[go: up one dir, main page]

FI122937B - Menetelmä selluloosamateriaalin käsittelemiseksi sekä tässä käyttökelpoiset CBH II/Cel6A entsyymit - Google Patents

Menetelmä selluloosamateriaalin käsittelemiseksi sekä tässä käyttökelpoiset CBH II/Cel6A entsyymit Download PDF

Info

Publication number
FI122937B
FI122937B FI20096412A FI20096412A FI122937B FI 122937 B FI122937 B FI 122937B FI 20096412 A FI20096412 A FI 20096412A FI 20096412 A FI20096412 A FI 20096412A FI 122937 B FI122937 B FI 122937B
Authority
FI
Finland
Prior art keywords
cel6a
polypeptide
cbhii
sequence
enzyme
Prior art date
Application number
FI20096412A
Other languages
English (en)
Swedish (sv)
Other versions
FI20096412A0 (fi
FI20096412A (fi
Inventor
Jari Vehmaanperae
Terhi Puranen
Kim Langfelder
Sauli Toikka
Original Assignee
Roal Oy
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Roal Oy filed Critical Roal Oy
Publication of FI20096412A0 publication Critical patent/FI20096412A0/fi
Priority to FI20096412A priority Critical patent/FI122937B/fi
Priority to EP10796442.1A priority patent/EP2519630B1/en
Priority to AP2012006392A priority patent/AP3652A/xx
Priority to CN201080060251.9A priority patent/CN102712917B/zh
Priority to ES10796442.1T priority patent/ES2612512T3/es
Priority to DK10796442.1T priority patent/DK2519630T3/en
Priority to PCT/EP2010/070927 priority patent/WO2011080317A2/en
Priority to CA2785944A priority patent/CA2785944C/en
Priority to BR112012016320A priority patent/BR112012016320B8/pt
Priority to US12/930,189 priority patent/US8580552B2/en
Publication of FI20096412A publication Critical patent/FI20096412A/fi
Application granted granted Critical
Publication of FI122937B publication Critical patent/FI122937B/fi
Priority to US14/049,671 priority patent/US9200267B2/en

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2405—Glucanases
    • C12N9/2434—Glucanases acting on beta-1,4-glucosidic bonds
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C11—ANIMAL OR VEGETABLE OILS, FATS, FATTY SUBSTANCES OR WAXES; FATTY ACIDS THEREFROM; DETERGENTS; CANDLES
    • C11D—DETERGENT COMPOSITIONS; USE OF SINGLE SUBSTANCES AS DETERGENTS; SOAP OR SOAP-MAKING; RESIN SOAPS; RECOVERY OF GLYCEROL
    • C11D3/00—Other compounding ingredients of detergent compositions covered in group C11D1/00
    • C11D3/16—Organic compounds
    • C11D3/38—Products with no well-defined composition, e.g. natural products
    • C11D3/386—Preparations containing enzymes, e.g. protease or amylase
    • C11D3/38645—Preparations containing enzymes, e.g. protease or amylase containing cellulase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2405—Glucanases
    • C12N9/2434—Glucanases acting on beta-1,4-glucosidic bonds
    • C12N9/2437—Cellulases (3.2.1.4; 3.2.1.74; 3.2.1.91; 3.2.1.150)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/14—Preparation of compounds containing saccharide radicals produced by the action of a carbohydrase (EC 3.2.x), e.g. by alpha-amylase, e.g. by cellulase, hemicellulase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/02—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group
    • C12P7/04—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group acyclic
    • C12P7/06—Ethanol, i.e. non-beverage
    • C12P7/08—Ethanol, i.e. non-beverage produced as by-product or from waste or cellulosic material substrate
    • C12P7/10—Ethanol, i.e. non-beverage produced as by-product or from waste or cellulosic material substrate substrate containing cellulosic material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01091—Cellulose 1,4-beta-cellobiosidase (3.2.1.91)
    • D—TEXTILES; PAPER
    • D06—TREATMENT OF TEXTILES OR THE LIKE; LAUNDERING; FLEXIBLE MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
    • D06M—TREATMENT, NOT PROVIDED FOR ELSEWHERE IN CLASS D06, OF FIBRES, THREADS, YARNS, FABRICS, FEATHERS OR FIBROUS GOODS MADE FROM SUCH MATERIALS
    • D06M16/00—Biochemical treatment of fibres, threads, yarns, fabrics, or fibrous goods made from such materials, e.g. enzymatic
    • D06M16/003—Biochemical treatment of fibres, threads, yarns, fabrics, or fibrous goods made from such materials, e.g. enzymatic with enzymes or microorganisms
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02E—REDUCTION OF GREENHOUSE GAS [GHG] EMISSIONS, RELATED TO ENERGY GENERATION, TRANSMISSION OR DISTRIBUTION
    • Y02E50/00—Technologies for the production of fuel of non-fossil origin
    • Y02E50/10—Biofuels, e.g. bio-diesel

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
  • Textile Engineering (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Description

MENETELMÄ SELLULOOSAMATERIAALIN KÄSITTELEMISEKSI SEKÄ TÄSSÄ KÄYTTÖKELPOISET CBHII/CEL6A-ENTSYYMIT
KEKSINNÖN ALA
Esillä oleva keksintö koskee menetelmää selluloosamateriaalin käsittelemiseksi sieniperäisellä CBHII/Cel6A-sellobiohydrolaasientsyymillä tai mainittua entsyymiä käsittävällä entsyymivalmisteella. Entsyymi on käyttökelpoinen erilaisissa teollisissa sovelluksissa, erityisesti biopolttoaineiden tuotannossa, joissa fermentoituvien sokereiden valmistus lignoselluloosamateriaalista kohtuullisista korotettuihin olevissa lämpötiloissa on edullista. Keksintö koskee edelleen sieniperäisiä CBHII/Cel6A-polypeptidejä sekä mainittuja entsyymejä koodaavia eristettyjä nukleiinihappomolekyylejä, rekombinanttista vektoria, isäntäsoluja mainittujen entsyymien tuottamiseksi, mainittuja entsyymejä käsittäviä entsyymikoostumuksia sekä menetelmää tällaisten koostumusten valmistamiseksi. Tämä keksintö koskee myös mainittujen entsyymien tai entsyymikoostumusten erilaisia käyttöjä, joissa selluloosa- tai lignoselluloosamateriaalin entsymaattinen muuntaminen on toivottua.
KEKSINNÖN TAUSTA
Fossiilisten polttoaineiden varannon rajallisuus sekä niistä yhä enenevässä määrin vapautuva CO2, joka aiheuttaa kasvihuoneilmiötä, ovat synnyttäneet tarpeen käyttää biomassaa uusiutuvana ja puhtaana energianlähteenä. Eräs lupaava vaihtoehtoinen tekniikka on biopolttoaineiden kuten etanolin, butanolin tai propanolin valmistus selluloosamateriaalista. o Kuljetusalalla biopolttoaineet ovat jo pitkään olleet ainoa vaihtoehto, jonka avulla CO2- g päästöjä olisi mahdollista vähentää toiseen suuruusluokkaan. Etanolia voidaan käyttää g olemassa olevissa ajoneuvoissa ja jakelujärjestelmissä, eikä se näin ollen edellytä kalliita x investointeja infrastruktuuriin. Selluloosa- ja lignoselluloosapitoisista uusiutuvista raaka- Q_ aineista saatuja sokereita voidaan käyttää myös raaka-aineina useille kemiallisille tuotteille,
(M
5 jotka voivat korvata öljypohjaisia kemikaaleja.
co σ> o o
CM
2
Suurin osa kasvien hiilihydraateista on lignoselluloosan muodossa, joka koostuu pääasiassa selluloosasta, hemiselluloosasta ja ligniinistä. Tavanomaisessa menetelmässä lignoselluloosan muuntamiseksi etanoliksi lignoselluloosamateriaali esikäshellään ensin joko kemiallisesti tai fysikaalisesti käyttäen happohydrolyysia, höyryräjäytystä, AFEX-käsittelyä (ammonia fiber expansion), emäksistä märkähapetusta tai otsonilla suoritettavaa esikäsittelyä selluloosafraktion tekemiseksi alttiimmaksi entsymaattiselle hydrolyysille. Sen jälkeen selluloosafraktio hydrolysoidaan sokerien aikaansaamiseksi, jotka voidaan fermentoida hiivalla etanoliksi ja tislata puhtaan etanolin aikaansaamiseksi. Pääasiallisena oheistuotteena saadaan ligniiniä, jota voidaan käyttää kiinteänä polttoaineena. Tässä erillisen hydrolyysin ja fermentaation (SHF, separate hydrolysis and fermentation) käsittävässä menetelmässä entsymaattisen hydrolyysin lämpötila on tyypillisesti korkeampi kuin fermentaation. Lämmönkestävien entsyymien käyttö hydrolyysissä tuottaa mahdollisia etuja, joita ovat korkeammat reaktionopeudet korotetuissa lämpötiloissa, entsyymikuorman väheneminen johtuen entsyymien korkeammasta spesifisestä aktiivisuudesta ja eliniästä, lisääntynyt joustavuus prosessin konfiguroimisen suhteen sekä parantunut hygienia.
Jatkuvasti suoritetaan tutkimusta bioetanolin valmistusmenetelmien tekemiseksi entistä taloudellisemmiksi. Eräs vaihtoehto on menetelmä, jossa käytetään samanaikaista sokeriksi muuntamista ja fermentaatiota (SSF, simultaneous saccharification and fermentation). Pääasiallisia etuja ovat entsymaattisen hydrolyysin alentunut lopputuoteinhibitio sekä alentuneet investointikustannukset. Haasteisiin sisältyvät edullisten olosuhteiden, esim. lämpötilan ja pH-arvon, löytäminen sekä entsymaattiselle hydrolyysille että fermentaatiolle. Konsolidoidussa bioprosessissa (CBP, consolidated bioprocess) ulkoisesti lisättävien cm entsyymien määrää voidaan vähentää merkittävästi, kun käytetään käymistä aiheuttavaa cm organismia tai etanoligeeniä, joka kykenee tuottamaan joukon lignosellulolyyttisiä o entsyymejä, o c Viime vuosina etanolin tuotannossa käytettyjen mikro-organismien metabolisessa
CL
^ muuntelussa on tapahtunut merkittävää edistystä. Paitsi Saccharomyces cerevisisiaeta, 2 sellaisia mikro-organismeja kuten bakteerilajeja Zymomonas ]a Escherichia coli sekä hiivoja
CD
§ kuten Pichia stipitis ja Kluyveromyces fragilis on kohdistettu etanolin valmistamiseen
CM
selluloosasta. SSF-menetelmässä fermentoivan mikro-organismin tärkeitä ominaisuuksia ovat 3 inhibiittori- ja lämpötilatoleranssi sekä kyky hyödyntää useita sokereita. On kehitetty muunnettuja hiivoja, jotka kykenevät fermentoimaan pentoosisokereita ksyloosia ja arabinoosia glukoosin lisäksi. Termofiilisiä mikrobeja, kuten lajeja Thermoanaerobacterium saccharolyticum tai Clostridium thermocellum, on kehitetty sokerien, mm. ksyloosin, fermentoimiseksi etanoliksi korotetuissa, 50-60 °C olevissa lämpötiloissa (termofiilinen SSF tai TSSF). Tällaisilla käymistä aikaansaavilla organismeilla on myös potentiaalia hyödynnettäviksi konsolidoiduissa bioprosesseissa (Shaw et ai. 2008).
Entsymaattisen hydrolyysin katsotaan olevan lupaavin tekniikka selluloosabiomassan muuntamiseksi fermentoituviksi sokereiksi. Entsymaattista hydrolyysia käytetään kuitenkin ainoastaan rajallisessa määrin teollisessa mittakaavassa, ja erityisesti käytettäessä voimakkaasti lignifioitua materiaalia kuten puuta tai maatalousjätettä tekniikka ei ole toiminut tyydyttävästi. Selluloosamateriaalin entsymaattisen hydrolyysin tehokkuutta on pyritty parantamaan (Badger 2002; Kurabi et ah, 2005).
Julkaisussa W02001060752 (Forskningscenter Riso, DK) kuvataan jatkuvatoiminen prosessi kiinteän lignoselluloosabiomassan muuntamiseksi palaviksi polttoainetuotteiksi. Märkähapetuksella tai höyryräjäytyksellä suoritetun esikäsittelyn jälkeen biomassa erotetaan osittain selluloosaksi, hemiselluloosaksi ja ligniiniksi, minkä jälkeen sille suoritetaan osittainen hydrolyysi käyttäen yhtä tai useampaa karbohydraasientsyymiä (EC 3.2).
Julkaisu W02002024882 (Iogen Bio-Products Corp., CA) koskee menetelmää selluloosan muuntamiseksi glukoosiksi käsittelemällä esikäsiteltyä lignoselluloosasubstraattia c\i entsyymiseoksella, joka käsittää sellulaasia ja modifioitua sellobiohydrolaasia I (CBHI), joka cu on saatu inaktivoimalla sen selluloosaa sitova domeeni (CBD). Julkaisussa US2004/0005674 i o (Athenix Corp., US) kuvataan uudenlaisia entsyymiseoksia, joita voidaan käyttää suoraan o lignoselluloosasubstaatille. Synergistinen entsyymiseos sisältää sellulaasin ja apuentsyymin, ir kuten sellulaasin, ksylanaasin, ligninaasin, amylaasin, proteaasin, lipaasin tai glukuronidaasin,
CL
tai minkä tahansa niiden yhdistelmän. Sellulaasin katsotaan sisältävän entsyymit ^ endoglukanaasi (EG), beetaglukosidaasi (BG) ja sellobiohydrolaasi (CBH). Julkaisussa O) § US20050164355 (Novozymes Biotech Inc., US) kuvataan menetelmä cu lignoselluloosamateriaalin hajottamiseksi yhdellä tai useammalla sellulolyyttisellä 4 entsyymillä, jotka on valittu entsyymeistä EG, BG ja CBH, sekä vähintään yhden pinta-aktiivisen aineen läsnä ollessa. Myös lisäentsyymejä kuten hemisellulaaseja, esteraasia, peroksidaasia, proteaasia, lakkaasia tai näiden seosta voidaan käyttää.
Eniten tutkitut ja laajimmin käytetyt sieniperäiset sellulolyyttiset entsyymit ovat peräisin Trichoderma reeseistä (Hypocrea jecorinan anamorfi). Myös vähemmän tunnetuista sienistä peräisin olevia sellulaaseja on tuotu esiin.
Hong et ai. (2003a ja 2003b) ovat karakterisoineet lajin Thermoascus aurantiacus EG:n ja CBHI:n sekä esittäneet niiden tuotannon hiivassa. Tuohy et ai. (2002) kuvaavat kolme sellobiohydrolaasimuotoa, mukaan lukien Talaromyces emersoniin CBHI ja CBHII.
Esimerkiksi julkaisusta W003/000941 (Novozymes A/S, DK), joka koskee eri sienistä saatuja CBHI-entsyymejä, tunnetaan glykosyylihydrolaasien perheeseen 7 kuuluvan sellobiohydrolaasin I (CBHI) käyttö selluloosamateriaalin entsymaattisessa muuntamisessa. W02005074656 (Novozymes Inc., US) tuo esiin polypeptidejä, joilla on sellulolyyttistä aktiivisuutta ja jotka on saatu esim. lajista Thermoascus aurantiacus.
W02007071818 (Roal Oy, FI) kuvaa sokerihydrolysaattien valmistuksen selluloosamateriaalista entsymaattisella muuntamisella sekä mainittuja entsyymejä käsittäviä entsyymivalmisteita. Menetelmässä käyttökelpoisiin entsyymeihin sisältyvät lämmönkestävä sellobiohydrolaasi, endoglukonaasi, beetaglukosidaasi sekä valinnaisesti ksylanaasi, jotka ovat peräisin lajeista Thermoascus aurantiacus, Acremonium thermophilum tai Chaetomium cvj thermophilum.
δ
CVJ
o Sellobiohydrolaaseja II on tuotu esiin useissa hakemuksissa. W02004056981 (Novozymes o A/S, DK) tuo esiin polypeptidejä, joilla on sellobiohydrolaasi II -aktiivisuutta, ja näitä ir polypeptidejä koodaavia polynukleotideja sekä menetelmiä polypeptidien tuottamiseksi ja
CL
^ käyttämiseksi sovelluksissa, kuten etanolin valmistuksessa. Esiin tuodaan täyspitkät DNA- 2 sekvenssit lajeista Aspergillus tubigensis, Chaetomium thermophilum, Myceliophtora CT) § thermophila, Trichophaea saccata, Stibella anualata ja Malbrancheae cinnamonea.
cvj
Julkaisussa EP1578964 B1 (Novozymes A/S, DK) tuodaan esiin C. thermophilumm CBHII:n 5 täyspitkä aminohapposekvenssi ja polypeptidi, jota koodaa nukleotidisekvenssi, joka hybridisoituu ankarissa olosuhteissa mainittua entsyymiä koodaavan nukleotidisekvenssin fragmentin kanssa.
Julkaisussa CN1757709 (Shandong Agricultural Univ., CN) tuodaan esiin kannan Chaetomium thermophilum CT2 termofiilinen CBHII-entsyymi sekä sen ilmentäminen Pichia pastoris -hiivassa. Entsyymi kykenee muuntamaan hylättyä kuitumateriaalia.
W02006074005 (Genencor Int., Inc., US) tuo esiin erään variantin Hypocrea jecorinan (Trichoderma reesei) CBHII/Cel6A-entsyymistä. Variattientsyymi on käyttökelpoinen esimerkiksi bioetanolin valmistuksessa.
W02007094852 (Diversa Corp., US; Verenium Corp., US) tuo esiin sellulolyyttisiä entsyymejä, näitä koodaavia nukleiinihappoja sekä menetelmiä niiden valmistamiseksi ja käyttämiseksi. Entsyymi voi olla endoglukanaasi, sellobiohydrolaasi, beetaglukosidaasi, ksylanaasi, mannanaasi, beetaksylosidaasi, arabinofuranosidaasi tai oligomeraasi. Entsyymi ja entsyymiseokset ovat käyttökelpoisia esimerkiksi polttoaineen tai bioetanolin valmistuksessa.
W02008095033 (Syngenta, CH, Verenium Corp., US) tuo esiin entsyymejä, joilla on lignosellulolyyttistä aktiivisuutta, mukaan lukien sellobiohydrolaaseja, jotka ovat käyttökelpoisia esimerkiksi polttoaineiden valmistuksessa ja biomassamateriaalien prosessoinnissa. W02009045627 (Verenium Corp., US) tuo esiin menetelmiä hemiselluloosan hajottamiseksi käyttämällä entsyymejä, joilla on ksylanaasi-, mannanaasi-(m ja/tai glukanaasiaktiivisuutta sekä lisääntynyt aktiivisuus ja stabiilisuus korotetussa pH:ssa ja ^ lämpötilassa.
LO
cp o W02009089630 (Iogen Energy Corp., CA) tuo esiin perheen 6 sellulaasin variantin, johon ir glukoosilla on vähentynyt inhibitiokyky ja joka käsittää yhden tai useamman
CL
cg aminohapposubstituution.
co en § W02009059234 (Novozymes Inc., US) tuo esiin menetelmiä selluloosamateriaalin cv valmistamiseksi, joissa redox-aktiivisia metalli-ioneja on vähennetty ja jotka soveltuvat 6 selluloosamateriaalin hajottamiseen tai muuntamiseen ja aikaansaavat fermentaatiotuotteen. Hakemuksessa tuodaan esiin esim. Chaetomium thermophilumin CBHII-polypeptidi.
W02009085868 (Novozymes A/S, DK) tuo esiin polypeptidejä, entsyymiä koodaavia polynukleotideja sekä menetelmän fermentaatiotuotteen valmistamiseksi, menetelmän käsittäessä selluloosamateriaalin muuntamisen sokeriksi sellulolyyttisellä entsyymikoostumuksella, joka käsittää mainitun polypeptidin. Tällaiset sellobiohydrolaasit voi olla saatu lajeista Trichoderma reesei, Humicola insolens, Myceliophtora thermophila, Thielavia terrestris ja Chaetomium thermophilum. US 7220565 (Novozymes Inc., US) tuo esiin polypeptidejä, joilla on sellulolyyttistä tehostavaa aktiivisuutta ja jotka ovat identtisiä Myceliophtora thermophilan CBHIIrn kypsän aminohapposekvenssin kanssa.
US20070238155 ja US20090280105 (Dyadic Int., Inc., US) tuovat esiin entsyymivalmisteita, jotka käsittävät uudenlaisia Chrysosporium lucknowensesta peräisin olevia entsyymejä, käsittäen CBHIIa- ja CBHIIb-entsyymit, jotka on sijoitettu glykosyylihydrolaasien perheeseen 6. Entsyymikoostumukset ovat tehokkaita lignoselluloosamateriaalin hydrolyysissä.
Kannan Neurospora erässä OR74A genomin sekvenssi on tuotu esiin julkaisussa Galagan et ai. (2003), sisältäen eksoglukanaasi 2:n esiasteen sekvenssin. Collins et ai. (2003) tuovat esiin Talaromyces emersoniin CBHII/Cel6A:n koodaavan sekvenssin.
Biopolttoaineiden, kuten kuljetuksissa käytettyjen uusiutuvien polttoaineiden, markkinoiden c\i uskotaan kasvavan huomattavasti lähitulevaisuudessa. Tämän seurauksena kiinnostus cv vaihtoehtoisiin biopolttoaineen tuotannossa käyttökelpoisiin raaka-aineisiin kasvaa nopeasti.
i o Kasveissa ja puussa tai yhdyskuntajätteessä olevan selluloosapitoisen biomassan fermentaatio o etanoliksi ja muiksi alkoholeiksi on kiinnostava reitti sellaisten polttoaineiden
Er aikaansaamiseksi, joilla voidaan täydentää fossiilisia polttoaineita. Eräs este biopolttoaineiden
CL
tuotannolle selluloosa- ja lignoselluloosapitoisesta biomassasta on soluseinien vahvuus sekä 2 läsnä olevat vaikeasti muunnettavina polymeereinä esiintyvät sokerimonomeerit, jotka
CD
§ vaativat suuren määrän käsittelyä, jotta sokerimonomeerit olisivat sellaisten mikro- cv organismien käytettävissä, joita tavallisesti käytetään tuottamaan alkoholia fermentaation 7 avulla. Näin ollen on olemassa jatkuva tarve uusille menetelmille sekä uusille entsyymeille ja entsyymiseoksille, jotka tehostavat selluloosa- ja lignoselluloosapitoisten substraattien hajoamista. Erityisesti tarvitaan sellaisia entsyymejä ja entsyymiseoksia, jotka kykenevät käsittelemään kiteisen selluloosamateriaalin erilaisia glykosidisidoksia ja näin aikaansaamaan erilaisten käsiteltävien materiaalien lähes täydellisen hydrolyysin. On myös olemassa tarve entsyymeille, jotka ovat stabiileja korotetuissa prosessilämpötiloissa ja jotka näin ollen mahdollistavat suuremman biomassan sakeuden käyttämisen ja johtavat korkeisiin sokeri- ja etanolipitoisuuksiin. Tämä menettelytapa saattaa johtaa merkittäviin säästöihin energiankulutuksessa sekä investointien määrässä. Korkea lämpötila myös vähentää riskiä hydrolyysin aikaisesta saastumisesta. Esillä olevan keksinnön tavoitteena on täyttää ainakin osa näistä tarpeista.
KEKSINNÖN YHTEENVETO
Esillä olevan keksinnön tavoitteena on aikaansaada uusia entsyymejä ja entsyymikoostumuksia selluloosan hydrolyysin tehokkuuden parantamiseksi. Sellobiohydrolaasit ja erityisesti sellobiohydrolaasit II, jotka ovat peräisin lajeista Acremonium thermophilum, Melanocarpus albomyces, Chaetomium thermophilum tai Talaromyces emersonii, ovat käyttökelpoisia selluloosamateriaalin hydrolysoinnissa ja hajotuksessa. Entsyymit ovat kineettisesti hyvin tehokkaita laajalla lämpötila-alueella, ja vaikka ne ovat hyvin aktiivisia korkeissa lämpötiloissa, ne ovat myös hyvin tehokkaita tavanomaisissa hydrolyysilämpötiloissa. Tämä tekee niistä erinomaisen hyvin soveltuvia erilaisiin selluloosasubstraattien hydrolyysiprosesseihin, joita suoritetaan sekä tavanomaisissa ^ että korotetuissa lämpötiloissa.
δ
CVJ
g Esillä oleva keksintö koskee menetelmää selluloosamateriaalin käsittelemiseksi i g CBHII/Cel6A-polypeptidillä tai mainittua polypeptidiä käsittävällä entsyymivalmisteella.
x Mainitussa menetelmässä käyttökelpoisella CBHII/Cel6A-polypeptidillä on sellobiohydrolaasiaktiivisuutta ja se käsittää aminohapposekvenssin, joka on vähintään g 76-prosenttisesti identtinen sekvenssin nro 12 täyspitkän polypeptidin kanssa, vähintään o 76-prosenttisesti identtinen sekvenssin nro 14 täyspitkän polypeptidin kanssa, vähintään
CM
95-prosenttisesti identtinen sekvenssin nro 15 täyspitkän polypeptidin kanssa tai vähintään 8 91-prosenttisesti identtinen sekvenssin nro 16 täyspitkän polypeptidin kanssa. CBHII/Cel6A-polypeptidi voi myös olla fragmentti tai variantti, jolla on samankaltaisia ominaisuuksia, kuten samanlainen substraattispesifisyys ja pH- ja lämpötilariippuvuus tai stabiilisuus. Menetelmässä käyttökelpoinen CBHII/Cel6A-sellobiohydrolaasi on glykosyylihydrolaasien perheen 6 sellobiohydrolaasi II -entsyymi, jolla on sekä konservoitunut laskos että hydrolyysireaktion edellyttämä stereokemia.
Menetelmässä käyttökelpoiset CBHII/Cel6A-sellobiohydrolaasit voidaan saada suvusta Acremonium, Melanocarpus, Chaetomium tai Talaromyces, edullisemmin lajista A. thermophilum, M. albomyces, C. thermophilum tai T. emersonii, edullisimmin talletetusta kannasta A. thermophilum CBS 116240, M. albomyces CBS 685.95, C. thermophilum CBS 730.95 tai T. emersonii DSM 2432.
Menetelmässä käyttökelpoinen CBHII/Cel6A-sellobiohydrolaasi kykenee hydrolysoimaan erilaisia selluloosamateriaaleja kohtuullisista korotettuihin olevissa lämpötiloissa, erityisesti yhdessä muiden entsyymien kanssa, joita käytetään erilaisten selluloosa- tai lignoselluloosamateriaalien hydrolyysissä.
Keksinnön CBHII/Cel6A-sellobiohydrolaasi on käyttökelpoinen erilaisia tarkoituksia varten, erityisesti biopolttoaineen tuotannossa.
Lisäksi esillä oleva keksintö koskee uudenlaisia CBHII/Cel6A-sellobiohydrolaaseja, joilla on sellobiohydrolaasiaktiivisuutta ja jotka käsittävät aminohapposekvenssin, joka on vähintään c\j 76-prosenttisesti identtinen sekvenssin nro 12 täyspitkän polypeptidin kanssa, vähintään cm 76-prosenttisesti identtinen sekvenssin nro 14 täyspitkän polypeptidin kanssa, vähintään i o 95-prosenttisesti identtinen sekvenssin nro 15 täyspitkän polypeptidin kanssa tai vähintään o 91-prosenttisesti identtinen sekvenssin nro 16 täyspitkän polypeptidin kanssa. Mainittu
Er CBHII/Cel6A-polypeptidi voi myös olla fragmentti tai variantti, jolla on samankaltaisia
CL
^ ominaisuuksia, kuten samanlainen substraattispesifisyys ja pH- ja lämpötilariippuvuus tai 2 stabiilisuus. Mainittu CBHII/Cel6A-sellobiohydrolaasi kykenee hydrolysoimaan
CD
§ selluloosamateriaalia kohtalaisista korotettuihin olevissa lämpötiloissa.
