DE69434122T2

DE69434122T2 - Osteogenisches produkt und verwendung

Info

Publication number: DE69434122T2
Application number: DE69434122T
Authority: DE
Inventors: William James POSER; John James BENEDICT; Christopher J. Damien
Original assignee: Zimmer Orthobiologics Inc
Current assignee: Zimmer Orthobiologics Inc
Priority date: 1993-11-16
Filing date: 1994-11-15
Publication date: 2005-10-27
Anticipated expiration: 2014-11-16
Also published as: DE69434122D1; US5563124A; JPH09505305A; CA2176205A1; EP0729325A1; EP0729325A4; EP0729325B1; CA2176205C; WO1995013767A1; ES2230544T3

Description

HINTERGRUND
Es ist eine Anzahl von Krankheiten oder Verletzungen bekannt, bei denen Knochen betroffen sind, für welche eine Regenerierung von Knochen eine gewünschte Behandlung ist. Die Bildung von Knochen in vivo umfaßt eine Wechselwirkung verschiedener induktiver Proteine und Wachstumsfaktoren, welche wirken, indem sie eine Differenzierung von Mesenchymzellen zu Knorpelgewebe und anschließend zu knochenbildenden Zellinien verursachen. Dieser Mechanismus ist nicht vollständig verstanden. Jedoch wurden bei den Bemühungen, orthopädische Verfahren zu verbessern, Gemische von gereinigten Proteinen oder rekombinant hergestellte Proteine entwickelt, welche osteoinduktive Aktivität stimulieren.
Obwohl von diesen Proteinen gezeigt wurde, daß sie osteoinduktive Aktivität besitzen, besteht eine Schwierigkeit bei der Entwicklung von brauchbaren Produkten in der Identifizierung geeigneter Auslieferungsvehikel für die Proteine. Unter den ersten Materialien, die hinsichtlich einer Auslieferung von Knochenwachstumsproteinen getestet wurden, war Hydroxylapatit. Knochenwachstumsprotein und Hydroxylapatit alleine zeigten keine verstärkte Knochenbildung. Eine Zugabe von Kollagen zu Zusammensetzungen dieser Materialien verbesserte die knochenbildende Reaktion, aber der Hydroxylapatit verblieb an der Stelle und wurde nicht resorbiert.
Es besteht ein anhaltender Bedarf nach der Entwicklung von verbesserten Produkten und Verfahren für die Auslieferung von Knochenwachstumsfaktoren bei der Behandlung von orthopädischen Erkrankungen und Verletzungen.
ZUSAMMENFASSUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft ein osteogenes Produkt, das Aragonit und einen Knochenwachstumsfaktor umfaßt. Das Produkt kann auch ein Material umfassen, das aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus Kollagen, Fibrin, Alginat und Gemischen davon. In einer weiteren Ausführungsform ist der Knochenwachstumsfaktor in einer Menge von etwa 10 Mikrogramm Knochenwachstumsfaktor/g Aragonit bis etwa 1000 Mikrogramm Knochenwachstumsfaktor/g Aragonit zugegen.
Der Knochenwachstumsfaktor kann aus der Gruppe ausgewählt sein, bestehend aus gereinigten Knochenwachstumsfaktoren, rekombinant hergestellten Knochenwachstumsfaktoren und Gemischen davon. In einer bevorzugten Ausführungsform umfaßt der Knochenwachstumsfaktor eine Aminosäurezusammensetzung von etwa 20,7 bis etwa 26,1 Mol-% saurer Aminosäuren, etwa 11,3 bis etwa 15,7 Mol-% Hydroxyaminosäuren, etwa 37,6 bis etwa 42,4 Mol-% aliphatische Aminosäuren, etwa 5,8 bis etwa 7,9 Mol-% aromatischer Aminosäuren und etwa 13,3 bis etwa 19,9 Mol-% basischer Aminosäuren. Der Knochenwachstumsfaktor kann auch nach Hydrolyse eine Aminosäurezusammensetzung aufweisen von etwa 20,7 bis etwa 26,1 Mol-% ASP(+ASN) und GLU(+GLN), von etwa 11,3 bis etwa 15,7 Mol-% SER und THR, von etwa 37,6 bis etwa 42,4 Mol-% ALA, GLY, PRO, MET, VAL, ILE und LEU, von etwa 5,8 bis etwa 7,9 Mol-% TYR und PHE und von etwa 13,3 bis etwa 19,9 Mol-% HIS, ARG und LYS, basierend auf der gesamten molaren Menge der Aminosäuren.
Hierin wird auch ein Verfahren zur Induzierung von Knochenbildung beschrieben, welches ein Implantieren des Produkts der vorliegenden Erfindung in einen Körper umfaßt. In bevorzugten Ausführungsformen ist das Verfahren aus der Gruppe ausgewählt, bestehend aus einer Hüftaustauschoperation, einer Knieaustauschoperation, einer Wirbelfusion, einer Reparatur von periodontalen Defekten, einer Behandlung von Osteoporose, einer Reparatur von Knochendefekten und einer Reparatur von Knochenbrüchen.
KURZE BESCHREIBUNG DER FIGUREN
1 zeigt eine SDS-PAGE eines bevorzugten Knochenwachstumsfaktors, sowohl in reduzierter als auch in nicht-reduzierter Form, der nach einem Verfahren der vorliegenden Erfindung erhalten wurde.
2 ist eine Zeichnung einer Ratte, welche Orte von Implantationen osteogener Produkte der vorliegenden Erfindung zeigt, wie es in Beispiel 1 beschrieben ist.
3 ist ein Balkendiagramm, welches die Ergebnisse von histologischen Analysen von Produktexplantaten zeigt, wobei osteogene Eigenschaften verschiedener Produkte verglichen werden, wie sie in Beispiel 1 beschrieben sind.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft ein osteogenes Produkt, welches Calciumcarbonat in der Form von Aragonit und Knochenwachstumsfaktor umfaßt. Das osteogene Produkt ist besonders in Verfahren nützlich, welche das Implantieren des Produkts in den Körper zum Zwecke der Induzierung von Knochenbildung umfassen.
Die Aragonitkomponente der vorliegenden Erfindung liegt in einer kristallinen Form vor. Der Aragonit hat zwei wichtige Funktionen in Produkten und Verfahren der vorliegenden Erfindung. Wenn er in einen Körper mit Knochenwachstumsfaktor und irgendwelchen optionalen Bestandteilen des vorliegenden Produkts implantiert wird, funktioniert der Aragonit als ein osteokonduktives Element. Somit wirkt der Aragonit als ein konduktives Substrat für die Knochenbildung.
Aragonit in der Form von natürlicher Koralle enthält ein Netzwerk von Makro- und Mikroporen, welche eine Knochenbildung in der Koralle ermöglichen. Die miteinander verbundenen Poren der Koralle ermöglichen es, daß Knochenvorläuferzellen und Gefäße in die Koralle eindringen, und implantieren und liefern eine große Oberfläche für die Knochenanlagerung. Zum Beispiel ermöglichen es diese Poren, daß Makrophagen und Osteoklasten oder osteoklastenähnliche Zellen Zugang zum inneren Bereich der Koralle haben, während sie das verfügbare Volumen für neuen Knochen erhöhen. In bevorzugten Ausführungsformen ist der Aragonit resorbierbar. Im Verlaufe der Zeit wird Koralle in der Form von Aragonit vollständig von dem Körper resorbiert. Das Produkt der vorliegenden Erfindung ermöglicht daher die Bildung von Knochen in einem defekten Gebiet ohne signifikan tes zurückbleibendes nicht-resorbiertes Substrat. Im Gegensatz dazu besitzen herkömmliche keramische Materialien, wie Hydroxylapatit, welche als Knochenwachstumssubstrate verwendet wurden, das Potential, in der Knochenmatrix zu verbleiben und brüchiger zu sein als Knochen.
