DE60130008T2

DE60130008T2 - Proteinkombinationen zur heilung von wunden

Info

Publication number: DE60130008T2
Application number: DE60130008T
Authority: DE
Inventors: Rama Austin AKELLA; John P. Austin RANIERI
Original assignee: Zimmer Orthobiologics Inc
Current assignee: Zimmer Orthobiologics Inc
Priority date: 2000-06-28
Filing date: 2001-06-22
Publication date: 2008-05-15
Anticipated expiration: 2021-06-23
Also published as: EP1328288B1; DE60130008D1; US20060286157A1; JP2004501203A; CA2413338A1; US7081240B1; WO2002000244A3; WO2002000244A2; EP1328288A2; ES2291332T3

Description

Hintergrund der Technik
Die Erfindung bezieht sich auf die Verwendung eines Protein-Cocktails, der aus Knochen gewonnen wird, durch eine Guanidinhydrochloridproteinextraktion von entmineralisierten Knochenpartikeln, zur Verwendung bei der Behandlung von Wunden.
Die Wundheilung ist ein komplexer Prozess, der mehrere Zelltypen und Wachstumsfaktoren für ein effektives Verschließen umfasst. Der normale Wundheilprozess kann grob in drei Stufen klassifiziert werden, nämlich die Entzündungs-, Proliferations- und Maturations-Phasen. Die Entzündungs-Phase dauert 0-2 Tage und umfasst eine ordnungsgemäße Rekrutierung von Zellen an dem Wundbereich. Danach folgt die 2-6-Tage-Proliferationsphase, in der Fibroblasten, Keratinozyten und andere Zellen in dem Wundenbett beginnen, aktiv zu wuchern, um die Wunde zu schließen. Die Maturationsphase folgt der Proliferationsphase, und hat ihre Spitze bei 21 Tagen, zu welcher Zeit die Wunde vollständig durch Neustrukturieren des anfänglichen Narbengewebes verheilt ist.
Eine problematische Wunde folgt nicht dem normalen Zeitplan für den Heilungsprozess, wie oben beschrieben wurde. Eine problematische Wunde folgt dem normalen Heilungsprozess aus einer Anzahl von Gründen möglicherweise nicht, die unter anderem Ernährung, Gefäßzustand, metabolische Faktoren, Alter, Immunzustand, Medikamententherapie, neurologischen Zustand und psychologischen Zustand umfassen. Verschiedene lokale Faktoren spielen ebenfalls eine wichtige Rolle bei der Wundheilung, und umfassen das Vorhandensein von nekro tischem Gewebe in dem Bereich, Infektion, Vorhandensein von Fremdkörper, Grad der Austrocknung, Vorhandensein von Ödemen, Druck, Reibung, Scher-Mazeration und Dermatitis.
Aus Wundflusszusammensetzungsstudien geht hervor, dass Wachstumsfaktoren in allen drei Phasen der Wundheilung eine wichtige Rolle spielen. Die Zelltypen, die an den Wundbereich hin erneuert werden, sezernieren Wachstumsfaktoren, die bei dem Wundheilungsprozess helfen und denselben fördern. Blutplättchen sind z. B. der erste Zelltyp, der an der Wundstelle erneuert wird, und initiiert den Wundheilungsprozess durch Sezernieren von Wachstumsfaktoren (d. h. aus Blutplättchen gewonnene Wachstumsfaktoren, oder PDGF; platelet derived growth factor), die für andere Zellentypen chemotaktisch sind. Dadurch helfen die Blutplättchen bei der Rekrutierung und Proliferation von zusätzlichen Zellentypen, die die Synthese von neuem Gewebe fördern. Zusätzlich zu den oben erwähnten funktionalen Eigenschaften haben Wachstumsfaktoren auch die Fähigkeit, die Proteinsynthese innerhalb der Zelle zu regulieren und die intrazelluläre Signalisierung zu steuern, wodurch sie es Zellen ermöglichen, miteinander zu kommunizieren.
Da die Wundheilung ein komplexer Prozess ist, der die Bildung von Bindegewebe und neuen Blutgefäßen umfasst, um den Wundort zu nähren, ist es offensichtlich, dass verschiedene Wachstumsfaktoren ins Spiel kommen. Bei chronischen Wunden besteht ein Anstieg an Kollagenaseaktivität und höhere Pegel von Entzündungszytokinen. Zusätzlich dazu liegt eine Abwesenheit von Wachstumsfaktoren in der Wundflüssigkeit vor, was verursacht, dass die Zellen mitotisch inkompetent sind. Alle diese Faktoren verursachen eine beeinträchtigte Wundheilung. Einiger dieser Faktoren wurden in vorklinischen Tiermodellen sowie in der Klinik studiert. Die meisten Wachstumsfaktorstudien, die den Wundheilungsprozess umfassen, umfassen Tests im Bereich von 20 bis 25 Tagen, was dem normalen Wundheilungsprozess angemessen darzustellen scheint. Es wird jedoch nun erkannt, dass längere Studienperioden von bis zu sechs Monaten oder länger vorteilhaft wären, um ein 100%iges Verschließen von problematischen Wunden zu erzielen.
Der einzige FDA-anerkannte Wachstumsfaktor zur Verwendung bei der Wundheilung in der Klinik ist der von Blutplättchen abstammende Wachstumsfaktor (PDGF; platelet derived growth factor), vertrieben von Ortho-McNeil Pharmaceutical als REGRANEX(r). REGRANEX(r) enthält Becaplermin, einen rekombinanten von menschlichen Blutplättchen abstammenden Wachstumsfaktor (rhPDGF-BB; recombinant human platelet-derived growth factor) zur lokalen Anwendung. Becaplermin wird erzeugt durch die DNA-Rekombinationstechnik durch Einfügung des Gens für die B-Kette des von Blutplättchen abstammenden Wachstumsfaktors (PDGF) in Hefe. Becaplermin weist ein Molekulargewicht von ungefähr 25 KD auf und ist ein Homodimer, bestehend aus zwei identischen Polypeptidketten, die durch Disulfidverbindungen aneinander gebunden sind. REGRANEX(r) ist ein nichtsteriles topisches auf bewahrter Natrium-Carboxymethylzellulose basierendes (auf CMC basierendes; CMC = Carboxymethylzellulose) topisches Gel, das die aktive Substanz Becaplermin und die inaktiven Substanzen Natriumchlorid, Natriumacetattrihydrat, Eisessig, Wasser zur Injektion und Methylparaben, Propylparaben und m-Cresol als Konservierungsmittel und 1-Lysin-Hydrochlorid als Stabilisator enthält.
Studien verschiedener Wachstumsfaktoren im Wundheilungsprozess wurden ausgeführt. Einige der Ergebnisse dieser Studien sind nachfolgend zusammengefasst:

