DE69936212T2

DE69936212T2 - Hydrogelzusammensetzungen mit kontrollierter Freigabe für die Verabreichung von Wachstumsfaktoren

Info

Publication number: DE69936212T2
Application number: DE69936212T
Authority: DE
Inventors: Robert N. San Jose JENNINGS; Bing Redwood City YANG; Andrew A. Palo Alto PROTTER; Yu-Chang John Newport Beach WANG
Original assignee: Scios LLC
Current assignee: Scios LLC
Priority date: 1998-09-04
Filing date: 1999-09-03
Publication date: 2008-01-24
Anticipated expiration: 2019-09-04
Also published as: CA2341410C; CY1107704T1; JP5576772B2; PT1107791E; IL141688A; EP1107791B8; DE69936212D1; WO2000013710A2; WO2000013710A3; ES2288024T3; EP1107791A2; DK1107791T3; EP1107791B1; US6331309B1; IL141688A0; ATE363292T1; JP2011021045A; CA2341410A1; JP2002524425A; AU758178B2

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Die Erfindung betrifft die Formulierungen für die kontrollierte Verabreichung von Wachstumsfaktoren. In spezifischen Ausführungsformen betrifft die Erfindung die kontrollierte Freigabe von angiogenen Wachstumsfaktoren für die Behandlung eines ischämischen Gewebes und/oder für die Wundheilung.
Polypeptid-Wachstumsfaktoren regulieren das Wachstum und die Vermehrung von Zellen. Eine Anzahl von menschlichen Wachstumsfaktoren wurden identifiziert und charakterisiert. Diese schließen nur beispielhaft den basischen Fibroblasten-Wachstumsfaktor (bFGF), den sauren Fibroblasten-Wachstumsfaktor (aFGF), den vaskulären endothelialen Zellwachstumsfaktor (VEGF), den Thrombocyten-Wachstumsfaktor (PDGF), die Insulin-ähnlichen Wachstumsfaktoren (IGF-I und IGF-II), den Nervenwachstumsfaktor (NGF), den epidermalen Wachstumsfaktor (EGF) und den Heparin-bindenden EGF-ähnlichen Wachstumsfaktor (HBEGF) ein. Aufgrund ihrer Fähigkeit, das Zellwachstum und die Zellvermehrung zu stimulieren, wurden Wachstumsfaktoren als Wundheilungsmittel verwendet. Einige Wachstumsfaktoren wie z.B. bFGF und VEGF zeigen starke angiogene Wirkungen, das heißt, sie stimulieren das Wachstum von neuen kapillaren Gefäßen. Diese angiogenen Wachstumsfaktoren wurden verwendet, um Erkrankungen zu behandeln, die mit Ischämie assoziiert sind, wie z.B. eine Erkrankung der Koronararterie und eine Erkrankung der peripheren Gefäße. Durch die Behandlung von ischämischem Gewebe mit einem angiogenetischen Wachstumsfaktor werden neue Blutgefäße hergestellt, die in der Lage sind, verschlossene Abschnitte von Arterien zu umgehen, wodurch der Blutfluss zu dem betroffenen Gewebe wiederhergestellt wird (ein Verfahren, das manchmal als ein "Bio-Bypass" bezeichnet wird). Angiogenetische Wachstumsfaktoren wurden ebenfalls verwendet, um Wundheilung zu fördern.
Yakehe Hakhoechi, 25(3), 177-188 (1995) (Chemical Abstracts: 124:211858) offenbart eine wässrige topische Herstellung von EGF zur Behandlung von offenen Wunden und Verbrennungen, die das Poloxamer 407 als eine Gelbasis in Kochsalzlösung und Gelatine oder Amastatin als einen Proteasehemmstoff umfasst.
EP-A-O 312 208 offenbart Gel-Formulierungen von Polypeptid-Wachstumsfaktoren, die ein wasserlösliches oder wasserquellbares, pharmazeutisch verträgliches Polymer enthalten, um bei Raumtemperatur eine Viskosität im Bereich von 1.000 bis 12.000.000 cps zur Verfügung zu stellen.
Eine große Herausforderung bei der Verwendung von Wachstumsfaktoren ist die Entwicklung eines Vehikels zur Verabreichung, welches das geeignete Maß der biologischen Verfügbarkeit des Arzneistoffs an dem betroffenen Gebiet zur Verfügung stellt, um ein erwünschtes klinisches Ergebnis zu erzielen. Das US-Patent Nr. 5,457,093 offenbart daher die Verwendung von verschiedenen Mitteln zur Herstellung von Hydrogelen mit einer relativ hohen Viskosität, die Wachstumsfaktoren enthalten. Wir haben jedoch gezeigt, dass die Verwendung eines Hydrogels, das bFGF und Hydroxyethylcellulose enthält, nicht das gewünschte Ergebnis in einer klinischen Humanstudie erzielte, die auf eine topische Wundheilung gerichtet war, obwohl bFGF ein starker angiogenetischer Wirkstoff ist und andere biologische Aktivitäten besitzt, die in einem Wundheilungsmittel erwünscht sind. Zusätzlich haben wir gezeigt, dass die Verwendung eines Hydrogels, das bFGF und ein Polyoxyethylen-Polyoxypropylen-Blockcopolymer (Pluronic) enthält, in einem Tiermodel der Angiogenese nicht eine erwünschte angiogene Antwort hervorruft.
Ein anderes Problem, auf das bei der Herstellung von Formulierungen zur kontrollierten Freisetzung von Polypeptid-Wachstumsfaktoren gestoßen wird, besteht darin, dass die zur Verleihung von Eigenschaften der kontrollierten Freisetzung verwendeten Excipienten die Herstellung einer homogenen Dispersion des Wachstumsfaktors durch einfache Mischtechniken erschweren können. Eine topische Formulierung von PDGF wurde zum Beispiel kommerziell hergestellt, wobei mehr als 1 % Carboxymethylcellulose verwendet wurde. Bei solchen Konzentrationen ist die Erzielung einer homogenen Dispersion des Polypeptids schwierig.
Es ist eine Aufgabe der Erfindung, eine Formulierung für die kontrollierte Freigabe von Polypeptid-Wachstumsfaktoren zur Verfügung zu stellen, die den Wachstumsfaktor mit einer Geschwindigkeit freisetzt, die eine Angiogenese und/oder eine Wundheilung fördert.
Es ist eine andere Aufgabe der Erfindung, Verfahren zur Verabreichung von Wachstumsfaktoren bei kontrollierten Geschwindigkeiten zur Verfügung zu stellen, welche die Wundheilung und/oder die Angiogenese in einem Patienten fördert, der eine solche Behandlung benötigt.
Es ist eine weitere Aufgabe der Erfindung, Formulierungen für die kontrollierte Freisetzung von Polypeptid-Wachstumsfaktoren zur Verfügung zu stellen, die als homogene Zusammensetzungen durch einfache Mischtechniken hergestellt werden können.
Andere Aufgaben der Erfindung werden durch die nachfolgende Beschreibung offensichtlich werden.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird eine Hydrogelzusammensetzung für die kontrollierte Freigabe eines Polypeptid-Wachstumsfaktor zur Verfügung gestellt, umfassend:

