DE3781509T2

DE3781509T2 - Stabilisierte zusammensetzungen mit gehalt an egf.

Info

Publication number: DE3781509T2
Application number: DE8787309748T
Authority: DE
Inventors: Amy L Finkenaur
Original assignee: Ethicon Inc
Current assignee: Ethicon Inc
Priority date: 1986-11-05
Filing date: 1987-11-04
Publication date: 1993-01-07
Anticipated expiration: 2007-11-05
Also published as: SG104292G; MX171861B; EP0267015A2; NZ235556A; ES2044952T3; JPS63152324A; DK579787D0; NZ222413A; JPH10167980A; PT86075B; DE3781509D1; GR871700B; CA1322328C; PT86075A; KR880005935A; AU614941B2; JP2942227B2; JPH11255663A; AU8064187A; EP0267015B1

Description

Die Erfindung betrifft ein Mittel zum Stabilisieren von Zusammensetzungen, die Polypeptide enthalten, und insbesondere Polypeptid-Wachstumsfaktoren, wie den Epidermis-Wachstumsfaktor.
Der Human-Epidermis-Wachstumsfaktor (EGF) ist ein Polypeptid-Wachstumsfaktor mit 53 Aminosäuren, der eine mitogenetische Aktivität für eine Anzahl von Zellarten hat, einschließlich Epithel- und Mesenchym-Zellen. Varianten des Human-EGF-Polypeptids sind beschrieben worden, wie das Gamma-Urogastron mit 52 Aminosäuren. Der Epidermis- Wachstumsfaktor zeigt eine das Hautwachstum fördernde Wirkung und eine die Sekretion von Magensäure hemmende Aktivität und ist deshalb als Medikament geeignet. Es wurde festgestellt, daß der Epidermis-Wachstumsfaktor die biologische Aktivität in Gegenwart von Feuchtigkeit verliert. Das ist ungünstig, da ein derartiger Aktivitätsverlust es verhindert, daß wäßrige Präparate des Epidermis-Wachstumsfaktors längere Zeit gelagert werden können. Diese Erfindung stellt ein Mittel zur Verminderung des Aktivitätsverlustes von Polypeptid-Wachstumsfaktoren zur Verfügung, einschließlich des Epidermis- Wachstumsfaktors, in Gegenwart von Feuchtigkeit.
Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zum Stabilisieren medizinischer Zusammensetzungen zur Verfügung, die Wachstumsfaktoren gegen den Verlust der biologischen Aktivität in Gegenwart von Feuchtigkeit enthalten. Das Verfahren umfaßt das Einbringen eines wasserlöslichen Cellulose-Polymers in die genannten Zusammensetzungen.
Die Verwendung von pharmazeutischen und chemischen Zusammensetzungen, die Cellulose-Derivate enthalten, ist beschrieben worden. So beschreibt beispielsweise Errede et al. in US-Patent Nr. 4 373 519 einen Wundverband, der ein Absorptionsmittel, wie ein Cellulose-Material einschließt, (das Carboxymethyl-cellulose sein kann), wobei der Wundverband verschiedene Medikamente, wie den Epidermis- Wachstumsfaktor, enthalten kann.
Hess et al., in US-Patent Nr. 3 923 599, beschreibt Pflanzenenzym-Zusammensetzungen, die ein Cellulose-Derivat enthalten können. Straub, in US-Patent Nr. 3 927 209, beschreibt eine Para-Influenza-3-Virus-Zusammensetzung, die Methyl-Cellulose als Dispergiermittel enthalten kann. Dworschack et al., in US-Patent Nr. 3 933 588, beschreibt Enzyme, die auf einem Cellulose-Derivat (DEAE-Cellulose) immobilisiert sind, das eine quartäre Ammonium-Verbindung als Stabilisator enthält. Diehl et al., in US-Patent Nr. 4 011 169, beschreibt eine ein Enzym enthaltende Reinigungs- Zusammensetzung, die eine aminierte Stärke oder Cellulose als Stabilisator enthält.
Die EP-A-0 193 917 beschreibt Zusammensetzungen von wasserlöslichen/dispergierbaren Kohlenhydrat-Polymeren und biologisch aktiven Wachstumshormon-Makromolekülen. Derartige Zusammensetzungen werden Tieren parentaral verabreicht.
Straub, in US-Patent Nr. 4 188 375, beschreibt wäßrige Impfstoff-Präparate, die Methylcellulose als Dispergier- Mittel enthalten können. "Polysaccharide" werden als "Stabilisatoren" beschrieben, es wird jedoch nicht gesagt, für welches Instabilitätsproblem die Stabilisatoren zugegeben werden.
Die GB-A-2 160 528 beschreibt die Stabilisierung von proteinartigen biologisch aktiven Substanzen (z.B Lymphokin und Peptid-Hormon) in einem trockenen Feststoff durch die Anwesenheit eines Polysaccharids, das aus sich wiederholenden Maltotriose-Einheiten besteht.
Akagi et al. beschreibt in der EP-A-0 150 067 Gamma- Interferon, das mit Dextran oder Hydroxyethylstärke stabilisiert ist.
Jacobsen et al., in US-Patent Nr. 4 540 506, beschreibt Enzyme enthaltende Abfluß-Reinigungs-Zusammensetzungen, die Hydroxyethyl-cellulose als Eindickmittel enthalten können.
Arakawa und Timasheff in Biochemistry 1982, Band 21, Seiten 6536 - 6544, beschreiben die Verwendung von Zuckern zur Stabilisierung von Proteinen in wäßrigen Medien. K. Gekko et al. in J. Biochem (1981), Band 90, Seiten 30 - 60, beschreibt, daß Zucker-Alkohole, wie Glycerin, Sorbit und Mannit, Stabilisierungsmittel für Proteine sind.
Die EP-A-140 998 beschreibt eine Zusammensetzung zur ophthalmologischen Anwendung, die einen Human-Epidermis- Wachstumsfaktor und ein Verdünnungsmittel, wie eine Pufferlösung oder eine Salbengrundlage enthält. Die Zusammensetzung wird als wirksam zur Heilung von Keratitis, Hornhaut-Erosion, Hornhaut-Infiltration oder Hornhaut- Geschwüren beschrieben.