Darüber hinaus nimmt man an, daß Aragonit weitere unerwartete Vorteile in Verbindung mit Osteoinduktion besitzt. Wie es nachfolgend in dem Beispielabschnitt ausführlicher diskutiert wird, führte die Gegenwart von Aragonit mit Knochenwachstumsfaktor in einer Alginatmatrix zur Knochenbildung. Bei Abwesenheit von Aragonit wurde in der Alginatmatrix mit Knochenwachstumsfaktor jedoch kein Knochen gebildet. Somit scheint es, daß Aragonit unter einigen Umständen eine Rolle bei der Knochenbildung spielt.
Der Aragonit wird vorzugsweise von den Skeletten von Korallen erhalten. Solche Korallen können Acropora, Goniopora, Lobophylla, Porites und Gemische davon umfassen, sind aber nicht darauf beschränkt.
Der von diesen Korallen erhaltene Aragonit liegt in der kristallinen Form von Aragonit vor, besitzt aber unterschiedliche Porositäten. Zum Beispiel ist Acropora zu etwa 20% porös, und Porites ist etwa 50% porös. Die Verwendung von Aragonit mit Porositäten von 0% bis mehr als 50% liegt im Umfang der vorliegenden Erfindung. Geeigneter Aragonit der vorliegenden Erfindung kann durch Gewinnung von natürlich vorkommender Koralle, Reinigung der Koralle und Sterilisierung derselben hergestellt werden. Das erhaltene Produkt kann dann auf Brüche untersucht werden, wie beispielsweise durch Röntgenuntersuchung. Sterilisierung kann z. B. dadurch erzielt werden, daß man das Material Gammastrahlung unterwirft. Das bevorzugte Aragonitmaterial der vorliegenden Erfindung ist das Material, welches unter der Marke BIOCORAL von Inoteb aus St. Gonnery, Frankreich, verkauft wird.
Aragonit der vorliegenden Erfindung kann in verschiedenen Formen verwendet werden, einschließlich als ein Block und als Teilchen. In der Blockform wird der Aragonit, wie Koralle, als ein einheitlicher Gegenstand aus einem größeren Korallenstück hergestellt. Der einheitliche Gegenstand wird dann verwendet, indem er z. B. in einen Knochendefekt eingesetzt wird, oder, wie es nachfolgend ausführlicher diskutiert wird, indem er in einem Wirbelfusionsverfahren zur Verbindung von zwei Wirbeln eingesetzt wird.
Alternativ kann der Aragonit in Teilchenform verwendet werden. Teilchen können z. B. hergestellt werden, indem man Koralle zu einer gewünschten Größe mahlt. Solche Teilchen sind typischerweise zwischen etwa 80 Mikrometer und etwa 30 Millimeter, vorzugsweise zwischen etwa 125 Mikrometer und etwa 2 mm und besonders bevorzugt zwischen etwa 150 Mikrometer und etwa 1 mm groß. Wie es nachfolgend ausführlicher diskutiert wird, werden die Teilchenformen von Aragonit typischerweise mit einem Bindemittel, wie Kollagen, zur Ausbildung einer Zusammensetzung eingesetzt, welche dazu verwendet wird, einen Knochendefekt zur Induktion von Knochenbildung zu füllen, Der Porendurchmesser von Aragonit ist groß genug, so daß Zellen, wie Osteoblasten und Makrophagen, die Poren infiltrieren können und daß eine Kapillarbildung in den Poren möglich ist. Somit liegt der Porendurchmesser in Aragonit typischerweise zwischen etwa 100 Mikrometer und etwa 500 Mikrometer und besonders bevorzugt zwischen etwa 150 Mikrometer und etwa 350 Mikrometer.
Der Knochenwachstumsfaktor der vorliegenden Erfindung ist ein Protein oder ein Gemisch von Proteinen, welche in der Lage sind, Knochenbildung zu induzieren, wenn sie in einen Körper implantiert werden. Es sollte angemerkt werden, daß, obwohl die meisten in Erwägung gezogenen Anwendungen der vorliegenden Erfindung die Anwendung in Menschen betreffen, die Produkte und Verfahren der vorliegenden Erfindung auch in Tieren funktionieren. Eine Induktion von Knochenbildung kann durch eine histologische Beurteilung bestimmt werden, welche die de novo-Bildung von Knochen mit damit einhergehenden Osteoblasten, Osteoklasten und Osteoidmatrix zeigt. Zum Beispiel kann osteoinduktive Aktivität eines Knochenwachstumsfaktors durch einen Test gezeigt werden, der ein Substrat verwendet, auf welchem zu untersuchendes Material abgeschieden wird. Ein Substrat mit abgeschiedenem Material wird subkutan in ein Versuchstier implantiert. Das Implantat wird anschließend entfernt und mikroskopisch hinsichtlich des Vorhandenseins von Knochenbildung, einschließlich des Vorhandenseins von Osteoblasten, Osteoklasten und Osteoidmatrix, untersucht. Ein geeignetes Verfahren ist in Beispiel 5 des US-Patents Nr. 5,290,763 erläutert.
Es gibt keinen allgemein anerkannten Maßstab für die Beurteilung des Ausmaßes an osteogener Aktivität, Jedoch ist von verschiedenen Faktoren weitgehend anerkannt, daß sie Knochenbildung anzeigen. Auf diese Faktoren wird in der Skala von 0–8 Bezug genommen, welche nachfolgend in Tabelle 3 von Beispiel 1 angegeben ist. Der Bereich von 0–4 dieser Skala entspricht dem Bewertungssystem, das in dem US-Patent Nr. 5,290,763 beschrieben ist, welches auf Bewertungen von 0–4 beschränkt ist. Der verbleibende Bereich der unten beschriebenen Skala, 5–8, bezieht sich auf zusätzliche Niveaus der Entwicklung von Knochenbildung. Die nachfolgend beschriebene Skala umfaßt auch eine Berücksichtigung der Resorption von Kollagen, einem Faktor, der in dem US-Patent Nr. 5,290,763 nicht beschrieben ist.
Geeigneter Knochenwachstumsfaktor der vorliegenden Erfindung kann durch Reinigung von natürlich vorkommenden Proteinen aus Knochen oder durch rekombinante DNA-Techniken hergestellt werden. Wie er hierin verwendet wird, bezieht sich der Begriff rekombinant hergestellte Knochenwachstumsfaktoren auf die Herstellung von Knochenwachstumsfaktor unter Verwendung von rekombinanter DNA-Technologie. Zum Beispiel können Nukleinsäuren, die Proteine mit osteogener Aktivität codieren, durch Herstellung von Antikörpern, die an die Proteine binden, identifiziert werden. Die Antikörper können dazu verwendet werden, gereinigte Populationen eines bestimmten osteogenen Proteins durch Affinitätschromatographie zu isolieren. Die Aminosäuresequenz kann durch Sequenzierung des gereinigten Proteins identifiziert werden. Es ist möglich, von der bekannten Aminosäuresequenz DNA-Oligonukleotide zu synthetisieren. Die Oligonukleotide können dazu verwendet werden, entweder eine genomische DNA-Bibliothek und/oder eine cDNA-Bibliothek, die z. B. aus Rinder-DNA hergestellt wurde, zu durchmustern, um Nukleinsäuren zu identifizieren, welche das osteogene Protein codieren. Das korrekte Oligonukleotid wird an die geeignete cDNA hybridisieren, wobei es die cDNA identifiziert, welche das das osteogene Protein codierende Gen codiert.
Die Antikörper, die osteogene Proteine binden, können auch direkt zur Durchmusterung einer cDNA-Expressionsbibliothek verwendet werden. Zum Beispiel können eukaryontische cDNA-Sequenzen, welche osteogene Proteine codieren, in bakterielle Expressionsvektoren ligiert werden. Die Expressionsvektoren können in Bakterien, wie E. coli, transformiert werden, welche den transformierten Expressionsvektor exprimieren und das osteogene Protein herstellen. Die transformierten Bakterien können hinsichtlich der Expression des osteogenen Proteins durchmustert werden, indem man die Bakterien lysiert und die Bakterien mit radioaktiv markiertem Antikörper in Kontakt bringt.