(a) eine therapeutisch wirksame Menge eines Polypeptid-Wachstumsfaktors, der mindestens eine Region mit positiver Ladung enthält;
(b) ein physiologisch verträgliches wassermischbares anionisches Polymer;
(c) einen physiologisch verträglichen wassermischbaren nicht-ionischen polymeren Viskositätsregler; und
(d) Wasser.

Wir haben gezeigt, dass die Verwendung eines anionischen Polymers in Kombination mit einem nicht-ionischen polymeren Viskositätsregler eine unabhängige Kontrolle der Freisetzungscharakteristika des Arzneistoffs und der physikalischen Charakteristika, das heißt der Viskosität, der Formulierung ermöglicht. Insbesondere haben wir gezeigt, dass das wassermischbare anionische Polymer verwendet werden kann, um eine therapeutisch wirksame Geschwindigkeit der Freisetzung zu verleihen, wenn es in niedrigen Konzentrationen verwendet wird. Vorzugsweise wird das wassermischbare anionische Polymer aus Natriumcarboxymethylcellulose und Poly(acrylsäure) ausgewählt. Die Poly(acrylsäure) verleiht eine therapeutisch wirksame Geschwindigkeit der Freisetzung, wenn sie einen so geringen Anteil wie 0,001 Gew.-% bis 0,01 Gew.-% der gesamten Hydrogelzusammensetzung darstellt. Bei dieser niedrigen Konzentration trägt die Poly(acrylsäure) nicht wesentlich zu einer Zunahme der Viskosität der Formulierung bei. Daher kann die Poly(acrylsäure) verwendet werden, um die Geschwindigkeit der Freisetzung des Wachstumsfaktors zu optimieren, damit eine gewünschte biologische Wirkung erzielt wird, während das physiologisch verträgliche nicht-ionische Polymer verwendet wird, um eine gewünschte Viskosität für die Verwendung in einer bestimmten Anwendung zu erhalten. Während ein hoch visköses Hydrogel gemäß der Erfindung hergestellt werden kann, haben wir gezeigt, dass eine hohe Viskosität nicht notwendig ist, um eine gewünschte biologische Wirkung bei der Wundheilung oder der Angiogenese zu erhalten.
Dementsprechend betrifft ein Aspekt der Erfindung eine Hydrogelzusammensetzung für die kontrollierte Freigabe des basischen Fibroblasten-Wachstumsfaktors, umfassend:

(a) eine therapeutisch wirksame Menge des basischen Fibroblasten-Wachstumsfaktors;
(b) ein physiologisch verträgliches wassermischbares anionisches Polymer in einer Menge von etwa 0,001 Gew.-% bis etwa 0,1 Gew.-%;
(c) einen nicht-ionischen wassermischbaren polymeren Viskositätsregler in einer Menge von etwa 0,5 Gew.-% bis etwa 25 Gew.-%; und
(d) Wasser.

Ein anderer Aspekt der Erfindung betrifft ein Verfahren für die kontrollierte Freigabe eines Wachstumsfaktors, das die Verabreichung einer Hydrogelzusammensetzung an einen Patienten umfasst, der eine Behandlung mit. einem solchen Wachstumsfaktor benötigt, umfassend:

Ein noch weiterer Aspekt der Erfindung betrifft ein Verfahren zur Förderung der Wundheilung, welches die Verabreichung einer Hydrogelzusammensetzung mit einer kontrollierten Freisetzung an einen Patienten umfasst, der eine solche Behandlung benötigt, umfassend:

Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines Wachstumsfaktors, der kontrolliert freigesetzt wird, umfassend das Dispergieren in Wasser von:

(a) einem physiologisch verträglichen wassermischbaren nicht-ionischen polymeren Viskositätsregler;
(b) einer ausreichenden Menge eines physiologisch verträglichen wassermischbaren anionischen Polymers zur Verleihung einer kontrollierten Freisetzung des Wachstumsfaktors aus der Zusammensetzung; und
(c) einer therapeutisch wirksamen Menge eines Polypeptid-Wachstumsfaktors, der mindestens eine Region mit positiver Ladung besitzt;

