DE3588008T2

DE3588008T2 - Hefestämme zur erzeugung cellulolytischer enzyme und verfahren und mittel zu deren herstellung.

Info

Publication number: DE3588008T2
Application number: DE3588008T
Authority: DE
Inventors: Jonathan Knowles; Paeivi Lehtovaara-Helenius; Helena Nevalainen; Merja Penttilae; Irma Salovuori; Tuula Teeri
Original assignee: Alko Oy AB
Current assignee: AB Enzymes Oy
Priority date: 1984-04-13
Filing date: 1985-04-12
Publication date: 1995-10-12
Anticipated expiration: 2005-04-13
Also published as: US5529919A; FI864110A; DK580385A; EP0214971B1; US4894338A; EP0312121A2; FI864110A0; WO1985004672A1; ATE121132T1; FI86745C; EP0312121A3; DE3588008D1; US5393670A; FI841500A0; FI86745B; CA1305931C; EP0214971A1; DK580385D0

Description

Hintergrund der Erfindung

Es sind drei verschiedene Klassen der enzymatischen Aktivität erforderlich für die vollständige Hydrolyse von Cellulose zu Glukose. Die beiden Hauptaktivitäten, die bei der Cellulosesolubilisierung involviert sind, sind Endoglukanose (EC 3.2.1.4) und Cellobiohydrolase (EC 3.2.1.91) (1, 2). Für die Herstellung von Glukose ist ein dritter Aktivitätstyp erforderlich, nämlich Cellobiase oder β-Glukosidase (EC 3.2.1.21). Die genaue Art, in welcher diese drei verschiedenen Enzymklassen miteinander reagieren, um die vollständige Hydrolyse der Cellulose zu bewirken, ist noch nicht aufgeklärt.
Einige fadenförmige Fungi produzieren eine Zahl von verschiedenen Isoenzymen von jeder Klasse der zellulolytischen Enzyme, die offensichtlich synergistisch bei der Hydrolyse reagieren (3, 4, 5, 6).
Es hat sich herausgestellt, daß Trichoderma wenigstens zwei immunologisch unterschiedliche Cellobiohydrolasen CBH 1 und CHB II, wenigstens zwei Endoglukanasen, ENDO II und ENDO III, und eine β-Glukosidase produziert. Während die enzymatische Hydrolyse der Cellulose äußerst schnell abläuft in Gegenwart aller dieser Enzyme, ist CBH I alleine in der Lage, kristalline Cellulose zu Glukose und Cellobiose (7, 8, 9) abzubauen.
Zwei Gruppen haben das Molekularklonen der T. reesei Gene für CBH I berichtet, und die vollständige Sequenz dieses Gens ist bekannt (10, 11):
Hefe ist ein wichtiger industrieller Organismus und wird zum Brauen, bei der Weinherstellung, zum Backen, bei der Ethanolherstellung, bei der Einzelzellenproteinherstellung und in letzterer Zeit für die Herstellung von pharmazeutischen Produkten wie Interferon, Wachstumshormon und Hepatitis B-Virusantigen verwendet. Hefe bildet keine Enzyme, die Zellulose abbauen. Die Entwicklung von Hefestämmen, die in der Lage sind, Cellulose zu hydrolysieren, würde Verbesserungen bei den bestehenden Verfahren, bei denen Cellulose oder Glukane in dem verwendeten Rohmaterial vorhanden sind, ermöglicht. Ebenso wichtig wäre es, neue Verfahren, die derzeit noch nicht möglich sind, zu entwickeln.
Beim Filtrieren und Klären von hochmolekulargewichtigen Bier- β-Glukanen, die aus Gerstekörnern stammen, treten Probleme auf. In der Brauindustrie werden mikrobielle β-Glukanasen zur Entfernung dieser β-Glukane verwendet. Wäre die bei der Herstellung des Biers verwendete Hefe in der Lage, Endoglukanasen zu produzieren, dann würde die Filtrierbarkeit des Bieres merklich verbessert werden, und die Kosten des Filtrierens würden verringert werden. Bei der Übertragung von individuellen fungalen Cellulasegenen auf Hefe ist es möglich, Hefestämme zu produzieren, die nur ein Cellulaseenzym bilden. Solche Hefestämme würden Enzyme produzieren, die beispielsweise in der Pulpe- und Papierindustrie verwendet werden. Die bei der Papierherstellung verwendete Cellulose könnte angequollen und mit einem Cellulaseenzym vorbehandelt werden, welches das Quellen bewirkt, ohne eine übermäßige Hydrolyse der Cellulose.
Es gibt zwei Wege, mittels denen man fremde Gene in Hefe exprimieren kann. Die einfachste Art ist, das ganze Gen aus dem Chromosom des Donororganismus in einen Hefevektor einzubringen und eine Hefezelle zu transformieren. Wenn das genetische System der Hefe die geeignete Sequenz in dem übertragenen Gen erkennt, dann wird das Gen exprimiert. Jedoch ist dies in der Praxis selten und hängt zumindestens zum Teil von dem genetischen Unterschied zwischen dem Donororganismus und der Hefe ab.
Beispielsweise wurde festgestellt, daß von den fünf Genen aus Aspergillus niger die in Saccharomyces cerevisiae getestet wurden, nur eines exprimiert wird (12). Deswegen kann man nicht annehmen, daß heterologe Gene automatisch in Hefe exprimiert werden.
Die zweite Methode für eine Exprimierung von Genen in Hefe besteht darin, daß man entweder das chromosomale Gen oder eine cDNA-Kopie der Messengers-RNA, die für das gewünschte Gen kodiert, mit einer Hefepromotorsequenz verbindet. Auf diese Weise wurden humanes Eukaryotinterferon (13), Hepatitis B-Virusoberflächenantigen (14), Rinderrennin (15) und Mäuse-α-Amylase (16) alle in Hefe exprimiert.
Diese und weitere Untersuchungen zeigen, daß zwar eine Exprimierung von cDNA oder von Genen immer erzielt wird, daß aber die Menge und die zellulare Lokalisation des Produktes sehr schwierig ohne Experimente vorherzusagen ist. Montenecourt (1) hat eine Reihe von möglichen Klonierungsstrategien zum Klonen zu Cellulasegenen aus T. reesei beschrieben, aber hat nicht die Methoden, die zum Erzielen des Ziels angewendet werden, beschrieben.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Die Erfindung beschreibt Hefestämme, die in der Lage sind, das zellulytische Enzym CBHII zu bilden, Verfahren zum Aufbau dieser Stämme, rekombinante DNA-Vektoren, die erforderlich sind zum Aufbau dieser Stämme, Methoden, die man zum Aufbau dieser Vektoren verwendet und cDNA-Kopien für die das zelluloytische Enzym kodierenden Gene.
Das chromosomale Gen, das für die Cellulase CBHII kodiert, wurde aus der Genphage von T. reesei durch Differentialhybridisierung isoliert. Fragmente dieses Gens wurdem zum Isolieren der vollen Länge aus einer T. reesei cDNA-Library verwendet.
cDNA für die Cellulase CBHII wurde in geeignete zwei 2 u Hefeplasmide überführt. Bei der Verwendung zum Transformieren von geeigneten Hefestämmen leitete es die Exprimierung und die Sekretion des Cellulaseenzyms. Die durch die Hefe gebildetete Cellulase zeigte ähnliche Aktivitäten wie das native fungale Enzym.

KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN

Die vorliegende Erfindung wird ausführlicher unter Bezugnahme auf die beiliegenden Zeichnungen erläutert.
Fig. 1 zeigt die Restriktionskarte von T. reesei Cellobiohydrolase I (CBH I) chromosomalem Gen. Die Kodierungsregion wird durch die dicke Linie ausgedrückt.
Fig. 2 zeigt die Restriktionskarte von T. reesei Cellobiohydrolase II (CBH II) chromosomalem Gen. Die Kodierungsregion wird durch die dicke Linie gekennzeichnet.
Fig. 3 zeigt die Restriktionskarte von T. reesei Endoglukanase II (ENDO II) chromosomalem Gen. Die Kodierungsregion wird durch die dicke Linie ausgedrückt.
Fig. 4 zeigt die cDNA-Sequenz des CBH II Gens von T. reesei aus dem Plasmid pTT09.
Fig. 5 zeigt die cDNA-Sequenz des ENDO II Gens von T. reesei aus Plasmid pTT11. Die Positionen der in der chromosomalen Kopie des Gens gefundenen Introne werden mit einem Pfeil gekennzeichnet ().
Fig. 6 zeigt den Aufbau des Plasmids pMP29 zum Exprimieren von T. reesei CBH II in Hefe.
Fig. 7 zeigt die Enzymaktivität von CBH I, hergestellt durch den Hefestamm VTT-RC-84001.

