha demostrado ser clonal,
una proteína que comprenda polipéptidos antigénicos procedentes de
una diversidad de proteínas y/o especies de Borrelia,
proporcionarán una inmunoprotección durante un tiempo considerable
cuando se dirigen a una vacuna. La carencia de una recombinación
intragénica significativa, un proceso que podría generar
rápidamente nuevos epítopos con propiedades antigénicas
modificadas, asegura que Borrelia pueda únicamente cambiar
el tipo antigénico simulando un cambio mutacional, que es lento
cuando se compara con la recombinación para generar diferentes
tipos antigénicos. La proteína quimérica se puede combinar con un
vehículo fisiológicamente aceptable y administrar a un animal
vertebrado por métodos convencionales (por ejemplo por vía
intravenosa o intramuscular).
La invención se ilustra mediante los siguientes
ejemplos que no han de considerarse limitantes de modo alguno.
Este ejemplo detalla un método para la
purificación de grandes cantidades de proteína de la superficie
exterior A nativa (OspA) hasta homogeneidad, y describe la
representación en mapa de las especificidades antigénicas de varios
acms anti-OspA. La OspA se purificó hasta
homogeneidad explotando su resistencia a la digestión con tripsina.
El marcaje intrínseco con ácido ^{14}C-palmítico
confirmó que OspA estaba lipidada y la digestión parcial estableció
una lipidación en la cisterna amino-terminal de la
molécula.
La reactividad de siete anticuerpos monoclonales
murínicos anti-OspA hacia nueve diferentes
materiales aislados de Borrelia se confirmó mediante
análisis de transferencia Western. La OspA purificada se fragmentó
mediante escisión enzimática o química, y los anticuerpos
monoclonales fueron capaces de definir cuatro dominios
inmunogénicos distintos (véase la figura 1). El dominio 3, que
incluía los residuos 190-220 de OspA era reactivo
con anticuerpos protectores que se sabe se aglutinan en el
organismo in vitro e incluían distintas especificidades,
algunas de las cuales no se limitaron a un genotipo de B.
burgdorferi.
La solubilización con detergente de B.
burgdorferi despoja a las proteínas de la superficie exterior y
proporciona preparaciones parcialmente purificadas que contienen
tanto OspA como proteína de la superficie exterior B (Osp B)
(Barbour, A. G. et al., Infect. Immun. 52 (5):
549-554 (1986); Coleman, J. L. y J. L. Benach,
J. Infect. Dis. 155 (4): 756-765 (1987);
Cunningham, T. M. et al., Ann. NY Acad. Sci. 539:
376-378 (1988); Brandt, M. E. et al., Infect.
Immun. 58: 983-991 (1990); Sambri, V. y R.
Cevenini, Microbiol. 14: 307-314 (1991)). A
pesar de que tanto OspA como OspB son sensibles a la digestión con
proteínasa K, a diferencia de OspB, OspA es resistente a la
escisión por parte de tripsina (Dunn, J. et al., Prot. Exp.
Purif. 1: 159-168 (1990); Barbour, A. G. et
al., Infect. Immun. 45: 94-100 (1984)). Es
sorprendente la insensibilidad relativa a tripsina a la vista del
hecho de que OspA tiene un alto contenido en lisina (16% para B31),
puede relacionarse con la configuración relativa de OspA y B en la
membrana externa.
El marcaje para lipoproteínas se efectuó como se
describe por Brandt et al. (Infect. Immun. 58:
983-991 (1990)). Ácido
^{14}C-palmítico (ICN, Irvine, California) se
añadió al medio BSK II hasta una concentración final de 0,5 \muCi
por mililitro (ml). En este medio se cultivaron organismos a 34ºC
hasta que se alcanzó una densidad de 10^{8} células por ml.
Borrelia burgdorferi, ya sean marcadas con
ácido ^{14}C-palmítico o no marcadas, se
recolectaron y lavaron según se describe (Brandt, M. E. et al.,
Infect. Immun. 58: 983-991 (1990)). Los
organismos enteros se tripsinizaron de acuerdo con el protocolo de
Barbour et al., (Infect. Immun. 45: 94-100
(1984)) con algunas modificaciones. El sedimento se suspendió en
solución salina tamponada con fosfato (PBS, 10 mM, pH 7,2) que
contenía 0,8% de tripsina tratada con
tosil-L-fenilalanina-clorometil
cetona (TPCK) (Sigma, St. Louis, Missouri), esta última a una
relación de 1 \mug por cada 10^{8} células. La reacción se llevó
a cabo a 25ºC durante 1 hora, tras lo cual las células se
centrifugaron. El sedimento se lavó en PBS con 100 \mug/ml de
fluoruro de metilfenilsulfonilo (PMSF). La división del sedimento
con Triton X-114 se llevó a cabo según se describe
por Brandt et al. (Infect. Immun. 58: 983-991
(1990)). Después del tratamiento con tripsina, las células se
resuspendieron en Triton X-114 enfriado con hielo
al 2% (v/v) en PBS a razón de 10^{9} células por ml. La
suspensión se centrifugó durante una noche a 4ºC y la fracción
insoluble se separó en forma de un sedimento después de la
centrifugación a 10.000 x g durante 15 minutos a 4ºC. El
sobrenadante (fracción soluble) se incubó a 37ºC durante 15 minutos
y se centrifugó a la temperatura ambiente a 1000 x g durante 15
minutos para separar las fases acuosa y detergente. La fase acuosa
se decantó y se añadió PBS enfriada con hielo a la fase inferior de
Triton, se mezcló, se calentó hasta 37ºC y se centrifugó de nuevo a
1000 x g durante 15 minutos. El lavado se repitió dos veces más.
Finalmente, el detergente se separó de la preparación utilizando
una columna de spin de Bio-beads SM2 (BioRad,
Melville, Nueva York) según se describe (Holloway, P. W., Anal.
Biochem. 53: 304-308 (1973)).
La cromatografía de intercambio de iones se llevó
a cabo según se describe por Dunn et al. (Prot. Exp. Purif.
1: 159-168 (1990)) con pequeñas modificaciones.
OspA bruta se disolvió en tampón a (Triton X-100 al
1%, tampón fosfato 10 mM (pH 5,0)) y se cargó sobre una resina de
SP Sepharose (Pharmacia, Piscataway, Nueva Jersey),
pre-equilibrada con tampón A a 25ºC. Después de
lavar la columna con 10 volúmenes de lecho de tampón A, la OspA
unida se eluyó con tampón B (Triton X-100 al 1%,
tampón fosfato 10 mM (pH 8,0)). Las fracciones de OspA se
detectaron mediante análisis de proteínas utilizando el método BCA
(Pierce, Rockford, Illinois) o como radiactividad cuando se
fraccionó material intrínsecamente marcado. Triton
X-100 se separó utilizando una columna de spin de
Bio-beads SM2.
Este método purifica OspA procedente de una
preparación de membrana de la superficie exterior. En ausencia de
tratamiento con tripsina, OspA y B eran los componentes principales
de la fracción soluble obtenida después de la separación con Triton
de la cepa B31. En contraposición, cuando la extracción con Triton
se llevó a cabo después del tratamiento con tripsina, no se observa
la banda de OspB. La purificación adicional de
OspA-B31 en una columna SP Sepharose dio como
resultado una banda única mediante SDS-PAGE. El
rendimiento, después de la retirada de detergente, era de
aproximadamente 2 mg por litro de cultivo. Este método de
purificación de OspA, según se describe en esta memoria para la cepa
B31, se puede utilizar también para otros materiales aislados de
Borrelia. El tratamiento con tripsina se puede omitir para
cepas tales como la cepa K48, que carece de OspB.
OspA marcada con ácido
^{14}C-palmítico procedente de la cepa B31 se
purificó según se describe anteriormente y se digerió parcialmente
con la endoproteinasa Asp-N (datos no mostrados).
Después de la digestión, resultó evidente una nueva banda de bajo
peso molecular mediante SDS-PAGE, encontrada
mediante secuenciación directa amino-terminal que
comenzaba en Asp_{25}. Esta banda no tenía ninguna traza de
radiactividad por autorradiografía (datos no mostrados). OspA y B
contienen una secuencia señal
(L-X-Y-C) similar al
consenso descrito para lipoproteínas de E. coli, y se ha
predicho que el sitio de lipidación de OspA y B debería ser
cisteína amino-terminal (Brandt, M. E. et al.,
Infect. Immun 58: 983-991 (1990)). Los
resultados presentados en esta memoria sustentan esta
predicción.
La disponibilidad del aminoácido secuenciado para
OspA procedente de un cierto número de diferentes materiales
aislados, combinada con la representación en mapa de los péptidos y
el análisis por transferencia Western, permitió la identificación
de los dominios antigénicos reconocidos por anticuerpos
monoclonales (acms) y permitió la deducción de los residuos clave de
aminoácidos responsables de la reactividad específica del
anticuerpo.
Nueve cepas de Borrelia incluidas siete
cepas europeas y dos cepas de Norte América se utilizaron en este
estudio de los dominios de unión de anticuerpos de varias
proteínas. En la Tabla I que figura a continuación se resume la
información concerniente a las cepas.
Las cepas K48, PGau y DK29 fueron suministradas
por R. Johnson, Universidad de Minnesota; PKo y pTrob fueron
proporcionadas por B. Wilske y V. Preac-Mursic del
Instituto Pettenkhofer, Munich, Alemania; e Ip3 e Ip90 fueron
suministradas por L. Mayer del Center for Disease Control, Atlanta,
Georgia. Las cepas de Norte América incluían la cepa 25015,
proporcionada por J. Anderson del Departamento de Agricultura de
Connecticut; y la cepa B31 (ATCC 35210).
En este estudio se utilizaron siete anticuerpos
monoclonales (acms). Cinco de los acms (12, 13, 15, 83 y 336) se
produjeron a partir de hibridomas clonados y subclonados como se ha
descrito previamente (Schubach, W. H., et al., Infect. Immun.
59(6): 1911-1915 (1991)). El acm H5332
(Barbour, A. G. et al., Infect. Immun. 41:
795-804 (1983)) fue una donación de Drs. Alan
Barbour, Universidad de Texas, y el acm CIII.78 Sears, J. E. et
al., J. Immunol. 147(6): 1995-2000 (1991)) fue
una donación de Richard A. Flavell, Universidad de Yale. Los acms 12
y 15 se desarrollaron contra B3 totalmente sonicado; el acm 336 se
produjo contra PGau completo; y los acms 132 y 83 se desarrollaron
a una forma truncada de OspA clonada a partir de la cepa K48 y se
expresaron en E. coli utilizando el sistema ARN polimerasa de
T7 (McGrath, B.C. et al., Vaccines, Cold Spring Harbor
Laboratory Press, Plainview, Nueva York, páginas
365-370 (1993)). Todos los acms se tiparon como si
fueran inmunoglobulina G (IgG).
La predicción de los diversos sitios de escisión
se consiguió conociendo la secuencia primaria de aminoácidos
derivada de las secuencias completas de nucleótidos de OspA, muchas
de las cuales están actualmente disponibles (véase la Tabla II que
figura a continuación). Los sitios de escisión también se pueden
predecir en base a la secuencia de péptidos de OspA, que se puede
determinar mediante técnicas convencionales después del aislamiento
y la purificación de OspA por el método descrito anteriormente. La
escisión de varios materiales aislados de OspA se realizó para
determinar la localización del anticuerpo monoclonal de las
proteínas.
La escisión de OspA con
hidroxilamina-HCl (HA),
N-clorosuccinimida (NCS) y bromuro de cianógeno
siguió los métodos descritos por Bornstein (Biochem. 9 (12):
2408-2421 (1970)), Shechter et al., (Biochem. 15
(23): 5071-5075 (1976)) y Gross (en Hirs,
C.H.W. (ed): Methods in Enzymology, (N.Y. Acad. Press),
11: 238-255 (1967)), respectivamente. La
escisión de la proteasa mediante endoproteinasa,
Asp-N (Boehringer Mannheim, Indianapolis, Indiana)
se efectuó según se describe por Cleveland D.W. et al., (J. Biol.
Chem, 252: 1102-1106 (1977)). Para cada reacción
se utilizaron diez microgramos de OspA. La relación de enzima a
OspA era de aproximadamente 1 a 10 (p/p).
