DE69226949T2

DE69226949T2 - Isolierter osteogener faktor

Info

Publication number: DE69226949T2
Application number: DE69226949T
Authority: DE
Inventors: Abdulwahid Edmonton Alberta T6J 2H1 Abdulwajid; Donna Mississauga Ontario L4T 3T7 Bueschkens; Deanna Ottawa Ontario K1Y Oc9 Byrne; Alain E. Kingston Ontario K7M 8K5 Lagarde
Original assignee: Allelix Biopharmaceuticals Inc
Current assignee: Allelix Biopharmaceuticals Inc
Priority date: 1991-03-28
Filing date: 1992-03-25
Publication date: 1999-05-20
Anticipated expiration: 2012-03-26
Also published as: DE69226949D1; EP0577649B1; AU1421792A; US5403825A; WO1992017501A1; PT100313B; CA2107118A1; EP0577649A1; US5169837A; IE920990A1; PT100313A; ATE170866T1; CA2107118C; DK0577649T3

Description

Gebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft Verbindungen und Zusammensetzungen, die therapeutisch wertvoll sind, um Knochen von Säugern zu heilen und zu reparieren. Insbesondere betrifft die Erfindung einen neuen osteogenen Faktor, der aus Knochenextrakten von Säugern wiedergewinnbar ist und nützlich ist, um Knochenbildung zu induzieren.

Hintergrund der Erfindung

Bei Knochen handelt es sich um ein mineralisiertes Gewebe von komplexer chemischer und zellulärer Zusammensetzung, welches kontinuierlich während der gesamten Lebensspanne von Säugern umgebaut wird. Dem Umbauprozeß liegen Zellen der Osteoblasten-Linie zugrunde, die an der Knochenbildung beteiligt sind, sowie Zellen der Osteoklasten-Linie, die an der Resorption des Knochens beteiligt sind. Diese beiden Zelltypen sind dafür bekannt, von distinkten früheren Vorläuferzellen abzustammen, d. h. von Stammzellen, die längs separater Wege sich in reife und funktionelle Zellen als Antwort auf derartige endogene Mediatoren wie systemische Hormone, Cytokine und Wachstumsfaktoren differenzieren.
Einige der Moleküle, die man dafür verantwortlich hält, für die Knochenentwicklung und -reparatur essentielle biologische Prozesse zu steuern, wurden isoliert und biochemisch identifiziert, außerdem wurden Technologien mit rekombinanter DNA dazu verwendet, relativ große Mengen derjenigen Stoffe mit einer auf Proteinen basierenden Struktur zu produzieren. Von diesen Fortschritten nimmt man an, daß sie schlußendlich Medizinern und Chirurgen definierte therapeutische Zusammensetzungen zur Verfügung stellen, die in klinischen Situationen verabreicht werden können, wenn beschleunigte Heilung, nachhaltige Reparatur oder Rekonstruktion von skelett- und cranio-maxillofazialen Defekten erwünscht sind, beispielsweise bei der Vereinigung von Brüchen, die durch Traumata oder als Konsequenz von Osteoporose, autogenen und allogenen Knochenspenden, plastischer Chirurgie und Korrektur von angeborenen Deformierungen verursächt sind.
Viele der Verbindungen mit einem günstigen Effekt auf die Knochenentwicklung sind Proteine und Glykoproteine, welche ursprünglich aus Extrakten von demineralisierten, d. h. säurebehandelten Säugerknochen identifiziert und isoliert wurden. Diese können in drei distinkte Klassen kategorisiert werden.
Die eine Klasse von Molekülen, die einen Effekt auf die Knochenzellaktivität zeigt, beinhaltet mitogene Substanzen, die zum größten Teil zuvor dafür bekannt waren, einen mitogenen Effekt auf andere Zelltypen als Knochenzellen zu haben, wie etwa Fibroblasten. Unter den Molekülen in dieser Klasse sind Polypeptide, die eine heparinbindende Affinität zeigen, wie etwa der saure Fibroblast-Wachstumsfaktor (15-18 kDa) und basischer Fibroblast-Wachstumsfaktor (18-22 kDa) ebenso wie der von Blutplättchen abgeleitete Wachstumsfaktor (28-31 kDa) und eine Isoform mit hohem Molekulargewicht (83 kDa) des insulinähnlichen Wachstumsfaktors II, der ursprünglich Skelett-Wachstumsfaktor genannt wurde.
Eine zweite Klasse von osteogenen Molekülen umfaßt die Faktoren, die die Knorpelbildung induzieren, genannt CIF-A (26 kDa) und CIF-B (26 kDa), welche mit den sogenannten "Transforming Growth Factors" TGF-β&sub1; und TGF-β&sub2;, identisch sind. Es wurde gezeigt, daß TGF-β&sub0; bei der Beschleunigung der Bildung von Knochenmasse in verschiedenen Tiermodellen effektiv ist, jedoch nur nach wiederholter (täglicher) Injektion einer Dosis im Überschuß von 250 ng. Tägliche Injektionen werden auch benötigt, um eine erhöhte Knochenmasse zu erzielen, wenn der in der Kanadischen Patentanmeldung 2,010,660 offenbarte osteogene Faktor (1,5 kDa, pI > 11) angewendet wird.
Eine dritte Klasse von osteogenen Molekülen umfaßt mehrere verwandte Mitglieder der Familie der glycosylierten Proteine, die gekennzeichnet sind durch: eine dimere Struktur, ein Molekulargewicht im Bereich von 25 bis 30 kDa, die Anwesenheit von mehreren Zwischenketten-Disulfid-Bindungen, die wesentlich für die Bioaktivität sind, eine moderate Affinität für Heparin, eine substantielle Homologie auf der Ebene der Aminosäuren mit Spezies von TGF-β, die Fähigkeit, Knochenbildung an knochenuntypischen Orten zu initiieren, wenn sie mit einer mit Knochen kompatiblen Matrix kombiniert und Ratten gegeben werden. In dieser Klasse finden sich mehrere Spezies der sog. "knochenmorphogenetischen Proteine" (28-30 kDa). Ebenso beinhaltet diese Klasse Substanzen, die weniger gut charakterisiert sind, die jedoch zumindest ein charakteristisches Merkmal mit Mitgliedern in dieser Klasse teilen, wie etwa der in dem US-Patent 4,804,744 offenbarte osteogene Faktor (22-24 kDa).
Weitere osteogene Moleküle betreffen die Proteolyse mit Trypsin aus menschlichen Knochen von morphogenen Proteinen aus Knochen.
US-Patent 4,795,804, das EP-A 0 212 474 entspricht, offenbart ein morphogenes Peptid für den Knochen mit einem relativen Molekulargewicht von etwa 4 bis etwa 7 kDa, das sich aus der Proteolyse des morphogenen Proteins des Knochens (BMP) ableitet. Das Peptid ist sowohl osteoinduktiv als auch immunoreaktiv mit einem Anti- BMP-Antikörper.
Wie vorstehend erwähnt, wurden diese osteogenen Substanzen zum größten Teil in Extrakten von zuvor demineralisierten Knochenfragmenten von Säugern entdeckt und daraus isoliert. Bei dem üblicherweise verwendeten Extraktionsprotokoll, das auf das demineralisierte Material angewandt wird, wird Verwendung von extraktiven Lösungen, die ein dissoziierendes Agens wie etwa Harnstoff oder Guanidinium-Hydrochlorid beinhalten, gemacht, um bei der Auftrennung der makromolekularen Aggregate behilflich zu sein, und die auch eine Kombination von Inhibitoren der proteolytischen Aktivität beinhalten, um die Andauung der während der Extraktion freigesetzten Proteinkomponenten zu reduzieren. Eine alternative Herangehensweise, um Knochenextrakte aus Säugern zu erzeugen, ist in US-Patent 3,458,397 beschrieben, wobei ein fragmentierter Knochen sowohl einer stark demineralisierenden Säure als auch dem proteinverdauendem Agens Pepsin exponiert wird. Dies hat zu der Isolierung von osteogenem Material geführt, das in bemerkenswerter Weise das Knochenwachstum erhöht.
Gemäß US-Patent 3,458,397 wird ein osteogenes Material bereitgestellt, wenn Knochenextrakte vom Kalb nach Behandlung mit Säure/Pepsin mit Ethanol ausgefällt und anschließend mit Wasser gestrippt werden, um eine unlösliche Komponente zu erhalten. Wie von Tornberg et al. in Clinical Orthopaedics and Related Research, 1977, 129: 305-312 und später in der gleichen Zeitschrift durch Clark et al., 1988, 237: 226-235 beschrieben, führt dieses osteogene Material zu einem dramatischen Anstieg im Knochengewicht, wenn es in einem phosphatgepufferten Salzlösungsvehikel der Knochenoberfläche zugeführt wird. Eine einzige Injektion einer Dosis von 6 mg des osteogenen Materials führte dazu, daß sich ein Anstieg im Trockengewicht des Armknochens von Ratten von bis zu 30% ergab, bezogen auf den nicht-behandelten kontralateralen Armknochen, wobei der maximale Effekt etwa 7 Tage nach der Injektion auftrat.
Obwohl dieser Effekt auf das Knochenwachstum; der durch das osteogene Material induziert wird, wünschenswert ist und er insbesondere im Kontext der Heilung von Brüchen wertvoll ist, bringt es der rohe Zustand des Materials mit sich, daß es für die Verwendung als menschliches Therapeutikum nicht geeignet ist.
Aufgabe der Erfindung ist es, einen isolierten osteogenen Faktor bereitzustellen.
Eine andere Aufgabe der Erfindung ist es, eine osteogene Zusammensetzung bereitzustellen, die für die Induktion von Knochenwachstum nützlich ist.
Eine andere Aufgabe der Erfindung ist es, ein Verfahren bereitzustellen, um Knochenwachstum im Säuger zu induzieren.