Ausführliche Beschreibung

Die in der ausführlichen Beschreibung verwendeten Definitionen sind die, wie sie in den Gilbert und Talmadge Patent (USA) 4,338,397 angegeben sind.

Materialien

Bakterien- und Pilzstämme, Plasmide und Phage.

Es wurde T. reesei Stamm VTT-D-80133, ein mutanter Stamm mit einer verbesserten Produktion von zellulolytischen Enzymen, der sich von QM 9414 (17) nach verschiedenen aufeinanderfolgenden Mutationsstufen (18) ableitet, zur Isolierung der Gene aus Cellobiohydrolase I (CBH I), Cellobiohydrolase II (CBH II) und Endoglukanase II (ENDO II) verwendet.
Die Escherichia coli Stämme Q358 und Q359 und Ä Phase 1059, die beim Aufbau der T. reesei Genbank verwendet wurden, wurden zur Verfügung gestellt von Dr. J. Karn (19) . E. coli HB 101 wurde als Wirt in fünf Transformationen mit dem Plasmid pBR 322 verwendet. E. coli JM 101 und die Phage M 13 mp 7 (20) und die Plasmide pUC 8 und pUC 9 (21), die in der Dideoxysequenz verwendet wurden, stammten aus dem Laboratorium von F. Sanger. Die verwendeten Hefestämme waren Saccharomyces cerevisiae OL1 (Mata leu 2-3 leu 2-112 his 3-11 his 3-15 ura 3-251 ura 3-373) (22) und S. Cerevisiae MT302-1c (Mata arg 5-6 leu 2-3 leu 2-112 his 3-11 his 3-15 pep 4-3 ade) (23).
Ein 12 kb Cosmid p3030, erhalten von Barbara Hohn, der sowohl in E. coli als in Hefe repliziert, wurde als Vektor, der die chromosomale Kopie von CBH I auf Hefe überträgt, verwendet. Cosmid p3030 enthält Gene für Ampicillin- und Tetracyclinresistenz in E. coli und das his3-Gen für die Auswahl in Hefe. Der Vektor enthält eine cos Stelle, die ihm ermöglicht, in vitro in infektive λ-Phage-Teilchen und in Hefe 2 u EcoD Fragment gepackt zu werden. Hefeexpressionsvektor enthaltend den Phosphorglycerokinase (PGK)-Genpromotor wurde zum Exprimieren von cDNA-Kopien von Cellulasegenen in Hefe verwendet (23).

Enzyme.

Restriktionsenzyme wurden von Amersham (UK), Boehringer Mannheim (FDR) und Bethesda Research Laboratories (Gaithersburg, MD) erworben und nach den Vorschriften des Herstellers verwendet. T4-Ligase und die DNA-Polymerase I- große Untereinheit stammten von Biolabs und die Kälbereingeweidephosphatase von Boehringer Mannheim. Die Umkehrtranskriptase stammten von Dr. J. W. Beard (Life Sciences Inc., St. Petersburg, Fla.). Das Protoplastenzym, Zymolyase 60000 wurde von Kirin Brewery Co., Japan erhalten. Klenow-Fragment von E. coli Polymerase I stammte von Boehringer Mannheim.

Allgemeines Wachstumsmedium.

E. coli HB101 wuchs in L-Brühe. Transformanten wurden ausgewählt auf L-Platten, die mit 1,5 % Agar supplementiert waren und 100 ug/ml Ampicillin enthielten. Die Konzentration des zu den L-Platten zugefügten Tetracyclins ware 10 ug/ml. Das vollständige Medium YPG für das Wachstum von Hefe enthielt 1 % Hefeextrakt, 2 % Pepton und 2 % Glukose. Das Hefeminimalmedium YMB enthielt 0,67 % Hefestickstoffbase (Difco, Detroit, USA) und 2 % Zucker (Lactose, Cellobiose, Stärke oder Glukose) . Die Endkonzentration der zugefügten Aminosäuren war entsprechend der Vorschrift (24) . Das Verfestigungsmittel auf den Hefeplatten war 2 % Agara (Difco Bacto Agar) . Zu dem Hefeprotoplastplattierungsmedium wurden 1,2 M Sorbitol als osmotischer Stabilisator zugefügt. Das oberste Agar, das zum Plattieren der Hefeprotoplasten für die Regeneration verwendet wurde, wurde hergestellt als ein Minimalmedium, jedoch unter Verwendung von 3 % gereinigtem Agar (Difco) als Verfestigungsmittel.
Alle Methoden entsprachen, wenn nicht anders angegeben, den in Maniatis et al. 1982 (25) beschriebenen.

