DE60030859T2

DE60030859T2 - Gruppen von borrelia burgdorferi, die lyme krankheit verursachen

Info

Publication number: DE60030859T2
Application number: DE60030859T
Authority: DE
Inventors: J. Raymond Setauket DATTWYLER; Gerald Graz SEINOST; Daniel St. James DYKHUIZEN; J. Benjamin Setauket LUFT; Maria New York GOMES-SOLECKI
Original assignee: Brook Biotechnologies Inc; Research Foundation of the State University of New York
Current assignee: Brook Biotechnologies Inc; Research Foundation of the State University of New York
Priority date: 1999-06-18
Filing date: 2000-06-19
Publication date: 2007-06-14
Anticipated expiration: 2020-06-20
Also published as: WO2000078966A1; DK1194559T3; EP1194559B1; US20060182756A1; EP1683867B1; US7582304B2; EP1194559A1; US20090060932A2; PT1194559E; ATE340262T1; ES2272296T3; AU5751000A; DE60030859D1; US7060281B1; EP1683867A1

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Die Lyme-Krankheit nimmt ihren Anfang an der Stelle eines Zeckenbisses, der eine Primärinfektion hervorruft, die sich früh im Verlauf der Infektion im Organismus zu sekundären Stellen ausbreitet. Die Lyme-Krankheit ist eine progressive, mehrere Organsysteme betreffende Erkrankung und ist sowohl in Nordamerika als auch in Europa die am weitesten verbreitete durch einen Vektor übertragene Krankheit. Diese Erkrankung wurde zuerst als Krankheitsherd bei Patienten mit pädiatrischer Arthritis in Old Lyme, CT beschrieben (Steere. A. C., et al., Arth. Rheum. 20: 17 (1977)). Der Zusammenhang dieses Syndroms mit dem Biss der Hirschzecke Ixodes scapularis führte zur Identifizierung des Spirochäten Borrelia burgdorferi als Verursacher (Burgdorfer, W., et al., Science, 216: 1317–1319 (1982). Als die Isolierung von Kulturen des Bakteriums aus klinischen Proben und Feldproben effizienter wurden, beschrieben Baranton und Mitarbeiter drei pathogene Genospezies, B. burgdorferi sensu stricto (B. burgdorferi oder B.b.s.s), B. afzelii und B. garinii (Baraton, G., et al., Int. J. Syst. Bacteriol. 43: 378–383 (1992)). Diese sind Vertreter eines Genospezies-Komplexes, B. burgdorferi sensu lato, der sich aus mindestens 10 unterschiedlichen Genospezies zusammensetzt (Piken, R. N., et al., J. Invest. Dermatol., 110: 211–214 (1998)); Postic, D., et al., Int. J. Syst. Bacteriol. 44: 743–752 (1994); Valsangiacomo, C. T., et al., Int. J. Syst. Bacteriol. 47: 1–10 (1997)). Man geht davon aus, dass B. burgdorferi, B. afzelii and B. garinii pathogen sind und alle wurden auch in Europa gefunden, aber in Nordamerika ist B. burgdorferi die einzige gefunde pathogene Genospezies. Jede dieser drei Genospezies geht mit bestimmten klinischen Erscheinungen einher (Van Dam, A. P., et al., Clin. Infect. Dis. 17: 708–717 (1993)). Dies besagt, dass Unterschiede in den Genospezies eine bedeutende Rolle in dem weiten Feld von klinischen Erscheinungen spielt, die bei der Lyme-Krankheft beobachtet wurden.
Wenn eine infizierte Zecke beginnt, sich auf einem Tier zu ernähren, wird die Synthese des Oberflächenproteins C (OspC) induziert (Schwan, T. G., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 2: 2909–2913 (1995)). Somit stellt im frühen Infektionsstadium OspC das hauptsächliche von der Spirochäte exprimierte Oberflächenprotein dar (Fung, B. P., et al., Infect. Immun. 62: 3213–3221 (1994); Padula, S. J., et al., Clin. Microbiol, 32: 1733–1738 (1994)). Wenn auch gezeigt worden ist, dass OspC sich auf der Oberfläche nur in beschränktem Umfang befindet (Cox, D. L., et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 93: 7973–7978 (1996); Mathiesen, M. M., et al., Infect. Immun. 66: 4073–4079 (1998)), ist OspC ein starkes Immunogen. Eine Immunisierung mit OspC schützt gegen eine von Zecken übertragene Borrelia-Infektion (Gilmore Jr., R. D., Infect. Immun. 64: 2234–2239 (1999)). Da jedoch OspC in seiner Sequenz höchst variabel ist, ist der Schutz auf den Borrelia burgdorferi-Stamm beschränkt, der das gleiche immunisierende OspC exprimiert, das von einem spezifischen Allel codiert wird. Ein Angriff mit heterologen Isolaten, die andere OspC-Allele exprimieren, führt zu einer Infektion (Probert, W. S., et al., J. Infect. D., 175: 400–405 (1997)). OspC ist sehr mannigfaltig (Jauris-Heipke, S., et al., Med. Microbiol. Immunol. 752: 37–50 (1993)). Livey et al. fanden vierunddreißig Allele in sechsundsiebzig Isolaten von B. burgdorferi sensu lato (Livey, I., et al., Mol. Microbiol. 18: 257–269 (1995)).
Derzeit wird die Lyme-Krankheit mit Antibiotika behandelt. Eine derartige Behandlung ist bei der Beseitigung der Infektion jedoch nicht immer erfolgreich. Die Behandlung wird wegen einer unsachgemäßen Diagnose oft verschleppt, was die schädliche Auswirkung hat, dass die Infektion bis zu einem chronischen Stadium fortschreitet, wo eine Behandlung mit Antibiotika oft nicht von Nutzen ist. Einer der Faktoren, die zu einer verschleppten Behandlung beitragen, ist das Fehlen von wirksamen diagnostischen Werkzeugen.
Während bekannt ist, dass Antigene wie OspC Schutz gewähren, wird in einigen Fällen durch das Vorkommen von multiplen Allelen dieser Antigene die Entwicklung von auf solchen Antigenen basierenden Impfstoffen verhindert, welche gegen mehr als einen Stamm von Borrelia Schutz gewähren würden. In zwei unabhängigen Tests von Impfstoffen der ersten Generation zur Verhinderung der Lyme-Krankheit wurde vor kurzem die Wirksamkeit und Sicherheit eines Impfstoffs untersucht, der auf dem rekombinanten Oberflächenprotein A (OspA) basiert (Sigal, L. H. et al., N. Engl. J. Med. 339: 216–222, 1998; Steere, A. C. et al., N. Engl. J. Med. 339: 209–215, (1998)). Ein Impfstoff, der aus rekombinantem OspA besteht, kann jedoch häufige Boosterimmunisierungen erfordern. Eine natürliche Infektion mit B. burgdorferi löst keine Antikörper-Antwort gegen OspA aus, wie sie dies gegen OspC tut. Es besteht ein Bedarf nach einer Auswahl von Borrelia-Antigenen, welche zur Diagnose oder als Impfstoff eingesetzt werden können, um gegen alle oder die meisten Formen von Borrelia, welche die Ursache für die systemische Krankheit sind, anzugehen.
Unterschiede in der Häufigkeit von B. burgdorferi, B. garinii und B. afzelii in Zecken und bei Infektionen des Menschen führten zu der Hypothese, dass die unterschiedlichen Genospezies auch unterschiedlich pathogen sind (Picken, R. N. et al., J. Invest. Dermatol. 110: 211–214, 1998; Van Dam, A. P. et al., Clin. Infect. Dis. 17: 708–717, 1993). Nichtsdestoweniger bilden die Anzahl der unterschiedlichen Stämme innerhalb einer gegebenen Genospezies und die Unterschiede zwischen den Stämmen einer gegebenen Genospezies sowie zwischen den Genospezies Hindernisse bei der Entwicklung von immunogenen Proteinverbindungen zur Verwendung als Diagnostika und als Impfstoffe beim Nachweis, der Verhinderung und Behandlung der Lyme-Krankheit. Eine Anzahl von Forschern verwendete OspC als serodiagnostisches Antigen für das Frühstadium der Lyme-Krankheit (Fung, B. P. et al., Infect. Immun. 52: 3213–3221, 1994; Gerber, M. A. et al., J. Infect. Dis. 171: 724–727, 1995; Padula, S. J. et al., J. Clin. Microbiol. 32: 1733–1738, (1994)). In diesen Tests führte die Verwendung von OspC als diagnostisches Antigen zu hochspezifischen aber unempfindlichen Ergebnissen. In diesen Untersuchungen wurde jedoch nur ein Stamm von B. burgdorferi verwendet und daher nur ein Typ des OspC. In Routinetests zur Diagnose der Lyme-Krankheft wird auch nur eine Vorschrift mit einem einzigen Stamm und daher mit einem einzigen OspC-Allel zum Nachweis von Antikörpern gegen Spirochäten verwendet. Es ist nicht klar, welche Mischung von OspC-Proteinen zur Herstellung nützlicher Diagnostika und Impfstoffe verwendet werden muss, die gegen mehr als einen die Lyme-Krankheit verursachenden Stamm von Borrelia oder gar gegen die meisten wenn nicht alle der invasiven Stämme innerhalb einer Genospezies wirksam sind. Eine solche Mischung würde vorzugsweise gegen alle invasiven Stämme von Lyme-Krankheit verursachender Borrelia sein.
In der WO 94/25596 wird ein Lösungsansatz für die Formulierung eines Borrelia-Impfstoffs beschrieben, in welchem die serologische, genotypische und epidemiologische Information berücksichtigt wird, durch welche sich OspC-Proteine aus verschiedenen Stämmen von B. burgdorferi zusammenfassen lassen. Es werden OspC-Antigene ausgewählt, um für die Zusammenfassung in Gruppen eine repräsentative Probe abzugeben, so dass der erhaltene Impfstoff für den größten Kreuzschutz mit der geringsten Anzahl von Antigenen sorgt.
Die vorliegende Erfindung ist, wie in Anspruch 1 beansprucht, auf eine Impfstoffzusammensetzung mit OspC-Polypeptiden aus Lyme-Krankheit verursachender Borrelia gerichtet. Bevorzugte Merkmale des Impfstoffs sind in den Ansprüchen 2–3 angegeben. In einem anderen Aspekt betrifft die Erfindung die Verwendung einer Zusammensetzung für die Herstellung eines Medikaments für die Immunisierung eines Tieres gegen die disseminierte Lyme-Krankheit. Bevorzugte Merkmale dieser Verwendung sind in den Ansprüchen 5–6 angegeben. In einem anderen Aspekt betrifft die Erfindung, wie in Anspruch 7 beansprucht, ein Verfahren zum Nachweis einer Immunantwort gegen mit disseminierter Lyme-Krankheit in Zusammenhang stehender Borrelia in einer Wirtsprobe. Bevorzugte Merkmale dieses Verfahrens sind in den Ansprüchen 8–9 angegeben. In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung ein wie in Anspruch 10 beanspruchtes chimäres Protein. Bevorzugte Merkmale dieses Proteins sind in den Ansprüchen 11–13 angegeben. In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung eine wie in Anspruch 14 beanspruchte isolierte Nucleinsäure. Bevorzugte Merkmale dieser Nucleinsäure sind in den Ansprüchen 15–16 angegeben. In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung die in Anspruch 17 beanspruchte Zusammensetzung.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die hier beschriebene Zusammensetzung umfasst ein OspC-Polypeptid oder ein Fragment desselben aus mindestens zwei OspC-Familien von Borrelia burgorferi, die ausgewählt sind aus der Gruppe A, B, I und K. Die hier beschriebene Zusammensetzung umfasst mindestens ein OspC-Polypeptid oder ein Fragment desselben aus jeder der OspC-Familien A und B von Borrelia afzelii.
Ein Verfahren zur Immunisierung eines Tieres gegen die Lyme-Krankheit, welches die Verabreichung einer Zusammensetzung mit OspC-Polypeptiden von Lyme-Krankheit verursachender Borrelia umfasst wird ebenfalls beschrieben Ebenfalls beschrieben wird eine Zusammensetzung, die ein OspC-Polypeptid oder Fragment desselben aus mindestens zwei OspC-Familien von Borrelia burgdorferi umfasst, welche ausgewählt sind aus der Gruppe A, B, I und K, mit Ausnahme der Kombination aus zwei OspC-Proteinen, in welcher ein OspC-Protein aus der OspC-Familie A und das zweite OspC-Protein aus der OspC-Familie I stammt. Eine Zusammensetzung, welche mindestens ein OspC-Polypeptid oder Fragment desselben aus jeder der OspC-Familien A und B von Borrelia afzelii umfasst, wird ebenfalls beschrieben. Die hier beschriebenen Zusammensetzungen zusammen mit geeigneten Vehikeln und/oder Adjuvantien werden an ein Tier so verabreicht, dass das Tier eine Immunantwort gegen mindestens ein OspC-Polypeptid der Zusammensetzung aufbaut.
Ein Verfahren zum Nachweis einer Immunantwort gegen die Lyme-Krankheit verursachende Borrelia in einer Wirtsprobe wird ebenfalls beschrieben. Das Verfahren umfasst, dass man eine Wirtsprobe mit einer Zusammensetzung, die OspC-Polypeptide von mit disseminierter Lyme-Krankheit assoziierten Stammen von Borrelia umfasst, in Kontakt bringt, so dass anti-OspC-Antikörper, falls in dieser Probe vorhanden, an diese OspC-Polypeptide binden. Die Zusammensetzung umfasst mindestens ein OspC-Polypeptid oder ein Fragment desselben aus jeder der Borrelia burgdorferi OspC-Familien A, B, I und K. Die Menge der Antikörper, die diese OspC-Peptide oder Fragmente derselben gebunden haben, wird gemessen; dadurch wird eine Immunantwort gegen die Lyme-Krankheit verursachende Borrelia nachgewiesen.
Ein Diagnose-Kit mit Polypeptiden aus die Lyme-Krankheit verursachenden Borrelia wird ebenfalls beschrieben. Der Diagnose-Kit umfasst mindestens ein OspC-Polypeptid oder ein diagnostisches Fragment desselben auf jeder der Borrelia burgdorferi OspC-Familien A, B, I und K. Alternativ umfasst die diagnostische Zusammensetzung mindestens ein OspC-Polypeptid oder ein diagnostisches Fragment desselben aus jeder der Borrelia afzelii OspC-Familien A und B.
Eine Zusammensetzung, die mindestens ein OspC-Polypeptid oder ein Fragment desselben aus jeder der Borrelia afzelii OspC-Familien A und B umfasst, wird ebenfalls beschrieben Zusammensetzungen, welche OspC-Polypeptide oder Fragmente desselben aus Borrelia burgdorferi, Borrelia afzelii, Borrelia garinii und Kombinationen derselben umfassen, werden ebenfalls beschrieben.
Ebenfalls offenbart werden chimäre Proteine mit zwei oder mehr OspC-Familien von die Lyme-Krankheit verursachendem Borrelia. Die Familien können die Borrelia burgdorferi OspC-Familien A, B, I und K umfassen. Alternativ können die Familien die Borrelia afzelii OspC-Familien A und B umfassen. Alternativ umfasst die Zusammensetzung chimäre OspC-Polypeptide oder Fragmente derselben von Borrelia burgdorferi, Borrelia afzelii, Borrelia garinii und Kombinationen derselben.
Die hier beschriebenen chimären Proteine umfassen mindestens ein erstes und ein zweites Polypeptid von OspC, so dass das erste Polypeptid das OspC von etwa der Base 26 bis etwa zur Base 630 eines ersten OspC-Gens und das zweite Polypeptid das OspC von etwa der Base 28 bis etwa zur Base 570 eines zweiten OspC-Gens umfasst. Die hier beschriebenen chimären Proteine können in den hier beschriebenen Immunisierungs- und Nachweisverfahren eingesetzt werden.
Die minimale Anzahl der Borrelia burgdorferi- und Borrelia afzelii-Familien, die für systemische Krankheiten des Menschen verantwortlich und nützlich für Impfstoffe und diagnostische Kits sind, wird hier beschrieben. Eine Kombination von Proteinen, die bei einem Einsatz als Impfstoff die Lyme-Krankheit daran hindert, systemisch zu werden, wird hier offenbart. Die hier beschriebenen Proteine und chimären Proteine können sowohl bei der Verhinderung des Lyme-Krankheit wirksam sein als auch ein therapeutische Wirkung auf eine bestehende Infektion ausüben, z.B. nachdem der Zeckenbiss vom Patienten bemerkt wurde. Es wird davon ausgegangen, dass die hier beschriebenen Proteine und chimären Proteine bei der Verhinderung von sowohl einer Infektion als auch einer Krankheit, die auf Borrelia burgdorferi, Borrelia afzelii oder Borrelia garinii zurückzuführen sind, sowohl auf der Ebene der Zecke als auch auf der Ebene des Wirts wirken.