Rekombinanter Knochenwachstumsfaktor kann hergestellt werden, indem man Gene, die nach dem oben beschriebenen Verfahren identifiziert wurden, unter Verwendung irgendeines Verfahrens, mit dem Nukleinsäuren in Zellen eingebracht werden, in Zellen transformiert. Nach der Transformation kann die Zelle rekombinanten Knochenwachstumsfaktor durch Expression der transformierten Nukleinsäuren herstellen, und dieser Knochenwachstumsfaktor kann aus den Zellen gewonnen werden.
Eine Anzahl natürlich vorkommender Proteine aus Knochen oder rekombinante Knochenwachstumsfaktoren wurden in der Literatur beschrieben und sind geeignet. Rekombinant hergestellte Knochenwachstumsfaktoren wurden von mehreren Gesellschaften hergestellt. Creative Biomolecules aus Hopkinton, Massachusetts, USA, stellt einen Knochenwachstumsfaktor her, der als osteogenes Protein 1 oder OP1 bezeichnet wird. Genetics Institute aus Cambridge, Massachusetts, USA, stellt eine Reihe von Knochenwachstumsfaktoren her, die als Bone Morphogenic Proteins 1–8 oder BMP 1–8 bezeichnet werden und welche in dem US-Patent Nr. 5,106,748 beschrieben sind. Gereinigte Knochenwachstumsfaktoren wurden von verschiedenen Gesellschaften entwickelt. Collagen Corporation aus Palo Alto, Kalifornien, USA, entwickelten ein Gemisch von gereinigtem Protein, von dem man annimmt, daß es osteogene Aktivität besitzt, und welches in den US-Patenten mit den Nummern 4,774,228, 4,774,322, 4,810,691 und 4,843,063 beschrieben ist. Marshall Urist der Universität von Kalifornien entwickelte ein Gemisch von gereinigtem Protein, von dem man annimmt, daß es osteogen ist, und welches in den US-Patenten mit den Nummern 4,455,256, 4,619,989, 4,761,471, 4,789,732 und 4,795,804 beschrieben ist. International Genetic Engineering, Inc. aus Santa Monica, Kalifornien, USA, entwickelte ein Gemisch von gereinigtem Protein, von dem man annimmt, daß es osteogen ist, und welches in dem US-Patent Nr. 4,804,744 beschrieben ist.
Ein bevorzugter Knochenwachstumsfaktor der vorliegenden Erfindung und ein Verfahren zur Herstellung desselben ist ausführlich in der verwandten US-Anmeldung mit der Seriennummer 07/689,459 beschrieben. Dieser Knochenwachstumsfaktor ist besonders bevorzugt aufgrund seiner hohen osteogenen Aktivität und weil er ein gereinigter Knochenwachstumsfaktor ist. Der Knochenwachstumsfaktor des US-Patents Nr. 5,290,763 zeigt osteoinduktive Aktivität bei etwa 3 Mikrogramm, wenn er auf einem geeigneten Träger abgeschieden und subkutan implantiert wird. In einer Ausführungsform ist der Knochenwachstumsfaktor ein osteoinduktiv aktives Gemisch von Proteinen, welche das in 1 gezeigte Gelauftrennungsprofil aufweisen. Dieses Gelauftrennungsprofil wurde unter Verwendung von SDS-PAGE erhalten. Die erste Spalte ist ein Molekulargewichtsmaßstab, welcher durch Ausführung von SDS-PAGE mit Standards von bekanntem Molekulargewicht erhalten wurde. Die zweite Spalte zeigt das SDS-PAGE-Profil für ein Gemisch von Proteinen gemäß der vorliegenden Erfindung, welche mit 2-Mercaptoethanol reduziert wurden. Die dritte Spalte zeigt das SDS-PAGE-Profil eines nicht-reduzierten Gemischs von Proteinen gemäß der vorliegenden Erfindung. Obwohl von dem Gemisch von Proteinen, welche das in 1 gezeigte SDS-PAGE-Profil liefem, gefunden wurde, daß sie hohe osteoinduktive Aktivität besitzen, wird erwartet, daß Gemische von Proteinen mit SDS-PAGE-Profilen, welche von den in 1 gezeigten leicht abweichen, ebenfalls wirkungsvoll sein werden. Zum Beispiel können wirkungsvolle Proteingemische Proteine umfassen, die im Molekulargewicht um plus oder minus 5 kD von solchen, die in 1 gezeigt sind, abweichen, und können eine geringere oder eine größere Anzahl an Proteinen als solche, die in 1 gezeigt sind, umfassen. Daher werden Gemische von Proteinen mit Profilen, welche im wesentlichen sämtliche der Proteinbanden umfassen, die in den reduzierten oder nicht-reduzierten SDS-PAGE-Profilen in 1 festgestellt wurden, als im Umfang der Erfindung liegend angesehen.
Noch eine weitere Ausführungsform des bevorzugten Knochenwachstumsfaktors der Erfindung umfaßt ein osteoinduktiv aktives Gemisch von Proteinen, das nach Hydrolyse eine Aminosäurezusammensetzung von etwa 20,7 bis etwa 26,1 Mol-% saurer Aminosäuren, etwa 11,3 bis etwa 15,7 Mol-% Hydroxyaminosäuren, etwa 37,6 bis etwa 42,4 Mol-% aliphatischer Aminosäuren, etwa 5,8 bis etwa 7,9 Mol-% aromatischer Aminosäuren und etwa 13,3 bis etwa 19,9 Mol-% basischer Aminosäuren aufweist. Spezieller besitzt der bevorzugte Knochenwachstumsfaktor eine Aminosäurezusammensetzung von etwa 20,7 bis etwa 26,1 (vorzugsweise etwa 23,4) Mol-% ASP(+ASN) und GLU(+GLN), etwa 11,3 bis etwa 15,7 (vorzugsweise etwa 13,5) Mol-% SER und THR, etwa 37,6 bis etwa 42,4 (vorzugsweise etwa 40,0) Mol-% ALA, GLY, PRO, VAL, MET, ILE und LEU, etwa 5,8 bis etwa 7,9 (vorzugsweise etwa 6,8) Mol-% TYR und PHE und etwa 13,3 bis etwa 19,9 (vorzugsweise etwa 16,6) Mol-% HIS, ARG und LYS. Eine weitere Ausführungsform des bevorzugten Knochenwachstumsfaktors ist ein Proteingemisch mit der ungefähren Aminosäurezusammensetzung, die in Tabelle 1 gezeigt ist.
TABELLE 1
Noch eine weitere Ausführungsform des bevorzugten Knochenwachstumsfaktors ist ein Proteinge misch, das nach einem der in dem US-Patent Nr. 5,290,763 beschriebenen Reinigungsverfahren erhalten wurde.
Ein Knochenwachstumsfaktor der vorliegenden Erfindung wird mit dem Aragonit auf ver schiedene Weisen kombiniert, wenn er in der vorliegenden Erfindung verwendet wird. Wenn der Aragonit z. B. in einer Blockform vorliegt, wird der Knochenwachstumsfaktor typischerweise in eine Lösung gebracht und dann auf den Block aufgebracht. Die den Knochenwachstumsfaktor enthaltende Lösung wird dann in die poröse Struktur des Blocks aufgesogen. Die Lösung wird dann getrocknet, wie beispielsweise durch schnelles Gefrieren, gefolgt von Lyophilisierung, wobei eine Ablagerung des Knochenwachstumsfaktors auf dem Block zurückbleibt.
Alternativ, wenn der Aragonit in Teilchenform vorliegt, können die Aragonitteilchen in eine Matrix eingebracht werden, wie z. B. eine Kollagen-, Fibrin- oder Alginatdispersion, um eine Zusammensetzung auszubilden, welche dann getrocknet wird. Eine Knochenwachstumsfaktor enthaltende Lösung wird dann auf den getrockneten Verbundstoff aufgebracht und aufsaugen gelassen. Alternativ kann Knochenwachstumsfaktor in eine Dispersion gemischt werden, welche dann mit teilchenförmigem Aragonit gemischt und getrocknet wird. Spezielle Beispiele von teilchenförmigen Produkten werden in dem Beispielabschnitt beschrieben.
