DE3786592T2

DE3786592T2 - Transformation von trichoderma.

Info

Publication number: DE3786592T2
Application number: DE87303834T
Authority: DE
Inventors: Mogens Trier Hansen; Anu Marjukka Harkki; Jonathan Knowles; Helena Nevalainen; Merja Penttilae
Original assignee: Alko Oy AB
Current assignee: Altia Group Ltd Helsinki Fi
Priority date: 1986-04-30
Filing date: 1987-04-29
Publication date: 1993-11-04
Anticipated expiration: 2007-04-30
Also published as: FI871908A; NO871785D0; DE3786592D1; JP2769305B2; EP0244234B1; GB8610600D0; DE3786592T3; DK175814B1; IE871149L; ES2056817T5; EP0244234A2; EP0244234B2; JPH08173156A; FI871908A0; DK219087A; EP0244234A3; NO871785L; DK219087D0; ES2056817T3; FI108358B

Description

Die vorliegende Erfindung ein Vektorsystem zur Verwendung bei der Transformation von Trichoderma, ein Verfahren zur Expression auf hohem Niveau und Sekretion von Proteinen in Trichoderma, DNA-rekombinante Vektoren und transformierte Trichoderma-Stämme.

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Fadenpilze sind niedere Eukaryonten, die in der Biotechnologie in breitem Umfang verwendet werden, um verschiedene Fermentationsprodukte herzustellen. Pilze sekretieren viele industriell wichtige Enzyme, wie etwa Glucoamylase, Proteasen, Lactase, Pectinasen und Glucose- Oxidase.
Fadenpilze besitzen eine Anzahl biotechnischer Vorteile. Sie produzieren im allgemeinen hohe Mengen an Proteinen, die Kultivierung im Großmaßstab ist nicht kompliziert und die Trennung des Mycels von der Kulturflüssigkeit nach der Fermentation ist einfach.
Der mesophile imperfekte Pilz Trichoderma reesei (früher T. viride) (Lit. 1) produziert Enzyme, die bei der Umwandlung cellulosischer Biomasse benötigt werden, und ist wahrscheinlich der am weitestgehenden untersuchte aller cellulaseproduzierenden Organismen.
Zur Hydrolyse von Cellulose zu Glucose sind drei Arten von Enzymaktivität erforderlich: zufällig spaltende Endoglucanasen (1,4-β-D-glukanglucanohydrolase, EC 3.2.1.4), die üblicherweise substituierte lösliche Substrate angreifen und keine Aktivität gegenüber kristalliner Cellulose zeigen; Cellobiohydrolase (1,4-β-D-Glucancellobiohydrolase, EC 3.2.1.91), die in der Lage ist, kristalline Cellulose abzubauen, aber keine Aktivität gegenüber derivatisierter Cellulose besitzt, und β-Glucosidase (β-D-Glucosid Glucohydrolase, EC 3.2.1.21), die Cellobiose und Cello- Oligosaccharide angreift, um Glucose zu liefern. Synergistische Wirkung zwischen einigen dieser Enzyme ist nachgewiesen worden (Lit. 2-4).
Pilz-Cellulasen sind gereinigt und charakterisiert worden und es hat sich gezeigt, daß alle drei Haupttypen von Enzymen in mehrfachen Formen auftreten (Lit. 5). Zwei immunologisch besondere Cellobiohydrolasen, CBH I und CBH II, sind aus dem Kulturmedium von T. reesei nachgewiesen worden (Lit. 4, 6). Über fünf bis acht elektrophoretisch verschiedene Endoglukanasen ist berichtet worden, wobei viele von diesen variierende Substratspezifitäten zeigten (Lit. 7, 8, 9, 10). Über die Charakterisierung von zwei extracellulären β-Glucosidasen ist berichtet worden (Lit. 11).
Intensive Stammentwicklung unter Verwendung des direkten Ansatzes der Mutation und des Screening hat erfolgreich mehrere, hohe Ausbeuten liefernde T. reesei-Mutantenstämme geliefert (Lit. 12-22). Die Menge an extracellulärem Protein, das von den besten T. reesei-Mutanten produziert wird, ist so viel wie 20-30 g/Liter Kulturflüssigkeit, was mehr ist als 50% des gesamten Zellproteins. Ein Hauptteil des sekretierten Proteins umfaßt Cellulasen, unter denen die CBH I-Komponente am reichlichsten vorhanden ist, wobei sie bis zu 60% der sekretierten Cellulase-Proteine darstellt.
Das Gen für CBH I ist von Shoemaker et al. (Lit. 23) und Teeri et al. (Lit. 24) kloniert worden und die gesamte Nukleotidsequenz des Gens ist veröffentlicht worden (Lit. 23). Aus T. reesei ist auch das Gen für die wichtige Endoglucanase EG I kloniert und charakterisiert worden (Lit. 25, 26, 27). Andere isolierte Cellulase-Gene sind cbh2 (Lit. 28, 29) und egl3 (Lit. 30).
Die Molekularbiologie von industriell wichtigen Fadenpilzen ist im allgemeinen nicht gut bekannt. Dies beruht teilweise auf dem Fehlen des sexuellen Fortpflanzungszyklus und/oder genetischen Transformationssystems. Kürzlich sind Tranformationssysteme für Neurospora crassa (Lit. 31), A. nidulans (Lit. 32, 33, 34) und A. niger (Lit. 35) oder Trichoderma (Lit. 61) entwickelt worden, die im allgemeinen ihre Basis in der Komplementation des mutanten Wirts durch ein entsprechendes funktionales Gen haben, das von dem Vektormolekül getragen wird. Von diesen Pilzen ist jedoch nur A. niger im Augenblick von industrieller Bedeutung.
In der Klassifikation von Pilzen ist die Gattung Aspergillus eingeschlossen in der Klasse Ascomycetes, Unterklasse Euascomycetes. Euascomycetes sind unterteilt in drei Gruppen, Plectomycetes, Pyrenomycetes und Discomycetes, auf der Basis der Fruchtkörper. Die wichtigsten Gattungen sind Aspergillus und Penicillium (Lit. 49). Trichoderma wird stattdessen als ein Mitglied von Fungi imperfecti klassifiziert. Fungi imperfecti ist eine Sonderkategorie von Pilzen, die keine sexuelle Fortpflanzung oder offensichtliche Affinitäten mit sich sexuell fortpflanzenden Gattungen besitzen, wie etwa die hoch charakteristischen Aspergillus. Obgleich berichtet worden ist, daß Trichoderma ein schlecht definiertes sexuelles Stadium besitzt, das ein imperfektes Stadium der perfekten Ascomycetenspezies Hypocrea ist (Lit. 50), müssen die Gattungen Aspergillus und Trichoderma klar als taxonomische sehr unterschiedlich angesehen werden. Es ist auch gezeigt worden, daß, das argB- Gen aus Aspergillus nidulans und das pyr4-Gen aus Neurospora crassa unter nicht-stringenten Bedingungen nicht an die entsprechenden Trichoderma-Gene hybridisieren, was den Gedanken untermauert, daß Trichoderma evolutionär recht verschieden von anderen Ascomycetes ist (Vananen, S. in Vorbereitung).
Wegen seiner außergewöhnlichen Fähigkeit, Proteine in das Wachstumsmedium zu sekretieren, ist Trichoderma reesei ein guter Kandidat als ein möglicher Wirt für die Produktion von Proteinen. Genetische Studien von T. reesei sind jedoch bisher fast ausschließlich darauf gerichtet worden, die Cellulase produzierenden Eigenschaften des Pilzes zu verbessern, und die einzige Technik, die für die Entwicklung von hypercellulotischen Trichoderma-Stämmen verwendet worden ist, ist traditionelle Mutagenese und Screening gewesen. Keine Transformationssysteme, die stabile Transformanten in Trichoderma geben, sind bisher entwickelt worden.
Es ist die Hauptaufgabe der vorliegenden Erfindung, Trichoderma zur Verfügung zu stellen, die mit einem effektiven Wirtsvektorsystem stabil transformiert sind, um eine Expression auf hohem Niveau und Sekretion heterologer Proteine in Trichoderma zu erhalten oder um die Produktion von homologen Proteinen zu erhöhen.
In der vorliegenden Beschreibung mit Ansprüchen bedeutet der Ausdruck "zu Trichoderma heterologe Proteine" Proteine, die natürlicherweise nicht von Trichoderma produziert werden, wohingegen "zu Trichoderma homologe Proteine" Proteine bedeutet, die von Trichoderma selbst produziert werden.
In den Pilz-Transformationssystemen, die zuerst entwickelt worden sind, nämlich für Aspergillus und Neurospora, wird Transformation unter Verwendung von Protoplasten durchgeführt. Die transformierende DNA wird üblicherweise in das Wirtsgenom integriert. Um ein Selektionssystem zur Identifizierung stabiler Transformanten zur Verfügung zu stellen, muß das Vektorsystem ein funktionelles Gen (einen Selektionsmarker) tragen, der entweder eine entsprechende Mutation des Wirtsgenoms komplementiert oder eine Aktivität, üblicherweise ein Enzym, liefert, das für das Wachstum des prototrophen Stamms auf einem bestimmten Wachstumsmedium erforderlich ist.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung beschreibt Trichoderma-Stämme, die mit einem rekombinanten DNA-Klonierungsvektorsystem stabil transformiert sind. Wenn das DNA-Klonierungsvektorsystem eine DNA-Sequenz umfaßt, die ein gewünschtes Proteinprodukt kodiert, wird die Transformation von Trichoderma mit dem vorliegenden Vektorsystem eine Expression auf hohem Niveau und Sekretion des gewünschten Proteins bereitstellen, wenn der transformierte Mikroorganismus in einem geeigneten Kulturmedium gezüchtet wird.
Gemäß ihrem ersten Aspekt stellt die vorliegende Erfindung einen Trichoderma-Stamm zur Verfügung, der stabil transformiert ist mit einem Vektorsystem, welches umfaßt:
a) ein Gen, das ein gewünschtes Proteinprodukt kodiert,
b) Funktionen, die Genexpression erleichtern, einschließlich DNA-Sequenzen, die Promotoren/Verstärker umfassen, die operabel mit besagtem Gen verbunden sind, um Expression des gewünschten Produktes zu kontrollieren, und
c) einen Selektionsmarker, der in der Lage ist, stabile Trichoderma-Transformanten zu selektieren, wobei der Selektionsmarker nicht vom Neurospora crassa pyr-4-Gen abgeleitet ist.
Gemäß ihrem zweiten Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Transformation von Trichoderma zur Verfügung, bei dem ein geeigneter Trichoderma-Stamm mit dem vorliegenden Vektorsystem transformiert wird.
Gemäß ihrem dritten Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines Proteins in Trichoderma zur Verfügung, welches umfaßt, daß Trichoderma mit dem vorliegenden Vektorsystem transformiert, der transformierte Stamm in einem geeigneten Medium kultiviert und das exprimierte und sekretierte Produkt aus dem Medium gewonnen wird.
Die vorliegende Erfindung stellt auch ein Verfahren zur Herstellung eines Proteins in Trichoderma zur Verfügung, durch welches ein Trichoderma-Stamm der mit dem Vektorsystem transformiert ist, in einem geeigneten Kulturmedium kultiviert und das exprimierte und sekretierte Protein aus dem Kulturmedium gewonnen wird.