Ein anderer Aspekt der Erfindung betrifft ein Verfahren zur Behandlung von Ischämie durch die Verabreichung einer Hydrogelzusammensetzung mit kontrollierter Freisetzung an eine Region eines ischämischen Gewebes in einem Patienten, der an einem Zustand leidet, die durch Ischämie charakterisiert wird, umfassend:

(a) eine therapeutisch wirksame Menge eines angiogenen Polypeptid-Faktors, der mindestens eine Region mit positiver Ladung besitzt, der vorzugsweise aus der Gruppe, bestehend aus dem basischen Fibroblasten-Wachstumsfaktor und dem vaskulären endothelialen Zellwachstumsfaktor, ausgewählt ist;
(b) einen physiologisch verträglichen wassermischbaren anionischen polymeren Viskositätsregler; und
(c) Wasser.

KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 ist eine graphische Darstellung der Wirkung einer bFGF-enthaltenden Hydrogelformulierung der Erfindung auf die Akkumulation von Granulationsgewebe in einem Wundheilungsmodel eines ischämischen Kaninchenohrs.
2 ist eine graphische Darstellung der Wirkung einer bFGF-enthaltenden Hydrogelformulierung der Erfindung auf die Akkumulation von Epithelgewebe in einem Wundheilungsmodel eines ischämischen Kaninchenohrs.
3 ist eine graphische Darstellung der Wirkung einer bFGF-enthaltenden Hydrogelformulierung der Erfindung auf die Spalte von Granulationsgewebe in Wunden eines ischämischen Kaninchenohrs.
4 ist eine graphische Darstellung der Wirkung einer bFGF-enthaltenden Hydrogelformulierung der Erfindung auf die Spalte von Epithelgewebe in Wunden eines ischämischen Kaninchenohrs.
5 stellt die Freisetzung von bFGF aus Gelformulierungen dar, die 0,4 mg/ml bFGF enthalten. A: 10% Pluronic^® und 0,8% CMC; B: 10% Pluronic^® und 0,001% Carbopol; C: 10% Pluronic^®.
6 stellt die Freisetzung von bFGF aus Gelformulierungen dar, die 4,0 mg/ml bFGF enthalten. A: 10% Pluronic^® und 0,8% CMC; B: 10% Pluronic^® und 0,001% Carbopol^®; C: 10% Pluronic^®.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die Zusammensetzungen der Erfindung können für die kontrollierte Freigabe eines Polypeptids-Wachstumsfaktors, der mindestens eine Region mit einer positiven Netto-Ladung besitzt, verwendet werden. Der Ausdruck "mindestens eine Region mit einer positiven Netto-Ladung" bedeutet, dass der Polypeptid-Wachstumsfaktor eine gesamte positive Netto-Ladung besitzt oder dass er mindestens eine positiv geladenen Domäne besitzt, die in der Lage ist, mit dem anionischen Polymer in einer solchen Weise zu interagieren, um die Freisetzung des Wachstumsfaktors aus der Zusammensetzung zu verlangsamen. Nur beispielhaft können der basische Fibroblasten-Wachstumsfaktor (bFGF, einschließlich ohne die Einschränkung der 155-, 154- und 146-Aminosäure-Formen), der vaskuläre endotheliale Zellwachstumsfaktor (VEGF, einschließlich ohne die Einschränkung der 189-, 165-, 145-, 121- und 110-Aminosäureformnen), der Thrombocyten-Wachstumsfaktor (PDGF), der epidermale Wachstumsfaktor (EGF) und der Heparin-bindende EGF-ähnliche Wachstumsfaktor (HB-EGF) als Wachstumsfaktoren erwähnt werden, die für die Verwendung in der Zusammensetzung der Erfindung geeignet sind. Die menschlichen Aminosäuresequenzen sind für jeden dieser Wachstumsfaktoren bekannt. VEGF und bFGF gehören zu der Klasse von Wachstumsfaktoren, die angiogene Wirkungen zeigen, das heißt sie fördern das Wachstum von neuen kapillaren Blutgefäßen. Der Prozess der Angiogenese ist eine wichtige Komponente der Wundheilung. Zusätzlich wurden diese Polypeptide verwendet, um Erkrankungen zu behandeln, die durch Ischämie gekennzeichnet sind. Die Verabreichung eines angiogenen Faktors an ein ischämisches Gewebe ruft die Erzeugung von neuen Kapillaren hervor, die eine verschlosse Arterie umgehen und den Blutfluss zu dem betroffenen Gewebe wiederherstellen können.
Der Polypeptid-Wachstumsfaktor wird in einer therapeutisch wirksamen Menge verwendet. Die spezifische Menge des Wachstumsfaktors, die in der Zusammensetzung verwendet wird, wird in Abhängigkeit von dem spezifischen Wachstumsfaktor, der zu behandelnden Erkrankung und dem Dosierungsplan variieren. Der Fachmann kann eine geeignete Menge des Wachstumsfaktors, der in der Zusammensetzung verwendet werden soll, bestimmen. Im Allgemeinen kann die Menge von etwa 0,01 Gew.-% bis etwa 5 Gew.-% der Zusammensetzung variieren.