Die verwendete Menge oder Dosis an Knochenwachstumsfaktor hängt von der Aktivität des Knochenwachstumsfaktors und der speziellen Anwendung ab. Im Falle des Knochenwachstumsfaktors, der in der US-Anmeldung mit der Seriennummer 071689,459 angegeben ist, wird der Knochenwachstumsfaktor in Mengen zwischen etwa 10 Mikrogramm/Gramm Aragonit und etwa 10.000 Mikrogramm/Gramm Aragonit und bevorzugt zwischen etwa 100 Mikrogramm/Gramm Aragonit und etwa 350 Mikrogramm/Gramm Aragonit verwendet.
Produkte der vorliegenden Erfindung können optional Bestandteile zusätzlich zu Aragonit und Knochenwachstumsfaktor umfassen. Zum Beispiel kann ein Produkt, wie es oben angegeben ist, ein matrixbildendes Material, wie Kollagen, Fibrin oder Alginat, umfassen. Bevorzugtes Kollagen ist Rindersehnenatelokollagen vom Typ I. Ein geeignetes Alginatprodukt ist in Beispiel 3 angegeben.
Weitere optionale Bestandteile, die für das vorliegende Produkt geeignet sind, umfassen andere Wachstumsfaktoren, wie basischen Fibroblastenwachstumsfaktor (bFGF) und transformierenden Wachstumsfaktor beta (TGF-beta) (siehe Cuevas et al., Basic Fibroblast Growth Factor (FGF) Promotes Cartilage Repair In Vivo, Biochem Biophys Res Commun 156: 611–618, 1988). Diese Wachstumsfaktoren wurden als knorpelstimulierende und angiogene Mittel einbezogen. Von bFGF wurde z. B. gezeigt, daß es die Geschwindigkeit der Osteoblastenreplikation erhöht, während es gleichzeitig deren Aktivität hemmt (Frenkel, S., Singh, I. J.; The effects of fibroblast growth factor on osteogenesis in the chick embryo. In: Fundamentals of bone growth: Methodology and applications. Hrsg. AD Dixon, BG Sarnat, D. Hoyte, CRC Press, Boca Raton, FL, USA, S. 245–259, 1990). Diese Wirkung ist dosisabhängig, wobei höhere und niedrigere Dosierungen eine verminderte Aktivität und Dosierungen im mittleren Bereich eine stimulierende Aktivität bewirken (Aspenberg, P., Thorngren, KG, Lohmander, LS; Dose-dependent stimulation of bone induction by basic fibroblast growth factor in rats. Acta Orthop Scand 62: 481–484, 1991).
Die anderen oben beschriebenen Wachstumsfaktoren können auf die gleiche Art und Weise wie Knochenwachstumsfaktoren in Produkte aufgenommen werden. Das heißt, sie können in eine Lösung gebracht und auf einen Block von Aragonit oder einen Verbundstoff von teilchenförmigem Aragonit aufgebracht werden.
Die vorliegende Erfindung umfaßt die Verwendung von Aragonit und einem Protein oder einem Gemisch aus Proteinen, welches in der Lage ist, Knochenbildung zu induzieren, wenn es in einen Körper implantiert wird, für die Herstellung eines osteogenen Produkts für die Induktion von Knochenbildung. Wie es oben angemerkt ist, betreffen die meisten Verwendungen der vorliegenden Erfindung Anwendungen am Menschen. Die Verwendung ist jedoch auch für eine breite Vielfalt von Tieren, welche insbesondere andere Säugetiere einschließen, geeignet. Wie er hierin verwendet wird, bezieht sich der Begriff implantiert auf das Plazieren des Produkts der vorliegenden Erfindung in irgendeinen Knochendefekt oder einen anderen Bereich, in welchem Knochenwachstum erwünscht ist. Durch Implantieren eines Produkts wird Knochenbildung durch den Knochenwachstumsfaktor induziert und der Aragonit wirkt als ein osteokonduktives Mittel. Im Verlaufe der Zeit werden Aragonitmaterialien resorbiert, was eine gleichmäßige Knochenbildung innerhalb eines defekten Bereichs ermöglicht.
Die vorliegende Verwendung kann in einer Vielzahl von Anwendungen eingesetzt werden, wo immer ein Bedarf besteht, Knochen zu erzeugen. Solche Anwendungen umfassen die Induzierung von Knochenbildung für Hüftaustauschoperationen, Knieaustauschoperationen, Wirbelfusionsverfahren, Reparatur von periodontalen Defekten, Behandlung von Osteoporose, Reparatur von Knochentumordefekten und Reparatur von Knochenbrüchen.
Im Falle von Hüftaustauschoperationen wird das Kugel- und Pfannengelenk einer Hüfte ausgetauscht, wenn die Hüfte einer Person nicht richtig funktioniert. Der Kugelabschnitt eines Gelenks wird durch chirurgisches Entfernen des Kugelabschnitts von dem Ende des Oberschenkelknochens ausgetauscht. Der künstliche Kugelabschnitt besitzt ein funktionales Kugelende, bei dem das gegenüberliegende Ende ein Dorn ist, welcher in das proximale Ende des Oberschenkelknochens, von dem der natürliche Kugelabschnitt entfernt wurde, eingesetzt wird. Der Dorn kann eine poröse Oberfläche haben, so daß Knochenwachstum um den Dorn herum den Dom in dem Oberschenkelknochen verankern kann. Das Produkt der vorliegenden Erfindung in Teilchenform wird zwischen den Dorn und den Hohlraum in dem Oberschenkelknochen, in welchen der Dom einzusetzen ist, geschichtet oder gepackt. Der Sockelabschnitt eines Gelenks wird durch Einsetzen eines künstlichen Sockels in den natürlichen Sockel ausgetauscht. Der künstliche Sockel wird so dimensioniert, daß er zu der künstlichen Kugel paßt. Auf der Oberfläche des künstlichen Sockels, welche in Kontakt mit dem natürlichen Sockel ist, kann der künstliche Sockel eine poröse Oberfläche aufweisen. Das Produkt der vorliegenden Erfindung in Teilchenform wird in dem Hohlraum des natürlichen Sockels plaziert, so daß nach Plazierung des künstlichen Sockels das Produkt zwischen dem natürlichen und dem künstlichen Sockel ist. Auf diese Art und Weise wird der künstliche Sockel, wenn Knochen gebildet wird, in dem natürichen Sockel verankert.
In Hüftaustauschverfahren und anderen Verfahren, welche Teilchenformen von Aragonit verwenden, kann Aragonit mit verschiedenen Porositäten verwendet werden. Aragonit von der Koralle Porites ist für solche Anwendungen bevorzugt.
Produkte der vorliegenden Erfindung sind auch für die Verwendung in Knieaustauschoperationen geeignet. Knieprothesen haben eine Oberschenkel- und eine Schienbeinkomponente, welche in das distale Ende des Oberschenkelknochens bzw. das chirurgisch präparierte Ende des Schienbeins eingesetzt werden. Das Produkt der vorliegenden Erfindung in Teilchenform wird zwischen die Oberschenkel- und/oder Schienbeinkomponenten der Prothese und die entsprechenden Abschnitte des Oberschenkelknochens und des Schienbeins geschichtet oder gepackt. Auf diese Art und Weise wird die Prothese verankert, wenn Knochenbildung zwischen der Prothese und den Knochen induziert wird.