Las proteínas y los péptidos generados por la
escisión se separaron mediante electroforesis en gel de
poliacrilamida con SDS (SDS-PAGE) (Laemmli, U.K.,
Nature (Londres) 227: 680-685 (1970)),
y se electrotransfirieron sobre membranas de difluoruro de
polivinilidina (PVDF) Immobilon (Ploskal, M.G. et al.,
Biotechniques 4: 272-283 (1986)). Estos se
detectaron mediante tinción con negro amido o mediante
inmunotinción con acms murínicos, seguido de IgG
anti-ratón de cabra conjugada con fosfatasa
alcalina. La unión específica se detectó utilizando un sistema de
revelado de fosfato de
5-bromo-4-cloro-3-indolilo
(BCIP)/tetrazolio nitroazul (NBT) (KPL Inc., Gathersburg,
Maryland).
Además, el análisis de la secuencia de
aminoácidos amino-terminal se llevó a cabo en
varios productos de escisión, según se describe por Luft et al.
(Infect. Immun. 57: 3637-3645 (1989)). Las
bandas manchadas con negro amido se escindieron a partir de manchas
PVDF y se secuenciaron mediante la degradación de Edman utilizando
un secuenciador Biosystems modelo 475A con un analizador PTH modelo
120A y analizador de control/datos modelo 900A.
OspA-B31 purificada, marcada con
ácido ^{14}C-palmítico, se fragmentó con
hidroxilamina-HCl (HA) en dos péptidos, designados
HA1 y HA2 (datos no mostrados). La banda de HA1 migró a 27 kD y
retuvo su radiactividad, indicando que el péptido incluía el sitio
de lipidación en el extremo N de la molécula (datos no mostrados).
A partir del punto de escisión predicho, HA1 debería corresponder a
los residuos 1 a 251 de OspA-B31. HA2 tenía un P.M.
de 21,6 kD mediante SDS-PAGE, mostrando el
análisis de la secuencia amino-terminal que
comienza en Gly72, es decir los residuos 72 a 273 de
OspA-B31. En contraposición, HA escindió
OspA-K48 en tres péptidos, designados HA1, HA2 y
HA3, con P.M.s aparentes de 22 kD, 16 kD y 12 kD, respectivamente.
La secuenciación amino-terminal mostró que HA1
comienza en Gly72, y HA3 en Gly142. Se encontró que HA2 tenía un
extremo amino bloqueado, según se observó para la proteína OspA de
longitud completa. Se predijo que HA1, 2 y 3 de
OspA-K48 eran los residuos 72-274,
1 a 141 y 142 a 274, respectivamente.
N-clorosuccinimida (NCS) escinde
triptófano (W), que se encuentra en el residuo 216 de
OspA-B31 o en el residuo 217 de
OspA-K48 (datos no mostrados). NCS escindió
OspA-B31 en 2 fragmentos, NCS1, con un P.M. de 23
kD, los residuos 1-216 de la proteína, y NCS2, con
un P.M. de 6,2 kD, los residuos 217 a 273 (datos no mostrados). De
manera similar, OspA-K48 se dividió en 2 trozos,
NCS1, residuos 1-217, y NCS2, residuos 218 a 274
(datos no mostrados).
La escisión de OspA mediante bromuro de cianógeno
(CNBr) se produce en el lado carboxi de metionina, residuo 39. El
fragmento principal, CNBr1, tiene un P.M. de 25,7 kD, residuos
39-274 mediante análisis de la secuencia de
aminoácidos amino-terminal (datos no mostrados).
CNBr2 (aproximadamente 4 kD) podría no visualizarse mediante
tinción con negro amido; en su lugar, se observaron bandas
ligeramente manchadas de aproximadamente un P.M. de 20 kD. Estas
bandas reaccionaron con acms anti-OspA y, lo más
probablemente, eran productos de degradación debido a la escisión
por ácido fórmico.
Los productos de escisión de
OspA-B31 y OspA-K48 se analizaron
mediante transferencia Western para confirmar su capacidad de unirse
a seis acms diferentes. El análisis de transferencia Western
preliminar de los productos de escisión demostró que las cepas K48
y DK29 tienen modelos similares de reactividad, al igual que IP3,
PGau y PKo. La OspA de la cepa PTrob era inmunológicamente distinta
a las otras, siendo únicamente reconocida por el acm 336. El acm 12
reconoció únicamente las dos cepas norteamericanas, B31 y 25015.
Cuando los materiales aislados se separaron en genogrupos, era
notable que todos los acms, excepto el acm 12, se cruzaran para
reaccionar con múltiples genogrupos.
El acm 12, específico para
OspA-B31, se unía tanto a HA1 como a HA2 de
OspA-B31. Sin embargo, la escisión de
OspA-B31 por NCS en el residuo Trp216 creó
fragmentos que no reaccionaban con el acm, sugiriendo que el dominio
relevante está próximo o es estructuralmente dependiente de la
integridad de este residuo (datos no mostrados). El acm 13 se unía
únicamente a Osp-K48 y a los péptidos que contenían
el extremo amino de esa molécula (por ejemplo HA2; NCS1). No se
unía a CNBr1, residuos 39 a 274. Así, el dominio reconocido por el
acm 13 se encuentra en el extremo amino-terminal de
Osp-K48, próximo a Met38.
El acm15 reacciona con la OspA tanto de las cepas
B31 como K48, y a los péptidos que contienen el extremo N de OspA,
tal como HA1 de OspA-B31 y NCS1, pero no a los
péptidos HA2 de OspA-B31 y HA1 de
OspA-K48 (datos no mostrados). Ambos péptidos
incluyen el residuo 72 al extremo C de las moléculas. El acm15 se
unió a CNBr1 de OspA-K48, indicando que el dominio
para este anticuerpo eran los residuos 39 a 72, específicamente
próximos a Gly72 (datos no mostrados).
El acm83 se une a OspA-K48 y a
los péptidos que contienen la porción C-terminal de
la molécula tal como HA1. Estos no se unen a HA2 de
Ospa-K48, lo más probablemente debido a que el
extremo C de HA2 de OspA-K48 termina en 141. De
manera similar al acm12 y OspA-B31, la unión de los
acms 83 y CIII.78 se elimina mediante la escisión de OspA en el
residuo triptófano. Así, la unión de los acms 12, 83 y CIII.78 a
OspA depende de la integridad estructural del residuo Trp_{216},
que parece ser crítico para la antigenicidad. Es también evidente
que, a pesar de que estos acms se unen a un dominio antigénico
común, los epítopos precisos que reconocen son distintos uno de
otro, dado los grados variables de reactividad cruzada a estos acms
entre cepas.
A pesar de que existe una pérdida similar de la
actividad de unión del acm 336 con la escisión en Trp_{216}, este
acm no se une a HA1 de OspA-B31, sugiriendo que el
dominio para este anticuerpo incluye el extremo
carboxi-terminal de la molécula, incluidos los
residuos 251 a 273. Péptidos de bajo P.M., tales como HA3 (10 KD) y
NCS2 (6 KD), de OspA-K48 no unen este acm en
transferencias Western. Con el fin de confirmar esta observación,
los autores de la invención sometieron a ensayo la unión de los 6
acms con una construcción de fusión recombinante p3A/EC que
contiene una proteína conductora trpE fusionada con los residuos
217 a 273 de OspA-B31 (Schubach, W. H. et al.,
Infect. Immun. 59 (6): 1911-1915 (1991)).
Únicamente el acm 336 reaccionó con esta construcción (datos no
mostrados). Los péptidos y dominios antigénicos localizados por la
fragmentación de OspA están resumidos en la figura 1.
Para definir la base molecular para el análisis
del serotipo de OspA, los autores de la invención compararon las
secuencias de aminoácidos derivadas de OspA para los nueve
materiales aislados (figura 2). En el extremo amino de la proteína,
estas predicciones pueden ser más precisas dado el número
relativamente pequeño de sustituciones de aminoácidos en esta región
comparado con el extremo carboxi. Dominio 1, que es
reconocido por el acm13, incluye los residuos Leu34 a Leu41. El
acm13 únicamente se une a la OspA de las especies K48, DK29 e IP90.
Dentro de esta región, el residuo 37 es variable, pero Gly37 se
conserva entre las tres cepas reactivas. Cuando Gly37 cambia a
Glu37, como es el caso en la OspA de las cepas B31, pTrob, PGau y
PKo, el acm13 no reconoce la proteína (datos no mostrados).
Mediante análisis similares, se puede observar que Asp70 es un
residuo crucial para el Dominio 2, que incluye los residuos
65 a 75 y es reconocido por el acm15. El Dominio 3 es
reactivo con los acms H5332, 12 y 83, e incluye los residuos
190-220. Es evidente que existe una heterogeneidad
significativa entre los acms reactivos con este dominio, y que
dentro de la secuencia debe estar contenido más de un epítopo
conformacional. El Dominio 4 se une al acm336, e incluye los
residuos 250 a 270. En esta región, el residuo 266 es variable y,
por lo tanto, puede ser un determinante importante. Sin embargo, es
evidente que en la región que comprende los aminoácidos
217-250 residen otros determinantes de la
reactividad de este anticuerpo monoclonal. Además, la integridad
estructural de Trp216 es esencial para la reactividad del
anticuerpo en la proteína intacta. Finalmente, es importante
enfatizar que la figura 2 indica únicamente las localizaciones de
los dominios y no abarca necesariamente el dominio completo. Están
siendo analizados epítopos exactos mediante mutagénesis dirigida al
lugar de residuos específicos.
En general, la evidencia sugiere que la porción
N-terminal no es el dominio inmunodominante de
OspA, posiblemente en virtud de su lipidación, y la supuesta
función del resto lípido en el anclaje de la proteína a la envuelta
exterior. El extremo C-terminal es inmunodominante e
incluye los dominios que explican en parte la heterogeneidad
estructural (Wilske, B. et al., Med. Microbiol. Immunol.
181: 191-207 (1992)), y pueden proporcionar
epítopos para la neutralización de los anticuerpos (Sears, J. E.
et al., J. Immunol. 147 (6) 1995-2000
(1991)), y se refieren a otras actividades tales como la inducción
de la proliferación de células T (Shanafel, M.M., et al., J.
Immunol. 148: 218-224 (1992)). Existen epítopos
comunes en el extremo carboxi de la proteína que son compartidos
entre geno-especies que pueden tener un potencial
inmunoprotector (Wilske, B., et al., Med. Microbiol. Immunol.
181: 191-207 (1992)).
La predicción de la estructura secundaria sobre
la base del análisis de la hidropatía y mediciones del dicroismo
circular y de espectroscopia de fluorescencia (McGrath, B. C.,
et al., Vaccines, Cold Spring Harbor Laboratory Press,
Plainview, Nueva York; págs. 365-370 (1993))
sugieren que los dominios 3 y 4 se encuentren en una región de la
molécula con una propensión a formar una hélice alfa, mientras que
los dominios 1 y 2 se producen en regiones de las que se predijo
que eran láminas beta (véase la figura 1). Estas diferencias pueden
distinguir dominios en accesibilidad al anticuerpo o a células T
reactivas (Shanafel, M. M. et al., J. Immunol. 148:
218-224 (1992)). La mutagénesis dirigida al lugar
de epítopos específicos, según se describe a continuación en el
Ejemplo 2, ayuda a identificar los epítopos exactos.
Este Ejemplo describe los estudios de
representación en mapa de los epítopos utilizando proteínas de
fusión OspA y TrpE-OspA químicamente escindidas.
Los estudios indican una región hipervariable que rodea al residuo
triptófano único conservado de OspA (en el residuo 216 o, en algunos
casos, 217), según se determina por un análisis de la población de
ventana en movimiento de OspA procedente de quince materiales
aislados europeos y norteamericanos de Borrelia. La región
hipervariable es importante para el reconocimiento inmune.
La mutagénesis dirigida al lugar también se
realizó para examinar más estrechamente las regiones hipervariables.
La espectroscopia de fluorescencia y de dicroismo circular han
indicado que el triptófano conservado es parte de una región de la
hélice alfa en la que el triptófano está encerrado en un entorno
hidrófobo (McGrath, B. C., et al., Vaccines, Cold Spring
Harbor Laboratory Press, Plainview, Nueva York; págs.
365-370 (1993)). Es probable que cadenas laterales
de aminoácidos más polares que flanquean el triptófano queden
expuestas al disolvente hidrófilo. La hipervariabilidad de estos
residuos expuestos al disolvente entre las diversas cepas de
Borrelia sugirió que estos residuos aminoácidos pueden
contribuir a la variación antigénica en OspA. Por lo tanto, la
mutagénesis dirigida al lugar se realizó para reemplazar alguna de
las cadenas laterales de aminoácidos potencialmente expuestas en la
proteína de una cepa con los residuos análogos de una segunda cepa.