Mit der hier gemachten Offenbarung lässt sich ein weltweiter Impfstoff entwickeln, der nur 6 Proteine umfasst, um gegen alle pathogenen Stämme von Borrelia burgdorferi und Borrelia afzelii eine schützende Immunantwort zu erzeugen.
Es werden auch verbesserte diagnostische Werkzeuge beschrieben. Es ist nun möglich, diagnostische Werkzeuge herzustellen, die OspC-Antigene umfassen, welche die vier pathogenen Familien von Borrelia burgdorferi und/oder die zwei pathogenen Familien von Borrelia afzelii repräsentieren, wobei sie eine klinisch bedeutsame Gefahr durch pathogene Bakterien anzeigen, während sie die restlichen Familien, die keine pathogene Krankheit hervorrufen, unbeachtet lassen.
Wie hier gezeigt, ist ein beträchtlicher Anteil, wenn nicht gar alle systemischen Infektionen durch B. burgdorferi sensu stricto bei Menschen mit vier OspC-Gruppen und ein beträchtlicher Anteil, wenn nicht gar alle systemischen Infektionen durch B. afzelii bei Menschen mit zwei OspC-Gruppen assoziiert. Es ist bekannt, dass Impfstoffe gegen OspC Schutz gewähren, sie sind jedoch durch die Mannigfaltigkeit des OspC eingeschränkt. (Probert, W. S. et al., J. Infect. D. 175: 400–405, (1997)). Die hier beschriebenen Polypeptide Stellen immunogene Proteine, Fragmente und chimäre Proteine derselben für äußersten Schutz gewährende Impfstoffe und Diagnostika zur Verfügung. Es wird ein Impfstoff beschrieben, der eine oder mehrere dieser vier Formen von OspC enthält. Die Impfstoffe sollten eine wichtige zweite Schutzstufe gegen eine disseminierte Infektion der B. burgdorferi-Spirochäte darstellen. Ferner kann die hier beschriebene single-strand conformation polymorphism-Analyse (SSCP) für ein schnelles und mächtiges Werkzeug zur Überwachung der Wirksamkeit eines Impfstoffs sorgen, indem es seltene oder neue invasive OspC-Gruppen nachweist.
Auf den OspC-Hauptgruppen A, B, I und K basierende neue diagnostische Assays sind von Nutzen, um solche zu identifizieren, bei denen die Gefahr besteht, dass sie eine progressive Krankheit verursachen. Bei der Annahme, dass OspC-Proteine antigenetisch variabel sind, können Individuen, die mit einem Stamm infiziert wurden, eine Antikörperantwort produzieren, die mit einem OspC-Protein aus einer anderen Hauptgruppe nicht reagiert. Ein Nachweis von Antikörpern unter Einsatz von Antigenpräparaten und die Inkorporierung einer richtigen Mischung invasiver Klone von B. burgdorferi wird weitaus mehr empfindlich sein als die derzeitigen Vorschriften mit einem einzigen Stamm. Die hier beschriebenen Zusammensetzungen lösen nicht nur humorale und Zellvermittelte Immunantworten aus, die Zusammensetzungen sind auch in der Lage, eine sowohl humorale als auch Zellvermittelte Immunantwort nachzuweisen, wenn sie zum Testen einer Wirtsprobe eingesetzt werden.
Es werden sowohl lipidierte OspC-Polypeptide und Fragmente derselben als auch chimäre Proteine mit zwei oder mehr OspC-Polypeptiden beschrieben, wobei das chimäre Protein ein Lipidierungssignal aufweist, wie z.B. das Lipidierungssignal vom äußeren Oberflächenprotein B am 5'-Ende des die Chimäre kodierenden Gens. Ferner werden nicht lipidierte OspC-Polypeptide, Fragmente derselben und chimäre Proteine mit zwei oder mehr OspC-Polypeptiden beschrieben, wobei das die Chimäre kodierende Gen über kein Lipidierungssignal verfügt und das chimäre Protein nicht lipidiert ist. Wegen der einfacheren Herstellungsverfahren, der verbesserten Ausbeuten an Protein und der einfacheren Reinigung sind nicht lipidierte OspC-Polypeptide, Fragmente derselben und chimäre Proteine derselben vorteilhaft. Die hier beschriebenen nicht lipidierten chimären Proteine lösten unerwartet eine Immunantwort gegen die Lyme-Krankheit verursachende Stämme von Borrelia aus, die zumindest in dem breiten Umfang wie lipidierte OspC-Proteine reagierte, welche als positive Kontrolle eingesetzt wurden. Ferner lösten die nicht lipidierten chimären OspC-Proteine eine Immunantwort gegen mehr als eine Genospezies der die Lyme-Krankheit verursachenden Stämme von Borrelia aus, einschließlich der Genospezies und Stämme, die nicht zur Erzeugung des chimären OspC-Immunogens eingesetzt werden.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 ist ein schematisches Diagramm der Häufigkeitsverteilung der OspC-Hauptgruppen unter den B. bergdorfii-Isolaten aus Eastern Long Island-Ixodes scapularis-Zecken.
2 ist ein Balkendiagramm und zeigt die Serumaktivität von Mäusen, die mit dem angegebenen Borrelia-Protein oder rekombinantem chimärem Borrelia-Protein (X-Achse) gegen die angegebenen OspC-Antigene (Legende) immunisiert wurden, wobei das Serum aus der ersten Blutentnahme stammt.
3 ist ein Balkendiagramm und zeigt die Serumaktivität von Mäusen, die mit dem angegebenen Borrelia-Protein oder rekombinantem chimärem Borrelia-Protein (X-Achse) gegen die angegebenen OspC-Antigene (Legende) immunisiert wurden, wobei das Serum aus der zweiten Blutentnahme stammt.
4 ist ein Balkendiagramm und zeigt die Serumaktivität von Mäusen, die mit dem angegebenen Borrelia-Protein oder rekombinantem chimärem Borrelia-Protein (X-Achse) gegen die angegebenen Stämme von Borrelia burgdorferi sensu stricto (Legende) immunisiert wurden.
5 ist ein Balkendiagramm und zeigt die Serumaktivität von Mäusen, die mit dem angegebenen Borrelia-Protein oder rekombinantem chimärem Borrelia-Protein (X-Achse) gegen die angegebenen Stämme von Borrelia burgdorferi sensu lato (Legende) immunisiert wurden.
6 ist ein Balkendiagramm und zeigt die Serumaktivität von Mäusen, die mit dem angegebenen Borrelia-Protein oder rekombinantem chimärem Borrelia-Protein (X-Achse) gegen die angegebenen Stämme von Borrelia afzelii (Legende) immunisiert wurden.
7 ist ein Balkendiagramm und zeigt die Serumaktivität von Mäusen, die mit dem angegebenen Borrelia-Protein oder rekombinantem chimärem Borrelia-Protein (X-Achse) gegen die angegebenen Stämme von Borrelia garinii (Legende) immunisiert wurden.
8 ist eine Tabelle, in welcher die Reaktivität der lipidierten OspC-Proteine C1 und C2 gegen Seren von Patienten mit dem angegebenen Befinden mit der Reaktivität der erfindungsgemäßen nicht lipidierten chimären Proteine verglichen wird, wobei die in Klammern angegebene Zahl die Gesamtzahl der in dieser Kategorie getesteten Seren ist.
GENAUE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Wie hier beschrieben wurden in einer kleinen Population von Zecken anfangs 19 OspC-Gruppen von B. burgdorferi sensu stricto gefunden (Wang, I-N., et al., Genetics, 151: 15–30 (1999)). Die OspC-Hauptgruppen wurden definiert, indem man sich die Beobachtung zunutze machte, dass OspC-Allele entweder sehr ähnlich mit weniger als 2% Sequenzabweichung oder sehr verschieden mit mehr als 8% Sequenzabweichung sind, wobei die meisten eine Ober 14% liegende Sequenzabweichung aufweisen.
Auf der Basis dieser Sequenzabweichungen lassen sich die OspC-Allele in einundzwanzig Hauptgruppen einteilen (Tabelle II). Um zu ermitteln, ob die durch eine gegebene OspC-Gruppe definierten Stammesunterschiede mit einer Invasivität und Pathogenizität in Zusammenhang stehen, wurden die Häufigkeitsverteilungen der OspC-Hauptgruppen aus Zecken, aus der primären Hautverletzung bei Erythema migrans (EM) sowie aus sekundären Stellen, im Prinzip aus dem Blut oder der Gehirn und Rückenmarksflüssigkeit miteinander verglichen. Wie hier beschrieben, unterscheidet sich die Häufigkeitsverteilung der OspC-Gruppen aus Zecken signifikant von der einer primären Infektionsstelle, die sich ihrerseits wieder signifikant von den sekundären unterscheidet. Die OspC-Hauptgruppen A, B, I und K nahmen von den Zecken zu den primären Stellen in der Häufigkeit zu und waren die einzigen Gruppen, die auch an sekundären Stellen der Infektion gefunden wurden. Daher werden hier drei Kategorien von OspC-Hauptgruppen definiert. Eine Kategorie ist den Zecken gemeinsam, verursacht aber sehr sehen, wenn überhaupt, eine Erkrankung beim Menschen, eine zweite Kategorie verursacht am Ort des Zeckenbisses nur eine lokale Infektion und eine dritte Kategorie verursacht eine systemische oder disseminierte Krankheit. Während viele in Zecken gefundene OspC-Gruppen auch in primären Hautverletzungen gefunden wurden, unterscheiden sich die Häufigkeitsverteilungen bei Zecken und primären Hautverletzungen signifikant voneinander (Tabelle III). In Zecken wurden alle OspC-Gruppen mehr oder weniger gemeinsam gefunden. In Hautverletzungen oder sekundären Infektionen wurden gemeinsam jedoch nur vier Gruppen gefunden Tabellen III und IV). Wie hier beschrieben fanden sich in Hautverletzungen Borrelia mit anderen OspC-Gruppen als A, B, I und K selten oder überhaupt nicht. Noch wichtiger ist, dass diese vier OspC-Gruppen in sekundären Stellen gefunden wurden. Der Befund, dass alle systemischen Infektionen durch B. burgdorferi sensu stricto mit vier OspC-Gruppen in Zusammengang stehen, ist bedeutsam für die Diagnose, Behandlung und Verhinderung der Lyme-Krankheit.
Es gibt Hinweise, dass OspC zwischen Stämmen und selbst zwischen Genospezies übertragen worden ist (Wang T-N.; et al., Genetics, 151: 15–30 (1998)). Dies trifft nicht auf die chromosomalen Gene von Borrelia zu (Dykhuizen, D. E., et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 30: 10163–10167 (1999); Maynard Smith, J. and Smith, N. H., Mol. Biol. Evol., 15: 590–599 (1998)). OspA- und OspC-Allele in B. burgdorferi sensu stricto sind jedoch fast vollständig miteinander verbunden (Wang, I-N., et al., Genetics, 151: 15–30 (1999)). Dies legt die Vermutung nahe, dass dann, wenn ein OspC-Allel erst einmal in einen besonderen Hintergrund transferiert worden ist, es eine geringe oder gar keine Auswahl für ein anderes ähnliches Rekombinationsereignis gibt. Somit repräsentiert jede OspC-Hauptgruppe eine von einer einzigen Rekombination herrührende Klon-Population.
20% von nicht behandelter Erythrema migrans heilen spontan, ohne irgendwelche systemischen Komplikationen zu verursachen (Steere, A. C. et al., Arth. Rheum. 20: 7–17, (1977)). Wie hier gezeigt wird, unterscheidet sich dies nicht signifikant (p = 0,25 für eine 2 × 2 Kontingenztafelanalyse mit doppelter Dichotomie) von dem Prozentsatz der in der Haut gefundenen nicht invasiven Stämme, was nahe legt, dass Erythema migrans, die spontan heilen, durch nicht invasive Klone verursacht wird.
In allen drei pathogenen Genospezies von B. burgdorferi sensu lato gibt es eine extensive genetische und antigene Mannigfaltigkeit (Livey, I. et al., Mol. Microbiol. 18: 257–269, 1995; Masuzawa, T. et al., Clin. Diagn. Lab. Immunol. 4: 60–63, 1997; Picken, R. N. et al., J. Invest. Dermatol. 110: 211–214, 1998; Theisen, M. et al., J. Clin. Microbiol. 31: 2570–2576, 1993; Wang, I-N. et al., Genetics 151: 15–30 (1999). Wie hier gezeigt wird, stehen nur vier Gruppen von OspC-Allelen sowohl mit einer Ansteckungsfähigkeit als auch einer Fähigkeit zur Invasion in Verbindung und dass die Fähigkeit zu einer Invasion auf eine kleine Anzahl von OspC-Klons beschränkt ist. Es ist klar, dass die OspA- und OspC-Allele eng miteinander verbunden sind, obwohl sie auf verschiedenen Plasmiden sitzen (Wang, I-N. et al., Genetics 151: 15–30 (1999)). Falls die Fähigkeit zu einer Invasion durch eine Allelvariation an einem anderen Lokus hervorgerufen wird, ist diese Variation wahrscheinlich eng mit der OspC-Variation verbunden. Somit stellt OspC einen guten Marker für eine Pathogenizität beim Menschen dar und ist vielleicht deren Charakteristikum. Diese Befunde haben bedeutende Auswirkungen, nicht nur auf unser Verständnis der Pathogenese dieser Krankheit sondern auch für deren Diagnose und Prävention.
Die Spirochätensepsis ist eine vorübergehende Erscheinung, ist aber vermutlich der Schlüssel bei der Verbreitung zu sekundären Hautstellen, zum Herzen, den Gelenken und dem Nervensystem, wo diese Borrelia die sekundären und tertiären klinischen Symptome hervorruft. Alle vier invasiven Gruppen von Borrelia burgdorferi wurden in Isolaten aus dem Blut und aus der Gehirn- und Rückenmarksflüssigkeit gefunden. Das eine Isolat aus den Gelenken gehörte zur Gruppe A. Es kann jedoch geschlossen werden, dass Gruppen, die im Blut nicht gefunden wurden auch nicht in den Gelenken gefunden werden, da die meiste, wenn nicht gar die ganze Dissemination von Borrelia zu sekundären Orten über das Blut erfolgt.
Für Experimente am Menschen werden normalerweise Modellorganismen als Ersatz eingesetzt. Dieser Ersatz funktioniert aber nur so lange, wie die untersuchten Phänomene von Modellorganismus und Mensch die gleichen sind. Das menschliche Immunsystem spielt eine kritische Rolle, da zu erwarten ist, dass es sich von der Immunantwort in Modellorganismen, insbesondere der Maus, unterscheidet. Menschen sind zufällige und gewöhnlich ein Fehlendwirt, während Mäuse ein kritisches Parasitenreservoir darstellen. Auf dem Gebiet der Populationsgenetik wurden brauchbare Verfahren entwickelt, um aus Überlebensdaten zu Schlussfolgerungen zu gelangen.
Die hier beschriebenen chimären Polypeptide lösen spezifische Immunantworten gegen OspC aus. Die chimären Polypeptide lösen auch eine Immunantwort gegen Stämme von die Lyme-Krankheit auslösenden Borrelia von derselben Genospecies aus, wie die vom chimären OspC repräsentierten, sowie gegen die Lyme-Krankheft auslösenden Borrelia von unterschiedlichen Genospecies aus, wie die vom chimären OspC repräsentierten. Die Immunantwort umfasst humorale Antworten, sekretorische Antworten, Zellvermittelte Antworten sowie Kombinationen derselben in einem Tier, das mit den hier beschriebenen Zusammensetzungen behandelt wurde. Die Zusammensetzungen können zusätzliche Komponenten enthalten, die für eine Verwendung in vitro und in vivo geeignet sind. Diese zusätzlichen Komponenten umfassen Puffer, Trägerproteine, Adjuvantien, Konservierungsmittel und Kombinationen derselben.
Die hier beschriebenen immunogenen Zusammensetzungen können verwendet werden, um Tiere einschließlich Menschen zu immunisieren. Eine Immunisierung ist so zu verstehen, dass sie, wie oben beschrieben, spezifische immunogene Antworten auslöst. Eine hier beschriebene Immunantwort umfasst Antworten, die in den behandelten Tieren zumindest zu einem gewissen Grad von Immunität führt, wobei das Tier mit einer Zusammensetzung behandelt wurde, welche mindestens ein Protein oder chimäres Protein umfasst. Das behandelte Tier entwickelt eine Immunität gegen eine Infektion durch die Lyme-Krankheit auslösende Borrelia, wobei die hier beschriebenen chimären Proteine Antworten gegen Borrelia burgdorferi, Borrelia afzelii und Borrelia garinii auslösen.