Produkte der vorliegenden Erfindung sind auch für die Verwendung in Wirbelfusionsoperationen geeignet, bei welchen es erwünscht ist, zwei Wirbel in Bezug zueinander im wesentlichen zu immobilisieren. Typischerweise liegt das Produkt in der Form von teilchenförmigem Verbundmaterial vor. Das Verbundmaterial kann z. B. zwischen benachbarten Dom- und Querfortsätzen aufgebracht werden, so daß nach Knochenbildung in dem Verbundstoffmaterial zwei benachbarte Wirbel durch Fusion zwischen den entsprechenden Dornfortsätzen und Querfortsätzen verbunden werden. Alternativ können Blockformen von Aragonit verwendet werden. Zum Beispiel können zwei Wirbel durch Anordnung eines oder mehrerer Blöcke von Aragonit mit Knochenwachstumsprotein zwischen gegenüberliegenden Oberflächen der Rumpfabschnitte der zwei benachbarten Wirbel in der ungefähren Position der ursprünglichen Scheibe fusioniert werden. Die zwei Wirbel werden fusioniert, wenn sich zwischen jedem Wirbel und jeder Seite des Blocks Knochen entwickelt.
Wenn er in Wirbelfusionsverfahren und insbesondere dem zuletzt beschriebenen Verfahren in dem unteren Dorn eingesetzt wird, wird relativ dichter Aragonit verwendet. Typischerweise ist ein Aragonit geeignet, der weniger als etwa 35% porös, vorzugsweise weniger als etwa 25% porös und besonders bevorzugt weniger als etwa 10% porös ist. Zum Beispiel ist Aragonit, der von der Koralle Acropora stammt, für solche Verfahren bevorzugt.
Im Falle von periodontalen Defekten wird das Produkt der vorliegenden Erfindung typischerweise in Teilchen- oder Verbundstofform verwendet und ist zu der defekten Form passend. Wenn Knochenwachstum induziert und der Aragonit resorbiert wird, füllt Knochen den Defekt auf.
In der Behandlung von Osteoporose werden Teilchen- oder Verbundstofformen des vorliegenden Produkts in vorhandenen Knochen injiziert, um die Wirkungen von Osteoporose, bei der ein Verlust an Knochendichte vorliegt, zu beseitigen. Wenn festgestellt wird, daß die Knochendichte in einem lokalisierten Bereich niedrig ist, kann z. B. solch eine Injektion in diesem Bereich vorgenommen werden.
BEISPIELE
Beispiel 1
Ein Produkt, das natürliche Koralle und Knochenwachstumsfaktor umfaßte, wurde hinsichtlich der Fähigkeit der Koralle, als eine resorbierbare osteokonduktive Trägermatrix für den Knochenwachstumsfaktor an subkutanen Stellen in Ratten zu wirken, getestet.
A. Korallenteilchen
Die verwendeten natürlichen Korallenimplantate umfaßten die Spezies Porites sp. mit einem Volumen untereinander verbundener Poren von 49 ± 2 Prozent und einem mittleren Porendurchmesser von 150 μm. In diesem Experiment wurden Korallenteilchen verwendet, die 630–710 Mikrometer (μm) maßen (Inoteb, St. Gonnery, Frankreich).
B. Knochenwachstumsfaktor
Knochenwachstumsfaktor wurde aus den Cortexdiaphysen von Rinderröhrenknochen isoliert. Das Knochenmark und weiches Gewebe wurden von den Röhrenknochen gereinigt, und die Knochen wurden pulverisiert und in 1,0 normaler (N) Salzsäure bei einem Gewicht-zu-Volumen-Verhältnis von 1 : 13 für 16 h bei 25°C demineralisiert. Die Knochenteilchen wurden in destilliertem Wasser gewaschen und anschließend in einer gepufferten Lösung extrahiert, die 4 N Guanidinhydrochlorid, gepuffert mit 0,1 N Tris, pH 7,6, enthielt, bei einer Konzentration von 3 Millilitern gepufferter Lösung pro Gramm des ursprünglichen gepulverten Knochens. Der Knochen wurde für 48 h bei 15°C extrahiert. Die extrahierten Knochenteilchen wurden dann durch eine Reihe von chromatographischen Reinigungsstufen geleitet, wie sie in der US-Anmeldung mit der Seriennummer 07/689,459 beschrieben sind, um Knochenwachstumsfaktor mit knocheninduktivem Effekt bei Dosierungen von weniger als 35 Mikrogramm (μg) zu extrahieren. Der Knochenwachstumsfaktor wurde zu dem oben beschriebenen vom Rind abgeleiteten Kollagen hinzugefügt und lyophilisiert.
C. Trägervehikel
Für Tests in Ratten wurden zwei Sätze von Scheiben für eine subkutane Implantation in Ratten verwendet. Ein Satz von Scheiben umfaßte Korallenteilchen in Verbindung mit einer 1%-igen Dispersion eines vom Rind abgeleiteten Atelokollagens vom Typ I (American Biomaterials Corp., Plainsboro, NJ). Der zweite Satz von Scheiben umfaßte 350–375 μg des Knochenwachstumsfaktors und des oben beschriebenen Kollagengemischs, das in sterilem Wasser wiederhergestellt war, hinzugefügt zu Korallenteilchen. Korallenteilchen, die mit Kollagen mit oder ohne Knochenwachstums faktor kombiniert waren, wurden in Scheiben mit 8 Millimeter Durchmesser und 3 Millimeter Dicke gegossen und lyophilisiert. Die Formulierung war geeignet zur Herstellung von etwa 10 Scheiben.
D. Basischer Fibroblastenwachstumsfaktor
Scheiben, die gereinigten basischen Fibroblastenwachstumsfaktor (bFGF) enthielten, wurden ebenfalls für eine Implantation hergestellt. bFGF wurde zu Korallenteilchenscheiben mit oder ohne hinzugefügtem Knochenwachstumsfaktor hinzugefügt. 15 Nanogramm bFGF (IMEDEX, Chaponost, Frankreich) pro Milligramm Korallenteilchenscheibe wurden auf eine Scheibe pipettiert und in die Scheibe aufsaugen gelassen.
E. Implantationsverfahren
Einundzwanzig Long-Evans-Ratten wurden für diese Studie verwendet. Die Ratten wurden unter Verwendung von 40 Milligramm pro Kilogramm Zoletil 50 (Tiletaminhydrochlorid und Zolazepamhydrochlorid; Laboratoires Reading, L'Hay-Les-Roses, Frankreich) betäubt. Die Ratten wurden rasiert und für die Operation vorbereitet. Unter Anwendung aseptischer Techniken wurden vier Einschnitte in dem ventralen Bereich und zwei auf jeder Seite der Mittellinie vorgenommen. Durch Anwendung von stumpfem Auseinanderdrängen wurden subkutane Taschen erzeugt und die Implantate an den in 2 gezeigten Stellen in den Ratten plaziert. Es wurde darauf geachtet, eine Kreuzreaktion der Implantate zu vermeiden. Die Einschnitte wurden dann unter Verwendung von Klammem geschlossen. Tabelle 2 faßt die Verteilung der Implantate und der untersuchten Zeiträume zusammen. TABELLE 2: Verteilung von Implantaten und Tötungszeiten (Anzahl von Implantaten pro Zeitraum)

CC: Koralle:Kollagen
BGF: Knochenwachstumsfaktor
bFGF: basischer Fibroblastenwachstumsfaktor

F. Histologische Analyse von gefärbten Eplantaten
Die Ratten wurden unter Verwendung einer letalen intraperitonealen Injektion von Dolethal getötet. Proben wurden entnommen, grob untersucht, in 40% Ethanol fixiert, in zunehmenden Konzentrationen an Ethanol entwässert und infiltriert und in Polymethylmethacrylat (PMMA) eingebettet. Die Proben wurden auf einer langsamen Diamantsäge geschnitten, auf Plexiglas^®-Objektträgem aufgeklebt, geschliffen und auf 40–60 μm poliert und mit einer Kombination von Stevenel'schem Blau und Van Gieson Picro-Fuchsin gefärbt.