(M
9
Mainittua entsyymiä koodaa eristetty nukleiinihappomolekyyli, joka käsittää keksinnön polypeptidiä koodaavan polynukleotidisekvenssin. Edullisesti nukleiinihappomolekyyli käsittää polynukleotidisekvenssin, joka on määritelty sekvenssissä nro 11, sekvenssissä nro 13, sekvenssissä nro 9 tai sekvenssissä nro 10, tai jonkin näistä osasekvenssin.
Keksinnön CBHII/CelöA-sellobiohydrolaasia voi koodata eristetty nukleiinihappomolekyyli, joka hybridisoituu ankarissa olosuhteissa polynukleotidisekvenssiin, joka sisältyy sekvenssiin nro 11, sekvenssiin nro 13, sekvenssiin nro 9, sekvenssiin nro 10, sekvenssiin nro 7, sekvenssiin nro 8, tai näiden osasekvenssiin.
Mainittua entsyymiä koodaa eristetty polynukleotidi, joka sisältyy plasmidiin pALK2582, joka on talletettu Escherichia colissa talletusnumerolla DSM 22946, plasmidiin pALK2581, joka on talletettu E. colissa talletusnumerolla DSM 22945, plasmidiin pALK2904, joka on talletettu E. colissa talletusnumerolla DSM 22947 tai plasmidiin pALK3006, joka on talletettu E. colissa talletusnumerolla DSM 23185.
Keksinnön CBHII/Cel6A-sellobiohydrolaasi voidaan valmistaa rekombinanttisesta ekspressiovektorista, joka käsittää mainittua sellobiohydrolaasia koodaavan nukleiinihappomolekyylin. Mainittu sellobiohydrolaasipolypeptidi voidaan valmistaa heterologisessa isännässä, edullisesti mikrobi-isännässä.
Keksintö koskee myös eristettyä nukleiinihappomolekyyliä, joka koodaa sieniperäistä CBHII/Cel6A-polypeptidiä, joka on valittu ryhmästä, jonka muodostavat: oj (a) nukleiinihappomolekyyli, joka koodaa polypeptidiä, jolla on cm sellobiohydrolaasiaktiivisuutta ja joka käsittää sekvenssissä nro 12, sekvenssissä nro 14, i cp sekvenssissä nro 15 tai sekvenssissä nro 16 esitetyn täyspitkän aminohapposekvenssin tai o näiden fragmentin tai variantin, jolla on samankaltaisia ominaisuuksia; | (b) nukleiinihappomolekyyli, joka koodaa polypeptidiä, jolla on cm sellobiohydrolaasiaktiivisuutta ja joka on vähintään 76-prosenttisesti identtinen S sekvenssin nro 12 täyspitkän polypeptidin kanssa, vähintään 76-prosenttisesti identtinen en o sekvenssin nro 14 täyspitkän polypeptidin kanssa, vähintään 95-prosenttisesti identtinen
CM
sekvenssin nro 15 täyspitkän polypeptidin kanssa tai vähintään 91-prosenttisesti identtinen 10 sekvenssin nro 16 täyspitkän polypeptidin kanssa, tai näiden fragmenttia tai varianttia, jolla on samankaltaisia ominaisuuksia; (e) nukleiinihappomolekyyli, joka käsittää sekvenssissä nro 11, sekvenssissä nro 13, sekvenssissä nro 9 tai sekvenssissä nro 10 kuvatun polynukleotidisekvenssin koodaavan sekvenssin; (d) nukleiinihappomolekyyli, joka käsittää DSM 22946:n, DSM 22945:n, DSM22947:n tai DSM 23185:n sisältämän polynukleotidisekvenssin koodaavan sekvenssin; (e) nukleiinihappomolekyyli, jonka koodaava sekvenssi eroaa minkä tahansa kohdista (c)-(d) nukleiinihappomolekyylin koodaavasta sekvenssistä geneettisen koodin degeneraation vuoksi; ja (f) nukleiinihappomolekyyli, joka hybridisoituu ankarissa olosuhteissa DSM 22946:n, DSM 22945:n, DSM 22947:n tai DSM 23185:n sisältämään nukleiinihappomolekyyliin ja joka koodaa polypeptidiä, jolla on sellobiohydrolaasiaktiivisuutta ja aminohapposekvenssi, joka on vähintään 76-prosenttisesti identtinen sekvenssin nro 12 täyspitkän aminohapposekvenssin kanssa, vähintään 76-prosenttisesti identtinen sekvenssin nro 14 täyspitkän aminohapposekvenssin kanssa, vähintään 95-prosenttisesti identtinen sekvenssin nro 15 täyspitkän aminohapposekvenssin kanssa tai vähintään 91-prosenttisesti identtinen sekvenssin nro 16 täyspitkän aminohapposekvenssin kanssa, tai näiden fragmenttia tai varianttia, jolla on samankaltaisia ominaisuuksia.
Keksintö koskee edelleen rekombinanttista ekspressiovektoria, joka käsittää keksinnön cm nukleiinihappomolekyylin toiminnallisesti liitettynä säätelysekvensseihin, jotka kykenevät cm ohjaamaan mainitun CBHII/Cel6A-sellobiohydrolaasin tuotantoa soveltuvassa isännässä.
i m o i o Keksintö koskee myös isäntäsolua, joka käsittää edellä kuvatun kaltaisen rekombinanttisen
Er ekspressiovektorin. Edullisesti isäntäsolu on mikrobi-isäntä, kuten rihmasieni-isäntä. Edulliset
CL
^ isännät kuuluvat sukuihin Trichoderma, Aspergillus, Fusarium, Humicola, Chrysosporium, ^ Neurospora, Rhizopus, Penicillium ja Mortiriella. Edullisemmin isäntä on Trichoderma tai § Aspergillus, edullisimmin rihmasieni T. reesei.
CM
11
Esillä oleva keksintö koskee menetelmää keksinnön polypeptidin valmistamiseksi, jolla on sellobiohydrolaasiaktiivisuutta, mainitun menetelmän käsittäessä vaiheet keksinnön isäntäsolun viljelemiseksi ja polypeptidin talteen ottamiseksi. Keksintöön sisältyy myös keksinnön nukleiinihappomolekyylin koodaama polypeptidi, jolla on sellobiohydrolaasiaktiivisuutta ja joka on saatavissa edellä kuvatulla menetelmällä.
Keksintö koskee myös menetelmää entsyymivalmisteen aikaansaamiseksi, menetelmän käsittäessä vaiheet, joissa viljellään keksinnön isäntäsolua ja valmistetaan koko viljelyliemi tai erotetaan solut käytetystä elatusaineesta ja otetaan talteen supernatantti. Esillä olevaan keksintöön sisältyy myös entsyymivalmiste, joka on saatavissa edellä kuvatulla menetelmällä. Lisäksi keksintö koskee entsyymivalmistetta, joka käsittää keksinnön CBHII/Cel6A-sellobiohydrolaasin.
Entsyymivalmiste voi edelleen käsittää muita entsyymejä, jotka on valittu seuraavasta ryhmästä: sellobiohydrolaasi, endoglukanaasi, beeta-glukosidaasi, beeta-glukanaasi, ksyloglukanaasi, ksylanaasi, beeta-ksylosidaasi, mannanaasi, beeta-mannosidaasi, α-glukuronidaasi, asetyyliksylaaniesteraasi, α-arabinofuranosidaasi, a-galaktosidaasi, pektinaasi, käsittäen endo- ja ekso-a-L-arabinaasit, α-galaktosidaasi, endo- ja ekso-galaktoronaasi, endopektiinilyaasi, pektaattilyaasi ja pektiiniesteraasi, fenoliesteraasi, ligninaasi käsittäen ligniiniperoksidaasin, mangaaniriippuvainen peroksidaasi, H2C>2:a generoiva entsyymi ja lakkaasi, mediaattorin kanssa tai ilman.
Entsyymivalmiste voi olla koko viljelyliemen muodossa tai käytettynä elatusaineena. Se voi cm olla nesteen, jauheen tai rakeiden muodossa.
δ
CM
o Keksintöön sisältyy myös keksinnön CBHII/Cel6A-polypeptidin tai entsyymivalmisteen o käyttö biopolttoaineen valmistuksessa, pesuaineissa, kuitujen käsittelyssä, elintarvikkeiden tai
Ee rehun käsittelyssä, massan ja paperin valmistuksessa, juomissa tai missä tahansa Q_ sovelluksissa, joihin liittyy selluloosamateriaalin hydrolyysi tai muuntaminen.
CD
05 § Erityisesti CBHII/Cel6A-polypeptidi tai mainittua polypeptidiä käsittävä entsyymivalmiste on
CM
käyttökelpoinen biopolttoaineen valmistuksessa.
12
PIIRUSTUSTEN LYHYT KUVAUS
Kuvio 1 esittää kaavamaisesti ekspressiokasetit, joita käytettiin Trichoderma reesein protoplastien muuntamiseksi ylituottamaan rekombinanttisia CBHII/Cel6A-proteiineja. cbhl/celb A-gccmt olivat T. reesei cbh\/cellA -promoottorin (p cbh 1) säätelyn alaisina ja transkription päättyminen varmistettiin käyttämällä T. reesei cbh \/cell A
tcrminaattorisckvcnssiä (t cbhl). amdS-gccni sisällytettiin transformaatiomarkkerina.
Kuvio 2 esittää rekombinanttisia CBHII/Cel6A-sellobiohydrolaaseja kannoista Acremonium thermophilum CBS 116240, Melanocarpus albomyces CBS 685.95, Chaetomium thermophilum CBS 730.95 ja Talaromyces emersonii DSM 2432 käsittävien entsyymikoostumusten pH-riippuvuuden määrittämisen (100 pg proteiinia reaktiossa). Hydrolyysi suoritettiin Avicel Ph 101 -selluloosalla pH-alueella 3-10, lämpötilassa 50 °C, 21 tunnin ajan. Pelkistävien sokereiden muodostuminen määritettiin parahydroksibentsoehappohydratsidi-menetelmällä (PAHBAH-menetelmällä) (Lever, 1972) käyttäen sellobioosi-standardikäyrää.
Kuvio 3 esittää rekombinanttisia CBHII/Cel6A-sellobiohydrolaaseja kannoista Acremonium thermophilum CBS 116240, Melanocarpus albomyces CBS 685.95, Chaetomium thermophilum CBS 730.95 ja Talaromyces emersonii DSM 2432 käsittävien entsyymikoostumusten lämmönkestävyyden määrittämisen (100 μ g proteiinia reaktiossa). Hydrolyysi suoritettiin Avicel Ph 101 -selluloosalla lämpötila-alueella 40-80 °C entsyymikoostumusten optimaalisessa pH:ssa 21 tunnin ajan. Pelkistävien sokereiden muodostuminen määritettiin parahydroksibentsoehappohydratsidi-menetelmällä (PAHBAH-c\i menetelmällä) (Lever, 1972) käyttäen sellobioosi-standardikäyrää.
δ
(M
ιό Kuvio 4 esittää tulokset höyryräjäytetyn lehtipuumateriaalin hydro fyysistä suoritettuna entsyymiseoksilla, jotka käsittävät keksinnön CBHII/Cel6A-sellobiohydrolaasia.
O
x Lehtipuusubstraatti hydrolysoitiin käyttämällä erilaisia entsyymiseoksia annostuksella, joka cc on 5 mg proteiinia per gramma kokonaiskiintoainetta, sekä 55 °C:ssa että 37 °C:ssa.
OJ
^ Termofiilisen entsyymiseoksen (SEOS 2) ja mesofiilisten entsyymiseosten (SEOS T.
CD
§ REESEIN ENTSYYMIT ja SEOS ACC), jotka käsittivät Ai_ALK04245_Ccl6 A:ta, o ^ Ma_ALK04237_Cel6A:ta tai C/_ALK04265_Cel6A:ta, on kuvattu yksityiskohtaisemmin 13 esimerkissä 4. Näytteet duplikaatteina valmistetuista ravistuspulloista otettiin 72 tunnin hydrolyysiajan jälkeen ja kvantifioitiin HPLCdla, jossa glukoosi- ja ksyloosipitoisuus määritettiin. Tulokset substraattien nollanäytteistä, jotka sisälsivät puskuria entsyyminäytteen sijaan, vähennettiin entsyymiseoksilla saaduista tuloksista. Yhdistetty glukoosin ja ksyloosin pitoisuus on esitetty.
Kuvio 4A esittää tulokset höyryräjäytetyn lehtipuun hydrolyysista suoritettuna 55 °C:ssa käyttäen termofiilistä entsyymiseosta (SEOS 2), jota oli täydennetty
At_ALK04245_Cel6A: 11a (SEOS 2_AT), Ma_ALK04237_Cel6A:lla (SEOS 2_MA) tai Q ALK04265_Cel6A: 11a (SEOS 2_CT).
Kuvio 4B esittää tulokset höyryräjäytetyn lehtipuun hydrolyysista suoritettuna 37 °C:ssa käyttäen mesofiilistä entsyymiseosta (SEOS T. REESEIN ENTSYYMIT) täydennettynä d/ALK04245 Ccl6A:lla (SEOS TRAT), Ma_ALK04237_Cel6A:lla (SEOS TR MA) tai O_ALK04265_Cel6A:lla (SEOS TR CT).
Kuvio 4C esittää tulokset höyryräjäytetyn lehtipuun hydrolyysista suoritettuna 37 °C:ssa käyttäen mesofnlistä entsyymiseosta (SEOS ACC), jota oli täydennetty j4i_ALK04245_Cel6A:lla (SEOS ACCAT), Mö_ALK04237_Cel6A:lla (SEOS ACC MA) tai Ct_ALK04265_Cel6A:lla (SEOS ACC_CT).
Kuvio 5 esittää tulokset höyryräjäytetyn maissintähkämateriaalin hydrolyysista suoritettuna entsyymiseoksilla, jotka käsittävät keksinnön CBHII/CelöA-sellobiohydrolaasia.
Maissintähkäsubstraatti hydrolysoitiin 55 °C:ssa käyttämällä erilaisia entsyymiseoksia annostuksella, joka oli 5 mg proteiinia per gramma kokonaiskiintoainetta. Termofiilisen o entsyymiseoksen (SEOS 2), joka käsitti keksinnön At_ALK04245_Cel6A-polypcptidiä ιό (SEOS 2_AT), koostumus on kuvattu yksityiskohtaisemmin esimerkissä 5. Näytteet o i duplikaatteina valmistetuista ravistuspulloista otettiin 72 tunnin hydrolyysiajan jälkeen ja o x kvantifioitiin HPLC:lla, jossa glukoosi- ja ksyloosipitoisuus määritettiin. Tulokset substraattien nollanäytteistä, jotka sisälsivät puskuria entsyyminäytteen sijaan, vähennettiin
(M
^ entsyymiseoksilla saaduista tuloksista. Yhdistetty glukoosin ja ksyloosin pitoisuus on esitetty.
CD
en o o
(M
14 SEKVENSSEISTÄ SEKVENSSI NRO: 1 Oligonukleotidialukkeen CBH1S sekvenssi SEKVENSSI NRO: 2 Oligonukleotidialukkeen CBHl AS sekvenssi SEKVENSSI NRO: 3 Oligonukleotidialukkeen CBH 8 sekvenssi SEKVENSSI NRO: 4 Oligonukleotidialukkeen CBH 9 sekvenssi SEKVENSSI NRO: 5 Oligonukleotidialukkeen Te CBH A sekvenssi SEKVENSSI NRO: 6 Oligonukleotidialukkeen Te CBH B sekvenssi SEKVENSSI NRO: 7 Kannasta Acremonium thermophilum ALK04245 (CBS 116240) alukkeita CBH1S ja CBH l AS käyttäen saadun PCR-fragmentin sekvenssi.
SEKVENSSI NRO: 8 Kannasta Melanocarpus albomyces ALK04237 (CBS 685.95) alukkeita CBH1S ja CBH_1AS käyttäen saadun PCR-fragmentin sekvenssi.
SEKVENSSI NRO: 9 Kannan Chaetomium thermophilum ALK04265 (CBS 730.95) c6/z2/ce/6A-geenin nukleotidisekvenssi.
SEKVENSSI NRO: 10 Kannan Talaromyces emersonii RF8069 (DSM 2432) cbh2/cel6A-c\j geenin nukleotidisekvenssi.
δ
(M
o SEKVENSSI NRO: 11 Kannan Acremonium thermophilum ALK04245 (CBS 116240) o cM2/ce/6A-gecnin nukleotidisekvenssi.
X
en
CL
SEKVENSSI NRO: 12 Kannan Acremonium thermophilum ALK04245 (CBS 116240) 2 CBHII/Cel6A:n johdettu aminohapposekvenssi.
05 o o
CM
15 SEKVENSSI NRO: 13 Kannan Melanocarpus albomyces ALK04237 (CBS 685.95) cM2/ce/6A-geenin nukleotidisekvenssi.
SEKVENSSI NRO: 14 Kannan Melanocarpus albomyces ALK04237 (CBS 685.95) CBHII/Cel6A:n johdettu aminohapposekvenssi.
SEKVENSSI NRO: 15 Kannan Chaetomium thermophilum ALK04265 (CBS 730.95) CBHII/Cel6A:n johdettu aminohapposekvenssi.
SEKVENSSI NRO: 16 Kannan Talaromyces emersonii RF8069 (DSM 2432) CBHII/Cel6A:n johdettu aminohapposekvenssi.
TALLETUKSET
Acremonium thermophilum ALK04245 talletettiin 20.9.2004 Centraalbureau Voor Schimmelcultures -kokoelmaan, Upsalalaan 8, 3584 CT, Utrecht, Alankomaat, ja sille annettiin talletusnumero CBS 116240.
Chaetomium thermophilum ALK04265 talletettiin 8.11.1995 Centraalbureau Voor Schimmelcultures -kokoelmaan, Oosterstraat 1, 3742 SK BAARN, Alankomaat, ja sille annettiin talletusnumero CBS 730.95. Tämänhetkisen talletusajan päätyttyä näytteitä säilytetään sovitulla tavalla, jotta kanta olisi saatavilla myös patentin voimassaoloajan jälkeen.
Melanocarpus albomyces ALK04237 talletettiin 11.10.1995 Centraalbureau Voor o Schimmelcultures -kokoelmaan, Oosterstraat 1, 3740 AG BAARN, Alankomaat, ja sille ιό annettiin talletusnumero CBS 685.95. Tämänhetkisen talletusajan päätyttyä näytteitä
O
säilytetään sovitulla tavalla, jotta kanta olisi saatavilla myös patentin voimassaoloajan o x jälkeen, cc
CL
^ E. coli -kanta RF8175, sisältäen plasmidin pALK2582, talletettiin 9.9.2009 kokoelmaan ^r σ, Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ), Inhoffenstrasse o ° 7B, D-38124 Braunschweig, Saksa, ja sille annettiin talletusnumero DSM 22946.
16 E. coli -kanta RF8174, sisältäen plasmidin pALK2581, talletettiin 9.9.2009 kokoelmaan Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ), Inhoffenstrasse 7B, D-38124 Braunschweig, Saksa, ja sille annettiin talletusnumero DSM 22945.
E. coli -kanta RF8214, sisältäen plasmidin pALK2904, talletettiin 9.9.2009 kokoelmaan Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ), Inhoffenstrasse 7B, D-38124 Braunschweig, Saksa, ja sille annettiin talletusnumero DSM 22947.
E. coli -kanta RF8333, sisältäen plasmidin pALK3006, talletettiin 10.12.2009 kokoelmaan Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ), Inhoffenstrasse 7B, D-38124 Braunschweig, Saksa, ja sille annettiin talletusnumero DSM 23185.
KEKSINNÖN YKSITYISKOHTAINEN KUVAUS
Esillä oleva keksintö koskee menetelmää selluloosamateriaalin käsittelemiseksi CBHII/Cel6A-sellobiohydrolaasipolypeptidillä tai mainittua polypeptidiä käsittävällä entsyymivalmisteella. Keksintö aikaansaa myös sieniperäisiä CBHII/Cel6A- sellobiohydrolaasipolypeptidejä ja entsyymivalmisteita, jotka käsittävät mainittuja CBHII/Cel6A-sellobiohydrolaasipolypeptidejä, joilla polypeptideillä on laaja substraattispesifisyys ja jotka ovat stabiileja laajoilla pH- ja lämpötila-aluilla. Ne ovat tehokkaita sekä kohtuullisissa että korotetuissa lämpötiloissa. Erityisesti CBHII/Cel6A-sellobiohydrolaasipolypeptidit ovat stabiileja vähintään 21 tunnin ajan jopa 70 °C:ssa, edullisesti lämpötila-alueella 40-60 °C. Polypeptidit ja mainittuja polypeptidejä käsittävät entsyymivalmisteet ovat ihanteellisia erilaisiin sovelluksiin, jotka edellyttävät sellaisten kompleksisten selluloosa- tai lignosclluloosamatcriaalicn, joissa selluloosa on yksi δ ^ pääasiallinen aineosa, tehokasta hydrolyysiä. Polypeptidit ja entsyymivalmisteet ovat ιό o käyttökelpoisia esimerkiksi selluloosamateriaalin hydrolyysissä sellaisten sokerimonomeerien o aikaansaamiseksi polymeerilähtöaineesta, jotka voidaan sitten fermentoida mikroin organismeilla biopolttoaineen tuotannossa. Näin ollen esillä oleva keksintö aikaansaa cm vaihtoehtoisia CBHII/Cel6A-sellobiohydrolaaseja käytettäviksi biopolttoaine- ja muissa S sovelluksissa. Sieniperäisiä CBHII/Cel6A-sellobiohydrolaaseja voidaan valmistaa o runsastuottoisissa sieni-isännissä jälkikäsittelyn kanssa tai ilman - esim. fermentaatioliemen ja sienirihmastojen erotus on helppoa suorittaa - tai fermentoivissa organismeissa.
17 Tässä käytettynä "selluloosa" tai “selluloosamateriaali" tarkoittaa mitä tahansa materiaalia, joka käsittää selluloosaa merkittävänä aineosana. Selluloosa on korkeampien kasvien pääasiallinen rakennekomponentti. Se antaa kasvisoluille korkean vetolujuuden ja auttaa niitä kestämään mekaanista rasitusta ja osmoottista painetta. Selluloosa on β-1,4-glukaani, joka koostuu glukoosijäännösten muodostamista lineaarisista ketjuista, joita liittävät yhteen β-1,4-glykosidisidokset. Sellobioosi on selluloosan pienin toistuva yksikkö. Esimerkkeihin selluloosamateriaalista sisältyvät tekstiilikuidut, jotka on saatu esim. puuvillasta, pellavasta, hampusta tai juutista, sekä ihmisen valmistamat selluloosakuidut kuten modaali, viskoosi ja lyocell.
Termit "selluloosa" tai “selluloosamateriaali" viittaavat myös “lignoselluloosaan” tai “lignoselluloosamateriaaliin”, jotka käsittävät selluloosaa merkittävänä aineosana.
Soluseinissä selluloosa on pakattu eri tavoin suuntautuneisiin levyihin, jotka ovat upotettuina matriksiin, jonka muodostavat hemiselluloosa, pektiini ja/tai fenoli-propanoliyksikköjä käsittävät polymeerit kuten ligniini, niin että muodostuu “lignoselluloosamateriaalia” tai “lignoselluloosaa”. Lignoselluloosa on aineena kova, tiivis ja vaikeasti muunnettava. Lignoselluloosaa sisältäviin materiaaleihin sisältyvät esim. kasviainekset kuten puu, mukaan lukien lehtipuu ja havupuu, lehti- ja havupuuhake, puumassa, sahajauho sekä metsäalan ja puuteollisuuden jätteet; ruohokasvit, maatalousbiomassa kuten viljakasvien korret, sokerijuurikasleike, maissikuitu, maissin varret ja tähkät, viljaperäiset beetaglukaanit, sokeriruokojäte, varret, lehdet, palot, kuoret ja vastaavat; jätetuotteet kuten kiinteä yhdyskuntajäte, sanomalehtipaperi ja jätetoimistopaperi, jätekuitu, paperiliete, jauhatusjäte cm esim. jyvistä; erityiset energiakasvit (esim. paju, poppeli, lännenhirssi tai ruokohelpi ja cm vastaavat).
i tn o i § Selluloosa- ja lignoselluloosamateriaalia hajottaa luonnossa joukko erilaisia organismeja, mukaan lukien bakteerit ja sienet, jotka tuottavat hiilihydraattipolymeerejä hajottamaan Q_ ^ kykeneviä entsyymejä. Hajotus edellyttää yleensä useiden entsyymien toimintaa, jotka S tyypillisesti vaikuttavat peräkkäin tai samanaikaisesti. Selluloosan biologinen muuntaminen 05 § glukoosiksi edellyttää yleensä kolmea pääasiallista tyyppiä hydrolyyttisiä entsyymejä: (1)
CM
endoglukanaaseja (EG), jotka katkaisevat sisäiset beeta-1,4-glykosidisidokset pääasiassa 18 selluloosan amorfisilla alueilla, (2) eksoglukanaaseja tai sellobiohydrolaaseja (CBH), jotka katkaisevat disakkaridi-sellobioosin kiteisen selluloosapolymeeriketjun pelkistävästä tai ei-pelkistävästä päästä, (3) beeta-1,4-glukosidaaseja (BG), jotka hydrolysoivat sellobioosin ja muut sello-oligosakkaridit glukoosiksi. Glukoosi ja sellobioosi toimivat hydrolyysireaktion lopputuote-inhibiittoreina.
“Sellulaasi” tai “sellulolyyttinen entsyymi” on entsyymi, jolla on "sellulaasiaktiivisuutta'' tai “sellulolyyttistä aktiivisuutta”, mikä tarkoittaa, että ne kykenevät hydrolysoimaan selluloosamateriaalia. Eräs eniten tutkituista sellulolyyttisistä entsyymijärjestelmistä on rihmasienestä Trichoderma reesei, jolla tiedetään olevan vähintään 2 CBH:a, 8 EG:a ja 5 BG:a.
“Lignosellulolyyttiset entsyymit” ovat entsyymejä, joilla on “lignosellulaasiaktiivisuutta” tai "lignosellulolyyttistä aktiivisuutta”, mikä tarkoittaa, että ne kykenevät hydrolysoimaan lignoselluloosamateriaalia kuten selluloosaa, hemiselluloosaa tai niiden johdannaisia pienemmiksi sakkarideiksi.
“Beetaglukaanit” ovat sekasidoksisia (1 —>3),( 1 -^4)-bccta-D-glukaancja. Ne ovat tavanomaisia esim. viljakasveissa.
“Beetaglukanaasi” tarkoittaa tässä käytettynä entsyymejä, jotka voivat pilkkoa ainakin osittain beetaglukaanin sidokset.
c\i “Sellobiohydrolaasi” tai “CBH” tarkoittaa tässä käytettynä entsyymejä, jotka voivat pilkkoa cv sellaisten polymeerien kuten selluloosan 1,4-beeta-D-glukosidisidokset pelkistävistä tai βίο pelkistävistä päistä ja aikaansaavat pääsiassa sellobioosia. Niitä kutsutaan myös o eksoglukanaaseiksi tai 1,4-beeta-D-glukaani-sellobiohydrolaaseiksi tai selluloosa-1,4-beeta- ir sellobiosidaaseiksi. CBH:illa on modulaarinen rakenne, joka koostuu erillisistä domeeneista,
CL
^ kuten katalyyttisesta domeenista ja N- tai C-terminaalisesta selluloosaa sitovasta domeenista 2 (CBD, cellulose-binding domain). Luonnossa esiintyy myös sellobiohydrolaaseja, joilta σ> § puuttuu CBD. CBD:issä voi myös olla lisädomeeneja, joiden tehtävää ei tunneta. Eri cv 19 domeenit liittää yleensä yhteen O-glykosyloitu linkkeri tai saranapeptidi, joka sisältää runsaasti glysiiniä, proliinia, seriiniä tai treoniinia.