Wie hierin verwendet, umfaßt der Ausdruck "Vektorsystem" einen einzelnen Vektor oder ein einzelnes Plasmid oder zwei oder mehr Vektoren oder Plasmide, die zusammen die DNA- Information, die in das Wirtsgenom integriert werden soll, enthalten. Die Vektoren oder Plasmide können lineare oder geschlossene zirkulare Moleküle sein. Obgleich selbstreplizierende Plasmide in Trichoderma gegenwärtig nicht bekannt sind, deckt die Erfindung auch solche selbstreplizierenden Plasmide ab, wenn sie zu einem späteren Zeitpunkt gefunden werden sollten.
Das Vektorsystem umfaßt DNA-Sequenzen, die Funktionen kodieren, die Genexpression erleichtern, einschließlich Promotoren, Verstärkern und Transkriptionsinitiationsstellen sowie Terminatoren, einen Marker zur Selektion von Transformanten und eine DNA-Sequenz, die das gewünschte Protein kodiert.
Um Sekretion des exprimierten Produktes sicherzustellen, wird das Gen für das gewünschte Produkt vorzugsweise mit einer Vorregion bereitgestellt, die effektive Lenkung des exprimierten Produktes in den sekretorischen Weg der Zelle sicherstellt. Diese Vorregion, die ein natürlich auftretendes Signal- oder Leader-Peptid oder Teile desselben sein könnte, wird üblicherweise während der Sekretion vom gewünschten Produkt abgespalten, woraufhin das reife Produkt aus dem Kulturmedium isoliert werden kann.
Das Gen für das gewünschte Produkt kann aus Genomklonen oder cDNA-Klonen erhalten werden. DNA-Sequenzen können auch synthetisiert werden.
Die Signal/Leader-Sequenz kann abgeleitet werden von der Signal/Leader-Sequenz des Gens, das das gewünschte Protein kodiert, oder kann abgeleitet werden von Genen für andere sekretierte Proteine entweder aus Trichoderma oder aus jeder anderen Organismenquelle. Beispiele für Signal/Leader- Sequenzen, die abgeleitet sind von Genen, die ein von Trichoderma sekretiertes Protein kodieren, sind die cbh1- Signalsequenz oder die egl1-Signalsequenz oder Teile derselben. Signal/Leader-Sequenzen, die abgeleitet sind von Genen, die zu Trichoderma heterologe sekretierte Proteine kodieren, können abgeleitet werden von Genen für Aspergillus-Amylasen oder -Glucoamylase. Auch synthetische Signal/Leader-Sequenzen können verwendet werden.
Der Promotor kann jede DNA-Sequenz sein, die Transkriptionsaktivität in Trichoderma zeigt, und kann abgeleitet werden von Genen, die entweder homolog oder heterolog zu Trichoderma sind. Beispiele für Promotoren, die von Genen abgeleitet sind, die zu Trichoderma homologe Proteine kodieren, sind der cbh1-Promotor oder egl1-Promotor oder Teile derselben. Ein Beispiel für einen Promotor, der von einem Gen für ein zu Trichoderma heterologes Protein abgeleitet ist, ist der Aspergillus-Glucoamylase-Promotor. Transkriptionsterminatoren können von denselben Quellen wie die Promotoren abgeleitet werden. Auch synthetische Promotor- oder Terminator-Sequenzen können verwendet werden,
Es wird verstanden und ist für den Fachmann auf diesem Gebiet offensichtlich, daß spezifisch erwähnte DNA-Sequenzen durch Änderung oder Deletion von ein paar Basen modifiziert werden kann, die für die Funktion des kodierten Produktes nicht wesentlich sind. Zum Beispiel können DNA-Sequenzen, die im wesentlichen mit cbh1- oder egl1-Signal- oder -Promotor-Sequenzen übereinstimmen, solange verwendet werden, wie sie die beabsichtigte Funktion in Trichoderma zeigen. Auch die Gene für die gewünschten Proteine können solange verändert werden, wie dies keine schädliche Wirkung auf die Aktivität des Proteins hat.
Verschiedenen Selektionsmarker können verwendet werden, z.B. argB (A. nidulans oder T. reesei), amdS (A. nidulans), trp1 aus N. crassa oder trpC aus A. nidulans und pyr4 (Neurospora crassa oder T. reesei).
Der Wirtsstamm kann entweder ein prototropher oder ein auxotropher Trichoderma-Stamm sein, abhängig vom Selektionsmarker, der im Transformationsverfahren verwendet wird. Das amdS-Gen aus A. nidulans kann, wie im experimentellen Teil der Beschreibung nachgewiesen ist, für die Transformation von prototrophen T. reesei-Stämmen verwendet werden. T. reesei wächst schlecht auf Acetamid als der einzigen Stickstoffquelle und das Wachstum kann überdies gehemmt werden durch Zugabe von CsCl zum Medium. Das Wachstum auf Acetamid als der einzigen Stickstoffquelle in Gegenwart von CsCl kann demgemäß als ein Selektionsmedium verwendet werden, um AmdS&spplus;-Transformanten zu identifizieren.
Wenn ein Selektionsmarker verwendet wird, der eine entsprechende Mutation des Wirtsgenoms komplementiert, müssen auxotrophe Trichoderma-Mutanten konstruiert werden. Auxotrophe Trichoderma-Mutanten können mit bekannten Verfahren zur Herstellung von mutanten Stämmen hergestellt werden.
Auxotrophe Trichoderma-Mutanten, die Uracil, Tryptophan oder Arginin zum Wachstum benötigen, wurden durch eine Filtrationsanreicherungstechnik isoliert, wie beschrieben von Nevalainen (Lit. 36). Aus Arginin benötigenden Auxotrophen wurden Mutanten, denen das argB-Gen fehlt, durch Verwendung einer Reihe von "minimal plates", geliefert von verschiedenen Zwischenprodukten in der Arginin-Biosynthese, identifiziert. Aus Uracil benötigenden Mutanten können Stämme, denen das pyr4-Gen fehlt, durch Messen der Orotidin- 5'-phosphat-Decarboxylase (OMP-Decase)-Aktivität in Mycel- Präparaten gesucht werden (Lit. 37).
Mutanten mit einem trp1-Genmangel können durch das Fehlen der PRA-Isomerase-InGP-Synthetase-Aktivität in ihren Mycelen charakterisiert werden (Lit. 39). Der trp1-Charakter der Mutanten, die keine Enzymaktivität zeigen, kann bestätigt werden durch z.B. Transformation und Komplementation mit dem N. crassa trp1-Plasmid (Lit. 40) oder dem trpC-Plasmid von A. nidulans (Lit. 34).
Die verwendete Transformationstechnik ist die Methode, die ausgeht von den Methoden zur Transformation von A. nidulans (Lit. 32, 33) adaptiert ist. Protoplasten werden mit bekannten Methoden hergestellt, indem Mycel auf Agarplatten gezüchtet und Mycel in einer gepufferten Lösung von Novozym 234 suspendiert wird. Anstelle der herkömmlichen Saccharoselösung von Novozym 234 kann vorteilhafterweise eine Sorbit-Lösung verwendet werden. Transformierende DNA wird dann zur Protoplast-Lösung zugegeben, wie im weiteren Detail im experimentellen Teil der Beschreibung beschrieben. Die Transformation wird üblicherweise als eine Co- Transformation durchgeführt, mit der ein nicht- selektierbares Plasmid mit hoher Häufigkeit unter Verwendung eines in ein anderes Plasmid inserierten selektierbaren Markers (z.B. amdS in p3SR2 oder argB in pSa143) in T. reesei co-transformiert wird. Ein großer Teil der Transformanten enthält das nicht-selektierbare Plasmid in das Genom integriert, wenn äquimolare Mengen DNA zur Transformation verwendet werden. Wenn ein argB&supmin; T. reesei- Stamm bei der Transformation mit äquimolaren Mengen der Plasmide p3SR2 und pSA143 verwendet wird, können Transformanten auf Doppelselektionsmedium (Minimalmedium, Acetamid, CsCl) erhalten werden. Alternativ kann ein einzelnes Plasmid zur Tranformation verwendet werden, in dem auch der selektierbare Marker inseriert ist.
Tranformanten werden dann in einem geeigneten Medium kultiviert. Um in der Lage zu sein, das gewünschte Produkt in einem einfachen definierten Medium zu produzieren, kann ein glucoseinduzierbarer Promotor verwendet werden. Wenn Trichoderma auf einem Medium gezüchtet wird, das 1% Glucose enthält, wird Sekretion aller extracellulären Proteine, einschließlich Proteasen, stark unterdrückt. Wenn das Gen, das für das gewünschte Enzym kodiert, mit einem Promotor verbunden ist, der in glucosehaltigem Medium stark exprimiert wird, wird das gewünschte Enzym in das Wachstumsmedium sekretiert. Da andere Proteine unter diesen Bedingungen nicht produziert werden, ist das gewünschte Enzym das in das Medium sekretierte Hauptprotein.
Wenn das Pilzmycel entfernt ist, liegt das gewünschte Protein in der resultierenden Lösung in einer sehr reinen Form vor. Falls erforderlich, kann es sehr leicht weiter gereinigt werden, daß es fast das einzige vorhandene Protein ist.
Die vorliegende Erfindung kann auch verwendet werden, um ein Gen, das eine bestimmte Enzymaktivität des Wirtsorganismus produziert, zu modifizieren oder zu inaktivieren. Als ein Beispiel können Cellulase-negative T. reesei-Stämme konstruiert werden. Diese Mutagenese beruht auf der Transformation von Trichoderma reesei mit einem Plasmid, das ein fehlerhaftes Cellulase-Gen trägt. Homologe Rekombination des Plasmids am chromosomalen Cellulase-Locus bewirkt insertionale Inaktivierung des endogenen T. reesei- Cellulase-Gens. Das für die Transformation verwendete Plasmid enthält nur einen Teil der Cellulase kodierenden Region und produziert inaktives Protein. Keine 5'- flankierenden Sequenzen sind eingeschlossen. Eine Leserastermutation kann ebenfalls in die gestutzte Kodierungsregion eingeführt werden. Ein Selektionsmarker (argB) oder ein Marker zum Screening (lacZ) kann an das zur Transformation verwendete Plasmid gekoppelt werden. Nach Rekombination wird der Marker zwischen den zwei resultierenden fehlerhaften Cellulase-Genen plaziert sein. Das Prinzip der Methode ist in Fig. 1 dargestellt.
Die vorliegende Erfindung wird mit Hilfe der Produktion von Chymosin und Trichoderma reesei-Endoglucanase I (EGI) veranschaulicht. Promotor-, Signal- und Leader- und Terminator-Sequenzen wurden abgeleitet von entweder dem Glucoamylase-Gen aus Aspergillus niger oder dem Trichoderma reesei cbh1-Gen. Als Selektionsmarker wurde das amdS-Gen aus A. nidulans verwendet, ebenso wie das argB-Gen aus A. nidulans.