1) PDGF-BB (der Wachstumsfaktor bei REGRANEX^®) ist ein Chemoattraktant für Neutrophile, Monozyten und Fibroblasten. Bei Wundheilungsanwendungen hat er die extrazelluläre Matrixdeposition erhöht und die Proliferation von Fibroblasten verbessert. PDGF ist jedoch kein Angingen. Somit sind zusätzliche Wachstumsfaktoren für die Gesundpflege der Neodermis erforderlich.
2) Fibroblastenwachstumsfaktor (FGF; Fibroblast Growth Factor) erhöht Kapillardichte und Proliferation von Fibroblasten. Eine lokale Anwendung in Gelform wurde getestet und es hat sich gezeigt, dass keine systemische Absorption des Proteins erfolgte (< 1 % der erfassten Dosis).
3) Transformations-Wachstumsfaktor β-2 (TGF β-2; TGF = transforming growth factor) ist ein Wachstumsfaktor, der die Proliferation von verschiedenen Zelltypen sowohl in vitro als auch in vivo verbessert und bei der venösen Geschwürheilung und bei diabetischen Fußgeschwürversuchen getestet wurde. Bei einer 2-Arm-Klinikstudie wurde eine 40%ige Reduzierung der Wundengröße im Vergleich zu der Vergleichswunde innerhalb von sechs Wochen beobachtet, bei Anwendung von 0,5 μg/cm². Bei einer 3-Arm-Klinikstudie jedoch, als 2,5 μg/cm² für einen Vergleich gegenüber einem standardmäßigen XEROFORM^TM-Verband getestet wurde, waren die Ergebnisse nicht sehr ermutigend.
4) Epidermaler Wachstumsfaktor (EGF; epidermal growth factor), erzeugt durch Blutplättchen und Makrophagen, ist ein Mitogen für Epithelzellen. Dieser Wachstumsfaktor wurde zuerst bei Verbrennungspatienten getestet und die anfänglichen Ergebnisse waren viel versprechend. Bei Tests an Freiwilligen jedoch bestand kein Unterschied zwischen Wachstums faktorbehandlungen und Placebo. Dies könnte an der Tatsache liegen, dass EGF nicht gut ist für die Migration von Keratinozyten, aber ein gutes miotisches Mittel ist.
5) Keratinozyt-Wachstumsfaktor-2 (KGF-2; Keratinocyte Growth Factor-2) wurde im Hinblick auf dessen Fähigkeit getestet, Ephithelialisation zu verstärken. An Tag 6 waren die Lücken geschlossen. KGF-2 fördert eine Re-Ephithelialisation bei jungen und alten Tieren, was indirekte Mechanismen für eine Neogranulations-Gewebebildung suggeriert. Xia Y. D. u. a., J. Pathol. (1999) 188: 431-438. Es besteht erhöhter Widerstand gegen mechanische Belastung von geheilten Wunden; somit kann KGF-2 nützlich für die Behandlung von Operationswunden sein. Jiminez, P. A. & Rampy, M. A., (1999) J. Surg. Res. 81: 238-242.
6) Bindegewebs-Wachstumsfaktor (CTGF; connective tissue growth factor) ist ein sezernierter, mitogenischer, chemotaktischer und zellmatrix-induzierender Faktor, codiert durch ein direktes Früh-Wachstums-ansprechendes Gen. Die Beteiligung von CTGF an menschlicher Atherosklerose und fibrotischen Störungen suggeriert eine Rolle bei der Geweberegeneration wie der Wundwiederherstellung, aber auch bei der aberranten Deposition von extrazellulärer Matrix. Tatsächlich wurden Anti-CTFG-Antikörper verwendet, um die fibrotische Kaskade zu blockieren.