Zusammenfassung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung stellt eine wäßrige medizinische Zusammensetzung zur Verfügung, die einen spezifischen Polypeptid-Wachstumsfaktor und ein wasserlösliches Cellulose-Polymer enthält, ausreichend, um den Polypeptid-Wachstumsfaktor gegen den Verlust der biologischen Aktivität zu stabilisieren. In einer bevorzugten Ausführungsform ist der Wachstumsfaktor der Epidermis- Wachstumsfaktor. Ein Verfahren zum Stabilisieren einer wäßrigen medizinischen Zusammensetzung, die einen spezifischen Polypeptid-Wachstumsfaktor als Wirkstoff enthält, umfaßt das Einbringen in die Zusammensetzung einer Menge eines wasserlöslichen Cellulose-Polymers, die ausreicht, um den Wachstumsfaktor gegen den Verlust der biologischen Aktivität in Gegenwart von Wasser zu stabilisieren.

Eingehende Beschreibung der Erfindung

Die Erfindung liegt in der Bereitstellung von stabilisierenden Zusammensetzungen, die Polypeptid- Wachstumsfaktoren, vorzugsweise den Human-Epidermis- Wachstumsfaktor (hEGF) enthalten. Der Epidermis- Wachstumsfaktor (EGF) und der hEGF sind bekannte Zusammensetzungen, die entweder aus natürlichen Quellen isoliert oder unter Verwendung von rekombinanten DNA- Verfahren hergestellt werden. Die folgenden Dokumente beschreiben den Epidermis-Wachstumsfaktor hEGF und/oder Verfahren zu seiner Isolierung aus natürlichen Quellen oder zu seiner Herstellung durch rDNA-Verfahren:
Camble et al., US-Patent Nr. 3,917,824
Cohen et al., US-Patent Nr. 3,948,875
Nishimura et al., US-Patent Nr. 4,528,186
Bell, veröffentlichte PCT-Patent-Anmeldung WO 85/00369
Urdea et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Band 80, Seiten 7461 - 7465 (1983)
Hollenberg, "Epidermal Growth Factor-Urogastrone, A Polypeptide Acquiring Hormonal Status", Acad. Press, Inc., N.Y. (1979) Seiten 90-132
Carpenter, "Epidermal Growth Factor" in: Handbook of Experimental Pharmacology, Vol. 57, Baserga, ed.
Lawn et al., "Cell" (1978) Band 15, Seiten 1157 - 1174
Savage et al., "J. Biol. Chem." (1972) Band 247, Seiten 7612 - 7621.
Wie in dieser Anmeldung verwendet, soll "Epidermis- Wachstumsfaktor" die Klasse von Polypeptiden einschließen, die eine biologische Aktivität haben, die der ähnlich ist, die das natürliche Human-Epidermis-Wachstumsfaktor- Polypeptid aufweist, wie sie in bekannten biologischen Versuchen bestimmt wird. Der weiter unten beschriebene Versuch zum Binden des EGF-Rezeptors ist dafür geeignet. Diese Polypeptide haben bestimmte noch erhaltene Aminosäure-Reste und gemeinsame Stellungen der Disulfid- Bindungen, wie von Carpenter et al. in "Epidermal Growth Factor, Its Receptor, and Related Proteins", Experimental Cell Research (1986), Band 164, Seiten 1 - 10, beschrieben. D.h., "Epidermis-Wachstumsfaktor" schließt den hEGF ein, der durch rekombinante DNA-Verfahren hergestellt wird, wie von Bell in der o.g. Literaturstelle beschrieben, den Mäuse-EGF ("mEGF"), der aus den Unterkiefer-Drüsen von Mäusen isoliert wird (siehe z.B. Cohen et al. in der o.g. Literaturstelle), Ratten-EGF und den natürlichen Human- Epidermis-Wachstumsfaktor, der aus Human-Urin, wie von Nishimura et al. in der o.g. Literaturstelle beschrieben, isoliert werden kann, und biologisch aktive Derivate und verwandte Polypeptide von irgendeinem der vorstehenden Faktoren, einschließlich der Vorstufen, die in situ in den aktiven Epidermis-Wachstums faktor durch proteolytische Verfahren umgewandelt werden können. Der Human-Epidermis- Wachstumsfaktor, einschließlich des durch rekombinante DNA- Verfahren hergestellten hEGF, wird für die erfindungsgemäße Verwendung bevorzugt.
Der Umwandlungs-Wachstumsfaktor-alpha (TGF-α), ein Polypeptide mit 50 Aminosäuren, und der Kuhpockenvirus- Wachstumsfaktor (VGF), ein Polypeptide mit 140 Aminosäuren, sind beide mitogenetisch und im wesentlichen sequenzhomolog zum Epidermis-Wachstumsfaktor, und alle drei scheinen sich an einen gemeinsamen Tyrosin-Kinase-Rezeptor zu binden und ihn zu aktivieren. Wegen ihrer Polypeptid- Natur, ihrer mitogenetischen Aktivität und der im wesentlichen Sequenz-Homologie zwischen diesen Molekülen wird angenommen, daß TGF-α und VGF auch in der Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung stabilisiert werden können. Zusätzlich werden die folgenden Polypeptid- Wachstumsfaktoren, die mitogenetische Aktivität haben, auch in der Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung stabilisiert. Dies sind: der basische Fibroblasten- Wachstumsfaktor (b-FGF), der saure Fibroblasten- Wachstumsfaktor (a-FGF), der Umwandlungs-Wachstumsfaktorbeta (TGF-B), Angiogenin, der Nerven-Wachstumsfaktor (NGF), der insulin-ähnliche Wachstumsfaktor-I (IGF-I), der insulin-ähnliche Wachstumsfaktor-II (IGF-II) und der von Blutplättchen abgeleitete Wachstumsfaktor (PDGF). Die Fibroblasten-Wachstumsfaktoren und Angiogenin sowie die Umwandlungs-Wachstumsfaktoren und der Epidermis- Wachstumsfaktor haben auch gefäßbildende Aktivität. Es wird bevorzugt, den Wachstumsfaktor durch rekombinante DNA- Verfahren herzustellen. Wie hier verwendet, schließt der Ausdruck "Wachstumsfaktor" nicht die sog. blutbildenden Wachstumsfaktoren ein, wie Erythropoietin und die Keimzellen stimulierenden Faktoren.
Die Cellulose-Stabilisatoren, die in der Erfindung verwendet werden, sind wasserlösliche veretherte Cellulose- Derivate, wie Alkyl-cellulosen, Hydroxyalkyl-cellulosen und Alkyl-hydroxyalkyl-cellulosen, z.B. Methyl-cellulose, Hydroxyethyl-cellulose, Carboxymethyl-cellulose, Hydroxypropyl-methyl-cellulose und Hydroxypropyl-cellulose. Methyl-cellulose und die Hydroxyalkyl-cellulose-Derivate, wie Hydroxypropyl-cellulose, Hydroxyethyl-cellulose und Hydroxypropyl-methyl-cellulose, werden bevorzugt.