Die Zusammensetzung der Erfindung enthält ebenfalls ein physiologisch verträgliches wassermischbares anionisches Polymer. Geeignete Polymere schließen zum Beispiel Poly(acrylsäure), Natriumcarboxymethylcellulose, Alginsäure und Hyaluronsäure ein. Poly(acrylsäure) und Natriumcarboxymethylcellulose sind bevorzugte anionische Polymere, wobei Poly(acrylsäure) am stärksten bevorzugt wird. Das verwendete anionische Polymer kann ein Molekulargewicht von etwa 5.000 Da bis zu etwa 5.000.000 Da besitzen.
Im Allgemeinen kann das wassermischbare anionische Polymer in einer Menge von etwa 0,001% bis etwa 1 % basierend auf dem Gesamtgewicht der Zusammensetzung verwendet werden. Die Menge des verwendeten wassermischbaren anionischen Polymers in der Zusammensetzung kann teilweise in Abhängigkeit von dem verwendeten spezifischen Polymer variieren. Weil die Ladungsdichte des anionischen Polymers ein bestimmender Faktor bei der Geschwindigkeit der Freisetzung ist, können anionische Polymere, die eine relativ hohe Ladungsdichte (und eine dementsprechende stärkere Wechselwirkung mit dem Polypeptid-Wachstumsfaktor) haben, in niedrigeren Konzentrationen in der Formulierung verwendet werden und noch immer eine wirksame Kontrolle über die Geschwindigkeit der Freisetzung haben. Natriumcarboxymethylcellulose zum Beispiel besitzt eine niedrigere Dichte der negativen Ladung als Poly(acrylsäure). Dementsprechend kann Poly(acrylsäure) bei deutlich niedrigeren Konzentrationen als Natriumcarboxymethylcellulose wirksam verwendet werden.
Wenn Poly(acrylsäure) als das wassermischbare anionische Polymer verwendet wird, wird die Verwendung der Poly(acrylsäure) in niedrigen Konzentrationen bevorzugt, das heißt von etwa 0,001 Gew.-% bis etwa 0,1 Gew.-% der Zusammensetzung. Erstaunlicherweise haben wir gezeigt, dass die Poly(acrylsäure) in diesen niedrigen Konzentrationen in der Lage ist, die Freisetzung mit einer Geschwindigkeit zu bewirken, die eine gewünschte biologische Antwort fördert. Es wurde gezeigt, dass höhere Konzentrationen von Poly(acrylsäure), das heißt, so hoch wie z.B. etwa 1,0%, die ebenfalls eine positive biologische Antwort hervorrufen, mit einer Entzündungsantwort assoziiert sind. Des weiteren kann Poly(acrylsäure) in höheren Konzentrationen zu der Viskosität der Zusammensetzung beitragen.
Aufgrund seiner niedrigeren Ladungsdichte wird Natriumcarboxymethylcellulose vorzugsweise bei einer etwas höheren Konzentration verwendet, das heißt von etwa 0,1% bis etwa 1% basierend auf dem Gesamtgewicht der Zusammensetzung.
Die Zusammensetzung der Erfindung enthält ebenfalls einen physiologisch verträglichen nicht-ionischen polymeren Viskositätsregler. Der nicht-ionische polymere Viskositätsregler kann ein Molekulargewicht von etwa 5.000 Da bis etwa 15.000 Da besitzen.
Ein bevorzugter nicht-ionischer polymerer Viskositätsregler ist ein Polyoxyethylen-Polyoxypropylen-Blockcopolymer. Solche Copolymere bestehen aus Segmenten oder Blöcken aus polymerisierten Ethylenoxid-Einheiten und Segmenten oder Blöcken aus polymerisierten Propylenoxid-Einheiten. Sie sind kommerziell erhältlich in einem Bereich von Molekulargewichten, der für die Verwendung in den Zusammensetzungen der Erfindungen geeignet ist. Wir haben zum Beispiel ein Block-Copolymer des A-B-A-Typs (Polyethylenoxid-Polypropylenoxid-Polyethylenoxid) verwendet, das ein Molekulargewicht von etwa 12.600 besitzt, das kommerziell unter dem Markennamen Pluronic^® F-127 erhältlich ist. Bei einem solchen Copolymer ist es von Vorteil, dass sich seine Viskosität mit der Temperatur erhöht. Dementsprechend kann eine Zusammensetzung der Erfindung hergestellt werden, die bei Raumtemperatur relativ dünnflüssig ist und leicht durch Mischen hergestellt wird, deren Viskosität sich aber erhöht, wenn sie Körpertemperatur ausgesetzt wird, wodurch verhindert wird, dass die Zusammensetzung von dem gewünschten Gebiet der Anwendung hinwegfließt.
Die Menge des verwendeten polymeren Viskositätsreglers kann in Abhängigkeit von der gewünschten Viskosität für eine bestimmt Anwendung deutlich variieren. Wir haben gezeigt, dass das Erzielen einer zufriedenstellend kontrollierten Freisetzung des Wachstumsfaktors nicht von der Viskosität der Zusammensetzung abhängig ist (obwohl eine erhöhte Viskosität die Geschwindigkeit. der Freisetzung verlangsamen kann). Die Zusammensetzungen der Erfindung können in einem Bereich von dünnflüssigen Flüssigkeiten bis zu viskösen Gelen bei Raumtemperatur liegen. Der polymere Viskositätsregler kann von etwa 0,5 Gew.-% bis etwa 25 Gew.-% der gesamten Zusammensetzung vorliegen, vorzugsweise von 5 bis zu 20%. Für einige Anwendungen wie z.B. die topische Wundheilung kann eine relativ hohe Viskosität erwünscht sein, um eine Wanderung des Wachstumsfaktors aus dem Behandlungsgebiet zu vermeiden. Für solche Anwendungen würde eine ausreichende Menge des nicht-ionischen polymeren Viskositätsreglers verwendet werden, so dass die Zusammensetzung an der Stelle des Orts der Anwendungen verbleibt.