Isolierung und Charakterisierung der zellulolytischen Gene aus dem Fungus T. reesei

Polyadenylierte (polyA+) Messenger RNA, isoliert aus T. reesei Myzelen, die aktiv Cellulasen bildet, steuert bei der in vitro Synthese - in Kaninchenreticulocytenlysat - eine Anzahl von großen Polypeptiden, die durch gegen gereinigte cellulolytische Enzyme hergestellte Antikörper ausgefällt werden. Messenger RNA, die isoliert wurden aus unterdrückten, auf Glukose gewachsenen Myzelen, bewirkt nicht direkt die Synthese dieser cellulasespezifischen Polypeptide. Dieser Unterschied zwischen eingeleiteten und unterdrückten Populationen wurde zum Identifizieren einer Sammlung von Hybrid-λ-Phagen, enthaltend T. reesei Genen, die stark während der Bildung der zellulolytischen Enzyme exprimiert wurden, verwendet.
Für die Isolierung des zellulasespezifischen induzierten mRNAs wurde T. reesei, wie von Bailey und Nevalainen (26) beschrieben, gezüchtet mit der Ausnahme, daß das Medium 2 % Lactose und 2 % löslicher Extrakte von Branntweinschlämpe enthielt. Proben, die während der Kultivierung entnommen wurden, wurden auf die Aktivität gegen abgetötetes Avicel, Hydroxyethylcellulose (HEC) und auf lösliches Protein (26) untersucht. Die Bewertung der reduzierten Zucker erfolgte nach der Methode von Sumner (27).
Zellular RNA aus Myzelen wurde durch Modifizieren der Methode von Ohi und Short (28) isoliert. Die gefrorenen Myzele wurden zu einem feinen Pulver unter flüssigem Stickstoff zermahlen und in einem Puffer, enthaltend 20 mM Tris-HC1 (pH 7,6), 0,1 M NH&sub4;, 1 mM Mg (Oac)&sub2;, 10 mM Natriumjodoacetat, 0,5 mg/ml Polyvinylsulfat und 2 % Na-dodecylsulfat (SDS) suspendiert.
Nach anschließendem 30-minütigen Inkubieren bei 37ºC wurde unlösliches Material durch 10-minütiges Zentrifugieren mit 13.000 G entfernt.
Die Poly(A)+-Fraktion wurde chromatographisch durch eine Oligo (dT)-Cellulosesäule (Bethesda Research Laboratories (29)) gereinigt und eine in vitro Translation wurde durchgeführt mit Kaninchen-Reticulozytenlysat unter Verwendung von ³&sup5;S-Methionin (Amersham International Ltd. (30)) . Eine Immunoausfällung wurde gemäß Dobberstein (31) durchgeführt unter Verwendung von Antiserum, das gegen gereinigtes CBH I, CBH 11 oder ENDO II hergestellt war oder mit dem entsprechenden präimmunen Serum.
Tabelle 1 zeigt die Molekulargewichte der durch die Antiseren gegen spezifische Cellulasen ausgefällten Proteine, analysiert auf 7,5 bis 15 % SDS Polyacrylamidgelen (32) Tabelle 1 Antiserum in vivo in vitro
Der Aufbau der T. reesi Genbank erfolgte wie nachfolgend angegeben.
Conidia von Trichoderma reesei wurden in einem flüssigen Medium, enthaltend 1,5 % KH&sub2;PO&sub4;, 0,5 % (NH4)&sub2;SO&sub4;, 0,06 % MgSO&sub4;.&sub7;H&sub2;O, 0,06 % CaCl2, 0,15 % Proteosepepton, 0,03 % Harnstoff, 2 % Saccharose und Mineralsalze, keimen gelassen. Die Kulturen wurden unter 12-stündigem Schütteln bei 29ºC inkubiert. Die Isolierung der Kerne erfolgte mittels der etwas modifizierten Methode von Hautala et al (33). DNA wurde aus den rohen Kernpellets, erhalten durch Differentialzentrifugieren, von homogenisiertem Myzelium isoliert. Die rohen Kernpellets wurden mit SDS-Amylaselösung (100 mM) EDTA pH 8,0, 140 mM NaCl, 1 % Na-decylsulfat und 3,3 % α-Amylase, erhalten von Merck, Darmstadt, BRD) 1 h bei 37ºC behandelt. Dann wurde Proteinase K (Endkonzentration 0,8 % (w/v) zugegeben und das Inkubieren wurde unter leichtem Schütteln 2 h bei 37ºC fortgesetzt. Nach dem Inkubieren wurde die Zelldebris durch Zentrifugieren abgetrennt und DNA wurde aus der überstehenden Lösung mit Ethanol ausgefällt. Die DNA wurde dann durch CsCl-Zentrifugieren gereinigt. Die chromosomale DNA aus T. reesei wurde teilweise mit MboI aufgeschlossen und mittels Saccharosedichtegradientenzentrifugieren aufgeteilt. 15 bis 20 kb Fragmente waren an Bam HI-gespaltene λ 1050 DNA gebunden. Das in vitro Packen der rekombinanten Moleküle wurde unter Verwendung eines Packextraktes, hergestellt nach der Methode von Hohn und beschrieben von Maniatis et al (25) durchgeführt.