Die Löslichkeit der Cellulose-Derivate wird durch den Substitutionsgrad (D.S.) der Ether-Gruppen bestimmt, und die in der vorliegenden Erfindung geeigneten stabilisierenden Derivate sollten eine ausreichende Menge an derartigen Ether-Gruppen je Anhydroglucose-Einheit in der Cellulose-Kette haben, um die Derivate wasserlöslich zu machen. Ein Ether-Substitutionsgrad (D.S.) von mindestens 0,35 Ether-Gruppen pro Anhydroglucose-Einheit ist im allgemeinen ausreichend. Außerdem können die Cellulose- Derivate in der Form von Alkalimetallsalzen, z.B. den Li-, Na-, K- oder Cs-Salze, vorliegen.
Die stabilisierenden Zusammensetzungen und die Formulierungen der vorliegenden Erfindung zur ophthalmologischen Anwendung können andere Polypeptid- Wachstumsfaktoren im Gemisch mit dem EGF enthalten. Insbesondere kann der EGF mit einem oder mehreren der folgenden Faktoren kombiniert sein: basischer Fibroblasten- Wachstumsfaktor, saurer Fibroblasten-Wachstumsfaktor, Umwandlungs-Wachstumsfaktor-beta, Umwandlungs-Wachstumsfaktor-alpha, Kuhpocken-Wachstumsfaktor, Angiogenin, Nerven-Wachstumsfaktor, insulin-ähnlicher Wachstumsfaktor und von Blutplättchen abgeleiteter Wachstumsfaktor.
Die Zusammensetzungen, die gemäß der Erfindung stabilisiert werden, sind Zusammensetzungen, die einen Polypeptid- Wachstumsfaktor, wie EGF, in einer wäßrigen medizinischen Zusammensetzung enthalten, wie einem Gel, einer Lösung, einer Suspension oder Dispersion, in der eine wirkungsvolle Menge des wasserlöslichen Cellulose-Polymers gelöst ist. Die genaue Menge des in spezifischen Fällen zu verwendenden Cellulose-Polymers kann in Abhängigkeit von Faktoren schwanken, wie der Gegenwart oder dem Fehlen von anderen Materialien in der Formulierung, der spezifischen Natur des besonderen verwendeten Wachstumsfaktors, der Konzentration des Wachstumsfaktors und der Art der Formulierung.
Angegeben in Bezug auf eine wäßrige Formulierung, die EGF und ein Cellulose-Derivat enthält (entweder als Anfangsformulierung oder als Formulierung, die nach der Entwässerung wieder hergestellt worden ist), beträgt die wirkungsvolle Menge des Cellulose-Derivats gewöhnlich mindestens 0,05 Gew.-%, bezogen auf das Gewicht der gesamten Zusammensetzung. Die verwendete Höchstmenge ist überhaupt nicht kritisch und wird zum Teil durch die Art der Formulierung bestimmt. So wird beispielsweise in einer wäßrigen Augentropfen-Formulierung eine Menge des Cellulose-Derivats im Bereich von etwa 0,05 bis etwa 3 Gew.-% verwendet. In einem Gel, in dem eine relativ kleine Menge an Wasser verwendet werden könnte, kann das Cellulose-Derivat den Hauptbestandteil der Formulierung, in einigen Fällen soviel wie z.B. etwa 90 Gew.-% der Formulierung, darstellen. Bevorzugt wird, wenn das Cellulose-Derivat in einer Gel-Formulierung im Bereich von 1 - 20 Gew.-% liegt. Der wesentliche Punkt ist, wenigstens die Mindestmenge an Cellulose-Derivat, das eine stabilisierende Wirkung hat, zu verwenden.
Die stabilisierenden Zusammensetzungen der Erfindung sind geeignet in Augentropfen-Formulierungen, in Salben für die Wundheilung, in Gel-Formulierungen, in Schäumen u. dgl. In den stabilisierenden Zusammensetzungen der Erfindung können zusätzliche Materialien, wie Puffer, Konservierungsmittel, den Tonus einstellende Mittel, Antioxidantien, andere Polymere (die z.B. zur Einstellung der Viskosität oder als Streckungsmittel) und Hilfsstoffe verwendet werden. Spezifische Beispiele derartiger anderer Materialien sind Phosphat-, Citrat- oder Borat-Puffer, Thiomersal, Sorbinsäure, Methyl- oder Propyl-Paraben und Chlorbutanol- Konservierungsmittel, Natriumchlorid und/oder Zucker zur Einstellung des Tonus, Polyvinylalkohol, Poly(acrylsäure) oder Salze davon, Polyvinyl-pyrrolidon, Mannit, Lactose, Saccharose und Ethylendiamin-tetra-essigsäure.
Die Konzentration des Wachstumsfaktors in der stabilisierenden Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung ist eine die Wundheilung fördernde Menge, die im Bereich von etwa 0,01 bis etwa 1000 ug/ml der wäßrigen Formulierung liegt (d.h. entweder der ursprünglichen wäßrigen Formulierung oder einer Formulierung, die nach der Entwässerung wieder hergestellt worden ist). Die Konzentration des Wachstumsfaktors beträgt vorzugsweise 1 - 500 ug/ml und liegt bevorzugter im Bereich von 1 - 100 ug/ml.
Produkte, die den Cellulose-Polymer-Stabilisator der vorliegenden Erfindung enthalten können, um ein Wachstumsfaktor-Präparat zu stabilisieren, sind Augentropfen, Augengele, Augencreme, Liposom- oder Mizell- Formulierungen, Hydrogele und Creme für die Wundheilung, wie zur Behandlung von Verbrennungen, wäßrige Träger zum Tränken von Gaze-Verbänden, von Verbänden für Verbrennungen, künstliche Haut, Nahtbeschichtungen und Produkte für gastrointestinale Indikationen, wie zur Verwendung bei der Hemmung der Magensäure-Sekretion.
Ein anderes Produkt, das die Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung enthalten kann, ist eine Muttermilch-Formulierung. Die Muttermilch-Formulierung kann als Ersatz für die Muttermilch zum Stillen von Säuglingen verwendet werden. Es wurde berichtet, daß Muttermilch eine hohe Konzentration an EGF enthält (Read L.C. et al., Ped. Res.(1984) Band 18, Seiten 133 - 139). Es wurde auch berichtet, daß das rekombinante humane EGF von dem natürlich vorkommenden EGF in der Muttermilch nicht zu unterscheiden ist (Read L.C. et al., J. Endocrin. (1986) Band 109, Seiten 245 - 250). Es wird vermutet, daß der in der Muttermilch vorhandene EGF das Zellen-Wachstum und die Zellen-Differenzierung bei Säuglingen stimuliert.