Termillä “sellobiohydrolaasi II” tai “CBHII-sellobiohydrolaasi” tai “CBHII/Cel6A-sellobiohydrolaasi” tai “CBHII/Cel6A-sellulaasi” tai “CBHII/Cel6A-polypeptidi” tai “CBHII/Cel6A-entsyymi” tarkoitetaan tämän keksinnön yhteydessä 1,4-β-ϋ-glukaanisellobiohydrolaasientsyymiä, joka saa luokituksen EC 3.2.1.91 kansainvälisen biokemian ja molekyylibiologian liiton IUBMBrn (International Union of Biochemistry and Molecular Biology, ks. http://www.inbmb.org) nimistön mukaan. Perustuen niiden rakenteellisiin samankaltaisuuksiin, esillä olevan keksinnön sellobiohydrolaasit II tai CBHII/Cel6A-sellobiohydrolaasit luokitellaan glykosyylihydrolaasien perheeseen 6 (GH6), ja niillä on samankaltaiset aminohapposekvenssit sekä kolmiulotteiset rakenteet (Henrissat 1991; Henrissat ja Bairoch 1993, 1996; Henrissat et ai. 1998; ks. myös http://www.cazy.org/,fam/GH6.htmj). Koska sekvenssi- ja laskostumissamankaltaisuuksien välillä on olemassa selvä suhde, tällaisen luokittelun uskotaan heijastavan entsyymien rakennepiirteitä paremmin kuin niiden pelkän substraattispesifisyyden, auttavan paljastamaan entsyymien väliset evolutiiviset suhteet sekä toimivan käyttökelpoisena työkaluna mekanistisen tiedon tuottamiselle.
Keksinnössä käytettynä termillä “sellobiohydrolaasiaktiivisiiiis” tai ”CBH-aktiivisuus” tarkoitetaan hydrolyyttistä aktiivisuutta, joka vaikuttaa 1,4-beeta-D-glykosidisidoksiin selluloosassa, sellotrioosissa, sellotetraoosissa tai missä tahansa beeta-1,4-linkittyneessä glukoosipolymeerissä, vapauttaen ensi sijassa sellobioosia polymeeriketjun pelkistävästä tai cm ei-pelkistävästä päästä. Glykosidisidoksen entsymaattinen hajoaminen on stereoselektiivinen ° prosessi, jossa konfiguraatio anomeerisen keskuksen (Cl-hiili) ympäri voi joko muodostua o käänteiseksi tai säilyä ennallaan. Molemmat mekanismit sisältävät sen, että sidoksen o molemmin puolin sijaitseva pari karboksyylihappojäännöksiä lohkaistaan pois. Invertoivat
Ee entsyymit hyödyntävät yhden korvauksen mekanismia, kun taas ennallaan pitäviin Q_ entsyymeihin liittyy kahden korvauksen reaktio (Sinnott, 1990; Withers ja Aebersold, 1995). ^ Hydrolyysin stereokemiallinen kulkusuunta määritetään yleensä protoni-NMR:lla, jossa a- ja 05 § β-anomeeriset protonit antavat erilaiset kemialliset siirtymät (Withers et ai., 1986).
CM
20
Keksinnössä käytettynä termillä “sellobiohydrolaasi II -aktiivisuus” tai “CBHII/Cel6A-aktiivisuus” tarkoitetaan hydrolyyttistä aktiivisuutta, joka vaikuttaa 1,4-beeta-D-glykosidisidoksiin selluloosassa, sellotrioosissa, sellotetraoosissa tai missä tahansa beeta-1,4-linkittyneessä glukoosipolymeerissä, vapauttaen ensi sijassa sellobioosia polymeeriketjun pelkistävästä tai ei-pelkistävästä päästä. CBHII/Cel6A-sellobiohydrolaasien reaktiomekanismi on invertoiva.
Menetelmät sellulaasiaktiivisuuden analysoimiseksi ovat kirjallisuudessa hyvin tunnettuja, ja niihin ovat viitanneet esim. Ghose (1987), Tomme et ai. (1988) ja van Tilbeurgh et ai. (1988).
Kokonaissellulaasiaktiivisuutta mitataan tavallisesti suodatinpaperia hajottavana aktiivisuutena (FPU, filter paper-degrading activity). Sellobiohydrolaasiaktiivisuutta voidaan analysoida käyttäen pieniä, liukoisia sellodekstriinejä ja niiden kromogeenisiä glykosideja, kuten 4-metyyliumbelliferyyli-beeta-D-glykosideja. CBHII/Cel6A-sellobiohydrolaasit voidaan identifioida perustuen hydrolyysireaktion lopputulokseen; CBHII/Cel6A-entsyymit eivät kykene katkaisemaan pienten kromogeenisten oligosakkararidien heterosidisidosta (van Tilbeurgh et ai., 1988). Sellobiohydrolaasiaktiivisuutta voidaan analysoida myös mikrokiteisellä selluloosalla kuten Avicel Ph 101, kuten on käytetty esimerkissä 3. Liukoisten pelkistävien sokereiden muodostuminen hydro lyysin jälkeen voidaan määrittää parahydroksibentsoehappohydratsidi-menetelmällä (PAHBAH-menetelmällä) (Lever, 1972) käyttäen sellobioosi-standardikäyrää, Somogyi-Nelson-menetelmällä (Somogyi, 1952), emäksisellä ferrisyanidimenetelmällä (Robyt ja Whelan, 1972), 2,2’-bikinkoninaatti- menetelmällä (Waffenschmidt ja Jaenicke, 1987) tai dinitrosalisyylihappomenetelmällä (DNS-menetelmällä), jonka on esittänyt Miller (1959). Muihin selluloosasubstraatteihin c\j sisältyvät esim. Solka-Floc-selluloosa tai fosforihapolla turvotettu selluloosa (Karlsson et ai., 2001).
i tn o
Sellobiohydrolaasi II voidaan identifioida myös Western- tai ELISA-määrityksellä käyttäen o x puhdistettua CBHII/CelöA-proteiinia vastaan tuotettuja polyklonaalisia tai monoklonaalisia tr vasta-aineita.
CM
CD
05
O
O
CM
21
Termi “CBHII/Cel6A-sellobiohydrolaasi” tarkoittaa näin ollen glykosyylihydrolaasien perheen 6 sellobiohydrolaasi II -entsyymejä, joilla on sekä konservoitunut laskos että hydrolyysireaktion stereokemia.
Termi “kohtalainen lämpötila” tai “tavanomainen lämpötila” tarkoittaa esillä olevan keksinnön yhteydessä lämpötiloja, joita tavanomaisesti käytetään selluloosan hydrolyysissä ja jotka vastaavat tällaisissa prosesseissa käytettyjen entsyymien optimilämpötiloja tai lämmönkestävyyksiä. Näin ollen termit tarkoittavat lämpötila-alueita 3 CM-5 °C.
Termillä “korotettu lämpötila” tai “korkea lämpötila” tarkoitetaan 45-70 °C olevaa lämpötila-aluetta. Lyhytkestoisissa hydrolyysiprosesseissa entsyymit voivat olla tehokkaita jopa 80 °C:ssa. Sellaisia entsyymejä, jotka ovat aktiivisia tai stabiileja korotetuilla lämpötila-alueilla, kutsutaan myös “lämmönkestäviksi" tai “termofiilisiksi” entsyymeiksi.
Mikro-organismikantoja, jotka kykenevät tuottamaan CBHII/Cel6A-sellobiohydrolaasipolypeptidiä tai CBHII/Cel6A-sellobiohydrolaasiaktiivisuutta, voidaan seuloa erilaisilla substraateilla. Ensin valittuja kantoja viljellään sopivassa elatusaineessa. Sen jälkeen, kun riittävä määrä kiinnostavia sellobiohydrolaaseja on valmistettu, entsyymi voidaan eristää tai puhdistaa ja sen ominaisuudet voidaan määrittää perinpohjaisemmin. Vaihtoehtoisesti eri organismeissa olevia sellobiohydrolaaseja tai CBHII/Cel6A-sellobiohydrolaaseja koodaavia geenejä voidaan eristää ja geenien koodaamaa aminohapposekvenssiä voidaan verrata esimerkissä 1 eristettyjen ja karakterisoitujen CBHII/Cel6A-sellobiohydrolaasien aminohapposekvensseihin.
C\J
cm Tuotetut sellobiohydrolaasientsyymit, erityisesti CBHII/Cel6A-sellobiohydrolaasientsyymit, o voidaan puhdistaa käyttämällä tavanomaisia entsyymikemiallisia menetelmiä, kuten suolan o valmistus, ultrasuodatus, ioninvaihtokromatografia, affiniteettikromatografia, geelisuodatus ja
Ee hydrofobinen vuorovaikutus -kromatogafia. Puhdistusta voidaan seurata proteiinien Q_ määrityksellä, entsyymiaktiivisuusmäärityksillä ja SDS- ^ polyakryyliamidigeelielektroforeesilla. Puhdistetun entsyymin entsyymiaktiivisuus eri σ> § lämpötiloissa ja pH-arvoissa sekä sen molekyylimassa ja isoelektrinen piste voidaan
CM
määrittää. Vaihtoehtoisesti keksinnön CBHII/Cel6A-sellobiohydrolaasien ominaisuudet 22 voidaan määritellä valmistamalla entsyymejä rekombinanttisessa isännässä ja puhdistamalla ja karakterisoimalla rekombinanttinen CBHII/Cel6A-sellobiohydrolaasientsyymi. Myös keksinnön CBHII/Cel6A-sellobiohydrolaasia yhtenä pääasiallisena entsyymiaineosana käsittävän rekombinanttisen entsyymivalmisteen omaisuudet voidaan karakterisoida esimerkissä 3 kuvatulla tavalla.
Puhdistetun CBHII/Cel6A-sellobiohydrolaasin molekyylimassa voidaan määrittää massaspektrometrisesti tai SDS-PAGE:lla tavalla, jonka on esittänyt Laemmli (1970). Molekyylimassa voidaan myös ennustaa entsyymin aminohapposekvenssistä käyttäen pI/MW-työkalua ExPASy-palvelimella (http://expasy\or&,toois/pi_tool.html.: Gasteiger et ai., 2003).
CBHII/CelöA-sellobiohydrolaasin lämpötilariippuvaisuus tai termostabiilisuus voidaan määrittää soveltuvassa puskurissa eri lämpötiloissa käyttäen esimerkiksi Avicel-selluloosaa substraattina esimerkissä 3 kuvatulla tavalla tai käyttäen muita kirjallisuudessa kuvattuja substraatteja ja puskurijärjestelmiä. pH-riippuvuuden ja pH-stabiilisuuden määritys voidaan suorittaa soveltuvassa puskurissa eri pH-arvoissa seuraamalla aktiivisuutta selluloosasubstraatilla.
pl voidaan määrittää isoelektrisellä fokusoinnilla immobilisoidulla pH-gradienttigeelillä, joka koostuu polyakryyliamidista, tärkkelyksestä tai agaroosista, tai arvioimalla pl aminohapposekvenssistä, esimerkiksi käyttämällä pI/MW-työkalua ExPASy-palvelimella flittp.vyexBasv.org/tools/m tooLhtml: Gasteiger et ai, 2003).
OJ
^ Puhdistetun rekombinanttisen CBHII/Cel6A-entsyymin N-pää sekä sisäiset peptidit voidaan i o sekvensoida Edmanin hajotuskemian mukaan (Edman ja Begg, 1967) tai ennustamalla i o erityssignaaliseksivenssin katkaisukohta aminohapposekvenssistä esim. käyttämällä ohjelmaa
Ee SignalP V3.0 (Nielsen et ai, 1997; Nielsen ja Krogh, 1998; Bendtsen et ai., 2004) kuten Q_ ^ esimerkissä 1 on kuvattu, tai muilla kirjallisuudessa kuvatuilla menetelmillä, co § Termi “täyspitkä” tarkoittaa entsyymin muotoa, joka on translaation avulla muodostettu
CM
koodaavasta DNA-sekvenssistä, alkaen aloituskodonista ATG, joka koodaa 23 aminohapposekvenssin ensimmäisen metioniinin, ja päättyen lopetuskodoniin TGA, TAG tai TAA.
Termi “kypsä” tarkoittaa sellaista entsyymin muotoa, joka signaalisekvenssin (erittymisen signaalipeptidi tai prepeptidi) poistamisen jälkeen käsittää entsymaattisen tai katalyyttisen aktiivisuuden kannalta välttämättömät aminohapot. Rihmasienissä tämä on se muoto, joka eritetään elatusaineeseen seurauksena esimerkiksi signaalisekvenssin N-terminaalisesta prosessoinnista ja muusta N-terminaalisesta prosessoinnista sekä post-translationaalisesta glykosylaatiosta. Lisäksi kypsä muoto tarkoittaa entsyymiä, joka on lohkaistu sen kantaj aproteiinista fuusiokonstrukteissa.
Monet bakteeri- ja sieniperäisistä sellobiohydrolaaseista valmistetaan modulaarisina entsyymeinä (Srisodsuk et ah, 1993; Suurnäkki et ai., 2000). Sellulolyyttistä aktiivisuutta ilmentävän katalyyttisen tai ydindomeenin lisäksi nämä entsyymit voivat käsittää yhden tai useampia selloloosaa sitovia domeeneja (CBD:itä), joita kutsutaan myös hiilihydraattia sitoviksi domeeneiksi/moduuleiksi (CBD/CBM, carbohydrate binding domain/module), jotka voivat sijaita joko katalyyttisen domeenin N- tai C-päässä. CBD:illä on hiilihydraattia sitovaa aktiivisuutta, ja ne välittävät sellulaasientsyymin sitoutumista kiteiseen selluloosaan, mutta niillä on vain vähän tai ei lainkaan vaikutusta entsyymin sellulaasihydrolyyttiseen aktiivisuuteen liukoisilla substraateilla. Nämä kaksi domeenia kytkeytyvät toisiinsa tyypillisesti joustavan ja runsaasti glykosyloituneen linkkerin tai sarana-alueen välityksellä, kuten on ilmeistä aminohapposekvensseistä nro 12, nro 14, nro 15 ja nro 16.
Keksinnössä käytettynä “fragmentti” tarkoittaa polypeptidiä, josta puuttuu yksi tai useampi o aminohappojäännös N- tai C-päästä sekvenssin nro 12, sekvenssin nro 14, sekvenssin nro 15 ιό ja sekvenssin nro 16 täyspitkään polypeptidiin verrattuna, kuten polypeptidin kypsää muotoa cp ^ tai muuta polypeptidin aktiivista osaa. Fragmentilla on edelleen täyspitkän CBHII/Cel6A-
O
x sellobiohydrolaasin keskeinen katalyyttinen aktiivisuus tai sellobiohydrolaasiaktiivisuus ja oleellisesti samankaltaiset ominaisuudet, kuten pH- ja lämpötilariippuvuus, stabiilisuus ja
CM
^ substraattispesifisyys. Sekvensseissä nro 12, nro 14, nro 15 ja nro 16 esitetyt keksinnön cp § polypeptidit sisältävät luontaisesti N-terminaalisen CBD:n ja linkkerin. Nämä luontaiset o ^ linkkeri- tai CBD-alueet voidaan korvata esim. Trichoderma- tai Chaetomium-lajista peräisin 24 olevalla CBD:llä. Keksinnön CBHII/Cel6A-entsyymejä voidaan käyttää sovelluksissa myös ilman signaalisekvenssiä ja/tai CBD:a, tai signaalisekvenssi ja/tai CBD voidaan saada edellä mainittujen mikro-organismien eri entsyymeistä tai eri mikro-organismeista tai ne voidaan sisällyttää synteettisesti tai rekombinanttisesti edellä mainittujen entsyymien katalyyttiseen domeeniin.
Termillä “identtisyys” tarkoitetaan tässä identtisyyttä kahden aminohapposekvenssin välillä verrattaessa niitä toisiinsa vastaavalla sekvenssialueella, jossa on suurin piirtein sama määrä aminohappoja. Voidaan esimerkiksi verrata kahden aminohapposekvenssin täyspitkän tai kypsän sekvenssin identtisyyttä. Lisäksi voidaan verrata kahden aminohapposekvenssin täyspitkän tai kypsän sekvenssin, joista puuttuu N-terminaalinen CBD, identtisyyttä. Näin ollen keksintöön ei sisälly esim. CBHII/CelöA-sekvenssien, jotka sisältävät CBD:n ja/tai signaalisekvenssit, vertailu sekvensseihin, joista nämä elementit puuttuvat. Täyspitkien sekvenssien identtisyys voidaan määrittää käyttäen esimerkiksi ClustalW-rinnastusta (esim. www.ebi,ac,uk/Toois/Ciustalw) seuraavalla matriisilla: BLOSUM, aukon muodostus: 10, aukon laajennus: 0,5, tai käyttäen Clone Managerin (versio 9) (Scientific and Educational Software, Cary, USA) ohjelmaa, joka sisältää toiminnot “Compare Two Sequences/Global/Compare sequences as amino acids/BLOSUM62 scoring matrix”, kuten on kuvattu esimerkissä 1.
Kahden verrattavan molekyylin aminohapposekvenssit voivat erota yhdessä tai useammassa asemassa, mikä ei kuitenkaan muuta molekyylien biologista funktiota tai rakennetta. Tällaisia “variantteja” voi esiintyä luonnollisesti johtuen eri isäntäorganismeista tai mutaatioista c\j aminohapposekvenssissä, esim. alleelisina variantteina samassa kannassa, lajissa tai suvussa, ° tai niitä voidaan aikaansaada spesifisellä mutageneesillä. Ne voivat käsittää aminohappojen o substituutioita, deleetioita, yhdistelmiä tai insertioita aminohapposekvenssin yhdessä tai o useammassa asemassa, mutta ne toimivat edelleen oleellisesti vastaavalla tavalla kuin
Ee sekvenssissä nro 12, sekvenssissä nro 14, sekvenssissä nro 15 ja sekvenssissä 16 määritellyt Q_ ^ entsyymit, toisin sanoen ne käsittävät variantin, jolla on sellulolyyttistä aktiivisuutta.
sj-
CD
O) § Esillä oleva keksintö koskee menetelmää selluloosamateriaalin, sisältäen myös lignoselluloosamateriaalin, käsittelemiseksi CBHII/Cel6A-polypeptidillä tai mainittua 25 polypeptidiä käsittävällä entsyymikoostumuksella, jossa CBHII/Cel6A-polypeptidillä on sellobiohydrolaasiaktiivisuutta ja se käsittää aminohapposekvenssin, joka on vähintään 76-prosenttisesti identtinen sekvenssin nro 12 täyspitkän polypeptidin kanssa, vähintään 76-prosenttisesti identtinen sekvenssin nro 14 täyspitkän polypeptidin kanssa, vähintään 95-prosenttisesti identtinen sekvenssin nro 15 täyspitkän polypeptidin kanssa tai vähintään 91-prosenttisesti identtinen sekvenssin nro 16 täyspitkän polypeptidin kanssa, tai näiden fragmentin tai variantin, jolla on vastaavia ominaisuuksia. Mainittu entsyymi kykenee hydrolysoimaan selluloosamateriaalia, mukaan lukien lignoselluloosaa, kohtalaisesta korotettuihin olevissa lämpötiloissa. Mainittu menetelmä käsittää seuraavat vaiheet: i) keksinnön CBHII/Cel6A-polypeptidin tai mainittua polypeptidiä käsittävän entsyymikoostumuksen valmistus; ii) selluloosamateriaalin saattaminen reagoimaan keksinnön CBHII/Cel6A-polypeptidin tai mainittua polypeptidiä käsittävän entsyymikoostumuksen kanssa; ja iii) osittain tai täysin hydrolysoidun selluloosamateriaalin, mukaan lukien hydrolysoidun lignoselluloosamateriaalin, talteen ottaminen.
CBHII/Cel6A-sellobiohydrolaasientsyymit, jotka ovat käyttökelpoisia selluloosamateriaalin käsittelyssä tai hydrolysoimisessa, ovat ’’saatavissa” mistä tahansa organismista, kasvit mukaan lukien. Edullisesti CBHII/Cel6A-entsyymit ovat peräisin mikro-organismeista, esim. bakteereista tai sienistä. Bakteerit voivat olla esimerkiksi suvusta, joka on valittu suvuista Bacillus, Azospirillum, Streptomyces ja Pseudomonas. Edullisemmin entsyymi on peräisin sienistä (mukaan lukien rihmasienet ja hiivat), esimerkiksi suvusta, joka on valittu ryhmästä, johon sisältyvät hiivat Schizosaccharomyces, Kluyveromyces, Pichia, Saccharomyces, Candida ja Yarrowia tai rihmasienet Achaetomium, Acremonium, Aspergillus, cvj Aureobasidium, Botrytis, Chaetomium, Chrysosporium, Cryptococcus, Collybia, Fomes, cm Fusarium, Humicola, Hypocrea, Lentinus, Magnaporthea, Melanocarpus, Mucor, o Myceliophthora, Myriococcum, Neocallimastix, Neurospora, Paecilomyces, Penicillium, o Phanerochaete, Phlebia, Pleurotus, Podospora, Polyporus, Pycnoporus, Rhizoctonia,
Schizophyllum, Scytalidium, Talaromyces, Thermoascus, Thielavia, Trametes ja Trichoderma.
CL
^ Edullisesti CBHII/Cel6A-entsyymit ovat peräisin lajista Acremonium thermophilum, ^ Melanocarpus albomyces, Chaetomium thermophilum tai Talaromyces emersonii.
CD
O
O
CVJ
26
Keksinnön edullisen suoritusmuodon mukaisesti entsyymit ovat saatavissa rihmasienikannasta ALK04245, jolla on talletusnumero CBS 116240 ja joka tällä hetkellä luokitellaan lajiksi Acremonium thermophilium, Melanocarpus albomyces -kannasta ALK04237, jolla on talletusnumero CBS 685.95, Talaromyces emersonii -kannasta DSM 2432 (hakijan viljelmäkokoelman numero RF8069) tai Chaetomium thermophilum -kannasta ALK04265, jolla on talletusnumero CBS 730.95.
Esillä olevan keksinnön CBHII/Cel6A-sellobiohydrolaaseja on merkitty tunnuksilla ^t_ALK04245_Cel6A, Ma_ALK04237_Cel6A, Ct_ALK04265_Cel6A ja 7e_RF8069_Cel6A, ja nämä ovat CBHII/Cel6A-sellobiohydrolaaseja, jotka ovat peräisin kannoista Acremonium thermophilum CBS 116240, Melanocarpus albomyces CBS 685.95, Chaetomium thermophilum CBS 730.95 tai Talaromyces emersonii DSM 2432, sekä glykosidihydrolaasien perheen 6 jäseniä.
Taulukko 1: Keksinnön CBHII/Cel6A-sellobiohydrolaasit
Sellobio- Geeni Saatavissa Nukleiini- Amino- hydrolaasi II lajista happo- happo- sekvenssi sekvenssi ____nro__nro_ /4/_ALK04245_ ylf_ALK04245_ Acremonium 11 12
CelöA cel6A thermophilum
Afa_ALK04237_ A/a_ALK04237_ Melanocarpus 13 14
Cel6A cel6 A albomyces c\j o , C/_ALK04265_ C/_ALK04265_ Chaetomium 9 15 o Cel6A cel6A__thermophilum _ sr ° 7e_RF8069_ 7e_RF8069_ Talaromyces 10 16 jr Cel6A cel6A emersonii CL I_I-1-1-1-1-1
C\J
5 Keksinnön edullisen suoritusmuodon mukaisesti menetelmässä käyttökelpoinen sieniperäinen o CBHII/Cel6A-sellobiohydrolaasientsyymi on polypeptidi, jolla on ^ sellobiohydrolaasiaktiivisuutta ja joka käsittää A/_ALK04245_Ccl6A-cntsyymin, jolla on 27 sekvenssissä nro 12 esitetty täyspitkä aminohapposekvenssi tai aminohapposekvenssi, joka on vähintään 76-prosenttisesti identtinen sekvenssin nro 12 aminohapposekvenssin kanssa. Edulliset entsyymit ovat vähintään 78-, 80-, tai 82-prosenttisesti, edullisesti vähintään 84-, 86-tai 88-prosenttisesti, edullisemmin vähintään 90-prosenttisesti ja tätäkin edullisemmin vähintään 92-prosenttisesti identtisiä. Vieläkin edullisemmin aminohapposekvenssit ovat vähintään 94-prosenttisesti tai vähintään 96- tai 97-prosenttisesti, edullisemmin vähintään 98-prosenttisesti, edullisimmin 99-prosenttisesti identtisiä sekvenssin nro 12 aminohapposekvenssin kanssa. Kahden entsyymin identtisyyksiä verrataan vastaavilla sekvenssialueilla, eli CBHII/Cel6A-sellobiohydrolaasin täyspitkällä alueella.
Eräs toinen keksinnön edullinen suoritusmuoto on menetelmässä käyttökelpoinen sieniperäinen CBHII/Cel6A-sellobiohydrolaasientsyymi, jolla on sellobiohydrolaasiaktiivisuutta ja joka käsittää Ma_ALK04237_Cel6A-entsyymin, jolla on sekvenssissä nro 14 esitetty täyspitkä aminohapposekvenssi tai aminohapposekvenssi, joka on vähintään 76-prosenttisesti identtinen sekvenssin nro 14 aminohapposekvenssin kanssa. Edulliset entsyymit ovat vähintään 78-, 80-, tai 82-prosenttisesti, edullisesti vähintään 84-, 86-tai 88-prosenttisesti, edullisemmin vähintään 90-prosenttisesti ja tätäkin edullisemmin vähintään 92-prosenttisesti identtisiä. Vieläkin edullisemmin aminohapposekvenssit ovat vähintään 94-prosenttisesti tai vähintään 96- tai 97-prosenttisesti, edullisemmin vähintään 98-prosenttisesti, edullisimmin 99-prosenttisesti identtisiä sekvenssin nro 14 aminohapposekvenssin kanssa. Kahden entsyymin identtisyyksiä verrataan vastaavilla sekvenssialueilla, eli CBHII/Cel6A-sellobiohydrolaasin täyspitkällä alueella.
c\j Eräs toinen keksinnön edullinen suoritusmuoto on menetelmässä käyttökelpoinen cm sieniperäinen CBHII/Cel6A-sellobiohydrolaasientsyymi, jolla on i o sellobiohydrolaasiaktiivisuutta ja joka käsittää C/_ALK04265_Cel6A-entsyymin, jolla on i o sekvenssissä nro 15 esitetty täyspitkä aminohapposekvenssi tai aminohapposekvenssi, joka on vähintään 95-prosenttisesti identtinen sekvenssin nro 15 aminohapposekvenssin kanssa.
Q_ ^ Edulliset entsyymit ovat vähintään 96-prosenttisesti, edullisesti vähintään 97-prosenttisesti, ^ edullisemmin vähintään 98-prosenttisesti ja edullisimmin vähintään 99-prosenttisesti
CD
§ identtisiä sekvenssin nro 15 aminohapposekvenssin kanssa. Kahden entsyymin identtisyyksiä
CM
28 verrataan vastaavilla sekvenssialueilla, eli CBHII/Cel6A-sellobiohydrolaasin täyspitkällä alueella.
Eräs toinen keksinnön edullinen suoritusmuoto on menetelmässä käyttökelpoinen sieniperäinen CBHII/Cel6A-sellobiohydrolaasientsyymi, jolla on sellobiohydrolaasiaktiivisuutta ja joka käsittää re_RF8069_Cel6A-entsyymin, jolla on sekvenssissä nro 16 esitetty täyspitkä aminohapposekvenssi tai aminohapposekvenssi, joka on vähintään 91-prosenttisesti identtinen sekvenssin nro 16 aminohapposekvenssin kanssa. Edulliset entsyymit ovat vähintään 92-prosenttisesti, edullisemmin vähintään 93-prosenttisesti ja tätäkin edullisemmin vähintään 94-prosenttisesti identtisiä. Vieläkin edullisemmin aminohapposekvenssit ovat vähintään 95- tai vähintään 96- tai 97-prosenttisesti, edullisemmin vähintään 98-prosenttisesti, edullisimmin 99-prosenttisesti identtisiä sekvenssin nro 16 aminohapposekvenssin kanssa. Kahden entsyymin identtisyyksiä verrataan vastaavilla sekvenssialueilla, eli CBHII/Cel6A-scllobiohydrolaasin täyspitkällä alueella.
Keksinnön sieniperäiset CBHII/Cel6A-sellobiohydrolaasit ovat aktiivisia tai stabiileja laajalla pH-alueella, joka on vähintään pH 3-10, ja edullisemmin pH-alueella, joka on vähintään pH 3-7, määritettynä 50 °C:ssa 21 tunnin ajan käyttäen Avicel-selluloosaa substraattina, kuten esimerkissä 3 on kuvattu.