Unter der hier beschriebenen Immunität ist die Fähigkeit des behandelten Tieres zu verstehen, einer Infektion und einer systemischen Infektion zu widerstehen, um im Vergleich mit nicht immunisierten oder nicht behandelten Indivisuen eine Infektion, wie z.B. eine systemische Infektion, leichter und schneller zu besiegen. Eine Immunität kann auch die verbesserte Fähigkeit des behandelten Individuums umfassen, eine Infektion mit verminderten oder keinen Symptomen einer systemischen Infektion zu ertragen. Das Individuum kann mit den hier beschriebenen chimären Proteinen entweder proaktiv, d.h. einmal pro Jahr, behandelt werden oder nachdem es sich einen Zeckenbiss zugezogen hat.
Für die Verwendung als Impfstoff kann die hier beschriebene Zusammensetzung geeignete im Stand der Technik bekannte Adjuvantien umfassen, um in dem behandelten Tier die Immunogenität, die Wirksamkeit oder die Habwertszeit der chimären Proteine zu steigern. Adjuvantien und deren Verwendung sind im Stand der Technik gut bekannt (siehe z.B. die PCT-Publikation WO 96/40290). Die Zusammensetzung lässt sich nach bekannten Verfahren zur Herstellung von Impfstoffen herstellen. Beispielsweise können die OspC-Proteine oder chimären Proteine, die in den Zusammensetzungen eingesetzt werden sollen, nach bekannten Techniken wie z.B. der Gelfiltrations-Chromatographie, der Affinitätschromatographie, der präparativen Elektrophorese, der selektiven Fällung oder Kombinationen derselben isoliert und/oder gereinigt werden. Die gewonnene Proteine oder chimären Proteine können, wie oben beschrieben, mit geeigneten anderen Reagenzien gemischt werden, wobei das chimäre Protein in einer geeigneten Konzentration vorliegt. Die Dosierung eines Proteins oder chimären Proteins variiert von 1 μg bis zu 500 μg und hängt vom Alter, Gewicht und physischen Zustand des zu behandelnden Tieres ab. Die optimale Dosierung kann mit bewährten Optimierungstechniken unter Einsatz geeigneter Tiermodelle ermittelt werden.
Die als Impfstoff zu verwendende Zusammensetzung kann mittels jeder geeigneten Technik verabreicht werden. Eine Verabreichung mittels Injektion erfolgt z.B. subkutan, intramuskulär, intravenös oder intraperitoneal. Alternativ lässt sich die Zusammensetzung an die Mucosa verabreichen, indem z.B. die Nasenschleimhaut Nasentropfen ausgesetzt wird, welche die Proteine oder chimären Proteine der vorliegenden Erfindung enthalten. Alternativ kann die immunogene Zusammensetzung oral verabreicht werden. Alternativ können die chimären Proteine durch DNA-Immunisierung verabreicht werden.
Wie viele andere Oberflächenproteine von Borrelia wird OspC in der Borrelia-Spirochäte mittels 5'-Lipidierung produziert. Die hier beschriebenen chimären Polypeptide können sowohl in lipidierter als auch nicht lipidierter Form hergestellt werden. Das vom Wildtyp-OspC codierte Lipidierungssignal wird aus der codierenden Sequenz entfernt, so dass das Gen oder chimäre Gen ein nicht lipidiertes OspC- oder chimäres OspC-Polypeptid codiert. Alternativ wird das Lipidierungssignal des Wildtyp-OspC-Gens durch das Lipidierungssignal des OspB-Gens ersetzt. Somit wird ein lipidiertes OspC- oder chimäres OspC-Protein hergestellt.
Die hier beschriebenen Polypeptide lassen sich in geeigneten mikrobiellen Wirten rekombinant exprimieren, wobei diese Wirte, jedoch nicht ausschließlich, bakterielle Wirte, wie z.B. E. coli, Pilz-Wirte, wie z.B. S. cerevisiae, oder Zellkultur-Wirte, wie z.B. eine Kultur aus Säugerzellen oder eine Kultur aus Insektenzellen, umfassen.
Während das Fehlen des Lipidierungssignals die Produktion großer Mengen von OspC-Proteinen und chimären OspC-Proteinen ermöglicht, wurde früher angenommen, dass das Fehlen des Lipidierungssignals die äußeren Oberflächenproteine von Borrelia wenig oder überhaupt nicht immunogen macht. Die nicht lipidierten chimären Polypeptide zeigten jedoch, wie hier beschrieben, unerwarteterweise eine so ausgedehnte Immunogenität wie lipidierte OspC-Proteine (2 und 3) und eine größere Immunogenität gegen Stämme von anderen Immunospezies (5–7) im Vergleich mit positiven Kontrollen, welche aus lipidiertem OspC aus B31 und lipidiertem OspC aus C12 bestanden.
Die hier beschriebenen Proteine und chimären Proteine sind ebenfalls antigen und daher nützlich zum Nachweis und der Diagnose von die Lyme-Krankheit verursachender Borrelia, insbesondere von Borrelia aus Gruppen, die in der Lage sind, disseminierte Symptome der Lyme-Krankheit hervorzurufen. Wie hier beschrieben beziehen sich disseminierte Symptome auf eine Infektion außerhalb der Hautverletzung bei Erythema migrans, z.B. eine Infektion im Blut, im Zentralnervensystem oder der Gelenkschmiere. Wie hier beschrieben bezieht sich antigen auf die Fähigkeit einer Verbindung, die Produkte einer Immunantwort, wie z.B. Antikörper, T-Zell-Rezeptoren oder beide an sich zu binden. Solche Antworten lassen sich durch den Einsatz von standardisierten Antikörper-Nachweisassays, wie z.B. ELISA, oder von standardisierten T-Zell-Aktivierungsassays messen.
Zusammensetzungen mit OspC-Polypeptiden aus die Lyme-Krankheit verursachender Borrelia sowie chimäre OspC-Polypeptide werden hier ebenfalls beschrieben. Die Zusammensetzungen können eine oder mehr OspC-Polypeptide oder Fragmente derselben aus mindestens zwei Borrelia burgdorferi-OspC-Gruppen enthalten, die hier auch als Familien bezeichnet werden, welche ausgewählt sind aus der Gruppe A, B, I und K, mit Ausnahme der Kombination aus zwei OspC-Polypeptiden aus der A- und I-Familie. Alternativ können die Zusammensetzungen mindestens ein OspC-Polypeptid oder Fragment desselben aus jeder der Borrelia burgdorferi-OspC-Familien A, B, I und K enthalten. Alternativ können die Zusammensetzungen mindestens ein OspC-Polypeptid oder Fragment desselben aus jeder der Borrelia afzelii-OspC-Familien A und B enthalten. Alternativ können die Zusammensetzungen OspC-Polypeptide aus mindestens einer Borrelia burgdorferi-OspC- Gruppe oder Familienmitglied enthalten, die ausgewählt sind aus der Gruppe A, B, I und K und mindestens ein Borrelia afielii-OspC-Familienmitglied, das ausgewählt ist aus der Gruppe A und B.
Wie hier beschrieben, weisen die OspC-Familien einen etwa 98% Homologie-Anteil am Level der Nucleinsäuren zwischen Stämmen der gleichen Familie und nicht mehr als 92% Homologie am Level der Nucleinsäuren zwischen Stämmen von unterschiedlichen Familien auf. Die Bestimmung der Homologie schließt sämtliche nicht-OspC-Sequenzen aus. Mitglieder der gleichen OspC-Familie haben ähnliche antigene Profile, z.B. lösen sie eine Immunantwort gegen ähnliche Stämme von die Lyme-Krankheit verursachender Borrelia aus. Die hier beschriebenen chimären Proteine lösen unerwartet eine Immunantwort gegen die Lyme-Krankheit verursachende Borrelia aus, wie die Genospezies, von welchen die Polypeptidkomponenten stammten. Die Borrelia burgdorferi-OspC-Familie A umfasst die Stämme B31, CA4, HII, IPI, IP2, IP3, L5, PIF, PKA, TXGW sowie Borrelia-Stämme, die das OspC-Allel OC1 enthalten. Die Borrelia burgdorferi-OspC-Familie B kann die Stämme 35B808, 61BV3, BUR, DK7, PB3, ZS7 sowie die Stämme umfassen, welche die OspC-Allele OC2 und OC3 enthalten. Die Borrelia burgdorferi-OspC-Familie I kann die Stämme 297, HB19 sowie Stämme enthalten, welch das OspC-Allel OC10 enthalten, wobei Stamm 297 durch das OspC mit der GenBank-Zugangsnummer L42893 gekennzeichnet ist. Die Borrelia burgdorferi OspC-Familie K kann die Stamme 272, 28354, KIPP, MUL sowie Stamme umfassen, die das OspC-Allel OC12 und OC13 enthalten, wobei Stamm 297 das OspC mit der GenBank-Zugangsnummer U08284 umfasst.
Diese Zusammensetzungen können ein OspC-Polypeptid oder Fragment desselben aus jeder der Borrelia afzelii-OspC-Familien A und Bumfassen. Die Borrelia afzelii-OspC-Familie A kann die Stämme Pbo, Pwud, Pko, Pgau, DK2, DK3, DK21, DK8, BFox und JSB umfassen. Die Borrelia afzelii-OspC-Familie B kann die Stämme DK5, ACA1, DK9, XB18h, Ple und 143M umfassen. Wie oben für Borrelia burgdorferi beschrieben, können die Zusammensetzungen auch chimäre OspC-Polypeptide der Borrelia afzelii-Familien A und B enthalten.
Das OspC-Polypeptid kann ein chimäres OspC mit mindestens einem variablen OspC-Proteinabschnitt oder einem Teil desselben von mindestens einem OspC-Gen sein. Alternativ kann der variable OspC-Proteinabschnitt von einer Nucleinsäure mit zwei Dritteln des OspC-Gen-3'-Endes codiert werden, etwa vom Nucleotid 150 bis etwa zum Nucleotid 519 eines OspC-Gens (oder etwa vom Codon 50 bis etwa zum Codon 173). Alternativ wird der variable OspC-Polypeptidabschnitt von einer Nucleinsäure codiert, wobei die Nucleinsäure z.B. die Nucleotide 244 bis etwa 519 (oder Codon 81 bis etwa Codon 173), die Nucleotide 337 bis etwa 519 (oder Codon 112 bis etwa Codon 173), die Nucleotide 418 bis etwa 519 (oder Codon 139 bis etwa Codon 173), die Nucleotide 244 bis etwa 418 (oder Codon 81 bis etwa Codon 139), die Nucleotide 337 bis etwa 418 (oder Codon 112 bis etwa Codon 139) und die Nucleotide 150 bis etwa 243 (oder Codon 50 bis etwa Codon 81) eines OspC-Gens umfasst.
Die hier beschriebenen chimären OspC-Polypeptide umfassen zwei oder mehr Polypeptide, wobei ein erstes Polypeptid von einem ersten OspC-Gen von etwa Nucleotid 26 (oder etwa Codon 8) bis etwa Nucleotid 630 (oder etwa Codon 210) stammt. Alternativ ist das erste Polypeptid von etwa Nucleotid 28. Alternativ ist das erste Polypeptid von etwa Nucleotid 53. Alternativ ist das erste Polypeptid von etwa Nucleotid 55. Alternativ ist das erste Polypeptid .ist bis zu etwa Nucleotid 621 eines ersten OspC-Gens. Alternativ ist das erste Polypeptid .bis zu etwa Nucleotid 582 eines ersten OspC-Gens. Alternativ ist das erste Polypeptid bis zu etwa Nucleotid 576 eines ersten OspC-Gens.
Das hier beschriebene chimäre OspC umfasst ferner ein zweites Polypeptid, wobei das zweite Polypeptid von einem zweiten OspC-Gen von etwa Nucleotid 28 (oder etwa Codon 9) bis etwa Nucleotid 571 (oder etwa Codon 190) stammt.
Selbstverständlich gehört dann zu den Polypeptiden, dass das chimäre Polypeptid extra Nucleotide oder weniger Nucleotide aus dem gegebenen OspC-Gen umfassen kann, von dem das Polypeptid stammt, um die Konstruktion des das chimäre Polypeptid codierenden Gens zu vereinfachen, damit z.B. passende Restriktionsendonucleasestellen verwendet oder die Genfragmente ligiert werden können, so dass ein zusammenhängender Codierungsabschnitt geschaffen wird. Auf Grundlage der hier vorgestellten Anleitung wäre ein Fachmann leicht in der Lage, Nucleotide an den Enden der die Polypeptide des chimären OspC-Proteins codierenden Genfragmente hinzuzufügen oder zu entfernen, um mit keinen oder nur Routineversuchen chimäre Proteine zu erzeugen. Ferner kann ein Überschuss von etwa 1 bis etwa 10 Aminosäuren an den N- und/oder C-terminalen Enden der hier beschriebenen Polypeptide und chimären Proteine vorkommen, wobei diese immer noch die hier beschriebenen Eigenschaften beibehalten.
Varianten oder abgeänderte Versionen der OspC-Polypeptide und der diese Polypeptide codierenden Nucleinsäuren werden ebenfalls beschrieben. Der hier verwendete Begriff Variante eines Polynucleotids oder Polypeptids bezieht sich auf ein Molekül, das dem gesamten Molekül im Wesentlichen ähnlich oder ein Fragment desselben ist. Wenn z.B. das Molekül ein Polypeptid ist, bezieht sich Variante auf die Sequenz einer Aminosäure, die durch eine oder mehr Amionosäuren verändert wird, wobei in der Variante entweder eine biologische Funktion, die Struktur oder die Antigenizität dieser Sequenz oder eine Kombination derselben beibehalten wird. Die Variante kann aus "konservativen" Veränderungen bestehen, wobei eine substituierte Aminosäure Ober ähnliche strukturelle oder chemische Eigenschaften verfügt, z.B. ein Ersatz von Leucin durch Isoleucin. Oder eine Variante kann "nicht konservative" Änderungen aufweisen, z.B. den Ersatz eines Glycinrestes durch Tryptophan. Ähnliche kleinere Variationen können auch Deletionen oder Insertionen von Aminosäuren oder beidem umfassen. Wenn das Molekül ein Polynucleotid ist, betrifft der Begriff Variante auf ähnliche Weise eine Sequenz, die durch ein oder mehrere Nucleotide verändert worden ist. Die Variante kann stille Veränderungen aufweisen, wobei die Veränderung die Aminosäure nicht verändert, die von dem diese Variation aufweisenden Triplett codiert wird oder die Variation ist nicht still, d.h. es werden Veränderungen in den codierten Aminosäuren erzeugt.
Der hier verwendete Ausdruck "veränderte Version" bezieht sich auf eine Polynucleotidsequenz oder eine Polypeptidsequenz, wobei diese diese Sequenz einen oder mehrere Unterschiede mit einer nativen oder Wildtyp-Version dieser Sequenz aufweist.
Ein isoliertes Nucleinsäuremolekül mit einer Nucleotidsequenz, die homolog zu einer oder mehreren der hier beschriebenen chimären Sequenzen oder Ergänzungen derselben ist, werden ebenfalls beschrieben. Eine derartige Nucleotidsequenz zeigt eine etwa 80% Homologie oder Sequenzidentität mit einer der chimären OspC-Sequenzen, si dass das codierte Protein die Antigenizität und Immunogenizität des unveränderten chimären Proteins beibehält. Vorzugsweise teilen die homologen Sequenzen mindestens eine etwa 90% Homologie oder Sequenzidentität mit dem entsprechenden unveränderten chimären OspC. Besonders bevorzugte Sequenzen verfügen mindestens über eine etwa 95% Homologie oder haben im Wesentlichen die gleiche Sequenz.
Die veränderten Nucleinsäuren und homologen Nucleinsäuren hybridisieren unter hoch stringenten Bedingungen an das entsprechende chimäre OspC. Eine allgemeine Beschreibung der Stringenz für Hybridisierungsbedingungen findet sich bei Ausubel, P. M., et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. und Wiley-Intercience 1987, & Supp. 49, 2000. Faktoren wie die Sondenlänge, die Basenzusammensetzung, der prozentuale Mismatch zwischen den hybridisierenden Sequenzen, die Temperatur und die Ionenstärke beeinflussen die Stabilität der Nucleinsäurehybride. Somit lassen sich Stringenzbedingungen, die ausreichen, um eine Hybridisierung der Oligonucleotide an die Matrize zu ermöglichen, mittels einer Routineoptimierung variieren, um hoch stringente Bedingungen zu schaffen.
Alternativ sind die Stringenzbedingungen wie in der WO 98/40404 beschrieben. Insbesondere werden in der Tabelle auf Seite 38 der WO 98/40404 hoch stringente, Stringenzbedingungen werden unten in Tabelle I wiedergegeben, welche der WO 98/40404 von Jacobs et al. entnommen ist: hoch stringente Bedingungen sind solche, die zumindest so stringent sind wie z.B. die Bedingungen A–F; stringente Bedingungen sind zumindest so stringent wie z.B. die Bedingungen G–L; vermindert stringente Bedingungen sind zumindest so stringent wie z.B. die Bedingungen M–R.