Es wird erwogen, daß ein diätetischer Milchzusatz oder ein Muttermilch-Ersatz für Säuglinge hergestellt werden kann durch Einbringen von rekombinanten Human-EGF in eine Muttermilch-Formulierung. Die Formulierung kann in flüssiger oder trockener Pulver-Form vorliegen. Wenn sie in flüssiger Form ist, so wird die Formulierung durch die Stabilisatoren der vorliegenden Erfindung stabilisiert. Die Konzentration des EGF in einer flüssigen Formulierung kann im Bereich von 0,01 - 100 ug/ml, vorzugsweise von 0,1 bis 10 ug/ml liegen. Die Formulierung kann auch Nahrungsmengen an Protein, Kohlenhydraten und Fetten enthalten. Die Proteine sollten die 20 Aminosäuren, die für die menschliche Ernährung essentiell sind, zur Verfügung stellen. Das Protein kann von Kuhmilch, beispielsweise Casein, oder von Sojabohnen stammen.
Die wäßrigen Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung können bei Verfahren zur Wundheilung verwendet werden. Derartige Verfahren schließen das Einbringen der stabilisierenden wäßrigen Zusammensetzung in eine Creme- Formulierung oder das Tränken eines Gazeverbandes mit der wäßrigen Lösung und das anschließende Aufbringen der Creme oder der getränkten Gaze auf eine Wundstelle ein, wie einer Verbrennung, einer Spender-Wundstelle, einem Geschwür oder auf jeder beliebigen Art von Hautwunde. Zusätzlich kann Nahtmaterial mit der stabilisierenden wäßrigen Zusammensetzung beschichtet oder getränkt und zum Verschließen einer offenen Wunde verwendet werden.
Es können stabilisierende, ophthalmologische, EGF enthaltende Formulierungen hergestellt werden. Der EGF ist in der ophthalmologischen Formulierung in einer Konzentration von etwa 1 bis etwa 1000 ug/ml vorhanden. Es wird bevorzugt, daß die EGF-Konzentration im Bereich von 10 - 500 ug/ml liegt, und noch bevorzugter ist eine Konzentration von 1 - 100 ug/ml. Die Formulierung enthält zusätzlich ein wasserlösliches, ophthalmologisch verträgliches Polymer zum Aufrechterhalten der Viskosität der Formulierung im Bereich von 1 - 1000 mPas (cps). Die Viskosität der Formulierung hängt von dem Polymer, der Polymer-Konzentration, dem Lösungsmittelsystem und der Schergeschwindigkeit ab. Veränderungen dieser Faktoren können zur Erreichung der gewünschten Viskosität leicht durchgeführt werden. Die Viskosität kann in einem Brookfield-Viskosimeter gemessen werden, das die Kraft bestimmt, die zum "Abscheren" einer Flüssigkeit notwendig ist. Die Brookfield-Methode berücksichtigt die Wechselwirkungen zwischen Polymeren (z.B. Ketten- Verflechtungen) und wird im allgemeinen verwendet, um viskose Polymer-Lösungen zu bestimmen, bei denen die Wechselwirkungen zwischen den Polymeren eine deutliche Rolle bei der beobachteten Viskosität spielen. Die Ergebnisse einer derartigen Bestimmung werden normalerweise bei einer vorgegebenen Schergeschwindigkeit (sec&supmin;¹) angegeben. Wird die Geschwindigkeit für den Viskositätswert nicht speziell angegeben, so wird im allgemeinen angenommen, daß die Geschwindigkeit auf Null extrapoliert worden ist. Dies wurde mit den hier angegebenen Werten von 1 - 1000 mPas (cps) getan. Die hier angegebenen Viskositätswerte beziehen sich auf Raumtemperatur, beispielsweise 22 - 25º C.
Es ist wichtig, hohe Konzentrationen des EGF in ophthalmologischen Formulierungen zu verwenden, weil einfache wäßrige Lösungen, die EGF enthalten, schnell durch den naso-lacrymalen Kanal abgezogen werden, wenn sie in das Auge eines Patienten eingebracht werden. Die Verwendung einer hohen EGF-Konzentration erhöht die Verweilzeit einer wirkungsvollen Konzentration des EGF an der Wundstelle im Auge. Ebenso erhöht die Verwendung von Polymeren zur Erhöhung der Viskosität der Formulierung die Verweilzeit oder die Berührungszeit des EGF im Auge durch Senken der Abzugsgeschwindigkeit. Die die Viskosität erhöhenden Polymere können eines oder mehrere der stabilisierenden Cellulose-Polymere der vorliegenden Erfindung sein, oder sie können andere wasserlösliche, ophthalmologisch verträgliche Polymere sein, die viskositätserhöhende Eigenschaften haben. Wird ein Cellulose-Derivat zur Bereitstellung einer Viskosität innerhalb des Bereichs von 1 - 5000 mPas (cps) verwendet, so sollte das Molekulargewicht im Bereich von 80.000 bis 240.000 liegen.
Das Polymer kann in der Formulierung in einer Konzentration von etwa 0,05 % bis etwa 3,0 % (Gewicht/Volumen) vorhanden sein. Es kann irgendein wasserlösliches, ophthalmologisch verträgliches Polymer verwendet werden, das die Viskosität der Formulierung im Bereich von 1 - 1000 mPas (cps) aufrecht erhält. Geeignete Polymere schließen Polysaccharide ein, wie die Cellulose-Derivate, Vinyl- Polymere, wie Polyvinylalkohol und Polyvinyl-pyrrolidon, Polyaminosäuren, wie Polylysin, und Polyethylenglycol. Das Polymer ist vorzugsweise eines der stabilisierenden Cellulose-Derivate der vorliegenden Erfindung und kann zusätzlich Polyvinylalkohol oder Polyvinyl-pyrrolidon enthalten. Soll die Formulierung jedoch gegen den Verlust von biologischer Aktivität stabilisiert werden, so sollte das Polymer eines der stabilisierenden Polysaccharide sein.
Die ophthalmologische Formulierung kann außerdem ein Konservierungsmittel in einer Konzentration von etwa 0,0002 % bis etwa 2,5 % (Gewicht/Volumen) enthalten. Geeignete Konservierungsmittel sind Thiomersal (0,0002 - 0,01 %), Sorbinsäure (0,05 - 2,5 %), Chlorbutanol (0,05 - 0,6 %) und EDTA (0,01 - 0,1 %).
Die ophthalmologische Formulierung kann auch ein oder mehrere wasserlösliche Streckungsmittel für die Lyophilisierung in einer Konzentration von etwa 0,1 - 6,0 % (Gewicht/Volumen) enthalten. Geeignete Streckungsmittel sind Mannit, Saccharose, Lactose und Glycin. Da das EGF sich nicht kristallisiert und sich selbst nicht gut in lyophilisierter Form bündelt, können die Streckungsmittel zugegeben werden, um das Zusammenpacken des lyophilisierten EGF zu einem festen "Kuchen" zu verbessern.