Zusammenfassung der Erfindung

Nunmehr wurde aus Rohextrakten von Knochen von Säugern ein neuer osteogener Faktor isoliert, der in der Lage ist, Knochenwachstum zu induzieren, wenn er dem Knochen zusammen mit einem physiologisch akzeptablen Zufuhr- bzw. Freisetzungsvehikel zugeführt wird. Insbesondere und gemäß einem Aspekt der Erfindung wird ein isolierter wasserlöslicher osteogener Faktor bereitgestellt, der gekennzeichnet ist durch ein relativ niedriges Molekulargewicht von etwa 2,5 kDa, gemessen mittels Filtration auf Sephacryl S 300 unter dissoziierenden Bedingungen, einem schwach sauren isoelektrischen Punkt im pH-Bereich von etwa 4,6 bis 7,2 und einer spezifischen Aktivität von wenigstens etwa 10 Einheiten/mg Proteins, wie mittels des Rattenknochen-Wachstumstests ermittelt. Die Erfindung stellt auch den osteogenen Faktor in seiner gereinigten Form bereit, welche durch eine Wanderung bei Umkehrphasen-Hochauflösungsflüssigchromatographie als ein einzelner Peak bei 214 nm und eine spezifische Aktivität von wenigstens etwa 3.000 Einheiten/mg gekennzeichnet ist.
Gemäß einem weiteren Aspekt der Erfindung wird eine osteogene Zusammensetzung bereitgestellt, die eine effektive Menge des erfindungsgemäßen osteogenen Faktors in Kombination mit einem physiologisch akzeptablen Freisetzungsvehikel umfaßt. Es wird des weiteren gemäß einem verwandten Aspekt der Erfindung ein Verfahren zur Herstellung einer osteogenen Zusammensetzung bereitgestellt, das den Schritt des Kombinierens eines physiologisch akzeptablen Zufuhr- bzw. Freisetzungsvehikels mit einer Menge des osteogenen Faktors umfaßt, welche darin effektiv ist, Knochenbildung zu induzieren.
Gemäß einem weiteren Aspekt der Erfindung wird ein Verfahren zum Induzieren der Knochenbildung in einem Säuger bereitgestellt, welches den Schritt umfaßt, eine erfindungsgemäße osteogene Zusammensetzung dem Knochen an einer Stelle zuzuführen, an der die Knochenbildung erwünscht ist.
Gemäß einem weiteren Aspekt der Erfindung wird ein Verfahren zur Isolierung und Reinigung des vorliegenden osteogenen Faktors aus Knochenextrakten von Säugern bereitgestellt, wie es nachfolgend beschrieben ist.

Kurze Bezugnahme auf die Zeichnungen

Die Erfindung und ihre bevorzugten Ausführungsformen werden nun unter Bezugnahme auf die beigefügten Zeichnungen beschrieben, wobei:
Fig. 1 graphisch die osteogene Antwort illustriert, die induziert wird, wenn angereicherter Knochenextrakt vom Kalb der Knochenoberfläche zugeführt wird;
Fig. 2 graphisch die Dosis-Antwort-Beziehung illustriert, die aufgestellt wurde, wenn der isolierte osteogene Faktor einer Knochenoberfläche in Kombination mit ausgewählten Freisetzungsvehikeln zugeführt wurde;
Fig. 3 die Elutionsprofile des osteogenen Faktors während der Fraktionierung mittels Gelfiltration auf einer Sephacryl S 300-Kolonne unter dissoziierenden Bedingungen (Gdn. HCl) illustriert;
Fig. 4 die Elutionsprofile des osteogenen Faktors auf einer Heparin-Sepharose- Kolonne unter dissoziierenden Bedingungen (Harnstoff) illustriert. Tatsächliche Proteinmengen (in ug), welche im Biotest verwendet wurden, sind angezeigt.
Fig. 5 illustriert das Elutionsprofil des osteogenen Faktors auf einer Hydroxylapatit-Kolonne unter dissoziierenden Bedingungen (Harnstoff). Tatsächliche Proteinmengen (in ug), welche im Biotest eingesetzt wurden, sind angezeigt.
Fig. 6 illustriert das Elutionsprofil des osteogenen Faktors auf einer DEAE- Cellulose-Kolonne bei pH 7,2 und unter dissoziierenden Bedingungen (Harnstoff).
Tatsächliche Proteinmengen (in ug), wie sie im Biotest eingesetzt wurden, sind angezeigt.
Fig. 7 illustriert das Elutionsprofil des osteogenen Faktors auf einer CM- Cellulose bei pH 4,6 und unter dissoziierenden Bedingungen (Harnstoff). Tatsächliche Proteinmengen (in ug), wie sie im Biotest eingesetzt wurden, sind angezeigt.
Figur B illustriert das Elutionsprofil des osteogenen Faktors auf einer C8-Umkehrphasen-HPLC-Kolonne, welche mittels eines Gradienten von Acetonitril in 0,1% Trifluoressigsäure entwickelt wurde.
Fig. 9 illustriert die Proteindosis-Antwort-Beziehung, wie sie durch den osteogenen Faktor in verschiedenen Stadien während der Isolierung hervorgerufen wurde; und
Fig. 10 illustriert den mitogenen Effekt, wie er durch den osteogenen Faktor, Insulin, Epidermal Growth Factor, α-Thrombin und Serum von Ratten-Osteoblasten sowie Fibroblasten von CCL39- und NRK-49F-Zellinien hervorgerufen wurde.