Die Zusammensetzungen der Erfindung können ebenfalls andere konventionelle pharmazeutische Excipienten und Zusätze in den üblichen wirksamen Mengen enthalten. Diese können zum Beispiel Konservierungsmittel, antimikrobielle Wirkstoffe, Pufferstoffe, tonisierende Mittel, grenzflächenaktive Mittel, Antioxidationsmittel, chelatbildende Verbindungen und Proteinstabilisatoren (z.B. Zucker) einschließen.
Die Formulierungen der Erfindung können durch Mischen der Bestandteile hergestellt werden. Es ist vorteilhaft, dass ein Vorratsgel durch Mischen des nicht-ionischen polymeren Viskositätsreglers in der geeigneten Konzentration durch ein einfaches Mischen hergestellt werden kann. Das anionische Polymer wird anschließend in der Vorratsgellösung gelöst und eine wässrige Lösung des Wachstumsfaktors wird anschließend im Gel gelöst und/oder das Gel kann verwendet werden, um ein gefriergetrocknetes Pulver, das den Wachstumsfaktor enthält, zu rekonstituieren.
Die Zusammensetzungen der Erfindung sind für die Förderung der Wundheilung in einem Individuum wie z.B. einem Menschen oder einem anderen Säuger nützlich. Die Wunden, die mit den Zusammensetzungen der Erfindung behandelt werden können, schließen jede Wunde ein, die durch eine zufällige Verletzung, durch eine chirurgische Verletzung oder durch Krankheitsgeschehnisse hervorgerufen wird. Diese schließen Hautverletzungen wie z.B. Verbrennungen, Schnittwunden, Wunden an Spenderstellen von Hauttransplantationen, Geschwüre einschließlich Druckwunden, Geschwüre durch Venenstauung und diabetische Geschwüre; Augenwunden wie z.B. korneale Geschwüre, radiäre Keratotomie, korneales Transplantat, Epikeratophakia und andere chirurgisch hervorgerufene Augenverletzungen; und innere Wunden wie z.B. innere chirurgische Verletzungen und Geschwüre ein.
Die Anwendung der Zusammensetzung an dem Ort der Verletzung kann in Abhängigkeit von der Art der Wunde und der Konsistenz der Zusammensetzung durch eine Vielfalt von Möglichkeiten durchgeführt werden. Im Fall von einer relativ viskosen Zusammensetzung kann die Zusammensetzung als Salbe oder Wundsalbe aufgetragen werden. Im Fall von einer dünnflüssigeren Zusammensetzung kann die Zusammensetzung auch durch Injektion oder als Tropfen wie z.B. Augentropfen verabreicht werden. Die Zusammensetzung kann ebenfalls verwendet werden, um im Fall einer topischen Anwendung Verbandmaterial oder im Fall einer Anwendung für eine innere Wundheilung ein Implantationsmaterial, vorzugsweise als ein biologisch abbaubares Implantationsmaterial, zu imprägnieren. Die Zusammensetzung kann als eine einzelne Anwendung oder in vielfachen Anwendungen verabreicht werden, wie es zur Verabreichung einer therapeutischen Dosis nötig ist, wie durch die Antwort der Wundheilung bestimmt wird.
Zusammensetzungen der Erfindung, die angiogene Wachstumsfaktoren wie z.B. bFGF oder VEGF enthalten, können verwendet werden, um Zustände zu behandeln, die durch eine Ischämie gekennzeichnet sind, um den Blutfluss in dem betroffenen Gebiet wiederherzustellen. Solche Zustände schließen eine Erkrankung der Koronararterie und eine Erkrankung der peripheren Gefäße ein. Die Zusammensetzung wird dem betroffenen Gewebe zum Beispiel durch eine Injektion in das gewünschte Gebiet oder durch die Verwendung eines Implantats, in einer einzelnen Anwendung oder in mehrfachen Anwendungen, wie es benötigt wird, verabreicht, um eine therapeutische Dosis zu erzielen, wie durch die angiogene Antwort bestimmt wird.
BEISPIELE
In den nachfolgenden Beispielen hatte die verwendete Natriumcarboxymethylcellulose (CMC) ein Molekulargewicht von 70.000 Da. Die Poly(acrylsäure) hatte ein Molekulargewicht von 3.000.000 Da (im Handel unter dem Markennamen Carbopol^® erhältlich). Das als ein Copolymer des A-B-A-Typs (Polyoxyethylen-Polyoxypropylen-Polyoxyethylen) verwendete Polyoxyethylen-Polyoxypropylen-Blockcopolymer hatte ein Molekulargewicht von 12.600 (im Handel unter dem Markennamen Pluronic^® 127 erhältlich). Der verwendete basische Fibroblasten-Wachstumsfaktor (bFGF) wurde rekombinant als der menschliche basische Fibroblasten-Wachstumsfaktor, das Expressionsprodukt eines Gens, das die 155-Aminosäure-Form des Proteins codiert, hergestellt.