Die rekombinanten Phagen wurden von dem Agar auf Nitrocellulosefilter (Schleicher & Schüll, BA 35), wie es von Benton und Davis (34) beschrieben wird, übertragen. cDNAs, hergestellt aus induzierter mRNA (vorher schon beschrieben) und aus mRNA, isoliert aus Fungus, der in Gegenwart von Glukose wachsengelassen worden war, wurden als Sonden verwendet. Eine erste cDNA Strangsynthese wurde nach dem Verfahren von Efstraiatis et al (35) durchgeführt, jedoch unter Verwendung von 10 uCi von 32 pαATP pro 50 ul Reaktionsansatz. Die in situ Plaquehybridisierung wurde gemäß Maniatis und Mitarbeiter (25) durchgeführt. Die Hybridisierung wurde durch Autoradiographie auf den Filtern auf Kodak X-OMAT-Film nachgewiesen. Positive Plaques wurden in 1 ml SM (25) und einen Tropfen Chloroform gegeben und bei -4ºC gelagert.
Die Hybridphagen, die nur gegen cDNA, hergestellt durch induzierte mRNA, enthaltend Celluloasekodierungssequenzen, hybridisierten, wurden gründlich gereinigt und gegenüber beiden Sonden durch Hybridisierung nochmal getestet. Es wurde eine Reihe von unterschiedlichen Hybridklonen, die kräftig gegenüber der induzierten Cellulasesonde hybridisierten, identifiziert und für weitere Untersuchungen ausgewählt.
Die Hybridphage, enthaltend Gene, die eingeführt wurden, als der Pilz Cellulasen bildete, wurden zunächst gemäß ihren Restriktionsenzymmustern gruppiert. Dann wurde das jeweilige Cellulasegen in jeder Gruppe durch Hybridselektion von Messenger RNA identifiziert.
DBM-Papier wurde von Schleicher und Schüll (Keene, NH) erhalten und nach den Anleitungen der Hersteller aktiviert. Das Binden von DNA an das aktivierte Papier und die RNA- Hybridisierung und Eluierung wurde gemäß Maniatis und Mitarbeiter (25) durchgeführt. Die Translation von RNA erfolgte mit Kaninchenreticulozytenlysat, das von Amersham International Ltd. stammte, und die gebildeten Proteine wurden mit ³&sup5;S-Methionon markiert. Die Proteine wurden autoradiographisch auf Kodak X-OMAT-Film nach dem Trennen auf einem 7-15 %igen Polyacrylamid-gradientendenaturierungsgel analysiert.
Die Größe der aus den jeweiligen Phagen durch Hybridselektion erhaltenen Proteine und deren Kreuzreaktion mit spezifischem Antiserum wird in Tabelle 2 gezeigt. Tabelle 2 Hybridphage Molekulargewicht des Hauptproteins, das aus hybridselektierter Message gebildet wurde Kreuzreaktion des Hauptproteins mit Antisera gegen
Einzelne und doppelte Aufschlüsse des Klons 44A wurden auf 0,6 % und 1,5 % Agarosegelen analysiert. Die Fragmente wurden elektrophoretisch auf Gensiebmembrane (New England Nuclear, MA) überführt und nach den Vorschriften des Herstellers zu den eingeführten cDNA-Sonden hybridisiert.
Dieses Verfahren ermöglichte die Konstruktion von Restriktionsenzymkarten der drei Cellulosegene. Diese Restriktionsenzymkarten werden in Fig. 1, 2 und 3 gezeigt.
Die Nukleotidsequenz der CBH I-, CBH II- und ENDO II-Gene wurde durch Dideoxysequenzierung (36) unter Verwendung von Restriktionsenzymfragmenten oder DNA-Fragmenten, die durch das "Shotgun"-Verfahren (37) erhalten wurden, erzeugt.