Genaue Beschreibung der Erfindung und ihrer bevorzugten Ausführungsformen

Die Erfindung betrifft einen wasserlöslichen osteogenen Faktor, der die Knochenbildung in Säugern induziert, wenn er der Knochenoberfläche gemeinsam mit einem physiologisch akzeptablen Freisetzungsvehikel zugeführt wird.
Abweichend von anderen osteogenen Faktoren ist der vorliegende osteogene Faktor im Sinne seiner physikalischen Eigenschaften durch die Kombination eines relativ niedrigen Molekulargewichts von etwa 2,5 kDa, gemessen mittels Gelfiltration unter dissoziierenden Bedingungen, und durch einen isoelektrischen Punkt im pH- Bereich von etwa 4,6 bis etwa 7,2 gekennzeichnet. Aufgrund seines Verhaltens, wenn er verschiedenen Auftrennungstechniken unterworfen wird, scheint es sich bei dem isolierten osteogenen Faktor zumindest teilweise um ein Polypeptid zu handeln, und außerdem weist er im wesentlichen keine heparinbindende Affinität auf. Des weiteren behält der Faktor auch nach Exposition für reduzierende Agenzien seine induzierende Aktivität für die Knochenbildung, was nahelegt, daß, falls vorhanden, Disulfidbindungen für die Aktivität nicht erforderlich sind. Außerdem haben Tests ergeben, daß der Faktor weder auf Osteoblasten noch auf Fibroblasten in vitro als ein Mitogen wirkt.
Der vorliegende osteogene Faktor ist ein Bestandteil des Knochens von Säugern und kann aus diesen in einer isolierten und gereinigten Form gewonnen werden, indem übliche Auftrennungstechniken in einer Kombination angewandt werden, die so ausgewählt ist, daß sie die charakteristischen physikalischen und biologischen Eigenschaften des Faktors ausnutzt. Wünschenswerterweise wird der osteogene Faktor aus einem Extrakt von Knochen von Säugern isoliert, der zuerst angedaut worden ist, um seine endogenen Komponenten freizusetzen. Andauung von Knochenmaterial kann dadurch erzielt werden, daß man einen gewaschenen und zerkleinerten Knochen einer Demineralisierung unterzieht, beispielsweise indem man ihn wäßriger Säure wie beispielsweise HCl unterwirft. Zum Zwecke der Extraktion des vorliegenden osteogenen Faktors kann die Andauung des Knochenmaterials in der Abwesenheit von Protease-Inhibitoren, die üblicherweise vom Fachmann eingesetzt werden, durchgeführt werden. In stärker geeigneter Weise kann die Andauung durchgeführt werden, indem man eine Kombination von demineralisierender Säure und einem Proteinandauungsagens wie etwa Pepsin durchführt. Im Anschluß an die Knochenandauung liegt der osteogene Faktor in der löslichen Phase vor und kann aus ihr mit einem Alkanol wie etwa Ethanol gefällt werden. Anschließend an die Exposition gegenüber Ethanol liegt der osteogene Faktor in der unlöslichen Phase vor, die als nützliche Quelle für die Isolierung des vorliegenden osteogenen Faktors dient.
Ein spezifisches Protokoll, das zum Erzeugen des Knochenextrakts, der mit Ethanol präzipitiert wurde und den osteogenen Faktor enthält, ist von Myers et al. in US-Patent 3,458,397 beschrieben, dessen Inhalt hier durch Inbezugnahme inkorporiert wird. Dieses Protokoll nutzt als Quelle des Extrakts schwammige Knochen von Kälbern aus, obwohl es auch gewürdigt wird, daß Knochen, welche von anderen Säugern erhalten wurden, wie etwa von Pferden, Schweinen und menschlichen Lebewesen, auch zu einem Extrakt führen, der den vorliegenden osteogenen Faktor oder dessen Homologe enthält, wenn sie einem derartigen Extraktionsprotokoll unterworfen werden.
Bei dem osteogenen Faktor handelt es sich um eine wasserlösliche Komponente des Knochenextrakts, der der Ethanol-Präzipitation unterzogen wurde. Demgemäß ist es wünschenswert, aus dem Extrakt den osteogenen Faktor durch Waschen mit Wasser herauszuwaschen bzw. zu strippen, vorzugsweise mit wenigstens zwei Waschdurchgängen mit Wasser. In dieser Hinsicht ist es wünschenswert, die Anleitungen, die von Myers et al., vorstehend erwähnt, gegeben werden, zu mißachten und eher die Waschflüssigkeiten als die unlöslichen, verbleibenden Restbestandteile nach Waschen des Ethanol-Präzipitats mit Wasser zurückzubehalten. Dem im Wasser unlöslichen Rest fehlt im wesentlichen die osteogene Aktivität, wenn drei oder mehr Waschzyklen durchgeführt wurden, und er kann verworfen werden. Der verbleibende wäßrige Extrakt, hier auch als "angereicherter Knochenextrakt" in Bezug genommen, repräsentiert eine nützliche Quelle für den osteogenen Faktor, er kann, falls gewünscht, in lyophilisierter Form gelagert werden.
Wenn der wäßrige Extrakt einmal erhalten ist, kann der darin befindliche osteogene Faktor durch Abtrennung des Faktors von den anderen anwesenden Komponenten getrennt werden, indem man den Extrakt einer ausgewählten Auftrenntechnik unterwirft. Dissoziierende Bedingungen sollten während der Isolierung verwendet werden, um die Bildung von makromolekularen Aggregaten innerhalb des wäßrigen Extrakts zu verhindern. Für diesen Zweck sind dissoziierende Agenzien wie etwa Harnstoff oder Guanadiniumchlorid geeignet. Auftrennung auf Molekularsieben ist nützlich, um beispielsweise Bestandteile des Extrakts mit einem höheren Molekulargewicht von denjenigen mit einem Molekulargewicht, das dem des osteogenen Faktors ähnlich ist, auszuschließen. Wenn beispielsweise Fraktionierung mittels Gelfiltration angewendet wird, können die Fraktionen, die unter dissoziierenden Bedingungen mit einem scheinbaren Molekulargewicht von weniger als etwa 8 kDa eluieren, gesammelt werden, um kontaminierende Agenzien mit einem höheren Molekulargewicht zu eliminieren. Zur Trennung der Komponenten des Extrakts ist ebenfalls die Affinitätschromatographie nützlich. Insbesondere zeigt der osteogene Faktor im wesentlichen keine Affinitität für Heparin, und der Extrakt kann deshalb auf einer heparinbindenden Kolonne, beispielsweise Heparin-Sepharose, fraktioniert werden, um heparinbindende Komponenten, die auf der Kolonne zurückgehalten werden, zu eliminieren. Ebenso zeigt der osteogene Faktor etwas an Affinität für Hydroxylapatit, also kann auch eine Hydroxylapatit-Affinitätskolonne verwendet werden, um die Extraktquellen für den Faktor zu fraktionieren. Ionenaustauschkolonnen, Kolonnen, welche anionische Spezies wie etwa Diethylaminoethyl (DEAE) oder kationische Spezies wie etwa Carboxymethylcellulose (CMC) binden, können auch verwendet werden, um den osteogenen Faktor zu isolieren, die Elutionsbedingungen können unter Berücksichtigung des scheinbaren isoelektrischen Punkts des Faktors, welcher im schwach sauren Bereich von etwa pH 4,6 bis etwa pH 7,2 liegt, ausgewählt werden. Auch ist es besonders nützlich, bevorzugt als letzte Phase bei der Isolierungsprozedur, eine Umkehrphasen-Hochauflösungsflüssigchromatographie (HPLC) einzusetzen.
Die besondere Reihenfolge, in der die ausgewählten Auftrenntechniken angewendet werden, um den Extrakt zu fraktionieren und den osteogenen Faktor zu isolieren, können variieren, jedoch werden sie im allgemeinen in einer Art kombiniert, die für die Wiedergewinnung des Faktors in im wesentlichen gereinigter Form am effizientesten ist. Gemäß einer Ausführungsform der Erfindung wird ein dreistufiges Isolierungsprotokoll verwendet, welches den osteogenen Faktor in hormogener Form liefert, gekennzeichnet durch die Wanderung als ein hervorstechender und gut individualisierter Absorptionspeak bei 214 nm in Umkehrphasen-HPLC. In diesem dreistufigen Protokoll wird der wäßrige Extrakt des Ethanol-Präzipitats, das, wie vorstehend beschrieben, erhalten wurde, lyophilisiert und in einem Puffer, der eine dissoziierende Menge an Harnstoff enthält, resuspendiert und dann auf eine Gel- Filtrationskolonne, z.B. Sephacryl S 300, aufgebracht. Die Fraktionen, die mit einem geschätzten Molekulargewicht von weniger als etwa 8 kDa eluieren, werden gesammelt und dann anschließend auf eine Anionenaustauscherkolonne, z. B. DEAE-Cellulose, aufgebracht, Fraktionen, welche bei einer Konzentration an Natriumchlorid von und oberhalb von 200 mM eluieren, werden gesammelt. Die Fraktionen, die von der Anionenaustauschersäule gesammelt werden, werden dann zusammengegeben und einer Umkehrphasen-HPLC, wie etwa auf einer C-8-Umkehrphasenkolonne, unterzogen. Der osteogene Faktor eluiert bei einer Konzentration an Acetonitril zwischen 15% und 20% als ein gut individualisierter Absorptionspeak bei 214 nm. Das Material, das dann auf eine Umkehrphasen-Kolonne aufgebracht wird, wandert als Einzelpeak und kann, falls erwünscht, durch erneute Chromatographie erhalten werden. Ein spezifisches Protokoll zur Durchführung dieser dreistufigen Isolierungsprozedur ist im Detail in Beispiel 2 wiedergegeben.
Dieses vorstehend beschriebene dreistufige Protokoll kann natürlich modifiziert werden. Beispielsweise ist der erste Schritt des Ausschlusses entbehrlich und das mit Wasser extrahierte osteogene Material kann direkt einer Ionenaustauschchromatographie unterzogen werden, wobei man die hier erwähnten Bedingungen beispielhaft verwenden kann, um bioaktive Fraktionen zu sammeln, die anschließend zusammengefaßt werden und einer Umkehrphasen-HPLC unterzogen werden. Alternativ dazu kann der Ionenaustauschschritt eher auf einer Carboxymethyl- Cellulose-Kolonne unter sauren pH-Bedingungen durchgeführt werden als auf einer DEAE-Kolonne, falls gewünscht.
Während der Isolierungsprozedur kann die Aktivität des osteogenen Faktors zur Induktion der Knochenbildung unter Verwendung eines Aktivitätstests überwacht werden, der im folgenden als "Rattenknochen-Wachstumstest" in Bezug genommen wird. Dieser Test vergleicht die Zunahme im Trockengewicht von Rattenknochen, die mit osteogenem Faktor behandelt wurden, relativ zu nicht-behandelten kontralateralen Knochen als Kontrolle. Der Test wird in der Weise durchgeführt, wie sie im Detail in den Beispielen beschrieben ist. Zusammengefaßt werden injizierbare Lösungen, die den osteogenen Faktor enthalten, hergestellt, indem man eine Präparation, die den Faktor enthält, mit einer Hydroxylapatitmatrix und einer wäßrigen gepufferten Lösung kombiniert und dann dem Armknochen einer Ratte mittels einer einzigen Injektion längs des, das heißt nahe der Oberfläche von dem Tibia-Fibula-Komplex zuführt. Eine Kontrolldosis ohne den osteogenen Faktor wird in ähnlicher Weise an dem kontralateralen Armknochen zugeführt. Die behandelten und die nicht-behandelten Knochen werden etwa 7 Tage nach Behandlung entfernt, die Knochen werden von weichem Gewebe befreit, gewaschen und anschließend getrocknet. Die Zunahme an Knochenmasse, die durch die Präparation mit dem osteogenen Faktor induziert wird, wird dann durch die Differenz im Trockengewicht zwischen den behandelten und den Kontrollknochen ermittelt. In Abhängigkeit von der Menge an osteogenem Faktor, der in der injizierten Präparation enthalten ist, kann eine Zunahme an Knochengewicht von mehr als 25% beobachtet werden. Der durch den Faktor induzierte Effekt ist prinzipiell auch im Unterschied zu erhöhter Knochenlänge als eine sichtbare Zunahme im Knochenwachstum manifest.