Erityisesti 4/_ALK04245_Cel6A on aktiivinen pH:ssa 3-7, edullisesti pH:ssa 4-6, ja edullisemmin pH:ssa 4-5. At_ALK04245_Ccl6A:n maksimiaktiivisuus esiintyy pH:ssa 5 määritettynä 50 °C:ssa 21 tunnin ajan käyttäen Avicel-selluloosaa substraattina.
C\J
cm Ma_ALK04237_Cel6A on aktiivinen pH-alueella 3-10, edullisesti pH:ssa 4-8, edullisemmin i o pH:ssa 4-7, vielä edullisemmin pH:ssa 4-6, ja vieläkin edullisemmin pH:ssa 4-5.
i § Ma_ALK04237_Cel6A:n maksimiaktiivisuus esiintyy pH:ssa 4 määritettynä 50 °C:ssa g 21 tunnin ajan käyttäen Avicel-selluloosaa substraattina.
□_
C\J
^ Q_ALK04265_Cel6A on aktiivinen pH-alueella 3-10, edullisesti pH:ssa 3-8, edullisemmin
CD
§ pH:ssa 3-7, vielä edullisemmin pH:ssa 4-7, ja vieläkin edullisemmin pH:ssa 4-6.
CM
29 Q_ALK04265 Ccl6A:n maksimiaktiivisuus esiintyy pH:ssa 5 määritettynä 50 °C:ssa 21 tunnin ajan käyttäen Avicel-selluloosaa substraattina.
7e_RF8089_Cel6A on aktiivinen pH-alueella 3-7, edullisesti pH:ssa 3-6, ja edullisemmin pH:ssa 4-6. 7h_RF8089_Cel6A:n maksimiaktiivisuus esiintyy pH:ssa 4 määritettynä 50 °C:ssa 21 tunnin ajan käyttäen Avicel-selluloosaa substraattina.
Keksinnön entsyymit ovat tehokkaita selluloosa- tai lignoselluloosamateriaalin hajottamisessa laajalla lämpötila-alueella. Keksinnön CBHII/Cel6A-sellobiohydrolaasit ovat aktiivisia tai stabiileja jopa 21 tunnin ajan laajalla lämpötila-alueella 40-70 °C määritettynä entsyymien optimaalisessa pH-arvossa käyttäen Avicel-selluloosaa substraattina, kuten esimerkissä 3 on kuvattu.
^4t_ALK04245_Cel6A-sellobiohydrolaasi on aktiivinen välillä 40-70 °C, edullisesti välillä 40-60 °C, edullisemmin välillä 50-60 °C. Optimaalisessa pH:ssa ^/ ALK04245 Cel6A:n maksimiaktiivisuus esiintyy 60 °C:ssa käytettäessä 21 tunnin inkubaatioaikaa ja Avicel-selluloosaa substraattina.
Ma_ALK04237_Cel6A-sellobiohydrolaasi on aktiivinen lämpötila-alueella 40-60 °C. Entsyymin maksimiaktiivisuus esiintyy 50 °C:ssa inkuboituna 21 tunnin ajan optimaalisessa pH:ssa käyttäen Avicel-selluloosaa substraattina. C/_ALK04265 Ccl6A-sellobiohydrolaasi on aktiivinen lämpötila-alueella 40-70 °C, edullisesti alueella 50-60 °C. Optimaalisessa pH:ssa maksimiaktiivisuus esiintyy 60 °C:ssa käytettäessä 21 tunnin inkubaatioaikaa ja Avicel-selluloosaa substraattina. 7e_RF8089_Cel6A-sellobiohydrolaasi on aktiivinen välillä c\j 40-70 °C, edullisesti välillä 40-60 °C, edullisemmin välillä 50-60 °C. Maksimiaktiivisuus cv esiintyy 60 °C:ssa inkuboituna 21 tunnin ajan optimaalisessa pH:ssa käyttäen Avicel- o selluloosaa substraattina.
'St o a. Sellulolyyttiset entsyymit, joita tällä hetkellä käytetään selluloosamateriaalin hydrolyysissä ja Q_ ^ fermentoituvien sokerien tuotannossa esim. bioetanolisovelluksiin, ovat pääasiassa peräisin 2 hyvin tunnetuista mikro-organismeista, kuten rihmasienestä Trichoderma reesei (esim.
CD
§ Accellerase®-tuotesarja, Genencor Int., Inc., USA). Sellulolyyttisiä entsyymejä käytetään cv tavanomaisesti lämpötiloissa, jotka ovat alueella 30-45 °C. Esillä olevan keksinnön 30 CBHII/Cel6A-sellobiohydrolaasit ovat tehokkaita myös näissä lämpötiloissa, mutta sen lisäksi ne toimivat äärimmäisen hyvin myös lämpötiloissa, jotka ovat jopa 70 °C, kuten 40-70 °C, esim. 40-70 °C tai 40-60 °C tai 50-60 °C, kuten esimerkissä 3 on osoitettu. Käytettäessä lyhyitä hydrolyysiaikoja entsyymikoostumukset saattavat olla toimivia jopa 80 °C:ssa. Täydellistä hydrolyysia varten tarvitaan pidempiä inkubointiaikoja, ja tästä syystä yleensä käytetään alhaisempia lämpötiloja. Tämä tekee keksinnön CBHII/Cel6A-sellobiohydrolaaseista erinomaisen hyvin soveltuvia erilaisiin selluloosasubstraattien hydrolyysiprosesseihin, joita suoritetaan sekä tavanomaisissa tai kohtalaisissa lämpötiloissa että korotetuissa lämpötiloissa.
Esimerkeissä 4 ja 5 on kuvattu kokeita, jotka on suoritettu erilaisilla selluloosamateriaaleilla, kuten lehtipuulla ja maissintähkillä. Kuviosta 4 käy ilmi, että sieniperäisillä CBHII/Cel6A-sellobiohydrolaaseilla 4/_ALK04245_Ccl6A, Mz_ALK04237_Cel6A tai C7_ALK04265_Cel6A täydennettyjen entsyymiseosten tehokkuus höyryräjäytetyn lehtipuun hydrolyysissä on huomattavasti parempi kuin entsyymiseosten, joita ei ole täydennetty tällä tavoin. Kokeissa, jotka suoritettiin 55 °C:ssa (kuvio 4A), lehtipuusubstraatista vapautuneiden sokerien määrän havaittiin kasvavan 12 %, 14 % ja 26 %, kun SEOKSESSA 2 käytettiin täydennyksenä, vastaavassa järjestyksessä, entsyymiä Ma_ALK04237_Cel6A, C7_ALKO 4265_Ccl6A tai 4/_ALK04245_Cel6A. Kannan Acremonlum thennophilum ALK04245 entsyymin havaittiin olevan tehokkain tässä yhteydessä tutkittu CBHII/Cel6A. 4/_ALK04245_Ccl6A:lla havaittiin lisääntynyttä hydrolyysia myös 37 °C:ssa, kun sitä lisättiin joko tämänhetkistä huipputasoa edustavaan Trichoderma-scokseen (SEOS T. REESEIN ENTSYYMIT) (kuvio 4B) tai kaupalliseen tuotteeseen (SEOS ACC) OJ (kuvio 4C).
δ
(M
o Samanlaisia tuloksia saatiin myös höyryräjäytetyillä maissintähkillä (kuvio 5). Termofiilistä o entsyymi-SEOSTA 2 täydennettiin keksinnön ^/_ALK04245_Cel6A-entsyymillä. Yhdistetty ir glukoosin ja ksyloosin määrä 72 tunnin hydrolyysin jälkeen oli huomattavasti korkeampi kuin
CL
^ ilman tällaista täydennystä, co
CD
§ Keksinnön erään edullisen suoritusmuodon mukaan menetelmä selluloosa- ja
CM
lignoselluloosamateriaalin, kuten hemiselluloosaa, pektiiniä ja ligniiniä sisältävän 31 lignoselluloosamateriaalin, käsittelemiseksi sisältää yhden tai useamman keksinnön CBHII/Cel6A-sellobiohydrolaasin käytön “entsyymikoostumuksena” tai "entsyymivalmisteena", joka käsittää vähintään yhden lisäentsyymin, joka kykenee hydrolysoimaan mainittua materiaalia. Lisäentsyymit voidaan valita ryhmästä, johon sisältyvät sellobiohydrolaasi, endoglukanaasi, beeta-glukosidaasi, beeta-glukanaasi, ksyloglukanaasi, ksylanaasi, beeta-ksylosidaasi, mannanaasi, beeta-mannosidaasi, a-glukuronidaasi, asetyyliksylaaniesteraasi, a-arabinofuranosidaasi, a-galaktosidaasi, pektinaasi, käsittäen endo- ja ekso-a-L-arabinaasit, a-galaktosidaasi, endo- ja ekso-galaktoronaasi, endopektiinilyaasi, pektiiniesteraasi, pektaattilyaasi, fenoliesteraasi, ligninaasi käsittäen ligniiniperoksidaasin, mangaaniriippuvainen peroksidaasi, H2C>2:a generoiva entsyymi ja lakkaasi, mediaattorin kanssa tai ilman.
Entsyymivalmiste tai -koostumus käsittää vähintään yhtä edellä mainituista entsyymeistä. Se voi sisältää entsyymit vähintään osittain puhdistetussa ja eristetyssä muodossa. Se voi jopa olennaisesti koostua halutusta entsyymistä tai entsyymeistä. Vaihtoehtoisesti valmiste voi olla käytetty elatusaine tai suodos, joka sisältää yhtä tai useampaa haluttua entsyymiä. Edullisesti entsyymivalmiste on käytetty elatusaine. “Käytetty elatusaine” viittaa isännän elatusaineeseen, joka käsittää tuotetut entsyymit. Edullisesti isäntäsolut erotetaan mainitusta elatusaineesta tuotannon jälkeen. Entsyymivalmiste tai -koostumus voi myös olla “koko viljelylle mi", joka on saatu, valinnaisesti yhden tai useamman tuotanto isännän tai mikro-organismin tappamisen jälkeen, ilman minkäänlaista halutun sellulolyyttisen entsyymin tai haluttujen sellulolyyttisten entsyymien jatkokäsittelyä tai puhdistusta. “Konsolidoidussa bioprosessissa” entsyymikoostumuksen tai ainakin osan entsyymikoostumuksen cvj entsyymeistä voivat valmistaa fermentoivat mikro-organismit.
δ
CVJ
o “Eristetty polypeptidi” voi esillä olevassa yhteydessä tarkoittaa yksinkertaisesti sitä, että o solut ja solujäte on poistettu polypeptidin sisältävästä elatusaineesta. Tarkoituksenmukaisesti ir polypeptidit eristetään, esim. lisäämällä anionisia ja/tai kationisia polymeerejä käytettyyn
CL
elatusaineeseen, jotta voitaisiin tehostaa solujen, solujätteen ja joidenkin epätoivottuja ^ haittavaikutuksia aiheuttavien entsyymien saostumista. Sen jälkeen elatusaine suodatetaan σ> § käyttäen epäorgaanista suodatusainetta ja suodatinta muodostuneiden saostumien
CM
32 poistamiseksi. Tämän jälkeen suodosta käsitellään edelleen käyttäen puoliläpäisevää kalvoa ylimääräisten suolojen, sokereiden ja aineenvaihduntatuotteiden poistamiseksi.
Entsymaattisen aktiivisuuden lisäksi valmiste voi sisältää lisäaineita, kuten mediaattoreita, stabilointiaineita, puskuriaineita, säilöntäaineita, pinta-aktiivisia aineita ja/tai elatusaineen aineosia. Edullisia lisäaineita ovat sellaiset, joita käytetään tavanomaisesti entsyymivalmisteissa, jotka on tarkoitettu johonkin nimenomaiseen sovellukseen. Entsyymivalmiste voi olla nesteen, jauheen tai rakeiden muodossa.
Keksinnön erään suoritusmuodon mukaisesti entsyymivalmiste käsittää seoksen entsyymejä CBH, EG ja BG, valinnaisesti yhdessä hemiselluloosaa hajottavien entsyymien kanssa, yhdistettynä keksinnön CBHII/Cel6A-sellobiohydrolaaseihin. Voidaan käyttää erilaisia entsyymien seoksia ja yhdistelmiä, jotka soveltuvat eri substraattimateriaaleille ja erilaisiin prosessiolosuhteisiin. Esimerkiksi mikäli hajotusprosessi suoritetaan korkeassa lämpötilassa, valitaan lämmönkestävä entsyymi.
“Hemiselluloosa” on heterogeeninen joukko hiilihydraattipolymeereja, sisältäen pääasiassa erilaisia glukaaneja, ksylaaneja ja mannaaneja. Hemiselluloosa koostuu lineaarisesta rungosta, jossa on β-1,4-kytkeytyneitä jäännöksiä, jotka ovat substituoituneet lyhyillä sivuketjuilla, jotka tavallisesti sisältävät asetyylihappo-, 4-O-glukuronihappo-, L-arabinoosi- ja galaktosyyliryhmiä. Hemiselluloosa voi olla kemiallisesti ristisilloittunut ligniiniin ja selluloosaan. “Ksylaania hajottavat entsyymit” tai “ksylanaasit” sisältävät sekä eksohydrolyyttisiä että endohydrolyyttisiä entsyymejä, kuten endo-l,4-beeta-D-ksylanaasia cm (EC 3.2.1.8) tai ekso-l,4-beeta-D-ksyylosidaasia (EC 3.2.1.37), jotka hajottavat cm hemiselluloosaa ksyloosiksi. Endo-l,4-beeta-mannanaasit (EC3.2.1.78) ja beeta-mannosidaasi i o (EC 3.2.1.25) hydrolysoivat gluko- ja galaktomannaaneja, jolloin saadaan beeta-D- o mannoosia. Entsyymeihin, jotka kykenevät poistamaan sivuketjun substituentteja, sisältyvät
Er α-glukuronidaasit, asetyyliksylaaniesteraasit, α-arabinofuranosidaasit ja a-galaktosidaasit,
CL
^ jotka toimivat yhdessä runkoa hajottavien entsyymien kanssa (Biely et ai. 1997; Sundberg ja ^ Poutanen, 1991; Stälbrand et ah, 1995).
en o o
CM
33 “Pektiiniii” hajotukseen osallistuviin entsyymeihin sisältyvät endo-ja ekso-a-L-arabinaasit ja α-galaktosidaasi, endo- ja ekso-galaktoronaasit, endopektiinilyaasit ja pektiiniesteraasit (Del Canizo et ai, 1994).
“Ligniini” on kompleksinen ristisilloittunut polymeeri, jossa on eri tavalla substituoituneita p-hydroksifenyylipropaaniyksikköjä. Sen hydrolyysiin osallistuvat ligniiniperoksidaasit, fenoliesteraasit, mangaaniriippuvaiset peroksidaasit, H202:a generoivat entsyymit ja lakkaasit (Cullen ja Kersten, 2004).
Ensyymikoostumuksen entsyymejä voidaan lisätä lignoselluloosamateriaaliin joko samanaikaisesti tai peräkkäin.
Keksinnön erään edullisen suoritusmuodon mukaan menetelmä on sovellettavissa erilaisille selluloosaa, lignoselluloosaa ja beetaglukaania sisältäville materiaaleille, kuten kasviainekset, esim. puu, mukaan lukien lehtipuu ja havupuu, lehti- ja havupuuhake, puumassa, sahajauho sekä metsäalan ja puuteollisuuden jätteet; ruohokasvit, maatalousbiomassa kuten viljakasvien korret, sokerijuurikasleike, maissikuitu, maissin varret ja tähkät, viljaperäiset beetaglukaanit, sokeriruokojäte, varret, lehdet, palot, kuoret ja vastaavat; jätetuotteet kuten kiinteä yhdyskuntajäte, sanomalehtipaperi ja jätetoimistopaperi, jätekuitu, paperiliete, jauhatusjäte esim. jyvistä; erityiset energiakasvit (esim. paju, poppeli, lännenhirssi tai ruokohelpi ja vastaavat).
Keksinnön erään suoritusmuodon mukaisesti menetelmä on sovellettavissa biopolttoaineiden c\i kuten etanolin, propanolin ja butanolin ja vastaavien tuotantoon selluloosamateriaalista.
δ
(M
i o Keksintöön sisältyy menetelmä, jossa selluloosamateriaalin hydrolyysissä käytetty o CBHII/Cel6A-polypeptidi on peräisin kannasta Acremonium thermophilum CBS 116240 ja
Ie sillä on aminohapposekvenssi nro 12 tai se on vähintään 78-, 80-, 82-, 84-, 86-, 88-, 90-, 92-, Q_ cv, 94-, 96-, 97-, 98- tai 99-prosenttisesti identtinen sekvenssin nro 12 aminohapposekvenssin ^ kanssa, tai se on tämän fragmentti tai variantti, jolla on sellobiohydrolaasiaktiivisuutta.
05 o o C\l 34
Esillä oleva keksintö koskee myös sieniperäistä CBHII/Cel6A-polypeptidiä, jolla on sellobiohydrolaasiaktiivisuutta ja joka käsittää aminohapposekvenssin, joka on vähintään 76-prosenttisesti identtinen sekvenssin nro 12 täyspitkän polypeptidin kanssa, vähintään 76-prosenttisesti identtinen sekvenssin nro 14 täyspitkän polypeptidin kanssa, vähintään 95-prosenttisesti identtinen sekvenssin nro 15 täyspitkän polypeptidin kanssa tai vähintään 91-prosenttisesti identtinen sekvenssin nro 16 täyspitkän polypeptidin kanssa, tai näiden fragmentin tai variantin, jolla on sellobiohydrolaasiaktiivisuutta.
CBHII/Cel6A-polypeptidi voi olla saatavissa rihmasienisuvusta Acremonium, Melanocarpus, Chaetomium tai Talaromyces. Edullisiin lajeihin sisältyvät Acremonium thermophilum, Melanocarpus albomyces, Chaetomium thermophilum tai Talaromyces emersonii.
Keksinnön edullisen suoritusmuodon mukaisesti entsyymit ovat saatavissa rihmasienikannasta ALK04245, jolla on talletusnumero CBS 116240 ja joka tällä hetkellä luokitellaan lajiksi Acremonium thermophilium, Melanocarpus albomyces -kannasta ALK04237, jolla on talletusnumero CBS 685.95, Chaetomium thermophilum -kannasta ALK04265, jolla on talletusnumero CBS 730.95, tai Talaromyces emersonii -kannasta DSM 2432 (RF8069).
Keksinnön edullisen suoritusmuodon mukaisesti sieniperäinen CBHII/Cel6A- sellobiohydrolaasientsyymi on polypeptidi, jolla on sellobiohydrolaasiaktiivisuutta ja joka käsittää entsyymin A/_ALK04245_Cel6A, jolla on sekvenssin nro 12 täyspitkä aminohapposekvenssi.
oj Keksinnön eräs toinen edullinen suoritusmuoto on sieniperäinen CBHII/Cel6A- ° sellobiohydrolaasientsyymi, jolla on sellobiohydrolaasiaktiivisuutta ja joka käsittää entsyymin o Ma_ALK04237_Cel6A, jolla on sekvenssin nro 14 täyspitkä aminohapposekvenssi.
^r o
Keksinnön eräs toinen edullinen suoritusmuoto on sieniperäinen CBHII/Cel6A-
CL
^ sellobiohydrolaasientsyymi, jolla on sellobiohydrolaasiaktiivisuutta ja joka käsittää entsyymin 2 Ct_ALK04265_Cel6A, jolla on sekvenssin nro 15 täyspitkä aminohapposekvenssi.
σ> o o cv 35
Keksinnön vielä eräs edullinen suoritusmuoto on sieniperäinen CBHII/Cel6A-sellobiohydrolaasientsyymi, jolla on sellobiohydrolaasiaktiivisuutta ja joka käsittää entsyymin 7e_RF8069_Ccl6A, jolla on sekvenssin nro 16 täyspitkä aminohapposekvenssi.
Keksinnön erään edullisen suoritusmuodon mukaisesti CBHII/Cel6A-sellobiohydrolaasientsyymi kykenee hydrolysoimaan selluloosamateriaalia kohtalaisista korotettuihin olevissa lämpötiloissa. Keksinnön CBHII/Cel6A-sellobiohydrolaasit ovat aktiivisia tai stabiileja jopa 70 °C olevissa lämpötiloissa, kuten 40-70 °C:ssa, esim. 40-60 °C:ssa tai 50-60 °C:ssa, määritettynä entsyymien optimaalisessa pH-arvossa käyttäen Avicel PhlOl -selluloosaa substraattina, kuten esimerkissä 3 on kuvattu. Käytettäessä lyhyitä hydrolyysiaikoja entsyymikoostumukset saattavat olla toimivia jopa 80 °C:ssa. Täydellistä hydrolyysia varten tarvitaan pidempiä inkubointiaikoja, ja tästä syystä yleensä käytetään alhaisempia lämpötiloja. Tämä tekee keksinnön CBHII/Cel6A-sellobiohydrolaaseista erinomaisen hyvin soveltuvia erilaisiin selluloosasubstraattien hydrolyysiprosesseihin, joita suoritetaan sekä tavanomaisissa tai kohtalaisissa lämpötiloissa että korotetuissa lämpötiloissa, jotka edellyttävät entsyymien lämmönkestävyyttä.
Keksinnön erään edullisen suoritusmuodon mukaisesti sieniperäistä CBHII/Cel6A:ta koodaa eristetty nukleiinihappomolekyyli, joka koodaa polypeptidiä, jolla on sekvenssissä nro 12, sekvenssissä nro 14, sekvenssissä nro 15 tai sekvenssissä nro 16 määritelty aminohapposekvenssi. Näin ollen keksinnön suojapiiriin sisältyy CBHII/Cel6A-sellobiohydrolaasientsyymi tai polypeptidi, joka käsittää täyspitkän muodon aminohapposekvenssin 4/_ALK04245_Cel6A-cntsyymistä, joka on esitetty sekvenssissä nro cvj 12, Mö_ALK04237_Cel6A-entsyymistä, joka on esitetty sekvenssissä nro 14, cu Q ALK04265-entsyymistä, joka on esitetty sekvenssissä nro 15 tai 7e_RF8069_Ccl6A- i o entsyymistä, joka on esitetty sekvenssissä nro 16.
o ir Lisäksi esillä olevan keksinnön suojapiiriin sisältyvät polypeptidit, joita koodaavat
CL
^ nukleiinihappomolekyylit, jotka koodaavat CBHII/Cel6A-polypeptidiä, jolla on ^ sellobiohydrolaasiaktiivisuutta ja joka on vähintään 76-prosenttisesti identtinen sekvenssin 05 § nro 12 täyspitkän aminohapposekvenssin kanssa, vähintään 76-prosenttisesti identtinen cu sekvenssin nro 14 täyspitkän aminohapposekvenssin kanssa, vähintään 95-prosenttisesti 36 identtinen sekvenssin nro 15 täyspitkän aminohapposekvenssin kanssa tai vähintään 91-prosenttisesti identtinen sekvenssin nro 16 täyspitkän aminohapposekvenssin kanssa. Kahden entsyymin identtisyyksiä verrataan vastaavilla alueilla, eli CBHII/Cel6A-polypeptidin täyspitkällä alueella.
Keksinnön suojapiiriin sisältyy polypeptidisekvenssi, jota koodaa nukleiinihappomolekyyli, joka koodaa polypeptidin fragmenttia, josta polypeptidin fragmentista puuttuu yksi tai useampi aminohappojäännös sekvenssin nro 12, sekvenssin nro 14, sekvenssin nro 15 tai sekvenssin nro 16 täyspitkän polypeptidin N- ja/tai C-päästä. Fragmentilla on edelleen täyspitkän C B HI I/Ccl 6 A-sellobi ohydrol aasin keskeinen katalyyttinen aktiivisuus tai sellobiohydrolaasiaktiivisuus ja oleellisesti vastaavat ominaisuudet, kuten pH- ja lämpötilariippuvuus sekä substraattispesifisyys. Fragmentti voi esimerkiksi olla entsyymi, josta puuttuu erityssignaalisekvenssi tai hiilihydraattia sitova domeeni tai CBD.
Keksintöön sisältyvät myös CBHII/Cel6A-sellobiohydrolaasien luonnolliset tai synteettiset variantit, joilla on vastaavia ominaisuuksia kuin sekvenssissä nro 12, sekvenssissä nro 14, sekvenssissä nro 15 tai sekvenssissä nro 16 määritellyillä polypeptideillä. Muuntelu voi olla seurausta aminohapposekvenssin yhden tai useamman aseman deleetiosta, substituutiosta, insertiosta, additiosta tai yhdistelmästä.
Keksinnön eräs edullinen suoritusmuoto on CBHII/Cel6A-sellobiohydrolaasi, jota koodaa eristetty nukleiinihappomolekyyli, joka käsittää polynukleotidisekvenssin, joka sisältyy sekvenssiin nro 11, sekvenssiin nro 13, sekvenssiin nro 9 tai sekvenssiin nro 10, tai näiden c\j osasekvenssin.
δ
(M
i o Keksintöön sisältyy CBHII/Cel6A-sellobiohydrolaasi, jota koodaa nukleiinihappomolekyyli, § joka hybridisoituu ankarissa olosuhteissa polynukleotidisekvenssiin, joka sisältyy sekvenssiin nro 11, sekvenssiin nro 13, sekvenssiin nro 9 tai sekvenssiin nro 10, tai näiden
CL
^ osasekvenssiin. Lisäksi edullinen suoritusmuoto on polypeptidi, jota koodaa 2 nukleiinihappomolekyyli, joka hybridisoituu PCR-menetelmällä valmistetun koettimen σ> § kanssa, kuten sekvenssiin nro 7 tai sekvenssiin nro 8 sisältyvät PCR-fragmentin kanssa.
CM
37
Tavanomaisia molekyylibiologian menetelmiä, esimerkiksi menetelmiä, jotka on kuvattu sellaisissa molekyylibiologian käsikirjoissa kuten Sambrookja Russell, 2001, voidaan käyttää cDNA:n tai genomisen DNA:n eristämisessä isäntäorganismista. Keksinnön CBHII/CelöA-sellobiohydrolaasia koodaava cDNA tai genomin geeni voidaan eristää käyttäen DNA-koettimia, jotka on valmistettu puhdistetun CBHII/CelöA-entsyymin N-terminaalisten tai tryptisten peptidien aminohapposekvenssiin perustuen. Vaihtoehtoisesti koetin voidaan myös suunnitella perustuen homologisten sellobiohydrolaasien tunnettuihin nukleotidi- tai aminohapposekvensseihin. CBHII/Cel6A-klooneja voidaan myös seuloa perustuen niiden aktiivisuuteen maljoilla, jotka sisältävät entsyymin spesifistä substraattia, tai käyttämällä CBHII/Cel6A-sellobiohydrolaasille spesifisiä vasta-aineita.
Hybridisointi sellaisen DNA-koettimen kuten esimerkiksi sekvenssin nro 7 kanssa, joka käsittää yli 100-200 nukleotidia, suoritetaan yleensä “erittäin ankarissa” olosuhteissa, toisin sanoen hybridisoimalla lämpötilassa, joka on 20-25 °C täydellisen hybridin lasketun sulamislämpötilan (Tm) alapuolella, niin että Tm on laskettu Boltonin ja McCarthyn (1962) mukaan, ja suorittaen hybridisaation jälkeiset pesut alhaisessa suolapitoisuudessa. Yleensä esihybridisointi ja hybridisointi suoritetaan vähintään 65 °C:ssa käyttäen 6 x SSC:a (tai 6 x SSPE:a), 5 x Denhardtin reagenssia, 0,5 % (paino/tilavuus) SDS:a, 100 pg/ml denaturoitua, fragmentoitua lohen maidin DNA:ta. Esihybridisaatio- ja hybridisaatiolämpötila laskee 42 °C:seen lisättäessä formamidia kunnes 50 %. Erittäin ankarat pesut suoritetaan alhaisessa suolapitoisuudessa, esim. käyttäen 2 x SSC:a - 0,1 % SDS:a (paino/tilavuus) huoneenlämpötilassa, ja lopuksi käyttäen 0,1 x SSC:a - 0,1 % SDS:a (paino/tilavuus), vähintään 65 °C:ssa, esim. 68 °C:ssa.