1. Zwei-Wochen-Explantate
Es wurden einundzwanzig von einundzwanzig Tieren analysiert. Die Implantate wurden durch die Haut abgetastet und einfach bei der Explantation visualisiert. Bei Verwendung der CC- und CC:bFGF-Implantate wurde keine Knochenbildung festgestellt. Daher wurden die CC- und CC-bFGF-Implantate als Negativkontrollen verwendet. Nach zwei Wochen waren die CC- und CC:bFGF-Proben mit Fasergewebe infiltriert. Die Reste des Kollagenverbundstoffs waren in der Mitte des Implantats deutlich sichtbar und waren manchmal dystrophischer Mineralisierung unterworfen. Die Korallenteilchen zeigten wenig Anzeichen von Resorption, insbesondere solche Teilchen, die nach wie vor in der Mitte des Implantats von Kollagen umgeben waren. Es gab keinen Unterschied zwischen den Ergebnissen der CC- und CC:bFGF-Implantate.
Signifikante osteokonduktive Aktivität wurde in den Proben, die Knochenwachstumsfaktor enthielten, nach zwei Wochen der Implantation festgestellt. Reichliche Knorpelbildung mit Chondroblasten und extrazellulärer Matrix wurde sowohl in den CC:BGF- als auch den CC:BGF:bFGF-Implantaten festgestellt. Der Knorpel bildete einen inneren Ring des Knöchelchens, wobei weiter entwickelter mineralisierender Knorpel und osteoblastische Knochenbildung den äußeren Ring bildeten. Der neu gebildete Knochen war nicht voll entwickelt und verwoben. Die Korallenteilchen in Richtung der Mitte des Implantats blieben praktisch unverändert von nicht-resorbierter Kollagenmatrix umgeben. Korallenteilchen in Richtung des äußeren Randes zeigten etwas Resorption und waren entweder von Knorpelbildung oder neuem Knochen umgeben. Die Proben wiesen häufig einen infarzierten Charakter auf mit etwas, was als eine Flüssigkeitsrückhaltung des Kollagen-"Schiebens" der Koralle in Richtung des äußeren Randes erschien.
2. Vier-Wochen-Explantate
In Explantaten der CC- und CC-bFGF-Implantate, die nach vier Wochen entfernt wurden, wurde keine Knochenbildung festgestellt. Etwas dystrophische Mineralisierung war in diesen Proben vorhanden. Erhöhte Resorption von Korallenteilchen, insbesondere in Richtung des äußeren Randes des Explantats, wurde festgestellt, wenn die Zwei-Wochen-CC- und -CC:bFGF-Proben mit den Vier-Wochen-Proben verglichen wurden. Die Explantate waren im allgemeinen kleiner und flacher als das implantierte Material.
Die CC:BGF- und CC:BGF:bFGF-Proben, die nach vier Wochen entnommen wurden, waren mineralisiert mit der Ausnahme einer Probe, wo geringe Mengen an Knorpel nach wie vor deutlich waren. Allgemein wurde in den Proben mineralisierender Knorpel und Knochenbildung über Osteoblasten festgestellt. Dünne Lagen eines von Osteoblasten abgeleiteten Knochens wurden an der äußeren Grenze des Knöchelchens gesehen. Lagen von verwobenem Knochen und mineralisiertem Knorpel wurden in Richtung der mittleren Bereiche festgestellt. Zwischen diesen zwei Lagen befand sich reichlich hematopoietisches Knochenmark. In Richtung der Mitte des Explantats blieben die Korallenteilchen ziemlich groß und von Fasergewebe und den Resten des Kollagenverbundstoffs umgeben. Weiter außerhalb konnte gesehen werden, daß die Koralle von Knochen und mineralisierendem Knorpel umgeben war und in dem Prozeß der Resorption zu sein schien, was dadurch angezeigt wurde, daß die Teilchen eine kleinere Größe besaßen.
3. Acht-Wochen-Eplantate
Die CC- und CC:bFGF-Probenimplantate zeigten weiterhin Resorption der Koralle durch Makrophagen und mehrkernige Zellen, wenn sie nach acht Wochen der Implantation entnommen wurden. Es wurde jedoch keine Knochenbildung oder Knorpel festgestellt.
Die CC:BGF- und CC:BGF:bFGF-Proben zeigten weiterhin unterschiedliche Ausmaße an sich entwickelnder Knochenbildung nach acht Wochen der Implantation. In einigen CC:BGF-Proben war die Kollagenmatrix in der Mitte des Knöchelchens vollständig durch Trabekelknochen und hematopoietisches Knochenmark ersetzt. Darüber hinaus war sehr wenig Koralle in diesen Explantaten übrig, und die Korallenteilchen, die verblieben, waren klein und von neuem Knochen umgeben. In den restlichen CC:BGF-Proben waren zwei separate Lagen der Knochenbildung mit dazwischenliegendem hematopoietischem Knochenmark vorhanden, was eine weniger stark voranschreitende Knochenbildung anzeigte. Es wurden auch nicht-resorbierte Korallenteilchen in der Mitte und resorbierende kleinere Teilchen in Richtung des äußeren Randes festgestellt.
Somit zeigen die Ergebnisse der histologischen Färbung, daß Implantate, die Korallenteilchen enthalten, osteokonduktiv und resorbierbar sind. Die Ergebnisse zeigen auch, daß Knochenwachstumsfaktor in der Gegenwart oder Abwesenheit von bFGF Knochenbildung induziert. bFGF trägt jedoch nicht zu der Knochenbildung bei.
G. Semiquantitative histologische Analyse

Es wurde ein semiquantitatives Bewertungssystem verwendet, um die Menge und das Voranschreiten der Knochenbildung zu analysieren und zu vergleichen. Tabelle 3 faßt histologische Bewertungen und deren bestimmende Eigenschaften, die zur Analyse der Proben verwendet wurden, zusammen. Bewertungen von 1–4 bedeuten Anzeichen von Chondrogenese. Bewertungen von 5–8 bedeuten Abwesenheit von Knorpel. Eine höhere Bewertung bedeutet ein weiter entwickeltes Ossikulum. TABELLE 3: Bewertungssystem für histologische Schnitte

Wert	Charakteristisches Erscheinungsbild
0	– Keine Mineralisierung, ausgenommen dystrophischer Mineralisierung – Korallengröße unverändert
1	– Fokale Bereiche (< 50% der Schnittfläche) an mineralisiertem Gewebe von zellulärem Ursprung – Minimale Korallenresorption

2	– Etwas Mineralisierung an äußeren Rändern – Wenig oder kein hematopoietisches Knochenmark – Minimale Korallenresorption
3	– Mineralisiertes Gewebe zeigt kreisförmiges Muster an äußeren Rändern – Etwas hematopoietisches Knochenmark – Etwas Korallenresorption
4	– Deutlicher, aber dünner Rand von Knochen an der Peripherie mit aktiven osteoblastischen Oberflächen – Hematopoietisches Knochenmark und Korallenresorption – Etwas Chondrozyten nach wie vor vorhanden
5	– Alles mineralisierte Gewebe ist osteoblastisch, jedoch zufällig orientiert und nicht kohärent – Große Menge an Koralle verbleibt
6	– Alles mineralisierte Gewebe ist osteoblastisch; kohärentere Knochenstruktur am äußeren Rand mit Lücken – Weniger Koralle; einige nach wie vor groß
7	– Alles mineralisierte Gewebe ist osteoblastisch; beständiger äußerer Knochenrand – Hauptsächlich kleine Korallenpartikel
8	– Dicker äußerer Knochenrand gefüllt mit hematopoietischem Knochenmark; Knochen überall im Ossikulum – Jede verbleibende Koralle von Knochen umgeben und im Prozeß der Resorption

Statistische Analyse wurde unter Verwendung eines zweiseitigen gepaarten Student-t-Tests und von Statview-Software durchgeführt. Die Signifikanz wurde mit p < 0,05 angenommen.