A continuación, las proteínas alteradas se analizaron mediante
transferencia Western utilizando anticuerpos monoclonales que unen
OspA sobre la superficie del espiroqueto no mutado. Los resultados
indicaron que determinados cambios específicos de aminoácidos
próximos al triptófano pueden anular la reactividad de OspA a estos
anticuerpos monoclonales.
La clonación y secuenciación de la proteína OspA
procedente de quince materiales aislados europeos y norteamericanos
(descritos anteriormente en la Tabla I) demostraron que el
polimorfismo de los aminoácidos no se distribuye aleatoriamente a
lo largo de la proteína; más bien, el polimorfismo tendió a formar
racimos en tres regiones de OspA. El análisis se llevó a cabo
representando el polimorfismo en movimiento y de media ponderada de
una ventana (una subsección de longitud fija de la secuencia total)
a medida que se desliza a lo largo de la secuencia. El tamaño de la
ventana en este análisis era de trece aminoácidos, basado en la
determinación del número mayor de puntos significativamente
desviantes, según se establece por el método de Tajima (J. Mol.
Evol. 33: 470-473 (1991). El polimorfismo
ponderado medio se calculó sumando el número de alelos variantes
para cada sitio. Los cálculos del polimorfismo se sopesaron por la
severidad del reemplazamiento de aminoácidos (Dayhoff, M. O. et
al., en: Dayhoff, M. O. (ed.) Atlas of Protein Sequence and
Structure NBRF, Washington, Vol. 5, Supl. 3 345 (1978)).
La suma se normalizó mediante el tamaño de la ventana y se
representó gráficamente. La posición de la secuencia de aminoácidos
corresponde a una ventana que abarca los aminoácidos 1 a 13. Se
utilizó un remuestreo del cordón de la bota ("bootstrap") para
generar intervalos de confianza del 95% en el análisis de la ventana
deslizante. Dado que Borrelia ha demostrado ser clonal, el
análisis del cordón de la bota debería dar una estimación fiable de
la varianza esperada de los cálculos de polimorfismo. El cordón de
la bota se repitió quinientas veces en cada posición y la media se
calculó a partir de la suma de todas las posiciones. La naturaleza
clonal de Borrelia asegura que se minimizará la varianza
estocástica que resulta de diferentes historias genealógicas de las
posiciones de la secuencia (como sería de esperar si la
recombinación fuera prevalerte).
Este ensayo verificó que las tres regiones en
torno a los picos observados tienen todas excesos significativos de
polimorfismo. Los excesos de polimorfismo se observaron en las
regiones que incluían los residuos de aminoácidos
132-145, los residuos 163-177 y los
residuos 208-221 (figura 3). En la figura 4 se
muestra una alineación de los aminoácidos entre los residuos 200 y
220 para B31, K48 y los cuatro mutantes dirigidos al lugar. La
región 208-221 del aminoácido incluye la región de
OspA que ha sido modelada como una hélice alfa orientada en la que
el residuo único de triptófano en el aminoácido 216 está encerrado
en una bolsa hidrófoba, exponiendo con ello más aminoácidos polares
al disolvente (figura 5). (France, L. L., et al.,
Biochem. Biophys. Acta 1120: 59 (1992)). Estos residuos
expuestos potencialmente al disolvente mostraron una variabilidad
considerable entre las OspAs de diversas cepas y pueden ser un
importante componente de la variación antigénica de OspA. Para los
fines de genera proteínas quiméricas, los dominios hipervariables
de interés son el Dominio A, que incluye los residuos
120-140 de aminoácidos de OspA; el Dominio
B, que incluye los residuos 150-180; y el
Dominio C que incluye los residuos 200-216 ó
217.
Se llevó a cabo la mutagénesis dirigida al lugar
para convertir los residuos dentro del dominio
204-219 de la OspA B31 recombinante en los residuos
análogos de una variante de OspA europea, K48. En la región de OspA
entre los residuos 204 y 219, que incluye el dominio helicoidal
(aminoácidos 204-217), existen siete diferencias de
aminoácidos entre OspAB31 y OspA-K48. Se generan
tres oligonucleótidos, cada uno de los cuales contenía cambios de
nucleótidos que incorporarían los aminoácidos K48 en sus posiciones
análogas en la proteína B31 OspA. Los oligos utilizados para crear
los mutantes dirigidos al lugar eran:
5'-CTTAATGACTCTGACACTAGTGC-3'
(nº 613, que convierte treonina en la posición 204 en serina, y
serina en 206 en treonina (Thr204-Ser,
Thr206-Ser)) (SEQ ID NO. 1);
5'-GCTACTAAAAAAACCGGGAAATGGAATTCA-3'
(nº 625, que convierte alanina en 214 en glicina, y alanina en 215
en lisina (Ala214-Gly, Ala215-Lys))
(SEQ ID NO. 2); y
5'-GCAGCTTGGGATTCAAAAACATCCACTTTAACA-3'
(nº 640, que convierte asparagina en 217 en aspartato, y glicina en
219 en lisina (Asn217-Asp, Gly
219-Lys) (SEQ ID NO. 3).
La mutagénesis dirigida al lugar se llevó a cabo
realizando mutagénesis con pares de los oligos anteriores. Se
crearon tres mutantes dirigidos al lugar, cada uno con dos cambios:
OspA 613 (Thr204-Ser, Thr206-Ser),
OspA 625 (Ala214-Gly, Ala215-Lys),
y 640 (Asn217-Asp, Gly219-Lys).
Existían también dos proteínas con cuatro cambios: OspA 613/625
(Thr204-Ser, Thr206-Ser,
Ala214-Gly, Ala215-Lys) y OspA
613/640 (Thr204-Ser, Thr206-Ser,
Ala217-Asp, Gly219-Lys).
Anticuerpos monoclonales que aglutinan
espiroquetos, incluidos varios que son neutralizantes in
vitro, reconocen epítopos que se representan en el mapa de la
región hipervariable en torno a Trp216 (Barbour, A. G. et al.,
Infect. and Immun. 41: 759 (1983); Schubach, W. H. et al.,
Infect. and Immun. 59: 1911 (1991)). El análisis por
transferencia Western demostró que la escisión química de OspA
procedente de la cepa B31 en Trp216 anula la reactividad de la
proteína con el acm 105 aglutinante, un anticuerpo monoclonal
desarrollado contra espiroquetos B31 (datos no mostrados). El
reactivo, N-clorosuccinimida (NCS) escinde OspA en
el Trp216, formando un fragmento de 23,2 kd y un péptido de 6,2 kd
que no es retenido en la membrana de Imobilon-P
después de la transferencia. El material no escindido une el acm
105; sin embargo, el fragmento de 23,2 kd, no es reactivo.
Transferencias Western similares con una proteína de fusión
TrpE-OspA que contenía la porción carboxi- terminal
de la proteína OspA demostraron que el pequeño trozo de 6,2 kd
también falla en unir el acm 105 (Schubach, W. H. et al., Infect.
and Immun. 59: 1911 (1991)).
Los anticuerpos monoclonales H5332 y H3TS
(Barbour, A. G. et al., Infect. and Immun. 41: 759 (1983))
han demostrado, por inmunofluorescencia, decorar la superficie de
espiroquetos fijados (Wilske, B. et al., World J. Microbiol.
7: 130 (1991)). Estos anticuerpos monoclonales también inhiben
el crecimiento del organismo en cultivo. La representación en mapa
del epítopo con proteínas de fusión ha confirmado que los epítopos
que unen estos acms están conformacionalmente determinados y
residen en la mitad carboxi de la proteína. El acm H5332 es el que
reacciona cruzadamente entre la totalidad de los grupos
filogenéticos conocidos, mientras que acm H3TS y acm 105 parecen ser
específicos de la cepa B31 contra la que fueron desarrollados. Al
igual que el acm 105, las reactividades de H5332 y H3TS a OspA son
eliminadas mediante fragmentación de la proteína en Trp216 (datos
no mostrados). El acm 336 se desarrolló a los espiroquetos
completos de la cepa P/Gau. Reacciona cruzadamente con OspA del
grupo 1 (el grupo al que pertenece B31), pero no al grupo 2 (del que
K48 es un miembro). Estudios previos utilizando proteínas de fusión
y escisión química han indicado que este anticuerpo reconoce un
dominio de OspA en la región entre los residuos 217 y 273 (datos no
mostrados). Todos estos acms aglutinarán el espiroqueto B31.
Se utilizaron acms para el análisis de la
transferencia Western de los mutantes de OspA dirigidos al lugar
inducidos en E. coli utilizando el sistema de expresión T7
(Dunn, J. J. et al., Protein Expresión and Purification 1:
159 (1990)). Células de E. coli que portan plásmidos Pet9c
con una inserción mutante de OspA dirigida al lugar se indujeron en
la fase de crecimiento medio logarítmico con IPTG durante cuatro
horas a 37ºC. Los lisados de células se realizaron hirviendo una
parte alícuota de los cultivos inducidos en colorante de carga de
gel SDS, y este material se cargó luego en un gel de SDS al 12%
(BioRad mini Protean II) y se sometieron a electroforesis. A
continuación, las proteínas se transfirieron a membranas
Imobilon-P (Millipore) 70V, 2 horas a 4ºC,
utilizando el sistema de minitransferencia de BioRad. El análisis
de Western se llevó a cabo según se describe por Schubach et al.
(Infect. Immun. 59: 1911 (1991)).
El análisis de la transferencia Western indicó
que únicamente el mutante 625 (Ala214-Gly y
Ala215-Lys) retuvo la unión al H3TS monoclonal
aglutinante (datos no mostrados). Sin embargo, el mutante 613/625,
que tiene alteraciones adicionales al extremo amino de Trp216
(Ser204-Thr y Thr206-Ser) no unía
este anticuerpo monoclonal. Las dos OspAs 640 y 613/640 que tienen
los cambios Asn217-Asp y Gly219-Lys
en el lado carboxi-terminal de Trp216 también
fracasaron en unir el acm H3TS. Esto indicó que el epítopo de la
OspA B31 que une H3TS está constituido por cadenas laterales de
aminoácidos a ambos lados de Trp216.
El mutante 613/625 no se unió a los acms 105 y
H5332, mientras que los otros mutantes conservaron su capacidad de
unir estos acms. Esto es importante a la vista de los datos
utilizando proteínas de fusión que indican que el acm 105 se
comporta más como el acm H3TS en términos de su especificidad por el
serotipio y unión a OspA ( Wilske, B. et al., Med. Microbiol.
Immunol. 181: 191 (1992)). La proteína 613/625 tiene, además de
las diferencias en los residuos Thr204 y Ser206, cambios
inmediatamente amino-terminales a Trp216
(Ala214-Gly y Ala215-Lys). La
supresión de la reactividad de los acms 105 y H5332 hacia esta
proteína indicó que los epítopos de OspA que unen estos anticuerpos
monoclonales están constituidos por residuos en el lado
amino-terminal de Trp216.
Las dos proteínas que portan los reemplazamientos
Asn217-Asp y Gly219-Lys en el lado
carboxi-terminal de Trp216 (OspAs 640 y 613/640)
conservaron su unión a los acms 105 y H5332; sin embargo, no fueron
capaces de reaccionar con el acm 336, un anticuerpo monoclonal que
ha sido representado en mapa con proteínas de fusión
TrpE-OspA y por escisión química a un dominio más
carboxi-terminal. Este resultado puede explicar el
por qué el acm 336 no reconoció el tipo K48 de OspA (Grupo 2).
Es claro que los aminoácidos Ser205 y Thr206
juegan un importante papel en la aglutinación de epítopos de
aglutinantes en la región de OspA B31 que flanquea a Trp216. El
reemplazamiento de estos dos residuos alteró los epítopos de OspA
que unen los acms 105, H3TS y H5332. La capacidad de los cambios de
640 sólo para anular la reactividad del acm 336 indicó que Thr204 y
Ser206 no están implicados en una interacción directa con el
acm
336.
336.
Los resultados indicaron que los epítopos de OspA
que están disponibles para acms que aglutinan espiroquetos están
constituidos, al menos en parte, por aminoácidos en la vecindad
inmediata de Trp216. Dado que el reciente análisis del dicroismo
circular indicó que las estructuras de OspA B31 y K48 difieren muy
poco dentro de este dominio, es improbable que los cambios hechos
por mutación hayan alterado radicalmente la estructura global de la
proteína OspA (France, L. L. et al., Biochem. Biophys. Acta
1120: 59 (1992); y France et al., Biochem. Biophys Acta,
referida (1993)). Esta hipótesis está sustentada por el hallazgo de
que las OspAs mutantes y recombinantes exhiben las mismas
propiedades de elevada solubilidad y purificación que la proteína
B31 parental (datos no mostrados).