Studien an der Kinetik der Aktion von verschiedenen Wachstumsfaktoren haben gezeigt, dass einige Wachstumsfaktoren, wie z. B. der Granulozyt-Monozyt-Kolonie-Stimulationsfaktor (GMCSF; granulocyte-monocyte colony stimulation factor) und der Rinder-FGF sequentiell agierten. Es wurde die Hypothese aufgestellt, dass eine Kombination aus Wachstumsfaktoren besser wäre als eine Behandlung mit einem einzelnen Wachstumsfaktor. Bei Tiermodellen jedoch hat eine Kombination dieser zwei Faktoren den regenerativen Prozess tatsächlich verlangsamt und die Heilung hat nie 100 % erreicht. Somit wurde eine sequentielle Lieferung dieser Faktoren angestrebt: GMCSF wurde zuerst verabreicht gefolgt von der Lieferung von FGF 25 Tage später. In einer einzelnen Studie konnte keine Verbesserung gegenüber dem Vergleich demonstriert werden.
Bei einer wiederum anderen Studie, die TGF-β, bFGF (Basis-FGF) und CTGF kombiniert, hat sich herausgestellt, dass TGF-β1, TGF-β2 oder TGF-β3 nach 3 Tagen durchgehender Injektion eine Hautfibrose verursachten, die Änderung aber vorübergehend war und nach 7 Tagen kontinuierlicher Injektion verschwand. Im Gegensatz dazu wurde eine irreversible Fibrose nach einer gleichzeitigen Injektion von TGF-β und bFGF oder TGF-β und CTGF beobachtet, oder einer TGF-β-Injektion für die ersten 3 Tage gefolgt von bFGF- oder CTGF-Injektion für die nächsten 4 Tage. Diese Beobachtungen suggerieren, dass TGF-β1 Hautfibrose induziert und bFGF oder CTGF verschiedene haut-fibrotische Erkrankungen beibehält.
Eine andere Art und Weise zum Erhalten von Wachstumsfaktormischungen zog die Verwendung eines Blutplättchen-Releasats in Betracht, das eine Sammlung aus Wachstumsfaktoren enthält, gelöst aus Blutplättchen, gewonnen aus Blut. Die Vorteile dieses Materials sind, dass es autolog oder homolog ist und ohne weiteres verfügbar ist und vermutlich die erforderlichen Faktoren in dem richtigen Verhältnis enthält. Bis jetzt bestand, obwohl eine gewisse Verbesserung in dem Heilungsprozess anfänglich beobachtet wurde, nach 24 Wochen kein Unterschied zwischen Wachstumsfaktor- und Placebo-Behandlungen.
Die US-A-6054122 offenbart die Verwendung eines Gewebe-Dichtungsmittels oder Fibrinklebers zur Verwendung bei der Wundheilung, der eine Zusammensetzung enthält, die zumindest zwei Wachstumsfaktoren aufweist, wie z. B. BMP3, TGF-beta und FGF-1. Ferner offenbart das Dokument die Verwendung eines Gewebedichtungsmittels oder Fibrinklebers, der eine entmineralisierte Knochenmatrix enthält.
Die US-A-5116738 offenbart eine BMP-3-Zusammensetzung zur Verwendung bei der Wundheilung (und Gewebereparatur), die andere Wachstumsfaktoren aufweisen kann, wie z. B. die BMP-Ptroteine, FGF und TGF.
Die US-A-5141905 offenbart eine BMP-7-Zusammensetzung zur Verwendung bei der Wundheilung (und Gewebereparatur), die andere Wachstumsfaktoren aufweisen kann, wie z. B. den BMP-3, FGF und TGFbeta (TGFbeta-1, -2, -3).
Die US-A-5187076 offenbart eine pharmazeutische Zusammensetzung zur Verwendung bei der Wundheilung, die zusätzlich zu BMP-6 BMP-3, TGF-beta und FGF aufweist.
Die WO-A-9641818 offenbart die Verwendung eines aus Chitin gewonnenen Hydrogels, das eine Zusammensetzung enthält, die zumindest einen Wachstumsfaktor aufweist, der BMP1-8, FGF-1 und TGFbeta aufweist, das eine Wundheilung fördert. Ferner offenbart das Dokument die Verwendung eines aus Chitin gewonnenen Hydrogels, das eine entmineralisierte Knochenmatrix enthält (DMB enthält BMP3, TGFbeta-2 und FGF-1) zur Verwendung bei der Wundheilung. Ferner wird die Formulierung und Lieferung von TGFbeta-2 aus Fibrin-Dichtungsmittel zur Wundheilung beschrieben.
Die EP-A-0747066 offenbart die Verwendung von auf Kollagen basierenden, biokompatiblen Haftmittel-Zusammensetzungen, die Kombinationen oder Mischungen aus zwei oder mehr Wachstumsfaktoren enthalten, ausgewählt aus der Gruppe von TGF-beta-1, -2, -3; BMP1-9 und FGFs zur Förderung der Wundheilung.
Die US-A-5356630 offenbart eine Mischung aus wasserlöslichen Osteogenproteinen (einschließlich BMP1-8), die aus entmineralisierter Knochenmatrix gewonnen werden, TGF-beta und FGF zur Wundheilung.
Es ist somit offensichtlich, dass, obwohl verschiedene Polypeptidwachstumsfaktoren eine wesentliche biologische Aktivität bei vor-klinischen Wundreparaturmodellen zeigten, der einzige Wachstumsfaktor, der sich als effektiv in der Klinik herausgestellt hat, der humane, rekombinante PDGF-BB ist. Dies kann liegen an schlechter Lieferung, Medikamen teninstabilität oder der Unfähigkeit eines einzelnen Faktors, den komplexen Prozess der Wundheilung zu orchestrieren. Eine effektive Behandlung sollte Punkte adressieren, wie z. B. Angiogenese, effiziente Kollagendeposition und ordnungsgemäße Epithelisation zum Schließen der Wunde.
Zusammenfassung der Erfindung
Die Erfindung weist einen Proteincocktail auf, der aus Knochen gewonnen wird, durch eine Guanidinhydrochloridproteinextraktion aus entmineralisierten Knochenpartikeln zum Verbessern des Wundheilungsprozesses bei lebenden Tieren, die menschliche Versuchspersonen umfassen. Bei bevorzugten Ausführungsbeispielen weist die Erfindung eine Mischung aus Wachstumsfaktoren auf, die den Wundheilungsprozess verbessern. In diesem Kontext beziehen sich die Ausdrücke „ausschließend", „Ausschluss" oder „ausgeschlossen" auf die Entfernung von im Wesentlichen der Gesamtheit einer angezeigten Komponente zu dem Ausmaß, dass eine solche Komponente aus einer Mischung mit Inmmunoaffinitäts-Chromatographie entfernt werden kann oder anderweitig nicht in der Mischung enthalten ist. Der Ausdruck „pharmazeutisch akzeptabler Träger" wird hierin in dem allgemeinen Sinn des Ausdrucks verwendet und umfasst alle bekannten Träger, einschließlich Wasser.
„BP" ist ein Protein-Cocktail, der aus Knochen gewonnen wird, wie in den U.S.-Patenten Nr. 5,290,763 , 5,371,191 und 5,563,124 beschrieben ist.
Kurz gesagt wird der Cocktail durch Guanidinhydrochloridproteinextraktion aus entmineralisierten Knochenpartikeln vorbereitet. Die Extraktlösung wird gefiltert und einem zweistufigen Ultrafiltrationsprozess unterzogen. Bei dem ersten Ultrafiltrationsschritt wird eine Ultrafiltrationsmembran verwendet, die eine Molekulargewichtssperre (MWCO; molecular weight cut off) von 100 kD aufweist. Das Retenat wird verworfen und das Filtrat wird einem zweiten Ultrafiltrationsschritt unter Verwendung einer Ultrafiltrationsmembran unterzogen, die eine nominale MWCO von etwa 10 kD aufweist. Das Retenat wird dann einer Diafiltration unterzogen, wobei Guanidin durch Harnstoff ersetzt wird. Die Protein-enthaltende Harnstofflösung wird dann einer sequentiellen Ionenaustauschchromatographie unterzogen, zuerst einer Anionenaustauschchromatographie gefolgt von einer Kationenaustauschchromatographie. Die osteoinduktiven Proteine, die durch den obigen Prozess erzeugt werden, werden dann einer HPLC mit einer präparativen VYDAC^TM-Säule unterzogen und mit einem flachen ansteigenden Gradienten von Acetonitril eluiert. Einminutenfraktionen des HPLC-Säuleneluats werden gesammelt, um den BP-Cocktail zu erzeugen (die Fraktionanzahl kann etwas im Hinblick auf Lösungszusammensetzung, Harzgröße, Volumen der Herstellungscharge etc. variieren). Ein Ausführungsbeispiel des BP-Cocktails ist charakterisiert, wie in 1-6 gezeigt ist. Absolute und relative Beträge der Wachstumsfaktoren, die in dem BP-Cocktail vorhanden sind, können durch Sammeln unterschiedlicher Fraktionen des HPLC-Eluats variiert werden. Bei einem bestimmten bevorzugten Ausführungsbeispiel werden Fraktionen 29-34 gesammelt. Es wird ferner berücksichtigt, dass bestimmte Proteine aus der BP-Mischung ausgeschlossen sein können, ohne die Wundheilungsaktivität zu beeinträchtigen.
BP wurde ursprünglich als eine Mischung aus Proteinen bekannt, die bekannterweise eine osteogene Aktivität aufweist. Es enthält jedoch eine Mehrzahl von Wachstumsfaktoren und ist stark angingen. Genauer gesagt enthält BP eine Anzahl von Knochen-morphogenetischen Proteinen (BMPs; bone morphogenetic proteins), die BMP-2, BMP-3, BMP-4, BMP-5, BMP-6 und BMP-7 sowie TGF-β1, TGF-β2 und TGF-β3 einschließen. FGF-1 ist auch in der Mischung enthalten. Das Vorhandensein von jedem der vorangehenden Proteine wurde unter Verwendung von Immunoblottechniken erfasst, wie in 14 gezeigt ist. Als BP in einem Tiermodell getestet wurde, um zu bestimmen, ob es bei der Unterstützung des Wundschlusses wirksam ist, wurde überraschenderweise entdeckt, dass BP die Wundheilung fördert, obwohl es ein grundlegend unterschiedlicher Prozess zur Osteogenese ist.
Die Proteinzusammensetzungen der Erfindung können vorteilhaft mit herkömmlichen Wundverbänden kombiniert werden, die primäre und sekundäre Verbände umfassen, Nass-zu-Trocken-Verbände, absorbierende Verbände, nichthaftende Verbände, semipermeable Verbände, transparente Verbände, Hydrocolloidverbände, Hydrogele, Schaumverbände, Alginatverbände, Operationstapes und ähnliches, wie es für die jeweilige Art der behandelten Wunde geeignet ist.
Zusammensetzungen gemäß der vorliegenden Erfindung können ferner mit einer Vielzahl von anderen aktiven Bestandteilen kombiniert werden, wie z. B. Aloe Vera, Arginin, Glutamin, Zink, Kupfer, Vitamin C, B-Vitaminen und andere Nahrungsergänzungen, Antibiotika, Antiseptika, antifungalen Mitteln, desodorierenden Mitteln und ähnlichem. Ausführungsbeispiele der Erfindung können ferner mit einer Vielzahl von entzündungshemmenden Mitteln kombiniert werden, die die Aktion von entzündungsfördernden Zytokinen hemmen, wie z. B. Interleukin-1, Interleukin-6 und Tumornekrose-Faktor-Alpha. Viele solche Hemmstoffe sind weitläufig bekannt, wie z. B. IL-1Ra, löslicher TGF-β-Rezeptor, Kortikosteroide, und es wird davon ausgegangen, dass in Zukunft weitere entdeckt werden.
Das Vorhandensein einer Anzahl von Proteinen, von denen man ausgeht, dass sie keine Wachstumsfaktoraktivität aufweisen, wurde in BP erfasst. Dementsprechend können diese Proteine, die Histon-Proteine, Ribosomal-Proteine oder beide umfassen, aus Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung ausgeschlossen werden. Alternativ kann die Zusammensetzung die BP-Mischung isoliert aufweisen, wie in den U.S.-Patenten Nr. 5,290,763 , 5,371,191 und 5,563,124 beschrieben ist, wie in 2 und 3 gezeigt ist (Bahnen innerhalb des Kastens gesammelt, um BP zu ergeben). Histone und Ribosome können aus dem BP ausgeschlossen werden, z. B. durch Antikörperbindung oder andere Techniken, die in der Technik bekannt sind. Zusätzlich dazu kann die Zusammensetzung von Stoffen eine oder mehrere der aufgelisteten, aktiven Komponenten enthalten, die als ein rekombinant erzeugtes Protein geliefert werden. Vorzugsweise sind die Komponenten aus einer natürlichen Quelle isoliert und sind zumindest teilweise phosphoriliert und glykosiliert.
Bei einem anderen Ausführungsbeispiel werden die obigen Zusammensetzungen bei Wundheilungsanwendungen zusammen mit einem pharmazeutisch akzeptablen Träger verwendet. Der pharmazeutisch akzeptable Träger umfasst Verbände, wie z. B. Hydrocolloidverbände, Hydrogele, Schaumverbände und Alginatverbände. Zusätzliche aktive Bestandteile können Arginin, Glutamin, Zink, Kupfer, Vitamin C, Vitamin B1, Vitamin B2, Vitamin B3, Vitamin B6, Vitamin B12 und Folsäure oder Wachstumsfaktoren umfassen, wie z. B. einen epidermalen Wachstumsfaktor, aus Plättchen gewonnenen Wachstumsfaktor, isolinähnlichen Wachstumsfaktor, Keratinozyten-Wachstumsfaktor, vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor, transformierenden Wachstumsfaktor-Alpha, Nervenwachstumsfaktor, Bindegewebswachstumsfaktor und Granulozyten-Monozyten-Kolonie-stimulierenden Faktor. Entzündungshemmer, wie z. B. Interleukin-1-Hemmer, Interleukin-6-Hemmer und Tumornekrosis-Faktor-Alpha-Hemmer können auch zu der Zusammensetzung hinzugefügt sein. Natürlich können auch Schmerzmittel, Desinfektionsmittel, Antibiotika und andere aktive Bestandteile, die für bestimmte Wundanwendungen geeignet sind, ebenfalls hinzugefügt sein.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 zeigt eine SDS-PAGE einer Proteinmischung gemäß der vorliegenden Erfindung, sowohl in reduzierter als auch nicht reduzierter Form.
2 ist ein SDS-PAGE-Gel aus HPLC-Fraktionen 27-36 einer Proteinmischung gemäß einem Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung.
3 ist ein SDS-PAGE-Gel mit identifizierten Bändern, angezeigt gemäß der Legende aus 4.
4 ist ein SDS-PAGE-Gel einer Proteinmischung gemäß einem Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung, wobei die identifizierten Bänder angezeigt sind, wie in der Legende vorgesehen ist.
5 ist ein zweidimensionales (2-D) SDS-PAGE-Gel einer Proteinmischung gemäß einem Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung, wobei interne Standards durch Pfeile angezeigt sind.
6 ist ein 2-D-SDS-PAGE-Gel einer Proteinmischung gemäß einem Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung, wobei eingekreiste Proteine wie in der Legende identifiziert sind.
7A-O sind Massenspektrometerergebnisse für typische Fragmente von eindimensionalen (1-D) Gelen einer Proteinmischung gemäß einem Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung.
8 ist ein 2-D-Gel-Westernblot einer Proteinmischung gemäß einem Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung, gekennzeichnet mit einem Anti-Phosphotyrosin-Antikörper.
9A-D sind 2-D-Gel-Westernblots einer Proteinmischung gemäß einem Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung, gekennzeichnet mit angezeigten Antikörpern. 9A zeigt das Vorhandensein von BMP-3 und BMP-2 an. 9B zeigt das Vorhan densein von BMP-3 und BMP-7 an. 9C zeigt das Vorhandensein von BMP-7 und BMP-2 an und 9D zeigt das Vorhandensein von BMP-3 und TGF-β1 an.
10 ist ein PAS- (periodisch Säure-Schiff-) gefärbtes SDS-PAGE-Gel von HPLC-Fraktionen einer Proteinmischung gemäß einem Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung.
11 ist ein Anti-BMP-7-gefärbtes SDS-PAGE-Gel einer PNGase-F-behandelten Proteinmischung gemäß einem Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung.
12 ist ein Anti-BMP-2-gefärbtes SDS-PAGE-Gel einer PNGase-F-behandelten Proteinmischung gemäß einem Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung.
13A-B sind Balkendiagramme, die die Explantatmasse von glykosilierten Komponenten in einer Proteinmischung gemäß einem Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung (13A) und ALP-Einstufung (13B) derselben Komponenten zeigen.
14 ist ein Diagramm, das eine Antikörper-Auflistung und -reaktivität zeigt.
15A-B weisen zusammen ein Diagramm auf, das tryptische Fragmentsequenzierungsdaten für Komponenten einer Proteinmischung gemäß einem Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung zeigt.
16A-F zeigen zusammen ein Diagramm, das tryptische Fragmentmassenspektrometriedaten für Komponenten einer Proteinmischung gemäß einem Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung zeigt.
17A-B sind ein SDS-Gel (17B) und eine Abtast-Densitometer-Abtastung (17A) desselben Gels für eine Proteinmischung gemäß einem Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung.
18 ist ein Diagramm, das die relative Masse, aus Abtast-Densitometer-Quantifizierung, von Proteinkomponenten in einer Proteinmischung gemäß einem Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung zeigt.
19A-D zeigen zusammen ein Diagramm, das Massenspektrometriedaten von verschiedenen Proteinfragmenten aus 2-D-Gelen einer Proteinmischung gemäß einem Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung zeigt.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
BEISPIEL 1. BP IN EINZELDOSISANWENDUNG AN NACKTEN MÄUSEN
Eine Einzeldosisanwendung von BP an Wunden voller Dicke bei nackten Mäusen bedeckt mit menschlichen vernetzten Hauttransplantaten in Teildicke ergab eine vollständige Wundheilung und schneller als Wunden, die die Wachstumsfaktormischung nicht erhielten. Obwohl die spezifische Art und Weise, in der die Wachstumsfaktoren bei BP den Wundheilungsprozess beeinflussen, nicht vollständig verständlich ist, wird hypothetisch angenommen, dass die synergistische Aktion der multiplen Wachstumsfaktoren, die in BP vorhanden sind, der Wunde helfen, sich besser zu erholen als jene bei Vergleichstieren, die nur den Träger erhalten haben.
Wunden voller Dicke wurden bei nackten Mäusen derart erzeugt, dass der Wundbereich ungefähr 20 % der Gesamtkörperoberfläche betrug. BP wurde vorbereitet wie in den U.S.-Patenten Nr. 5,290,763 , 5,371,191 und 5,563,124 und an die Wunde bei einem Povidonträger angewendet. Die Wunde wurde dann mit menschlichen vernetzten Hauttransplantaten in Teildicke abgedeckt. Die Vergleichstiergruppe erhielt nur den Povidonträger. Die Transplantatstellen wurden verbunden und mit Pflastern verschlossen, um den Verband sicher an Ort und Stelle zu halten. Die ersten Verbandwechselungen wurden an Tag 5 nach der Operation und danach jeden dritten Tag ausgeführt. Das Basisprotokoll ist ferner beschrieben in „Clinical and Experimental Approaches to Dermal and Epidermal Repair: Normal and Chronic Wounds", S. 429-442 (1991) Wiley-Liss, Inc. und Cooper M. L. u. a., The Effects of Epidermal Growth factor and basic Fibroblast Growth factor an Ephithelialization of Meshed Skin Graft Interstices, Prog. Clin. Biol. Res. (1991) 365: 429-42. Solche Protokolle sind Fachleuten auf dem Gebiet bekannt.
Die Ergebnisse waren sehr ermutigend. Einzelanwendungen von zwei Konzentrationen (entweder 100 μg/Wundstelle oder 200 μg/Wundstelle) des Wachstumsfaktors wurden getestet. Es bestand kein Unterschied weder in Geschwindigkeit noch Grad der Wundheilung zwischen den zwei Gruppen. Es bestand jedoch eine starke Differenz zwischen der Gruppe aus Tieren, die die Wachstumsfaktorbehandlung erhielt, und den Vergleichstieren, die den Wachstumsfaktor nicht erhielten. An Tag 11 nach der Operation wurde ein 95%iger Wundschluss bei den Tieren beobachtet, die den Wachstumsfaktor erhielten, wohingegen die Vergleichstiere nur 74 % Wundschluss zeigten. An Tag 14 nach der Operation zeigten alle mit Wachstumsfaktor behandelten Tiere 100 % Wundschluss, während die Vergleichstiere nur 85 % Wundschluss bis Tag 20 nach der Operation zeigten.