Materialien

Plasmide:

p285: ATCC No. 20681
pCAMG91: Lit. 59
pIC19R: Lit. 60
pSa143: Lit. 51 + 54
p3SR2: Lit. 33 + 35
pDJB2: Lit. 38
pMC1817: Lit. 46
pTT01, pTT11: Lit. 28
pUC9, pUC13: Lit. 61
pUC18, pUC19: Lit. 58
pTZ19R: (Pharmacia)
pAN5-41B: Lit. 62
E. coli-Stämme JM101, JM103, JM109 und DH1 (Lit. 51) werden als Wirte bei der E. coli-Klonierung verwendet. Trichoderma reesei-Stämme QM9414 (ATCC 26921) und RUT-C-30 (ATCC 56765) werden bei der Pilztransformation und den Expressionsstudien verwendet.

Trichoderma-Minimalmedium:

Glucose 20 g
(NH&sub4;)&sub2;SO&sub4; 5 g
KH&sub2;PO&sub4; 15 g
MgSO&sub4; 0,6 g
CaC1 0,6 g
FeSO&sub4;, 7H&sub2;O 5 mg
MnSO&sub4;, H&sub2;O 1,56 mg
ZnSO&sub4;, 7H&sub2;O 1,4 mg
CoCl&sub2; 2 mg/ 1 H&sub2;O

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Die Figuren der Konstruktionen sind nicht maßstabsgerecht.
Fig. 1 zeigt das Prinzip der Inaktivierung eines chromosomalen Cellulase-Gens.
Fig. 2 zeigt die Konstruktion der Plasmide pMS4, die zur Insertionsmutagenese des chromosomalen T. reesei cbh1-Locus verwendet wurden. Die Position einer Leserastermutation, die durch Inaktivierung der EcoRI-Stelle erzeugt wurde, ist mit * markiert.
Fig. 3 zeigt die Konstruktion von Plasmid p285' proC.
Fig. 4 zeigt die Konstruktion der Plasmide pMT648 und 15 pMT813.
Fig. 5 zeigt die Konstruktion von Plasmid pMT837.
Fig. 6 zeigt die Restriktionskarte von Plasmid pR27.
Fig. 7 zeigt die Restriktionskarte von Plasmid pAMH100.
Fig. 8 zeigt die Konstruktion von Plasmid pAMH105.
Fig. 9 zeigt die Konstruktion der Plasmide pAMH1103, pAMH1106 und pAMH1101 durch Loop-Mutagenese unter Verwendung synthetisierter Oligonukleotide OAMH1, OAMH2 und OAMH3.
Fig. 10 zeigt die Linker NOR 202, NOR 203, OAMH1, OAMH2 und OAMH3.
Fig. 11 zeigt die Restriktionskarten der Plasmide pAMH102 und pAMH104.
Fig. 12 zeigt die Restriktionskarte von Plasmid pAMH1103 und die Konstruktion von pAMH103.
Fig. 13 zeigt die Restriktionskarte von Plasmid pAMH1106 und die Konstruktion von pAMH106.
Fig. 14 zeigt die Restriktionskarte von Plasmid pAMH1101 und die Konstruktion von pAMH101.
Fig. 15 zeigt die Konstruktion von Plasmid pAMH110.
Fig. 16 zeigt die Konstruktion von Plasmid pAMH111, verwendet zur Expression von EGI unter cbh1- Promotorfunktion.
Fig. 17 zeigt die Expression von Chymosin in T. reesei, Western Blot. Spur 1; gereinigte Prochymosin- Kontrollsubstanz, schließt Spuren von Pseudochymosin und Chymosin ein. Spur 2; Kulturüberstand aus Wachstum von Stamm, der pAMH102 einschließt. Spur 3; Kontrollüberstand aus Stamm ohne Plasmide. Spur 4; Mycele aus Stamm, der pAMH102 einschließt.

EXPERIMENTELLER TEIL

Beispiel 1

Induktion, Anreicherung und Isolierung von auxotrophen T. reesei-Mutantenstämmen.

Auxotrophe Mutanten, die zum Wachstum Uracil, Tryptophan oder Arginin benötigen, wurden unter Verwendung von Filtrationsanreicherung isoliert, wie beschrieben von Nevalainen (Lit. 36). Das verwendete mutagene Mittel war UV- Licht. Aus Arginin benötigenden Auxotrophen wurden Mutanten, denen das argB-Gen fehlte, unter Verwendung einer Reihe von "minimal plates", geliefert von verschiedenen Zwischenprodukten in der Arginin-Biosynthese, identifiziert (Lit. 36). Mutanten, die zum Wachstum Citrullin benötigen, wurden als mögliche argB&supmin;-Mutanten angesehen. Der argB&supmin;- Charakter isolierter Mutanten wurde bestätigt, indem sie durch Verwendung des Plasmids pSa143, das das A. nidulans argB-Gen enthielt, zu Prototrophie transformiert wurden (Beispiel 4).
Aus Uracil benötigenden Mutanten wurden Stämme, denen das pyr4-Gen fehlte, herausgesucht. Der pyr4&supmin;-Charakter dieser Mutanten wurde bestätigt durch Transformation mit einem Plasmid, welches das N. crassa pyr4-Gen (Lit. 38) enthielt (Beispiel 4).