Eine Einheit (U) an osteogener Aktivität wird nachfolgend als die Menge an osteogenem Faktor in der Präparation definiert (gemessen als Milligramm Protein), die erforderlich ist, um einen halbmaximalen Wert für die Zunahme an Knochenmasse nach 7 Tagen unter den vorstehend beschriebenen Bedingungen des Biotests zu induzieren. Typischerweise zeigt der wasserlösliche Proteinextrakt, d. h. das angereicherte Knochenextraktausgangsmaterial, eine Aktivität von etwa 1 Einheit/mg vor der Reinigung.
Der Effekt von Präparationen, die zu verschiedenen Stadien während der Isolierung des osteogenen Faktors gewonnen wurden, auf das Knochenwachstum wird durch die spezifischen Aktivitäten offenbart, die nach Aufstellung einer Dosis-Antwort- Kurve bestimmt wurden. Wie durch die Dosis-Antwortkurve, die in Fig. 9 gezeigt ist, gezeigt wird, hat die Fraktionierung des angereicherten Knochenextrakts mittels Gelfiltration den Effekt, daß die spezifische Aktivität auf etwa 10 Einheiten/mg Protein erhöht wird. Die anschließende Fraktionierung auf einer DEAE-Cellulose-Kolonne stellt eine weitere Zunahme der spezifischen Aktivität auf etwa 600 Einheiten/mg bereit. Das nachfolgend als "gereinigter" osteogener Faktor bezeichnete Material, das als ein individualisierter Peak im Anschluß an eine Passage durch eine Umkehrphasen-HPLC- Kolonne wandert, weist eine spezifische Aktivität von wenigstens etwa 3.000 Einheiten/mg bis maximal etwa 4.000 Einheiten/mg auf.
Gemäß einer Ausführungsform der Erfindung wird der gereinigte osteogene Faktor mittels Lyophilisierung in die Pulverform verwandelt, um seine Formulierung zu erleichtern, so daß die Lagerstabilität erhöht und kontaminierende Lösungsmittel eliminiert werden.
Um therapeutisch die die Knochenbildung induzierenden Eigenschaften des osteogenen Faktors auszunutzen, werden osteogene Zusammensetzungen hergestellt, indem eine therapeutisch effektive Menge, d. h. eine Menge, die die Knochenbildung induziert, des gereinigten osteogenen Faktors mit einem physiologisch akzeptablen Vehikel kombiniert wird. Für die Verwendung mit dem osteogenen Faktor geeignete Freisetzungs- bzw. Zufuhrvehikel können von dem Typ sein, der üblicherweise dazu verwendet wird, Knochenoberflächen andere therapeutische Agenzien für Knochen zuzuführen, wie etwa verschiedene Spezies von knochenmorphogenetischen Proteinen. Am stärksten bevorzugt beinhaltet das Zufuhrvehikel als einen Bestandteil ein Matrixmaterial, das knochenkompatibel ist, welches dazu dient, die knochenbildende Aktivität des osteogenen Faktors an der Knochenoberfläche zuzuführen. Der Ausdruck "knochenkompatibel", wie er hier verwendet wird, bezieht sich auf Substanzen, die im wesentlichen keine gegenteiligen Effekte, z. B. toxische Effekte, auf den Knochen oder das umgebende Gewebe haben, während sie an der Oberfläche des Knochens anliegen. Für die Verwendung als ein derartiges Matrixmaterial sind solche Substanzen oder ihre Kombinationen geeignet, die, wenn sie mit dem gereinigten osteogenen Faktor kombiniert werden, ein positives Ergebnis bei dem Rattenknochen-Wachstumstest, der hierin beschrieben ist, erzielen. Derartige Matrixmaterialien beinhalten Materialien, die vom Knochen abgeleitet sind, wie etwa osteogenisch-"deaktiviertes"- Knochenextraktmaterial, das nach Abtrennung des osteogenen Faktors erhalten wird.
Stärker bevorzugt besteht die knochenkompatible Matrix aus chemisch definiertem Material, um eine bessere Kontrolle während der Formulierung der Dosis zu erlauben. In dieser Hinsicht beinhalten geeignete Matrixmaterialien solche Substanzen, die vom Knochen hergestellt sind, die aber per se keine Knochenbildungsaktivität aufweisen, wie etwa Hydroxylapatit und Kollagen. Ebenso sind als Matrixmaterialien verwendbar Calciumsulfat, Tricalciumphosphat, Polymilchsäuren, Polylactid eingeschlossen, Polyglycolsäure, Polyglactin und Polyglactinsäure, Polyanhydride, Polymethylmethacrylat und Gelatine. Derartige Materialien könne alleine oder in jeglicher brauchbaren Kombination verwendet werden. Beispielsweise wurde gefunden, daß Hydroxylapatit per se als Matrixmaterial brauchbar ist, daß er jedoch auch in Kombination mit Kollagen und Gelatine brauchbar ist.
Zusätzlich zu dem knochenkompatiblen Matrixmaterial kann das -physiologisch akzeptable Freisetzungsvehikel einen pharmazeutisch akzeptablen Träger oder ein Verdünnungsmittel enthalten. Die Verwendung derartiger Trägermaterialien und Verdünnungsmittel ist insbesondere wünschenswert, um Formulierungen zu bereiten, die für die transdermale Zufuhr, zum Beispiel mittels Injektion, geeignet sind. Beispielsweise können injizierbare Formulierungen der osteogenen Zusammensetzung für die subkutane Zufuhr hergestellt werden, indem man eine effektive Menge des gereinigten osteogenen Faktors mit einem Freisetzungsvehikel mischt, das aus einer physiologischen gepufferten Salzlösung und einem ausgewählten Matrixmaterial wie etwa Hydroxylapatit besteht. In ähnlicher Weise können geeignete Träger zur Formulierung viskoser Zusammensetzungen, wie etwa von Zementen, Pasten und Gelen eingesetzt werden.
Es können auch alternative Formen der osteogenen Zusammensetzung hergestellt werden, die dazu geeignet sind, den osteogenen Faktor mittels anderer Arten als der Injektion freizusetzen bzw. zuzuführen. Beispielsweise können poröse keramische Zusammensetzungen formuliert werden, indem man gesintertes Tricalciumphosphat als Matrixmaterial verwendet. Dieses stellt eine langsame Freisetzung in bio-degradierbarer Form einer Zusammensetzung bereit, die brauchbar ist, um Knochendefekte zu reparieren. Diesbezüglich wird Bezug genommen auf US- Patent 4,596,574 zur Anleitung über die Herstellung derartiger Zusammensetzungen.
Die osteogene Zusammensetzung wird brauchbar sein, um verschiedene Knochendefekte wie etwa solche, die nach Krankheit oder nach einem Schaden entstehen, der durch Trauma induziert ist, oder die angeboren sind oder als Folge einer chirurgischen Behandlung induziert werden, zu heilen oder zu reparieren. Diese Zusammensetzungen werden auch im Falle von Knochentransplantationen nützlich sein. Die spezielle Art der Anwendung wird von der Natur des Knochendefekts, der behandelt werden soll, abhängen. In den Fällen, wenn der zu behandelnde Knochen - beispielsweise während einer Knochentransplantation bei chirurgischer Intervention - exponiert wird, kann die Zusammensetzung direkt auf die Oberfläche mittels Anwendung als ein Zement, Gel oder Paste aufgebracht werden oder sie kann in der Form eines Implantats aufgebracht werden.
Bei einer Ausführungsform der Erfindung wird die osteogene Zusammensetzung dazu verwendet, das Heilen von Knochenbrüchen zu fördern. Zu diesem Zwecke kann die Zusammensetzung in der Form einer wäßrigen gepufferten Lösung, welche eine Dosiseinheit des gereinigten Faktors in Kombination mit einem gewünschten Matrixmaterial wie etwa Hydroxylapatit oder Kollagen enthält, vorliegen. Die Zusammensetzung wird mittels Injektion an dem Orte, an dem der Bruch aufgetreten ist, zugeführt. Für Brüche von einer im medizinischen Sinne ernsthaften Natur wird es die chirurgische Intervention erlauben, die Zusammensetzung direkt der Knochenoberfläche zuzuführen.
Die besondere Dosisverabreichung für eine gegebene Applikation wird letzten Endes durch den behandelnden Arzt festgelegt werden, und sie wird derartige Faktoren wie den Ort und die Schwere des Knochenschadens berücksichtigen. Definierte Bereiche für die Dosis können in geeignet ausgearbeiteten klinischen Untersuchungen, bei denen der Fortschritt der Patienten periodisch mittels Röntgenstrahl-Überwachung oder - falls notwendig - mittels chirurgischer Untersuchungen nachverfolgt wird, bestimmt werden. Vorläufige Einschätzungen, die nützlich sein können, um die Größenordnung der Dosis, welche für menschliche Patienten geeignet ist, zu bestimmen, können den hier vorgelegten Ergebnissen für den Knochenwachstumstest bei Ratten entnommen werden. Man kann beispielsweise merken, daß eine einzige Injektion einer Menge des gereinigten Faktors im Bereich von Sub-Mikrogramm bereits eine signifikante Zunahme im Tibia-Fibula-Gewicht von etwa 100 mg bis etwa 120 mg innerhalb von sieben Tagen nach Injektion verursacht. Dies kann man grob auf eine Dosis von etwa 10 ug des gereinigten Faktors für jedes Gramm Knochen, das behandelt werden soll, übertragen, um eine maximale Zunahme in der Knochenmasse zu erzielen. Die Zunahme in der Knochenmasse wird signifikant für eine Zeitdauer von etwa einem Monat bei einer einzigen Injektion aufrechterhalten, was es unwahrscheinlich macht, daß eine Verordnung einer täglichen Dosis für die Therapie bei der Knochenheilung bzw. Knochenreparatur wesentlich ist.
Es wird gewürdigt, daß der osteogene Faktor auch veterinärmedizinische Anwendungen bereitstellen wird. Zusätzlich zu Menschen sind insbesondere Haustiere und reinrassige Zuchtpferde geeignete Patienten für eine derartige Behandlung. Wenn der osteogene Faktor für veterinärmedizinische Zwecke eingesetzt wird, kann berücksichtigt werden, daß die Reinheit des osteogenen Faktors geringer sein kann, als es für menschliche Anwendungen geraten erscheint. Demgemäß kann es geeignet erscheinen, eine Präparation mit einer spezifischen Aktivität von wenigstens etwa 10 Einheiten/mg bis etwa 500 Einheiten/mg eher zu verwenden als etwa das gereinigte Material.