Die Dicke der Epithelschicht bei BP-behandelten Wunden war wesentlich höher bei mit BP behandelten Tieren im Vergleich zu den Vergleichstieren, wie in Tabelle 1 gezeigt ist. Die Daten stellen die Dicke der Neodermis in mm gemessen an Tag 11 für die BP-behandelten Tiere und Tag 16 für die Vergleichstiere dar, so dass Messungen bei entsprechenden Schritten der Heilung ausgeführt wurden. Die histologische Analyse zeigte, dass die Wunden durch die menschlichen Zellen aus dem transplantierten Material geschlossen wurden und eine Kollagenablagerung in den geschlossenen Wunden vorlag, wie gezeigt ist durch Involukrin- und Kollagen-Typ-1 Immuno-histologische Färbung (Daten nicht gezeigt). Die Kapillardichte in dem Wundbett nach der BP-Behandlung war ebenfalls wesentlich höher zur Zeit des Wundschlusses im Vergleich zu unbehandelten Vergleichen, wie in Tabelle 1 gezeigt ist. Ferner bestand bei den mit der niedrigeren BP-Dosierung behandelten Tieren eine wesentliche Erhöhung bei dem Zählwert bei der glatten Muskelzelle (SMC; smooth muscle cell) bei BP-behandelten Wunden im Gegensatz zu den Vergleichen, wie ebenfalls in Tabelle 1 gezeigt ist. Tabelle 1. Wunddicke, Kapillarzahl und SMC-Zahl für BP- und Vergleichs-behandelte Wunden.