Die ophthalmologische Formulierung kann auch einen Puffer zur Aufrechterhaltung des pH-Wertes der ophthalmologischen Lösung zwischen etwa 5,0 und etwa 8,0, vorzugsweise 7,0 - 8,0, enthalten. Geeignete Puffer werden aus den Phosphat- Puffern, Citrat-Puffern, Borat-Puffern und Acetat-Puffern ausgewählt.
Ein fakultativer Bestandteil für die ophthalmologische Formulierung ist ein den Tonus erhöhendes Mittel, um die wäßrige Lösung isotonisch und isosmotisch zu machen. Das den Tonus erhöhende Mittel kann in einer Konzentration bix zu etwa 1,8 % (Gewicht/Volumen) vorhanden sein. Geeignete, den Tonus erhöhende Mittel sind Chlorid-Salze, wie Natriumchlorid und Kaliumchlorid. Die oben angeführten Streckungsmittel, wie Mannit, können auch als ein den Tonus erhöhendes Mittel ebenso wie auch ein Streckungsmittel wirken, und daher kann das den Tonus erhöhende Mittel aus der Formulierung weggelassen und eine größere Menge des Streckungsmittels zugegeben werden, um eine gewünschte, den Tonus erhöhende Wirkung zu erreichen.
Ein Verfahren zur Erhöhung der Heilungsgeschwindigkeit einer Wunde in dem Auge eines Patienten umfaßt das In- Berührungbringen der Wunde mit einer wirkungsvollen, die Wunde heilenden menge der oben beschriebenen ophthalmologischen Formulierung. Geeignete Patienten sind Primate, wie Menschen. Die ophthalmologische Formulierung kann in Form von Augentropfen verwendet werden, um die Heilungsgeschwindigkeit und die Reifung der Hornhaut- Epithelzellen zu erhöhen. Die Formulierung kann auch zur Stimulierung des Wachstums von Mesothelial-Zellen im Auge verwendet werden. Die topische Anwendung der ophthalmologischen Formulierung in Augentropfen kann verwendet werden zur Behandlung von Epikeratophakie, Hornhaut-Geschwüren, radialer Keratotomie, Hornhaut- Transplantaten und anderen chirurgisch verursachten Wunden im Auge.
Im unten beschriebenen Beispiel 1 wird die biologische Aktivität von stabilisierten und nicht stabilisierten wäßrigen Epidermis-Wachstumsfaktor-Formulierungen bestimmt anhand des Rezeptor-Bindungsversuchs gemäß Savage et al., Analytical Biochem., Band 111, Seiten 195 ff. (1981). Alternativ kann die Stabilität auch durch jede geeignete HPLC-Methode gemessen werden. Kurz erläutert erfolgt der Rezeptor-Bindungsversuch wie folgt:
Der Rezeptor-Bindungsversuch beruht auf der Fähigkeit von Human-EGF, mit ¹²&sup5;I-markiertem Mäuse-Epidermis- Wachstumsfaktor um Bindungsstellen auf Human-Zellen zu konkurrieren. Die Bindung wird an zusammenlaufenden Monoschichten von mit Formalin fixierten Human-Epidermis- Karzinom-A431-Zellen durchgeführt [Ref.: Fabricant et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Band 74, Seite 565 (1977), Haigler et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Band 75, Seite 3317 (1978) und Ullrich et al., Nature, Band 309, Seite 418 (1984)]. Diese Zellen haben 10 - 50 mal mehr EGF-Rezeptoren auf ihrer Oberfläche, als die meisten anderen Zellarten. Es wurde ein markierter Mäuse-Epidermis-Wachstumsfaktor (¹²&sup5;I- EGF), erhalten von Amersham, verwendet.
Mehrfachschalen, die eine Vielzahl von Behälter enthielten, wurden verwendet. Jeder Behälter hatte eine zusammenlaufende Monoschicht von mit Formalin fixierten Human-Epidermis-Karzinom-A431-Zellen, die am Boden fixiert waren. Zuerst wurden in jeden Behälter 80 ul PBS- Verdünnungsmittel eingebracht (phosphat-gepufferte Salzlösung, die 0,1 Gew.-% Rinderserum-Albumin und 0,2 Mol/l Glycin enthielt), das entweder einen bekannten Standard-Epidermis-Wachstumsfaktor, die zu bestimmende Probe oder eine Kontrolle enthielt, die keinen Epidermis- Wachstumsfaktor aufwies. Serienverdünnungen der Standard- und Proben-Reagentien wurden im allgemeinen verwendet. Dann wurden 20 ul des ¹²&sup5;I-EGF einer bekannten Aktivität und Konzentration in PBS jedem Behälter zugegeben. (Es ist wichtig, daß die Zugabe der Reagentien in der angegebenen Reihenfolge erfolgt.) Die Behälter wurden bedeckt und bei 37º C etwa 1¼ bis 2 ½ Stunden inkubiert.
Das Reaktionsgemisch in jedem Behälter wurde angesaugt, um die Flüssigkeit zu verwerfen, jeder Behälter wurde zweimal mit PBS gewaschen, und die Waschflüssigkeit wurde verworfen. 100 ul 0,1 n NaOH, 1 Gew.-% Natriumdodecylsulfat, wurden jedem Behälter zugegeben. Die Behälter wurden bei 37º C 10 Minuten lang inkubiert, dann wurden die Proben einzeln in Gammastrahl-Zählröhrchen übergeführt. Das Röhrchen mit der Probe wurde in einen Gammastrahl-Zähler eingebracht, und die Zahl der Gammastrahlen wurde während einer Minute gezählt. Alternativ können Mehrfachschalen, die entfernbare Behälter enthalten, verwendet werden, wobei in diesem Fall nach der Waschstufe der ganze Behälter entfernt und in den Gammastrahl-Zähler zum Zählen eingebracht wird.
Die Zählungen aus einer Serienverdünnung eines frisch hergestellten, bekannten EGF-Standards wurden als Funktion der EGF-Konzentration in einer Log-Log-Darstellung zusammengefaßt, wobei die Zählungen je Minute die Y-Achse und die Konzentration die X-Achse sind. Die Zählungen je Minute sind der Konzentration des bekannten Epidermis- Wachstumsfaktors umgekehrt proportional. Die Kurven, die für die unbekannten Proben in bekannten Verdünnungen erstellt wurden, wurden mit der Kurve eines frisch hergestellten, bekannten Standards verglichen, um die Konzentration des aktiven EGF in jeder unbekannten Probe zu bestimmen (in ug je ml). Die aus Duplikaten und Serienverdünnungen erhaltenen Werte wurden gemittelt, um die Genauigkeit zu verbessern.