Beispiel 2

Herstellung von Protoplasten

Mycel wurde auf Cellophanscheiben auf Kartoffeldextrose- Agar-Platten (Difco) gezüchtet. Mycel aus 5 Cellophan- Kulturen wurde in 15 ml einer 5 mg/ml-Lösung von Novozym 234 in 1,2 M Sorbit, gepuffert bei pH 5,6 mit 0,1 M Kaliumphosphat, suspendiert. Die Mischung wurde 1,5-2 h bei 30ºC inkubiert. Protoplasten wurde von Myceltrümmern durch Filtration durch gesintertes Glas (Porosität 1) getrennt, für 5 min. bei 4.000 g pelletiert und zweimal mit 1,2 M Sorbit - 10mM Tris, HCl, pH 7,5 gewaschen.
Bessere Reinigung von Protoplasten kann erreicht werden durch Verwendung eines Verfahrens, das von Tilburn et al. beschrieben (Lit. 33). 5 mg/ml Lösung von Novozym 234 in 1,2 M MgSO&sub4;, gepuffert bei pH 5,8, wurde für die Protoplastenbildung verwendet. Nach Inkubation und Filtration wurde die Protoplastensuspension bei 4.000 g für 15 min. mit einer Deckschicht eines gleichen Volumens aus 0,6 M Sorbit - 100 mM Tris, HCl, pH 7,0, zentrifugiert. Protoplasten bildeten ein scharfes Band in halber Höhe des Röhrchens. Die Protoplasten wurden in 1 vol. 1,2 M Sorbit - 10 mM Tris, HCl, pH 7,5, suspendiert, heruntergeschleudert und zweimal in 1,2 M Sorbit - 10 mM Tris, HCl, pH 7,5, gewaschen. Die Protoplasten wurden in 1,2 M Sorbit - 10 mM CaCl&sub2; - 10 mM Tris, HCl, pH 7,5, bei einer Konzentration von 5 x 10&sup6; - 5 x 10&sup7; Protoplasten/ml suspendiert.
Die Lebensfähigkeit der Protoplasten wurde auf Trichoderma- Minimalmedium mit 1 M Sorbit als osmotischem Stabilisator beurteilt. Die Protoplasten wurden in 3% Agar-Deckschicht plattiert. Die Regenerationshäufigkeit betrug 40-80% für den Stamm QM 9414 (ATCC 26921).

Beispiel 3

Transformation von T. reesei unter Verwendung des A. nidulans Acetamidase(amdS)-Gens.

Plasmid p3SR2 wurde bei der Tranformation verwendet. Es enthielt A. nidulans-DNA, die das gesamte Acetamidase- Strukturgen amdS und seine regulatorische Region amdI trug (Lit. 41 und 33).
20 ul (4 - 10 ug) transformierende DNA wurden zu 200 ul Protoplastenlösung zugegeben. 50 ul 25% PEG 6.000 - 50 mM CaCl&sub2; - 10 mM Tris, HCl, pH 7,5, wurden zugegeben und die Mischung wurde für 20 min. auf Eis inkubiert. 2 ml der PEG- Lösung wurden zugegeben und die Mischung wurde 5 min. bei Raumtemperatur weiter inkubiert. 4 ml 1,2 M Sorbit - 10 mM CaCl&sub2; - 10 mM Tris, HCl, pH 7,5, wurden zugegeben und die Protoplasten wurden in 3% Agar-Deckschicht plattiert. Das selektive Medium war Trichoderma-Minimalmedium mit 10 mM Acetamid als der einzigen Stickstoffquelle anstelle von (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4;, und ergänzt mit 1 M Sorbit als osmotischem Stabilisator und 12,5 mM CsCl, um das Hintergrundwachstum zu unterdrücken.
Transformationshäufigkeiten von 40 bis 600 Transformanten pro ug DNA wurden für den Stamm QM 9414 (ATCC 26921) erhalten. Die höchsten Häufigkeiten wurden erhalten, wenn die DNA mit zwei Zyklen CsCl/Ethidiumbromid-Zentrifugation gereinigt wurde.
Sporulation wurde auf dem selektiven Medium selten beobachtet, aber die Tranformanten sporulierten normal, wenn sie auf Kartoffeldextrose-Agar überführt wurden. Ihre Fähigkeit, auf Acetamid zu wachsen, schwankte. Der Durchmesser der Kolonien auf dem selektiven Medium lag im Bereich 1 mm bis 10 - 20 mm.
Die Mitosestabilität der Transformanten wurde untersucht. Zehn große Transformanten variierender Größe wurden subkultiviert auf Acetamid-CsCl-Platten, sporuliert auf Kartoffeldextrose (PD) und replattiert auf PD. Um durch Heterokaryose hervorgerufene Heterogenität auszuschließen, wurden einzelne Kolonien, die aus einer Spore stammten, auf AmdS&spplus;-Phänotyp getestet. Ein positiver Klon von jedem ursprünglichen Transformanten wurde sukzessiven Plattierungen (5 Wachstumszyklen) auf nicht-selektivem Medium unterzogen und der Phänotyp wurde nach jeder Generation auf dem selektiven Medium getestet. Von 10 getesteten großen Transformanten gaben nach einem Zyklus auf nicht-selektivem Medium sechs der zehn Transformanten 100% AmdS&spplus;-Konidien, drei 47-87% und ein Transformant gab keine AmdS&spplus;-Konidien. Dieses Ergebnis blieb dasselbe über fünf nicht-selektive Wachstumszyklen, was nahelegt, daß der anfänglich instabile AmdS&spplus;-Phänotyp später stabilisiert werden kann.
Von zehn ursprünglichen kleinen Kolonien gaben drei Sporen mit variablen Häufigkeiten von AmdS&spplus;-Phänotyp (94%, 44% und 5% der Sporen). Die anderen sieben Klone gaben nur Sporen, die nicht in der Lage waren, auf Acetamid zu wachsen. Interessanterweise zeigten alle erhaltenen AmdS&spplus;-Sporen heftiges Wachstum auf Acetamid-Platten, was für Transformanten aus großen Kolonien charakteristisch ist.
Das Vorhandensein der Plasmid-DNA in den Transformanten wurde durch Southern-Blots auf der gesamten DNA analysiert, isoliert aus Transformanten (gemäß Raeder und Broda, Lit. 43), geschnitten mit Xho I oder Sal I und Eco RI geschnitten. Der Vektor pUC 18 und das Sal I - Eco RI- Fragment, welches das amdS-Gen von Plasmid p3SR2 enthielt, wurden als Sonden verwendet. Es wurde gezeigt, daß die Transformation durch Rekombination an einer Anzahl unterschiedlicher Stellen in der Trichoderma-Genom-DNA aufgetreten war, eine bis mehrere Kopien pro Genom.

Beispiel 4

Transformation von T. reesei mit A. nidulans-Plasmiden.

Komplementierung von auxotrophen Mutationen in T. reesei durch heterologe DNA wurde nachgewiesen. Das Plasmid pSa143 welches das argB-Gen aus A. nidulans enthielt, wurde verwendet, um T. reesei argB&supmin;-Mutantenstämme zu transformieren. Die Transformanten wurde auf Minimalmedium ohne Arginin bzw. 30 ug/ml Uracil selektiert. Die Transformationshäufigkeit betrug etwa 300 (150-400) Transformanten/uG DNA.
Chromosomale DNA wurde aus den Transformanten isoliert und für Southern-Hybridisierungsexperimente verwendet, um die richtige Integration von Plasmid-DNA in die chromosomale DNA von T. reesei zu verifizieren. Mehrfach-Tandemkopien von pSa143 wurden in dem Genom integriert. Southern- und Dot- Blot-Hybridisierungen zeigten, daß in analysierten Transformanten die Kopienzahl von argB von ungefähr 2 bis über 100 schwankte. Es wurde gezeigt, daß die argB&spplus;- Transformanten phänotypisch 100% stabil über wenigstens 3 Generationen waren. Dies wurde durch sukzessive Plattierung von Konidien aus fünf Transformanten auf Komplettmedium und anschließendes Testen des Arg&spplus;-Phänotyps auf Minimalmedium getestet (50-80 Kolonien/Transformant).

Beispiel 5

Co-Transformation von T. reesei mit amdS und argB-Plasmiden.