Beispiele

Man schloß sich dem von Myers et al. im US-Patent 3,458,397 beschriebenen Protokoll mit geringeren Abweichungen an, um das Ethanolpräzipitat eines Knochenextrakts zu erzeugen, das den vorliegenden osteogenen Faktor enthielt. Speziell ausgedrückt, wurden schwammige Kälberknochen, die zu Partikeln nicht größer als 1 mm³ zerstoßen waren, von ANTECH Animal Technology (Tyler, Texas), in einer Kelvinator-Gefriereinrichtung bei -80ºC gehalten und innerhalb einer Dauer von 3 Monaten weiterverarbeitet. Sie repräsentieren die am stärksten distalen Teile (6 cm) von isolierten Mittelhandknochen und Mittelfußknochen. Falls erforderlich, wurden gewünschte Mengen der gelagerten Knochenfragmente (etwa 4 kg je Charge) in einen größeren Schüttelbehälter transferiert. Die Extraktion und das Solubilisieren der Knochenbestandteile wurde dann im wesentlichen wie von Myers et al. [US-Patent 3,458,397] beschrieben, mit kleineren Abweichungen bis einschließlich des alkoholischen Ausfällungsschritts durchgeführt.
Genauer gesagt, wurden die pulverisierten Knochen in 9 Litern einer wäßrigen Lösung, die 15% NaCl (w/v) und 0,3% Toluol (v/v) enthielt, suspendiert und bei 4ºC 2 Stunden lang geschüttelt. Die Knochenfragmente wurde nach einer Zentrifugation (5.000 upm · 7 Minuten, Zentrifuge Sorwall-RC-3B) als ein Niederschlag wiedergewonnen, und der rosafarbene Überstand wurde verworfen. Die gleiche Waschprozedur wurde zweimal (4 Stunden insgesamt) mit 15% NaCl-Lösung (Kontaktzeit von 18 Stunden), anschließend mit Wasser (1 Stunde Kontaktzeit) wiederholt. Der resultierende gewaschene Niederschlag wurde in 9 Litern Wasser resuspendiert und in einen Glasbehälter eines 20-Liter-Fermenters (MBR-Bioreaktor AG, Wetzikon, Schweiz) transferiert. Die Vorrichtung ist so eingerichtet, daß sie eine gesteuerte Temperatur, die auf 37 ± 2ºC eingestellt ist, und einen gleichmäßigen pH, der auf 2,5 ± 0,2 eingestellt ist, ansteuern kann. Die wäßrige Knochensuspension wurde bei moderater Geschwindigkeit (400 upm) gerührt, und der pH wurde mittels der automatisierten Zugabe von konzentrierter HCl (6 N) eingestellt. Drei Stunden später, wenn sich der pH bei 2,5 stabilisiert hat, wurde genügend Pepsin vom Schwein (kristallisiert und lyophilisiert; spezifische Aktivität = 2,345 Einheiten je mg des Proteins, erhältlich von Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) dem Reaktionsbehälter zugefügt, so daß 10 Millionen Einheiten an enzymatischer Aktivität je kg der Knochenfragmente bereitgestellt wurden. Nach einer Inkubation mit einer Dauer von etwa 48 Stunden (und im allgemeinen nicht weniger als 24 Stunden) wurde die Suspension zentrifugiert (5.000 upm · 20 Minuten), um einen Niederschlag, der demineralisierte Knochenfragmente enthielt und anschließend verworfen wurde, von einem Überstand abzutrennen, welcher lösliche Mineralien und organische Knochenbestandteile enthielt. Dieser Überstand wurde gesammelt und auf 4ºC gekühlt. Nach Dekantierung wurde eine obere Schicht, die aus einem ölartigen Material zusammengesetzt war, welches während des vorherigen Schritts freigesetzt wurde, sorgfältig begast und verworfen. Der wäßrigen Lösung, die noch einen sauren pH (2,52 ± 0,2) aufwies, wurde reiner Alkohol (95%; über Nacht vorgekühlt bei -20ºC) hinzugefügt, so daß die Endkonzentration auf 30% (v/v) gebracht wurde. Diese Zugabe erfolgte langsam über eine Zeitdauer von 10 Minuten unter moderatem Schütteln. Man ließ die Lösung unbewegt in einem Kälteraum, bis sich ein weißes Präzipitat gebildet hatte, stehen, was normalerweise innerhalb einer Zeit von etwa 20 bis 24 Stunden erfolgt. Dieses erste Präzipitat wurde mittels Zentrifugation (5.000 upm · 30 Minuten) gesammelt, und der alkoholische Überstand wurde bewahrt und unbewegt in dem Kälteraum stehengelassen, bis der Präzipitationsvorgang vollständig war, was sich an einer zunehmenden Eintrübung der Lösung, welche nach etwa 16 bis 24 Stunden ihren Höhepunkt erreichte, zeigte. Ein zweites und drittes Präzipitat wurde in ähnlicher Weise mittels Zentrifugation gesammelt, wohingegen der verbleibende ethanolische Überstand verworfen wurde. Jedes der ethanolischen Präzipitate, das den osteogenen Faktor enthielt, wurde in 400 ml Wasser resuspendiert und auf einen pH von 7,2 ± 0,3 mit 5 N NaOH titriert. Die neutralisierte Lösung wurde abschließend einer Lyophilisierung unterworfen, nach der ein Pulver erhalten wurde und die individuellen Präzipitate anschließend gesammelt wurden.
Im Durchschnitt erzielte diese Methode 40 ± 10 g eines mit Alkohol ausgefällten Pulvers je kg pulverisierter Kälberknochen. Der Proteingehalt dieses Knochenmaterials, wie er mittels des bicinchoninsauren (B CA)-Farbstoffs, erhältlich von Pierce, Rockford, IL. und unter Verwendung von Rinderserumalbumin als Standard abgeschätzt wurde, betrug durchschnittlich 13 mg je g Trockengewicht, war jedoch für einige verarbeitete Chargen bis zu 30 mg hoch.
Die lyophilisierten Ethanol-Präzipitate wurden anschließend weiterbehandelt, um die osteogene Aktivität in der Art, wie sie in dem nachfolgenden Beispiel 1 beschrieben ist, anzureichern.

Beispiel 1 - Isolierung des osteogenen Faktors

Ethanol-Präzipitate wurden in Wasser bei Raumtemperatur (4ºC) auf 1,5 g/ml unter 20- bis 30-minütigem Rühren resuspendiert und anschließend zentrifugiert (1.500 upm · 10 Minuten). Der Überstand wurde bewahrt, der Niederschlag wurde einer zweiten Extraktion mit Wasser unter den gleichen Bedingungen unterzogen. Die erhaltenen gewaschenen Niederschläge, welche weniger als 0,6 mg Protein je g Trockengewicht enthielten und welchen die relevante biologische Aktivität fehlt, wurden verworfen. Die ersten und zweiten wäßrigen Überstände wurden miteinander kombiniert und einer Lyophilisierung unterworfen. Von diesem lyophilisierten Pulver, welches nachfolgend als "angereicherter Knochenextrakt" bezeichnet wird, wurde gefunden, daß es die Aktivität des osteogenen Faktors enthielt, und es wurde in einem verschlossenen Behälter bei -20ºC aufbewahrt.
Die Ausbeute an Protein aus den trockenen ethanolischen Präzipitaten nach der zweistufigen Extraktion mit Wasser betrug im Durchschnitt 53%, sie kann jedoch auch so hoch wie etwa 90% sein. Die aufeinanderfolgenden Schritte, die in der beschriebenen Extraktionsprozedur beinhaltet sind, liefern im Durchschnitt 1,5 ± 0,2 g (Trockengewicht) sowie ein Minimum an 150 ± 50 mg (Protein) an angereichertem Knochenextrakt bzw. je kg der behandelten Kälberknochenfragmente. Die Löslichkeit dieser Präparation in wäßrigen Lösungsmitteln oder verdünnten Säuren (0,1 N Essigsäure) ist nicht vollständig; der rehydratisierte angereicherte Knochenextrakt kann genauer als mikropartikuläre Suspension gekennzeichnet werden. Wie nachfolgend offenbart, wurde gefunden, daß diese Suspension in dem Rattenknochen-Wachstumstest eine osteogene Aktivität zeigt.

Biotest zum Testen des osteogenen Potentials

Der Rattenknochen-Wachstumstest wird durchgeführt, indem Suspensionen verwendet werden, die durch Mischen variabler Mengen an angereichertem Knochenextrakt in einem Bereich zwischen 1 und 20 mg Trockengewicht mit 1 ml steriler physiologischer Lösung (0,85% NaCl) gemischt werden. Nicht mehr als 0,1 ml einer derartigen Suspension werden mittels einer Einmalspritze in junge Wistar-Ratten (Körpergewicht 150 ± 20 g) injiziert. Die Präparation wird langsam in der Nähe von langen Knochen wie etwa dem Elle-Speiche-Komplex, jedoch bevorzugt nahe dem Kniegelenk an dem oberen Teil der Tibia an der Grenzfläche zwischen der Knochenoberfläche und den daran anhaftenden Muskelligamenten zugeführt, ohne jedoch die Tibia selber zu penetrieren oder zu beschädigen. Jedes Tier erhält eine einzige Dosis an einem einzigen Ort. Eine Kontrolldosis, der es an Knochenextrakt mangelt, wird in ähnlicher Weise entweder in das contralaterale Glied desselben Tiers oder in einen unabhängigen Empfänger injiziert. Zu verschiedenen Zeitpunkten danach, im Bereich von 4 bis 30 Tagen, üblicherweise nach 7 Tagen, wurden die Tiere geschlachtet und die beiden Elle-Speiche-Komplexe entnommen, isoliert und sorgfältig von anhaftendem weichen Gewebe befreit. Diese isolierten Knochen können in einer Fixierlösung, die aus Formaldehyd (10%) in 100 mM AcetatPuffer, pH 5, 5, aufbewahrt werden. Die Knochen werden der Fixierungslösung entnommen und in einem Ofen bei 60ºC 15 bis 20 Stunden lang getrocknet. Der durch das Inokulum, welches den angereicherten Kälberknochenextrakt enthielt, spezifisch induzierte Anstieg in der Knochenmasse wird als Differenz im Trockengewicht (in mg) zwischen dem Test- und dem Kontroll-Ratten-Elle-Speiche-Komplex gemessen, jedoch präziser als Prozentsatz (%), indem als Bezugswert die Knochen des Kontrolltieres, die vom contralateralen Glied desselben Individuums isoliert sind, genommen wurden. Typischerweise erreicht die biologische Antwort auf den suspendierten angereicherten Knochenextrakt einen Spitzenwert bei 7-8 Tagen und fällt danach mit einer variablen Rate, welche von der inokulierten Dosis abhängig ist, wie in Fig. 1 gezeigt, ab. Der maximale Anstieg in der Knochenmasse, der niemals 25 ± 5% überschreitet, nimmt als Funktion der inokulierten Dosis zu, ist jedoch sättigbar.
Eine modifizierte Version des vorstehend beschriebenen Biotests wurde routinemäßig verwendet, um die Anreicherung in der osteogenen Aktivität während der darauffolgenden Reinigungsschritte, welche es erforderlich machen, eher mit Lösungen als mit Suspensionen zu arbeiten, zu überwachen. Eine Suspension wird durch Mischen einer Menge an angereichertem Kälberknochenextrakt, welche nicht 200 mg Trockengewicht übersteigt, mit 1 ml einer wäßrigen Lösung, welche verschiedene Puffer, Salze und andere Agenzien, wie nachfolgend beschrieben, enthält, hergestellt. Diese Suspension wird bei 37ºC 15 bis 30 Minuten lang inkubiert und anschließend in einer Laborbank-Top-Zentrifuge (Eppendorf; 12.000 g · 5 Minuten) zentrifugiert. Der Überstand wird sorgfältig begast, und es wird sein Proteingehalt gemessen, wobei das Verfahren mittels des BCA-Farbstoffs (Pierce) und Rinderserumalbumin als Standard verwendet werden. Aliquots des Überstands werden mit einer konstanten Menge (entweder 0,5 mg oder 1 mg Trockengewicht) Hydroxlyapatit (HAP, erhältlich von Sigma) gemischt und einer Lyophilisierung unterzogen. Das erhaltene Trockenpulver wird in einem Volumen einer physiologischen Salzlösung, die zur Injektion in die Empfängerratten - wie vorstehend beschrieben - geeignet ist, rekonstituiert. Als solches bestätigt dieses Protokoll, daß das osteogene Potential des rehydratisierten angereicherten Knochenextrakts, wie in Fig. 1 beispielhaft verdeutlicht, in einer offensichtlich wasserlöslichen Proteinfraktion liegt, da weder der unlösliche und an Protein verarmte Rest (hier auch als deaktivierte, vom Knochen abgeleitete Matrix bezeichnet), der durch Zentrifugation abgetrennt werden kann, noch die künstliche und proteinfreie HAP-Matrix alleine bioaktiv sind. Wie in Fig. 2 gezeigt, folgt die biologische Antwort unter diesen Bedingungen einer Beziehung, die von der Proteindosis abhängig ist, unabhängig davon, ob das Material, das zur Übertragung der knocheninduzierenden Eigenschaften in das Inokulum verwendet wird, eine vom Knochen abgeleitete Matrix mit nicht-definierter Zusammensetzung oder eine HAP- Matrix ist, die frei von Proteinen ist. Es sollte festgehalten werden, daß die Ergebnisse im wesentlichen für den Fall, daß Protein mit einer Matrix kombiniert wurde, die aus 0,5 mg Hydroxylapatit, 0,5 mg Gelatine und 0,5 mg Kollagen Typ I besteht, die gleichen wie diejenigen sind, die für den Fall eines Proteins, das mit Hydroxylapatit alleine kombiniert ist, gezeigt sind.