Isolierung der cDNAs in voller Länge, die für die Enzyme CBH I, CBH II und ENDO II kodieren

Eine cDNA-Reihe aus T. reesei wurde aus eingeführter mRNA, die, wie schon vorher beschrieben, aus Zellen isoliert worden war, hergestellt. Jedoch wurde sie, nachdem die gefrorenen Myzele unter flüssigem Stickstoff zermahlen worden waren, in 5 Volumina eines Guanidiniumisothiocyanatpuffers suspendiert, wie dies von Maniatis und Mitarbeiter (25) beschrieben wird. Die RNA-Herstellung wurde wie beschrieben durchgeführt (42).
Die erste cDNA-Strangsynthese wurde gemäß Maniatis (25) durchgeführt und der zweite Strang wurde gemäß Gubler und Hoffmann (43) durchgeführt. Die doppelstrangige cDNA wurde dann mit T&sub4;-Polymerase unter Ausbildung von stumpfen Enden behandelt und kleinere cDNAs, die weniger als 500 Nukleotide lang waren, wurden durch Durchlaufen durch eine CL-4B-Säule (Pharmacia) entfernt. Lange cDNAs wurden dann an Sma I und Phosphatase, die mit Zubereitungen von pUC 8 Vektor behandelt worden war, ligiert. Das Ligierungsgemisch wurde verwendet zum Transformieren von E. coli Stamm JM 105 und die cDNA- Reihe wurde auf Nitrocellulosefilter aufbewahrt.
cDNAs voller Länge, die für CBHI, CBHII und ENDOII kodierten, wurden aus einer cDNA-Reihe isoliert unter Verwendung von spezifischen Restriktionsfragmenten als Sonden. Für die Identifierung von CBHI wurde ein radioaktives Eco RI-Hind III-Fragment aus dem 5'-Ende des chromosomalen Gens zum Identifizieren von langen cDNAs verwendet. Ein Plasmid pTT01 aus einem Klon enthaltend Sequenzhomologe zu diesen Eco RI Hind III-Fragmenten, wurde weiterhin durch Sequenzieren von cDNA-Enden durch doppelstrangiges Dideoxysequenzieren charakterisiert. 1 ug des gereinigten Plasmids wurde in 0,4 M NaOH bei Raumtemperatur 5 min bei einer Konzentration von 100 ng/ul denaturiert. 5 ul eines sequenzierenden oder umkehrsequenzierenden Primers (Amersham) wurde zugegeben, und die Mischung wurde mit Ethanol ausgefällt. Nach dem Waschen wurden die Pellets in 10 ul von 14 mM Tris pH 8 - 7 mM MgCl&sub2; resuspendiert. Sequenzierungsreaktionen wurden nach der allgemeinen Methode (36) durchgeführt, wobei jedoch die Temperatur bei 37ºC gehalten wurde. CBH II cDNAs wurden unter Verwendung von Pvu II-Fragmenten aus dem 5'-Ende des chromosomalen Gens isoliert und das Plasmid pTT09 wurde wie die CBHI cDNA charakterisiert. ENDOII cDNAs wurden identifiziert unter Verwendung eines Kpn I-Sal I-Fragments aus den 5'-Enden des Gens und Plasmid pTT11 wurde ebenfalls wie die CBHI cDNA charakterisiert. Alle cDNAs wurden dann sequenziert, um zu bestimmen, daß ihre Sequenz der des Gens, aus dem sie durch Transkription gewonnen wurden, entsprach. Die DNA-Sequenzen von CBH II und ENDO II cDNAs werden in den Fig. 4 und 5 gezeigt. Die cDNA-Sequenzen von CBH I waren identisch zu der bereits beschriebenen (10).