BEISPIEL 1: Herstellung der Gelformulierung
1. Herstellung einer 11,25% Polyoxyethylen-Polyoxypropylen-Vorratslösung
In einer Flasche mit einem Volumen von 250 ml wurden 28,125 g Polyoxyethylen-Polyoxypropylen in 20 mM Citrat-Puffer mit 1 μM EDTA (pH-Wert 6,0) gelöst. Die Lösung wurde durch Bewegung gemischt und in einem Kühlschrank bei 4°C bis zur vollständigen Auflösung des Polymers aufgehoben.
2. Herstellung einer 0,9% CMC- und 11,25% Polyoxyethylen-Polyoxypropylen-Vorratsgellösung
In einer Glasflasche wurden 0,9 g Natriumcarboxymethylcellulose in 100 ml der 11,25% Polyoxyethylen-Polyoxypropylen-Vorratsgellösung gelöst, die, wie vorstehend beschrieben wurde, hergestellt wurde. Die Lösung wurde durch Bewegung gemischt und in einem Kühlschrank bei 4°C aufgehoben.
3. Herstellung einer 0,001% Poly(acrylsäure)- und 11,25% Polyoxyethylen-Polyoxypropylen-Vorratsgellösung
In einer Glasflasche wurde 1 mg Poly(acrylsäure) in 100 ml der 11,25% Polyoxyethylen-Polyoxypropylen-Vorratsgellösung gelöst, die, wie vorstehend beschrieben wurde, hergestellt wurde. Die Lösung wurde durch Bewegung gemischt und in einem Kühlschrank bei 4°C aufgehoben.
4. Herstellung einer 4,0 mg/ml bFGF-Gelformulierung in 10% Polyoxyethylen-Polyoxypropylen und 0,8% Natriumcarboxymethylcellulose
Ein Reaktionsgefäß des gefriergetrockneten bFGF (7,2 mg/Reaktionsgefäß) wurde mit 1,6 ml (Gesamtvolumen 1,8 ml) der Vorratsgellösung (0,9% CMC und 11,25% Polyoxyethylen-Polyoxypropylen) rekonstruiert, um eine Gelformulierung mit 4,0 mg/ml bFGF, 10% Polyoxyethylen-Polyoxypropylen und 0,8% CMC zu erhalten.
Die Formulierung wurde durch Bewegung gemischt, bis das Pulver vollständig gelöst war.
5. Herstellung einer 0,4 mg/ml bFGF-Gelformulierung in 10% Polyoxyethylen-Polyoxypropylen und 0,8% CMC
Ein Reaktionsgefäß des gefriergetrockneten bFGF (7,2 mg/Reaktionsgefäß) wurde mit 1,8 ml (Gesamtvolumen 2,0 ml) Wasser rekonstruiert. Ein ml der rekonstruierten bFGF-Lösung wurde zu 8,0 ml der Vorratsgellösung (0,9% CMC und 11,25% Polyoxyethylen-Polyoxypropylen) zugegeben, um eine Gelformulierung mit 0,4 mg/ml bFGF, 10% Polyoxyethylen-Polyoxypropylen und 0,8% CMC zu erhalten. Die Gelformulierung wurde durch Rühren gemischt, bis das Pulver vollständig gelöst war.
6. Herstellung eines 4,0 mg/ml bFGF-Gels in 10% Polyoxyethylen-Polyoxypropylen und 0,01% Poly(acrylsäure)
Das Herstellungsverfahren war das gleiche wie für die Herstellung der 0,4 mg/ml bFGF-Gelformulierung in 10% Polyoxyethylen-Polyoxypropylen und 0,8% CMC, mit der Ausnahme dass die Vorratsgelformulierung aus 0,01% Poly(acrylsäure) und 11,25% Polyoxyethylen-Polyoxypropylen bestand.
7. Herstellung eines 0,4 mg/ml bFGF-Gels in 10% Polyoxyethylen-Polyoxypropylen und 0,01% Poly(acrylsäure)
Das Herstellungsverfahren war das gleiche wie für die Herstellung der 0,4 mg/ml bFGF-Gelformulierung in 10% Polyoxyethylen-Polyoxypropylen und 0,8% CMC, mit der Ausnahme dass die Vorratsgelformulierung aus 0,01% Poly(acrylsäure) und 11,25% Polyoxyethylen-Polyoxypropylen bestand.
Unter Verwendung der in BEISPIEL 1 beschriebenen Verfahren können Formulierungen der Erfindung hergestellt werden, die variierende Mengen des Wachstumsfaktors, des wassermischbaren anionischen Polymers und des wassermischbaren nicht-ionischen Polymers enthalten.
BEISPIEL 2: Förderung der Angiogenese
Männliche und weibliche Sprague-Dawley-Ratten (225-425 g Körpergewicht) wurden kurz durch das Einatmen von Isofluran betäubt. Der Unterleib wurde rasiert und mit 70% Ethanol gereinigt. Unter Verwendung einer 18- oder 25-Gauge-Nadel wurden Gelformulierungen, die variierende Dosen von bFGF enthielten und die durch, die in Beispiel 1 beschriebenen Verfahren, hergestellt wurden, sowie Kontroll-Gelformulierungen, die kein bFGF enthielten, subkutan entlang der Mittellinie des Unterleibs injiziert. Die Tiere waren fast sofort, nachdem das Einatmen von Isofluran abgebrochen wurde, wach und beweglich.
Fünf Tage nach der Injektion wurden die Tiere durch das Einatmen von Kohlendioxid oder durch eine Überdosis von Phenobarbital getötet. Das Körpergewicht wurde aufgezeichnet und die Haut des Unterleibs wurde vorsichtig aufgeschnitten und zurückgebogen, um die Unterleibsmuskeln freizulegen. Das Gewebe, das die Injektionsstelle direkt umgab, wurde auf Anzeichen für Angiogenese sowie auf das Vorhandensein oder das Fehlen von Entzündungen beurteilt. Das Bewertungssystem war, wie nachfolgend beschrieben wird.