Unter Verwendung des in Tabelle 3 beschriebenen Bewertungssystems wurden histologische Proben hinsichtlich ihrer Knorpel- und Knochenbildungsfähigkeit und der relativen Entwicklung des mineralisierten Gewebes beurteilt. 3 faßt die relative Entwicklung der Eplantate in Abhängigkeit von dem implantierten Material über die Zeit zusammen. Die Ergebnisse zeigen, daß Implantate, die Knochenwachstumsfaktor enthalten, größere chondroinduktive und osteoinduktive Aktivität auslösten als Proben ohne Knochenwachstumsfaktor. Die Entwicklung des Ossikulum von Proben, die Knochenwachstumsfaktor enthielten, nahm mit zunehmender Implantationszeit zu. Dies wurde auch qualitativ anhand eines steigenden Mangels an Knorpel und Verdickung der äußeren Knochenlage beobachtet. Die Ergebnisse zeigen auch, daß Proben, die sowohl Knochenwachstumsfaktor als auch bFGF enthielten, eine höhere durchschnittliche statistische Zunahme in der Entwicklung zeigten als Proben mit Knochenwachstumsfaktor alleine (p < 0,05). Die Zunahme wurde jedoch nicht in den Vier-Wochen- und Acht-Wochen-Explantaten festgestellt, obwohl die durchschnittliche Zunahme höher war.
Übereinstimmend mit den Ergebnissen der histologischen Färbung zeigen die Ergebnisse der semiquantitativen Bewertung, daß die Entwicklung von Ossikuli statistisch höher war in Proben, die Knochenwachstumsfaktor enthielten, verglichen mit Proben, die keinen Knochenwachstumsfaktor enthielten.
Beispiel 2
Dieses Beispiel zeigt die Wirksamkeit eines Aragonit- und Knochenwachstumsfaktor-Produkts, Knochenersatz in defekten Ulnaknochen in Kaninchen zu induzieren.
Die Knochenbildung und die Korallenresorption durch CC- und CC:BGF-Verbundstoffe, wie sie in Beispiel 1 beschrieben sind, wurden in einem Modell eines segmentären Knochendefekts in Kaninchen getestet. Segmente wurden von der Ulna des Unterarms von 40 Kaninchen entnommen. Implantate mit der gleichen Form wie das entnommene Segment des Ulnaknochens, typischerweise mit einem Durchmesser von etwa 5 Millimetem und einer Länge von 17 Millimetern, wurden unter Verwendung von CC- und CC:BGF-Verbundstoffen hergestellt. Die Implantate wurden chirurgisch in den Segmentdefekt in der Ulna als ein einzelnes Stück eingesetzt. Explantate wurden nach 2, 4 und 8 Wochen unter Verwendung der in Beispiel 1 beschriebenen Verfahren der histologischen Färbung analysiert.
Die Ergebnisse zeigen, daß Explantate nach 2 Wochen von überbrückten Ulnaknochen unter Verwendung von CC:BGF-Verbundstoff eine Überbrückung des Defekts zeigten. Mineralisierender Knochen und Knorpelbildung über Osteoblasten wurden in den Bereichen festgestellt, wo der Ulnaknochen mit dem CC:BGF-Verbundstoff in Kontakt war, und an dem äußeren Rand der CC:BGF-Grenze wurden dünne Lagen eines von Osteoblasten abgeleiteten Knochens gesehen. Die Korallenteilchen des CC:BGF-Verbundstoffs in den Explantaten nach 4 Wochen waren > 90% resorbiert und durch Knochen ersetzt. Nahezu die gesamte Koralle des CC:BGF-Verbundstoffs war in den Explantaten nach 8 Wochen resorbiert und durch Trabekelknochen und hematopoietisches Knochenmark ersetzt.
Die CC-Explantate zeigten zu allen Zeitpunkten erheblich geringere Knochenbildung und Resorption als die CC:BGF-Explantate.
Die Ergebnisse zeigen, daß natürliche Koralle ein formbares Knochentransplantatmaterial bereitstellt, das unbelastete Knochendefekte auffüllen kann. Der CC:BGF-Verbundstoff stellt sowohl osteoinduktive als auch osteokonduktive Eigenschaften bereit. Darüber hinaus wird die Koralle mit einer Geschwindigkeit resorbiert, die zu derjenigen des sich neu bildenden Knochens ähnlich ist.
Beispiel 3
Dieses Beispiel vergleicht die Wirksamkeit von Knochenwachstumsprotein in einer Alginatmatrix bei der Knochenbildung mit derjenigen von Knochenwachstumsprotein und Aragonit in einer Alginatmatrix.
Produkte wurden hergestellt, indem Scheiben aus entweder (1) einer 4%-igen wäßrigen Dispersion von Alginsäure [Sigma A-7128]-Natriumsalz von dem Seetang Macrocystis pyrifera (2%-ige Lösung) oder (2) eine 4%-ige wäßrige Dispersion von Alginsäure mit Koralle (teilchenförmige Porites mit 300–450 Mikrometern mit 50% Porosität von Inoteb aus St. Gonnery, Frankreich) mit einem Gewichtsverhältnis von 1 : 1 ausgebildet wurden. Eine Dosis von 30–35 Mikrogramm Knochenwachstumsfaktor, der gemäß den Beispielen 1 und 2 der US-Anmeldung mit der Seriennummer 07/689,459 hergestellt worden war, wurde zu jeder Scheibe hinzugefügt, welche dann in Formen eingesetzt und lyophilisiert wurden. Zusätzlich wurden Kontrollscheiben ohne Knochenwachstumsfaktor hergestellt.
Ein kleiner Einschnitt (≈ 6 mm) wurde in der Haut des ventralen Thoraxbereichs einer weiblichen Long-Evans-Ratte, die etwa 50–100 g wog, vorgenommen. Durch stumpfes Auseinanderdrängen wurde eine Tasche in der Nähe der Haut hergestellt. Eine der zuvor hergestellten Scheiben, die Knochenwachstumsfaktor enthielt, wurde in die Tasche eingesetzt, und der Einschnitt wurde mit Tevdek II^TM (Ethicon) 5-0-Nähten geschlossen. Eine Kontrollscheibe ohne Knochenwachstumsfaktor wurde in gleicher Weise in jedes Tier implantiert. Die implantierten Scheiben waren voneinander durch einen minimalen Abstand von 1 cm getrennt. Es wurde eine Gruppe von 5 Ratten mit "Plus Koralle"-Scheiben hergestellt, und es wurde eine Gruppe von 5 mit "Minus Koralle"-Scheiben hergestellt. Nach 4 Wochen wurden die Ratten durch Asphyxie mit Kohlendioxid getötet, und die Testmaterialien wurden entnommen. Alle Kontrollscheiben und die "Minus Koralle"-Scheiben wurden in Polyglycolmethacrylat eingebettet und in 5 Mikrometer dicke Schnitte auf einem Mikrotom geschnitten. Die "Plus Koralle"-Scheiben wurden in Polymethylmethacrylat eingebettet, auf einer Diamantsäge geschnitten und auf etwa 50 Mikrometer geschliffen und poliert.
Nach Röntgenuntersuchung war in den Kontrollen oder in den "Minus Koralle"-Scheiben kein Knochen nachweisbar. Röntgenuntersuchung war bei der Bestimmung von Knochenbildung in den "Plus Koralle"-Proben nicht hilfreich.
Histologische Analyse der Kontrollen und der "Minus Koralle"-Proben zeigte keine Knochen- oder Knorpelbildung. Drei der fünf "Plus Koralle"-Scheiben hatten eine Knochenbildung, was durch das Auftreten von Knorpel, mineralisierendem Knorpel und Knochen gezeigt wurde. Der Knorpel und der Knochen waren innerhalb des Alginatnetzwerks und im allgemeinen in der Nähe zu Korallenteilchen lokalisiert.
Die Ergebnisse dieses Beispiels zeigen, daß Koralle eine vorteilhafte Wirkung bei der verstärkten Bildung von Knochen in einer Matrix mit Knochenwachstumsfaktor hat.
Beispiel 4
Dieses Beispiel befaßt sich mit Rattenstudien unter Verwendung von Korallenblockimplantaten mit Knochenwachstumsfaktor und keinem zusätzlichen Träger.