Beispiel 1

Stabilitäts-Studien

Polymere mit pharmazeutischer Reinheit wurden aus den folgenden Quellen erhalten:
Poly(vinylalkohol) : Gelvatol 40/20 - Monsanto ("PVA")
Methyl-cellulose : Methocel A4M - Dow ("MC")
Hydroxypropyl-methyl-cellulose: Methocel E4M - Dow ("HPMC")
Poly(vinylpyrrolidon) : Plasdon C15 - GAF ("PVP").
Vier Polymer-Lösungen wurden hergestellt, um Viskositäten zu erhalten, die denen entsprechen, die üblicherweise in ophthalmologischen Formulierungen verwendet werden. Die Lösungen enthielten auch 0,01 Gew.-% Thiomersal, um das Bakterienwachstum zu hemmen, und 0,9 Gew.-% NaCl, um die Lösungen isotonisch zu machen. Die Lösungen wurden durch ein 0,2-um Polysulfon-Filter filtriert, um sie zu sterilisieren. Die filtrierten Lösungen wurden in sterilen Glasröhrchen gelagert. Epidermis-Wachstumsfaktor, der wie von Bell in WO 85/00369 beschrieben hergestellt wurde, wurde jedem Röhrchen zugegeben, um eine Lösung mit 12 ug je ml zu erhalten. Es wurden auch zwei Kontroll-Lösungen verwendet; eine enthielt den Epidermis-Wachstumsfaktor in reinem destilliertem Wasser und die andere enthielt den Epidermis-Wachstumsfaktor in destilliertem Wasser, das nur das Thiomersal plus NaCl enthielt. Tabelle 1 gibt die Konzentrationen und Strukturviskositäten bei 25º C der vier Polymer-Lösungen an. Die Strukturviskosität wurde verwendet, um die Viskosität einer verdünnten Lösung zu definieren, sie wird gewöhnlich in einem Ubbelohde- Viskosimeter gemessen. Die Strukturviskosität hängt vom Molekulargewicht des Polymers und vom Lösungsmittel ab. Tabelle 1 Polymer Konzentration,Gew.-% Strukturviskosität,dl/g
Die Aktivitäten des Epidermis-Wachstumsfaktors der sechs Lösungen wurden anhand des Rezeptor-Bindungsversuches, der oben für die frisch hergestellten Lösungen beschrieben ist, 6, 21 und 48 Tagen nach ihrer Herstellung bestimmt. Die Lösungen wurden während des Versuchs in Glasröhrchen bei 37º C gelagert.
Die unten angegebene Tabelle 2 zeigt die Aktivitäten (angegeben in ug des aktiven Epidermis-Wachstumsfaktors je ml) , für die sechs Lösungen und zwar sowohl wie sie hergestellt wurden als auch in Intervallen am 6., 21. und 48. Tag sowie den nach 48 Tagen noch vorhandenen Prozentsatz der ursprünglichen Aktivität. Tabelle 2 Rezeptor-Bindungs-Aktivität Aktivitäten am Lösung Proz. der ursprüng. Aktivität n. 48 Tg. Wasser Thiomersal/NaCl
Einige Polymere führten dazu, daß die zu bestimmenden EGF- Konzentrationswerte ungewöhnlich hoch waren. Deshalb sollten die Konzentrationswerte nicht zwischen verschiedenen Polymeren verglichen werden. Die Konzentrationswerte müssen für jedes einzelne Polymer zwischen dem Tag 0 und dem 48. Tag verglichen werden. Wie aus den oben angegebenen Ergebnissen ersichtlich ist, verloren die wäßrigen Lösungen des Epidermis- Wachstumsfaktors, die die beiden Cellulose-Derivate enthielten, nichts von ihrer biologischen Aktivität (innerhalb der Versuchsabweichung) nach der Lagerung während 48 Tagen, während die anderen etwa die Hälfte ihrer biologischen Aktivität nach der gleichen Zeit verloren.