En resumen, las cadenas laterales de los
aminoácidos en Ser204 y Thr206 son importantes para muchos de los
epítopos aglutinantes. Sin embargo, un conjunto limitado de cambios
conservativos en estos sitios no eran suficientes para anular la
unión de la totalidad de los acms aglutinantes. Estos resultados
sugirieron que los epítopos aglutinantes de OspA son distintos, pero
todavía tienen un cierto solapamiento. Los resultados también
sustentaron la hipótesis de que el epítopo expuesto a la superficie
en torno a Trp216, que se piensa que es importante para el
reconocimiento y la neutralización inmunológica, es un dominio
conformacionalmente determinado y complejo de
OspA.
OspA.
En la presente invención se pueden utilizar
proteínas y genes procedentes de cualquier cepa de Borrelia.
Las cepas representativas están resumidas en la Tabla I que figura
anteriormente.
Los péptidos quiméricos de la presente invención
pueden contener derivados de cualesquiera proteínas de
Borrelia. Proteínas representativas incluyen OspA, OspB,
OspC, OspD, p12, p39, p41 (fla), p66 y p93. Secuencias de ácidos
nucleicos que codifican varias proteínas de Borrelia están
actualmente disponibles (véase la Tabla II que figura a
continuación); alternativamente, secuencias de ácidos nucleicos que
codifican proteínas de Borrelia se pueden aislar y
caracterizar utilizando métodos como los descritos más abajo.
Secuencias de ácidos nucleicos que codifican
proteínas lipidadas de longitud completa procedentes de cepas de
Borrelia conocidas se aislaron utilizando la reacción en
cadena de la polimerasa (PCR) según se describe más abajo. Además,
se generaron secuencias de ácidos nucleicos que codificaban
proteínas truncadas (proteínas en las que la señal de lipidación ha
sido retirada, tal como eliminando la secuencia de ácidos nucleicos
que codifica los primeros 18 aminoácidos, dando como resultado
proteínas no lipidadas). Se generaron otras proteínas que
codificaban polipéptidos de un gen particular (es decir que
codifican un segmento de la proteína que tiene un número diferente
de aminoácidos que el que tiene la proteína de la naturaleza).
Utilizando métodos similares a los descritos más abajo, se pueden
generar cebadores a partir de secuencias de ácidos nucleicos
conocidas que codifican proteínas de Borrelia y se utilizan
para aislar otros genes que codifican proteínas de Borrelia.
Los cebadores se pueden diseñar para que amplifiquen la totalidad
de un gen, así como para que amplifiquen una secuencia de ácidos
nucleicos que codifica secuencias de proteínas truncadas tales como
las que se describen más abajo para OspC, o secuencias de ácidos
nucleicos que codifican un polipéptido derivado de una proteína de
Borrelia. Los cebadores también se pueden diseñar para que
incorporen sitios de escisión de enzimas de restricción únicos en
las secuencias de ácidos nucleicos amplificadas. El análisis de las
secuencias de ácidos nucleicos amplificadas se puede luego realizar
utilizando técnicas convencionales.
Secuencias de OspA de Borrelia se aislaron
de la siguiente manera: se utilizaron 100 \mul de mezclas de
reacción que contenían KCl 50 mM, Tris-HCl 10 mM
(pH 8,3), MgCl_{2}1,5 mM, 200 \muM de cada NTP, 2,5 unidades de
TaqI ADN polimerasa (Amplitaq, Perkin-Elmer/Cetus)
y 100 pmol de cada uno de los cebadores 5' y 3' (descritos más
abajo). La amplificación se realizó en un ciclador térmico
Perkin-Elmer/Cetus según se describe (Schubach, W.
H. et al., Infect. Immun. 59: 1811-1915
(1991)). El amplicón se visualizó en un gel de agarosa mediante
tinción con bromuro de etidio. Veinte nanogramos del producto de
PCR extraído con cloroformo se clonaron directamente en el vector
PC-TA (Invitrogen) siguiendo las instrucciones del
fabricante. Se seleccionaron colonias recombinantes que contenían
el fragmento amplificado, los plásmidos se prepararon y la
secuencia de ácidos nucleicos de cada OspA se determinó mediante la
técnica de terminación en cadena didesoxi utilizando el kit
Sequenase (United States Biochemical). La secuenciación dirigida se
realizó con cebadores M13, seguido de cebadores específicos para
OspA derivados de secuencias previamente obtenidas con cebadores
M13.
Dado que los extremos 5' y 3' del gen de OspA
están muy conservados (Fikrig, E.S. et al., J. Immunol. 7:
2256-2260 (1992); Bergstrom, S. et al., (Mol.
Microbiol. 3: 479-486 (1989); Zumstein, G.
et al., (Med. Microbiol. Immunol. 181: 57-70
(1992)), los cebadores 5' y 3' para la clonación se pueden basar en
cualesquiera secuencias conocidas de OspA. Por ejemplo, se
utilizaron los siguientes cebadores basados en la secuencia de
ácidos nucleicos de OspA procedente de la cepa B31:
5'-GGAGAATATATTATGAAA-3'
(-12 a +6) (SEQ ID NO. 4); y
5'-CTCCTTATTTTAAAGCG-3'
(+826 a +809) (SEQ ID NO. 5).
(Schubach, W.H. et al., Infect. Immun 59:
1811-1915 (1991)).
Los genes de OspA aislados de esta manera
incluyen los de las cepas B31, K48, PGau y 25015; las secuencias de
ácidos nucleicos se describen en el listado de secuencias como SEQ
ID NO. 6 (OspA-B31), SEQ ID NO. 8
(OspA-K48), SEQ ID NO. 10
(OspA-PGau) y SEQ ID NO. 12
(OspA-25015). En la figura 42 se muestra una
alineación de ésta y otras secuencias de ácidos nucleicos de OspA.
Las secuencias de aminoácidos de las proteínas codificadas por
estas secuencias de ácidos nucleicos están representadas como SEQ
ID NO. 7 (OspA-B31), SEQ ID NO. 9
(OspA-K48), SEQ ID NO. 11
(OspA-PGau) y SEQ ID NO. 13
(OspA-25015).
Los siguientes cebadores se utilizaron para
generar secuencias específicas de ácidos nucleicos del gen de OspA,
a utilizar para generar secuencias de ácidos nucleicos quiméricas
(según se describe en el Ejemplo 4):
5'-GTCTGCAAAAACCATGACAAG-3'
(cebador de la cadena positiva nº 369) (SEQ ID NO. 14);
5'-GTCATCAACAGAAGAAAAATTC-3'
(cebador de la cadena positiva nº 357) (SEQ ID NO. 15);
5'-CCGGATCCATATGAAAAAATATTTATTGGG-3'
(cebador de la cadena positiva nº 607) (SEQ ID NO. 16);
5'-CCGGGATCCATATGGCTAAGCAAAATGTTAGC-3'(cebador
de la cadena positiva nº 584) (SEQ ID NO. 17);
5'-GCGTTCAAGTACTCCAGA-3'
(cebador de la cadena negativa nº 200) (SEQ ID NO. 18);
5'-GATATCTAGATCTTATTTTAAAGCGTT-3'
(cebador de la cadena negativa nº 586) (SEQ ID NO. 19);
5'-GGATCCGGTGACCTTTTAAAGCGTTTTTAT-3'
(cebador de la cadena negativa nº 1169) (SEQ ID NO. 20).
Se utilizaron también métodos similares para
aislar genes de OspB. Un gen de OspB aislado se representa como SEQ
ID NO. 21 (Osp-B31); su secuencia de aminoácidos
codificada es SEQ ID NO. 22.
Se utilizaron los siguientes cebadores para
generar secuencias específicas de ácidos nucleicos del gen de OspB,
a utilizar en la generación de secuencias de ácidos nucleicos
quiméricas (según se describe en el Ejemplo 4):
5'-GGTACAATTACAGTACAA-3'
(cebador de la cadena negativa nº 271) (SEQ ID NO. 23);
5'-CCGAGAATCTCATATGGCACAAAAAGGTGCTGAGTCAATTGG-3'
(cebador de la cadena positiva nº
1105) (SEQ ID NO. 24);
1105) (SEQ ID NO. 24);
5'-CCGATATCGGATCCTATTTTAAAGCGTTTTTAAGC-3'
(cebador de la cadena negativa nº 1106) (SEQ ID NO. 25); y
5'-GGATCCGGTGACCTTTTAAAGCGTTTTTAAG-3'
(cebador de la cadena negativa nº 1170) (SEQ ID NO. 26).
Se utilizaron también métodos similares para
aislar genes de OspC. Se utilizaron los siguientes cebadores para
aislar genes de OspC completos procedentes de las cepas de
Borrelia B31, K48, PKo y pTrob.
5'-GTGCGCGACCATATGAAAAAGAATACATTAAGTGCG-3'
(cebador de la cadena positiva que tiene un sitio Nde1 combinado
con el codón de iniciación) (SEQ ID NO. 27), y
5'-GTCGGCGGATCCTTAAGGTTTTTTTGGACTTTCTGC-3'
(cebador de la cadena negativa que tiene un sitio BamH1 seguido
por el codón de detención) (SEQ ID NO. 28).
Las secuencias de ácidos nucleicos de los genes
de OspC se determinaron entonces mediante la técnica de terminación
en cadena didesoxi utilizando el kit Sequenase (United States
Biochemical). Los genes de OspC aislados y secuenciados de esta
manera incluyen aquellos para las cepas B31, K48, PKo y Tro; las
secuencias de ácidos nucleicos están representadas en el listado de
secuencias como SEQ ID NO. 29 (OspC-B31), SEQ ID
NO. 31 (OspC-K48), SEQ ID NO. 33
(OspC-PKo) y SEQ ID NO. 35
(OspC-Tro). En la figura 38 se muestra una
alineación de estas secuencias. Las secuencias de aminoácidos de
las proteínas codificadas por estas secuencias de ácidos nucleicos
se representan como SEQ ID NO. 30 (OspC-B31), SEQ
ID NO. 32 (OspC-K48), SEQ ID NO. 34
(OspC-PKo) y SEQ ID NO. 36
(OspC-Tro).
Los genes de OspC truncados se generaron
utilizando otros cebadores. Estos cebadores se diseñaron para
amplificar las secuencias de ácidos nucleicos derivadas del gen de
OspC, que carecían de los ácidos nucleicos que codifican la
secuencia de peptidasa señal de la proteína de longitud completa.
Los cebadores correspondían a los pb 58-75 de la
proteína natural, con un codón para Met-Ala fijado
en la parte de cabeza. Para la cepa B31 se utilizó el siguiente
cebador:
5'-GTGCGCGACCATATGGCTAATAATTCAGGGAAAGAT-3'
(SEQ ID Nº 37).
Para la cepa PKo, se utilizó
5'-GTGCGCGACCATATGGCTAGTAATTCAGGGAAAGGT-3'
(SEQ ID Nº 38).
Para las cepas pTrob y K48, se utilizó
5'-GTGCGCGACCATATGGCTAATAATTCAGGTGGGGAT-3'
(SEQ ID Nº 39).
También se diseñaron cebadores adicionales para
amplificar ácidos nucleicos que codifican polipéptidos
particulares, para uso en la creación de secuencias quiméricas de
ácidos nucleicos (véase el Ejemplo 4). Estos cebadores
incluían:
5'-CTTGGAAAATTATTTGAA-3'
(cebador de la cadena positiva nº 520) (SEQ ID NO. 40);
5'-CACGGTCACCCCATGGGAAATAATTCAGGGAAAGG-3'
(cebador de la cadena positiva nº 58) (SEQ ID NO. 41);
5'-TATAGATGACAGCAACGC-3'
(cebador de la cadena negativa nº 207 (SEQ ID NO. 42); y
5'-CCGGTGACCCCATGGTACCAGGTTTTTTTGGACTTTCTGC-3'
(cebador de la cadena negativa nº 636) (SEQ ID NO. 43).
Se pueden utilizar métodos similares para aislar
genes de OspD. En la figura 39 se muestra una alineación de cuatro
secuencias de ácidos nucleicos de OspD (procedentes de las cepas
pBo, PGau, DK29 y K48).
El gen de p12 se identificó de modo similar. Los
cebadores utilizados para clonar el gen de p12 completo incluían:
5'-CCGGATCCATATGGTTAAAAAAATAATATTTATTTC-3'
(cebador delantero nº 757) (SEQ ID NO. 44); y
5'GATATCTAGATCTTTAATTGCTCTGCTCACTCTCTTC-3' (cebador
inverso nº 758) (SEQ ID NO. 45).