OJ
cu Esillä olevassa keksinnössä ^t_ALK04245_ce/6A-, A/a_ALK04237_ce/6A-, i o C/_ALK04265_ce/6A- ja 7e_RF8069_ce/6A-geenit eristettiin PCR-menetelmällä o valmistetulla koettimella käyttäen ankaria hybridisaatio-olosuhteita, kuten esimerkissä 1 on ί kuvattu. Genomiset cbh2/cel6 A-geenit eristettiin käyttäen oligonukleotidialukkeita, jotka oli Q_ ^ suunniteltu julkaistujen nukleotidisekvenssien perusteella, tai käyttäen degeneroituneita 2 oligonukleotidialukkeita, jotka oli suunniteltu perustuen CBHII/Cel6A-protciinicn aiemmin CT) § tunnettujen aminohapposekvenssien rinnastukseen.
CM
38
Keksinnön erään edullisen suoritusmuodon mukaisesti sieniperäistä CBHII/Cel6A-sellobiohydrolaasientsyymiä koodaa eristetty nukleiinihappomolekyyli, joka käsittää sekvenssin nro 11 nukleotidisekvenssin, joka koodaa A /A LK04245 Ccl6 A-entsyym i n täyspitkää muotoa, jolla on sekvenssi nro 12. Keksinnön eräs toinen edullinen suoritusmuoto on sieniperäinen CBHII/Cel6A-sellobiohydrolaasi, jota koodaa eristetty nukleiinihappomolekyyli, joka käsittää sekvenssin nro 13 nukleotidisekvenssin, joka koodaa A/u_ALK04237 Cel6A-entsyymin täyspitkää muotoa, jolla on aminohapposekvenssi nro 14. Keksinnön eräs toinen edullinen suoritusmuoto on sieniperäinen CBHII/Cel6A-sellobiohydrolaasi, jota koodaa eristetty nukleiinihappomolekyyli, joka käsittää sekvenssin nro 9 nukleotidisekvenssin, joka koodaa Q_ALK04265_Cel6A-entsyymin täyspitkää muotoa, jolla on sekvenssi nro 15. Keksinnön vielä eräs toinen edullinen suoritusmuoto on sieniperäinen CBHII/Cel6A-sellobiohydrolaasi, jota koodaa eristetty nukleiinihappomolekyyli, joka käsittää sekvenssin nro 10 nukleotidisekvenssin, joka koodaa 7e_RF8069_Cel6A-entsyymin täyspitkää muotoa, jolla on aminohapposekvenssi nro 16.
Keksinnön erään toisen suoritusmuodon mukaisesti sieniperäistä CBHII/Cel6A- sellobiohydrolaasia koodaa polynukleotidisekvenssi, joka sisältyy plasmidiin pALK2582, joka on talletettu kannassa Escherichia coli RF8175 talletusnumerolla DSM 22946, plasmidiin pALK25 81, j oka on talletettu kannassa Escherichia coli RF8174 talletusnumerolla DSM 22945, plasmidiin pALK2904, joka on talletettu kannassa Escherichia coli RF8214 talletusnumerolla DSM 22947, tai plasmidiin pALK3006, joka on talletettu kannassa Escherichia coli RF8333 talletusnumerolla DSM 23185.
cm Eräs keksinnön suoritusmuoto on CBHII/Cel6A-sellobiohydrolaasi, joka tuotetaan cu rekombinanttisesta ekspressiovektorista, joka käsittää nukleiinihappomolekyylin, joka koodaa i o edellä määriteltyä sieniperäistä CBHII/Cel6A-sellobiohydrolaasia, toiminnallisesti liitettynä o säätelysekvensseihin, jotka kykenevät ohjaamaan mainitun CBHII/Cel6A- | sellobiohydrolaasientsyymin ilmentymistä soveltuvassa isännässä. Mainitun rekombinanttisen ekspressiovektorin rakentamista ja mainitun vektorin käyttöä on kuvattu 2 yksityiskohtaisemmin esimerkissä 2.
O) o o
CM
39
Soveltuvia isäntiä sieniperäisen CBHII/Cel6A-sellobiohydrolaasin tuottamista varten ovat homologiset tai heterologiset isännät, kuten mikrobi-isännät, mukaan lukien bakteerit, hiivat ja sienet. Rihmasienet kuten Trichoderma, Aspergillus, Fusarium, Humicola, Chrysosporium Neurospora, Rhizopus, Penicillium ja Mortiriella, ovat edullisia tuotantoisäntiä johtuen jatkokäsittelyn ja entsyymituotteen talteen ottamisen helppoudesta. Soveltuviin isäntälajeihin sisältyvät sellaiset kuten T. reesei, A. niger, A oryzae, A. sojae, A. awamori tai A. japonicus -tyyppiset kannat, F. venenatum tai F. oxysporum, H. insolens tai H. lanuginosa, N. erässä ja C. lucknowense, joista osa on lueteltu entsyymien tuotannossa käytettävinä isäntäorganismeina esim. AMFEP:n vuoden 2007 kaupallisten entsyymien luettelossa (http://www.amfep.org/list.html). Edullisemmin entsyymi valmistetaan suvun Trichoderma tai Aspergillus rihmasieni-isännässä, kuten lajeissa T. reesei tai A. niger, A. oryzae tai A. awamori. Keksinnön edullisimman suoritusmuodon mukaan sieniperäinen CBHII/Cel6A-sellobiohydrolaasientsyymi valmistetaan T. reeseissä.
Keksinnön edullisen suoritusmuodon mukaan on sieniperäinen CBHII/Cel6A-polypeptidi on ^4t_ALK04245_Cel6A, joka on peräsin kannasta Acremonium thermophilum CBS 116240 ja jolla on sekvenssin nro 12 aminohapposekvenssi.
Esillä oleva keksintö koskee myös eristettyä nukleiinihappomolekyyliä, joka koodaa sieniperäistä CBHII/Cel6A-sellobiohydrolaasia, joka on valittu seuraavasta ryhmästä: (a) nukleiinihappomolekyyli, joka koodaa polypeptidiä, jolla on sellobiohydrolaasiaktiivisuutta ja joka käsittää sekvenssissä nro 12, sekvenssissä nro evi 14, sekvenssissä nro 15 tai sekvenssissä nro 16 esitetyn aminohapposekvenssin tai näiden fragmentin tai variantin, jolla on samankaltaisia ominaisuuksia; o (b) nukleiinihappomolekyyli, joka koodaa polypeptidiä, jolla on o sellobiohydrolaasiaktiivisuutta joka on vähintään 76-prosenttisesti identtinen
Et sekvenssin nro 12 täyspitkän aminohapposekvenssin kanssa, vähintään 76- (M prosenttisesti identtinen sekvenssin nro 14 täyspitkän aminohapposekvenssin kanssa, 2 vähintään 95-prosenttisesti identtinen sekvenssin nro 15 täyspitkän
CD
§ aminohapposekvenssin kanssa tai vähintään 91-prosenttisesti identtinen sekvenssin
CU
40 nro 16 täyspitkän aminohapposekvenssin kanssa, tai näiden fragmenttia tai varianttia, jolla on samankaltaisia ominaisuuksia; (c) nukleiinihappomolekyyli, joka käsittää sekvenssissä nro 11, sekvenssissä nro 13, sekvenssissä nro 9 tai sekvenssissä nro 10 kuvatun nukleotidisekvenssin koodaavan sekvenssin; (d) nukleiinihappomolekyyli, joka käsittää DSM 22946:n, DSM 22945:n, DSM 22947:n tai DSM 23185:n sisältämän polynukleotidisekvenssin koodaavan sekvenssin; (e) nukleiinihappomolekyyli, jonka koodaava sekvenssi eroaa minkä tahansa kohdista (c)-(d) nukleiinihappomolekyylin koodaavasta sekvenssistä geneettisen koodin degeneraation vuoksi; ja (f) nukleiinihappomolekyyli, joka hybridisoituu ankarissa olosuhteissa DSM 22946:n, DSM 22945:n, DSM 22947:n tai DSM 23185:n sisältämään nukleiinihappomolekyyliin tai sen osasekvenssiin ja joka koodaa polypeptidiä, jolla on sellobiohydrolaasiaktiivisuutta ja aminohapposekvenssi, joka on vähintään 76-prosenttisesti identtinen sekvenssin nro 12 täyspitkän aminohapposekvenssin kanssa, vähintään 76-prosenttisesti identtinen sekvenssin nro 14 täyspitkän aminohapposekvenssin kanssa, vähintään 95-prosenttisesti identtinen sekvenssin nro 15 täyspitkän aminohapposekvenssin kanssa tai vähintään 91-prosenttisesti identtinen sekvenssin nro 16 täyspitkän aminohapposekvenssin kanssa.
Keksinnön nukleiinihappomolekyyli voi olla RNA tai DNA, jolloin DNA voi koostua genomisesta DNA:sta tai cDNA:sta.
c\j Tavanomaisia molekyylibiologian menetelmiä voidaan käyttää eristettäessä ja cv entsyymikäsiteltäessä polynukleotidisekvenssiä, joka koodaa keksinnön sieniperäistä o CBHII/Cel6A-sellobiohydrolaasia, mukaan lukien genomisen ja plasmidi-DNA:n i § eristäminen, DNA:n pilkkominen DNA-fragmenttien aikaansaamiseksi, sekvensointi, E. coli - § transformaatiot jne. Perusmenetelmiä on kuvattu tavanomaisissa molekyylibiologian
CL
^ käsikirjoissa, esim. teoksessa Sambrook ja Russell, 2001.
co § Polypeptidejä 4/_ALK04245_Ccl6A, A/ö_ALK04237_Ccl6A, CY_ALK04265_Cel6A ja 7e_RF8069_Ccl6A koodaavien geenien ^4t_ALK04245_ce/6A, Ma_ALK04237_ce/6A, 41 Q_ALK04265_ce/6A ja 7e_RF8069_ce/6A eristäminen on kuvattu esimerkissä 1. Lyhyesti esitettynä, 1 032 emäsparin PCR-fragmenttia (sekvenssi nro 7) ja 831 emäsparin PCR-fragmenttia (sekvenssi nro 8), jotka oli saatu käyttämällä degeneroituneiden oligonukleotidialukkeiden sekvenssejä (sekvenssi nro 1 ja sekvenssi nro 2), käytettiin d/_ALK04245_6'e/6A-gccnin eristämiseksi kannasta Acremonium thermophilum ALK04245 ja Ma_ALK04237_ce/6A-geenin eristämiseksi kannasta Melanocarpus albomyces ALK04237 pCR®4Blunt-TOPO®-vektoriin. Täyspitkä A. thermophilum cel6A -geeni sisällytettiin plasmidiin pALK2582, joka on talletettu E. co//ssa DSMZ-kokoelmaan talletusnumerolla DSM 22946. Täyspitkä M. albomyces cel6A -geeni sisällytettiin plasmidiin pALK2581, joka on talletettu E. colissa DSMZ-kokoelmaan talletusnumerolla DSM 22945. C/_ALK04265 ce/6A-gccni eristettiin käyttäen sekvenssin nro 3 ja sekvenssin nro 4 alukepareja ja 7e_RF8069_ce/6A-geeni eristettiin käyttäen sekvenssin nro 5 ja sekvenssin nro 6 alukepareja, kuten esimerkissä 1 on kuvattu. PCR-fragmentit, jotka sisälsivät täyspitkät ce/6A-geenit kannoista Chaetomium thermophilum ALK04265 ja Talaromyces emersonii RF8069, sisällytettiin plasmideihin pALK2904 ja pALK3006, jotka on talletettu E. colissa DSMZ-kokoelmaan talletusnumeroilla DSM 22947 ja vastaavasti DSM 23185.
CBHII/Cel6A-sellobiohydrolaasien johdetut aminohapposekvenssit analysoitiin DNA-sekvensseistä esimerkissä 1 kuvatulla tavalla.
Acremonium thermophilumm CBHII/Cel6A-sellobiohydrolaasia (sekvenssi nro 12) koodaavan geenin At_ALKOA2A5_cel6A (sekvenssi nro 11) pituus on 1 830 emäsparia (mukaan lukien lopetuskodoni). Löydettiin neljä oletettua intronia, joiden pituudet olivat 79, cvj 72, 117 ja 126 emäsparia. Näin ollen ^4t_ALK04245_ce/6A:n koodaava alue on 1 434 ° emäsparia (ilman lopetuskodonia) ja johdettu proteiinisekvenssi koostuu 478 aminohaposta, o sisältäen ennustetun 18 aminohapon signaalisekvenssin (SignalP V3.0; Nielsen et ah, 1997; o Nielsen ja Krogh, 1998, sekä Bendtsen et ah, 2004). Johdetun aminohapposekvenssin
Ee todettiin olevan homologinen julkaistujen CBHII/Cel6A-sekvenssien kanssa, kun sitä Q_ ^ analysoitiin käyttäen BLAST-ohjelmaa, versio 2.2.9 NCBLssa, National Center for 2 Biotechnology Information; Altschul et ah, 1990). Kypsän entsyymin ennustettu O) § molekyylimassa ilman signaalisekvenssiä oli 48 918 Da ja ennustettu pl oli 4,82. Nämä
(M
ennusteet laadittiin käyttäen Compute pI/MW -työkalua ExPASy-palvelimella (Gasteiger et 42 ai, 2003). Täyspitkän At_ALK04245_Cel6A-sekvenssin identtisyysarvot homologisten sekvenssien vastaaviin alueisiin nähden saatiin käyttäen Clone Manager -ohjelmaa (versio 9), joka sisälsi toiminnot “Compare two Sequences/Global/Compare sequences as amino acids/BLOSUM62 scoring matrix”. Taulukossa 6 on esitetty arvot (%), jotka osoittavat identtisyyden keksinnön muiden CBHII/Cel6A-sellobiohydrolaasien kanssa. Identtisyys julkaistuihin CBHII/Cel6A-aminohapposekvensseihin nähden on esitetty taulukoissa 7 ja 8.
Keksinnön At_ALK04245_Cel6A:lla on suurin homologia suhteessa täyspitkiin polypeptideihin Thielavia terrestris NRRL 8126 (sekvenssi nro 2 julkaisussa US 7,220,565, Novozymes Inc., US, ja sekvenssi nro 49 julkaisussa W02009085868, Novozymes A/S, DK), nimeämättömään proteiinituotteeseen kannasta Podospora anserina DSM 980 (EMBL-talletusnumero XP 001903170) ja johdettuun endoglukanaasi 2 -esiasteeseen kannasta Neurospora erässä OR74A (XM 955677). Identtisyys T. lerreslrism proteiiniin nähden oli täyspitkässä polypeptidissä 75 %. Identtisyydet P. anserinan ja N. crassan polypeptideihin nähden olivat 69 %.
Melanocarpus albomycesin CBHII/Cel6A-sellobiohydrolaasia (sekvenssi nro 14) koodaavan geenin Ma_ALK04237_ce/6A (sekvenssi nro 13) pituus on 1 607 emäsparia (mukaan lukien lopetuskodoni). Löydettiin kaksi oletettua intronia, joiden pituudet olivat 93 ja 95 emäsparia. Näin ollen Ma_ALK04237_ce/6A:n koodaava alue on 1 416 emäsparia (ilman lopetuskodonia) ja johdettu proteiinisekvenssi koostuu 472 aminohaposta, sisältäen ennustetun 17 aminohapon signaalisekvenssin (SignalP V3.0; Nielsen et ai., 1997; Nielsen ja Krogh, 1998, sekä Bendtsen et ai., 2004). Kypsän entsyymin ennustettu molekyylimassa c\j ilman signaalisekvenssiä oli 48 627 Da ja ennustettu pl oli 4,50. Nämä ennustukset cv suoritettiin käyttäen Compute pI/MW -työkalua ExPASy-palvelimella (Gasteiger et ai., i o 2003). Keksinnön Ma_ALK04237_Cel6A:lla on suurin homologia suhteessa i o karakterisoimattoman organismin täyspitkään polypeptidiin, joka on tuotu esiin jr aminohapposekvenssinä nro 413 julkaisussa W02008095033 (Syngenta Inc., US) (72 %),
CL
^ CBHII-polypeptidiin kannasta Thielavia terrestris NRRL 8126 (sekvenssi nro 49 julkaisussa ^ W02009085868, Novozymes A/S, DK) (71 %) sekä hypoteettiseen proteiiniin CHGG 10762 σ> § kannasta Chaetomium globosum CBS 148.151 (EMBL-talletusnumero XP001226029) cv (identtisyys 75 %).
43
Chaetomium thermophilumm CBHII/Cel6A-sellobiohydrolaasia (sekvenssi nro 15) koodaavan geenin Q_ALK04265_ce/6A (sekvenssi nro 9) pituus on 1 757 emäsparia (mukaan lukien lopetuskodoni). Löydettiin kolme oletettua intronia, joiden pituudet olivat 77, 196 ja 56 emäsparia. Näin ollen Ct_ALK04265_ce/6A:n koodaava alue on 1 425 emäsparia (ilman lopetuskodonia) ja johdettu proteiinisekvenssi koostuu 475 aminohaposta, sisältäen ennustetun 17 aminohapon signaalisekvenssin (SignalP V3.0; Nielsen et ai., 1997; Nielsen ja Krogh, 1998, sekä Bendtsen et ai., 2004). Kypsän entsyymin ennustettu molekyylimassa ilman signaalisekvenssiä oli 49 408 Da ja ennustettu pl 5,31. Keksinnön C/ ALK04265_Ccl6A: 11a oli suurin homologia verrattuna Chaetomium thermophilum CT2:n perheen 6 johdettuun sellobiohydrolaasiin (EMBL-talletusnumero AY861348; CN 1757709, Shandong Agricultural University, CN), polypeptidiin C. thermophilum CGMCC0859, jolla on sellobiohydrolaasi II -aktiivisuutta (sekvenssi nro 2 julkaisussa EP1578964B1, Novozymes A/S, DK) sekä Chaetomium thermophilum CBHIEeen, jolla on sekvenssi nro 45 (W02009059234, Novozymes Inc., US). Täyspitkien polypeptidien identtisyydet olivat 94 %.
Talaromyces emersonim CBHII/Cel6A-sellobiohydrolaasia (sekvenssi nro 16) koodaavan geenin 7e_RF8069_ce/6A (sekvenssi nro 10) pituus on 1 754 emäsparia (mukaan lukien lopetuskodoni). Löydettiin seitsemän oletettua intronia, joiden pituudet olivat 50, 44, 52, 56, 53, 59 ja 60 emäsparia. Näin ollen 7e_RF8069_ce/6A:n koodaava alue on 1 377 emäsparia (ilman lopetuskodonia) ja johdettu proteiinisekvenssi koostuu 459 aminohaposta, sisältäen ennustetun 19 aminohapon signaalisekvenssin (SignalP V3.0; Nielsen et ai., 1997; Nielsen ja Krogh, 1998, sekä Bendtsen et ai., 2004). Kypsän entsyymin ennustettu molekyylimassa cvj ilman signaalisekvenssiä oli 46 618 Da ja ennustettu pl oli 4,27. Keksinnön cm 7e_RF8069_Ccl6A:lla oli suurin homologia suhteessa polypeptidiin Talaromyces i o emersoniista (Q8N1B5 kuviossa 3A-C julkaisussa W02006074005, Novozymes Inc., US) o sekä sellobiohydrolaasiin II Talaromyces emersoniista (AY075018). Täyspitkien ir aminohapposekvenssien identtisyydet olivat 90 %.
CL
C\J
2 Näin ollen keksinnön suojapiiriin sisältyy eristetty polynukleotidisekvenssi tai eristetty
CD
§ nukleiinihappomolekyyli, joka koodaa CBHII/Cel6A-sellobiohydrolaasinetsyymiä tai
(M
polypeptidiä, joka käsittää ^/_ALK04245 Ccl6A-cntsyymin, joka on esitetty sekvenssissä 44 nro 12, Ma_ALK04237_Cel6A-entsyymin, joka on esitetty sekvenssissä nro 14, QALK04265-entsyymin, joka on esitetty sekvenssissä nro 15 tai 7e_RF8069_Cel6A-cntsyymin, joka on esitetty sekvenssissä nro 16, täyspitkän muodon aminohapposekvenssin.
Lisäksi keksinnön suojapiiriin sisältyvät nukleiinihappomolekyylit, jotka koodaavat CBHII/Cel6A-polypeptidiä, jolla on sellobiohydrolaasiaktiivisuutta ja joka on 76-prosenttisesti, edullisesti vähintään 78-, 80-, 82-, 84-, 86-, 88-, 90-, 92-, 94-, 96- tai 97-prosenttisesti, edullisemmin vähintään 98-prosenttisesti, edullisimmin 99-prosenttisesti identtinen sekvenssin 12 täyspitkän aminohapposekvenssin kanssa. Kahden entsyymin identtisyyksiä verrataan vastaavilla sekvenssialueilla, toisin sanoen CBHII/Cel6A-polypeptidin täyspitkällä alueella.
Keksinnön eräs toinen edullinen suoritusmuoto on sieniperäinen CBHII/Cel6A-sellobiohydrolaasientsyymi, joka on vähintään 76-prosenttisesti, edullisesti vähintään 78-, 80-, 82-, 84-, 86-, 88-, 90-, 92-, 94-, 96- tai 97-prosenttisesti, edullisemmin vähintään 98-prosenttisesti, edullisimmin 99-prosenttisesti identtinen sekvenssin 14 täyspitkän aminohapposekvenssin kanssa.
Lisäksi edulliset CBHII/Cel6A-sellobiohydrolaasit ovat vähintään 95-prosenttisesti, edullisesti vähintään 96-prosenttisesti tai vähintään 97-prosenttisesti, vieläkin edullisemmin 98-prosenttisesti identtisiä, edullisimmin vähintään 99-prosenttisesti identtisiä sekvenssin nro 15 täyspitkän aminohapposekvenssin kanssa.
oj Muut edulliset CBHII/Cel6a-polypeptidit ovat vähintään 91-prosenttisesti, edullisesti cm vähintään 92-, 93-, 94-, 95-, 96- tai 97-prosenttisesti, edullisemmin vähintään 98- i o prosenttisesti ja edullisimmin vähintään 99-prosenttisesti identtisiä sekvenssin nro 16 0 täyspitkän aminohapposekvenssin kanssa.
cc
CL
^ Keksinnön suojapiiriin sisältyy eristetty nukleiinihappomolekyyli, joka koodaa polypeptidiä, 2 jolla on täyspitkän CBHII/Cel6A-sellobiohydrolaasin aminohapposekvenssi, sekä keksinnön CT) § polypeptidien fragmentit tai luonnolliset tai synteettiset variantit, joilla on
CM
sellobiohydrolaasiaktiivisuutta ja samankaltaisia ominaisuuksia kuin täyspitkillä 45 polypeptideillä. Tällainen fragmentti voi esimerkiksi olla entsyymi, josta puuttuu erityssignaalisekvenssi tai hiilihydraattia sitova domeeni tai CBD.
Keksinnön eräs edullinen suoritusmuoto on eristetty nukleiinihappomolekyyli, joka käsittää “koodaavan sekvenssin” polynukleotidisekvenssistä, joka sisältyy sekvenssiin nro 11, sekvenssiin nro 13, sekvenssiin nro 9, sekvenssiin nro 10, tai jonkin näistä osasekvenssiin. Keksinnön erään edullisen suoritusmuodon mukaisesti polypeptidiä koodaa nukleiinihappomolekyyli, jolla on sekvenssin nro 11 nukleotidisekvenssi, joka käsittää A/ALK04245 Ccl6 A-cntsyymiä koodaavan sekvenssin. Ilmaus “koodaava sekvenssi” tarkoittaa sitä nukleotidisekvenssiä, joka alkaa translaation aloituskodonista (ATG) ja päättyy translaation lopetuskodoniin (TAA, TAG tai TGA) ja joka voi käsittää intronialueita. Polypeptidi, jolle translaatio on suoritettu, alkaa yleensä metioniinista.
Keksinnön erään toisen suoritusmuodon mukaisesti eristetty nukleiinihappomolekyyli käsittää koodaavan sekvenssin polynukleotidisekvenssistä, joka sisältyy plasmidiin pALK2582, joka on talletettu kannassa Escherichia coli RF8175 talletusnumerolla DSM 22946, plasmidiin pALK2581, joka on talletettu kannassa Escherichia coli RF8174 talletusnumerolla DSM 22945, plasmidiin pALK2904, joka on talletettu kannassa Escherichia coli RF8214 talletusnumerolla DSM 22947, tai plasmidiin pALK3006, joka on talletettu kannassa Escherichia coli RF8333 talletusnumerolla DSM 23185.
Keksinnön nukleiinihappomolekyyli voi myös olla edellä määritellyn nukleotidisekvenssin analogi. Termi “degeneraatio” viittaa sellaisiin nukleotidisekvenssin analogeihin, jotka cvj eroavat yhden tai useamman nukleotidin tai kodonin suhteen, mutta jotka koodaavat cm keksinnön rekombinanttista CBHII/Cel6A:ta.
ih o i o Nukleiinihappomolekyyli voi myös olla nukleiinihappomolekyyli, joka hybridisoituu ankarissa olosuhteissa polynukleotidisekvenssiin, joka sisältyy plasmidiin pALK2582,
CL
^ pALK2581, pALK2904 tai pALK3006, jotka on talletettu E. co/zssa talletusnumeroilla ^ DSM 22946, DSM 22945, DSM 22947 ja DSM 23185, tai näiden osasekvenssiin ja joka O) § koodaa polypeptidiä, jolla on sellobiohydrolaasiaktiivisuutta ja aminohapposekvenssi, joka
CM
vastaavalla sekvenssialueella on vähintään 76-prosenttisesti identtinen sekvenssissä nro 12 46 esitetyn täyspitkän aminohapposekvenssin kanssa, vähintään 76-prosenttisesti identtinen sekvenssissä nro 14 esitetyn täyspitkän aminohapposekvenssin kanssa, vähintään 95-prosenttisesti identtinen sekvenssissä nro 15 esitetyn täyspitkän aminohapposekvenssin kanssa tai vähintään 91-prosenttisesti identtinen sekvenssissä nro 16 esitetyn täyspitkän aminohapposekvenssin kanssa. Hybridisoituva DNA voi olla peräisin sukuun Acremonium, Melanocarpus, Chaetomium tai Talaromyces kuuluvasta sienestä, tai se voi olla peräisin jostain muusta sienilajista.
Keksinnön erään edullisen suoritusmuodon mukaisesti sieniperäistä CBHII/Cel6A-sellobiohydrolaasientsyymiä koodaa eristetty nukleiinihappomolekyyli, joka käsittää sekvenssin nro 11 nukleotidisekvenssin, joka koodaa d/_ALK04245 Ccl6A-cntsyymin täyspitkää muotoa, jolla on sekvenssi nro 12.
Esillä oleva keksintö koskee myös rekombinanttista ekspressiovektoria tai rekombinanttista ekpressiokonstruktia, jota voidaan käyttää valittua CBHII/Cel6A-sellobiohydrolaasia koodaavan nukleiinihappomolekyylin lisäämiseksi tai ilmentämiseksi soveltuvassa prokaryoottisessa tai eukaryoottisessa isännässä. Rekombinanttinen ekspressiovektori käsittää DNA:ta tai nukleiinihapposekvenssejä, jotka helpottavat tai ohjaavat CBHII/Cel6A-polypeptidiä koodaavan sekvenssin ilmentymistä ja erittymistä soveltuvassa isännässä, kuten promoottoreita, tehostajia, terminaattoreita (mukaan lukien transkription ja translaation päättämissignaalit) sekä signaalisekvenssejä, jotka ovat toiminnallisesti liitettyjä mainittua polypeptidiä koodaavaan polynukleotidisekvenssiin. Ekspressiovektori voi edelleen käsittää markkerigeenejä transformattikantojen valintaa varten, tai selektiomarkkeri voidaan viedä cvi isäntään toisessa vektorikonstruktissa kotransformoinnin avulla. Mainitut säätelysekvenssit ° voivat olla homologisia tai heterologisia tuotanto-organismin kanssa, tai ne voivat olla o peräisin siitä organismista, josta CBHIECel6A-polypeptidiä koodaava geeni eristettiin, o c Esimerkkeihin promoottoreista keksinnön CBHII/Cel6A:n ilmentämiseksi rihmasieni- c^, isännissä sisältyvät promoottorit seuraavista: A. oryzaen TAKA-amylaasi, emäksinen ^ proteaasi ALP ja trioosifosfaatti-isomeraasi, Rhizopus miehein lipaasi, Aspergillus nigerin tai 05 3 A awamorin glukoamylaasi (glaA), Fusarium oxysporumm trypsiinin kaltainen proteaasi,
(M
AI
Chrysosporium lucknowensen sellobiohydrolaasi 1 -promoottori, Trichoderma reesein sellobiohydrolaasi I (Cel7A) jne.