¹: Die Hybridlänge ist diejenige, welche für den (die) hybridisierte(n) Abschnitt(e) der hybridisierenden Polynucleotide erwartet wird. Wird ein Polynucleotid an ein Zielpolynucleotid unbekannter Sequenz hybridisiert, wird angenommen, dass die Hybridlänge die Länge des hybridisierenden Polynucleotids hat. Werden Polynucleotide mit bekannter Sequenz hybridisiert, lässt sich die Hybridlänge ermitteln, indem die Sequenz der Polynucleotide nebeneinander aufgereiht werden und der Abschnitt oder die Abschnitte mit optimaler Komplementarität in der Sequenz identifiziert wird (werden).
^↑: SSPE (1 × SSPE ist 0,15 M NaCl, 10 mM NaH₂PO₄ und 1,25 mM EDTA, pH 7,4) kann in den Hybridisierungs- und Waschpuffern durch SSC (1 × SSC ist 0,15 M NaCl und 15 mM Natriumcitrat) ersetzt werden; die Waschvorgänge werden nach vollständiger Hybridisierung während 15 Minuten durchgeführt.
*TB – TR: Die Hybridisierungstempetatur für Hybride, bei denen erwartet wird, dass sie eine Länge von weniger als 50 Basenpaaren haben, sollte 5°–10°C unter der Schmelztemperatur T_m des Hybrids liegen, wobei T_m nach den folgenden Gleichungen ermittelt wird. Für Hybride mit einer Länge von weniger als 18 Basenpaaren, T_m (°C) = 2(Anzahl der A + T Basen) + 4(Anzahl der G + C Basen). Für Hybride mit einer Länge von 18 bis 49 Basenpaaren, T_m (°C) = 81,5 + 16,6(log₁₀[Na⁺]) + 0,41(% G + C) – 600/N), wobei N die Anzahl der Basen in dem Hybrid ist und [Na⁺] die Konzentration der Natriumionen im Hybridisierungspuffer ([Na⁺] für 1 × SSC = 0,165 M).