Para amplificar un gen de p12 truncado (uno en el
que la proteína transcrita no está lipidada y comienza en el
aminoácido 18 de la secuencia nativa) se utilizaron los siguientes
cebadores: 5'CCGGGATCCATATGGCTAGTGCAATTGGTCGTGG-3'
(cebador delantero nº 759) (SEQ ID NO. 45).
Se utilizó un enfoque similar para clonar y
secuenciar genes que codifican la proteína p41 (fla). Las
secuencias de p41 listadas en la Tabla II con los números de acceso
a GenBank se aislaron utilizando los siguientes cebadores
procedentes de la cepa B31:
5'-ATGATTATCAATCATAAT-3' (+1 a +18)
(SEQ ID NO. 47); y
5'-TCTGAACAATGACAAAAC-3' (+1008 a
+991) (SEQ ID NO. 48). Las secuencias de ácidos nucleicos de p41
aisladas de esta manera están representadas en el listado de
secuencias como SEQ ID NO. 51 (p41-PGau) y SEQ ID
NO. 53 (p41-DK29). En la figura 41 se muestra una
alineación de varias secuencias de ácidos nucleicos p41, incluidas
las de las cepas B31, pKa1, PGau, pBo, DK29 y pKo. La secuencia de
aminoácidos de las proteínas codificadas por estas secuencias de
ácidos nucleicos se representan como SEQ ID NO. 50
(p41-K48), SEQ ID NO. 52
(p41-PGau), SEQ ID NO. 54
(p41-DK29), SEQ ID NO. 56
(p41-PTrob) y SEQ ID NO. 58
(p41-PHei).
Se diseñaron otros cebadores para amplificar
secuencias de ácidos nucleicos que codifican los polipéptidos de
p41, a utilizar en las secuencias de ácidos nucleicos quiméricas.
Estos cebadores incluían:
5'-TTGGATCCGGTCACCCCATGGCTCAATATAACCAATG-3'
(cebador de la cadena negativa nº 122) (SEQ ID NO. 59);
5'-TTGGATCCGGTCACCCCATGGCTTCTCAAAATGTAAG-3'
(cebador de la cadena positiva nº 140) (SEQ ID NO. 60);
5'-TTGGATCCGGTGACCAACTCCGCCTTGAGAAGG-3'
(cebador de la cadena negativa nº 234) (SEQ ID NO. 61); y
5'-TTGGATCCGGTGACCTATTTGAGCATAAGATGC-3'
(cebador de la cadena negativa nº 141) (SEQ ID NO. 62).
También se utilizó el mismo enfoque para clonar y
secuenciar la proteína p93. Genes que codifican p93, según se lista
en la Tabla II con los números de acceso a GenBank, se aislaron
mediante este método con los siguientes cebadores procedentes de la
cepa B31:
5'-GGTGAATTTAGTTGGTAAGG-3'
(-54 a -35) (SEQ ID NO. 63); y
5'-CACCAGTTTCTTTAAGCTGCTCCTGC-3'
(+1117 a +1092) (SEQ ID NO. 64).
Las secuencias de ácidos nucleicos de p93
aisladas de esta manera se representan en el listado de secuencias
como SEQ ID NO. 65 (p93-B31), SEQ ID NO. 67
(p93-K48), SEQ ID NO. 69 (p93-PBo),
SEQ ID NO. 71 (p93-PTrob), SEQ ID NO. 73
(p93-PGau), SEQ ID NO. 75
(p93-25015), y SEQ ID NO. 77
(p93-PKo). Las secuencias de aminoácidos de las
proteínas codificadas por estas secuencias de ácidos nucleicos se
representan como SEQ ID NO. 66 (p93-B31), SEQ ID NO.
68 (p93-K48), SEQ ID NO. 70
(p93-PBo), SEQ ID NO. 72
(p93-PTrob), SEQ ID NO. 74
(p93-PGau), SEQ ID NO. 76
(p93-25015) y SEQ ID NO. 78
(p93-PKo).
Se utilizaron otros cebadores para amplificar
secuencias de ácidos nucleicos que codifican polipéptidos de p93 a
utilizar en la generación de secuencias de ácidos nucleico
quiméricas. Estos cebadores incluían:
5'-CCGGTCACCCCATGGCTGCTTTAAAGTCTTTA-3'
(cebador de la cadena positiva nº 475) (SEQ ID NO. 79);
5'-CCGGTCACCCCATGAATCTTGATAAAGCTCAG-3'
(cebador de la cadena positiva nº 900) (SEQ ID NO. 80);
5'-CCGGTCACCCCATGGATGAAAAGCTTTTAAAAAGT-3'
(cebador de la cadena positiva nº 1168) (SEQ ID NO. 81);
5'-CCGGTCACCCCCATGGTTGAGAAATTAGATAAG-3'
(cebador de la cadena positiva nº 1423) (SEQ ID NO. 82); y
5'-TTGGATCCGGTGACCCTTAACTTTTTTTAAAG-3'
(cebador de la cadena negativa nº 2100) (SEQ ID NO. 83).
Las secuencias de ácidos nucleicos descritas
anteriormente se pueden incorporar en plásmidos de expresión,
utilizando técnicas convencionales, y se pueden transfectar en
células huésped compatibles con el fin de expresar las proteínas
codificadas por las secuencias de ácidos nucleicos. Como ejemplo, se
recoge la expresión del gen de p12 y el aislamiento de la proteína
p12.
La amplificación de la secuencia de ácidos
nucleicos de p12 se realizó con los cebadores que incluían un sitio
de restricción NdeI en la secuencia de ácidos nucleicos. El
producto de PCR se extrajo con fenol/cloroformo y se precipitó con
etanol. El producto precipitado se digirió y ligó en un plásmido de
expresión como sigue: 15 \mul (aproximadamente 1 \mug) de ADN de
PCR se combinó con 2 \mul de tampón de restricción 10X para NdeI
(Gibco/BRL), 1 \mul de NdeI (Gibco/BRL) y 2 \mul de agua
destilada, y se incubó durante una noche a 37ºC. Subsiguientemente,
esta mezcla se combinó con 3 \mul de tampón 10X (tampón 3, New
England BioLabs), 1 \mul de BamHI (NEB) y 6 \mul de agua
destilada, y se incubó a 37ºC durante dos horas. El material
resultante se purificó mediante electroforesis en gel preparativa
utilizando agarosa de bajo punto de fusión, y la banda se visualizó
bajo luz ultravioleta de onda larga y se escindió del gel. La
rodaja de gel se trató con Gelase utilizando las condiciones
recomendadas por el fabricante (Epicentre Technologies). El ADN
resultante sedimentado se resuspendió en 25-50
\mul de Tris-CL 10 mM (pH 8,0) y EDTA 10 mM (TE).
Una parte alícuota de este material se ligó en el vector de
expresión Pet9c (Dunn, J. J. et al., Protein Expression and
Purificaticon 1: 159 (1990)).
Para ligar el material en el vector de expresión
Pet9c, 20-50 ng de la secuencia de ácidos nucleicos
de p12, cortados y purificados según se describe antes, se
combinaron con 5 \mul de tampón 10
One-Phor-All (OPA) (Pharmacia),
30-60 ng de Pet9c se cortaron con NdeI y BamHI, 2,5
\mul de ATP 20 mM, 2 \mul de ADN ligasa de T4 (Pharmacia)
diluida a razón de 1:5 en tampón 1X OPA y suficiente agua destilada
para llevar el volumen final hasta 50 \mul. La mezcla se incubó a
12ºC durante una noche.
Los ligamientos resultantes se transformaron en
células DH5-alfa competentes y se extendieron en
placas de agar nutriente que contenían 50 \mug/ml de canamicina y
se incubaron durante una noche a 37ºC. DH5-alfa se
utiliza como una "cepa de almacenamiento" para clones de
expresión de T7, dado que es RecA deficiente, de modo que no son
problemáticas la recombinación y la concatenación, y debido a que
carece del gen de ARN polimerasa de T7 necesario para expresar el
gen clonado. El uso de esta cepa permite la clonación de productos
génicos potencialmente tóxicos al tiempo que minimiza la posibilidad
de deleción y/o redisposición de los genes deseados. También se
pueden utilizar otras líneas de células con propiedades
similares.
Colonias resistentes a canamicina eran de colonia
única purificada sobre placas de agar nutriente suplementadas con
canamicina a razón de 50 \mug/ml. Una colonia procedente de cada
material aislado se inoculó en 3-5 ml de un medio
líquido que contenía 50 \mug/ml de canamicina, y se incubó a 37ºC
sin agitación. El ADN del plásmido se obtuvo a partir de 1 ml de
cada material aislado utilizando un proceso de lisis alcalina en
caliente (Maniatis, T. et al., Molecular Cloning: A Laboratory
Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY
(1982)).
El ADN del plásmido se digirió con EcoRI y BglII
de la siguiente manera: 15 \mul de ADN del plásmido se combinaron
con 2 \mul de tampón 10 X 3 (NEB), 1 \mul de EcoRI
(NEB), 1 \mul de BglII (NEB) y 1 \mul de agua destilada, y se
incubó durante dos horas a 37ºC. Toda la mezcla de reacción se
sometió a electroforesis en gel de agarosa analítico. Plásmidos que
portaban la inserción p12 se identificaron por la presencia de una
banda correspondiente a 925 pares de bases (p12 de longitud
completa) u 875 pares de bases (p12 no lipidada).
Uno o dos ADNs del plásmido procedente de los
clones de p12 de longitud completa y no lipidado en Pet9c se usaron
para transformar BL21 DE3 pLysS en resistencia a la canamicina según
se describe por Studier et al. (Methods in Enzymology,
Goeddel, D. (Ed.), Academic Press, 185: 60-89
(1990)). Uno o dos transformantes de los clones de longitud
completa y no lipidados eran una colonia única purificada sobre
placas nutrientes que contenían 25 \mug/ml de cloranfenicol (para
mantener pLysS) y 50 \mug/ml de canamicina a 37ºC. Una colonia de
cada material aislado se inoculó en medio líquido suplementado con
cloranfenicol y canamicina y se incubó durante una noche a 37ºC. El
cultivo durante una noche se subcultivó a la mañana siguiente en
500 ml de un caldo líquido con cloranfenicol (25 \mug/ml) y
canamicina (50 \mug/ml) y se desarrolló con aireación a 37ºC en
un sacudidor de aire orbital hasta que la absorbancia a 600 nm
alcanzó 0,4-0,7. Se añadió
isopropil-tio-galactósido (IPTG)
hasta una concentración final de 0,5 mM, para la inducción, y el
cultivo se incubó durante 3-4 horas a 37º como
antes. Las células inducidas se sedimentaron mediante
centrifugación y se resuspendieron en 25 ml de NaPO_{4}(pH
7,7). Una pequeña parte alícuota se retiró para el análisis
mediante electroforesis en gel. Los clones de expresión producían
proteínas que migraban en la posición de 12 kDa.
Se preparó un lisado de células bruto a partir
del cultivo según se describe para la OspA recombinante por Dunn,
J. J. et al., (Protein Expression and Purification 1: 159
(1990)). El lisado bruto se hizo pasar primeramente sobre una
columna de Q-Sepharose (Pharmacia) que había sido
pre-equilibrada en tampón A: NaPO_{4} 10 mM (pH
7,7), NaCl 10 mM, PMSF 0,5 mM. La columna se lavó con NaPO_{4} 10
mM, NaCl 50 mM y PMSF 0,5 mM y luego p12 se eluyó en NaPO_{4} 10
mM, PMSF 0,5 mM con un gradiente de NaCl de 50-400
mM. p12 eluía aproximadamente a mitad de camino a través del
gradiente entre NaCl 100 y 200 mM. Las fracciones pico se agruparon
y dializaron contra NaPO_{4} 10 mM (pH 7,7), NaCl 10 mM, PMSF 0,5
mM. A continuación, la proteína se concentró y aplicó a una columna
de filtración en gel Sephadex G50 con un volumen de lecho de
aproximadamente 50 ml (Pharmacia) en NaPO_{4} 10 mM, NaCl 200 mM,
PMSF 0,5 mM. p12 eluiría típicamente poco después del marcador de
volumen excluido. Las fracciones pico se determinaron haciendo pasar
pequeñas partes alícuotas de todas las fracciones sobre un gel. El
pico de p12 se agrupó y almacenó en pequeñas partes alícuotas a
-20ºC.