	Behandlung Vergleich
	100 μg BP (n = 5)	200 μg BP (n = 5)	Vergleich (n = 10)
Epitheldicke (mm)	1,60 ± 0,12 (P < 0,001)	1,55 ± 0,09 (P < 0,001)	1,1 ± 0,25
Kapillare/Feld	37 ± 6 (P < 0,01)	35 ± 7 (P < 0,01)	25 ± 5,9
SMC-Zahl Feld	53 ± 3,5 (P < 0,001)	46,8 ± 4,4 (P < 0,05)	46 ± 5,8

Zusammenfassend war eine Einzeldosisanwendung von BP effektiv beim Reduzieren der Heilzeit einer Wunde voller Dicke bei nackten Mäusen, mit transplantierter menschlicher vernetzter Haut in Teildicke. Zusätzlich dazu war die Dicke der Neodermis und die Dichte der Kapillaren bei den behandelten Wunden bedeutend höher im Vergleich zu der Vergleichstiergruppe. Im Gegensatz dazu hat sich gezeigt, dass bFGF, auch ein angiogener Wachstumsfaktor, eine nachteil hafte Wirkung auf die Epithelisierung hatte, wie bei einem ähnlichen Tiermodell getestet wurde. (Cooper, M. L. u. a., 1991; Clinical and experimental approaches to dermal and epidermal repair: normal and chronic wounds, S. 429-442; Weilly-Liss, Inc.)
BEISPIEL 2. BP BEI HYDROGEL

Eine kleine Anzahl von Tieren (n = 3) wurde mit BP behandelt, gelöst ist einem Hydrogel (Carboxy-Methyl-Zellulose), bei demselben Tiermodell, wie oben beschrieben wurde. Bei dieser Studie wurde beobachtet, dass die Wunden (n = 2), die mit BP in dem Hydrogel behandelt wurden, schon 5 Tage nach der Operation eine Initiierung einer Epithelisierung zeigten, im Vergleich zu den Wunden, die mit BP gelöst in 1 % Povidon behandelt wurden, die erst 8 Tage nach der Operation (POD 8; POD = post operation day = Tag nach der OP) eine Initiierung der Epithelisierung zeigten (Daten nicht gezeigt). In beiden Fällen zeigten Vergleichstiere, die den Träger allein erhielten, bis Tag 8 nach der Operation keine Initiierung einer Epithelisierung. Eine detaillierte Histologie wird an den Gewebeproben ausgeführt, um die Dicke der Neodermis und den Grad der Angiogenese in den Wunden zu bestimmen, die mit der Hydrogel-Formulierung behandelt wurden. Wundschlussdaten sind jedoch in Tabelle 2 unten angegeben. Tabelle 2. Prozent des Wundschlusses für mit BP behandelte und Vergleichs-Wunden.

	Prozent Wundschluss (%)
	Tier Nr.	POD 5	POD 8	POD 11	POD 14
*Vergleich (kein BP)	1	0	50	70	70
Vergleich (Hydrogel, kein BP, keine Salze)	2	25	70	70	100
BP & Hydrogel, keine Salze	3	0	70	90	100
BP & Hydrogel, keine Salze	4	25	80	90	90
BP & Hydrogel, Salze (etwas Precipitat gebildet, wahrscheinlich aufgrund der Einlagerung von Salzen)	5	0	80	90	100

*Das Vergleichstier hatte zur Zeit der Biopsie sehr dünne und empfindliche Haut im Vergleich zu den Tieren, die BP erhielten.

Zusammenfassend waren die Ergebnisse sehr viel versprechend wenngleich vorläufig, und zeigten einen schnelleren Wundschluss bei mit BP behandelten als bei Vergleichs-Tieren.
Somit wurden ausführlichere Experimente unternommen, um die Ergebnisse zu bestätigen, wie nachfolgend beschrieben wird.
BEISPIEL 3. VERGLEICHSSTUDIE ZWISCHEN REGRANEX^® UND BP

REGRANEX^® (PDGF-BB), das einzige anerkannte Wachstumsfaktorprodukt auf dem Markt zum Behandeln von diabetischen Fußgeschwüren, zeigte eine vollständige Heilung bei 50 % der Patientenpopulation im Vergleich zu 35 % der Placebogelbehandlung, die eine vollständige Heilung nach wiederholter Anwendung für ungefähr zwei Wochen bei Diabetikerpatienten zeigte (siehe REGRANEX(r) U.S. volle Verschreibungsinformationen – Packungsbeilage). Somit wurde ein Vergleich von REGRANEX(r) (tm) gegenüber BP in einer Studie ähnlich zu der oben beschriebenen unternommen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 und 4 gezeigt. Tabelle 3. mit BP, Hydrogel (HG) und Regranex^® behandelte Wunden und Prozent des Wundschlusses (%), Epitheldicke (mm) und Grad der Angiogenese (Anzahl geschätzter Kapillaren pro 20× Feld).