Die Möglichkeit, Trichoderma mit einem nicht-selektierbaren Plasmid zu co-transformieren, wurde zunächst mit dem Arginin-auxotrophen Mutanten gezeigt.
Der argB&supmin; T. reesei-Stamm wurde mit gleichen molaren Mengen der A. nidulans-Plasmide pSa143 (argB) und p3SR2 (amdS) transformiert, Transformanten wurde auf Arg&spplus;-Phänotyp selektiert und auf Erwerb von amdS durch Aufstreichen auf Acetamid-CsCl-Platten getestet. Von den ArgB-Transformanten waren 86% auch AmdS&spplus;. Southern-Analyse von Co-Transformanten zeigte, daß beide Plasmide als variable Mengen an Kopien in mehreren unterschiedlichen Stellen im Genom integriert waren (Daten nicht dargestellt).
Doppelselektion auf Minimal-Acetamid-CsCl-Medium führte zu 100 großen Amd&spplus;Arg&spplus;Transformanten pro ug DNA und einer Anzahl kleiner Kolonien, charakteristisch für amdS- Transformation.
Als die Stabilität des ArgB&spplus;-Phänotyps der argB amdS-Co- Transformanten getestet wurde, erwiesen sich drei von fünf 100% stabil, wohingegen die anderen den ArgB&spplus;-Charakter in 7% oder 80% der analysierten Nachkommen verloren hatten. Dieselben einzelnen Kolonien hatten auch den AmdS&spplus;-Phänotyp verloren. Ob diese Instabilität durch z.B. die Co- Integration von argB mit dem amdS in dieselbe chromosomale Stelle hervorgerufen wurde, ist nicht bekannt.
Das Plasmid pAN5-4IB, das das E. coli lacZ-Gen enthält, gekoppelt in Phase an den Promotor und die N-terminale Proteinkodierungs- region des A. nidulans Glyceraldehydphosphat-Dihydrogenase-Gens (gpd) (Lit. 55) wurde ebenfalls für Co-Transformation verwendet. Zusätzlich enthält dieses Plasmid das A. nidulans argB-Gen und pBR322- Sequenzen. Prototropher T. reesei (QM 9114) wurde mit dem Plasmid p3SR2 (amdS) und pAN5-4IB co-transformiert, Transformanten wurde auf Amd&spplus;-Phänotyp selektiert und auf β- gal-Expression auf Acetamid-CsCl-Platten, die Xgal enthielten, gescreent. Keine endogene T. reesei β- Galactosidase-Aktivität konnte nachgewiesen werden, wenn Glucose im Medium vorhanden war und der pH der Xgal-Platte neutral war.
Nach 1-4 Tagen Wachstum war blaue Farbe sichtbar. Wenn ein 1,0/0,7-Molverhältnis der Plasmide (p3SR2/pAN5-4IB) bei der Transformation verwendet wurde, zeigten 13% der großen und 6% der kleinen Amd&spplus;-Klone β-Galactosidase-Aktivität, mit Molverhältnis von 1,0/2,6 wurden 39% bzw. 7% Xgal&spplus;-Klone erhalten. Das Vorhandensein beider Plasmide in Amd&spplus;- Transformanten, die blaue Farbe zeigten, wurde durch Southern Hybridisierung verifiziert (Daten nicht dargestellt).

Beispiel 6

Konstruktion eines cbh1&supmin;-Trichoderma reesei-Stammes. Die Inaktivierung verschiedener Cellulase-Gene in der beschriebenen Art und Weise erlaubt die Konstruktion einer Reihe von T. reesei-Stämmen, die eine bestimmte Kombination von Cellulasen produzieren. cbh&supmin;1-Stämme sind auch wichtig für die effiziente Produktion von heterologen Proteinen, wenn der cbh1-Promotor verwendet wird. Es wurde gezeigt, daß Trichoderma reesei-Stamm QM 9414 (ATCC 26921) nur eine chromosomale Kopie des cbh1-Gens enthielt, durch Southern- Hybridisierung unter Verwendung cbh1-spezifischer Sonden, und so sollte ein Rekombinationsereignis das Gen inaktivieren. Ein inaktives Gen wurde wie folgt konstruiert. Das Plasmid pTT01 (Lit. 28), das den cDNA-Klon des cbh1-Gens im Vektor pUC8 in voller Länge enthielt, wurde mit den Restriktionsenzymen Bgl I und Bgl II geschnitten. Das 0,8 kb Fragment aus der 5'-terminalen Region des cbh1-Gens wurde mit herkömmlichen Techniken aus Agarosegel isoliert. Das Fragment wurde stumpfendig gemacht unter Verwendung von S1- Nuclease und es wurde an einen mit Eco RI geschnittenen, stumpfendig gemachten pUC 18-Vektor ligiert und in E. coli JM 109 transformiert. DNA aus dem Klon, die das cbh1- Genfragment enthält, wurde isoliert und mit Restriktionsenzym Eco RI verdaut, das in der Mitte des Bgl I - Bgl II-Fragments von cbh1 schneidet. Die durch Eco RI erzeugten Termini wurden eingefüllt und zurückligiert. Ein Plasmid pMS4, das eine Leserastermutation in der Mitte des gestutzten cbh1-Genfragments enthielt, wurde erzeugt (Fig. 2).
Trichoderma wurde mit dem Plasmid pMS4 und dem A. nidulans amdS enthaltenden Plasmid p3SR2 mit 3-4 fachem molaren Überschuß von Plasmid pMS4 co-transformiert.
Transformanten wurden auf der Basis des amdS&spplus;-Phänotyps, wie beschrieben (Beispiel 3) selektiert und auf selektivem Medium gereinigt das Acetamid als einzige Kohlenstoffquelle enthielt. Gereinigte Transformanten wurden auf Mikrotiterplatten in 200 ul Trichoderma-Minimalmedium mit 1% Solka-Flockencellulose als Kohlenstoffquelle und 0,2% Proteosepepton als Stickstoffquelle gezüchtet. Der Cellulase-Phänotyp wurde mit der Ouchterlony-Immundiffusion unter Verwendung nicht-verdünnter Wachstumsmedien gegen das CBHI-spezifische Antiserum (Schaf) getestet, wie beschrieben (Lit. 56). Eine Anzahl Transformanten wurde identifiziert, die normale Menge CBH II, aber kein nachweisbares CBH I produzierten.

Beispiel 7

I. Herstellung von Plasmid 285'proC, welches das Prochymosin-Gen enthält (Fig. 3).

Als ein Beispiel eines heterologen Proteins in T. reesei wählten wir die Expression der Prochymosin-cDNA (Fig. 3). Das Präprochymosin-Gen wurde aus einer Kalbsmagen-cDNA- Bibliothek isoliert und die Pst I-Stelle von pBR322 durch G-C-Tailing inseriert (Lit. 46 und 47), um pR26 zu erhalten. pUC 9 wurde mit SalI geschnitten und ausgefüllt mit Klenow- Polymerase und ligiert mit T4-Ligase. Das erhaltene Plasmid wurde mit BamHI-EcoRI geschnitten und das 2,7 kb große Fragment wurde mit einem 0,47 kb BamHI-EcoRI-Fragment aus pR26 ligiert, um pUC9' zu schaffen, das eine HindIII-Stelle N-terminal vom Prochymosin-Gen enthält. pUC13 wurde mit BamHI-NarI und NarI-XmaI geschnitten und das große bzw. kleine Fragment wurde ligiert mit einem 0,64 kb XmaI-BclI- Fragment aus pR26, um Plamid pUC13' zu erhalten, das eine XbaI-Stelle C-terminal vom Prochymosin-Gen enthält. Ein 0,65 kb XmaI-XbaI-Fragment von pUC13' wurde mit einem 0,46 kb HindIII-XmaI-Fragment von pUC9' und einem 11 kb XbaI- HindIII-Fragment von p285 ligiert, um Plasmid p285' pro C zu schaffen, das das Prochymosin-Gen enthält, wie in Fig. 3 veranschaulicht.

II. Konstruktion von Plasmid pAMG/Term.

pCAMG91 wurde mit SalI- und PstI-Restriktionsendonukleasen verdaut. Aus solchen Verdauungsprodukten wurde ein 698 bp- Fragment auf einem Agarosegel isoliert. Dieses SalI-PstI- Fragment enthält die Region, die den 140 bp 3' nicht- translierten Teil der Glucoamylase-mRNA plus 540 bp 3' zur Poly(A)-Additionsstelle kodiert. Dieses 3'-Fragment wurde mit T4-DNA-Polymerase behandelt, um die Restriktionsstellen vor der Addition von XbaI-Linkern und der Verdauung mit XbaI-Restriktionsenzym "stumpfendig" zu machen. Dieses 3'- Ende des Glucoamylase-Gens wurde an pUC13 ligiert, linearisiert mit XbaI, um Plasmid mAMG/Term zu schaffen, daß die Glucoamylase-Gen-Poly(A)-Additionsregion enthält.