El método del megacebador de la mutagénesis
dirigida al lugar y su modificación se utilizaron para generar
secuencias de ácidos nucleicos quiméricas (Sarkar y Sommer,
Biotechniques 8(4): 404-407 (1990);
Aiyar, A. y J. Leis, Biotechniques 14 (3):
366-369 (1993)). Se utilizan un cebador 5' para la
primera plantilla genómica y una fusión oligo 3' para amplificar la
región deseada. El cebador de fusión consiste en un extremo 3' de la
primera plantilla (ADN que codifica el polipéptido
amino-proximal de la proteína de fusión), acoplado
a un extremo 5' de la segunda plantilla (ADN que codifica el
polipéptido carboxi-proximal de la proteína de
fusión).
Las amplificaciones por PCR se realizan
utilizando ADN polimerasa de Taq, tampón 10X PCR y MgCl_{2}
(Promega Corp., Madison, WI), y dNTPs de Ultrapure (Pharmacia,
Piscataway, NJ). Un \mug de plantilla genómica 1, 5 \mu de 10
\muM 5' oligo y 5 \mul de 10 \muM de fusión oligo se combinan
con los reactivos siguientes con las concentraciones finales
indicadas: tampón 10X-Mg FREE (1X), MgCl_{2} (2
mM), mezcla de dNTPs (200 \muM de cada dNTP), ADN polimerasa de
Taq (2,5 unidades), agua hasta llegar a un volumen final de 100
\mul. Se utiliza un ciclador térmico (Perkin Elmer Cetus, Norwalk,
CT) para amplificar bajo las siguientes condiciones: 35 ciclos a
95ºC durante un minuto, 55ºC durante dos minutos y 72º durante tres
minutos. Este proceso da como resultado un "megacebador".
El megacebador resultante se hace pasar sobre un
gel de agarosa 1X TAE de bajo punto de fusión al 4%. La banda del
megacebador se corta del gel y se purifica utilizando el sistema de
purificación de ADN Promega Magic PCR Preps. A continuación, el
megacebador purificado se utiliza en una segunda etapa de PCR. Un
\mug de plantilla genómica 2, aproximadamente 0,5 \mug del
megacebador y 5 \mu de 10 \muM 3' oligo se añaden a un cóctel
de tampón 10X, MgCl_{2}, dNTPs y Taq a las mismas concentraciones
finales que las señaladas anteriormente, y se llevan hasta 100
\mul con agua. Las condiciones de PCR son las mismas que antes. La
proteína de fusión que resulta de esta amplificación se purifica
también utilizando el sistema de purificación de ADN Promega Magic
PCR Preps.
El producto de fusión se liga luego en vector TA
y se transforma en E. coli utilizando el kit de clonación TA
de Invitrogen (San Diego, CA). Aproximadamente 50 ng de producto de
fusión por PCR se ligan a 50 ng de vector pCRII con tampón de
ligamiento 1X, 4 unidades de ligasa de T4 y se llevan a 10 Nl con
agua. Esta mezcla de productos ligados se incuba a 12ºC durante una
noche (aproximadamente 14 horas). Dos \mul de la mezcla de
productos de ligamiento se añaden a 50 \mul de células F' INC
competentes y 2 \mu de beta-mercaptoetanol. A
continuación, las células se incuban durante 30 minutos, seguido de
tratamiento por choque térmico a 42ºC durante 60 segundos, y un
enfriamiento brusco con hielo durante dos minutos. Después se añaden
a las células 450 \mul de medio SOC calentado, dando como
resultado un cultivo de células transformadas que se incuba a 37ºC
durante una hora con ligero sacudimiento. 50 \mul del cultivo de
células transformadas se extienden en placas de LB + 50 \mug/
\mul de ampicilina y se incuban durante una noche a 37ºC. Se
recogen las colonias de color blanco sencillas y se añaden a
cultivos individuales durante una noche que contenían 3 ml de LB
con ampicilina (50 \mug/\mul).
Los cultivos de una noche individuales se
preparan utilizando el sistema de purificación de ADN Promega Magic
Miniprep. Una pequeña cantidad del ADN resultante se corta
utilizando una digestión de restricción como verificación. La
secuenciación del ADN se realiza luego para verificar la secuencia
de la secuencia de ácidos nucleicos de fusión utilizando el kit de
secuenciación de ADN de United States Biochemical (Cleveland, OH)
Sequenase Versión 2.0. Por cada reacción se utilizan de tres a
cinco \mug de ADN de plásmido. Al ADN se añaden 2 \mul de
NaOH/EDTA 2 mM, y el volumen se lleva a 20 \mul con agua. La
mezcla se incuba luego a la temperatura ambiente durante cinco
minutos. Se añaden 7 \mul de agua, 3 \mul de NaAc 3 M, 75 \mul
de EtOH. La mezcla resultante se combina mediante arremolinamiento
y se incuba durante 10 minutos a -70ºC y luego se somete a
microfugación. Después de microcentrifugar durante diez minutos, el
sobrenadante se separa por aspiración y el sedimento se seca en el
speed vac durante 30 segundos. Después se añaden 6 \mul de agua, 2
\mul de tampón de reasociación y 2 \mul de 10 \muM del oligo
apropiado. Esta mezcla se incuba durante 10 minutos a 37ºC y luego
se deja reposar a la temperatura ambiente durante 10 minutos.
Subsiguientemente, se añaden a cada muestra de la mezcla 5,5 \mul
de cóctel de marcaje (descrito anteriormente) que se incuban a la
temperatura ambiente durante cinco minutos adicionales. Luego se
añaden 3,5 \mul de ADN marcado a cada muestra que luego se incuba
durante cinco minutos a 37ºC. A cada pocillo se añaden 4 \mul de
solución de terminación. El ADN se desnaturaliza a 95º durante dos
minutos y luego se coloca sobre hielo.
Los clones con las secuencias de ácidos nucleicos
de fusión deseadas se reclonan luego en el marco en el sistema de
expresión de pEt en las formas lipidadas (longitud completa) y no
lipidada (truncada, es decir sin los primeros 17 aminoácidos). El
producto se amplifica utilizando sitios de restricción contenidos
en los cebadores de PCR. El vector y el producto se cortan con las
mismas enzimas y se ligan juntos con la ligasa de T4. El plásmido
resultante se transforma en E. coli competente utilizando
técnicas de transformación convencionales. Las colonias se rastrean
según se describe anteriormente y clones positivos se transforman
en células de expresión tales como E. coli BL21, para la
expresión de proteínas con IPTG para inducción. La proteína
expresada en su forma de lisado de cultivo bacteriano y/o forma
purificada se inyecta luego en ratones para la producción de
anticuerpos. Los ratones son desangrados y los sueros son recogidos
para la aglutinación, inhibición del desarrollo in vitro y
ensayos de lisis dependiente e independiente del complemento.
Se generaron diversas secuencias de ácidos
nucleicos quiméricas. Las secuencias de ácidos nucleicos se
describen como codificadoras de polipéptidos de proteínas de
Borrelia. Las secuencias de ácidos nucleicos quiméricas se
producen de modo que la secuencia de ácido nucleico que codifica un
polipéptido se encuentra en el mismo marco de lectura que la
secuencia de ácidos nucleicos que codifica el siguiente polipéptido
en la secuencia de proteína quimérica codificada por la secuencia
de ácidos nucleicos quimérica. Las proteínas se listan
secuencialmente (en el orden de presencia de la secuencia
codificante) en la descripción de la secuencia de ácidos nucleicos
quimérica. Por ejemplo, si se secuenciara una secuencia de ácidos
nucleicos quimérica consistente en los pb 1-650 de
OspA-1 y los pb 651-820 de
OspA-2, la secuencia de la quimera incluiría los
primeros 650 pares de bases de OspA-1, seguido
inmediatamente de los pares de bases 651-820 de
OspA-2.
Una quimera de OspA procedente de la cepa K48
(OspA-K48) y OspA procedente de la cepa PGau
(OspA-PGau) se generó utilizando el método descrito
anteriormente. Esta secuencia de ácidos nucleicos quimérica incluía
los pb 1-654 de OspA-K48, seguido
de los pb 655-820 de OspA-PGau. Los
cebadores utilizados incluían: la secuencia
amino-terminal del cebador de OspA nº 607 (SEQ ID
NO. 16); el cebador de fusión,
5'-AAAGTAGAAGTTTTTGAATCCCATTTTCCAGTTTTTTT-3'
(cebador de la cadena negativa nº 668-654) (SEQ ID
NO. 84); la secuencia carboxi-terminal del cebador
de OspA nº 586 (SEQ ID NO. 19); y los cebadores de secuencia nº 369
(SEQ ID NO. 14) y nº 358 (SEQ ID NO. 15). La secuencia de ácidos
nucleicos quimérica se presenta como SEQ ID NO. 85; la proteína
quimérica codificada por esta secuencia de ácidos nucleicos
quimérica se presenta como SEQ ID NO. 86.
Una quimera de OspA procedente de la cepa B31
(OspA-B31) y OspA procedente de la cepa PGau
(OspA-PGau) se generó utilizando el método descrito
anteriormente. Esta secuencia de ácidos nucleicos quimérica incluía
los pb 1-651 de OspA-B31, seguido
de los pb 652-820 de OspA-PGau. Los
cebadores utilizados incluían: el cebador de fusión,
5'-AAAGTAGAAGTTTTTGAATTCCAAGCTGCAGTTTT-3'
(cebador de la cadena negativa nº 668-651) (SEQ ID
NO. 87); y el cebador de la secuencia nº 369 (SEQ ID NO 14) La
secuencia de ácidos nucleicos quimérica se presenta como SEQ ID NO.
88; la proteína quimérica codificada por esta secuencia de ácidos
nucleicos quimérica se presenta como SEQ ID NO. 89.
Una quimera de OspA procedente de la cepa B31
(OspA-B31) y OspA procedente de la cepa K48
(OspA-K48) se generó utilizando el método descrito
anteriormente. Esta secuencia de ácidos nucleicos quimérica incluía
los pb 1-651 de OspA-B31, seguido
de los pb 652-820 de OspA-K48. Los
cebadores utilizados incluían: el cebador de fusión,
5'-AAAGTGGAAGTTTTTGAATTCCAAGCTGCAGTTTTTTT-3'
(cebador de la cadena negativa nº 671-651) (SEQ ID
NO. 90); y el cebador de la secuencia nº 369 (SEQ ID NO. 14) La
secuencia de ácidos nucleicos quimérica se presenta como SEQ ID NO.
91; la proteína quimérica codificada por esta secuencia de ácidos
nucleicos quimérica se presenta como SEQ ID NO. 92.
Una quimera de OspA procedente de la cepa B31
(OspA-B31) y OspA procedente de la cepa 25015
(OspA-25015) se generó utilizando el método descrito
anteriormente. Esta secuencia de ácidos nucleicos quimérica incluía
los pb 1-651 de OspA-B31, seguido
de los pb 652-820 de OspA-25015. Los
cebadores utilizados incluían: el cebador de fusión,
5'-TAAAGTTGAAGTGCCTGCATTCCAAGCTGCAGTTT-3'
(SEQ ID NO 93). La secuencia de ácidos nucleicos quimérica se
presenta como SEQ ID NO. 94; la proteína quimérica codificada por
esta secuencia de ácidos nucleicos quimérica se presenta como SEQ
ID NO. 95.
Una quimera de OspA procedente de la cepa B31
(OspA-B31) y OspA procedente de la cepa K48
(OspA-K48) se generó utilizando el método descrito
anteriormente. Esta secuencia de ácidos nucleicos quimérica incluía
los pb 1-570 de OspA-B31, seguido
de los pb 570-651 de OspA-B31,
seguido de los pb 650-820 de
OspA-K48. Los cebadores utilizados incluían: el
cebador de fusión,
5'-CCCCAGATTTTGAAATCTTGCTTAAAACAAC-3'(SEQ
ID NO. 96); y el cebador de la nº 357 (SEQ ID NO. 15). La secuencia
de ácidos nucleicos quimérica se presenta como SEQ ID NO. 97; la
proteína quimérica codificada por esta secuencia de ácidos
nucleicos quimérica se presenta como SEQ ID NO. 98.
Una quimera de OspA procedente de la cepa B31
(OspA-B31) y OspA procedente de la cepa K48
(OspA-K48) se generó utilizando el método descrito
anteriormente. Esta secuencia de ácidos nucleicos quimérica incluía
los pb 1-420 de OspA-B31, seguido
de los pb 420-570 de OspA-K48,
seguido de los pb 570-650 de
OspA-B31, seguido de los pb 651-820
de OspA-K48. Los cebadores utilizados incluían: el
cebador de fusión,
5'-CAAGTCTGGTTCCAATTTGCTCTTGTTATTAT-3'
(cebador de la cadena negativa nº 436-420) (SEQ ID
NO. 99); y el cebador de la secuencia nº 357 (SEQ ID NO. 15). La
secuencia de ácidos nucleicos quimérica se presenta como SEQ ID NO.