Fraktionierung mittels Gel-Permeationschromatographie

170 mg an angereichertem Knochenextrakt wurden in 2 ml einer Pufferlösung, die 5O mM Tris-HCl (pH 7,4) und 4 M hochreines Guanidiniumchlorid (Gdn. HCl) enthielt, resuspendiert, bei 37ºC 20 Minuten lang inkubiert und in einer Eppendorf- Zentrifuge (bei 12.000 g · 5 Minuten) abzentrifugiert. Der Überstand, der etwa 24 mg Protein (BCA-Farbstoff-Verfahren) enthielt, wurde sorgfältig begast und auf eine Kolonne von 1,5 cm · 33 cm, die mit Sephacryl S 300 Superfein-Gel (Pharmacia Canada Inc., QB) gepackt war, gegeben und bei Raumtemperatur in dem gleichen Puffer äquilibiert. Fraktionen mit einem Volumen von 1 ml wurden bei einer Durchflußrate von 12 ml je Stunde gesammelt. Der Proteingehalt jeder Fraktion wurde mittels Absorptionsmessung bei 280 nm ebenso wie mit der BCA-Farbstoffmethode überwacht, wobei, wie in Fig. 3 illustriert, Serumalbumin, das in dem gleichen Tris- Gdn-Puffer zur Kalibrierung gelöst war, verwendet wurde. Die Kolonne wurde mit bekannten Mr-Markern kalibriert, welche an distinkten Positionen, die mittels Pfeilen markiert sind, eluieren: Dextran blau (Mr = 1 bis 2 Mda, Vo), IgG-Immunglobulin vom Rind (Mr = 150 kDa, Sigma); Rinderserumalbumin (Mr = 68 kDa) und Cytochrom C (Mr = 12,5 kDa) von Boehringer Mannheim Canada Ltd., Laval, QB; und Insulin-A- Kette vom Rind, oxidiert (Sigma). 3ede zweite Fraktion wurde bei Raumtemperatur gegen entionisiertes und steriles Wasser (3 · 1 Liter) unter Verwendung von Spectrapor #6-Schläuchen (Spectrum Medical Industries, Inc., Los Angeles, CA), welche einen Ausschlußwert von nominal Mr = 1 kDa zeigten, dialysiert. Der Proteingehalt jeder dialysierten Fraktion wurde erneut bestimmt, und er repräsentierte üblicherweise 5-10% seines ursprünglichen Wertes vor der Dialyse. Jede Fraktion wurde mit 0,5 mg HAP-Matrix gemischt, einer Lyophilisierung unterzogen, in 0,1 ml einer Salzlösung rekonstituiert und in eine einzelne Ratte injiziert.
Der Test legt offen, daß die osteogene Aktivität, die in den angereicherten Kälberknochenextrakten liegt, mit einer molekularen Spezies assoziiert ist, die als nahezu symmetrischer Peak wandert, der mit der Elutionsposition des Markers mit der Insulin-A-Kette mit Mr = 2,5 kDa (vgl. Fig. 3) übereinstimmt. Auf dieser Basis wird der osteogene Faktor hier mit einem Molekulargewicht von "etwa" 2,5 kDa charakterisiert, wobei der Irrtumsbereich etwa ±1 kDa ist. Bioaktive Fraktionen, die in dem Peak (#58 bis 62) vorhanden sind, enthalten zwischen 30 und SS ug Protein und rufen eine osteogene Antwort hervor, deren Größe derjenigen äquivalent ist, die 250 bis 500 ug Protein des ursprünglichen angereicherten Knochenextrakts entspricht. Demtentsprechend wurde eine nahezu 10-fache Anreicherung in der spezifischen Aktivität nach Sephacryl-Gelfiltration und Dialyse (Fig. 9) erreicht.
Um zu bestätigen, daß die Bioaktivität auf eine molekulare Spezies mit Mr unterhalb von 5 kDa beschränkt ist, wurden die verbleibenden alternierenden Fraktionen der Säule, die nicht getestet waren, anschließend gesammelt, dialysiert, mittels Lyophilisierung konzentriert und wie vorstehend einem Biotest unterworfen. Die Ergebnisse zeigen den nachfolgend gezeigten prozentualen Anstieg in der Knochenmasse an: 0% für Pool A (Fraktionen #20 bis 47; 480 ug Protein injiziert); 6, 6% für Pool B (Fraktionen # 49 bis 53; 56 ug Protein); und 5,3% für Pool C (Fraktionen # 55 bis 68; 6 ug Protein). Zum Vergleich sei angefügt, daß die osteogene Aktivität des osteoinduktiven Faktors vom Rind, das osteogene Protein-1 vom Rind, das knochenmorphogenetische Protein-2 und die rinderknorpelinduzierenden Faktoren A und B bei Elution von Sephacryl-Kolonnen, die unter ähnlichen dissoziativen und puffermäßigen Bedingungen entwickelt wurden, in einem Bereich für Mr von 20 bis 40 kDa, typisch etwa um 30 kDa liegt.

Fraktionierung mittels Affinitätschromatographie auf Heparin-Sepharose

Eine Probe wurde ähnlich der vorstehend erläuterten Vorgehensweise hergestellt, wobei von 100 mg anreichertem Knochenextrakt ausgegangen wurde und es wurde eine Lösung mit 50 mM Tris-HCl (pH 7,2), 100 mM NaCl und 6 M ultrareinem Harnstoff als Extraktionspuffer verwendet. Der erhaltene Überstand der Zentrifugation, der schätzungsweise 20 mg Protein enthielt, wurde auf 10 ml eingestellt und einer Aufschlämmung von Heparin-Sepharose CL-6B (5 g Trockengewichtäquivalente; Pharmacia) hinzugefügt, die mit dem gleichen harnstoffhaltigen Puffer äquilibriert war. Die chargenweise Inkubation wurde über Nacht bei Raumtemperatur fortgesetzt, woraufhin die Mischung in eine 1,5 cm · 9 cm Kolonne gekippt wurde. Die Durchfluß- und Wasch-Fraktionen (1 ml) wurden gesammelt, bis die Absorption bei 280 nm auf weniger als 0,01 abgesunken war. Ein stufenweises Elutionsprotokoll wurde dann initiiert, indem die NaCl-Konzentration des 50 mM Tris-HCl, 6 M Harnstoffpuffers (pH 7,2) von 100 mM bis 150 mM und 500 mM, wie in Fig. 4 gezeigt, angehoben wurde.
Die drei mit NaCl eluierten Fraktionen wurden getrennt gesammelt, dialysiert und lyophilisiert. Nach der Rekonstitution in Wasser wurde gefunden, daß die drei Pools 98%, 1%a bzw. 1% des gesamten mittels der Trennung wiedergewonnenen Proteins enthielten. Also bindet der überwiegende Teil der Proteine, die in dem angereicherten Knochenextrakt vorhanden sind, nicht merklich an Heparin, und der osteogene Faktor ist dementsprechend hier dadurch gekennzeichnet, daß er "im wesentlichen" keine heparinbindende Affinität zeigt. Wie in Fig. 4 gezeigt, verursacht lediglich der erste Pool, der bei weniger als 100 mM NaCl eluiert, eine signifikante osteogene Antwort, wenn er in der Gegenwart einer HAP-Matrix verabreicht wird. Wegen der Abwesenheit selbst einer nur mäßigen Affinität des gewonnenen Produkts für Heparin kann mittels dieses Fremdverfahrens keine signifikante Anreicherung in der spezifischen Aktivität geleistet werden. Dies steht in merklichem Kontrast zu der Situation, die während der zuvor beschriebenen Reinigung des osteoinduktiven Faktors, des osteogenen Protein-1, Osteogenin und des knochenmorphogenetischen-Proteins-2 auftrat, da alle diese bioaktiven Peptide in charakteristischer Weise an Heparin- Sepharose mit einer derartigen Affinität binden, daß es zur Elution wenigstens 0,5 M NaCl bedarf.