III. Konstruktion von Plasmid pMT837

Ein 0,5 kb SmaII-BssHII-Fragment von pCAMG91, das den Promotor und die Sequenzen, die für das Glucoamylase (AMG)Signal- und -Leader-Peptid kodieren, wurde an mit SmaI-BamHI verdauten pUC13 und einen synthetischen BssHII-BamHI- Adaptor, der die ersten 6 Aminosäuren von Prochymosin kodiert, ligiert. Aus dem resultierenden Plasmid, pMT626, wurde ein 0,8 kb NdeI-BamHI-Fragment isoliert und an ein 0,5 kb BamHI-EcoRI-Fragment aus p285'proC, das die Sequenz für die N-terminale Hälfte von proC enthält, und an ein 3,0 kb EcoRI-NdeI-Fragment von pMT622, das den C-terminalen Teil der Sequenz für proC enthält, ligiert. (pMT622 ist einfach ein EcoRI-XbaI-Subklon von p285' proC in pUC13). Das resultierende Plasmid pMT648 (siehe Fig. 4) enthält das gesamte Prochymosin-Gen, dem AMG-Promotor- und -Signal/Leader-kodierende Sequenzen vorangehen. pMT648 wurde so weiter modifiziert, daß er das argB-Gen von A. nidulans enthielt (Lit. 48). 1,8 kb NarI-eingefülltes XbaI-Fragment von pMT648 wurde an ein 6,8 kb ClaI-eingefülltes EcoRI- Fragment von pSal43 ligiert, um pMT651 zu ergeben. Sequenzen weiter stromaufwärts vom AMG-Promotor (stromaufwärtige aktivierende Sequenzen; UASs) wurden außerdem inseriert. Dies wurde erreicht durch Ligieren eines 3,7 kb ClaI-BssHII- Fragments aus dem ursprünglichen Klon pCAMG91 an das 1,1 kb BssHII-eingefüllte XbaI-Fragment von pMT648, das die proC- Sequenzen enthält und das argB-Gen als ein 3,1 kb ClaI- eingefülltes EcoRI-Fragment aus pMT813 (pMT813 ist das argB- Gen, kloniert als ein 3,1 kb BamHI-NruI-Fragment, kloniert in mit EcoRV-BglII geschnittenen p1C19R). Das resultierende Plasmid, pMT830, hat eine Expressionseinheit erhalten, die die UASs, Promotor-, Signal- und Leader-Sequenzen aus AMG und das gesamte Gen für proC enthält. Schließlich wird die Terminator-Sequenz von AMG als ein 0,6 kb xbaI-XbaI-Fragment aus Plasmid pAMG/Term genommen und in den XbaI-Schnitt und dephosphorylierten pMT830 inseriert, um pMT837 zu ergeben. Die Konstruktion von pMT837 ist in Fig. 5 veranschaulicht.

Beispiel 8

Herstellung von Chymosin unter Verwendung pMT837.

T. reesei-Stämiue QM 9414 und RUT-C-30 wurden mit Plasmiden pMT837 und p3SR2 co-transformiert. Plasmid pMT837 enthält das Prochymosin-Gen, dem die AMG-Promotor- und -Signal/Leader-Sequenz vorangeht. Die Konstruktion von Plasmid pMT837 wurde in Beispiel 7 beschrieben (siehe auch Figs. 3-5). Co-Transformation und Selektion wurden durchgeführt wie in Beispiel 5.
Für die Chymosinproduktion wurden Transformanten auf Minimalmedium, das 1% Solka Flockencellulose und 0,2% Proteosepepton enthielt, kultiviert.
Die Mycele wurden gesammelt und der Überstand wurde. Falls erforderlich, durch TCA-Ausfällung konzentriert und in 2 M NaOH 10 mM Tris (pH 8,5) verdünnt. Die Proben wurden auf SDS-PAGE (7,5% - 15% Polyacrylamid-Gradient) fraktioniert und auf einem Nitrocellulosefilter elektrogeblottet. Die Filter wurden mit Kaninchen-Prochymosin-Antiserum inkubiert und mit 4-Chlor-1-naphtol unter Verwendung von a-Kaninchen- IgG-Peroxidase-Konjugat, bezogen von Sigma, angefärbt.
Es wurde gezeigt, daß Chymosin in das Medium ungefähr bei dem Niveau von 1 ug/l sekretiert wurde. Da der AMG-Promotor in T. reesei klar ineffizient funktioniert, wurden homologe T. reesei-Promotor-Terminator-Vektoren konstruiert, um das Produktionsniveau von Chymosin zu verbessern.

Beispiel 9

Die Konstruktion von heterologen Expressionsvektoren zur Herstellung von Kalbs-Prochymosin in T. reesei unter Verwendung von cbh1-Promotor.

I. Das Verknüpfen des Prochymosin-Gens mit der cbh1- Terminatorregion.

Das Kalbs-Prochymosin-Gen wurde erhalten aus pR27 (Fig. 6). Das PstI-PstI-Fragment ( 1.110 bp), das fast das gesamte Gen enthielt, wurde mit herkömmlichen Techniken aus Agarosegel isoliert und an die PstI-Stelle von pUC19 ligiert
Dieses Plasmid wurde teilweise mit PstI verdaut, die Enden wurden mit S1-Nuclease stumpfendig gemacht und ein AvaII- Terminatorfragment ( 750 bp) des cbh1-Fragments (stumpfe Enden mit Klenow-Fragment) wurde in dieses Plasmid ligiert. Die Terminatorregion des cbh1-Gens wurde aus dem terminalen 1,8 kb BamHI-Fragment von cbh1-cDNA, subkloniert in pBR322, erhalten (Lit. 24).
Dieses Plasmid, das das 'pro C-Fragment enthielt, gekoppelt mit der Terminatorregion des cbh1-Gens in pUC19, wurde pAMH 100 genannt (Fig. 7).

II. Die Fusion der cbh1-Promotorregion und der Prochymosin- Kodierungsregion durch Verwendung von BglI-SacII-Adaptor.

Das SacII-PstI-Fragment (80 bp), das für die N-terminale Region von Prochymosin kodiert, wurde aus Plasmid pR27 isoliert (siehe Fig. 6). Die cbh1-Promotorregion wurde zuerst aus dem Genomklon λ 44A als ein 2,8 kb langes EcoRI- EcoRI-Fragment in pUC18 subkloniert (Plasmid pUA01, Fig. 8) und dann wurde ein 2,2 kb langes EcoRI-BglI-Fragment aus diesem Subklon isoliert. Die BglI-Stelle ist in der Mitte der Signalsequenz des cbh1-Gens angeordnet. Die genaue Verknüpfung des 2,2 kb langen EcoRI-BglI-Fragments, das den Promotor und etwa die Hälfte der Signalpeptid- Kodierungsregion des cbh1-Gens enthält, an das 80 bp SacII-PstI-Prochymosinfragment wird mediatisiert durch den BglI-SacII-Adaptor (NOR 202 + NOR 203, Fig. 10). Diese Fragmente zusammen mit dem Adaptor wurden in pUC19 ligiert, das mit EcoRI-PstI verdaut worden war. Dieses Plasmid kodiert für eine vollständige Signalsequenz von CBH I, fusioniert an die erste Aminosäure von Prochymosin, gefolgt von einigen seiner N-terminalen Sequenzen. Schließlich wurde aus dieser Konstruktion das EcoRI-pcbh1-ss-proC-PstI- Fragment isoliert, von seinem 3'-Ende in pAMH100, verdaut mit Sal I und Pst I, ligiert. Das 5'-Ende des Fragments und das 3'-Ende von Plasmid pAMH100 wurde eingefüllt mit Klenow und ligiert. Sowohl der Promotor des cbh1-Gens und das proC'-Fragment wurde vor 'proC, gefolgt vom cbh1- Terminatorbereich transferiert. Die Konstruktion wurde pAMH102 genannt (Fig. 11).

III. Die Addition eines selektierbaren Markers zum Chymosin- Expressionsplasmid.

Als ein selektierbarer Marker in den Expressionsplasmiden kann entweder das amdS-Gen von A. nidulans (Lit. 33, 41) oder das argB-Gen von A. nidulans verwendet werden (Lit. 45).
Das amdS-Gen wurde als ein PvuI-SalI-Fragment aus p3SR2 isoliert und an das 6 kb lange PvuI-SalI-Fragment von pAMH102 ligiert. Dieser selektierbare Vektor wurde pAMH104 genannt (Fig. 11).

IV. Die genaue Fusion des cbh1-Promotors und der Präprochymosin-Kodierungssequenzen durch Verwendung von Oligonukleotiden.