100; la proteína quimérica codificada por esta secuencia de ácidos
nucleicos quimérica se presenta como SEQ ID
NO. 101.
NO. 101.
Una quimera de OspA y OspB procedente de la cepa
B31 (OspA-B31, OspB-B31) se generó
utilizando el método descrito anteriormente. La secuencia de ácidos
nucleicos quimérica incluía los pb 1-651 de
OspA-B31, seguido de los pb 652-820
de OspB-B31. Los cebadores utilizados incluían: el
cebador de fusión,
5'-GTTAAAGTGCTAGTACTGTCATTCCAAGCTGCAGTTTTTTT-3'
(cebador de la cadena negativa nº 740-651) (SEQ ID
NO. 102); la secuencia carboxi-terminal del cebador
de OspB nº 1106 (SEQ ID NO. 25); y el cebador de la secuencia nº 357
(SEQ ID NO. 15). La secuencia de ácidos nucleicos quimérica se
presenta como SEQ ID NO. 103; la proteína quimérica codificada por
esta secuencia de ácidos nucleicos se presenta como SEQ ID NO.
104.
Una quimera de OspA, OspB y OspC procedente de la
cepa B31 (OspA-B31, OspB-B31 y
OspC-B31) se generó utilizando el método descrito
anteriormente. La secuencia de ácidos nucleicos quimérica incluía
los pb 1-650 de OspA-B31, seguido de
los pb 652-820 de OspB-B31, seguido
de los pb 74-630 de OspC-B31. Los
cebadores utilizados incluían: el cebador de fusión,
5'-TGCAGATGTAATCCCATCCGCCATTTTTAAAGCGTTTTT-3'
(SEQ ID NO. 105); y la secuencia carboxi-terminal
del cebador de OspC nº 1106 (SEQ ID NO. 28). La secuencia de
ácidos nucleicos quimérica se presenta como SEQ ID NO. 106; la
proteína quimérica codificada por esta secuencia de ácidos nucleicos
quimérica se presenta como SEQ ID NO. 107.
Una quimera de OspA, OspB y OspC procedente de la
cepa B31 (OspA-B31, OspB-B31 y
OspC-B31) se generó utilizando el método descrito
anteriormente. La secuencia de ácidos nucleicos quimérica incluía
los pb 1-630 de OspC-B31, seguido de
los pb 52-650 de OspA-B31, seguido
de los pb 650-820 de OspB-B31. Los
cebadores utilizados incluían: el cebador de fusión,
5'-GCTGCTAACATTTTGCTTAGGTTTTTTTGGACTTTC-3'
(cebador de la cadena negativa nº 69-630)(SEQ ID NO.
108); y los cebadores de la secuencia nº 520 (SEQ ID NO. 40) y nº
200 (SEQ ID NO. 18). La secuencia de ácidos nucleicos quimérica se
presenta como SEQ ID NO. 109; la proteína quimérica codificada por
esta secuencia de ácidos nucleicos quimérica se presenta como SEQ
ID NO. 110.
Utilizando los métodos descritos anteriormente,
se produjeron otras secuencias de ácidos nucleicos quiméricas.
Estas secuencias de ácidos nucleicos quiméricas y las proteínas
codificadas se resumen en la Tabla 3:
Las secuencias de ácidos nucleicos quiméricas
descritas anteriormente, así como las secuencias de ácidos
nucleicos quiméricas producidas por los métodos descritos
anteriormente, se utilizan para producir proteínas quiméricas
codificadas por las secuencias de ácidos nucleicos. Métodos
convencionales tales como los descritos anteriormente en el Ejemplo
3, concernientes a la expresión de proteínas procedentes de genes
de Borrelia, se pueden utilizar para expresar las proteínas
en un organismo huésped compatible. A continuación, las proteínas
quiméricas se pueden aislar y purificar utilizando técnicas
convencionales.
Si la proteína quimérica es soluble, ésta se
puede purificar en una columna de Sepharose. Las proteínas
insolubles se pueden solubilizar en guanidina y purificar en una
columna de Ni++; alternativamente, se pueden solubilizar en
NaPO_{4} 10 mM con TRITON X 114 al 0,1-1%, y
subsiguientemente purificar sobre una columna S (Pharmacia). Las
proteínas lipidadas se purificaron generalmente por el método
citado en último lugar. La solubilidad se determinó separando tanto
las fracciones solubles como insolubles del lisado de células en un
gel de PAGE al 12%, y verificando la localización de la proteína
mediante tinción con Coomasie, o mediante transferencia Western con
anticuerpos monoclonales dirigidos contra un polipéptido antigénico
de la proteína quimérica.
Los expertos en la técnica reconocerán, o serán
capaces de verificar utilizando no más de una experimentación
rutinaria, muchos equivalentes a las realizaciones específicas de
la invención descrita en esta memoria. Equivalentes de este tipo
pretenden ser abarcados en el alcance de las siguientes
reivindicaciones.
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Associated Universities, Inc.
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: Suite 730
\hskip4,2cm1400 16th Street, NW
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: Washington
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- ESTADO/PROVINCIA: Distrito de Columbia
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: Estados Unidos de América
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO POSTAL: 20036
\vskip0.500000\baselineskip
- (G)
- TELÉFONO: (516) 282-7338
\vskip0.500000\baselineskip
- (I)
- TELEFAX:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- INVENTOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Dunn, John J.
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: 5 Mott Drive
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: Bellport
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- ESTADO/PROVINCIA: Nueva York
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: Estados Unidos de América
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO POSTAL: 11713
\vskip0.500000\baselineskip
- (G)
- TELÉFONO:
\vskip0.500000\baselineskip
- (I)
- TELEFAX:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- INVENTOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Luft, Benjamin J.
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: 232 Lincoln Avenue
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: Port Jefferson
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- ESTADO/PROVINCIA: Nueva York
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: Estados Unidos de América
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO POSTAL: 11777
\vskip0.500000\baselineskip
- (G)
- TELÉFONO:
\vskip0.500000\baselineskip
- (I)
- TELEFAX:
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Proteínas quiméricas que comprenden polipéptidos de Borrelia; usos para las mismas
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 144
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- DIRECCIÓN DE CORRESPONDENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- RECEPTOR: Hamilton, Brook, Smith & Reynolds, P.C.
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: Two Militia Drive
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: Lexington
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- ESTADO: MA
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: EE.UU.
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO POSTAL: 02173
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TIPO DE MEDIO: disquete
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: IBM PC compatible
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- SOFTWARE: PatentIn Release nº 1.0, versión nº 1.25
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- DATOS ACTUALES DE LA SOLICITUD:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE SOLICITUD: PCT/US94/12352
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE PRESENTACIÓN: 27 de octubre de 1994
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASIFICACIÓN:
\vskip0.800000\baselineskip
- (vii)
- DATOS DE SOLICITUD ANTERIOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE SOLICITUD: US 235.836
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE PRESENTACIÓN: 29 de abril de 1994
\vskip0.800000\baselineskip
- (vii)
- DATOS DE SOLICITUD ANTERIOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE SOLICITUD: US 08/148.191
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE PRESENTACIÓN: 01 de noviembre de 1993
\vskip0.800000\baselineskip
- (viii)
- INFORMACIÓN SOBRE EL APODERADO/AGENTE:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Granan, Patricia
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- NÚMERO DE REGISTRO: 32.227
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- REFERENCIA/NÚMERO DE EXPEDIENTE: BNL93-28A PCT
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIÓN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TELÉFONO: (617) 861-6240
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TELEFAX: (617) 861-9540
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:1:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 23 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 1:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCTTAATGACT CTGACACTAG TGC
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 2:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 30 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 2:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGCTACTAAAA AAACCGGGAA ATGGAATTCA
\hfill30
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 3:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 33 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 3:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGCAGCTTGGG ATTCAAAAAC ATCCACTTTA ACA
\hfill33
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 4:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 18 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 4:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGGAGAATATA TTATGAAA
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 5:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 17 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- SECUENCIA DE LA DESCRIPCIÓN: SEQ ID NO: 5:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCTCCTTATTT TAAAGCG
\hfill17
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 6:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 822 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1..822
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 6:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 7:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 273 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 7:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 8:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 825 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1..825
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 8:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 9:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 274 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 9:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 10:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 822 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1..822
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 10:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 11:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 273 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 11:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 12:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 819 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1..819
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- Descripción de la secuencia: SEQ ID NO:12:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 13:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 273 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 13:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 14:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 21 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- SECUENCIA DE LA DESCRIPCIÓN: SEQ ID NO: 14:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGTCTGCAAAA ACCATGACAA G
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 15:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 22 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 15:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCTCATCAACA GAAGAAAAAT TC
\hfill22
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 16:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 30 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 16:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCCGGATCCAT ATGAAAAAAT ATTTATTGGG
\hfill30
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 17:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 32 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 17:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCCGGGATCCAC TATGGCTAAG CAAAATGTTA GC
\hfill32
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 18:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 18 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 18:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGCGTTCAAGT ACTCCAGA
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 19:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 27 pares de base
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 19:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGATATCTAGA TCTTATTTTA AAGCGTT
\hfill27
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 20:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 31 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 20:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGGATCCGGTG ACCTTTTAAA GCGTTTTTAA T
\hfill31
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 21:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 891 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TIPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1..891
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 21:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 22:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 296 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TIPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 22:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 23:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 18 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 23:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGGTACAATTA CAGTACAA
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 24:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 42 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCCGAGAATCT CATATGGCAC AAAAAGGTGC TGAGTCAATT GG
\hfill42
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 25:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 35 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 25:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCCGATATCGG ATCCTATTTT AAAGCGTTTT TAAGC
\hfill35
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 26:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 31 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 26:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGGATCCGGTG ACCTTTTAAA GCGTTTTTAA G
\hfill31
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 27:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 36 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 27:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGTGCGCGACC ATATGAAAAA GAATACATTA AGTGCG
\hfill36
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 28:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 36 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 28:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGTCGGCGGAT CCTTAAGGTT TTTTTGGACT TTCTGC
\hfill36
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 29:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 633 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1..633
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 29:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 30:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 210 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 30:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 31:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 630 pares de base
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1..630
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 31:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 32:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 209 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 32:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 33:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 639 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1..639
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 33:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 34:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 212 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 34:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 35:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 624 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1..624
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 35:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:36:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 207 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA SEQ ID NO: 36:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 37:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 36 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 37:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGTGCGCGACC ATATGGCTAA TAATTCAGGG AAAGAT
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 38:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 37 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 38:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGTGCGCGACC ATATGGGCTA GTAATTCAGG GAAAGGT
\hfill37
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 39:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 36 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 39:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGTGCGCGACC ATATGGCTAA TAATTCAGGT GGGGAT
\hfill36
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 40:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 18 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 40:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCTTGGAAAAT TATTTGAA
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 41:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 35 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA SEQ ID NO: 41
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCACGGTCACC CCATGGGAAA TAATTCAGGG AAAGG
\hfill35
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 42:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 18 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 42:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTATAGATGAC AGCAACGC
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 43:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 40 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 43:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCCGGTGACCC CATGGTACCA GGTTTTTTTG GACTTTCTGC
\hfill40
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 44:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 36 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 44:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCCGGATCCAT ATGGTTAAAA AAATAATATT TATTTC
\hfill36
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 45:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 37 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 45:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGATATCTAGA TCTTTAATTG CTCTGCTCAC TCTCTTC
\hfill37
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 46:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 34 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 46:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCCGGGATCCA TATGGCTAGT GCAATTGGTC GTGG
\hfill34
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 47:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 18 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 47:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipATGATTATCA ATCATAAT
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 48:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 18 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 48:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTCTCAACAAT GACAAAAC
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 49:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 825 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 49:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 50:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 824 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 50:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 51:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1011 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1..1011
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 51:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 52:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 336 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 52:
\newpage
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 53:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1008 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1..1008
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEO ID NO: 53:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 54:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 336 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 54
\newpage
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 55:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 821 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 55:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 56:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 821 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 56:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 57:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 821 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 57:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 58:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 822 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 58:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 59:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 37 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 59:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTTGGATCCGG TCACCCCATG GCTCAATATA ACCAATG
\hfill37
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 60:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 37 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 60:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTTGGATCCGG TCACCCCATG GCTTCTCAAA ATGTAAG
\hfill37
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 61:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 33 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 61:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTTGGATCCGG TGACCAACTC CGCCTTGAGA AGG
\hfill33
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 62:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 33 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 62:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTTGGATCCGG TGACCTATTT GAGCATAAGA TGC
\hfill33
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 63:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 63:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGGTGAATTTA GTTGGTAAGG
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 64:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 26 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 64:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCACCAGTTTC TTTAAGCTGC TCCTGC
\hfill26
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 65:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 2102 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1..2100
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 65:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 66:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 700 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 66:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 67:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 2081 pares de base
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1..2079