Der hier verwendete Ausdruck "isoliert" bezieht sich auf eine Nucleinsäure oder ein Polypeptid, das aus seiner ursprünglichen Umgebung entfernt worden ist (z.B. der natürlichen Umgebung, falls es natürlich vorkommt). Beispielsweise ein Polynucleotid oder eine DNA oder ein Polypeptid, das von einigen oder allen zusammen in einem natürlichen System vorkommenden Stoffen abgetrennt worden ist. Ein isoliertes Polynucleotid kann Teil eines Vektors und/oder einer Zusammensetzung und insofern immer noch isoliert sein, als der Vektor oder die Zusammensetzung keinen Teil seiner natürlichen Umgebung darstellt. Ebenso können Polypeptide Teil einer Zusammensetzung und insofern immer noch isoliert sein, als die Zusammensetzung keinen Teil seiner natürlichen Umgebung darstellt.
Die hier beschriebenen chimären Proteine umfassen, wie oben beschrieben, Proteine oder Polypeptide aus, wie in Tabelle II beschrieben, zwei oder mehr OspC-Familien von die Lyme Krankheit verursachender Borrelia. Diese Familien können die Borrelia burgdorferi OspC Familien a, B, I und K sowie die Borrelia afzelii OspC Familien A und B umfassen. Die hier beschriebenen chimären Proteine umfassen z.B. ein erstes OspC-Polypeptid, das von einer Nucleinsäure codiert wird, die eine Sequenz etwa vom Codon 18 an bis zum Codon 210 eines ersten OspC-Gens umfasst. Alternativ beginnt die Sequenz etwa mit dem Codon 8. Alternativ reicht die Sequenz bis zum Codon 207. Alternativ reicht die Sequenz bis zum Codon 194. Alternativ reicht die Sequenz bis zum Codon 192. Die hier beschriebenen chimären Proteine umfassen ferner z.B. ein zweites OspC-Polypeptid mit einem variablen OspC-Polypeptid, das wie oben beschrieben von Nucleinsäurefragmenten codiert wird. Alternativ umfasst das chimäre Protein, wie oben beschrieben, zwei oder mehr variable OspC-Polypeptide.
Die hier beschriebenen chimären Proteine umfassen ferner z.B. ein zweites OspC-Polypeptid, das von einer Nucleinsäure codiert wird, welche eine Sequenz von etwa Codon 9 an bis zu etwa Codon 190 eines zweiten OspC-Gens umfasst.
Für die hier beschriebenen chimären Proteine sind mindestens zwei dieser OspC-Polypeptide oder immunogenen Fragmente derselben zu einem einzigen Protein, einem chimären Protein fusioniert das von einer einzigen Nucleinsäure codiert wird, wobei keine zwei in diesem Fusionsprotein aneinandergrenzende Polypeptide mit der derselben Konfiguration in einem natürlich vorkommenden OspC-Protein gefunden werden.
Alternativ werden die hier beschriebenen OspC-Proteine oder chimären Proteine aus Borrelia burgdorferi und Borrelia afzelii in einer Zusammensetzung kombiniert.
Ein Verfahren zum Nachweis einer Immunantwort gegen die Lyme-Krankheit verursachende Borrelia in einer Wirtsprobe wird ebenfalls beschrieben. Das Verfahren umfasst das in Kontakt Bringen der Wirtsprobe mit einer Zusammensetzung, welche OspC-Polypeptide aus die Lyme-Krankheit verursachenden Stämmen von Borrelia umfasst, so dass in der Probe anti-OspC-Antikörper, falls vorhanden, an die OspC-Polypeptide binden. Die Zusammensetzung kann ein oder mehrere OspC-Polypeptide oder diagnostische Fragmente derselben aus zwei Borrelia burgdorferi OspC Familien, die ausgewählt sind aus der Gruppe A, B, I und K umfassen, mit Ausnahme der Zusammensetzung, die aus zwei OspC-Proteinen besteht, wobei ein OspC-Protein aus der OspC-Familie A und das zweite OspC-Protein aus der OspC-Familie I stammt. Die Antikörper, welche die OspC-Polypeptide der Zusammensetzung binden werden nachgewiesen oder gemessen, wodurch eine Immunantwort gegen die Lyme-Krankheit auslösende Borrelia nachgewiesen wird. Alternativ kann die Zusammensetzung mindestens zwei Borrelia OspC-Polypeptide oder diagnostische Fragmente derselben aus zwei Borrelia afzelii OspC Familien, die ausgewählt sind aus der Gruppe A und B umfassen. Alternativ kann die Zusammensetzung Polypeptide aus Borrelia burgdorferi und Borrelia afzelii umfassen. Alternativ kann die Zusammensetzung eines oder mehrere Polypeptide aus jeder der Borrelia burgdorferi Familien a, B, I und K und der Borrelia afzelii Familien A und B umfassen. Die Zusammensetzung kann auch eines oder mehrere der hier beschriebenen chimären Polypeptide umfassen.
Es werden auch Kits beschrieben, welche eines oder mehrere OspC-Polypeptide oder chimären OspC-Polypeptide oder Kombinationen derselben zusammen mit geeigneten Puffern und Mitteln zum Nachweis von Antikörpern für den Nachweis oder die Diagnose von die Lyme-Krankheit verursachender Borrelia umfassen. Die Kits können Nucleinsäuren umfassen, die ausreichend homolog zu den OspC-Polypeptiden oder den chimären OspC-Polypeptiden sind, um Nucleinsäuren nachzuweisen, welche die Gene aus die Lyme-Krankheit verursachenden Stämmen von Borrelia codieren, zusammen mit Reagenzien zum Nachweis einer positiven Hybridisierung an die Ziel-DNA oder z.B. Reagenzien für eine spezifische DNA.
Für die Zwecke eines Nachweis-Kits bezieht sich der Ausdruck "homolog" auf zwei oder mehrere Sequenzen, die untereinander im Wesentlichen ähnlich aber nicht identisch sind Zwei DNA-Sequenzen sind "im Wesentliche ähnlich", wenn mindestens etwa 95% (vorzugsweise mindestens 98%) der Nucleotide über eine definierte Länge der DNA-Sequenzen zusammenpassen. Sequenzen die im Wesentlichen homolog sind, lassen sich identifizieren, indem die Sequenzen unter Einsatz von Standard-Software, die von Sequenz-Datenbanken bezogen werden kann, oder in einem Southern-Hybridisierungs-Experiment unter z.B. stringenten Bedingungen, wie sie für dieses besondere System definiert sind, miteinander verglichen werden. Das Aufstellen passender Hybridisierungsbedingungen gehört zum Können des Fachmanns. Siehe z.B. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., New York; Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Für die Zwecke der vorliegenden Offenbarung werden Aminosäuresequenzen mit z.B. mehr als 90 Prozent Ähnlichkeit als im Wesentlichen homolog angesehen.
Die hier beschriebenen Impfstoffzusammensetzungen lösen in einem Wirt humorale und Zellvermittelte Immunantworten aus. Ferner sind die hier beschriebenen diagnostischen Zusammensetzungen in der Lage, unter Einsatz standardmäßiger immundiagnostischer Techniken sowohl eine humorale als auch zellvermittelte Immunantwort nachzuweisen.
BEISPIELE
BEISPIEL 1: TECHNOLOGIEN
Stämme von Borrelia
Aus primären Erythema migrans (EM)-Verletzungen, Blur oder Gehirn- und Rückenmarksflüssigkeit von Patienten vom Lyme Disease Center in Stony Brook, New York, vom Lyme Disease Diagnostic Center am New York Medical College, Valhalla, New York oder von privaten Praxen von zwei zusammenarbeitenden Medizinern am Eastend von Long Island wurden 140 B. burgdorferi-Stämme isoliert oder con den Centers for Disease Control (CDC) erhalten. Alle Patienten erfüllten die von den Centers for Disease Control aufgestellte Definition zur Überwachung der Lyme-Krankheit (CDC, Morb. Mortal Wkly. Rep. 46: 20–21, (1997)). Isolate aus der Haut, dem Blut und der Gehirn- und Rückenmarksflüssigkeit wurden unter Einsatz von standardisierten Techniken erhalten; (Barbour, A. G., Yale J. Biol. Med. 57: 521–525, 1984; Berger, B. W. et al., J. Clin. Microbiol. 30: 359–361, 1992; Wormser, G. P. et al., J. Clin. Microbiol. 36: 296–298 (1998)). Vom fortschreitenden Rand eine Erythema migrans-Verletzung wurden Stanzbiopsien entnommen und in BSK-H-Medium (Sigma, St. Louis, MO) bei 34°C inkubiert, um eine Kultur anzuzüchten. Wie durch direkte Analyse des Biopsiegewebes im Vergleich mit Kulturisolaten ermittelt wurde (Seinost, G. et al., Arch. Derm., 135: 1329–1333, (1999)) gab es anders als bei der Isolierung von B. burgdorferi aus ohne Nahrung belassenen Zecken; (Norris, D. E. et al., J. Clin. Microbiol. 35: 2359–2364, (1997)) einen geringen Culture-Bias. Darüber hinaus wurden 22 OspC-Sequenzen von B. burgdorgeri sensu stricto vob GenBank erhalten. Die verwendeten Zeckendaten stammen entweder von GenBank oder aus der Untersuchung von Wang et al. (Wang, I-N. et al., Genetics 151: 15–30 (1999)).
DNA.Isolierung
Zur Isolierung der genomischen Borrelia-DNA wurden durch Zentrifugation bei 10.000 Upm über 30 Minuten bei 4°C Zellen aus der Log-Phase gewonnen. Das Bakterienpellet wurde in Tris/Saline-Puffer (10 mM Tris (pH 7,5), 150 mM NaCl) resuspendiert. Die Bakterien wurden dann pelletisiert und in TNE (10 mM Tris (pH 7,5), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA) resuspendiert. Es wurde frisch gewonnenes Lysozym (20 mg/ml in TNE), Natriumdodecylsulfat (10%) und Proteinase K (20 mg/ml) zugesetzt und die Mischung bei 50°C 1 Stunde lang inkubiert und dann mit RNAse behandelt. Die DNA wurde mit Phenol/Chloroform extrahiert, mit Ethanol gefällt und in TE-Puffer resuspendiert.
Polymerase-Kettenreaktion
Wie früher beschrieben (Wang, I-N. et al., Genetics 151: 15–30 (1999)) wurde das OspC-Gen unter Einsatz der PCR amplifiziert. Das OspC-Gen wurde unter Verwendung von zwei externen Primern amplifiziert: 5'-AAA GAA TAG ATT AAG TGC GAT ATT-3' (+), SEQ ID NO: 1, beginnend mit der Base 6 und 5'-GGG CTT GTA AGC TCT TTA ACT G-3' (–), SEQ ID NO: 4, endend an der Base 602. Unter Verwendung von SEQ ID NO: 1 und dem reversen Primer 5':CAA TCC ACT TAA TTT TTG TGT TAT TAG-3' (–) SEQ ID NO: 2, endend an der Base 345 wurde die 5'-Hälfte von OspC amplifiziert. Die 3'-Hälfte von OspC wurde unter Einsatz des Primers 5'-TTG TTA GCA GGA GCT TAT GCA ATA TC-3' (+), SEQ ID NO: 3, beginnend an der Base 289 und der SEQ ID NO: 4 als reversem Primer amplifiziert. Die externen Primer amplifizierten ein Fragment von 597 bp. Die Amplifikation der 5'-Hälfte ergab ein Fragment von 340 bp, während die Amplifikation der 3'-Hälfte ein Fragment von 314 bp ergab. Alle Anzahlen für die Basen und die amplifizierten Größen der Fragmente beruhen aus der OspC-Sequenz des Stammes B31 (GenBank Zugangsnummer U10894) mit dem Startcodon als Base 1.
Die Amplifikation erfolgte in 50 μl einer Lösung mit Perkin-Elmer Cetus 10 × PCR-Puffer (100 mM Tris-HCl (pH 8,3), 500 mM KCl), 2,5 mM MgCl2, 0,2 mM Desoxynucleosidtriphosphat pro Nucleotid, 2,5 E Taq-Polymerase (Perkin-Elmer/Cetus) und 0,5 mM von jedem Primer. Die Amplifikations-Reaktion wurde für 40 Zyklen in einem DNA-Thermal-Cycler (PTC-100; MJ Research, Inc., Watertown, MA) mit folgendem Amplifikationsprofil durchgeführt: Denaturierung bei 95°C über einen Zeitraum von 40 Sekunden, Hybridisierung bei 54°C über einen Zeitraum von 25 Sekunden und Verlängerung bei 72°C über einen Zeitraum von 1 Minute, nach einem anfänglichen Denaturierungsschritt bei 96°C einen Zeitraum von 2 Minuten. In jedem Versuch wurde eine negative Kontrolle eingesetzt, um aus eine Kontamination hin zu überwachen.
Kalte SSCP-Analyse
Die SSCP-Analyse wurde ausgewählt, um die genetische Variation der isolierten OspC-Genfragmente auf der Grundlage von deren ausgezeichnet hohem Nachweisvermögen von DNA-Polymorphismen und Punktmutationen an den verschiedenen Positionen in DNA-Fragmenten zu charakterisieren. (Orita, M. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 86: 2766–2770, (1989)). In Fragmenten mit einer Länge von bis zu 800 bp sind einzelne Punktmutationen nachgewiesen worden (Michaud, J. et al., Genomics. 73: 389–394, (1992)). Es gibt jedoch Hinweise dafür, dass die Fähigkeit der SSCP-Analyse zum Nachweis von Mutationen signifikant abnimmt, wenn sich die PCR-Fragmente einer Länge von 400 bp annähern (Hayashi, K., PCR Methods & Applications 1: 34–38, (1991)). Um eine hohe Nachweiseffizienz von Nucleotidpolymorphismen zu erzielen, betrug die Länge der hier verwendeten PCR-Produkte 340 bp von der 5'-Hälfte her und 314 bp von der 3'-Hälfte des OspC her.
Die amplifizierten OspC-Genfragmente von allen 140 Stämmen wurden mittels der von Hongyo et al. beschriebenen Vorschrift für die kalte SSCP-Analyse auf ihre genetischen Variationen hin analysiert (Hongyo, T. et al., Nucleic. Acids Res. 21: 3637–3642, (1993)). Kurz zusammengefasst wurden 5 bis 15 μl des PCR-Produkts einer Mischung mit 4 μl 5 × TBE-Ficoll-Probenpuffer (NOVEX, San Diego, CA) und 0,4 μl 1 μM Methylquecksilberhydroxid (Alfa Aesaer, Ward Hill, MA) zugesetzt. Die Menge des für die SSCP-Analyse eingesetzten PCR-Produkts wurde nach dem Sichtbarmachen des PCR-Produkts auf einem Agarosegel mit Ethidiumbromid bestimmt. Die Probenmischung wurde über einen Zeitraum von 4 Minuten auf 95°C erhitzt und dann vor dem Eintragen der gesamten 20 μl in die Vertiefung der Gelprobe auf Eis abgekühlt. Die schärfsten Banden wurden beobachtet, wenn die Probe auf ein vorgegossenes 20% TBE-Gel (NOVEX)-Elektophoresesystem (ThermoFlow ETC Unit, NOVEX) mit 1,25 × TBE-Laufpuffer aufgetragen wurde. Die Elektrophorese der SSCP-Produkte erfolgte mit 240 Volt bei einer konstanten Temperatur von 8°C über einen Zeitraum von 17 Stunden, um unterscheidbare Verschiebungen in der Mobilität anzuzeigen. Die Gele wurden mit 0,5 μl/ml Ethidiumbromid in 1 × TBE-Puffer über einen Zeitraum von 25 Minuten angefärbt und in destilliertem Wasser über einen Zeitraum von 30 Minuten entfärbt. Die gefärbten Bande wurden in einer UV-Box mit einer Wellenlänge von 340 nm in Augenschein genommen. Die Proben, die mehr als zwei SSCP- Bande aufwiesen, wurden erneut amplifiziert, um zu ermitteln, ob mit den Banden wirkliche Allele aufgefunden wurden oder nur das Produkt von PCR-Artefakten. Es erfolgte eine Seite an Seite durchgeführte SSCP-Analyse, um selbst geringfügige Verschiebungen in der elektrophoretischen Beweglichkeit nachzuweisen.
DNA-Sequenzierung
Das OspC-Gen oder Repräsentanten von jeder Mobilitätsklasse wurden erneut amplifiziert. Doppelsträngige PCR-Fragmente wurden mittels Agarose-Gelelektrophorese gereinigt und unter Einsatz der Didesoxy-Terminations-Methode und der ursprünglich für die PCR-Amplifikation eingesetzten Vorwärts- und Rückwärts-Primer einer automatischen DNA-Sequenzierung unterzogen.
Statistische Analyse
Es erfolgte eine Chi-Quadrat-Analyse der Kontingenztafeln. Mit dieser Analyse werden signifikante Unterschiede in der Häufigkeitsverteilung untersucht. Die Tafeln waren 2 × N, wobei N die Anzahl der unterschiedenen OspC-Hauptgruppen ist. Für eine Untersuchung, die frei von systematischen Fehlern ist, muss die erwartete Durchschnittszahl in jedem Element der Tafel etwa 6 oder größer sein (Zar, J. H., Biostatistical Analysis, 3. Ausgabe, S. 206, (1996)). Dies bedeutet, dass die Zahl der Beobachtungen größer als 6-mal 2N sein sollte. Wenn die erwartete Durchschnittszahl kleiner als 6 war, wurden die OspC-Hauptgruppen mit der niedrigsten Zahl in der Probe vereinigt, bis die Zahl der Beobachtungen etwa gleich oder größer 12N war.
ERGEBNISSE
OspC-Mobilitätsklassen in menschlichen Isolaten von B. burgdorferi
132 Isolate von B. burgdorferi sensu stricto aus Patientenproben der Haut, des Blutes und der Gehirn- und Rückenmarksflüssigkeit (Tabelle II) wurden in vitro vermehrt und als DNA- Quelle für die Analyse verwendet. Der OspC-Genotyp von jedem Stamm wurde mit einer kalten SSCP-Analyse des 5'-Endes (340 bp) des Gens ermittelt und mit einer SSCP-Analyse des 3'-Endes (314 bp) von OspC bestätigt. In allen Isolaten von B. burgdorferi entsprach die genetische Variation am 5'-Ende des Gens der Variation am 3'-Ende. Daraufhin wurden mindestens zwei Repräsentanten von jeder SSCP-Mobilitätsklasse sequenziert. Die Sequenzen von den gleichen Mobilitätsklassen waren in allen Proben identisch und jede Mobilitätsklasse hatte ihre eigene Sequenz. Daher war die Empfindlichkeit und Spezifität der SSCP-Analyse 100%. Jede SSCP-Mobilitätsklasse wurde als Allel bezeichnet. Wang et al. beschrieben vor kurzem 13 OspC-Allele (Wang, I-N. et al., Genetics 151: 15–30). In dieser Anmeldung werden weitere 5 OspC (OC)-Mobilitätsklassen, OC14–18) beschrieben. OC14 hat die gleiche OspC-Sequenz wie das OspC im Stamm 2591. TABELLE II. Aufstellung der OspC-Hauptgruppen zusammen mit den durch SSCP analysierten OspC-Allelen