Der Aufbau des Expressionsvektors, enthaltend cDNAs für die Bildung von Pilzcellulase in Hefe

Der wirksame Hefeexpressionsvektor pMA 91 wurde unter Anwendung der Überwachungssequenzen des Hefephosphorglycerokinase(PGK)-Gens (23) angeordnet. Die für die Aminosäuresequenz des Enzyms kodierenden Sequenzen wurden aus den Gen entfernt und durch eine einfache Bg1l II-Stelle ersetzt. Dieses fortgelassene Gen wurde dann in ein Hefe/Coli-Shuttleplasmid eingesetzt.

CBH II Expressionsvektor (Figur 6)

CBHII cDNA wurde aus Plasmid pTT 09 unter Verwendung von Eco RI und Bam HI entfernt. Die Enden der DNA wurden mit Klenow- Fragment gefüllt. Das cDNA-Fragment wurde dann aus einem Agarosegel isoliert und an den Vektor pMA 91, der wie folgt hergestellt war, ligiert:
pMA 91, der Expressionsvektor, wurde mit Bgl II gespalten, und die Enden wurden mit dem Klenow-Fragment gefüllt. Der Vektor wurde mit Phosphatase behandelt, an die cDNA ligiert und in einen E. coli-Strang HB101 durch Selektion transformiert zum Exprimieren des Vektor Leucingens.
Klone, welche die cDNA in der genauen Orientierung enthielten, wurden identifiziert. Plasmid DNA wurde aus einer Anzahl von Transformanten isoliert und solche Klone, welche den cDNA-Einsatz der korrekten Orientierung bezüglich des PGK-Promotors - identifiziert durch Restriktionsenzymanalyse - enthielten, wurden zurückgehalten. Die Figur 6 zeigt die DNA-Sequenz an den Verbindungsstellen zwischen pMA 91 und der cDNA.
Plasmid pMP 29 mit der cDNA in der korrekten Orientierung wurde dann zum Transformieren von Hefe MT302-1c durch Selektion des Leucinmarkers unter Erhalt des Stammes VTT-RC-84012 verwendet. Die Transformation wurde einfach durchgeführt gemäß der Beschreibung von Gerbaud et al (38). Die Gegenwart eines intakten CBH II-Gens in der Hefe wurde sichergestellt durch Isolieren der Gesamt-DNA (39) aus einer Transformantenkolonie und Verdauung derselben mit Restriktionsenzymen. DNA wurde auf Nitrocellulosefilter (40) von dem Agarosegel übertragen und zu einer geeigneten Sonde (41) hybridisiert.

Kultivieren der Hybridhefestämme unter Ausbildung des cellulolytischen Enzyms CBHII

Stamm VTT-RC-84012 (CBHII cDNA) wurde auf einem Hefeminimalmedium, enthaltend Arginin, Histidin und Adenin drei Tage wachsen gelassen und im Anschluß daran 1/3 Volumen des vollständigen Mediums zugegeben, um den Zellen eine weitere Teilung zu ermöglichen. Das Endvolumen der Kulturen betrug etwa 150 ml.

Herstellung einer unterschiedlichen Fraktion zum Analysieren der Lokalisierung der Enzymaktivität

Drei Fraktionen wurden aus Hybridhefekulturen zum Analysieren der Enzymaktivität bereitet. Fraktion 1 umfaßte das gewachsene Medium ohne die Zellen. Fraktion 2 umfaßte die überstehende Flüssigkeit, die zurückblieb, wenn man die Protoplaste pelletisierte, und Fraktion 3 umfaßte die überstehende Flüssigkeit der lysierten Protoplaste.
Nach dem Kultivieren wurden die Hefezellen durch Zentrifugieren gesammelt und die überstehende Flüssigkeit wurde gewonnen (Fraktion 1) . Die erhaltenen Pellets wurden zweimal mit destilliertem Wasser und 1,2 M Sorbit gewaschen. Die Pellets wurden dann in Protoplasma bildenden Puffer (1,2 M Sorbit, 10 mM Tris und 10 mM CaCl&sub2;, pH 7,6) resuspendiert und dazu wurde Zymolyase 60000 in einer Konzentration von 30 ug/ml der Protoplasma bildenden Suspension gegeben. Die Suspension wurde auf einem Wasserbad bei 37ºC 60 min unter leichtem Schütteln inkubiert. Das so gebildete Protoplasma wurde pelletisiert und die erhaltene überstehende Lösung (periplasmischer Zellgehalt) (Fraktion 2) wurde zur Bestimmung der Enzymaktivität gesammelt. In einigen Fällen wurden Fraktionen 1 und 2 durch Ultrafiltration (Amicon) konzentriert. Die Protoplastpellets wurden mit kaltem 1,2 M Sorbit gewaschen und in 1,2 ml 5 mM Citratpuffer pH 5,0 resuspendiert, pelletisiert und die überstehende Flüssigkeit wurde gewonnen (Fraktion 3).