A. Herstellung von Korallenblöcken
Es wurden 5 × 7 × 2 Millimeter große rechteckige Blöcke aus einer größeren Platte von Porites-Koralle unter Verwendung einer Diamantsäge geschnitten. Die rechteckigen Blöcke wurden gereinigt und getrocknet. Fünf Blöcke wurden gleichmäßig mit 25 Mikrolitern einer Lösung von 1,43 Milligramm pro Milliliter Knochenwachstumsfaktor in 10 mM HCl befeuchtet. Somit enthielt jeder Block nominell eine Menge von 36 Mikrogramm Knochenwachstumsfaktor. Fünf zusätzliche Blöcke wurden unter Verwendung einer Lösung von 0,14 Milligramm pro Milliliter BGF hergestellt. Jeder Block enthielt nominell 3,6 Mikrogramm BGF. Alle Blöcke wurden dann schnell auf einer vorgekühlten Glasplatte bei –70°C eingefroren und anschließend über Nacht lyophilisiert.
B. Schädelimplantation
Einschnitte von 7 Millimetern wurden in der Kopfhaut von betäubten weiblichen Long-Evans-Ratten, deren Gewicht im Bereich von 100–130 Gramm lag, vorgenommen. Die periosteale Membran wurde durch Abkratzen entfernt. Ein BGF enthaltender Block wurde an dem Schädel von jedem von 10 Tieren plaziert. Fünf Tieren wurden Blöcke, die 36 Mikrogramm BGF enthielten, implantiert, und 5 Tieren wurden Blöcke, die 3,6 Mikrogramm BGF enthielten, implantiert. Die Einschnitte wurden mit Nähten geschlossen. Nach 6 Wochen wurden die Tiere durch Kohlendioxid-Asphyxie getötet. Die Schädel mit den anhaftenden Korallenblöcken wurden entnommen und in kaltem Methanol fixiert. Die Gewebe wurden entwässert und in Polymethylmethacrylat eingebettet. Schnitte wurden auf einer langsamen Diamantsäge geschnitten, geschliffen und auf etwa 100 Mikrometer poliert.
C. Histologische Analyse
Histologische Untersuchung der gefärbten Schnitte zeigte eine erhebliche Proliferation von intramembranartigem Knochen, der von der Schädeldachoberfläche aufwärts und in die porösen Räume der Korallenblöcke wuchs. Es gab eine stärkere Proliferation von neuem Knochen an der Grenzfläche zwischen dem Schädel und dem Korallenblock in der Gruppe mit der Dosierung von 36 Mikrogramm als in der Gruppe mit der Dosierung von 3,6 Mikrogramm. In beiden Gruppen war der Knochen, der sich bildete, entwickelt und von lamellarer Art mit Nachweisen von Knochenmarkselementen in den dazwischenliegenden Räumen. Viele aktive Osteoblasten und knochenbildende Oberflächen wurden nachgewiesen. Der Knochen, der sich in den Korallenblöcken bildete, war in engem Kontakt mit den Korallenoberflächen. Die Korallenblöcke waren starr an den Rattenschädeln befestigt.
Somit zeigen die Ergebnisse der histologischen Daten, daß Koralle in der Gegenwart von BGF und in der Abwesenheit von zusätzlichen Trägerkomponenten, wie Kollagen, erhebliche und effiziente Knochenbildung induziert.
Obwohl verschiedene Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung ausführlich beschrieben wurden, ist es klar, daß Modifikationen und Anpassungen dieser Ausführungsformen für den Fachmann auf dem Gebiet nahliegend sein werden. Es soll jedoch ausdrücklich klar sein, daß sol che Modifikationen und Anpassungen innerhalb des Umfangs der vorliegenden Erfindung liegen, wie sie in den nachfolgenden Patentansprüchen angegeben ist.

Claims

Zusammensetzung für die Verwendung in einem osteogenen Produkt, das Aragonit und ein Protein oder ein Gemisch aus Proteinen, welches in der Lage ist, Knochenbildung zu induzieren, wenn es in einen Körper implantiert wird, umfaßt.
Zusammensetzung für die Verwendung in einem osteogenen Produkt nach Anspruch 1, welche weiterhin ein Material umfaßt, das unter Kollagen, Fibrin, Alginat und Gemischen davon ausgewählt ist.
Zusammensetzung für die Verwendung in einem osteogenen Produkt nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, wobei das Protein oder das Gemisch aus Proteinen, welches in der Lage ist, Knochenbildung zu induzieren, wenn es in einen Körper implantiert wird, unter gereinigtem Proteingereinigten Proteinen, rekombinant hergestelltem Protein/hergestellten Proteinen und Gemischen davon ausgewählt ist.
Zusammensetzung für die Verwendung in einem osteogenen Produkt nach einem der vorangegangenen Ansprüche, wobei das Protein oder das Gemisch aus Proteinen, welches in der Lage ist, Knochenbildung zu induzieren, wenn es in einen Körper implantiert wird, eine Aminosäurezusammensetzung von 20,7 bis 26,1 Mol-% saurer Aminosäuren, 11,3 bis 15,7 Mol-% Hydroxyaminosäuren, 37,6 bis 42,4 Mol-% aliphatischer Aminosäuren, 5,8 bis 7,9 Mol-% aromatischer Aminosäuren und 13,3 bis 19,9 Mol-% basischer Aminosäuren in einer Gesamtmenge von 100 Mol-% umfaßt.
Zusammensetzung für die Verwendung in einem osteogenen Produkt nach einem der vorangegangenen Ansprüche, wobei das Protein oder das Gemisch aus Proteinen, welches in der Lage ist, Knochenbildung zu induzieren, wenn es in einen Körper implantiert wird, nach Hydrolyse eine Aminosäurezusammensetzung von 20,7 bis 26,1 Mol-% ASP(+ASN) und GLU(+GLN), von 11,3 bis 15,7 Mol-% SER und THR, von 37,6 bis 42,4 Mol-% ALA, GLY, PRO, MET, VAL, ILE und LEU, von 5,8 bis 7,9 Mol-% TYR und PHE und von 13,3 bis 19,9 Mol-% HIS, ARG und LYS, basierend auf der gesamten molaren Menge der Aminosäuren und in einer Gesamtmenge von 100 Mol-%, umfaßt.
Zusammensetzung für die Verwendung in einem osteogenen Produkt nach einem der vorangegangenen Ansprüche, wobei das Produkt zwischen 10 Mikrogramm Protein oder Gemisch aus Proteinen/g Aragonit und 1000 Mikrogramm Protein oder Gemisch aus Proteinen/g Aragonit enthält.
Zusammensetzung für die Verwendung in einem osteogenen Produkt nach einem der vorangegangenen Ansprüche, wobei der Aragonit in partikulärer Form vorliegt.
Zusammensetzung für die Verwendung in einem osteogenen Produkt nach einem der vorangegangenen Ansprüche, wobei der Aragonit in der Form eines Blocks vorliegt.
Osteogenes Produkt mit Aragonit und einem Protein oder einem Gemisch aus Proteinen, welches in der Lage ist, Knochenbildung zu induzieren, wenn es in einen Körper implantiert wird, nach einem der vorangegangenen Ansprüche.
Verwendung von Aragonit und einem Protein oder einem Gemisch aus Proteinen, welches in der Lage ist, Knochenbildung zu induzieren, wenn es in einen Körper implantiert wird, für die Herstellung eines osteogenen Produkts für die Induktion von Knochenbildung.
Verwendung nach Anspruch 10, wobei das Produkt für die Verwendung in einer Hüftersatzoperation, einer Knieersatzoperation, einer Wirbelfusion, einer Reparatur von Periodontaldefekten, einer Behandlung von Osteoporose, einer Reparatur von Knochendefekten und einer Reparatur von Knochenbrüchen vorgesehen ist.
Verwendung nach Anspruch 11, wobei die Hüftersatzoperation die Implantation einer künst^lichen Hüfte umfaßt, der Aragonit in partikulärer Form vorliegt und das Produkt zwischen den Knochen und entweder den Kugel- oder den Pfannenabschnitt der künstlichen Hüfte angeordnet wird.