¹ Als Beispiel wurde eine einzelne GenBank-Sequenz von jedem Typ angegeben
² Die Anzahl von jeder im Blut, in der Synovialflüssigkeit oder in der Gehirn- und Rückenmarksflüssigkeit beobachteten OspC-Gruppe. Darin sind sowohl SSCP-Daten als auch Daten aus der Literatur, einschließlich GenBank-Daten, enthalten.
* Die B. burgdorferi sensu stricto-Gruppen P bis S sind nur in Europa zu finden. Die Gruppen R und S sind von der Analyse ausgeschlossen, weil nahezu identische OspC-Allele in B. afzelii und B. garinii gefunden werden, was darauf hinweist, dass diese Gruppen vor kurzem durch Übertragung unter den Spezies erzeugt wurden.

Mehrfach-Infektionen
Von den 132 primären Isolaten aus Patienten mit der Lyme-Krankheit in dieser Untersuchung enthielten die meisten nur einen einzigen Stamm. Sieben Isolate aus der Haut und ein Isolat aus der Gehirn- und Rückenmarksflüssigkeit enthielten, wie mittels SSCP-Analyse nachgewiesen, zwei unterschiedliche Stämme, was zusammen dann 140 unterschiedliche Stämme ergab. Die in mehrfach infizierten Erythema migrans-Biopsiemustern gefundenen OspC-Allelpaare waren (OC1, OC12), OC1, OC14), 2 × (OC2, OC3), 2 × (OC2, OC12) und OC8, OC18). Das Isolat aus der Gehirn- und Rückenmarksflüssigkeit NY940657 enthielt die OspC-Allele OC1 und OC12. Für das Isolat aus der Gehirn- und Rückenmarksflüssigkeit 297, das in Connecticut isoliert wurde, gab es zwei bei GenBank veröffentlichte Sequenzen: L42893, welche OC10 analog ist und U08284, welche OC12 analog ist. Der paarweise Unterschied der OspC-Sequenzen beider Stämme ist 16,4%, was eine Infektion der Gehirn- und Rückenmarksflüssigkeit mit zwei unterschiedlichen Stämmen in diesem Isolat nahe legt. Insgesamt enthielten 5,5% aller hier beschriebenen Isolate zwei Stämme. Weil 50% der in der Wildnis isolierten Zecken mit mehrfachen Stämmen infiziert sind, ist man allgemein bei einem einzigen Zeckenbiss mehrfachen Stämmen ausgesetzt, was die Möglichkeit erhöht, dass unterschiedliche Stämme unterschiedlich pathogen sind.
Zu diesem 140 Stämmen, für welche hier das OspC-Allel ermittelt wurde, wurden 22 Stämme der bekannten OspC-Sequenz von GenBank hinzugefügt, was insgesamt 162 ergab. 51 dieser Stämme wurden jeweils aus dem östlichen Long Island erhalten; 77 wurden von Westchester County, New York erhalten und der Rest aus anderen endemischen Gebieten der USA (22 Stämme) und aus Europa (12 Stämme). Die Isolate wurden in solche aus dem Ort der Primärinfektion, aus der Erythema migrans-Hautverletzung (118 Isolate) und solche aus Sekundärorten, wo die Infektion disseminiert worden war (44 Isolate). unterteilt. Diese letztere Gruppe enthielt z.B. 20 aus der Gehirn- und Rückenmarksflüssigkeit, 23 aus dem Blut und eine aus der Synovialflüssigkeit.
OspC-Hauptgruppen aus B. burgdorferi-Isolaten des Menschen
Überraschenderweise fielen, wie hier beschrieben, die Unterschiede zwischen OspC-Sequenzen unter und zwischen den Familien von B. burgdorferi sensu stricto in zwei Gruppen. Paare von OspC-Genen innerhalb der gleichen Familie unterschieden sich in ihrer Nucleinsäuresequenz um weniger als 2%, während Paare von OspC-Genen aus separaten Familien sich in ihrer Nucleinsäuresequenz um mehr als 8% unterschieden. Wang et al. definierten 19 als A bis S bezeichnete OspC-Hauptgruppen, (Wang, I-N. et al., Genetics 151: 15–30 (1999)). Wie hier beschrieben, werden zwei zusätzliche als T und U bezeichnete OspC-Gruppen zur Verfügung gestellt. OC16 steht für die Hauptgruppe T und OC17 für die Hauptgruppe U (Siehe Tabelle I). Die geringsten paarweisen Unterschiede der Gruppen T und U zu irgend einer anderen OspC-Hauptgruppe sind 16,1% bzw. 20,5%.
B. burgdorferi-Klone sind unterschiedlich pathogen
Wie hier beschrieben sind Klone, welche unterschiedliche OspC-Gruppen von Borrelia burgdorferi repräsentieren, unterschiedlich pathogen. Dies zeigt sich in den unterschiedlichen Häufigkeiten der verschiedenen OspC-Hauptgruppen in Zecken, in der anfänglichen Infektion der Haut und in disseminierten Infektionen.
Die Stämme bei GenBank und in der Literatur, für welche die OspC-Sequenzen ermittelt worden sind, wurden in weitem Umfang im gesamten geographischen Verbreitungsgebiet der Spezies gesammelt und wurden ungeachtet dessen, ob sie von Zecken oder vom Menschen stammten ausgewählt. Diese Stämme ergaben eine kleine aber zufällige Probe der Häufigkeiten der OspC-Hauptgruppen in Zecken und im Menschen. Wie hier gezeigt, wurde gefunden, dass die Häufigkeit der OspC-Hauptgruppen aus Isolaten des Menschen sich signifikant von der in Zecken auf Long Island gefundenen Häufigkeit unterschied. In Tabelle III wird gezeigt, dass sich die Häufigkeitsverteilung der Stämme aus der Haut von Individuen auf dem östlichen Long Island signifikant von den im gleichen Gebiet gesammelten Zeckenstämmen unterschied. TABELLE III
χ² = 36,3 mit 9 Freiheitsgraden
p < 0,001

^a Die kombinierten Hauptgruppen sind durch individuelle Häufigkeiten von 0,025 oder weniger definiert und enthalten die Gruppen E, J, N, O.

Die hier für alle in dieser Untersuchung präsentierten OspC-Gruppen abgegebene Analyse zeigte, dass die meisten Gruppen sowohl in Zecken als auch im Menschen gefunden werden (Tabelle II). Die Hauptgruppen A, B, I und K überwogen jedoch im Menschen, wobei die A- und K-Gruppen am häufigsten gefunden wurden (1).
Das Pathogenitätsmuster der verschiedenen Klone, wie es durch die Häufigkeit am Primärort der Infektion, der Haut, im Vergleich mit der Häufigkeit an Sekundärorten gezeigt wird, gab zu erkennen, das nur vier Hauptgruppen (A, B, I, K) sowohl in der haut als auch an den Sekundärorten gefunden wurden (Vergleich der Tabellen III und IV). Alle anderen Hauptgruppen wurden nur in der Haut gefunden. Wenn alle Gruppen mit drei oder weniger Isolaten kombiniert werden, um die kombinierte Gruppe der Tabelle IV zu ergeben, ergibt ein 2 × 8 Kontingenztest zum Vergleich der Häufigkeitsverteilung der Haut gegenüber den Sekundärorten eine Signifikanz von p < 0,005. Wenn keine Gruppen kombiniert werden, ist ein 2 × 15 Kontingenztest immer noch signifikant (χ² = 24,07 mit 14 Freiheitsgraden, p < 0,05). Die Verteilung der Stämme aus Primär- und Sekundärorten zeigte, dass nur ein gewisser Teil der Hauptgruppen A, B, I und K eine disseminierte Krankheit verursachen. Wie hier beschrieben werden diese als invasive Klone bezeichnet, während andere Klone als nicht invasive Klone bezeichnet werden TABELLE IV
χ² = 23,6 mit 7 Freiheitsgraden
p < 0,005

^a Die kombinierten Hauptgruppen werden durch individuelle Häufigkeiten von 0,0225 oder weniger definiert und enthalten C, D, E, M, N, O, T und U.