Hiivoissa ilmentymisen aikaansaamiseksi voidaan käyttää esimerkiksi promoottoreita seuraavista: S. cerevisiaen enolaasi (ENO-1), galaktokinaasi (GAL1), alkoholidehydrogenaasi (ADH2) ja 3-fosfoglyseraattikinaasi.
Esimerkkejä promoottorisekvensseistä keksinnön CBHn/Cel6A-polypeptidin transkription ohjaamiseksi bakteeri-isännässä ovat seuraavat: Escherichia colin /ac-operonin promoottori, Streptomyces coelicolorm agaraasigeenin dagA promoottori, B. licheniformisin alfa-amylaasigeenin (amyL) promoottori, B. stearothermophilusin maltogeenisen amylaasigeenin (arnyM) promoottori, B. subtilis -lajin xylA ja xy/B -geenien promoottorit, jne.
Soveltuviin terminaattoreihin sisältyvät edellä mainittujen geenien terminaattorit tai mitkä tahansa karakterisoidut terminaattorisekvenssit.
Soveltuviin transformaatio- tai selektiomarkkereihin sisältyvät ne, jotka täydentävät puutetta isännässä tai lisäävät isäntään uuden piirteen, esim. entsyymiaktiivisuutta, esimerkiksi dal-geenit lajeista B. subtilis tai B. licheniformis, tai Aspergillus amdS ja niaD. Selektio voi myös pohjautua markkerille, joka antaa antibioottista resistenssiä, kuten ampisilliini-, kanamysiini-, kloramfenikoli-, tetrasykliini-, pleomysiini- tai hygromysiiniresistenssiä.
Keksinnön CBHII/Cel6A:n solun ulkoinen ilmentäminen on edullista. Näin ollen cm rekombinanttinen vektori käsittää sekvenssejä, jotka helpottavat erittämistä valitussa cm isännässä. Keksinnön CBHII/CelöA-sellobiohydrolaasin signaalisekvenssi tai presekvenssi tai o prepeptidi voidaan sisällyttää rekombinanttiseen ekspressiovektoriin, tai luonnollinen o signaalisekvenssi voidaan korvata toisella signaalisekvenssillä, joka kykenee helpottamaan ir ilmentämistä valitussa isännässä. Näin ollen valittu signaalisekvenssi voi olla homologinen tai
CL
^ heterologinen valitun ilmentämisessä käytetyn isännän kanssa.
CD
CD
o o
CM
48
Esimerkkeihin soveltuvista signaalisekvensseistä sisältyvät sieni- tai hiivaorganismien signaalisekvenssit, esimerkiksi signaalisekvenssit hyvin ilmennetyistä geeneistä. Tällaiset signaalisekvenssit ovat kirjallisuudesta hyvin tunnettuja.
Rekombinanttinen vektori voi edelleen käsittää sekvenssejä, jotka helpottavat vektorin sisällyttämistä isännän kromosomaaliseen DNA:han stabiilin ilmentämisen aikaansaamiseksi. Vektori voi myös olla fuusiokonstrukti ja käsittää sekvenssejä, jotka koodaavat kantajapolypeptidiä, joka on geneettisesti fuusioitunut samaan koodaavaan sekvenssiin kuin kiinnostuksen kohteena olevan proteiinin koodaava sekvenssi ja joka parantaa polypeptidin erittymistä heterologisessa isäntäorganismissa tai joka helpottaa proteiinin puhdistusta tuotannon jälkeen. Tällaisiin kantajiin kuuluvat esimerkiksi proteiinit, joita tuotetaan suuria määriä luonnollisessa isännässä, kuten T. reesein sellulaasit tai Aspergillus-L·} ien glukoamylaasit. Kantajapolypeptidi voi myös olla eritettävän proteiinin ehjä domeeni, kuten CBD. Kantajaproteiini ja kiinnostava proteiini voivat pysyä fuusioituneita erittymisen jälkeen, tai ne voivat erottua proteolyyttisen prosessoinnin kautta proteiinin kuljetusprosessissa isännässä, tai ne voidaan erottaa kemiallisesti tai biokemiallisesti supernatanttiin tapahtuvan erittämisen jälkeen.
Keksinnön d/_ALK04245_Cel6A-, Ma_ALK04237_Cel6A-, Q_ALK04265_Cel6A- ja 7b_RF8069_Cel6A-sellobiohydrolaasi ilmennettiin niiden oman signaalisekvenssin kanssa Trichoderma reesei cbhl (cel7A) -promoottorista, kuten esimerkissä 2 on kuvattu. Ekspressiokonstruktiin, jota käytettiin T. reesei -isännän transformoinnissa, sisältyi myös cbhl-terminaattori ja amc/S-markkeri transformanttien valitsemiseksi transformoimattomista c\j soluista.
δ
CM
o Esillä oleva keksintö koskee myös isäntäsoluja, jotka käsittävät edellä kuvatun kaltaisen q rekombinanttisen ekspressiovektorin. Soveltuvia isäntiä sieniperäisen CBHII/CelöA- g sellobiohydrolaasin tuottamista varten ovat homologiset tai heterologiset isännät kuten ^ mikrobi-isännät, mukaan lukien bakteerit, hiivat ja sienet. Mahdollisia ovat myös ^ tuotantojärjestelmät kasvi- tai nisäkässoluissa.
en o o
CM
49
Rihmasienet, kuten Trichoderma, Aspergillus, Fusarium, Humicola, Chrysosporium Neurospora, Rhizopus, Penicillium ja Mortiriella, ovat edullisia valmistusisäntiä johtuen jatkokäsittelyn ja entsyymituotteen talteen ottamisen helppoudesta. Soveltuviin ilmentämis- ja tuotantoisäntäjärjestelmiin sisältyvät esimerkiksi tuotantojärjestelmä, joka on kehitetty rihmasieni-isännälle Trichoderma reesei (EP 244234), tai .Tv/;e/y///M.v-tuotantojärjcstclmät, kuten A. oryzae tai A. niger (WO 9708325, US 5,843,745, US 5,770,418), A. awamori, A. sojae ja A. japonicus -tyyppiset kannat, tai tuotantojärjestelmä, jotka on kehitetty Fusarium-lajeille kuten F. oxysporum (Malardier et ai., 1989) tai F. venenatum, sekä lajeille Neurospora erässä, Rhizopus miehei, Mortiriella alpinis, H. lanuginosa tai H. insolens tai lajille Chrysosporium lucknowense (US 6,573,086). Soveltuviin hiivoille kehitettyihin tuotantojärjestelmiin sisältyvät järjestelmät, jotka on kehitetty seuraaville: Saccharomyces, Schizosaccharomyces tai Pichia pastoris. Soveltuviin bakteereille kehitettyihin tuotantojärjestelmiin sisältyvät tuotantojärjestelmät, jotka on kehitetty suvulle Bacillus, esimerkiksi lajeille B. subtilis, B. lieheniformis, B. amyloliquefaciens, tai E. colille tai sädesienille Streptomyces. Edullisesti keksinnön CBHII/Cel6A-sellobiohydrolaasi valmistetaan suvun Trichoderma tai Aspergillus rihmasieni-isännässä, kuten T. reeseissä tai A. niger, A oryzae, A. sojae, A. awamori tai A. japonicus -tyyppisissä kannoissa. Keksinnön edullisimman suoritusmuodon mukaan sieniperäinen CBHII/Cel6A-sellobiohydrolaasi tuotetaan T. reeseissä.
Tuotantoisäntäsolu voi olla homologinen tai heterologinen keksinnön CBHII/Cel6A-sellobiohydrolaasin kanssa. Edullisesti rekombinanttinen isäntä muunnetaan ilmentämään ja erittämään sellulolyyttisiä entsyymejä sen pääasiallisena aktiivisuutena tai yhtenä sen c\j pääasiallisista aktiivisuuksista. Tämä voidaan aikaansaada deletoimalla pääasiallisia cm homologisia eritettyjä geenituotteita, kuten Trichoderman neljä pääasiallista sellulaasia, ja i o kohdentamalla heterologiset geenit lokukseen, joka on muunnettu korkean ilmentämisen ja o tuotantotasojen varmistamiseksi. Isännältä voi esimerkiksi puuttua homogeeniset
Er sellobiohydrolaasit johtuen mainittujen sellobiohydrolaasien poistamisesta joko
CL
^ inaktivoimalla tai poistamalla yksi tai useampi isännän sellobiohydrolaaseista, esim. yhtä tai 2 useampaa tällaista homogeenistä tai homologista sellobiohydrolaasia koodaavan yhden tai O) § useamman geenin deleetion vuoksi.
cm 50
Esillä oleva keksintö koskee myös valmistusmenetelmää CBHII/Cel6A-polypeptidille, jolla on sellobiohydrolaasiaktiivisuutta, mainitun menetelmän käsittäessä vaiheet, joissa viljellään luonnollista tai rekombinanttista isäntäsolua, joka kantaa keksinnön CBHII/CelöA-sellobiohydrolaasin rekombinanttista ekspressiovektoria, soveltuvissa olosuhteissa sekä valinnaisesti eristetään mainittu entsyymi. Tuotantoelatusaine voi olla elatusaine, joka soveltuu isäntäorganismin kasvattamiseen sekä sisältää tehokkaan ilmentämisen vaatimat indusorit. Tällaiset elatusaineet ovat kirjallisuudesta hyvin tunnettuja.
Keksintö koskee polypeptidiä, jolla on sellobiohydrolaasiaktiivisuutta, jota polypeptidiä koodaa keksinnön nukleiinihappomolekyyli ja joka on saatavissa edellä kuvatulla menetelmällä.
Keksintö koskee edelleen menetelmää sellaisen entsyymivalmisteen aikaansaamiseksi, joka käsittää CBHII/Cel6A-polypeptidin, jolla on sellobiohydrolaasiaktiivisuutta, mainitun menetelmän käsittäessä vaiheet, joissa viljellään keksinnön ekpressiovektoria kantavaa isäntäsolua ja valmistetaan koko viljelyliemi, tai erotetaan solut käytetystä elatusaineesta ja otetaan talteen supematantti, jolla on sellobiohydrolaasiaktiivisuutta.
Esillä oleva keksintö koskee myös entsyymivalmistetta, joka käsittää edellä luonnehditun CBHII/Cel6A-entsyymin. Entsyymivalmisteella tai -koostumuksella on sellobiohydrolaasiaktiivisuutta ja se on saatavissa keksinnön menetelmällä.
Keksintö kattaa entsyymivalmisteen, joka käsittää keksinnön sieniperäisen CBHII/Cel6A-c\j sellobiohydrolaasin.
δ
(M
i o Mainittu entsyymivalmiste voi lisäksi käsittää erityyppisiä entsyymejä tämän keksinnön o CBHII/Cel6A-sellobiohydrolaasin lisäksi, esimerkiksi seuraavia: toinen sellulaasi, mukaan §_ lukien sellobiohydrolaasi, endoglukanaasi ja beeta-glukosidaasi, beeta-glukanaasi, amylaasi,
CL
^ lipaasi, kutinaasi, proteaasi, ksylanaasi, beeta-ksylosidaasi, mannanaasi, beeta-mannosidaasi, 2 α-glukuronidaasi, asetyyliksylaaniesteraasi, α-arabinofuranosidaasi, a-galaktosidaasi, O) § pektinaasi, käsittäen endo- ja ekso-a-L-arabinaasit, α-galaktosidaasi, endo- ja ekso- C\] galaktoronaasi, ksyloglukanaasi, endopektiinilyaasi, pektaattilyaasi ja pektiiniesteraasi, 51 fenoliesteraasi, ligninaasi käsittäen ligniiniperoksidaasin, mangaaniriippuvaisen peroksidaasin, H202:a generoivan entsyymin ja/tai oksidaasin, kuten lakkaasi tai peroksidaasi, mediaattorin kanssa tai ilman sitä. Näiden entsyymien odotetaan tehostavan keksinnön CBHII/Cel6A-entsyymin vaikutusta poistamalla käsiteltävässä materiaalissa olevia hiilihydraatteja, proteiineja ja öljyjä tai rasvoja. Mainitut entsyymit voivat olla luonnollisia tai rekombinanttisia entsyymejä, jotka isäntäkanta tuottaa, tai ne voidaan lisätä viljelmän supernatanttiin valmistusprosessin jälkeen. Entsyymikoostumukset tai entsyymivalmisteet voivat sisältää näiden entsyymien minkä tahansa yhdistelmän. CBHII/Cel6A-sellobiohydrolaaseja voidaan myös käyttää yhdessä kaupallisesti saatavilla olevien entsyymivalmisteiden kanssa.
Keksinnön mukaisia entsyymejä, joita tarvitaan selluloosamateriaalin hydrolyysiin, voidaan lisätä entsymaattisesti tehokkaana määränä joko samanaikaisesti, esim. entsyymiseoksena, tai peräkkäin, tai osana SFF-menetelmää (simultaneous saccharification and fermentation), tai niitä voidaan valmistaa fermentatiivisessa mikro-organismissa konsolidoidussa bioprosessissa.
Entsyymivalmiste tai -koostumus voi sisältää entsyymit vähintään osittain puhdistetussa ja eristetyssä muodossa. Se voi jopa olennaisesti koostua halutusta entsyymistä tai entsyymeistä. Vaihtoehtoisesti valmiste voi olla koko viljelyliemi tai käytetty elatusaine tai suodos, joka sisältää yhtä tai useampaa haluttua entsyymiä. Konsolidoidussa bioprosessissa menetelmässä käytetty fermentatiivinen mikro-organismi voi valmistaa entsyymit. Entsymaattisen aktiivisuuden lisäksi valmiste voi sisältää lisäaineita, kuten mediaattoreita, stabilointiaineita, c\j puskuriaineita, säilöntäaineita, pinta-aktiivisia aineita ja/tai elatusaineen aineosia.
δ
CM
o Edullisia lisäaineita ovat sellaiset, joita käytetään tavanomaisesti entsyymivalmisteissa, jotka § on tarkoitettu johonkin nimenomaiseen sovellukseen. Pinta-aktiiviset aineet ovat
Ie käyttökelpoisia rasvan emulgoinnissa ja pintojen kostuttamisessa. Pinta-aktiivinen aine voi Q_ ^ olla ioniton, mukaan lukien semipolaarinen, ja/tai anioninen ja/tai kationinen ja/tai ^ kahtaisioninen. Entsyymivalmisteeseen voidaan lisätä puskureita pH:n säätämiseksi tai σ> § muiden aineiden tehokkuuteen tai stabiilisuuteen vaikuttamiseksi. Soveltuviin
CM
stabilointiaineisiin sisältyvät polyolit kuten propyleeniglykoli tai glyseroli, sokeri tai 52 sokerialkoholi, maitohappo, boorihappo tai boorihappojohdannaiset, peptidit jne. Valkaisuainetta käytetään orgaanisten yhdisteiden hapettamiseksi ja hajottamiseksi. Esimerkkejä soveltuvista kemiallisista valkaisujärjestelmistä ovat tEChin lähteet, kuten perboraatti tai perkarbonaatti perhappoa muodostavien valkaisuaktivaattorien kuten tetra-asetyylietyleenidiamiinin kanssa tai ilman, tai vaihtoehtoisesti peroksihapot kuten amidi-, imidi- tai sulfonityyppiset. Kemiallisia hapettimia voidaan korvata osittain tai kokonaan käyttämällä hapettavia entsyymejä, kuten lakkaaseja tai peroksidaaseja. Monet lakkaasit eivät toimi tehokkaasti mediaattorien puuttuessa. Vedenpehmentäjiin tai kompleksointiaineisiin sisältyvät sellaiset aineet kuten zeoliitti, difosfaatti, trifosfaatti, karbonaatti, sitraatti jne. Entsyymivalmiste voi lisäksi käsittää yhtä tai useampaa polymeeriä, kuten karboksimetyyliselluloosaa, poly(etyleeniglykolia), poly(vinyylialkoholia), poly(vinyylipyrrolidonia), jne. Voidaan lisätä myös pehmentimiä, syövyttäviä aineita ja säilöntäaineita muiden aineosien pilaantumisen estämiseksi, hankausaineita ja vaahtoamis- ja viskositeettiominaisuuksia muuttavia aineita.
Keksinnön erään edullisen suoritusmuodon mukaisesti mainittu entsyymivalmiste on käytetyn elatusaineen, nesteen, jauheen tai rakeiden muodossa. Edullisesti entsyymivalmiste on käytetty elatusaine.
Esillä oleva keksintö koskeen myös keksinnön sieniperäisen CBHII/Cel6A-sellobiohydrolaasin erilaisia käyttöjä, joissa selluloosamateriaalin hydro lyysi tai muuntaminen on toivottua. Tällaisiin käyttöihin sisältyy mikä tahansa sovellus, jossa sellulolyyttisiä entsyymejä tavanomaisesti käytetään, kuten polttoaine-, tekstiili-, pesuaine-, cm massa- ja paperi-, elintarvike-, rehu- tai juomateollisuus. Keksinnön CBHII/Cel6A- cm sellobiohydrolaasin lisääminen entsyymiskoostumukseen, joka käsittää muita selluloosaa o hajottavia entsyymejä, kuten sellobiohydrolaasia I, endoglukanaaseja ja beeta-glukosidaaseja, o tehostaa merkittävästi hydrolyysiä ja johtaa selluloosapolymeerirungon lähes täydelliseen c hydrolyysiin glukoosimonomeereiksi. CBHII/Cel6A:n toiminnan pääasiallinen tuote on Q_ ^ sellobioosi, joka koostuu kahdesta glukoosiyksiköstä.
co
CD
§ Eräs edullinen suoritusmuoto on keksinnön menetelmän käyttö sovelluksissa, jotka
CM
edellyttävät CBHII/Cel6 A-sellobiohydrolaasin stabiilisuutta/tehokkuutta 53 kohtuullisissa/tavanomaisissa lämpötiloissa tai korotetuissa lämpötiloissa, toisin sanoen jotka edellyttävät termotiilisiä tai lämmönkestäviä entsyymejä. Korotettujen lämpötilojen tiedetään tehostavan selluloosa- tai lignoselluloosamateriaaleissa olevan kiteisen selluloosan hydrolyysiä ja vähentävän näin hydrolyysissä tarvittujen entsyymien kokonaismäärää tai lyhentävän vaadittua hydrolyysiaikaa. Lisäksi koska lignoselluloosasubstraatin viskoosisuus laskee korotetuissa lämpötiloissa, lämmönkestävät entsyymit mahdollistavat työskentelyn korotetuilla kiinteiden aineiden täyttömäärillä ja säästävät investointikustannuksia.
Eräs toinen edullinen suoritusmuoto on keksinnön CBHII/Cel6A-polypeptidin tai mainittua polypeptidiä käsittävän entsyymivalmisteen käyttö hydrolysoitaessa selluloosamateriaalia biopolttoaineen valmistamiseksi, joka käsittää etanolia, propanolia, butanolia ja vastaavia. Biopolttoaineen tuotannossa keksinnön CBHII/CelöA-sellobiohydrolaasit ovat, muiden sellulolyyttisten entsyymien tapaan, erityisen soveltuvia sellaisten glukoosimonomeerien valmistamiseen selluloosapolymeerimateriaalista, jotka voidaan sitten fermentoida hiivakannoilla etanoliksi ja käyttää polttoaineena.
Lignoselluloosamateriaali voidaan esikäsitellä ennen entsymaattista hydrolyysiä selluloosasubstraattien kuiturakenteen hajottamiseksi ja selluloosafraktion tekemiseksi alttiimmaksi sellulolyyttisille entsyymeille. Tämänhetkisiin esikäsittelyihin sisältyvät mekaaniset, kemialliset tai lämpöön perustuvat prosessit sekä niiden yhdistelmät. Materiaali voidaan esimerkiksi esikäsitellä höyryräjäyttämällä tai happohydrolyysillä. Sokeriksi muuntamisprosessi, toisin sanoen sokerimonomeerien valmistus, ja fermentointi hiivakannoilla voidaan suorittaa erikseen tai samanaikaisesti samassa reaktorissa. Keksinnön oj CBHII/Cel6A-sellobiohydrolaasilla on merkittävä etu verrattuna tällä hetkellä saatavilla ° oleviin kaupallisiin entsyymeihin sen suhteen, että se on stabiili myös korotetuissa o lämpötiloissa, toisin sanoen se on lämmönkestävä. Selluloosa- tai lignoselluloosamateriaalin o hydrolyysin tiedetään tehostuvat korotetuissa lämpötiloissa ja tuottavan sokerimonomeereja tehokkaammin.
Q_
OJ
^ Keksinnön CBHII/Cel6A-polypeptidien käyttö mahdollistaa suuren biomassan sakeuden
CD
§ käyttämisen ja johtavat korkeisiin sokeri- ja etanolipitoisuuksiin. Tämä menettelytapa saattaa
(M
54 johtaa merkittäviin säästöihin energiankulutuksessa sekä investointikustannuksissa. Korkea lämpötila myös vähentää hydrolyysin aikaisen saastumisen riskiä.
Sokerihydrolysaatit voivat myös toimia raaka-aineena muille ei-mikrobiaalisille prosesseille, toisin sanoen arvokkaiden sokerien rikastukselle, eristykselle ja puhdistukselle, tai erilaisille polymerointiprosesseille.
Glukoosimonomeerejä voidaan käyttää myös välituotteina tai raaka-aineina valmistettaessa erilaisia kemikaaleja tai rakennusaineita käytettäviksi kemianteollisuuden prosesseissa, esim. niin kutsutussa biojalostamossa.
Massa- ja paperiteollisuudessa polypeptidejä voidaan käyttää selluloosakuitujen muuntelemiseksi esim. käsiteltäessä sulfaattisellua, mekaanista massaa tai kierrätettyä paperia.
Tekstiiliteollisuudessa CBHII/Cel6A-sellobiohydrolaaseilla on käyttöä pehmennettäessä ja/tai parannettaessa puuvillakankaiden tuntua ja poistettaessa indigo värejä sen sijaan että suoritettaisiin kivipesu.
Rehuteollisuudessa keksinnön CBHII/Cel6A-sellobiohydrolaaseja voidaan käyttää hajotettaessa raaka-aineissa olevia selluloosa- tai hemiselluloosamateriaaleja.
Pesuaineteollisuudessa CBHII/Cel6A-sellobiohydrolaaseja voidaan käyttää käsipesuun tai c\i konepesuun tarkoitetuissa pyykin- tai astianpesuainekoostumuksissa selluloosapitoisten cm tahrojen poistamiseksi.
i tn o
Keksintöä havainnollistetaan edelleen seuraavien ei-rajoittavien esimerkkien avulla, o x Koetuloksista voidaan päätellä, että keksinnön sieniperäiset CBHII/Cel6A-sellobiohydrolaasit cc
kykenevät tyydyttämään eri teollisuudenalojen hyvin vaihtelevat tarpeet koskien erilaisissa CM
^ lähtöaineissa olevien selluloosamateriaalien hydrolysoimista.
CD
05 o ^ ESIMERKKI 1. Sellobiohydrolaasi 2 (cbhl) -geenien kloonaus 55
Tavanomaisia molekyylibiologian menetelmiä käytettiin DNA:n eristämisessä ja entsyymikäsittelyissä (esim. plasmidi-DNA:n eristäminen, DNA:n digestio DNA-fragmenttien aikaansaamiseksi), E. coli -transformaatioissa, sekvensoinnissa jne. Näitä perusmenetelmiä käytettiin joko entsyymin, reagenssin tai pakkauksen valmistajan ohjeiden mukaan tai tavalla, joka on kuvattu tavanomaisissa molekyylibiologian oppikirjoissa, esim. Sambrook ja Russell (2001). Genomisen DNA:n eristäminen suoritettiin tavalla, jonka ovat yksityiskohtaisesti kuvanneet Raeder ja Broda (1985).
Kloonausten suorittamiseksi valittiin neljä termofiilistä sienikantaa Roal Oy -kokoelmasta perustuen aiempiin havaintoihin siitä, että nämä kannat tuottavat lämmönkestäviä sellulaaseja (W02007071818; Maheshvvari et ai., 2000; Murray et ai., 2003; Miettinen-Oinonen et ai., 2004). Koettimet cM2-geenien kloonaamiseksi kannoista Acremonium thermophilum ALK04245 ja Melanocarpus albomyces ALK04237 syntetisoitiin PCR-menetelmällä. Degeneroituneet oligot suunniteltiin käyttäen sellobiohydrolaasi I (CBHII) -proteiinien aiemmin julkaistuja aminohapposekvenssejä. Sekvenssit homologisille alukkeille, joita käytettiin kloonattaessa cM2-geenit kannoista Chaetomium thermophilum ALK4265 ja Talaromyces emersonii RF8069, saatiin julkaistuista nukleotidisekvensseistä (AY861348; DQ020255; CQ838150; Murray et ai., 2003; AY075018; AF439936). Alukkeiden sekvenssit on esitetty taulukossa 2 (sekvenssit nro 1-6).
Taulukko 2. Oligonukleotidit, joita käytettiin PCR-alukkeina koettimien monistamiseksi cbh2-geenien seulomista varten kannoista Acremonium thermophilum ALK04245 ja Melanocarpus albomyces ALK04237 sekä täyspitkien cbA2-geenien monistamiseksi kannoista Chaetomium thermophilum ALK04265 ja Talaromyces emersonii RF8069.
C\J ______ 1— Templaatti, Oligonuklotidi Pituus Sekvenssi'3 Sekv.
^ genominen (emäs- nro: i DNA kannasta paria) § ALK04245 ~CBH IS 17 TGGGGNCARTGYGGNGG (s) 1 '__CBH 1AS__17__GCNGGC CAN C CNARC CA (as)__2 § ALK04237__CBH IS__17__TGGGGNCARTGYGGNGG (s)__1 __CBH 1AS__17__GCNGGC CANC CNARC CA (as)__2 C ALK04265__CBH 8__21__ATGGCTAAGCAGCTGCTGCTC (s)__3 __CBH 9__20__TCAGARCGGAGGGTTGGCAT (as)__4 CSJ RF8069 Te_CBH_Ä 44 TATTATCCGCGGACTGCGCATCATGCGGAATCTT 5 I-____CTTGCTCTTG (s)__ ^ Te_CBH_B 38 AATTTGGATCCTCÄGÄÄCÄGCGGGTTÄGCATTCG 6 05 I ___ TGAG(as)__ § (a R = A tai GN N = A tai G tai T tai Y = T tai cl "s" suluissa = sense-juoste, CM "as" suluissa = antisense-juoste.
56
Koettimet monistettiin PCR-menetelmällä taulukossa 2 kuvattujen alukkeiden kanssa käyttäen genomista DNA:ta templaattina reaktioissa. PCR-reaktioseokset kannoille Acremonium thermophilum ALK04245 ja Melanocarpus albomyces ALK04237 sisälsivät 10 mM Tris-HCl:a, pH 8,8, 50 mM KCl:a, 0,1 % Triton X-100:aa, 1,5 mM MgCbia, 0,2 mM dNTP:eja, 5 μΜ kutakin aluketta ja 1-2 yksikköä Dynazyme EXT DNA -polymeraasia (Finnzymes, Suomi) ja 0,5-1 pg vastaavaa genomista DNA:ta. Olosuhteet PCR-reaktioille olivat seuraavat: 5 min alkudenaturaatio 95 °C:ssa, minkä jälkeen 30 sykliä seuraavaa: 1 min 95 °C:ssa, 1 min liittäminen 60 °C:ssa (+5 °C gradientti), 2 min pidentäminen 72 °C:ssa sekä loppupidentäminen 72 °C:ssa 10 min ajan. cM2-geenicn PCR-kloonausta varten kannoista Chaetomium thermophilum ALK04265 ja Talaromyces emersonii RF8069 reaktiot sisälsivät puskureita lx Phusion GC ja vastaavasti lx Phusion HF sekä 0,2 mM dNTP:eja, 5 μΜ kutakin aluketta ja 1-2 yksikköä Phusion DNA -polymeraasia (Finnzymes, Suomi) ja 0,5-1 pg vastaavaa genomista DNA:ta. Olosuhteet PCR-reaktioille olivat seuraavat: 3 min alkudenaturaatio 98 °C:ssa, minkä jälkeen 30 sykliä seuraavaa: 30 s 98 °C:ssa, 30 s liittäminen 55 °C:ssa (+5 °C gradientti), 1-2 min pidentäminen 72 °C:ssa sekä loppupidentäminen 72 °C:ssa 10 min ajan.