++++ deutliche Angiogenese
+++ moderate Angiogenese
++ leichte Angiogenese
+ sehr leichte Angiogenese
– keine Angiogenese
I Entzündung

Die Ergebnisse der 5-Tage dauernden Angiogenesetests sind in der nachfolgenden Tabelle dargestellt. Ergebnis der Angiogenese der bFGF-Gelformulierungen (5-Tage-Test)

bFGF (mg/ml)	Polyoxyethylen-Polyoxypropylen (Pluronic 127)	anionisches Polymer	Ergebnis
0.4	17%		–
4.0	10%	0.80% CMC	+ + + +
0.4	10%	0.80% CMC	+ + +
0.04	10%	0.80% CMC	+ +
0	10%	0.80% CMC	–
0.4	15%	0.50% PAA	+ + + +, I
0.4	10%	0.78% PAA	+ + + +, I
4.0	10%	0.80% PAA	+ + + + +, I
0.4	10%	0.80% PAA	+ + + +, I
0.04	10%	0.80% PAA	+ + + +, I
0	10%	0.80% PAA	+, I
0.4	10%	0.25% PAA	+ + +, I
0.4	10%	0.10% PAA	+ + +, I
0	10%	0.25% PAA	+, I
0	10%	0.10% PAA	+, I
0.4	10%	0.0 1% PAA	+ + +
0.4	10%	0.001% PAA	+ + +
0	10%	0.01% PAA	–
0	10%	0.001% PAA	–

PAA = Poly(acrylsaure)
CMC = Natriumcarboxymethylcellulose

BEISPIEL 3: Förderung der Wundheilung
Dr. Thomas Mustoe (Division of Plastic Surgery and Departments of Surgery and Pathology, Northwestern University Medical School, Chicago) zeigte, dass Ischämie im Kaninchenohr, die durch eine chirurgische Durchtrennung von zwei der drei Hauptohrarterien hervorgerufen wurde, zu einer beeinträchtigten Heilung von Vollhautwunden führte (Ahn und Mustoe, Ann Plast Surg 24:17-23 (1990)). Weil die Wunde durch den darunter liegenden, intakten Knorpel des Ohrs geschient ist, erfolgt der Wundverschluss durch die zelluläre Infiltration und nicht durch physikalische Kontraktion. Veröffentliche Studien haben gezeigt, dass bFGF, das in Kochsalzlösung in Dosen bis zu 30 μg/Wunde verabreicht wurde, bei der Stimulation der Akkumulation des Granulationsgewebes oder des Epithelgewebes in diesen Wunden unwirksam ist (Wu et al., Growth Factors 12:29-35 (1995)). Die Wirkungen von bFGF, das in einer Depot-Gelformulierung verabreicht wurde, wurde in diesem Model getestet.
Zwei Dosierungsformen von bFGF (0,4 mg/ml und 4,0 mg/ml), die mit 10% Polyoxyethylen-Polyoxypropylen (Pluronic^® 127) plus 0,001% Poly(acrylsäure) formuliert wurden, wurden mit Placebokontrollen (Formulierungen ohne bFGF) in einer Blindstudie getestet. Jede Dosierungsform wurde mit 10 μl pro Wunde (4 und 40 μg/Wunde bFGF) verabreicht. Die Testproben wurden einmal an dem Tag verabreicht, an dem die Wunde eingeführt wurde. Eine histologische Auswertung, die nach einer Erholungszeit von 7 Tagen durchgeführt wurde, schloss die Quantifizierung der Akkumulation von Granulationsgewebe und Epithelgewebe ein (Wu et al., 1995). Es wurde eine deutliche Akkumulation von Granulationsgewebe (dargestellt in 1) und Epithelgewebe (dargestellt in 2) in dem Bereich der Wunde als Antwort auf bFGF festgestellt. Zusätzlich war die Größe der Wunde, gemessen als Hohlraum mit Granulationsgewebe (dargestellt in 3) und Hohlraum mit Epithelgewebe (dargestellt in 4), in einer statistisch signifikanten Weise durch die Behandlung mit bFGF vermindert, wobei die Formulierung der Erfindung verwendet wurde. Die P-Werte, die in 1–4 angezeigt werden, wurde in einem zweiseitigen ungepaarten t-Test ermittelt. Eine frühere Arbeit zeigte, dass Dosen von bFGF bis zu 30 μg/Wunde, die in Kochsalzlösung formuliert wurden, in diesem Model unwirksam waren.
BEISPIEL 4: In-vitro-Freisetzung von bFGF
Die in-vitro-Freisetzung von bFGF von verschiedenen Gelformulierungen wurde unter Verwendung von Franz-Diffusionszellen (Model FDC40015FG, Crown Bioscientific, Inc., NJ) bei 32°C beurteilt. Jede Zelle besteht aus einer Spender- und einer Empfängerkammer. Eine hydrophile Membran (Nucleopore Track-Etch Membrane, Corning Separation Division, Nr. 110609) wurde zwischen den Spender- und den Empfängerkammern aufgebaut. Die Membran wurde so ausgewählt, dass bFGF, nicht aber deutliche Mengen von Pluronic^®, Carbopol^® oder Natrium-CMC in die Empfängerkammer übertreten konnten. Die Gelformulierungen wurden in die Spenderkammer platziert und eine Pufferlösung (100 g/ml Heparin in HBS-EP-Puffer [BIA geprüft, BIAcore AB, Uppsala, Schweden, enthaltend 0,01 M HEPES mit einem pH-Wert von 7,4; 0,15 M NaCl, 3 mM EDTA und 0,05% Polysorbat 20]) wurde in die Empfängerkammer platziert. Proben wurden aus der Empfängerkammer zu verschiedenen Zeitpunkten entnommen und die Konzentrationen von bFGF wurden unter Verwendung eines BiaCore 2000-Instruments (Biacore AB, Uppsala, Schweden) bestimmt. Die Gesamtmenge und Gesamtfreisetzung in Prozent wurden anschließend berechnet und die Ergebnisse werden in den 5 beziehungsweise 6 gezeigt.