Beispiel 2

Bewertung der ophthalmologischen EGF-Formulierungen in Primaten

Dieses Beispiel zeigt die Wirkung von Human-EGF auf die Beschleunigung der Epithel-Regeneration von Hornhaut bei Primaten. Die verwendete Versuchsformulierung enthielt Human-EGF, der durch rekombinante Methoden hergestellt worden war (Chiron Corp., Emeryville, CA), mit einer Konzentration von 100 ug/ml. Die verwendete Formulierung wurde bei einem pH-Wert von 5,5 mit Chlorbutanol (Chlorbutanol-8A) als Konservierungsmittel hergestellt und enthielt die folgenden Bestandteile: Bestandteile Chlorbutanol Zitronensäure Natriumcitrat/H&sub2;O Mannit Wasser
Es wurden drei erwachsene weibliche Macaca-fascicularis- Primaten mit einem Gewicht von fünf bis sieben Kilogramm verwendet. Die anatomische Struktur der Hornhaut von Primaten und Menschen ist nahezu identisch, und Primate sind ein gut akzeptiertes Modell für Versuche der Epithel- Regeneration.
Jedes Tier wurde mit Ketamin (5 mg/lb = 11 mg/kg) und Rompum (1 mg/lb = 2,2 mg/kg) anesthesiert. Atropin-sulfat (0,5 mg/lb = 1,1 mg/kg) wurde auch gegeben, um die Speichelabsonderung zu vermindern. Ein Lid-Spekulum wurde in das Auge eingeführt, und ein Vakuum-Trepan aus rostfreiem Stahl mit einem Durchmesser von 8 mm wurde an der Hornhaut befestigt. Die Mitte des Trepans wurde während 45 Sekunden mit n-Heptanol gefüllt, um das Epithel zu entfernen. Dann wurde das n-Heptanol durch Aspiration entfernt, und die Hornhaut wurde mit 30 ml einer phosphatgepufferten Salzlösung überschwemmt. Das Epithel wurde zum Rand hin entfernt durch schwaches Abwischen der Oberfläche mit einem mit einer Baumwollspitze versehenen Applikator. Die Entfernung des Epithels wurde durch Färben mit Fluorescein bestätigt. Die Tiere wurden viermal täglich mit 2 Tropfen der Lösung um 9.00 Uhr, 12.00 Uhr, 15.00 Uhr und 18.00 Uhr behandelt. Das linke Auge diente als Kontrolle und erhielt nur Trägermittel (d.h. alle Bestandteile außer EGF), während das rechte Auge ein EGF enthaltendes Trägermittel erhielt. Die Primaten wurden täglich anästhesiert, wie oben beschrieben, ihre Hornhaut wurde mit Fluorescein gefärbt und dann mit einem Farbdia-Film fotografiert.
Das Ausmaß der Epithel-Regeneration wurde bestimmt durch computergestützte Planimetrie der vergrößerten Projektionen der Farbdias unter Verwendung des Sigma-Abtast-Programms und angegeben als Prozent jeder Hornhaut, die reepithelisiert wurde. Die Ergebnisse wurden auf ihre statistische Signifikanz anhand eines doppelten T-Tests analysiert. Die Primaten wurden am Ende des Versuchs schmerzlos getötet, und ihre Hornhäute wurden für die Routine-Histologie weiter verarbeitet.
Die Ergebnisse der computergestützten Planimetrie der vergrößerten Farbdias sind in Tabelle 3 angegeben. Wie ersichtlich wurde mit der Formulierung ein verstärkter Bereich der Epithel-Regeneration 24 Stunden nach der Verletzung erreicht. Die statistische Analyse der Ergebnisse nach 24 Stunden unter Verwendung eines einseitigen doppelten T-Tests zeigte einen kleinen p-Wert von 0,10 > p> 0,05. Der Primat Nr. 11316 zeigte eine geringe Reizung im epithelisierten Bereich in der Zeit von 48 bis 72 Stunden (92,5 % bis 88,2 %), die sich zu einem punktförmigen Defekt während der nächsten 24 Stunden erholte.
Die histologische Bewertung der Hornhäute der Primaten Nr. 11314 und 10668, die mit der den EGF enthaltenden Formulierung behandelt worden waren, zeigte ein dickes, kontinuierliches Epithel mit einer Dicke von etwa 5 - 7 Zellschichten. Die Zellen, die die Grundschicht enthielt, waren würfelförmig und kompakt. Die Zellen, die über der Grundschicht lagen, zeigten eine fortschreitende Schichtenbildung zu schuppenförmigem Epithel. Im Vergleich dazu hatten die Kontroll-Hornhäute dieser Primaten ein sehr dünnes Epithel, das etwa 2 - 3 Zellen dick war und weit auseinander liegende und irgendwie abgeflachte Grundzellen und eine geringe Schichtenbildung der darüber liegenden Zellen aufwies. Das Erscheinungsbild beider Hornhäute des Primaten Nr. 11316 entsprach den Kontroll-Hornhäuten der Primaten Nr. 11314 und 10668.
Demzufolge ist leicht ersichtlich, daß die Behandlung von Defekten des Hornhaut-Epithels mit der EGF enthaltenden Formulierung die Anfangsgeschwindigkeit der Epithel- Regeneration im Vergleich zum Trägermittel beschleunigt. Auch war das histologische Erscheinungsbild des regenerierten Epithels wesentlich besser an Hornhäuten, die mit EGF behandelt worden sind. D.h. die EGF-Formulierung verbessert sowohl die Geschwindigkeit der Regeneration als auch die Qualität des regenerierten Epithels in diesem Primaten-Modell. Tabelle 3 Computer-Planimetrie der re-epithelisierten Bereiche anhand von Fotografien Affe Nr. Auge

Beispiel 3

Zusätzlich zu der in Beispiel 2 angegebenen Chlorbutanol- 8A-Formulierung wurden auch zwei andere Formulierungen hergestellt.
Die Formulierung 6 wurde bei einem pH-Wert von 7,0 hergestellt und enthielt Thiomersal als Konservierungsmittel. Bestandteile Thiomersal-6A % (Gew./Vol.) Thiomersal Bestandteile Thiomersal-6A % (Gew./Vol.) Mannit Hydroxypropylmethyl-cellulose E4M Wasser
Formulierung 7 wurde bei einem pH-Wert von 6,65 hergestellt und enthielt Sorbinsäure als Konservierungsmittel. Sorbinsäure-7A % (Gew./Vol.) Sorbinsäure Zitronensäure Na-citrat/2H&sub2;O Mannit Wasser
Die Stabilität der drei unterschiedlichen Formulierungen wurde über eine Zeitspanne von 292 Tagen bei vier verschiedenen Temperaturen bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 angegeben. Tabelle 4 STABILITÄT VON OPHTHALMOLOGISCHEN FORMULIERUNGEN Die EGF-Konzentration dieser Proben betrug 10 ug/ml. Zeit in Tagen Formulierung Thiomersal-6A Sorbinsäure-7A Chlorbutanol-8A ND = nicht nachweisbar.