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 67:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 68:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 693 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 68:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 69:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1991 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (x)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1..1989
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 69:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 70:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 663 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 70:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 71:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 2081 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1..2079
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 71:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 72:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 693 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 72:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 73:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 2107 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1..2100
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 73:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 74:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 700 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 74:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 75:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 2126 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1..2124
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 75
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 76:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 708 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 76:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 77:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1991 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1..989
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 77:
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 78:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 663 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 78:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 79:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 32 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 79:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCCGGTCACCC CATGGCTGCT TTAAAGTCTT TA
\hfill32
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 80:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 32 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 80:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCCGGTCACCC CATGAATCTT GATAAAGCTC AG
\hfill32
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 81:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 32 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 81:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCCGGTCACCC CATGGATGAA AAGCTTTTAA AAAGT
\hfill35
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 82:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 33 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 82:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCCGGTCACCC CCATGGTTGA GAAATTAGAT AAG
\hfill33
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 83:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 32 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 83:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTTGGATCCGG TGACCCTTAA CTTTTTTTAA AG
\hfill32
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 84:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 38 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 84:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipAAAGTAGAAG TTTTTGAATC CCATTTTCCA GTTTTTTT
\hfill38
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 85:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 825 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1..825
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 85:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 86:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 274 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 86:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 87:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 35 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 87:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipAAAGTAGAAG TTTTTGAATT CCAAGCTGCA GTTTT
\hfill35
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 88:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 822 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1..822
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 88:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 89:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 273 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 89:
\newpage
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 90:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 38 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 90:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipAAAGTGGAAG TTTTTGAATT CCAAGCTGCA GTTTTTTT
\hfill38
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 91:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 822 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1..822
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 91:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 92:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 273 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 92:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 93:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 35 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 93:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTAAAGTTGAA GTGCCTGCAT TCCCAAGCTGC AGTTT
\hfill35
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 94:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 819 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1..819
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 94:
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 95:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 273 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 95:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 96:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 31 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 96:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCCCCAGATTT TGAAATCTTG CTTAAAACAA C
\hfill31
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 97:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 822 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1..822
\vskip0.500000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 97:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 98:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 273 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA SEQ ID NO: 98:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 99:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 32 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 99:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCAAGTCTGGT TCCAATTTGC TCTTGTTATT AT
\hfill32
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 100:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 822 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1..822
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 100:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:101:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 273 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA SEQ ID NO: 101:
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 102:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 41 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 102:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGTTAAAGTGC TAGTACTGTC ATTCCAAGCT GCAGTTTTTT T
\hfill41
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 103:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA SEQ ID NO: 103:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 822 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1..822
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 103:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 104:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 273 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 104:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 105:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 39 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 105:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTGCAGATGTA ATCCCATCCG CCATTTTTAA AGCGTTTTT
\hfill39
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 106:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1401 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1..1401
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 106:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 107:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 466 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 107:
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 108:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 36 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 108:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGCTGCTAACA TTTTGCTTAG GTTTTTTGG ACTTTC
\hfill36
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 109:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1401 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1..1401
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 109:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 110:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 466 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 110:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 111:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1720 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1..1719
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 111:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 112:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 573 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 112:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 113:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1180 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1..1179
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA SEQ ID NO: 113:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 114:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 393 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 114:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 115:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1363 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1.. 1362
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 115:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 116:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 454 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 116:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 117:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1141 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1..1140
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 117:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 118:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 380 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 118:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 119:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1324 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1..1323
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 119:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 120:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 441 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 120:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 121:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1765 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1..1764
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 121:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 122:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 588 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 122:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 123:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 704 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 123
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 124:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 704 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 124:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 125:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 704 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 125:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 126:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 704 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 126:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 127:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1011 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1..1011
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 127:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 128:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 336 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 128:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 129:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1008 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 129:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 130:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1008 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 130:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 131:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1008 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 131:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 132:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 822 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 132:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 133:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 822 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 133:
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 134:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICA DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 822 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 134:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 135:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 821 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 135:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 136:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 821 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 136:
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 137:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 825 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1..825
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 137:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 138:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 274 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 138:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 139:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 822 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1..822
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA SEQ ID NO: 139:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 140:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 273 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 140:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 141:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 822 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1..822
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 141:
\newpage
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 142:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 273 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 142:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 143:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 822 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1..822
\vskip0.500000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 143:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 144:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 273 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 144:
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (9)
1. Una proteína quimérica, producida de modo
recombinante, que comprende dos polipéptidos derivados de la
proteína de la superficie exterior A o de la proteína de la
superficie exterior B procedente de diferentes cepas de
Borrelia causantes de la enfermedad de Lyme, en donde el
primer polipéptido comprende la proteína de la superficie exterior
A o B desde el extremo N hasta e incluido un triptófano conservado,
y el segundo polipéptido comprende la proteína de la superficie
exterior A o B desde el triptófano conservado hasta el extremo C de
la proteína, en donde dicho primer polipéptido y dicho segundo
polipéptido proceden de diferentes cepas de Borrelia
causantes de la enfermedad de Lyme, y en donde la secuencia de
aminoácidos de dicha proteína quimérica no es la misma que la
secuencia de aminoácidos de la proteína de la superficie exterior A
o B de las que se obtienen dicho primer polipéptido y dicho segundo
polipéptido, y en donde cada polipéptido conserva una antigenicidad
en la proteína quimérica.
2. La proteína quimérica de la reivindicación 1,
en donde:
- a)
- el primer polipéptido comprende la proteína de la superficie exterior A o B desde el extremo N hasta e incluido un triptófano conservado, en donde dicho primer polipéptido incluye regiones hipervariables de la proteína de la superficie exterior A que comprende los residuos 120 a 140, los residuos 150 a 180 y los residuos 200 a 217, y
- b)
- el segundo polipéptido comprende la proteína de la superficie exterior A o la proteína de la superficie exterior B desde el triptófano conservado hasta el extremo C de la proteína;
en donde la cepa de Borrelia
causante de la enfermedad de Lyme se obtiene a partir de al menos
uno del grupo que consiste en: una cualquiera de dichas regiones
hipervariables y dicho segundo polipéptido difiere de la cepa de
Borrelia que causa la enfermedad de Lyme de la que se obtiene
el resto de dicho primer
polipéptido,
en donde la región variable que
comprende los residuos 200 a 217 y dicho segundo polipéptido
proceden de diferentes cepas de Borrelia causantes de la
enfermedad de Lyme, y en donde la secuencia de aminoácidos de dicha
proteína quimérica no es la misma que la secuencia de aminoácidos
de cualquier proteína de la superficie exterior A o B de la que se
obtienen dicho primer polipéptido y dicho segundo polipéptido,
y
en donde la proteína quimérica
conserva antigenicidad representativa de la proteína OspA o B de
las cepas de Borrelia
parentales.
3. La proteína quimérica de la reivindicación 2,
en la que los primero y segundo dominios hipervariables se derivan
de la proteína de la superficie exterior A procedente de diferentes
cepas de Borrelia burgdorferi.
4. La secuencia de ácidos nucleicos que codifica
una proteína quimérica, producida de modo recombinante, que
comprende los polipéptidos derivados de la proteína de la superficie
exterior A o de la proteína de la superficie exterior B procedente
de diferentes cepas de Borrelia causantes de la enfermedad de
Lyme, en donde el primer polipéptido comprende la proteína de la
superficie exterior A o B desde el extremo N hasta e incluido un
triptófano conservado, y el segundo polipéptido comprende la
proteína de la superficie exterior A o B desde el triptófano
conservado hasta el extremo C de la proteína, en donde dicho primer
polipéptido y dicho segundo polipéptido son de diferentes cepas de
Borrelia causantes de la enfermedad de Lyme, y en donde la
secuencia de aminoácidos de dicha proteína quimérica no es la misma
que la secuencia de aminoácidos de la proteína de la superficie
exterior A o B de la que se obtienen dicho primer polipéptido y
dicho segundo polipéptido, y en donde cada polipéptido conserva
antigenicidad en la proteína quimérica.
5. La secuencia de ácidos nucleicos de la
reivindicación 4, en donde:
- a)
- el primer polipéptido comprende la proteína de la superficie exterior A o B desde el extremo N hasta e incluido un triptófano conservado, en donde dicho primer polipéptido incluye regiones hipervariables de la proteína de la superficie exterior A que comprende los residuos 120 a 140, los residuos 150 a 180 y los residuos 200 a 217, y
- b)
- el segundo polipéptido comprende la proteína de la superficie exterior A o la proteína de la superficie exterior B desde el triptófano conservado hasta el extremo C de la proteína;
en donde la cepa de Borrelia
causante de la enfermedad de Lyme se obtiene a partir de al menos
uno del grupo que consiste en: una cualquiera de dichas regiones
hipervariables y dicho segundo polipéptido difiere de la cepa de
Borrelia que causa la enfermedad de Lyme de la que se obtiene
el resto de dicho primer
polipéptido,
y en donde la región hipervariable
que comprende los residuos 200 a 217 y dicho segundo polipéptido
proceden de diferentes cepas de Borrelia causantes de la
enfermedad de Lyme, y en donde la secuencia de aminoácidos de dicha
proteína quimérica no es la misma que la secuencia de aminoácidos de
cualquier proteína de la superficie exterior A o B de la que se
obtienen dicho primer polipéptido y dicho segundo polipéptido y en
donde la proteína quimérica conserva antigenicidad representativa
de la proteína OspA o B de las cepas de Borrelia
parentales.
6. La secuencia de ácidos nucleicos de la
reivindicación 5, en la que los primero y segundo dominios
hipervariables se derivan de la proteína de la superficie exterior
A procedente de diferentes cepas de Borrelia
burgdorferi.
7. Una secuencia de ácidos nucleicos que tiene
una secuencia seleccionada del grupo que consiste: SEQ ID NO. 85,
SEQ ID NO. 88, SEQ ID NO. 91, SEQ ID NO. 94, SEQ ID NO. 97, SEQ ID
NO. 100, SEQ ID NO. 103, SEQ ID NO. 106, SEQ ID NO. 109, SEQ ID NO.
111, SEQ ID NO. 113, SEQ ID NO. 115, SEQ ID NO. 117, SEQ ID NO.
119, SEQ ID NO. 121, SEQ ID NO. 137, SEQ ID NO. 139, SEQ ID NO. 141
y SEQ ID NO. 143, o una proteína que tiene una secuencia de
aminoácidos seleccionada de los grupos que consisten en SEQ ID NO.
86, SEQ ID NO. 89, SEQ ID NO. 92, SEQ ID NO. 95, SEQ ID NO. 98, SEQ
ID NO. 101, SEQ ID NO. 104, SEQ ID NO. 107, SEQ ID NO. 110, SEQ ID
NO. 112, SEQ ID NO. 114, SEQ ID NO. 116, SEQ ID NO. 118, SEQ ID NO.
120, SEQ ID NO. 122, SEQ ID NO. 138, SEQ ID NO. 140, SEQ ID NO. 142
y SEQ ID NO. 144.
8. Una proteína quimérica, producida de modo
recombinante, de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones
1 a 3 y 7, para uso en la terapia o diagnosis, por ejemplo en
calidad de una vacuna contra una infección por Borrelia
burgdorferi, en ensayos inmunodiagnósticos para detectar la
presencia de anticuerpos contra Borrelia burgdorferi o para
medir la reactividad de células T, siendo el ensayo
inmunodiagnóstico, por ejemplo, una mancha por punto, transferencia
Western, ELISA o ensayo de aglutinación.
9. Uso de la proteína quimérica de acuerdo con
una cualquiera de las revindicaciones 1 a 3 y 7 o la secuencia de
ácidos nucleicos de una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 7,
para la preparación de un compuesto para uso en la terapia o
diagnosis, por ejemplo en calidad de una vacuna contra una
infección por Borrelia burgdorferi, en ensayos
inmunodiagnósticos para detectar la presencia de anticuerpos contra
Borrelia burgdorferi o para medir la reactividad de células
T, siendo el ensayo inmunodiagnóstico, por ejemplo, un borrón por
puntos, transferencia Western, ELISA o ensayo de aglutinación.
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