Prozent (%) Wundschluss						Epi-Dicke (μm)	Angio (# ges. cap/hpf 20×)
Tier Nr.	Behandlungsgruppe	POD 5	POD 8	POD 11	POD 14	POD 14	POD 14
1	BP	10	25	85	100	17,5	28
2	BP	10
3	BP	15
4	BP	10
5	BP	10	30	85	80	7,5	16
6	BP	10
7	BP	10	10
8	BP	10	30	85	100	11,5	26
9	BP	30	50	85	100	16	21
10	BP	30	50	85	100	12	20
11	BP	20	45	85	100	18	18
12	BP	10	15	85	90	6	20
13	BP	10	20	95	100	5,5	23
14	BP	15	25	90	100	10	32
15	BP	5	50	90	95	14	25

n		15	11	10	10	10	10
Mittel		13,67	31,82	87,00	96,50	11,80	22,9
SD		7,43	14,71	3,50	6,69	4,58	4,88
SEM		0,54	0,46	0,04	0,07	0,39
16	HG	15	35	75	55	12,5	28
17	HG	10	60	70	95	10,5	5
18	HG	5	25	60	95	9	34
19	HG	10	30	70	90	17,5	8
20	HG	20	40	80	95	17,5	20
21	HG	10	10	80	95	13	15
22	HG	30	80	70	90	10
23	HG	10	80	80	90	20	10
24	HG	15	40	70	90	18	15
25	HG	20	35	70	90	10,5	16
26	HG	10	10	70	90	12,5	20
27	HG	10	35	70	90	8	32
28	HG	10	55
29	HG	5	40
30	HG	15	40	70
n		15	15	13	12	12	11
Mittel		13,00	41,00	71,92	88,75	13,25	18,455
SD		6,49	20,72	5,60	10,90	4,01	9,55
SEM		0,50	0,51	0,08	0,12	0,30
31	Regranex	20	30	55	75	16
32	Regranex	15	80				13
33	Regranex	20	80	100	100	8,5	4
34	Regranex	15	50	90	100	10
35	Regranex	40	75				6
36	Regranex	15	70	90	100	7,5	10
37	Regranex	15	70	90		18
38	Regranex	10	80
39	Regranex	40	80
40	Regranex	15	50	80	90	15	13
41	Regranex	15	10
42	Regranex	5	50	100	100	16	21
43	Regranex	40	70	100	100	22,5	10
44	Regranex	5	40	80	100	16,5	6

45	Regranex
n		14	14	9	8	9	9
Mittel		19,29	59,64	87,22	95,63	14,44	10,375
SD		12,07	21,88	14,39	9,04	4,88	5,4
SEM		0,63	0,37	0,16	0,09	0,34

Die Prozent-Verschluss-Ergebnisse können wie folgt zusammengefasst werden: Tabelle 4. Zusammenfassung

	POD's	BP (Mittel)	HG (Mittel)	REG (Mittel)
Wundschluss (%)	0	0,00	0,00	0,00
	5	13,67	13,00	19,29
	8	31,82	41,33	59,64
	11	87,00	71,92	87,22
	14	96,25	89,17	95,63
Epitheldicke (mm)	14	11,8	13,25	14,44
Angiogenese (Nr./Feld)	14	22,9	18,45	10,38

Somit ist die BP-Behandlung so gut wie REGRENEX^TM beim Schließen von Wunden, obwohl anfänglich etwas langsamere Heilungsraten beobachtet wurden. Die BP-Behandlung zeigt ferner etwas weniger Verdickung des Epithels und zeigt eine beträchtlich verbesserte Angiogenese im Wundbereich.
BEISPIEL 4. ZUKÜNFTIGE ANWENDUNGEN
Da sich BP als viel versprechend als ein Wundheilmittel gezeigt hat, wird es als nächstes bei Anwendungen getestet, bei denen die Wundheilung bekanntermaßen ungenügend ist.
Experimente ähnlich zu jenen, die oben beschrieben wurden, werden mit diabetischen Tieren durchgeführt, um die Heilung von Wunden ganzer und Teil-Dicke zu testen. Das Ansprechverhalten Geschwüre venöser Stauungen und diabetischer Geschwüre auf BP wird ebenfalls getestet.
Bei vorbereitenden Experimenten wurden männliche Sprague Dawley-Ratten mit einem Gewicht von mehr als 325 g durch eine Behandlung mit Streptozotozin zuckerkrank gemacht und die Hyperglykemie wurde durch Glukometrie bestätigt. Vier Schnittwunden voller Dicke wurden auf der Rückenoberfläche jedes Tiers senkrecht zu der Längsachse verursacht. Die Wunden wurden mit Seidenstrukturen geschlossen und der Wachstumsfaktor oder das Placebo in die Wundlücke oder auf den Schnitt nach dem Schließen aufgebracht. Die Anwendung wurde zu zwei Zeitpunkten ausgeführt: 1) an Tag 0, was der Tag der Verursachung der Wunde (Operation) ist und eine zweite Anwendung 2) an Tag 3 nach der Verursachung der Wunde. Die Schnittstärke wurde an Tag 7 und Tag 10 nach der Operation gemessen. Die Daten sind in Tabelle 5 angegeben und sind insofern sehr ermutigend, als die BP-Behandlung besonders hilfreich ist beim Behandeln einer Vielzahl von diabetischen Geschwüren oder anderen Wunden, die durch verzögerte und/oder schlechte Heilung gekennzeichnet sind. Tabelle 5. Zerreißfestigkeit von Wunden bei diabetischen Ratten