Taulukossa 2 kuvatut alukeyhdistelmät tuottivat spesifisen DNA-tuotteen, jonka koko oli odotettu (julkaistuihin cM2-sekvensseihin pohjautuvien laskelmien perusteella). DNA-tuotteet eristettiin ja puhdistettiin PCR-reaktioseoksista ja kloonattiin pCR®4Blunt-TOPO® -vektoriin valmistajan ohjeiden mukaisesti (Invitrogen, USA). Insertit karakterisoitiin sekvensoimalla ja suorittamalla Southern blot -hybridisaatiot genomisiin DNA:ihin, jotka oli pilkottu useilla restriktioentyymeillä. PCR-fragmentit, jotka valittiin käytettäviksi koettimina
CM
o geenien kloonaamista varten kannoista Acremonium thermophilum AFK04245 ja l0 Melanocarpus albomyces AFK04237, on esitetty taulukossa 3. Fisäksi taulukossa on kuvattu o PCR-fragmentit, jotka sisältävät täyspitkät cM2-geenit kannoista Chaetomium thermophilum o x AFK04265 ja Talaromyces emersonii RF8069.
cc
CL
^ Taulukko 3. PCR-reaktioissa käytetyt alukkeet, koettimet, jotka valittiin cbh2- geenien seulomista varten kannoista Acremonium thermophilum ALK04245 ja (j) Melanocarpus albomyces ALK04237 sekä DNA-fragmentit, jotka sisältävät täyspitkät O ciih2-geenit kannoista Chaetomium thermophilum ALK042S5 ja Talaromyces emersonii C\l RF8069. Genominen templaatti-DNA ja koetinfragmentin sisältävän plasmidin nimi on ilmoitettu.
57
Geeni Eteenpäin- Taaksepäin- Genominen Saatu Insertti Sekv.
aluke aluke DNA, jota fragmentti plasmidissa nro: käytettiin (kb) templaattina PCR- ___reaktiossa___ ~MjK04245 cel6A CBH IS ~ CBH IAS ~ ALK04245 1, 0 kb pALK2580 7 ALK04237 cel6A CBH IS__CBH 1AS__ALK04237__0,8 kb__pALK257 6__8 ALK04265 ce!6A CBH 8__CBH 9__ALK04265__1, 8 kb__pALK2904__9 RF80 69 cel6A Te CBH A Te CBH B__RF8069__1,8 kb__pALK3006__10
Kaikista näistä PCR-fragmenteista johdetuilla aminohapposekvensseillä oli homologiaa julkaistuihin CBHII/Cel6A-sekvensseihin nähden (BLAST-ohjelma, versio 2.2.9 NCBIissa, National Center for Biotechnology Information; Altschul et ai., 1990). 1 757 emäsparin PCR-fragmentti plasmidissa pALK2904 (sekvenssi nro 9) ja 1 788 emänparin PCR-fragmentti plasmidissa pALK3006 (sekvenssi nro 10) sisälsivät täyspitkät cM2/ce/6A-geenit kannoista Chaetomium thermophilum ALK04265 ja vastaavasti Talaromyces emersonii RF8069. Chaetomium thermophilum ALK04265:n koodaavalle geenille annettiin nimeksi Q_ALK04265_ce/6A ja Talaromyces emersonii RF8069:n geenille annettiin nimeksi 7e_RF8069_ce/6A. E. coli -kannat RF8214 (= pALK2904) ja RF8333 (= pALK3006) talletettiin DSM-kokoelmaan talletusnumeroilla DSM 22947 ja vastaavasti DSM 23185.
Acremonium thermohilum ALK04245:n ja Melanocarpus albomyces ALK04237:n genomiset DNA:t pilkottiin useilla restriktioentsyymeillä Southern blot -analyysia varten. Hybridisaatioissa käytetyt koettimet olivat 1 032 emänparin (sekvenssin nro 7) ja 831 emäsparin (sekvenssi nro 8) EcoRI-fragmcntit, jotka oli irrotettu plasmideista pALK2580 ja vastaavasti pALK2576. Edellä mainitut koettimet leimattiin käyttäen digoksigeniiniä valmistajan ohjeiden mukaisesti (Roche, Saksa). Hybridisaatiot suoritettiin yön yli 68 °C:ssa.
C\J
q Hybridisaation jälkeen suodattimia pestiin 2x5 min huoneenlämpötilassa käyttäen 2 x SSC:a
CVJ
^ - 0,1 % SDS:a, ja sitten 2x15 min 68 °C:ssa käyttäen 0,1 x SSC:a - 0,1% SDS:a.
o i
O
Kannan Acremonium thermophilum ALK04245 genomisesta DNA:sta hybridisoitiin noin cc “ 8 kiloemäsparin ΑδαΙ-pilkottu fragmentti käyttäen koettimena dioksigeniinileimattua
CM
^ 1 032 emäsparin EcoRI-fragmcnttia plasmidista pALK2580. Vastaavasti kannan
CD
g Melanocarpus albomyces ALK04237 genomisesta DNA:sta hybridisoitiin noin 4,5 o cm kiloemäsparin BamHl-pilkottu fragmentti dioksigeniinileimatun 831 emäsparin EcoKl- 58 fragmentin kanssa plasmidista pALK2576. Hybridisoituvat genomiset DNA-fragmentit eristettiin digestoitujen genomisten fragmenttien joukosta niiden koon perusteella. Genomiset fragmentit eristettiin agaroosigeelistä ja kloonattiin pBluescript II KS+ -vektoreihin (Stratagene, USA), jotka oli katkaistu joko Xbal: 11a (Acremonium thermophilum ALK04245) tai BamWV.Wd (Melanocarpus albomyces ALK04237). Ligaatioseokset transformoitiin Escherichia coli XLIO-Gold -soluihin (Stratagene) ja maljattiin LB (Luria-Bertani) -maljoille, jotka sisälsivät 50-100 pg/ml ampisilliiniä. E. coli -pesäkkeet seulottiin positiivisten kloonien suhteen käyttäen pesäkehybridisaatiota pALK2580- ja pALK2576-inserttien kanssa, jotka toimivat koettimina hybridisaatio-olosuhteissa, jotka vastasivat edellä Southern blot -analyyseille kuvattua, paitsi että käytettiin 65 °C olevaa hybridisaatiolämpötilaa 68 °C:n sijaan. Maljoilta kerättiin useita positiivisia klooneja. Niiden osoitettiin restriktiodigestiolla sisältävät odotetun kokoiset insertit. Täyspitkä geeni, joka koodasi kannan Acremonium thermohilum ALK04245 CBHII/Cel6A:ta (^4t_ALK04245_Cel6A, sekvenssi nro 11) sekvensoitiin 7 kiloemäsparin ΑδαΙ-insertistä ja tämän insertin sisältävälle plasmidille annettiin nimi pALK2582. Plasmidin pALK2582 sisältävä E. coli -kanta RF8175 talletettiin DSM-kokoelmaan talletusnumerolla DSM 22946. Acremonium thermohilum ALK04245 -proteiinia koodaavalle geenille annettiin nimi At_ALK04245_ce/6A. Vastaavasti täyspitkä geeni, joka koodasi kannan Melanocarpus albomyces ALK04237 CBHII/Cel6A:ta (Ma_ALK04237_Cel6A, sekvenssi nro 12) sekvensoitiin 5 kiloemäsparin SamHI-insertistä ja tämän insertin sisältävälle plasmidille annettiin nimi pALK2581. Plasmidin pALK2581 sisältävä E. coli -kanta RF8174 talletettiin DSM-kokoelmaan talletusnumerolla DSM 22945. Melanocarpus albomyces ALK04237 -proteiinia koodaavalle geenille annettiin nimi Ma_ALK04237_ce/6A. Geenien ja johdettujen proteiinisekvenssien (sekvenssit nro 9-16) cm oleellisista tiedoista on esitetty yhteenveto taulukossa 4 ja vastaavasti taulukossa 5.
δ C\l CO Taulukko 4. Yhteenveto cbh2/cel6A-geeneistä, jotka eristettiin kannoista Acremonium ? thermophilum ALK04245, Melanocarpus albomyces ALK04237, Chaetomium thermophilum g ALK04265 ja Talaromyces emersonii RF8069.
Geeni Pituus sis. Koodaava Oletettujen Oletettujen Sekv.
CL
intronit alue (bp) intronien intronien pituus nro: ^ (bp) lukumäärä (bp) ------ CD At ALK04245 cel6A__1 830__1 434__4__79, 72, 117, 126__11 § Ma ÄLK04237 cel6A__1 607__1 416__2__93, 95__13 O Ct ALK04265 cel6A__1 757__1 425__3__77, 196, 56__9 ^ Te_RF8 0 6 9_cel6A 1 754 1 377 7 50, 44, 52, 56, 10 ____ 53, 59, 60__ 59 (a Sisältäen lopetuskodonin.
(b Ilman lopetuskodonia.
C\J
δ
(M
in o sj- o
X
Χ
CL
(M
sj-
CD
σ> o o
(M
60
Taulukko 5. Yhteenveto aminohapposekvensseistä, jotka johdettiin kantojen Acremonium thermophilum ALK04245, Melanocarpus albomyces ALK04237, Chaetomium thermophilum ALK04265 ja Talaromyces emersonii RF8069 cbh2/cel6A-geenisekvensseistä.
CBHII/Cel6A- Aminohappo- Signaali- CBD<d Ennustettu Ennustettu Sekv.
... . jen määrä , , ,. pl, ilman nro: proteiini J sekvenssin molekyyli- signaali- pituus paino (Da), sekvenssiä NN/HMM (a ilman signaali- sekvenssiä(c
At_ALK04245_Cel6A 478 18 Q26-L63 48 918 4,82 12
Ma_ALK0423 7_Cel6A 472 T7 Q25-L62 48 627 4,50 14
Ct_ALK04265_Cel6A 475 17 Q25-I62 49 408 5,31 15
Te_RF8069_Cel6A 459 Ϊ9 Q20-V55 46 618 4,27 Ϊ6
Signaalisekvenssiä koskeva ennuste tehtiin käyttäen ohj elmaa SignalP V3.0 (Nielsen et ai., 1997; Nielsen ja Krogh, 1998; Bendtsen et ai., 2004); NN-arvo saatiin käyttäen neuroverkkoja.
(b Selluloosaa sitova domeeni (CBD), CBD-alueen aminohapot on osoitettu [Ml(Met #1) sisällytetty numerointiin].
(c Ilman ennustettua signaalisekvenssiä. Ennuste laadittiin käyttäen Compute pI/MW -työkalua ExPASy-palvelimella (Gasteiger et ai. 2003).
Taulukossa 6 on esitetty johdettujen CBHII/Cel6A-sekvenssien kannoista Acremonium thermophilum ALK04245, Melanocarpus albomyces ALK04237, Chaetomium thermophilum ALK04265 ja Talaromyces emersonii DSM 2432 (RF8069) keskinäinen vertailu. Identtisyysasteen määrittämiseen käytettiin Clone Managerin (versio 9) ohjelmaa, joka sisälsi toiminnot “Compare Two Sequences/Global/Compare sequences as amino acids/BLOSUM62 scoring matrix”.
Taulukko 6. Identtisyysarvot (%) , jotka saatiin rinnastamalla CBHII/Cel6A-aminohapposekvenssit kannoista Acremonium thermophilum ALK04245, Melanocarpus albomyces ALK04237, Chaetomium thermophilum ALK04265 ja Talaromyces emersonii RF8069. Rinnastuksessa käytettiin täyspitkiä aminohapposekvenssejä, jotka cvj sisälsivät signaalisekvenssit. Identtisyysasteen määrittämisessä käytettiin Clone v Managerin 9 ohjelmaa (Compare Two Sequences/Global/Compare sequences as amino C\j acids/BLOSUM62 scoring matrix) .
LO __ ? ALK04245_ ALK04237_ ALK04265_ RF8069_
Cel6A Cel6A Cel6A Cel6A
O-- AI,:-' )42.4 5 Ge 6Λ 100 SSSSSSSS 67 68 66 Ϊ ALK04 2 3 7_Cel 6A ||||||||β|||Ι11 71 60 ALK04265_Cel6A 61 cvj RF8069 Cel6A__^lllililllllig
CD
o Taulukoissa 7 ja 8 on esitetty johdettujen CBHII/Cel6A-sekvenssien kannoista Acremonium thermophilum ALK04245, Melanocarpus albomyces ALK04237, Chaetomium 61 thermophilum ALK04265 ja Talaromyces emersonii RF8069 vertailu tietokannoista löytyneisiin sekvensseihin.
Taulukko 7. Korkeimmat sekvenssien identtisyysarvot johdetuille CBHII/Cel6A-aminohapposekvensseille kannoista Acremonium thermophilum ALK04245, Melanocarpus albomyces ALK04237, Chaetomium thermophilum ALK04265 ja Talaromyces emersonii RF8069. Rinnastuksessa käytettiin täyspitkiä aminohapposekvenssejä, jotka sisälsivät signaalisekvenssit. Tietokantahaku suoritettiin käyttäen BLAST:ia (tblastn, nr/nt-tietokanta) ja identtisyysasteen määrityksessä käytettiin Clone Managerin 9 ohjelmaa (Compare Two Sequence s/Global/Compare sequences as amino acids/BLOSUM62 scoring matrix).
Identtisyys
Organismi ja talletusnumero (%)_
At_ALK04245_Cel6A 100
Podospora anserine, XP_001903170 69
Neurospora erässä, XM 955677__69_
Afa_ALKO4237_Ce 16A 100
Chaetomium globosum, XP 001226029__75_
Ct_ALK04265_Cel6A 100
Chaetomium thermophilum, AY861346__94_
Te_RF80 69_Cel6A 100
Talaromyces emersonii, AY075018 90
Taulukko 8. Korkeimmat patentoitujen sekvenssien identtisyysarvot johdetuille CBHII/Cel6A-aminohapposekvensseille kannoista Acremonium thermophilum ALK04245, Melanocarpus albomyces ALK04237, Chaetomium thermophilum ALK04265 ja Talaromyces emersonii RF8069. Rinnastuksessa käytettiin täyspitkiä aminohapposekvenssejä, jotka sisälsivät signaalisekvenssit. Haut tietokannoista Chemical Abstracts Service (CAS) Registry System ja Patended Protein Sequences NCBIT suoritettiin käyttäen BLAST:ia, ja identtisyysasteen määrityksessä käytettiin Clone Managerin 9 ohjelmaa (Compare Two Sequences/Global/Compare sequences as amino acids/BLOSUM62 scoring matrix).
Identtisyys
Organismi ja talletusnumero (%)
At_ALK04245_Cel6A 100 US7220565 B2, sekvenssi nro 2 75 WQ2009085868 B2, sekvenssi nro 49_ 75 cyj Ma_ALK04237_Ce 16A 100 q WO2008095033 A2, sekvenssi nro 413 72 (M WO2009085868 AI, sekvenssi nro 49 71
LO
O Ct_ALK04265_Cel6A 100 EP1578964 Bl, sekvenssi nro 2 94 ® WO2009059234 A2, sekvenssi nro 45*’ 94 X CN1757709A 94 tr--—- □.
Te_RF8069_Cel6A 100 £! W02006074005 A2, kuvio 3A-C 90
CD
O) *) Julkaisun W02009059234 selitysosassa viitataan sekvenssiin SEQ ID NO: 45 § (DNA) tai SEQ ID NO:46 (proteiini). Julkaisun WO2009059234 sekvenssiluettelossa (M viitataan sekvenssiin SEQ ID NO:35 (DNA) tai SEQ ID NO:36 (proteiini).
62 ESIMERKKI 2. Rekombinanttisten CBHII/Cel6A -proteiinien tuotanto Trichoderma teeseissä
Aikaansaatiin ekspressioplasmidit käytettäviksi tuotettaessa rekombinanttisia CBHII/Cel6A-proteiineja kannoista Acremonium thermophilum ALK04245, Melanocarpus albomyces ALK04237, Chaetomium thermophilum ALK04265 ja Talaromyces emersonii RF8069 Trichoderma teeseissä. Aikaansaadut ekspressioplasmidit on lueteltu taulukossa 9. Rekombinanttiset cWz2/ce/6A-geenit, jotka sisälsivät niiden omat signaalisekvenssit, fuusioitiin tarkasti T. teesein cöM/ce/7A-promootttoriin PCR-menetelmällä. Transkription päättyminen varmistettiin T. reesein cbh 1 /«77A-terminaattorilla ja A. nidulansin amdS-markkerigeeniä käytettiin transformanttien valitsemisessa, kuten ovat kuvanneet Paloheimo et ai. (2003). Lineaariset ekspressiokasetit (kuvio 1) eristettiin vektorirungoista EcoRI- tai iscoRI-S^el-digestion jälkeen ja niitä käytettiin T. reesein protoplastien transformoinnissa. Käytetty isäntäkanta ei tuota mitään T. reesein pääasiallisista sellulaaseista (CBHI, CBHII, EGI, EGII). Transformaatiot suoritettiin kuten ovat kuvanneet Penttilä et ai. (1987) niillä muunnelmilla, jotka ovat esittäneet Karhunen et ai. (1993), valiten asetamidi ainoaksi typen lähteeksi (amc/S-markkerigeeni). Transformantit puhdistettiin selektiivisillä maljoilla käyttäen yksittäisiä konidioita ennen niiden itiöittämistä PD:llä.
Taulukko 9. Ekspressiokasetit, jotka rakennettiin käytettäviksi tuotettaessa rekombinanttisia CBHII/Cel6A-proteiineja kannoista Acremonium thermophilum ALK04245, Melanocarpus albomyces ALK04237, Chaetomium thermophilum ALK04265 ja Talaromyces emersonii RF8069 Trichoderma reeseissä. Ekspresslokasettlen yleinen rakenne oli kuten on kuvattu kuviossa 1. Kloonatut cbh2/cel6A-geenit fuusioitiin tarkasti T. reesein cbhl/cel7A-promoottoriin.
Sellobiohydrolaasi Ekspressioplasmidi Ekspressiokasetti ,a Terminaattori (t> OJ II -proteiini ^ At_ALK04245_Cel6A pÄLK2 90 6 9,4 kb EcoRI 125 bp (Xbal) LO Ma_ALKO4237_Cel6A pÄLK2 901 9,3 kb EcoRI-Spel 258 bp (Drain) O----
' Ct_ALK04265_Cel6A pALK2903 9,2 kb EcoRI
____
O Te_RF8069_Cel6A pALK3010 7, 9 kb EcoRI
^ ,a Ekspressiokasetti T~. reesein transformaatiota varten eristettiin vektorirungosta käyttäen joko EcoRI- tai EcoRI-Spel-digestiota.
(b Ekspressiokasettiin sisällytetyn rekombinanttisen geenin nukleotidien lukumäärä t— lopetuskodonin jälkeen. Genomisen geenifragmentin 3'-päässä oleva restriktiokohta, ^ jota käytettiin rakennettaessa ekspressiokasetti, on osoitettu sulkeilla.
05 ct_ _ALK04265_cel6A -geenifragmentti katkaistiin sen 3'-päästä EcoRI:11a (pCR®4Blunt- § T0P0®-vektorissa oleva kohta). Vastaavasti Te_RF8069_cel6A-geenifragmentti C\j katkaistiin sen 3'-päästä BamHI:11a (kohta, joka luotiin lopetuskodonin jälkeen PCR:ssä). Näin konstrukteihin ei jää alkuperäistä Ct_ALK04265_cel6A- tai Te_RF8069_cel6A-terminaattoria ennen cbhl-terminaattorisekvenssiä.
63 CBHII/Cel6A:n tuotanto transformanteista analysoitiin ravistuspulloviljelmistä saaduista viljelmien supernatanteista. Transformantit siirrostettiin PD-vinopinnoilta ravistuspulloihin, jotka sisälsivät 50 ml kompleksista laktoosipohjaista sellulaasia indusoivaa elatusainetta (Joutsjoki et ai, 1993), joka oli puskuroitu käyttäen 5 % KE^PO^a. Transformanttien CBHII/Cel6A-proteiinin tuotanto analysoitiin viljelmien supernatanteista sen jälkeen, kun niitä oli kasvatettu 7 päivää 30 °C:ssa, 250 rpm. Rekombinanttisten proteiinien heterologinen tuotanto analysoitiin SDS-PAGE:lla ja sen jälkeen Coomassie-värjäyksellä. Valittujen transformattien genotyypit vahvistettiin käyttäen Southern blot -analyyseja, joihin sisällytettiin useita digestoituja genomisia fragmentteja, ja ekspressiokasettia käytettiin koettimena.
Tuottavimmat transformantit valittiin viljeltäviksi laboratoriomittakaavan bioreaktoreissa. Transformantteja viljeltiin laboratoriobioreaktoreissa 28 °C:ssa sellulaasia indusoivassa kompleksisessa elatusaineessa 3-4 päivää säätäen pH-arvoksi 4,4 ± 0,2 (NH3/H3PO4), niin että saatiin sovelluskokeissa käytettävä materiaali. Supernatantit otettiin talteen sentrifugoimalla ja suodattamalla Seitz-K 150 - ja EK-suodattimien läpi (Pali SeitzSchenk Filtersystems GmbH, Bad Kreuznach, Saksa).
ESIMERKKI 3. Rekombinanttisten CBHII/Cel6A-entsyymien aikaansaama kiteisen selluloosan (Avicel) hydrolyysi
Rekombinanttiset CBHII/Cel6A-entsyymivalmisteet karakterisoitiin niiden pH-riippuvuuden ja lämmönkestävyyden suhteen käyttäen kiteistä selluloosaa (Avicel) substraattina. pH- riippuvuus ja lämmönkestävyys rekombinanttisille CBHII/Cel6A-proteiineille kannoista
Acremonium thermophilum ALK04245, Melanocarpus albomyces ALK04237, Chaetomium ^ thermophilum ALK04265 ja Talaromyces emersonii RF8069 määritettiin pH-alueella 3,0- ° 10,0 ja vastaavasti lämpötila-alueella 40-80 °C. Kiteisen selluloosan (Ph 101, Avicel; Fluka,
Bucsh, Sveitsi) hydrolyysimääritykset suoritettiin 2,0 ml:n koeputkimittakaavassa 50 mM x Q- natriumasetaatissa, pH 6,0. Optimaalisen pH-arvon määrittämiseksi substraattiliuoksia £! (Avicel, 50 mg/ml natriumasetaatissa, pH 6,0), jotka olivat pH-alueella 3-10, ravisteltiin sj- entsyymivalmisteiden kanssa (100 pg proteiinia reaktiossa) 50 °C:ssa, ja reaktioseoksen o oj lopullinen tilavuus oli 650 μΐ. Hydrolyysiä jatkettiin 21 tuntia ja se pysäytettiin lisäämällä 64 326 μΐ pysäytysreagenssia, joka sisälsi 9 tilavuusosaa 94-prosenttista etanolia ja 1 tilavuusosan IM glysiiniä (pH 11). Liuos suodatettiin Millex GV13 0,22 pm -suodatusyksikön läpi (Millipore, Billerica, MA, USA). Liukoisten pelkistävien sokereiden muodostuminen supematanttiin määritettiin parahydroksibentsoehappohydratsidi-menetelmällä (PAHBAH-menetelmällä) (Lever, 1972) käyttäen sellobioosi-standardikäyrää (200-1 200 μΜ sellobioosia). Vastavalmistettua 0,1 M PAHBAH:a (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) 0,5 M NaOH-liuoksessa (200 μΐ) lisättiin 300 pl:aan suodatettua näytettä ja tätä keitettiin 10 minuuttia, minkä jälkeen liuos jäähdytettiin huoneenlämpötilaan. Absorbanssi aallonpituudella 405 nm määritettiin duplikaattinäytteistä Multiskan EX -fotometrillä (Thermo Labsystems, Franklin, MA, USA). Vastaavasti rekombinanttisten CBHII/Cel6A-proteiininen lämmönkestävyys määritettiin Avicel-substraattiliuoksissa lämpötila-alueella 40-80 °C optimaalisessa pH:ssa käyttäen reaktioaikana 21 tuntia. Tulokset osoittavat, että Talaromyces emersonii RF8069 -kannan CBHII/Cel6A:n ja Melanocarpus albomyces ALK04237 -kannan CBHII/Cel6A:n optimaalinen pH on 4,0, kun taas kantojen Chaetomium thermophilum ALK04265 ja Acremonium thermophilum ALK04245 entsyymien optimaalinen pH on 5,0 (kuvio 2). Lämmönkestävyyden todettiin olevan merkittävästi korkeampi Acremonium thermophilum ALK04245:n, Chaetomium thermophilum ALK04265:n ja Talaromyces emersonii RF8069:n CBHII/Cel6A:lla kuin Melanocarpus albomyces ALK04237 -proteiinilla (kuvio 3).
ESIMERKKI 4. Lehtipuusubstraatm hydrolyysi rekombinanttista CBHII/Cel6A-sellobiohydrolaasia käsittävillä entsyymivalmisteilla cvj Höyryräjäytettyä lehtipuuta suspendoitiin 0,05 M natriumasetaattipuskuriin, pH 4,8.
cu Hydrolyysiseoksen lopullinen paino oli 20 g, josta kiintoaineiden yhteenlaskettu osuus oli i o 2 % (paino/paino). Substraatti hydrolysoitiin käyttäen erilaisia entsyymiseoksia annostuksella, q joka oli 5 mg proteiinia per gramma kokonaiskiintoaineitta, 50 ml:n ravistuspulloissa.
Entsyymiaineosien ja seosten proteiinipitoisuudet määritettiin käyttäen Pierce BCA -
CL
^ määrityspakkausta (Thermo Scientific, tuotenumero 23227) sekä naudan seerumin albumiinia 2 (Bovine Serum Albumin, Thermo Scientific, tuotenumero 23209) standardina.
σ> § Ravistuspulloja ravisteltiin lineaarisesti ravistelevassa vesihauteessa, joka oli säädetty eri cu lämpötiloihin. Kutakin näytekohtaa varten otettiin 1 ml:n näyte duplikaattiravistuspulloista ja 65 näytettä keitettiin 10 minuuttia entsymaattisen hydrolyysin päättämiseksi, se sentrifugoitiin ja supernatantti analysoitiin hydrolyysistä peräisin olevien reaktiotuotteiden suhteen. Nollanäytteet, jotka sisälsivät pelkkää substraattia (pelkkä puskuri entsyymien sijaan) valmistettiin samalla tavalla kuin muut näytteet.
Valmistettiin kolme erillistä seosyhdistelmää (termofiilinen SEOS 2, mesofiilinen SEOS ACC ja mesofiilinen SEOS T. REESEIN ENTSYYMIT) käyttäen erilaisia Cel6A/CBHII
korvaajia.
Termofiilisten sellulaasien seos valmistettiin käyttäen seuraavia aineosia:
Termofiilinen Cel7A/CBHI-valmiste, joka sisältää kannan Thermoascus aurantiacus ALK04242 Cel7A:ta, johon on geneettisesti liitetty CBD T. reesein CBHI/Cel7A:sta (W02007071818).
Termofiilinen endoglukanaasivalmiste, joka sisältää kannan Acremonium thermophilum ALK04245 Cel45A-endoglukanaasia (At EG_40/Cel45A, W02007071818).