Das aminoterminale PstI-Fragment ( 150 bp) von Präprochymosin wurde aus pR26 (Fig. 3) isoliert, das einen vollständigen Präprochymosin-cDNA-Klon einschließt, beginnend 12 bp stromaufwärts von ATG, inseriert in die PstI-Stelle in pBR322. Dieses Fragment wurde in den Polylinker von pTZ19R zusammen mit dem cbh1-Eco RI- SacI( 2,6 kb)-Promotorfragment subkloniert, das auch die Signalsequenz-Kodierungsregion von cbh1 einschließt (Fig. 8). Das cbh1-Eco RI-Sac I-Fragment wird erhalten aus einem 2,8 kb Eco RI-Eco RI-Subklon in pUC18 (pUA01, Fig. 8) des ursprünglichen λ44A-Klons (Lit. 24). pTZ19R (Pharmacia) ist ein Plasmid auf der Basis von pUC19, welches den F1- Replikationsursprung und den T7-Promotor einschließt, was die Verwendung von ss-Matrize (einzelsträngig) für Oligonukleotid-Mutagenese erlaubt. Die Konstruktion des resultierenden Plasmids (pAMH105) ist in Figur 8 veranschaulicht. Aus diesem Plasmid wurden die Sequenzen zwischen dem cbh1-Promotorbereich und proC-ATG durch Loop- Mutagenese unter Verwendung eines spezifischen Oligonukleotids, OAMH3, deletiert (Fig. 10). Die Durchführung von Oligonukleotid - gerichteter Mutagenese ist in Figur 9 veranschaulicht. Das fragliche Oligonukleotid wurde phosphoryliert, an ss-pAMH105-DNA (Lit. 57, ss-DNA wurde isoliert aus JM103/pAMH105, wie beschrieben von Pharmacia) im Molverhältnis 20:1, entsprechend, aneliert. Der Oligonukleotid-Primer wurde unter Verwendung von Klenow- Polymerase und T4-Ligase verlängert, wie in Lit. 57 beschrieben. Die verlängerte Mischung wurde mit SmaI (findet sich im Polylinker von pTZ19R, siehe Fig. 9) vor Transformation in den E. coli-Stamm mit mutL-Mismatch- Repair-Defekt, BMH71.18 (Lit. 58), verdaut. Der Transformanten-Pool wurde über Nacht in 5 ml Flüssigkultur (Luria-Brühe, wie beschrieben in Lit. 59, mit 100 ug/ml Ampicillin) gezüchtet. Plasmid-DNA wurde aus dem Transformantenpool isoliert und sie wurde erneut verdaut mit SmaI und erneut transformiert in E. coli-JM109-Stamm. Das Screening von potentiellen Deletions-Klonen wurde durchgeführt durch Verdauung unter Verwendung verschiedener Restriktionsenzyme und die Deletionsspezifität wurde weiter durch Sequenzierung bestätigt. Das resultierende Plasmid wurde pAMH1101 genannt (Fig. 14). Dieses Plasmid wurde weiter mit EcoRI und PstI verdaut und das resultierende cbh1-preproC-Fragment wurde isoliert (Fig. 14) und an seinem PstI-Ende an das pAMH100-Plasmid, das mit PstI und SalI verdaut war, ligiert. Die Enden des resultierenden ligierten Fragments wurden mit Klenow stumpfendig gemacht und ligiert. Das resultierende Plasmid wurde pAMH101 genannt und es enthielt den cbh1-Promotorbereich, fusioniert an die Signalsequenz von Prochymosin, und die gesamte Prochymosin- Kodierungsregion, fusioniert an den Terminatorbereich des cbh1-Gens (Fig. 14).

V. Die genaue Fusion des cbh1-Promotors und preproC-Gens durch Signalsequenz-Fusion, ausgeführt durch Verwendung von Oligonukleotiden.

Die Konstruktion von Plasmid pAMH1103 (Fig. 12) wurde im wesentlichen wie pAMH1101 durchgeführt, im Detail beschrieben im vorstehenden Kapitel IV, mit der Ausnahme, daß das spezifische, für diese Konstruktion verwendete Oligonukleotid OAMH1 war (Fig. 10 und 9). Das resultierende Plasmid pAMH1103 enthält eine Signalsequenz-Fusion, die Aminosäuren (aa) 1-12 aus der cbh1-Signalsequenz einschließt, fusioniert an aa 12-16 aus der preproC- Signalsequenz, die dem aminoterminalen Teil ( 140 bp) der Kodierungsregion des proC-Gens vorangeht (Fig. 12). Aus Plasmid pAMH1103 wurde das pcbh1-sso-proC' (o = Fusion)- Fragment pAMH100 im wesentlichen so in pAMH100 subkloniert, wie im vorstehenden Kapitel IV beschrieben (siehe Fig. 12). Das resultierende Plasmid pAMH103 schließt den Promotorbereich von cbh1 und die Signalsequenz-Fusion von cbh1 und preproC ein, die der proC-Kodierungsregion vorangehen, fusioniert an den cbh1-Terminatorbereich.

VI. Die genaue Fusion der cbh1-Kodierungsregion an die proC- Kodierungsregion durch Verwendung von Oligonukleotiden.

Die Konstruktion von Plasmid pAMH1106 (Fig. 13) wurde im wesentlichen wie pAMH1101 durchgeführt, im Detail beschrieben im vorstehenden Kapitel IV, mit der Ausnahme, daß das spezifische, für diese Konstruktion verwendete Nukleotid OAMH2 war (Fig. 10 und 9). Aus dem resultierenden Plasmid pAMH1106, welches den Promotorbereich von cbh1, die Signalsequenz von cbh1 und die Kodierungsregion der 1-20 ersten aa von reifem CBHI einschließt, fusioniert an Kodierungsregion von proC, wurde das Fragment, das pcbh1- reifes o-proC' enthielt, im wesentlichen so in pAMH100 subkloniert, wie im vorstehenden Kapitel IV beschrieben (Fig. 12). Das resultierende Plasmid pAMH106 schließt den Promotorbereich von cbh1, die Signalsequenz von cbh1, die Kodierungsregion der aa 1-20 von reifem CBHI, fusioniert an die Kodierungsregion von proC, ein.

Beispiel 10

Herstellung von Chymosin unter Verwendung von pAMH102 und pAMH104.

T. reesei-Stämme QM9414 und RUT-C-30 wurden mit Plasmiden pAMH102 und p3SR2 im Molverhältnis 5:1, entsprechend, co- transformiert. Die Konstruktion von Plasmid pAMH102 wurde in Beispiel 9, Kapitel II beschrieben. Co-Transformation und Selektion wurde durchgeführt wie in Beispiel 5. Die Transformanten wurden gereinigt auf selektiven Acetamid- Platten, beschrieben in Beispiel 3.
Für die Chymosin-Produktion wurden Transformanten auf Minimalmedium (10 bis 50 ml), das 1% Solka-Flockenzellulose und 0,2% Proteosepepton enthielt, kultiviert. Die Mycele wurden gesammelt und der Überstand wurde durch TCA- Ausfällung konzentiert und in 2M NaOH 10 mM Tris (pH 8,5) verdünnt. Die Mycele wurden in Gegenwart von flüssigem Stickstoff aufgebrochen, die aufgebrochenen Zellen wurden pelletiert und der Überstand in derselben Art und Weise wie die Kulturmedien behandelt. Die Proben wurden aus SDS-PAGE (7,5%-15% Polyacrylamid-Gradient) fraktioniert und auf einen Nitrocellulosefilter elektrogeblottet. Die Filter wurden mit Kaninchen-Prochymosin-Antiserum und α-Kaninchen-IgG-AP (alkalische Phosphatase)-Konjugat inkubiert und mit Nitroblau-Tetrazolium und 5-Brom-4-chlor-3-indolylphosphat, bezogen von Promega Biotec, angefärbt. Die Chymosinmenge im Inneren und außerhalb des Mycels wurde verglichen (Fig. 17). Es wurde durch Southern-Hybridisierung gezeigt, daß die Klone, die hohe Kopienzahlen von Plasmid pAMH102, integriert in die chromosomale Pilz-DNA, enthielten, auch mehr Chymosin produzierten. Wenn ein Ein-Kopien-Transformant verwendet wurde, betrug die Menge an sekretiertem Chymosin 100 ug/l Kulturmedium, wenn angenähert aus Western-Gelen (Fig. 17). Es wurde gezeigt, daß das sekretierte Prochymosin durch Western-Gele und durch die Milchgerinnungsaktivität (Chymosin läßt Milch durch Spaltung von β-Kasein gerinnen, Bestimmung (Lit. 60)) zu einem aktiven Chymosin verarbeitet wird. Die Menge an verschiedenen Formen an Chymosin (preproC, proC, C und von Chymosin abgeleitete Abbauprodukte im Innern der Zelle) im Innern des Mycels wurde zu 0,04% vom Mycel-Gesamtprotein bestimmt (Fig. 17) und die Menge an sekretiertem Chymosin betrug 60% des produzierten Gesamtchymosins. Dies zeigt die Effizienz von T. reesei, sogar heterologe Genprodukte aus den Mycelen heraus zu sekretieren.
Transformanten mit mehreren Kopien von Plasmid pAMH104 (Fig. 11), die in der Lage sind, größere Mengen an Prochymosin zu sekretieren, wurden durch Bestimmung der Milchgerinnungsaktivität der Wachstumsmedien herausgescreent. Es wurde festgestellt, daß der beste Transformant aus den 40 untersuchten 500 ug/l Kulturmedium sekretierte, wie bestimmt auf Western-Gelen und durch Milchgerinnungsaktivität.
Da die Menge an sekretiertem aktiven Chymosin 200fach erhöht war, wenn Kulturen in einem 5 l-Laborfermenter gezüchtet wurden, verglichen mit den Kulturen im Kleinmaßstab (10-50 ml), beträgt die Menge an von diesem Stammtyp produziertem Chymosin etwa 100 mg/l.

Beispiel 11

Konstruktion eines allgemeinen Expressionsvektors zur Herstellung von homologen und heterologen Proteinen in in reesei.