Fraktionierung mittels Adsorptionschromatographie auf Hydroxylapapit

Ähnlich zu den vorstehend beschriebenen Vorgehensweisen wurde eine Probe ausgehend von 100 mg angereichertem Knochenextrakt und unter Verwendung von 50 mM Tris-HCl (pH 7,0), 6 M Harnstoff, 500 mM NaCl und 10 mM Na&sub2;HPO&sub4;-Lösung als Extraktionspuffer hergestellt. Der Überstand der Zentrifugation, der schätzungsweise 20 mg Protein enthielt, wurde auf eine 1,5 cm · 10 cm Kolonne, die mit Hydroxylapatit (Biogel HT von Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA.) gepackt war, aufgebracht und bei Raumtemperatur in dem gleichen Puffer äquilibriert. Fraktionen (1 ml) wurden so lange gesammelt, bis die Absorption bei 280 nm auf die Basislinie absank. Die Elution wurde initiiert, indem man die Na&sub2;HPO&sub4; Konzentration in dem gleichen Tris-Harnstoffhaltigen Puffer stufenweise von 10 mM bis 100 mM (pH 7, 8), 200 mM (pH 8,0) und S00 mM (pH 8,5), wie in Fig. 5 gezeigt, anhob.
Die Fraktionen, die den vier Elutionsstufen entsprachen, wurden gesammelt, dialysiert und lyophilisiert. Nach Wiederauflösung in Wasser wurde gefunden, daß diese vier Pools 98,7%, 1,3% und vernachlässigbare Mengen des gesamten wiedergewonnenen Proteins enthielten. Aus den Ergebnissen des Biotests (Fig. 5) wird deutlich, daß die in dem angereicherten Knochenextrakt vorhandene biologisch aktive Spezies zusammen mit der Mehrzahl der Proteine eine mäßige Affinität für Hydroxylapatit zeigt, da sie komplett mit 100 mM Na&sub2;HPO&sub4; eluiert.

Fraktionierung mittels Ionenaustauschchromatographie

100 mg des angereicherten Knochenextrakts wurden in 2 ml einer Pufferlösung resuspendiert, welche aus 50 mM Tris-HCl (pH 7,2), 6 M Harnstoff und 50 mM NaCl bestand, bei 37ºC 20 Minuten lang inkubiert und abzentrifugiert. Der erhaltene Überstand enthielt schätzungsweise 12,4 mg Protein und wurde auf eine Kolonne mit Diethylaminoethylcellulose (DEAE)-Kolonne (Whatman DE-52 Mikrogranulat von Mandel Scientific, Rockwood, ONT.; 2,5 cm · 5,5 cm) gegeben und bei Raumtemperatur im gleichen Puffer äquilibriert. Nicht gebundenes Material und Material, das mit demselben Puffer ausgewaschen wurde, wurden in Fraktionen von 1 ml gesammelt, bis die Absorption sich auf unter 0,01 verringerte. Eine stufenweise Elution wurde unter Verwendung des gleichen vorstehend erwähnten Tris-Harnstoff- Puffers (pH 7,2), der jedoch 100, 200, 300 bzw. 400 mM NaCl enthielt, durchgeführt, wie in Fig. 6 gezeigt.
Die gesammelten Fraktionen, die jedem Elutionsschritt entsprachen, wurden dialysiert, lyophilisiert und in Wasser rekonstituiert und dem Biotest unterworfen. Die Aktivität wurde in der Fraktion, die bei 2200 mM NaCl eluierte, wiedergewonnen, welche weniger als 1% des wiedergewonnenen Proteins (Fig. 6) enthielt. Basierend auf den Proteinmengen, von denen gefunden wurde, daß sie zum Hervorrrufen einer osteogenen Antwort ausreichend sind, war die spezifische Aktivität der auf der DEAE-Cellulose eluierten Fraktionen wenigstens 500mal höher als diejenige des angereicherten Knochenextrakts als Ausgangsmaterial. Die bioaktive molekulare Spezies, die in den angereicherten Knochenextrakten vorhanden ist, kann auf einem Anionenaustauscher zurückgehalten werden, was anzeigt, daß sie eine negative Ladung bei pH 7,2 aufweist oder von amphoterer Natur mit einem pI von weniger als 7,2 ist. Für Vergleichszwecke kann angegeben werden, daß mehrere morphogenetische Proteinspezies aus Knochen - wie berichtet - nicht auf DEAE-Cellulose-Harz zurückgehalten werden.
Eine identische Vorgehensweise wurde angewandt, um angereicherte Knochenextrakte auf einer Carboxymethyl(cm)-Cellulose-Kolonne (Whatman CM-52, 2,5 cm · 5,5 cm) aufzutrennen, außer daß 3 ml Fraktionen gesammelt wurden und daß es sich bei dem verwendeten Puffer um einen handelte, der 50 mM Natriumacetat (pH 4,6), 6 M Harnstoff und 50 mM NaCl enthielt. Die in Fig. 7 illustrierten Ergebnisse zeigen an, daß die gesamte bioaktive Spezies auf dem Harz zurückgehalten wurde und danach variabel eluierte. Trotz seiner hohen Absorption bei 280 nm enthielt der Pool, der mit 100 mM NaCl eluierte, lediglich 1% des wiedergewonnenen Proteins nach der Dialyse. 94% des Proteins band nicht an die Kolonne. Basierend auf der Proteinmenge, von der gefunden wurde, daß sie ausreichend ist, um eine osteogene Antwort hervorzurufen (2 bis 3,5 ug, Fig. 7), wurde gefunden, daß nach CM-Cellulose- Chromatographie eine schätzungsweise um mindestens 100-fach angereicherte spezifische Aktivität erhalten wurde. Die Bindung der bioaktiven Spezies sowohl an Anionen- als auch Kationen-Austauscher legt einen Ampholytcharakter sehr nahe, der demjenigen von Polypeptiden und Proteinen mit einem pI in dem Bereich zwischen 4,6 und 7,2 äquivalent ist.

Beispiel 2: dreistufiges Reinigungsprotokoll

200 mg an angereichertem Kälberknochenextrakt wurden bei 37ºC in einem Puffer gelöst, der aus 50 mM Tris-HCl-Puffer (pH 7,2), 6 M Harnstoff und 50 mM NaCl bestand, und abzentrifugiert. Der Überstand, der schätzungsweise 25 bis 30 mg des Proteins enthielt, wurde auf eine Sephacryl-S300-Gelfiltrations-Kolonne gegeben, die mit dem gleichen Puffer äquilibriert war. Eluierte Fraktionen (1,1 ml) wurden wie vorstehend genau beschrieben gesammelt, und diejenigen, die schätzungsweise das bioaktive Material enthielten (d. h. Fraktionen #45 bis #71), wurden vereint (-30 ml Gesamtvolumen) und dann direkt auf eine DEAE-Cellulose-Kolonne, die mit dem gleichen Puffer äquilibriert war, gegeben. Eine stufenweise Elutionsprozedur, die mit der vorstehend beschriebenen identisch war, wurde durchgeführt, was zu den Pools D50 bzw. D400 führte.
Jeder Pool war wurde gegen Wasser dialysiert, lyophilisiert und in 2 ml entionisierten Wassers rekonstituiert. Aliquots wurden im Biotest untersucht, um die Anwesenheit der osteogenen Aktivität in den Pools D200, D300 und in geringerem Maße in D400 zu bestätigen. Ein anderes Aliquot jedes DEAE-Cellulose-Pools D50 bis D400, das etwa 3 ug Protein entsprach, wurde durch die Zugabe von 0,1% Trifluoressigsäure (TFA) auf einen pH 4,0 angesäuert und separat auf eine C8-Umkehrphasenkolonne (2,1 · 30 mm Aquapore RP-300 narrowbore, 300 A Porengröße, Applied Biosystems Canada Inc., Mississauga, ON.) gegeben. 10% des Lösungsmittels zur Elution (80% Acetonitril, 20% Wasser, 0,1% TFA) wurden bei Raumtemperatur 2 Minuten lang aufgegeben, gefolgt von einem 10 bis 70%-linearen Gradienten (von 2 bis 26 Minuten), gefolgt von einem 70 bis 100%-Gradienten (26 bis 30 Minuten), wobei die Flußrate konstant bei 0,1 ml je Minute gehalten wurde. Die Absorption bei 214 nm, die für Peptidbindung charakteristisch ist, wurde aufgezeichnet und ist in Fig. 8 gezeigt.
Wie in Fig. 8 gezeigt, enthielten die Pool-Fraktionen D100 bis D400, die von der DEAE-Cellulosekolonne eluierten, nicht-aufgelöstes Material, das als ein Cluster von sich überlappenden Absorptionspeaks im Bereich von 7 bis 20 Minuten der Umkehrphasen-HPLC-Trennung erschien. Jedoch waren lediglich die zusammengefaßten Fraktionen D200 und D300, die den osteogenen Faktor umfassen, durch die Anwesenheit eines zusätzlichen Absorptionspeaks mit einer früheren Retentionszeit von 6 ± 0,5 Minuten charakterisiert, welcher zwischen 15 und 20% Acetonitril eluierte. Der Proteingehalt dieses Einzelpeaks war schätzungsweise für 8 ± 2% des eluierten Materials verantwortlich. Mehrere Proben des D200-Pools, welche 43 ug Protein ausmachten, wurden dann unter identischen Bedingungen auf die C8- Umkehrphasen-HPLC-Kolonne gegeben, und S Fraktionen wurden gesammelt: A (0 bis 6 Minuten), B (6 bis 7 Minuten), C (7 bis 13 Minuten), D (13 bis 19 Minuten), E (19 bis 30 Minuten). Nach Lyophilisierung und Rekonstitution wurden die Fraktionen doppelt im Biotest gemessen. Ähnlich wurden 17 ug Protein des D300-Pools verarbeitet und 6 Fraktionen gesammelt und im Biotest gemessen.
Fig. 8 zeigt, daß die osteogene Aktivität in Fraktion B gefunden wurde, was mit dem gut individualisierten Absorptionspeak, der vorstehend bei 6 Minuten Retentionszeit identifiziert wurde, übereinstimmt. Eine Menge von schätzungsweise weniger als 1 ug des mittels Umkehrphasen-HPLC gereinigten Materials ist ausreichend, um unter den Bedingungen des Tests eine biologische Antwort hervorzurufen.
Andere charakteristische Merkmale des osteogenen Faktors wurden auch ermittelt und die Ergebnisse dieser Untersuchungen sind nachfolgend bereitgestellt.