Claims

Hydrogelzusammensetzung für die kontrollierte Freigabe eines Polypeptid-Wachstumsfaktors, umfassend: (a) eine therapeutisch wirksame Menge eines Polypeptid-Wachstumsfaktors, der mindestens eine Region mit positiver Ladung enthält; (b) ein physiologisch verträgliches wassermischbares anionisches Polymer; (c) einen physiologisch verträglichen wassermischbaren nicht-ionischen polymeren Viskositätsregler; und (d) Wasser.
Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei der Wachstumsfaktor ausgewählt ist aus basischem Fibroblasten-Wachstumsfaktor, Thrombocyten-Wachstumsfaktor, epidermalem Wachstumsfaktor, vaskulärem endothelialem Zellwachstumsfaktor und Heparin-bindendem EGF-ähnlichem Wachstumsfaktor.
Zusammensetzung nach Anspruch 2, wobei der Wachstumsfaktor basischer Fibroblasten-Wachstumsfaktor ist.
Zusammensetzung nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei das wassermischbare anionische Polymer ausgewählt ist aus Natriumcarboxymethylcellulose und Poly(acrylsäure).
Zusammensetzung nach Anspruch 4, wobei das wassermischbare anionische Polymer Poly(acrylsäure) ist.
Zusammensetzung nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei der wassermischbare nicht-ionische polymere Viskositätsregler ein Polyoxyethylen-Polyoxypropylen-Blockcopolymer ist, das ein Molekulargewicht von 5.000 Da bis 15.000 Da aufweist.
Zusammensetzung nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei das anionische Polymer in einer Menge von 0,001 Gew.-% bis 1,0 Gew.-% der Zusammensetzung vorliegt.
Zusammensetzung nach Anspruch 5, wobei die Poly(acrylsäure) in einer Menge von 0,001 Gew.-% bis 0,1 Gew.-% der Zusammensetzung vorliegt.
Zusammensetzung nach Anspruch 5, wobei die Poly(acrylsäure) in einer Menge von 0,001 Gew.-% der Zusammensetzung vorliegt.
Zusammensetzung nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei der nicht-ionische polymere Viskositätsregler in einer Menge von 0,5 Gew.-% bis 25 Gew.-% der Zusammensetzung vorliegt.
Hydrogelzusammensetzung nach Anspruch 1, wobei der Polypeptid-Wachstumsfaktor basischer Fibroblasten-Wachstumsfaktor ist, das anionische Polymer in einem Bereich von etwa 0,001 Gew.-% bis etwa 0,1 Gew.-% und der physiologisch verträgliche wassermischbare nicht-ionische polymere Viskositätsregler in einem Bereich von etwa 0,5 Gew.-% bis etwa 25 Gew.-% vorliegt.
Verwendung eines angiogenen Polypetid-Wachstumsfaktors, der mindestens eine Region mit positiver Ladung, ein physiologisch verträgliches wassermischbares anionisches Polymer, einen physiologisch verträglichen wassermischbaren nicht-ionischen polymeren Viskositätsregler und Wasser enthält, zur Herstellung einer Hydrogelzusammensetzung mit kontrollierter Freigabe für die Behandlung eines an Ischämie erkrankten Individuums.
Verwendung nach Anspruch 12, wobei der nicht-ionische polymere Viskositätsregler ein Polyoxyethylen-Polyoxypropylen-Blockcopolymer mit einem Molekulargewicht von 5.000 Da bis 15.000 Da ist.
Verwendung nach Anspruch 12, wobei das anionische Polymer in einer Menge von etwa 0,001 Gew.-% bis etwa 0,1 Gew.-% der Zusammensetzung vorliegt.
Verwendung nach Anspruch 12, wobei die Hydrogelzusammensetzung durch Depotinjektion verabreicht wird.
Verwendung nach Anspruch 12, wobei die Hydrogelzusammensetzung topisch verabreicht wird.
Verwendung nach einem der Ansprüche 12 bis 16, wobei das Arzneimittel eine kontrollierte Freigabe des Wachstumsfaktors ermöglicht.
Verwendung nach einem der Ansprüche 12 bis 17, wobei der Wachstumsfaktor ein angiogener Polypeptid-Wachstumsfaktor ist.
Verwendung nach Anspruch 18, wobei der angiogene Polypeptid-Wachstumsfaktor ausgewählt ist aus basischem Fibroblasten-Wachstumsfaktor und vaskulärem endiothelialem Zeltwachstumsfaktor.
Verwendung nach einem der Ansprüche 12 bis 19, wobei das anionische Polymer in einer Menge von etwa 0,001 Gew.-% bis etwa 0,1 Gew.-% der Zusammensetzung vorliegt.
Verwendung nach einem der Ansprüche 18 bis 20, wobei die behandelte Ischämie eine Erkrankung der peripheren Gefäße ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 18 bis 20, wobei die behandelte Ischämie eine Erkrankung der Koronararterie ist.