Wie hier beschrieben, sind die durch die OspC-Gruppen definierten unterschiedlichen Klone von B. burgdorferi sensu stricto unterschiedlich pathogen. Einige Gruppen verursachen sehr selten, wenn überhaupt, eine Krankheit beim Menschen, z.B. die OspC-Gruppen D, E, F und L. Einige Gruppen verursachen am Ort des Zeckenbisses eine lokale Infektion, jedoch keine systemische Erkrankung, z.B. die OspC-Gruppen G, H, J und T. Schließlich gibt es einige Gruppen, die für eine systemische Erkrankung verantwortlich sind; dies sind die OspC-Gruppen A, B, I und K. Unsere Befund weisen darauf hin, dass alle systemischen B. burdorferi sensu stricto Infektionen beim Menschen von den Stämmen in diesen vier OspC-Gruppen verursacht werden
1 zeigt die Häufigkeitsverteilung der OspC-Hauptgruppen unter B. burgdorferi Isolaten aus Ixodes scapularis Zecken auf Eastern Long Island, n = 72, (A); Erythema migrans Verletzungen, n = 118, (B); und Sekundärorten der Infektion, n = 44, (C). Der Prozentsatz von Gruppe A plus Gruppe K stieg von 23% in den Zecken.Isolaten auf 47% in den Hautisolaten und auf 84% in den Sekundärorten. Die Länge der Balken in 1 veranschaulicht diesen Zuwachs, wobei die Länge der kombinierten A- und K-Gruppen konstant gehalten wird. In der Haut sind die Gruppen C, D, E, M, N, O, T und U kombiniert worden, da ihre individuellen Häufigkeiten 0,025 oder weniger sind. Diese Kombination von Gruppen, wenn sie kombiniert wurden, macht bis zu 12,7% der Gesamtzahl der Stämme aus.
Eine ähnliche Analyse wurde für B. afzelii durchgeführt. Die Analyse umfasste OspC-Allele aus 21 Stämmen von GenBank und 12 für diese Untersuchung sequenzierte Stämme. Diese Sequenzen fielen in 20 Hauptgruppen, wobei die Definition einer Gruppe so war, dass innerhalb einer Gruppe weniger als 1% Sequenzunterschied herrschte und zwischen den Gruppen ein Sequenzunterschied von mindestens 7,7% bestand. Es gab zwei Ausnahmen von dieser Regel, die verursacht wurden von einer Deletion in einem OspC-Gen und von einem kreuzweisen Spezies-Transfer eines kleinen DNA-Abschnitts in einem anderen OspC-Gen. Wurden diese anomalen Abschnitte entfernt, fielen alle OspC-Allele unter die 20 Gruppen. Nur zwei Gruppen enthielten Stämme aus chronischen Infektionen – die Gruppen A und B. Durch analoge Betrachtung und die Untersuchung bei B. burgdorferi scheint es, dass bei B. afzelii nur zwei Gruppen pathogen sind.
BEISPIEL 2: Protein-Expression und Immunoblotting
Protein-Expression
Die Escherichia coli (Stamm BL21 (pLysS) oder Stamm B834 (DE3)) wurden mit dem die rekombinanten chimären Borrelia-Proteine (RCBPs) codierenden Plasmid transformiert und in 10 ml LB-Medium (5 g/l NaCl, 10 g/l Trypton, 3 g/l Hefeextrakt, 25 mg/l Chloramphenicol und 50 mg/l Ampicillin) bei 37°C unter Schütteln angezüchtet. Sobald die optische Dichte bei 600λ 0,3–0,4 Einheiten erreichte wurde durch Zugabe von IPTG (Isopropyl-B-D-thiogalactosid) bis zu einer Endkonzentration von 0,5 mMol die Expression der rekombinanten Proteine induziert und die Zellen für weitere drei Stunden angezüchtet. Die Kulturen wurden durch Zentrifugation bei 3800 g über einen Zeitraum von 5 Minuten geerntet. Die Zellen wurden in 20 mM NaPO₄ bei pH 7,7 resuspendiert und über Nacht bei –20°C aufbewahrt. Nach dem Auftauen wurde der Rohextrakt mit DNAse (2 μg/ml) in Gegenwart von 2,5 mM MgCl₂ bei Raumtemperatur 30 Minuten lang inkubiert, bei 14.000 Upm 5 Minuten lang zentrifugiert (Eppendorf 5417C) und 5 μl der Proteinprobe wurden auf einer SDS-PAGE laufen gelassen, die entweder mit Commassie-Blau gefärbt war, oder sie wurden für ein Immunoblotting verwendet. Die Proteinproben wurden gewöhnlich mit einem Natriumdodecylsulfat (SDS) enthaltendem Puffer und in ausgesuchten Fällen mit Reduktionsmitteln wie Dithiothreitol (DTT) oder 2-Mercaptoethanol (2-ME) solubilisiert. Nach dem Auflösen wurde das Material mittels SDS-PAGE aufgetrennt. Die Proteine wurden sodann elektrophoretisch auf eine Polyvinylidendifluorid-Membran (PVDF, Immobilon-P^®, Millipore) übertragen. Der Transfer der Proteine wurde mit einem reversiblen Färbeverfahren, Ponceau S, verfolgt. Die gefärbte Membran wurde hergestellt und die Membran durch Einweichen in Wasser über einen Zeitraum von 10 Minuten entfärbt. Alle nicht spezifischen Bindungsstellen an den Proteinen und auf der Membran wurden blockiert, indem die Membran in eine Lösung mit einem Proteine oder Detergentien blockierenden Mittel (5% Milch in mit Tris gepufferter Saline (TBS) Tween-20^® 0,1%) getaucht wurde. Die Membranen wurden dann mit einem primären Antikörper (entweder einem monoklonalen Antikörper oder Erythema migrans-Lyme-Krankheit-Humanserum) inkubiert. Die Membran wurde gewaschen und die Antikörper-Antigen-Komplexe unter Einsatz von alkalischer Phosphatase (AP) identifiziert, die an einen sekundären Antikörper gekoppelt war, entweder an Anti-Immunglobulin G (Anti-Maus IgG) zum Nachweis des monklonalen Antikörpers oder an Anti-human IgA + IgG + IgM zum Nachweis der Serum Antikörper. Sodann wurde ein chromogenes Substrat für die alkalische Phosphatase eingesetzt, um die Aktivität sichtbar zu machen.
BEISPIEL 3: SEROLOGISCHE CHARAKTERISIERUNG – ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay)
Immobilisierung von RCBPs auf ELISA-Platten, Bestimmung der optimalen RCBP-Bindung:
Eine Lösung von gereinigten RCBPs in Natriumphosphat-Puffer von pH 9,0 wurde verwendet, um kommerzielle Mikrowell-Platten (MaxiSorp^®, Nunc) zu beschichten. Die rekombinanten OspC-Borrelia-Proteine werden in Tabelle V beschrieben. Das Beschichtungsverfahren wurde wie folgt durchgeführt: 100 μl einer Lösung mit der geeigneten Konzentration von jedem RCBP wurde jeder Vertiefung zugesetzt und die Mikrowell-Platte jeweils 1 Stunde bei Raumtemperatur oder 4°C über Nacht inkubiert. Die Antigenlösung wurde aus den Vertiefungen entfernt, die Platte dreimal mit phosphatgepufferter Saline (PBS) von pH 9,0 gewaschen und 200 μl der Blockierungslösung (2% BSA-Fraktion V (Sigma) in PBS) zugesetzt. Nach 30-minütiger Inkubation bei 37°C wurden die Platten dreimal mit PBS gewaschen, in Kunststoff eingehüllt und bis zur Verwendung bei 4°C aufbewahrt. Die Bindung der einzelnen RCBPs wurde gemessen, indem monoklonale Antikörper eingesetzt wurden, die entweder spezifisch auf OspA oder OspC reagierten und dann wurde (nach dem Waschen) ein mit alkalischer Phosphatase konjugierter sekundärer Anti-Maus-Antikörper von Ziegen eingesetzt. Es wurde gefunden, dass die Obergrenze für die Proteinbindung über dem Wirkungsbereich des zu deren Messung eingesetzten Antikörpers lag und es wurde gefunden, dass die Standardvorschrift für die Blockierung diese hohe Protein-Bindungskapazität erfolgreich absättigt, was in den Vertiefungen mit der Kontrolle zu niederem Hintergrundrauschen führte. Die Ergebnisse dieser Experimente zeigten, dass für jedes der untersuchten RCBPs eine Proteinkonzentration von 0,5 μg/ml im Beschichtungspuffer optimal war. Es wurde nicht gefunden, dass es nötig ist, die chimären Proteine in einem spezifischen molaren Verhältnis zueinander zu immobilisieren; es ist nur nötig, dass eine ausreichende menge eines jeden Proteins gebunden wird, so dass bei Verwendung von Patientenserum die Epitope im chimären Protein im nachfolgenden ELISA-Assay nicht limitierend werden. Es wurde gefunden, dass für praktische Zwecke diese Bedingungen erfüllt waren, wenn mit einem in einer der chimären Proteine auf der der Oberfläche einer Vertiefung vorkommenden spezifischen Epitop der Monoclonal-Capture-Assay für jeden monoklonalen Antikörper der Maus eine Extinktion von etwa 1,5 Einheiten oder darüber erreichte. Falls nötig können jedoch die Konzentrationen der einzelnen Proteine in der Mischung eingestellt werden, um unter Einsatz einer Routineoptimierung die gewünschten Mengen an immobilisiertem Protein zu erreichen. Obwohl die Menge von jedem an die Oberfläche der Vertiefung gebundenen RCBP und die Menge von jedem der Lösung ausgesetzten Epitop von Protein zu Protein etwas variiert, wurde nicht gefunden, dass die Menge an gebundenem Epitop innerhalb des nützlichen Rahmens eines ELISA-Tests nicht limitierend wirkt.
ELISA-Tests:
Das Standardverfahren für die ELISA-Tests war wie folgt: Proben von menschlichem Serum wurden mit einem Muster-Verdünnungsmittel (10% fötales Rinderserum in PBS von pH 9,0) 1:100 verdünnt und 100 μl von jeder Probe auf die Mikrowells von ELISA-Platten gegeben, die wie oben beschrieben mit einem Antigen beschichtet worden waren. Nach der Inkubation über einen Zeitraum von 1 Stunde bei 37°C wurden die Proben entfernt und die Platten dreimal in TBS-Tween^TM (0,5 M Tris pH 7,2; 1,5 M NaCl; 0,5% Tween^TM) gewaschen. Anti-Human-Antiserum der Ziege, die an alkalische Phosphatase gekoppelt waren, welche spezifisch entweder auf IgM (Fc) oder IgG (Fab) reagiert (Jackson Immuno Research Laboratories) wurde in PBS von pH 7,4 1:1000 verdünnt und in jede Vertiefung 100 μl der Lösung gegeben. Nach der Inkubation über einen Zeitraum von 30 Minuten bei 37°C wurden die Platten dreimal mit TBS-Tween^TM gewaschen und 100 μl einer Substrat-Lösung (5 mg p-Nitrophenylphosphat-Tabletten gelöst in 1 × Diethanolamin-Substratpuffer, um 2 mg/l Lösung zu erhalten – Kirkegaard Perry Laboratory) wurden jeder Vertiefung zugesetzt. Die Platten wurden über einen Zeitraum von 30 Minuten bei 37°C inkubiert und jeder Vertiefung dann 100 μl einer Stop-Lösung (5% EDTA) zugesetzt. An einem Mikroplatten-Leser (Dynatech) wurde die Extinktion bei 410 nm abgelesen. Eine Probe wurde als positiv angesehen, wenn sie eine mittlere Extinktion über dem Mittelwert der Negativkontrollen plus drei Standardabweichungen aufwies. Die Kreuzreaktivität wurde gegen Serum von Patienten mit Syphilis, systemischem Lupus erythematosus, rheumatischer Arthritis und sowohl endemischen als auch nicht endemischen Feldarbeitern gemessen.
Unter Einsatz des oben beschriebenen ELISA-Tests wurde Serum von verschiedenen Patienten untersucht. Patienten mit akuter Erythema migrans (EMA) wiesen frühe lokalisierte Infektionen auf, welche typisch sind für das Vorkommen von gut definierter Erythema migrans (EM) bei Patienten aus einem endemischen Bereich. Patienten mit einer frühen Dissemination (EA) sind akut disseminierte (AcD) Infektionen, welche sich durch EM und eines der folgenden Symptome auszeichnen: zusätzliche EM-Verletzungen, AV-Blockade, neurologische Anomalitäten (z.B. Paralyse des 7. Nervs) oder Meningitis. Patienten mit akuter Konvaleszenz (AcC) wurden aus denselben Patienten erhalten wie EA und AcD zwei bis vier Wochen später. Serum wurde auch aus der CDC aus Patienten mit gut dokumentierter Syphilis (S) untersucht, das Serum wurde auch von SUNY in Stone Brook, Division of Rheumatology aus Patienten mit gut dokumentiertem systemischem Lupus erythematosus (SLE) oder von Patienten mit gut dokumentierter rheumatischer Arthritis (RA) erhalten. Die Seren von endemischen Feldarbeitern (End) wurden von im Freien arbeitenden Arbeitern aus Long Island erhalten, das für die Lyme-Krankheit endemisch ist. Nicht endemische Seren (Nend) wurden von im Freien arbeitenden Arbeitern aus Arizona erhalten, das für die Lyme-Krankheit nicht endemisch ist. Zusätzlich wurde das Serum von endemischen Feldarbeitern (End) und nicht endemischen Feldarbeitern (NEnd) untersucht. Die Polypeptide der vorliegenden Erfindung wurden eingesetzt, um diese verschiedenen in 8 zusammengefassten Seren zu untersuchen. Tabelle V

¹ C1–C12 sind Gene/Proteine mit einem Lipidierungssignal
² C2C10 und andere Verbindungsnamen mit C beziehen sich auf chimäre OspC-Proteine, wobei wie hier beschrieben der N-terminale Abschnitt der Chimäre von einem ersten OspC-Allel stammt und der C-terminale Abschnitt des chimären Moleküls von einem zweiten OspC-Allel stammt. Die Polypeptide waren nicht lipidiert.

BEISPIEL 4: IMMUNISIERUNG VON MÄUSEN MIT CHIMÄREN OSPC-PROTEINEN ALS IMMUNOGEN
Vier bis fünf Wochen alte weibliche BALB/c-Mäuse wurden mit 5 μg chimären OspC-Proteinen in 100 μl Aluminiumhydroxid-Adjuvans mittels subkutaner Injektion (SC) immunisiert. Für jede Gruppe wurden 5 Mäuse eingesetzt. Zur negativen Kontrolle wurden 5 weibliche BALB/c-Mäuse mit 100 μl Aluminiumhydroxid-Adjuvans allein immunisiert. Zwei Wochen nach der Immunisierung erhielten die Mäuse eine Booster-Dosis mit demselben Antigen und zwei Wochen danach wurde eine gleiche Boosterdosis verabreicht. Eine Woche nach jeder Booster-Dosis wurde jeder Maus (einschließlich der negativen Kontrollen) Blut entnommen und unter Einsatz des oben beschriebenen ELISA-Verfahrens das Serum auf das Vorkommen der entsprechenden chimären Anti-OspC-Protein-Antikörper hin untersucht.
Die Mäuse wurden mit chimären Proteinen wie in der folgenden Tabelle VI immunisiert. TABELLE VI

¹ "Lip" bedeutet ein lipidiertes N-terminales Ende, LipCB31 ist das OspC-Protein von B. burgdorferi Stamm B31.
² Die Zahl unmittelbar nach "C" betrifft, wie hier beschrieben, das besondere Allel von OspC.
³ "Unlip" bedeutet die nicht lipidierte Form des N-terminalen Endes.

Einige Typen von einzelnen OspCs aus B. burgdorferi sensu stricto, OspCB31, OspC2, OspC3, OspC7, OspC10, OspC12 und ein einzelnes OdpC aus B. afzelii, Ctro, wurden in einem ELISA-Test als Antigene verwendet, um das aus den immunisierten Mäusen gewonnene Serum zu untersuchen. Wie in den 2 und 3 gezeigt, lösten UnlipC2C10 und UnlipC2C12 nach der ersten bzw. zweiten Blutentnahme eine Immunantwort in Form von Antikörpern aus (humorale Antwort) gegen ein breites Spektrum von OspC-Familien aus. Das Serum von mit UnlipC2C10, UnlipC2C12, LipCB31 und LipC12 immunisierten Mäusen wurde sodann verwendet, um gegen einzelne OspC-Polypeptide aus verschiedenen Stämmen der drei Borrelia-Gen-Hauptspezies Borrelia burgdorferi, Borrelia afzelii und Borrelia garinii zu testen.
Wie in 4 gezeigt, wurden unterschiedliche Stämme von B. burgdorferi sensu stricto (B.b.s.s.) auf ihre Reaktivität mit den oben beschriebenen Seren getestet. Die Seren aus mit sowohl LipCB31 als auch LipC12 immunisierten Mäusen, welche die Goldstandard dieses Experiments waren, wiesen 12/13 der B.b.s.s. Stämme nach. Die Seren aus mit nicht lipidiertem C2C12 immunisierten Mäusen wiesen 8/13 der untersuchten Stämme nach. Die Verwendung der nicht lipidierten Formen dieser Proteine als Impfstoff Immunogene oder diagnostische Antigene ist erwünscht, weil die Produktausbeute durch den Expressionsvektor viel größer ist sich die Protein viel leichter reinigen lassen. Diese beiden Gründe allein machten die Produktion dieser Proteine weniger teuer.
Wie in 5 gezeigt, lösten die chimären Proteine UnlipC2C10 und UnlipC2C12 der vorliegenden Erfindung eine Immunantwort aus, die 5/6 und 6/6 der getesteten Stämme nachwies, im Vergleich mit den die Goldstandard darstellenden lipidierten Proteinen LipC12 und LipCB31, die 5/6 bzw. 3/6 der Stämme nachwiesen. Bei einem Vergleich mit dem elterlichen nicht lipidierten OspC2 (rOspC2) lösten die chimären Proteine UnlipC2C10 und UnlipC2C12 eine Immunantwort aus und wiesen mehr Stämme nach als der Goldstandard ((0/6) gegenüber (5/6) bzw. (6/6)). Dieses Ergebnis war nicht vorhergesehen und unerwartet.
Wie in den 6 und 7 gezeigt, lösten in einem anderen Experiment die chimären Proteine der vorliegenden Erfindung eine signifikante Immunantwort quer durch alle 18 unterschiedlichen Stämme von B. afzelii (6) und alle 21 unterschiedlichen Stämme von B. garinii (7) aus. Die Chimären UnlipC2C10 bzw. UnlipC2C12 wiesen z.B. 12 bzw 18 der 18 Stämme von B. afzelii nach, im Vergleich zu 0/18, die von dem elterlichen nicht lipidierten C2 nachgewiesen wurden. Die gleichen Chimären wiesen 14 bzw. 20 der 21 Stämme von B. garinii nach, im Vergleich zu 0/21, die von dem elterlichen nicht lipidierten C2 nachgewiesen wurden. Ferner wiesen die Goldstandards LipCB31 bzw. LipC12 2 bzw. 17 der 18 Stämme von B. afzelii nach und 2 bzw. 15 der 21 Stämme von B. garinii. Diese Ergebnisse zeigen, dass, anders als bei LipOspCB31, LipOspC12 und UnlipOspC2, die als Immunogen verwendeten nicht lipidiertes C2C10 und nicht lipidiertes C2C12 eine signifikante Immunantwort quer durch alle die getesteten unterschiedlichen Stämme von B. burgdorferi, B. afzelii und B. garinii auslösten.
Es wurden zusätzliche Chimären konstruiert und in Tabelle VII zusammengestellt. TABELLE VII OspC-Polypeptide und chimäre Polypeptide der vorliegenden Erfindung

¹Unlip bedeutet, dass das Polypeptid nicht lipidiert ist.
²Eine OspC-Chimäre aus 3 OspC-Polypeptiden
³Blip bedeutet, dass das Polypeptid wegen des Gens mit dem OspB-Lipidierungssignal am N-terminalen Ende lipidiert ist.

SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Impfstoff-Zusammensetzung umfassend einen oder mehrere Hilfsstoffe, Zusätze, Puffer, Trägerproteine oder Konservierungsmittel, oder eine Kombination davon, und ein immunogenes Mittel, wobei das immunogene Mittel aus einem oder mehreren OspC-Polypeptiden von jeder der Borrelia burgdorferi OspC-Familien besteht, die aus den Gruppen ausgewählt werden, die aus: A, B, I und K bestehen, wobei die Borrelia burgdorferi OspC-Familie A durch die GenBank-Zugangsnummer AF029860 gekennzeichnet ist, und dass ospC-Gene wenigstens 98% Identität mit der GenBank-Zugangsnummer AF029860 aufweisen, die Borrelia burgdorferi OspC-Familie B durch die GenBank-Zugangsnummer AF029861 gekennzeichnet ist, und dass ospC-Gene wenigstens 98% Identität mit der Gen-Bank-Zugangsnummer AF029861 aufweisen, die Borrelia burgdorferi OspC-Familie I durch die GenBank-Zugangsnummer AF029869 gekennzeichnet ist, und dass ospC-Gene wenigstens 98% Identität mit der GenBank-Zugangsnummer AF029869 aufweisen, und die Borrelia burgdorferi OspC-Familie K durch die GenBank-Zugangsnummer U08284 gekennzeichnet ist, und dass ospC-Gene wenigstens 98% Identität mit der GenBank-Zugangsnummer U08284 aufweisen.
Zusammensetzung von Anspruch 1, (a) wobei dieses OspC-Polypeptid die OspC-Protein variable Region umfasst, die von den Nukleotiden 150–519 eines ospC-Gens kodiert wird; oder (b) wobei dieses OspC-Polypeptid von einer Nukleinsäure kodiert wird, umfassend Nukleotid 26 bis etwa Nukleotid 621 eines ospC-Gens, oder (c) wobei dieses OspC-Polypeptid von einer Nukleinsäure kodiert wird, umfassend Nukleotid 53 bis Nukleotid 570 eines ospC-Gens; oder (d) wobei wenigstens zwei dieser OspC-Polypeptide zusammen in einem einzigen Protein fusioniert sind, das von einer einzigen Nukleinsäure kodiert wird, wobei Polypeptide in diesem Fusionsprotein nicht in der gleichen Anordnung in einem natürlich vorkommenden OspC-Protein gefunden werden.
Zusammensetzung von Anspruch 2, wobei (a) die Borrelia burgdorferi OspC-Familie A die Stämme B31, CA4, HII, IPI, IP2, IP3, L5, PIF, Pka, Txgw und Stämme, die das ospC-Allel OC1 enthalten, umfasst; oder (b) die Borrelia burgdorferi OspC-Familie B die Stämme 35B808, 61BV3, BUR, DK7, PB3, ZS7 und Stämme, die die ospC-Gene OC2 und OC3 enthalten, umfasst; oder (c) die Borrelia burgdorferi OspC-Familie I den Stamm HB19, Stämme, die das ospC-Gen OC10 enthalten, und GenBank-Zugangsnummer L42893 umfasst; oder (d) die Borrelia burgdorferi OspC-Familie K die Stämme 272, 28354, KIPP, MUL, Stämme, die das ospC-Gen O12C und OC13 enthalten, und Gen-Bank-Zugangsnummer U08284 umfasst.
Verwendung einer Zusammensetzung für die Herstellung eines Medikaments zur Immunisierung eines Tieres gegen die disseminierte Lyme-Krankheit, wobei diese Zusammensetzung einen oder mehrere Hilfsstoffe, Zusätze, Puffer, Trägerproteine oder Konservierungsmittel, oder eine Kombination davon, und ein immunogenes Mittel umfasst, wobei das immunogene Mittel aus einem oder mehreren OspC-Polypeptiden von jeder der Borrelia burgdorferi OspC-Familien besteht, die aus der Gruppe ausgewählt werden, die aus A, B, I und K besteht, wobei die Borrelia burgdorferi OspC-Familie A durch die GenBank-Zugangsnummer AF029860 gekennzeichnet ist, und dass ospC-Gene wenigstens 98% Identität mit der GenBank-Zugangsnummer AF029860 aufweisen, die Borrelia burgdorferi OspC-Familie B durch die GenBank-Zugangsnummer AF029861 gekennzeichnet ist, und dass ospC-Gene wenigstens 98% Identität mit der GenBank-Zugangsnummer AF029861 aufweisen, die Borrelia burgdorferi OspC-Familie I durch die Gen-Bank-Zugangsnummer AF029869 gekennzeichnet ist, und dass ospC-Gene wenigstens 98% Identität mit der GenBank-Zugangsnummer AF029869 aufweisen, und die Borrelia burgdorferi OspC-Familie K durch die GenBank-Zugangsnummer U08284 gekennzeichnet ist, und ospC-Gene wenigstens 98% Identität mit der GenBank-Zugangsnummer U08284 aufweisen, so dass das Tier eine Immunantwort gegen die OspC-Polypeptide generiert.
Verwendung von Anspruch 4, wobei (a) ein oder mehrere dieser OspC-Polypeptide die OspC-Protein variable Region umfassen, die von den Nukleotiden 150–519 eines ospC-Gens kodiert wird; oder (b) ein oder mehrere dieser OspC-Polypeptide von einer Nukleinsäure kodiert werden, umfassend Nukleotid 26 bis Nukleotid 621 eines ospC-Gens; oder (c) ein oder mehrere dieses OspC-Polypeptids oder Fragments davon von einer Nukleinsäure kodiert wird, umfassend Nukleotid 53 bis Nukleotid 570 eines ospC-Gens; oder (d) wenigstens zwei dieser OspC-Polypeptide zusammen in einem einzigen Protein fusioniert sind, das von einer einzigen Nukleinsäure kodiert wird, wobei Polypeptide in diesem Fusionsprotein nicht in der gleichen Anordnung in einem natürlich vorkommenden OspC-Protein gefunden werden.
Verwendung nach einem der Ansprüche 4–5, wobei (a) die Borrelia burgdorferi OspC-Familie A die Stämme B31, CA4, HII, IPI, IP2, IP3, L5, PIF, Pka, Txgw und Stämme, die das ospC-Allel OC1 enthalten, umfasst; oder (b) die Borrelia burgdordferi OspC-Familie B die Stämme 35B808, 61BV3, BUR, DK7, PB3, ZS7 und Stämme, die die ospC-Gene OC2 und OC3 enthalten, umfasst; oder (c) die Borrelia burgdorferi OspC-Familie I den Stamm HB19, Stämme, die das ospC-Gen OC10 enthalten, und GenBank-Zugangsnummer L42893 umfasst; oder (d) die Borrelia burgdorferi OspC-Familie K die Stämme 272, 28354, KIPP, MUL, Stämme, die das ospC-Gen OC12 und OC13 enthalten, und Gen-Bank-Zugangsnummer U08284 umfasst.
Verfahren zur Detektion einer Immunantwort gegenüber Borrelia, assoziiert mit disseminierter Lyme-Krankheit, in einer Wirtprobe, wobei man: a) die Wirtprobe mit einer Zusammensetzung, die OpsC-Polypeptide von mit disseminierter Lyme-Krankheit assoziierten Stämmen von Borrelia umfasst, in Kontakt bringt, so dass anti-OspC-Antikörper, falls in dieser Probe vor handen, an diese OspC-Polypeptide binden, wobei diese Zusammensetzung aus einem oder mehreren OspC-Polypeptiden von jeder der Borrelia burgdorferi OspC-Familien besteht, die aus der Gruppe ausgewählt werden, die aus A, B, I und K besteht, wobei die Borrelia burgdorferi OspC-Familie A durch die GenBank-Zugangsnummer AF029860 gekennzeichnet ist, und dass ospC-Gene wenigstens 98% mit der GenBank-Zugangsnummer AF029860 aufweist, die Borrelia burgdorferi OspC-Familie B durch die GenBank-Zugangsnummer AF029861 gekennzeichnet ist, und dass ospC-Gene wenigstens 98% Identität mit der GenBank-Zugangsnummer AF029861 aufweisen, die Borrelia burgdorferi OspC-Familie I durch die GenBank-Zugangsnummer AF029869 gekennzeichnet ist, und dass ospC-Gene wenigstens 98% Identität mit der GenBank-Zugangsnummer AF029869 aufweisen, und die Borrelia burgdorferi OspC-Familie K durch die GenBank-Zugangsnummer U08284 gekennzeichnet ist, und dass ospC-Gene wenigstens 98% Identität mit der GenBank-Zugangsnummer U08284 aufweisen; und b) Antikörper, die diese OspC-Peptide gebunden haben, detektiert, wodurch man eine Immunantwort gegenüber Borrelia, assoziiert mit disseminierter Lyme-Krankheit, detektiert.
Verfahren von Anspruch 7, wobei (a) ein oder mehrere dieser OspC-Polypeptide die OspC-Protein variable Region umfassen, die von den Nukleotiden 150–519 eines ospC-Gens kodiert wird; oder (b) ein oder mehrere dieser OspC-Polypeptide von einer Nukleinsäure kodiert wird, umfassend Nukleotid 26 bis Nukleotid 621 eines ospC-Gens; oder (c) ein oder mehrere dieser OspC-Polypeptide von einer Nukleinsäure kodiert werden, umfassend Nukleotid 53 bis Nukleotid 570 eines ospC-Gens; oder (d) wenigstens zwei dieser OspC-Polypeptide zusammen in einem einzigen Protein fusioniert sind, das von einer einzigen Nukleinsäure kodiert wird, wobei die Polypeptide in diesem Fusionsprotein nicht in der gleichen Anordnung in einem natürlich vorkommenden OspC-Protein gefunden werden.
Verfahren von Anspruch 8, wobei (a) die Borrelia burgdorferi OspC-Familie A die Stämme B31, CA4, HII, IPI, IP2, IP3, L5, PIF, Pka, Txgw und Stämme, die das ospC-Allel OC1 enthalten, umfasst; oder (b) die Borrelia burgdorferi OspC-Familie B die Stämme 35B808, 61BV3, BUR, DK7, PB3, ZS7 und Stämme, die die ospC-Gene OC2 und OC3 enthalten, umfasst; oder (c) die Borrelia burgdorferi OspC-Familie I den Stamm HB19, Stämme, die das ospC-Gen OC10 enthalten, und die GenBank-Zugangsnummer L42893 umfasst; oder (d) die Borrelia burgdorferi OspC-Familie K die Stämme 272, 28354, KIPP, MUL, Stämme, die das ospC-Gen OC12 und OC13 enthalten, und die Gen-Bank-Zugangsnummer U08284 umfasst.
Chimäres Protein, bestehend aus OspC-Polypeptiden von jeder der OspC-Familien, die aus der Gruppe ausgewählt werden, die aus den Borrelia burgdorferi OspC-Familien A, B, I und K besteht, wobei die Borrelia burgdorferi OspC-Familie A durch die GenBank-Zugangsnummer AF029860 gekennzeichnet ist, und dass ospC-Gene wenigstens 98% Identität mit der GenBank-Zugangsnummer AF029860 aufweisen, die Borrelia burgdorferi OspC-Familie B durch die Gen-Bank-Zugangsnummer AF029861 gekennzeichnet ist, und dass ospC-Gene wenigstens 98% Identität mit der GenBank-Zugangsnummer AF029861 aufweisen, die Borrelia burgdorferi OspC-Familie I durch die GenBank-Zugangsnummer AF029869 gekennzeichnet ist, und dass ospC-Gene wenigstens 98% Identität mit der GenBank-Zugangsnummer AF029869 aufweisen, die Borrelia burgdorferi OspC-Familie K durch die GenBank-Zugangsnummer U08284 gekennzeichnet ist, und dass ospC-Gene wenigstens 98% Identität mit der GenBank-Zugangsnummer U08284 aufweisen.
Chimäres Protein von Anspruch 10, umfassend: a) ein erstes OspC-Polypeptid, das von einer Nukleinsäure kodiert wird, die eine Sequenz von Nukleotid 26 bis Nukleotid 621 eines ospC-Gens von einer ersten OspC-Familie umfasst, und ein zweites OspC-Polypeptid, das von einer Nukleinsäure kodiert wird, die eine Sequenz von Nukleotid 28 bis Nukleotid 570 eines ospC-Gens von einer zweiten OspC-Familie umfasst; oder b) ein erstes OspC-Polypeptid, das von einer Nukleinsäure kodiert wird, die eine Sequenz von Nukleotid 53 bis Nukleotid 570 eines ospC-Gens von einer ersten OspC-Familie umfasst, und ein zweites OspC-Polypeptid, das von einer Nukleinsäure kodiert wird, die eine Sequenz von Nukleotid 28 bis Nukleotid 570 eines ospC-Gens von einer zweiten OspC-Familie umfasst.
Chimäres Protein von Anspruch 10 oder 11, wobei dieses Protein nicht lipidiert ist.
Chimäres OspC-Protein, das aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus den SEQ ID Nos: 24, 26, 28, 30, 34, 36, 42, 52, 54, 58, 60, 64, 66, 70, 72, 78, 80, 82, 84 und 86 besteht.
Isolierte Nukleinsäure, die für ein chimäres Protein kodiert, wobei dieses Protein aus OspC-Polypeptiden von jeder der OspC-Familien besteht, die aus der Gruppe ausgewählt werden, die aus den Borrelia burgdorferi OspC-Familien A, B, I und K besteht, wobei die Borrelia burgdorferi OspC-Familie A durch die GenBank-Zugangsnummer AF029860 gekennzeichnet ist, und dass ospC-Gene wenigstens 98% Identität mit der GenBank-Zugangsnummer AF029860 aufweisen, die Borrelia burgdorferi OspC-Familie B durch die GenBank-Zugangsnummer AF029861 gekennzeichnet ist, und dass ospC-Gene wenigstens 98% Identität mit der Gen-Bank-Zugangsnummer AF029861 aufweisen, die Borrelia burgdorferi OspC-Familie I durch die GenBank-Zugangsnummer AF029869 gekennzeichnet ist, und dass ospC-Gene wenigstens 98% Identität mit der GenBank-Zugangsnummer AF029869 aufweisen, und die Borrelia burgdorferi OspC-Familie K durch die GenBank-Zugangsnummer U08284 gekennzeichnet ist, und dass ospC-Gene wenigstens 98% Identität mit der GenBank-Zugangsnummer U08284 aufweisen.
Isolierte Nukleinsäure von Anspruch 14, wobei: a) diese Nukleinsäure eine Sequenz von Nukleotid 26 bis Nukleotid 621 eines ospC-Gens von einer ersten OspC-Familie und eine Sequenz von Nukleotid 28 bis Nukleotid 570 eines ospC-Gens von einer zweiten OspC-Familie umfasst; oder b) diese Nukleinsäure eine Sequenz von Nukleotid 53 bis Nukleotid 570 eines ospC-Gens von einer ersten OspC-Familie und eine Nukleinsäure, umfassend eine Sequenz von Nukleotid 28 bis Nukleotid 570 eines ospC-Gens von einer zweiten OspC-Familie, umfasst.
Isolierte Nukleinsäure, die aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus den SEQ ID Nos: 23, 25, 27, 29, 33, 35, 51, 53, 59, 63, 65, 69, 77, 79, 81, 83 und 85 besteht.
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1, 2 und 3 zur Verwendung in der Therapie, zum Beispiel der Therapie von disseminierter Lyme-Krankheit.