Effekt von Reduktionsmittel

Ein gemeinsames Merkmal, das anscheinend von allen multimeren osteogenen Faktoren geteilt wird, ist der Verlust an Aktivität in der Folge von Reduktion. Wenn angereicherte Kälberknochenextrakte (5,85 mg Protein) 2 Stunden lang bei 37ºC in einem 50 mM Tris-HCl-Puffer (ph 7,4) mit 4 M Gdn.HCl und je nachdem 10 mM 2-mercaptoethanol (ME) oder 10 mM Dithiothreitol (DII) inkubiert wurden, gegen reines Wasser bei Raumtemperatur dialysiert wurden, dann lyophilisiert und mit einer HAP-Matrix rekonstituiert wurden, fand man, daß die osteogenen Eigenschaften beibehalten wurden. Deshalb scheint die Reduktion der mutmaßlichen Disulfidbindungen die Funktion des vorliegenden osteogenen Faktors nicht zu beeinträchtigen.

Test auf Kompetenz in einem mitogenen Test

Nachfolgend wird Evidenz dafür gegeben, die anzeigt, daß es angereicherten Kälberknochenextrakten vollständig an dem klassischen mitogenen Potential in vitro entweder auf Nagetier-Osteoblasten oder -Fibroblasten mangelt, wobei Techniken der Gewebekultur und Biotests verwendet werden, die im Stand der Technik bekannt sind.
Drei Typen von Zellen wurden untersucht: NRK-49F-Fibroblasten aus Rattennieren, CCL39-Fibroblasten aus der Lunge chinesischer Hamster und eine Zellsuspension, die mit Osteoblasten angereichert und positiv für alkalische Phosphatase war, welche mittels sequentieller Andauung mit Kollagenase und Dispase (Boehringer) von Calvaria aus neugeborenen Ratten, wie in Wong, G. L. & Cohn, A. V. [(1975) Proc. Natl. Acad. Sdi. USA, 72: 3167-3171] beschrieben. Etwa 2 · 10&sup5; Zellen wurden in 24-Loch-Gewebekulturplatten, jeweils doppelt, in HAMF12:DMEM- Medium (Gibco) mit 10% hitzeinaktiviertem fetalen Kälberserum (Gibco) inokuliert. Einen Tag später wurde das Medium mit serumfreiem Medium ersetzt, um die Zellen ruhig zu stellen. Wachstumsstimulierende Agenzien oder Testsubstanzen wurden dann zusammen mit 1uCi[³H]-Methylthymidin (Amersham) in 500 ul Volumen hinzugefügt. 48 Stunden später wurde das Medium begast und die einschichtige Schicht extrahiert, um die mittels Trichloressigsäure fällbare Radioaktivität (d. h. DNA) in einem Flüssigszintillations-Zählgerät zu messen. Die Testsubstanzen beinhalteten verschiedene Konzentrationen an fetalem Kälberserum (FCS), Epidermal Growth Factor der Maus, α-Thrombin vom Rind und eine wäßrige Lösung von angereichertem Kälberknochenextrakt. Die letztere wurde durch Zentrifugieren einer Suspension mit 10 mg/ml, die in dem vorstehend beschriebenen, serumfreien Medium hergestellt war, und anschließender Filter-Sterilisierung (Millipore 0,22 um) des erhaltenen Überstands hergestellt.
Die in Fig. 10 gezeigten Ergebnisse legen dar, daß Konzentrationen des angereicherten Knochenextrakts bis zu 40 ug/ml Protein nicht in der Lage sind, in vitro die DNA-Replikation in ruhenden Calvarien-Osteoblasten, CCL39 oder NRK-49F- Fibroblasten im Unterschied zu bekannten mitogenen Substanzen wie etwa Serum, gereinigtes EGF oder α-Thrombin zu reinitiieren. Nachdem berichtet wurde, daß dieselben drei Zelltypen auch auf basischen oder sauren FGF und PDGF unter den identischen Bedingungen antworten, ist es vernünftig anzunehmen, daß keine wesentliche Menge eines dieser Wachstumsfaktoren in dem angereicherten Kälberknochenextrakt vorhanden ist, aus denen der vorliegende osteogene Faktor isoliert wurde. Vermutlich wurden viele derartige Wachstumsfaktoren, die bekanntermaßen in Knochen aus Rindern vorhanden sind und die während des Demineralisierungsschrittes freigesetzt werden können, durch die Pepsin-Behandlung zerstört.

Claims

1. Isolierter, wasserlöslicher osteogener Faktor, der imstande ist, im Säuger die Knochenbildung zu induzieren, wenn er Knochen in Assoziierung mit einem physiologisch akzeptablen Freisetzungsvehikel zugeführt wird, gekennzeichnet durch ein Molekulargewicht von etwa 2,5 kDa, gemessen mittels Gelfiltration unter dissoziierenden Bedingungen, einem isoelektrischen Punkt im pH-Bereich von 4, 6 bis 7, 2 und einer spezifischen Aktivität von wenigstens 10 Einheiten/mg, ermittelt im Rattenknochenwachstumstest.

2. Isolierter osteogener Faktor nach Anspruch 1, der eine spezifische Aktivität, ermittelt im Rattenknochenwachstumstest, von wenigstens etwa 600 Einheiten/mg aufweist.

3. Osteogener Faktor nach Anspruch 1 oder 2 in gereinigter Form, gekennzeichnet durch eine Wanderung als ein individualisierter Absorptionspeak bei 214 nm in der Umkehrphasen-HPLC (high performance liquid chromatography).

4. Osteogener Faktor nach einem der Ansprüche 1, 2 und 3 in lyophilisierter Form.

5. Verfahren zur Herstellung einer osteogenen Zusammensetzung, die in einem Säuger bei Zuführung zum Knochen die Knochenbildung induziert, wobei das Verfahren den Schritt umfaßt, daß eine effektive Menge des osteogenen Faktors nach einem der Ansprüche 1, 2, 3 oder 4 mit einem physiologisch akzeptablen Freisetzungsvehikel kombiniert wird.

6. Osteogene Zusammensetzung, die Knochenbildung in einem Säuger bei Zuführung zum Knochen induziert, welche eine effektive Menge des isolierten, wasserlöslichen osteogenen Faktors nach einem der Ansprüche 1, 2, 3 oder 4 und ein physiologisch akzeptables Freisetzungsvehikel umfaßt.

7. Osteogene Zusammensetzung nach Anspruch 6, wobei das physiologisch akzeptable Freisetzungsvehikel ein knochenkompatibles Matrixmaterial und wahlweise ein pharmazeutisch akzeptables Verdünnungsmittel umfaßt.

8. Osteogene Zusammensetzung nach Anspruch 7, wobei das knochenkompatible Matrixmaterial Hydroxyapatit umfaßt.

9. Osteogene Zusammensetzung nach Anspruch 7, wobei das Verdünnungsmittel eine wäßrige gepufferte Salzlösung ist.

10. Osteogener Faktor nach einem der Ansprüche 1 bis 4 zur Verwendung bei der Induktion der Knochenbildung.

11. Verwendung des osteogenen Faktors nach einem der Ansprüche 1 bis 4 bei der Herstellung einer osteogenen Zusammensetzung zur Induktion der Knochenbildung im Säuger.

12. Verwendung nach Anspruch 11, wobei die Zusammensetzung dem Knochen an einer Bruchstelle, beispielsweise mittels Injektion, zugeführt wird.

13. Verfahren zum Erhalten des osteogenen Faktors nach Anspruch 1, welches die Schritte umfaßt, daß ein Säugerknochenextrakt mit dem Faktor erhalten und der Extrakt fraktioniert wird, um daraus einen osteogenen Faktor mit einem mittels Gelfiltration unter dissoziierenden Bedingungen ermittelten Molekulargewicht von etwa 2,5 kDa, einem isoelektrischen Punkt im pH-Bereich von 4,6 bis 7,2 und einer spezifischen Aktivität von wenigstens etwa 10 Einheiten/mg im Rattenknochenwachstumstest zu gewinnen.

14. Verfahren nach Anspruch 13, wobei es sich bei dem Säugerknochenextrakt um Rinderknochenextrakt handelt.

15. Verfahren nach Anspruch 14, wobei der Knochenextrakt unter dissoziierenden Bedingungen nach Größe fraktioniert wird, um Material mit einem Molekulargewicht von weniger als 8 kDa zu gewinnen.

16. Verfahren nach Anspruch 13 oder 14, wobei der Knochenextrakt mittels Ionenaustauschchromatographie fraktioniert wird, um Material mit einem pI im Bereich von 4,6 bis 7,2 zu gewinnen.

17. Verfahren nach Anspruch 16, wobei das nach Fraktionierung mittels Ionenaustauschchromatographie gewonnene Material anschließend Umkehrphasen-HPLC unterzogen und ein osteogener Faktor mit einer spezifischen Aktivität im Rattenknochenwachstumstest von wenigstens etwa 3.000 Einheiten/mg gewonnen wird.