Um in der Lage zu sein, Vektoren zur Herstellung von verschiedenen Proteinen in T. reesei zu konstruieren, wurde ein allgemeiner Expressionsvektor konstruiert, der die Promotor- und Terminatorbereiche des cbh1-Gens einschloß. Der cbh1-Terminator wurde zusammen mit einem Adaptor, der das STOP-Codon TAA in drei Leserahmen einschloß, in die PstI-Stelle von pUC19 subkloniert, was zu Plasmid pAMH110' führte (Fig. 15). Das PstI-Terminatorfragment wurde aus pAMH110' isoliert, der cbh1-Promotorbereich wurde aus pAMH102 als ein EcoRI-PstI-Fragment, das den Aminoterminus des proC-Gens einschloß, isoliert und diese Fragmente wurden in einen mit Eco RI-PstI verdauten pUC19-Stamm subkloniert, aus dem die einzelne NdeI-Stelle vor diesem Subklonierungsschritt mit Klenow stumpfendig gemacht worden war. Das resultierende Plasmid pAMH100 schließt den Promotor und Terminator des cbh1-Gen und zwischen diesen Sequenzen ein Füllfragment ein, das durch Verdauung mit SacII und NdeI entfernt werden kann. Nachdem die Enden stumpf gemacht worden sind, können irgendwelche cDNAs oder chromosomale Kopien von Genen zwischen dem Promotor und Terminator inseriert werden (Fig. 15).

Beispiel 12

Die Expression von T. reesei-Endoglucanase I unter cbhI- Promotor.

Um die Menge an produzierter Endoglucanase zu erhöhen, wurde das egl1-Gen mit dem stärkeren cbh1-Promotor verknüpft. Die cDNA für T. reesei-Endoglucanase I wurde als eine Eco-RI- BamHI-Fragment in den allgemeinen Expressionsvektor pAMH110 (beschrieben in Beispiel 11) subkloniert, der zunächst mit SacII - NdeI verdaut wurde, um das Füllfragment zu deletieren (Fig. 16). Das resultierende Plasmid pAMH111, das das egl1-Gen zwischen dem Promotor und Terminator des cbh1- Gens einschloß, wurde mit p3SR2 in T. reesei QM 9414 (ATCC 26921) im molaren Verhältnis 5:1, entsprechend, co- transformiert. Die Transformanten wurden auf AmdS&spplus;-Phänotyp selektiert und auf selektivem Medium weiter gereinigt. Sechs einzelne Transformanten wurden für 4 Tage in Cellulase induzierendem Medium (Solka-Flocke als eine Kohlenstoffquelle, 1%) in 50 ml-Flüssigkulturen gezüchtet. Die Kulturüberstände wurden dann auf Endoglucanase-Aktivität durch Messung der Freisetzung von reduzierenden Zuckern aus Hydroxyethylcellulose (0,1%, Lit. 12) getestet. Die EG I- Aktivitäten von Transformanten wurden mit einer Kontrolle (QM 9414) verglichen und es zeigte sich, daß der beste Transformant das 4fache der Endoglucanase-Aktivität des Kontrollstamms sekretierte. Dieses Beispiel zeigt, daß es möglich ist, die Menge an verschiedenen cellulolytischen Enzymen in T. reesei durch Veränderung des entsprechenden Promotors zu modifizieren.

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61. EP-A-0 215 594 (Genencor, Inc.).
Die in der vorstehenden Beschreibung, in den folgenden Ansprüchen und/oder in den beigefügten Zeichnungen offenbarten Merkmale können, sowohl einzeln als auch in jeder ihrer Kombinationen, Gegenstand zur Verwirklichung der Erfindung in ihren verschiedenen Formen sein.

Claims

1. Trichoderma-Stamm, der stabil transformiert ist mit einem Vektorsystem, welches umfaßt:

a) ein Gen, das ein gewünschtes Proteinprodukt kodiert,

b) Funktionen, die Genexpression erleichtern, einschließlich DNA-Sequenzen, die Promotoren/Verstärker umfassen, die operabel mit besagtem Gen verbunden sind, um Expression des gewünschten Produktes zu kontrollieren, und

c) einen Selektionsmarker, der in der Lage ist, stabile Trichoderma-Transformanten zu selektieren, wobei der Selektionsmarker nicht vom Neurospora crassa pyr-4-Gen abgeleitet ist.

2. Stamm nach Anspruch 1, wobei das Vektorsystem außerdem eine Signal/Leader-Sequenz umfaßt, die stromaufwärts an das 5'-Ende des Gens für das gewünschte Proteinprodukt fusioniert ist.

3. Stamm nach Anspruch 1 oder 2, wobei der Promotor des Vektorsystems in Trichoderma funktionieren kann.

4. Stamm nach Anspruch 1, wobei der Promotor des Vektorsystems abgeleitet ist von einen Gen für ein zu Trichoderma heterologes Protein.

5. Stamm nach Anspruch 2, wobei die Signal/Leader-Sequenz des Vektorsystems abgeleitet ist von einem Gen für ein von Trichoderma sekretiertes Protein.

6. Stamm nach Anspruch 2, wobei die Signal/Leader-Sequenz des Vektorsystems abgeleitet ist von einem sekretierten Protein, das zu Trichoderma heterolog ist.

7. Stamm nach Anspruch 5 bis 6, wobei die Signal/Leader- Sequenz des Vektorsystems abgeleitet ist von der Signal/Leader-Sequenz der gewünschten Proteine.

8. Stamm nach Anspruch 5, wobei die Signalsequenz des Vektorsystems die Trichoderma reesei cbh1-Signalsequenz ist.

9. Stamm nach Anspruch 6, wobei die Signalsequenz des Vektorsystems die Aspergillus-Glucoamylase-Signalsequenz ist.

10. Stamm nach Anspruch 1, wobei das gewünschte Protein zu Trichoderma homolog ist.

11. Stamm nach Anspruch 1, wobei das gewünschte Protein zu Trichoderma heterolog ist.

12. Stamm nach Anspruch 11, wobei das gewünschte Produkt Prochymosin ist.

13. Stamm nach Anspruch 10, wobei das gewünschte Protein T. reesei-Endoglucanase (EG I) ist.

14. Stamm nach Anspruch 3, wobei der Promotor des Vektorsystems der Trichoderma reesei chb1-Promotor ist.

15. Stamm nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß der Promotor des Vektorsystems der Aspergillus-Glucoamylase- Promotor ist.

16. Stamm nach Anspruch 1, wobei der Selektionsmarker des Vektorsystems abgeleitet ist von dem Aspergillus nidulans amdS-Gen, dem Aspergillus nidulans- oder Trichoderma reesei argB-Gen, dem Trichoderma reesei pyr4-Gen oder dem Aspergillus nidulans trpC-Gen.

17. Stamm nach Anspruch 1, wobei das Vektorsystem wenigstens zwei Plasmide oder Vektoren umfaßt.

18. Stamm nach Anspruch 17, wobei der Selektionsmarker des Vektorsystems auf einem Plasmid angeordnet ist und die restlichen DNA-Sequenzen, die in das Wirtsgenom eingebaut werden sollen, auf einem anderen Plasmid angeordnet sind.

19. Stamm nach Anspruch 1, wobei das Vektorsystem ein Plasmid oder einen Vektor umfaßt.

20. Verfahren zur Transformation von Trichoderma, wobei ein geeigneter Trichoderma-Stamm mit einem Vektorsystem transformiert ist, welches umfaßt:

a) ein Gen, das ein gewünschtes Proteinprodukt kodiert,

c) einen Selektionsmarker, der in der Lage ist, stabile Trichoderma-Transformanten zu selektieren und stabil transformierte Trichoderma zu selektieren durch das Vorhandensein des Selektionsmarkers, wobei der Selektionsmarker nicht vom Neurospora crassa pyr-4-Gen abgeleitet ist.

21. Verfahren zur Herstellung eines Proteinproduktes in Trichoderma, wobei ein Stamm gemäß einem der Ansprüche 1 bis 19 in einem geeigneten Kulturmedium kultiviert wird und das exprimierte und sekretierte Proteinprodukt aus dem Kulturmedium gewonnen wird.

22. Verfahren zur Herstellung eines Proteinproduktes in Trichoderma, welches umfaßt, daß in einem geeigneten Kulturmedium ein geeigneter stabiler transformierter Wirtsmikroorganismus gemäß einem der Ansprüche 1 bis 19 kultiviert und das exprimierte und sekretierte Proteinprodukt aus dem Kulturmedium gewonnen wird.

23. Verfahren nach Anspruch 21 oder 22, wobei der Wirtsmikroorganismus ein prototropher T. reesei-Stamm ist.

24. Verfahren gemäß Anspruch 21 oder 22, wobei der Wirtsmikroorganismus ein auxotropher T. reesei-Stamm ist.

25. Verfahren nach einem der Ansprüche 21 bis 24, wobei dem Wirtsstamm jegliches Gen fehlt, das ein unerwünschtes Produkt kodiert.

26. Verfahren nach Anspruch 25, wobei dem Wirtsstamm das chb1- Gen fehlt.