Messung der durch die Hybridhefen produzierte Cellulaseenzymaktivität

CBHII-Aktivität aus VTT-RC-84012

Drei verschiedene Fraktionen wurden auf CBHII-Enzymaktivität getestet unter Verwendung von amorpher, in einer Kugelmühle gemahlener Cellulose, die nur durch Cellobiohydrolasen (44) angegriffen wird. Die Gesamtproteinkonzentration der Proben betrug etwa 300 ug/ml. Die durch aktives Cellobiohydrolaseenzym verursachte Hydrolyse des Substrates wurde gemessen, indem man die Veränderung der Absorption bei 620 nm maß. Der größte Teil der cellobiohydrolaseartigen Aktivität wurde im Wachstumsmedium gefunden. Die endgültige Proteinkonzentration von 10 ug/ml ist ähnlich der in Fig. 7 gezeigten. Das mit diesem Aufbau gebildete CBHII-Enzym stellte 1 bis 5 % des gesamten Zellproteins dar.
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Claims

1. DNA-Sequenz, die für das Cellulaseenzym Cellobiohydrolase II aus Trichoderma reseei codiert, die in der Lage ist, wenn sie richtig mit einem Expressionsvektor kombiniert wird, ein Protein zu exprimieren, das die cellulolytische Aktivität des Enzymes eines Gastorganismus nach der Transformation durch den Vektor aufweist, wobei die DNA-Sequenz die folgende Aminosäurensequenz:

oder eine im wesentlichen identische Aminosäurensequenz codiert, die die gleiche enzymatische Aktivität zeigt.

2. DNA-Sequenz nach Anspruch 1, die für das Cellulaseenzym Cellobiohydrolase II codiert und die folgende Nukleotidsequenz

oder eine im wesentlichen identische Nukleotidsequenz die eine Aminosaurensequenz codiert, die die gleiche enzymatische Aktivität zeigt, aufweist.

3. DNA-Sequenz nach Anspruch 1, bei der die DNA eine cDNA-Kopie einer mRNA-Codierung für Cellbiohydrolase II in Trichoderma reseei ist.

4. Signalsequenz, die die extracellulare Sekretion eines Proteinsäurenmateriales in Hefe bewirkt, wobei die Signalsequenz die folgende Aminoräurensequenz:

aufweist.

5. Rekombinantes DNA-Plasmid mit einer DNA-Sequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 3 oder einer Signalsequenz nach Anspruch 4, wobei das Plasmid sich in Hefe replizieren und exprimieren kann.

6. Rekombinantes DNA-Plasmid nach Anspruch 5, das sich in der Gattung Saccharomyces replizieren und exprimieren kann.

7. Hefestamm mit einer oder mehreren der folgenden DNA-Sequenzen:

DNA-Sequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 3 oder einer Signalsequenz nach Anspruch 4.

8. Hefestamm nach Anspruch 7, der einen rekombinanten DNA-Vektor mit der DNA-Sequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 3 aufweist.

9. Hefestamm nach Anspruch 8, wobei der Hefestamm ein Mitglied der Gattung Saccharomyces ist.

10. Verfahren zum Konstruieren eines rekombinanten DNA-Plasmid nach Anspruch 5, wobei das Verfahren Verknüpfen einer DNA-Sequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 3 oder einer Signalsequenz nach Anspruch 4 mit einem Plasmid aufweist, der sich in Hefe replizieren und exprimieren kann, aufweist.

11. Verfahren zum Konstruieren eines Hefestammes nach Anspruch 7, wobei das Verfahren Transformieren eines Hefestammes durch einen oder mehrere der rekombinanten DNA-Vektoren von Anspruch 5 bis 6 aufweist.

12. Verfahren zum Erzeugen des fungalen Cellulaseenzym Cellobiohydrolase II, wobei das Verfahren die Kultivierung eines Hefestammes nach einem der Ansprüche 7 bis 10 unter Bedingungen, bei denen der Stamm das Enzym produziert, und die Wiedergewinnung des Enzyms umfaßt.