Zerreißfestigkeit (kg/mm) ± sem

Vergleich BP

Tag 7 3,6 ± 1 4,2 ± 0,7

Tag 10 5,2 ± 0,7 9,1 ± 0,8
BEISPIEL 5: WEITERE CHARAKTERISIERUNG VON BP
Das BP wurde teilweise wie Folgt charakterisiert: Hochleistungsflüssigchromatographie- („HPLC-"; high performance liquid chromatography) Fraktionen wurden denaturiert, mit DTT reduziert und durch Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE; sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis) getrennt. Einminütige HPLC-Fraktionen von Minute 27 bis 36 sind in 2 gezeigt. Größenstandards (ST) von 14, 21, 31, 45, 68 und 97 kDa wurden als Niedrigbereichs-Größenstandards aus BIORAD^TM erhalten und sind an jedem Ende des Coomassie-Blaugefärbten Gels gezeigt. Bei dem üblichen Protokoll sind HPLC-Fraktionen 29 bis 34 gesammelt, um BP zu erzeugen (siehe Kästen, 2 und 3), wie in einem ähnlich vorbereiteten SDS-PAGE-Gel in 17B gezeigt ist.
Die verschiedenen Komponenten des BP wurden durch Massenspektrometrie und Aminosäuresequenzierung tryptischer Fragmente charakterisiert, wo ausreichende Pegel an Protein zur Analyse vorlagen. Die Hauptbänder in dem 10-Gel (wie numerisch in 3 angezeigt ist) wurden herausgeschnitten, eluiert, einer tryptischen Zersetzung unterzogen und die Fragmente wurden HPLC-gereinigt und sequenziert. Die Sequenzdaten wurden gegenüber bekannten Sequenzen verglichen und die besten Übereinstimmungen sind in 15A-B gezeigt. Diese Identifikationen sind insofern gewissermaßen unverbindlich, als nur Abschnitte der Gesamtproteine sequenziert wurden und in einigen Fällen eine Abweichung zwischen Mensch- und Rind-Analogen für ein gegebenes Protein vorliegt.
Dieselben tryptischen Proteinfragmente wurden durch Massenspektrometrie analysiert und die Massenspektrogramme sind in 7A-O gezeigt. Die tabellarisierten Ergebnisse und Homologien sind in 16A-F gezeigt, die Identifikationsinformationen für die Bänder liefern, die in 3-4 identifiziert sind. Wie oben kann die Zuweisung einer Ortsidentität vorläufig sein, basierend auf Spezies-Unterschieden und Modifikationen nach der Translation. Eine Zusammenfassung aller Proteinidentifikationen aus ID-Gelen ist in 4 gezeigt.
Die identifizierten Proteinkomponenten von BP, die in 15A-B, 16A-F und 19A-D beschrieben sind, wurden quantifiziert, wie in 17A und 17B gezeigt ist. 17B ist ein gefärbtes SDS-PAGE-Gel von BP und 17A stellt eine Abtastdensitometerspur desselben Gels dar. Die identifizierten Proteine wurden gekennzeichnet und quantifiziert durch Messen des Bereichs unter der Kurve. Diese Ergebnisse sind in 18 als ein Prozentsatz des Gesamtspitzenbereichs dargestellt.
Somit liegen 11 Hauptbänder in dem BP SDS-PAGE-Gel vor, die ungefähr 60 % des Proteins in BP darstellen. Die identifizierten Proteine fallen grob in drei Kategorien: die Ribosomalproteine, die Histone und Wachstumsfaktoren, die morphogene Knochenfaktoren (BMP; bone morphogenic factors) umfassen. Es wird erwartet, dass die Ribosomalproteine und Histonproteine aus dem BP ohne Aktivitätsverlust entfernt werden können, da diese Proteine bekanntermaßen keine Wachstumsfaktoraktivität aufweisen. Nach dieser Trennung wird erwartet, dass sich die spezifische Aktivität entsprechend erhöht.
Experimente sind in Planung, um die Hypothese zu bestätigen, dass die Histon- und Ribosomalproteine aus dem BP ohne daraus folgenden Verlust entfernt werden können oder sogar mit einer Erhöhung der spezifischen Aktivität. Histone werden aus dem BP-Cocktail durch Immunoaffinitätschromatographie entfernt, entweder unter Verwendung spezifischer Histonproteinantikörper oder eines Pan-Histon-Antikörpers. Das Histone-bereinigte BP (BP-H) wird wie oben beschrieben im Hinblick auf Wundheilung und/oder osteogene Aktivität getestet. Auf ähnliche Weise werden die bekannten Ribosomalproteine abisoliert und die verbleibende Mischung (BP-R) wird getestet.
Ein SDS-PAGE-Gel von BP wurde ebenfalls durch ein Western Immunoblot mit einer Reihe von Antikörpern analysiert, wie in 14 aufgelistet ist. Die Visualisierung von Antikörperreaktivität erfolgte durch Meerrettich-Peroxidase konjugiert mit einem zweiten Antikörper und unter Verwendung eines chemilumineszierenden Substrats. Ferner wurde TGF-β1 unter Verwendung von handelsüblich reinem TGF-β1 als Standard quantifiziert und wurde bestimmt, um weniger als 1 % des BP-Proteins darzustellen. Die Antikörperanalyse zeigte, dass jedes der in 14 aufgelisteten Proteine in BP enthalten ist.
Das BP wurde weiter charakterisiert durch 2-D-Gel-Elektrophorese, wie in 5-6 gezeigt ist. Die Proteine sind in horizontaler Richtung nach Ladung (pI) und in der vertikalen Richtung nach Größe getrennt, wie in der zweidimensionalen Elektrophorese beschrieben ist, angepasst für eine Auflösung von Basisproteinen, wurde gemäß dem Verfahren ausgeführt von O'Farrell u. a. (O'Farrell, P. Z., Goodman, H. M. und O'Farrell, P. H., Cell, 12: 1.133-1.142, 1977) durch das Kendrick Laboratory (Madison, WI). Zweidimensionale Gelelektrophoresetechniken sind Fachleuten auf dem Gebiet bekannt. Die Nonequilibrium-pH-Gradient-Elektrophorese („NEPHGE") unter Verwendung von Ampholinen, 1,5 %, pH 3,5-10 und 0,25 %, pH 9-11 (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ) wurde bei 200 V für 12 Stunden ausgeführt. Gereinigtes Tropomyosin (unterer Fleck, 33.000 KDa, pI 5,2), und gereinigtes Lysozym (14.000 KDa, pI 10,5-11) (Merck-Index) wurden zu den Proben als interne pI-Marker hinzugefügt und sind mit Pfeilen markiert.
Nach der Equilibrierung für 10 Minuten in Puffer „0" (10 % Glycerol, 50 mM Dithiothreitol, 2,3 % SDS und 0,0625 M Tris, pH 6,8) wurde die Tube Gel auf einem Stacking-Gel abgedichtet, das auf einem 12,5 % Acrylamid-Slab-Gel (0,75 mm dick) ist. SDS-Slab-Gel-Elektrophorese wurde für ungefähr 4 Stunden bei 12,5 mA/Gel ausgeführt.
Nach der Slab-Gel-Elektrophorese wurden zwei der Gele Coomassie-Blau-gefärbt und die anderen zwei wurden in den Transferpuffer übertragen (12,5 mM Tris, pH 8,8, 86 mM Glycin, 10 % MeoH), über Nacht auf PVDF-Papier bei 200 mA und ungefähr 100 Volt/zwei Gele transblottiert. Die folgenden Proteine (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) wurden als Molekulargewichtstandards zu der Agarose hinzugefügt, die die Tube Gel zu dem Slab-Gel abdichtete: Myosin (220.000 KDa), Phosphorylase A (94.000 KDa), Katalase (60.000 KDa), Aktin (43.000 KDa), Karbonanhydrase (29.000 KDa) und Lysozym (14.000 KDa). 5 zeigt das gefärbte 2-D-Gel mit Größenstandards, die auf der linken Seite angezeigt sind. Tropomyosin (linker Pfeil) und Lysozym (rechter Pfeil) sind ebenfalls angezeigt.
Dasselbe Gel ist in 6 gezeigt, wobei verschiedene identifizierte Proteinen durch nummerierte Kreise angezeigt sind. Die Proteine wurden durch Massenspektrometrie und Aminosäuresequenzierung tryptischer Peptide identifiziert, wie oben beschrieben ist. Die Identität von jedem der gekennzeichneten Kreise ist in der Legende von 6 angegeben und die Daten, die die verschiedenen Proteinorte identifizieren, sind in 19A-D angegeben.
Da verschiedene der Proteine bei mehr als einer Größe migrierten (z. B. BMP-3 das als 6 Bänder migriert), wurden Untersuchungen unternommen, um das Ausmaß einer Modifikation nach der Translation der BP-Komponenten zu untersuchen. Die Phosphorilierung wurde durch Anti-Phosphotyrosin-Immunoblot- und durch Phosphatase-Studien gemessen. 8 zeigt ein 2-D-Gel, elektrogeblottet auf Filterpapier und sondiert mit einem Phosphotyrosin-Maus-Monoclonal-Antikörper durch SIGMA (# A-5964). Verschiedene Proteine wurden somit als phosphoriliert an einem oder mehreren Tyrosin-Resten gezeigt.
Ähnliche 2-D-Elektroblotte wurden mit BP-Komponentenspezifischen Antikörpern sondiert, wie in 9A-D gezeigt ist. Die Filter wurden sondiert mit BMP-2, BMP-3 (9A), BMP-3, BMP-7 (9B), BMP-7, BMP-2 (9C) und BMP-3 und TGF-β1 (9D). Jedes zeigt das charakteristische Ein-Größen-Band, das bei variierendem pI migriert, wie für ein Protein, das in verschiedenen Phosphorelierungszuständen existiert, üblich ist.
Für die Phosphatasestudien wurde BP in 10 mM HCl über Nacht bei 37°C inkubiert mit 0,4 Einheiten sauerer Phosphatase (AcP). Behandelte und unbehandelte Proben wurden lyophilisierten Platten aus Typ-I-Kollagen hinzugefügt und Seite an Seite in dem Subcutanimplantat-Ratten-Bioassay bewertet, wie vorangehend in den U.S.-Patenten Nr. 5,290,763 , 5,563,124 und 5,371,191 beschrieben wurde. Kurz gesagt wurden 10 g BP in Lösung zu lyophilisierten Kollagenplatten hinzugefügt und die Platten subkutan in der Brust einer Ratte implantiert. Die Platten wurden dann nach 2 Wochen für den Alkalinphosphotase- („ALP” – ein Marker für Knochen- und Knorpel-erzeugende Zellen) Test oder nach 3 Wochen zur histologischen Analyse wieder entnommen. Für die ALP-Analyse der Proben wurden die Explantate homogenisiert und Pegel der ALP-Aktivität unter Verwendung handelsüblicher Ausrüstung gemessen. Zur Histologie wurden dünne Abschnitte des Explantats mit einem Mikrotom geschnitten und die Abschnitte gefärbt und im Hinblick auf Knochen und Knorpelbildung analysiert.
Sowohl nativ- als auch phosphatase-behandelte BP-Proben wurden im Hinblick auf morphogene Aktivität durch Masse des subkutanen Implantats (Explantatmasse) und ALP-Einstufung getestet. Die Ergebnisse zeigten, dass eine AcP-Behandlung die Explantatmasse und die ALP-Einstufung von 100 % auf ungefähr 60 % reduzierte. Somit ist die Phosphorilierung wichtig für die BP-Aktivität.
Das BP wurde ferner im Hinblick auf Glykosilierung analysiert. 10 zeigt ein SDS-PAGE-Gel, gefärbt mit Periodishce Säure-Schiff (PAS; periodic acid schiff) – einer nichtspezifischen Karbohydratfärbung, die anzeigt, dass einige der BP-Komponenten glykosiliert sind (Stern-Protein identifiziert als BMP-3). 11-12 zeigen eine Immunodetektion von zwei spezifischen Proteinen (BMP-7, 11 und BMP-2, 12), behandelt mit ansteigenden Pegeln von PNGase F (Peptid-N-Glycosidase F). Sowohl BMP-2 als auch BMP-7 zeigen einen gewissen Grad an Glykosilierung bei BP, scheinen aber auch einen gewissen Pegel an Protein, das resistent gegen PNGase F ist, aufzuweisen (Pluszeichen zeigen ansteigende Enzympegel). Die funktionale Aktivität von mit PNGase F und Sialadase behandelten Proben wurde im Hinblick auf Explantatmasse und ALP-Einstufung getestet, wie in 13A und 13B gezeigt ist, die zeigen, dass eine Glykosilierung für eine vollständige Aktivität erforderlich ist.
Zusammenfassend sind BMPs 2, 3 und 7 durch Phosphorilierung und Glykosilierung modifiziert. Diese Nach-Translations-Modifikationen beeinflussen die morphogene Proteinaktivität, 33 % bzw. 50 % und Vorsicht ist geboten beim Vorbereiten von BP, um diese funktionalen Derivate nicht zu beeinträchtigen.