Beispiel 4

Es wurde erwogen, daß eine Muttermilch-Ersatzformulierung bereitgestellt werden könnte in Verbindung mit rekombinant hergestelltem Human-EGF. Eine derartige Formulierung kann als Flüssigkeit oder in Form eines trockenen Pulvers bereitgestellt werden. Ist sie in flüssiger Form, so ist es wünschenswert, die wasserlöslichen Polysaccharid- Stabilisatoren der vorliegenden Erfindung zuzusetzen, um den EGF gegen Verlust der biologischen Aktivität zu stabilisieren. Die Stabilisatoren erhöhen die Lagerbeständigkeit der Muttermilch-Formulierung.
Die Formulierung enthält jeden der Nährstoff-Bestandteile, die üblicherweise in Milch- oder Muttermilch-Ersatz eingebracht werden. Derartige Bestandteile schließen Nahrungsmengen an Protein, Kohlenhydraten und Fetten ein, um essentielle Aminosäuren und Kalorien für den Säugling zur Verfügung zu stellen. Das Protein sollte alle 20 Aminosäuren zur Verfügung stellen können, die für die menschliche Ernährung essentiell sind. Das Protein kann sich von Kuhmilch, beispielsweise Casein, oder von Sojabohnen ableiten, wenn eine Formulierung erwünscht ist, die frei von tierischem Protein ist. Die Kohlenhydrate können Lactose einschließen, oder, wenn ein lactose-freies Produkt erwünscht ist, kann jedes andere geeignete Kohlenhydrat verwendet werden, wie Saccharose oder Fructose.
Die Formulierung kann auch Nahrungsmengen von Verbindungen enthalten, die folgende Vitamine zur Verfügung stellen: A, D, K, E, C, B&sub1;, B&sub2;, B&sub6;, B&sub1;&sub2;, Niacin, Folsäure, Pantothensäure, Biotin, Cholin und Inosit, entweder einzeln oder in jeder beliebigen Kombination.
Zusätzlich kann die Formulierung Nahrungsmengen von Verbindungen enthalten, die Mineralien zur Verfügung stellen, wie Calcium, Phosphor, Magnesium, Eisen, Jod, Zink, Kupfer, Mangan, Natrium, Kalium oder Chlorid, entweder einzeln oder in jeder beliebigen Kombination.
Die Erfindung wurde hier anhand gewisser bevorzugter Ausführungsformen und Beispiele erläutert. Da jedoch offensichtliche Veränderungen den Fachleuten ersichtlich sind, soll die Erfindung nur durch die folgenden Ansprüche umfaßt werden.

Claims

1. Wässerige medizinische Zusammensetzung, enthaltend einen Wachstumsfaktor, ausgewählt unter Epidermis- Wachstumsfaktor, Umwandlungs-Wachstumsfaktor-alpha, Umwandlungs-Wachstumsfaktor-beta, basischem Fibroblasten-Wachstumsfaktor, saurem Fibroblasten- Wachstumsfaktor, Angiogenin, Nerven-Wachstumsfaktor, insulin-ähnlichem Wachstumsfaktor, von Blutplättchen abgeleitetem Wachstumsfaktor oder einem Gemisch davon, und eine Menge an wasserlöslichem Zellulose-Polymer, ausreichend, um den genannten Wachstumsfaktor gegen den Verlust der biologischen Aktivität zu stabilisieren.

2. Zusammensetzung nach Anspruch 1, in der der Wachstumsfaktor ein Epidermis-Wachstumsfaktor ist.

3. Zusammensetzung nach Anspruch 2, in der der Epidermis- Wachstumsfaktor ein Human-Epidermis-Wachstumsfaktor ist.

4. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, in der das Zellulose-Derivat Hydroxypropyl-Zellulose, Methyl-Zellulose, Hydroxypropylmethyl-Zellulose oder ein Gemisch davon ist.

5. Verfahren zum Stabilisieren einer wässerigen medizinischen Zusammensetzung, enthaltend einen Wachstumsfaktor, ausgewählt aus Epidermis- Wachstumsfaktor, Umwandlungs-Wachstumsfaktor-alpha, Umwandlungs-Wachstumsfaktor-beta, basischem Fibroblasten-Wachstumsfaktor, saurem Fibroblasten- Wachstumsfaktor, Angiogenin, Nerven-Wachstumsfaktor, insulin-ähnlichem Wachstumsfaktor, von Blutplättchen abgeleitetem Wachstumsfaktor oder einem Gemisch davon, wobei das genannte Verfahren umfaßt das Einbringen in die genannte Zusammensetzung einer Menge an wasserlöslichem Zellulose-Polymer, ausreichend, um den genannten Wachstumsfaktor gegen den Verlust der biologischen Aktivität in Gegenwart von Wasser zu stabilisieren.

6. Pharmazeutisch verträgliche(s) Creme oder Gel, die Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 4 umfassend.

7. Naht oder absorbierender Gazeverband, beschichtet oder getränkt mit der Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 4.

8. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, Creme oder Gel nach Anspruch 6, oder Naht oder Gazeverband nach Anspruch 7 für die Verwendung zur Beschleunigung der Heilung einer Wunde.

9. Muttermilch-Ersatz, die Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 4 umfassend.

10. Muttermilch-Ersatz nach Anspruch 9, umfassend rekombinanten Human-EGF und eine Nahrungsmenge an Protein, welche die für die menschliche Ernährung essentiellen Aminosäuren zur Verfügung stellen kann.