Claims

Verwendung einer Zusammensetzung, die einen Protein-BP-Cocktail aufweist, der aus Knochen gewonnen wird, bei der Herstellung eines Medikaments für die Behandlung von Wunden, wobei der Protein-BP-Cocktail durch eine Guanidinhydrochloridproteinextraktion von entmineralisierten Knochenpartikeln herstellbar ist, wobei die Extraktlösung gefiltert und dann einem zweistufigen Ultrafiltrationsprozess unterzogen wird, wobei bei dem ersten Ultrafiltrationsschritt eine Ultrafiltrationsmembran verwendet wird, die eine Molekulargewichtssperre (MWCO) von 100 kD aufweist, wobei das Retentat verworfen wird und das Filtrat einem zweiten Ultrafiltrationsschritt unter Verwendung einer Ultrafiltrationsmembran unterzogen wird, die eine nominale MWCO von etwa 10 kD aufweist, wobei das Retentat dann einer Diafiltration unterzogen wird, wobei Guanidin durch Harnstoff ersetzt wird, wobei die proteinenthaltende Harnstofflösung dann einer sequentiellen Ionenaustauschchromatographie unterzogen wird, die zuerst eine Anionenaustauschchromatographie gefolgt von einer Kationenaustauschchromatographie aufweist, wobei die osteoinduktiven Proteine, die durch den obigen Prozess erzeugt werden, dann einer HPLC mit einer präparativen VYDAC^TM-Säule unterzogen werden und mit einem flachen ansteigenden Gradienten von Acetonitril eluiert werden, wobei Einminutenfraktionen des HPLC-Säuleneluats gesammelt werden, um den BP-Cocktail herzustellen.
Verwendung gemäß Anspruch 1, bei der der pharmazeutisch akzeptable Träger ein Hydrogel umfasst.
Verwendung gemäß Anspruch 1, bei der der pharmazeutisch akzeptable Träger einen Verband umfasst, der aus der Gruppe ausgewählt ist, die Hydrokolloidverbände, Hydrogele, Schaumverbände und Alginatverbände umfasst.
Verwendung gemäß Anspruch 1, wobei die Zusammensetzung ferner einen oder mehr aktive Inhaltsstoffe aufweist, die aus Arginin, Glutamin, Zink, Kupfer, Vitamin C, Vitamin B1, Vitamin B2, Vitamin B3, Vitamin B6, Vitamin B12 und Folat ausgewählt sind.
Verwendung gemäß Anspruch 1, wobei die Zusammensetzung ferner einen oder mehr Wachstumsfaktoren umfasst, die aus epidermalem Wachstumsfaktor, von Thrombozyten gewonnenem Wachstumsfaktor, insulinähnlichem Wachstumsfaktor, Keratinozyten-Wachstumsfaktor, vaskulärem endothelialem Wachstumsfaktor, transformierendem Wachstumsfaktor alpha, Nervenwachstumsfaktor, Bindegewebswachstumsfaktor und Granulozyten-Monozyten-Koloniestimulierendem Faktor ausgewählt sind.
Verwendung gemäß Anspruch 1, wobei die Zusammensetzung ferner einen oder mehr Entzündungshemmer umfasst, die aus Interleukin-1-Hemmer, Interleukin-6-Hemmer und Tumor-Nekrose-Faktor-alpha-Hemmer ausgewählt sind.