Termofiilinen B-ghikosidaasivalmiste, joka sisältää kannan Thermoascus aurantiacus ALK04242 B-glukosidaasia (Ta pG_81/Ccl3A, W02007071818).
Termofiilinen ksylanaasivalmiste, joka sisältää Nonomurea flexuosan XynllA:ta (AM24, W02005100557, AB Enzymes Oy, Suomi).
Kaikki sellulaasit valmistettiin heterologisesti monokomponentteina Trichoderma reesei -isäntäkannassa, jolla oli sellulaasivapaa tausta (neljää pääasiallista sellulaasia Cel7A/CBHI, Cel6A/CBHII, Cel7B/EGI ja Cel5A/EGII koodaavat geenit oli deletoitu). Seoksessa käytettiin cm puhdistamattomia viljelmien supernatantteja. Entsyymiaineosia yhdistettiin seuraavalla ^ tavalla (per 10 ml seosta): CBHI/Cel7 A-valmistetta 330 mg (71,2 %), i cp endoglukanaasivalmistetta 105 mg (22,7 %), B-glukosidaasivalmistetta 7,5 mg (1,6 %) ja o ksylanaasivalmistetta 21 mg (4,5 %). Tilavuudeksi säädettiin 10 ml käyttäen vesijohtovettä, ir Seoksen lopullinen proteiinipitoisuus oli 46,35 mg/ml. Tälle entsyymiseokselle annettiin nimi cvj SEOS 2.
CD
CD
o Cel6A/CBHII:n tehokkuuden testaamiseksi hydrolyysissä SEOKSEN 2 kanssa 15 %
CM
(49,5 mg) SEOKSEN 2 CBHI/Ccl7A-aincosaa korvattiin Mz_ALK04237_Cel6A:lla (SEOS
66 2_MA), G ALK04265_Ccl6Ailia (SEOS 2_CT) tai vastaavasti ^t_ALK04245_Cel6A:lla (SEOS 2 AT).
Tekniikan tason mukainen seos valmistettiin yhdistämällä seuraavia aineosia (per 10 ml seosta): valmistetta ECONASE® CE (Roal Oy, perinteinen T. reesein entsyymituote) 470 mg (94 %), β-glukosidaasivalmistetta (At pG_101/Cel3A, W02007071818) 20 mg (4 %) ja ksylanaasivalmistetta (Ta XYN_30, W02007071818) 10 mg (2 %). Tilavuudeksi säädettiin 10 ml käyttäen vesijohtovettä. Seoksen lopullinen proteiinipitoisuus oli 50 mg/ml. Tälle entsyymiseokselle annettiin nimi SEOS T. REESEIN ENTSYYMIT. Entsyymit At pG_101/Cel3A ja TaXYN_30 valmistettiin heterologisesti monokomponentteina Trichoderma reesei -isäntäkannassa, jolla oli sellulaasivapaa tausta.
Cel6A/CBHII:n tehokkuuden testaamiseksi hydrolyysissä SEOKSEN T. REESEIN ENTSYYMIT kanssa 15 % (70,5 mg) ECONASE® CE -aineosaa SEOKSESTA T. REESEIN ENTSYYMIT korvattiin Tfa_ALK04237_Ccl6A:lla (SEOS TRMA), a_ALK04265_Cel6A:lla (SEOS TR CT) tai vastaavasti rii ALK04245_Ccl6A:lla (SEOS TRAT).
SEOS ACC valmistettiin kaupallisesta Accellerase® 1000 -tuotteesta (valmistaja Genencor International/Danisco A/S) (per 10 ml): Accellerase® 1000 400 mg proteiinia (100 %). Tilavuudeksi säädettiin 10 ml käyttäen vesijohtovettä. Seoksen lopullinen proteiinipitoisuus 011 40 mg/ml.
c\j Cel6A/CBHII:n tehokkuuden testaamiseksi hydrolyysissä SEOKSEN ACC kanssa 15 % cm (60 mg) SEOKSEN ACC Accellerase® 1000 -aineosaa korvattiin Mö_ALK04237_Ce 16A: 11 a i o (SEOS ACCMA), Ct_ALK04265_Cel6A:lla (SEOS ACCCT) tai vastaavasti 0 ^t_ALK04245_Cel6A:lla (SEOS ACC AT).
CC
Q_ cm SEOKSEN 2 yhdistelmiä varten hydrolyysi suoritettiin 55 °C:ssa, kun taas
S hydrolyysilämpötila SEOKSELLA T. REESEIN ENTSYYMIT ja SEOKSELLA ACC
O) o suoritetuissa kokeissa oli 37 °C. Hydrolyysistä otettiin näytteet 72 tunnin jälkeen, ne
CM
kvantifioitiin HPLCdlä ja glukoosi-ja ksyloosipitoisuudet määritettiin. Tulokset substraattien 67 nollanäytteistä vähennettiin entsyymeitä käyttäen saaduista tuloksista ja glukoosin ja ksyloosin yhdistetty pitoisuus on esitetty kuvioissa 4A-C.
Tulokset osoittavat selvästi paremman tehokkuuden SEOKSELLA 2 lämmönkestävien Cel6A/CBHII-entsyymien kanssa 55 °C:ssa. Lehtipuusubstraatista vapautuneiden sokerien määrän havaittiin kasvavan 12 %, 14 % ja 26 %, kun SEOKSESSA 2 käytettiin täydennyksenä, vastaavassa järjestyksessä, Mz_ALK04237_Cel6A-, C/_ALK04265_Cel6A-tai ^4t_ALK04245_Cel6A-entsyymiä. Acremonium thermophilum ALK04245 -entsyymin havaittiin olevan tehokkain tässä yhteydessä tutkittu Cel6A/CBHII (kuvio 4A). At_ALK04245_Cel6A:lla havaittiin lisääntynyttä hydrolyysia myös 37 °C:ssa, kun sitä lisättiin joko tekniikan tason mukaiseen Trichoderma-scoksccn (SEOS T. REESEIN ENTSYYMIT) (kuvio 4B) tai kaupalliseen tuotteeseen (SEOS ACC) (kuvio 4C).
ESIMERKKI 5. Maissintähkien hydrolyysi rekombinanttista CBHII/Cel6A-sellobiohydrolaasia käsittävillä entsyymivalmisteilla Höyryräjäytettyjä maissintähkiä suspendoitiin 0,05 M natriumasetaattipuskuriin, pH 4,8. Hydrolyysiseoksen lopullinen paino oli 20 g, josta kiintoaineiden yhteenlaskettu osuus oli 2 % (paino/paino). Substraatti hydrolysoitiin käyttäen erilaisia entsyymiseoksia annostuksella, joka oli 5 mg proteiinia per gramma kokonaiskiintoaineitta, 50 ml:n ravistuspulloissa. Entsyymiaineosien ja seosten proteiinipitoisuudet määritettiin käyttäen Pierce BCA -määrityspakkausta (Thermo Scientific, tuotenumero 23227) sekä naudan seerumin albumiinia (Bovine Serum Albumin, Thermo Scientific, tuotenumero 23209) standardina. cm Ravistuspulloja ravisteltiin lineaarisesti ravistelevassa vesihauteessa, joka oli säädetty cm 55 °C:seen. Kutakin näytekohtaa varten otettiin 1 ml:n näyte duplikaattiravistuspulloista, ja i o näytettä keitettiin 10 minuuttia entsymaattisen hydrolyysin päättämiseksi, se sentrifugoitiin ja o supernatantti analysoitiin hydrolyysistä peräisin olevien reaktiotuotteiden suhteen, g Nollanäytteet, jotka sisälsivät pelkkää substraattia (pelkkä puskuri entsyymien sijaan) Q_ ^ valmistettiin vastaavalla tavalla kuin muut näytteet.
CD
CD
o o
CM
68 Lämmönkestävien sellulaasien seos valmistettiin käyttäen seuraavia aineosia:
Termofiilinen Cel7A/CBHI-valmiste, joka sisältää kannan Thermoascus aurantiacus ALK04242 Cel7A:ta, johon on geneettisesti liitetty CBD T. reesein CBHI/Cel7A:sta (W02007071818).
Termofiilinen endoglukanaasivalmiste, joka sisältää kannan Acremonium thermophilum ALK04245 Cel45A-endoglukanaasia (At EG_40/Cel45A, W02007071818).
Termofiilinen β-glukosidaasivalmiste, joka sisältää kannan Thermoascus aurantiacus ALK04242 β-glukosidaasia (Ta pG81/Ccl3A, W02007071818).
Termofiilinen ksylanaasivalmiste, joka sisältää Nonomurea flexuosan XynllA:ta (AM24, W02005100557).
Kaikki sellulaasit valmistettiin heterologisesti monokomponentteina Trichoderma reesei -isäntäkannassa, jolla oli sellulaasivapaa tausta (neljää pääasiallista sellulaasia Cel7A/CBHI, Cel6A/CBHII, Cel7B/EGI ja Cel5A/EGII koodaavat geenit oli deletoitu). Seoksessa käytettiin puhdistamattomia viljelmien supematantteja. Entsyymiaineosia yhdistettiin seuraavalla tavalla (per 10 ml seosta): CBHI/Cel7 A-valmistetta 330 mg (71,2 %), endoglukanaasivalmistetta 105 mg (22,7 %), β-glukosidaasivalmistetta 7,5 mg (1,6 %) ja ksylanaasivalmistetta 21 mg (4,5 %). Tilavuudeksi säädettiin 10 ml käyttäen vesijohtovettä. Seoksen lopullinen proteiinipitoisuus oli 46,35 mg/ml. Tälle entsyymiseokselle annettiin nimi SEOS 2.
d/_ALK04245_Cel6A:n tehokkuuden testaamiseksi hydrolyysissä SEOKSEN 2 kanssa, 15 % (49,5 mg) SEOKSEN 2 CBHI/Cel7A-aineosaa korvattiin vastaavasti cm ^t_ALK04245_Cel6A:lla (SEOS 2_AT).
δ
CM
o Hydrolyysistä otettiin näytteet 72 tunnin jälkeen, ne kvantifioitiin HPLC:llä ja glukoosi- ja o ksyloosipitoisuudet määritettiin. Tulokset substraattien nollanäytteistä vähennettiin c entsyymeitä käyttäen saaduista tuloksista ja glukoosin ja ksyloosin yhdistetty pitoisuus on c\i esitetty kuviossa 5.
5-
CD
O) o o
CM
69
Vastaavalla tavalla kuin on kuvattu esimerkissä 4, tästä saadut tulokset osoittavat SEOKSEN 2 selvästi paremman tehokkuuden .4i_ALK04245_Ccl6A-cntsyymin kanssa 55 °C:ssa maissintähkäsubstraatilla.
VIITTEET
Altschul SF, W Gish, W Miller, EW Myers ja DJ Lipman. 1990. Basic local alignment search tool. J. Mol. Biol. 215: 403-410.
AMFEP, 2007. Association of Manufacturers and Formulators of Enzyme products, kaupallisten entsyymien luettelo osoitteessa http://www.amfep.org/hst.html (päivitetty 30.11.2007).
Badger, PC. 2002. Ethanol from cellulose: a general review. Julkaisussa Trends in new crops and new uses. J Janickja A Whipkey (toim.). ASHS Press, Alexandria, VA, USA, s. 17-21.
Bendtsen JD, H Nielsen, G von Heijne ja S Brunak. 2004. Improved prediction of signal peptides: SignalP 3.0. J. Mol. Biol. 340: 783-795.
Biely P, M Vrsanska, M Tenkanen ja D Kluepfel. 1997. Endo-beta-l,4-xylanase families: differences in catalytic properties. Journal of Biotechnology 57: 151-166.
Bolton, ET ja BJ McCarthy. 1962. A general method for the isolation of RNA complementary to DNA. Proc. Nat. Acad. Sci. USA 48: 1390-1397.
^ Collins CM, PG Murray, S Denman, A Grassick, TT Teeri, L Byrnes ja MG Tuohy. 2003.
Molecular cloning of the cellobiohydrolase genes of Talaromyces emersonii. Biochem
LO
? Biophys Res. Comm. 301: 280-286.
‘'sf
O
X
£ Cullen D ja PJ Kersten. 2004. Enzymology and molecular biology of lignin degradation.
£! Julkaisussa: The Mycota III. Biochemistry and molecular biology. R Brambl ja GA Marzluf §> (toim.). 2. painos, Springer-Verlag, Berlin-Heidelberg, s. 249-273.
o o
C\J
70
Del Canizo AN, RA Hours, MV Miranda, O Cascone. 1994. Fractionation of fungal pectic enzymes by immobilised metal ion affinity chromatography. J. Sci. Food Agric. 64: 527-531.
Edman P ja G Begg. 1967. A protein sequenator. Eur. J. Biochem. 1: 80-91.
Galagan JE, SE Calvo, KA Borkovich, EU Selker, ND Read, D Jaffe, W FitzHugh, LJ Ma, S Smirnov, S Purcell, B Rehman, T Elkins, R Engels, S Wang, CB Nielsen, J Butler, MEndrizzi, D Qui, P Ianakiev, D Bell-Pedersen, MA Nelson, M Werner-Washburne, CP Selitrennikoff, JA Kinsey, EL Braun, A Zelter, U Schulte, GO Kothe, G Jedd, W Mewes, C Staben, E Marcotte, D Greenberg, A Roy, K Foley, J Naylor, N Stange-Thomann, R Barrett, S Gnerre, M Kamal, M Kamvysselis, E Mauceli, C Bielke, S Rudd, D Frishman, S Krystofova, C Rasmussen, RL Metzenberg, DD Perkins, S Kroken, C Cogoni, G Macino, D Catcheside, W Li, RJ Pratt, SA Osmani, CP DeSouza, L Glass, MJ Orbach, JA Berglund, R Voelker, O Yarden, M Plamann, S Seiler, J Dunlap, A Radford, R Aramayo, DO Natvig, LA Alex, G Mannhaupt, DJ Ebbole, M Freitag, I Paulsen, MS Sachs, ES Lander, C Nusbaum, B Birren. 2003. The genome sequence of the filamentous fungus Neurospora crassa. Nature 422: 859-868.
Gasteiger, E, A Gattiker, C Hoogland, I Ivanyi, RD Appel ja A Bairoch. 2003. ExPASy: the proteomics server for in-depth protein knowledge and analysis. Nucleic Acids Res. 31: 3784-3788.
Ghose TK. 1987. International Union of Pure and Applied Chemistry. Measurement of cellulase activities. Pure and Appi. Chem. 59: 257-268.
CM
δ
CM
ιό Henrissat B. 1991. A classification of glycosyl hydrolases based on amino acid sequence o similarities. Biochem. J. 280: 309-316. o x
X
Henrissat B ja A Bairoch. 1993. New families in the classification of glycosyl hydrolases
CM
^ based on amino acid sequence similarities. Biochem. J. 293: 781-788.
CD
cn o o
CM
71
Henrissat B ja A Bairoch. 1996. Updating the sequence-based classification of glycosyl hydrolases. Biochem. J. 316: 695-696
Henrissat B, TT Teeri ja RAJ Warren. 1998. A scheme for designating enzymes that hydrolyse the polysaccharides in the cell wall of plants. FEBS Letters 425: 352-354.
Hong J, H Tamaki, K Yamamoto ja H Kumagai. 2003a. Cloning of a gene encoding a thermo-stabile cndo-β-1,4-glucanasc from Thermoascus aurantiacus and its expression in yeast. Biotechnol. Letters 25: 657-661.
Hong J, H Tamaki, K Yamamoto ja H Kumagai. 2003b. Cloning of a gene encoding thermostable cellobiohydrolase from Thermoascus aurantiacus and its expression in yeast. Appi. Microbiol. Biotechnol. 63: 42-50.
Joutsjoki W, TK Torkkeli ja KMH Nevalainen. 1993. Transformation of Trichoderma reesei with the Hormoconis resinae glucoamylase P (gamP) gene: production of a heterologous glucoamylase by Trichoderma reesei. Curr. Genet. 24: 223-228.
Karhunen T, A Mäntylä, KMH Nevalainen ja PL Suominen. 1993. High frequency one-step gene replacement in Trichoderma reesei. I. Endoglucanase I overproduction. Mol. Gen. Genet. 241: 515-522.
Karlsson J, M Saloheimo, M Siika-aho, M Tenkanen, M Penttilä ja F Tjerneld. 2001. Homologous expression and characterization of Cel61A (EGIV) of Trichoderma reesei. Eur. cvi J. Biochem. 268: 6498-6507.
δ
(M
g Kurabi A, A Berlin, N Gilkes, D Kilbum, A Markov, A Skomarovsky, A Gusakov, O
g Okunev, A Sinitsyn, D Gregg, D Xie ja J Saddler. 2005. Enzymatic hydrolysis of steam- i exploded and ethanol organosolv-pretreated Douglas-Fir by novel and commercial fungal cellulases. Appi. Biochem and Biotechnol. Vol 121-124: 219-229.
CVJ
Oi Laemmli UK. 1970. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of o bacteriophage T4. Nature 227: 680-685.
72
Lever M. 1972. A new reaction for colorimetric determination of carbohydrates. Anal. Biochem., 47: 276-279.
Maheshwari R, G Bharadwaj ja MK Bhat. 2000. Thermophilic fungi: their physiology and enzymes. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 64: 461-488.
Malardier L, MJ Daboussi, J Julien, F Roussel, C Scazzocchio ja Y Brygoo. 1989. Cloning of the nitrate reductase gene (niaD) of Aspergillus nidulans and its use for transformation of Fusarium oxysporum. Gene 78: 147-156.
Miettinen-Oinonen A, J Londesborough, V Joutsjoki, R Lantto, J Vehmaanperä. 2004. Three cellulases from Melanocarpus albomyces with application in textile industry. Enzyme Microb. Technol. 34: 332-341.
Miller GL. 1959. Use of dinitrosalisylic acid reagent for determination of reducing sugars. Anal. Chem. 31: 426-428.
Murray PG, CM Collins, A Grassick ja MG Tuohy. 2003. Molecular cloning, transcriptional, and expression analysis of the first cellulase gene (cbh2), encoding cellobiohydrolase II, from the moderately thermophilic fungus Talaromyces emersonii and structure prediction of the gene product. Biochem. Biophys. Res. Commun. 301: 280-286.
Nielsen H, J Engelbrecht, S Brunak ja G von Heijne. 1997. Identification of prokaryotic and eykaryotic signal peptides and prediction of their cleavage sites. Protein Engineering 10: 1-6.
Nielsen H ja A Krogh. 1998. Prediction of signal peptides and signal anchors by a hidden o Markov model. Julkaisussa: Proceedings of the Sixth International Conference on Intelligent lo Systems for Molecular Biology (ISMB 6), AAAI Press, Menlo Park, Kalifornia, s. 122-130.
o ° Paloheimo M, A Mäntylä, J Kallio ja P Suominen. 2003. High-yield production of a bacterial x ο- xylanase in the filamentous fungus Trichoderma reesei requires a carrier polypeptide with an intact domain structure. Appi. Env. Microbiol. 69: 7073-7082.
CD
CD
O
O
CM
73
Penttilä M, H Nevalainen, M Rättö, E Salminen ja J Knowles. 1987. A versatile transformation system for the cellulolytic filamentous fungus Trichoderma reesei. Gene 78: 147-156.
Raeder U ja P Broda. 1985. Rapid preparation of DNA from filamentous fungi. Lett. Appi. Microbiol. 1: 17-20.
Robyt JF ja WJ Whelan. 1972. Reducing value methods for maltodextrins: I. Chain length dependence of alkaline 3,5-dinitrosalisylate and chain-length independence of alkaline copper. Anal. Biochem. 45: 510-516.
Sambrook J ja DW Russell. 2001. Molecular cloning, a laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory, New York, US.
Shaw AJ, KK Podkaminer, SG Desai, JS Bardsley , SR Rogers, PG Thorne, DA Hogsett ja LR Lynd. 2008. Metabolic engineering of a thermophilic bacterium to produce ethanol at high yield. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 105: 13769-13774.
Sinnott ML. 1990. Catalytic mechanisms of enzymic glycosyl transfer. Chem. Rev. 90: 1171— 1202.
Somogyi M. 1952. Notes on sugar determination. J. Biol. Chem. 195: 19-23.
Srisodsuk M, T Reinikainen, M Penttilä ja T Teeri. 1993. Role of the interdomain linker peptide of Trichoderma reesei cellobiohydrolase I in its interaction with crystalline cellulose.
J. Biol. Chem. 268 (28): 20756-61. c\j δ
(M
ιό Stälbrand H, A Saloheimo, J Vehmaanperä, B Henrissat ja M Penttilä. 1995. Cloning and ^ expression in Saccharomyces cerevisiae of a Trichoderma reesei β-mannanase gene o x containing a cellulose binding domain. Appi. Environ. Microbiol. 61: 1090-1097.
DL
C\J
^ Sundberg M ja K Poutanen. 1991. Purification and properties of two acetylxylan esterases of
CD
o Trichoderma reesei. Biotechnol. Appi. Biochem. 13: 1-11.
o
CM
74
Suurnäkki A, M Tenkanen, M Siika-aho, M-L Niku-Paavola, L Viikari ja J Buchert. 2000.
Trichoderma reesei cellulases and their core domains in the hydrolysis and modification of chemical pulp. Cellulose 7: 189-209.
van Tilbeurgh H, F Loonties, C de Bruyne ja M Claeyssens. 1988. Fluorogenic and chromogenic glycosides as substrates and ligands of carbohydrases. Methods Enzymol. 160: 45-59.
Tomme P, S McRae, T Wood ja M Claeyssens. 1988. Chromatographic separation of cellulolytic enzymes. Methods in Enzymol. 160: 187-192.
Tuohy M, J Walsh, P Murray, M Claeyssens, M Cuffe, A Savage ja M Coughan. 2002. Kinetic parameters and mode of action of cellobiohydrolases produced by Talaromyces emersonii. Biochem. Biophys. Acta 1596: 366-380.
Waffenschmidt S ja L Jaenicke. 1987. Assay of reducing sugars in the nanomole range with 2,2’bicinchoninate. Anal. Biochem. 165: 337-340.
Withers SG, D Dombroski, LA Berven, DG Kilburn, RC Miller Jr, RAJ Warren ja NR Gilkes. 1986. Direct 'H NMR determination of the stereochemical course of hydrolases catalysed by glucanase components of the cellulose complex. Biochem. Biophys. Res. Commun. 139: 487^194.
cm Withers SG ja Aebersold R. 1995. Approaches to labeling and identification of active site ^ residues in glycosidases. Protein Sci. 4: 361-372.
LO
o o
X
Ct Q_
CM
CO
05
O
O
CM

Claims (42)

1. Menetelmä selluloosamateriaalin käsittelemiseksi CBHII/Cel6A-polypeptidillä tai mainittua polypeptidiä käsittävällä entsyymivalmisteella, tunnettu siitä että mainitulla CBHII/Cel6A-polypeptidillä on sellobiohydrolaasiaktiivisuutta ja se käsittää aminohapposekvenssin, joka on vähintään 78-prosenttisesti identtinen sekvenssin nro 12 täyspitkän polypeptidin kanssa tai näiden fragmentin tai variantin, jolla on sellobiohydrolaasiaktiivisuutta ja joka menetelmä käsittää seuraavat vaiheet: i) valmistetaan mainittua CBHII/Cel6A-polypeptidiä tai mainittua polypeptidiä käsittävää entsyymikoostumusta: ii) saatetaan selluloosamateriaali reagoimaan mainitun CBHII/Cel6A-polypeptidin tai mainittua polypeptidiä käsittävän entsyymikoostumuksen kanssa; ja iii) otetaan talteen osittain tai täysin hydrolysoitu selluloosamateriaali, mukaan lukien lignoselluloosamateriaali.
2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, jossa CBHII/Cel6A-polypeptidi on saatavissa suvusta Acremonium, edullisemmin lajista A. thermophilum, edullisimmin talletetusta kannasta A. thermophilum CBS 116240.
3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, jossa CBHII/Ccl6A-polypeptidillä on aminohapposekvenssi, joka on esitetty sekvenssissä nro 12.
4. Minkä tahansa patenttivaatimuksista 1-3 mukainen menetelmä, jossa CBHII/Cel6A-polypeptidi kykenee hydrolysoimaan selluloosamateriaalia kohtalaisista o ^ korotettuihin olevissa lämpötiloissa. tn o i
5. Minkä tahansa patenttivaatimuksista 1-4 mukainen menetelmä, jossa g selluloosamateriaalia käsitellään entsyymikoostumuksella, joka käsittää mainittua (M CBHII/Cel6A-polypeptidiä yhdessä vähintään yhden lisäentsyymin kanssa, joka kykenee S hydrolysoimaan mainittua selluloosamateriaalia ja joka on valittu ryhmästä, johon o sisältyvät sellobiohydrolaasi, endoglukanaasi, beeta-glukosidaasi, beeta-glukanaasi, ksyloglukanaasi, ksylanaasi, beeta-ksylosidaasi, mannanaasi, beeta-mannosidaasi, a-glukuronidaasi, asetyyliksylaaniesteraasi, α-arabinofuranosidaasi, a-galaktosidaasi, pektinaasi, käsittäen endo- ja ekso-a-L-arabinaasit, α-galaktosidaasin, endo- ja ekso-galaktoronaasin, endopektiinilyaasin, pektaattilyaasin ja pektiiniesteraasin, fenoliesteraasi, ligninaasi käsittäen ligniiniperoksidaasin, mangaaniriippuvaisen peroksidaasin, E^C^ia generoivan entsyymin ja lakkaasin, mediaattoreiden kanssa tai ilman niitä.
6. Patenttivaatimuksen 5 mukainen menetelmä, jossa entsyymit lisätään selluloosamateriaaliin joko samanaikaisesti tai peräkkäin.
7. Minkä tahansa patenttivaatimuksista 1-6 mukainen menetelmä, jossa selluloosamateriaali valitaan ryhmästä, johon sisältyvät kasvimateriaalit, maatalousbiomassa, jätctuottcct ja erityiset cncrgiakasvit.
8. Minkä tahansa patenttivaatimuksista 1-7 mukainen menetelmä, jossa mainittua CBHII/Cel6A-polypeptidiä voidaan käyttää biopolttoaineen tuotannossa.
9. Minkä tahansa patenttivaatimuksista 1-8 mukainen menetelmä, jossa mainittu CBHII/Cel6A-polypeptidi on peräisin kannasta A. thermophilum CBS 116240 ja sillä on aminohapposekvenssi, joka on esitetty sekvenssissä nro 12.
10. Sieniperäinen CBHII/Cel6A-polypeptidi, jossa mainitulla polypeptidillä on sellobiohydrolaasiaktiivisuutta ja se käsittää aminohapposekvenssin, joka on vähintään o 78-prosenttisesti identtinen sekvenssin nro 12 täyspitkän polypeptidin kanssa, tai sen ιό fragmentin tai variantin, jolla on samankaltaisia ominaisuuksia. 0
11. Patenttivaatimuksen 10 mukainen CBHII/Cel6A-polypeptidi, jossa mainittu polypeptidi on saatavissa suvusta Acremonium, edullisemmin lajeista A. thermophilum, 01 5 edullisimmin kannasta A. thermophilum CBS 116240. co σ> o o CM
12. Patenttivaatimuksen 10 tai 11 mukainen CBHII/Cel6A-polypeptidi, jossa mainitulla polypeptidillä on aminohapposekvenssi, joka on esitetty sekvenssissä nro 12.
13. Minkä tahansa patenttivaatimuksista 10-12 mukainen CBHII/Cel6A-polypeptidi, jossa mainittu polypeptidi kykenee hydrolysoimaan selluloosamateriaalia kohtalaisista korotettuihin olevissa lämpötiloissa.
14. Minkä tahansa patenttivaatimuksista 10-13 mukainen CBHII/Cel6A-polypeptidi, jossa mainittua polypeptidiä koodaa eristetty nukleiinihappomolekyyli, joka koodaa polypeptidiä, joka käsittää sekvenssissä nro 12 määritellyn aminohapposekvenssin tai aminohapposekvenssin, joka on vähintään 78-prosenttisesti identtinen sekvenssissä 12 määritellyn aminohapposekvenssin kanssa, tai näiden fragmentin tai variantin, jolla on samankantaisia ominaisuuksia.
15. Minkä tahansa patenttivaatimuksista 10-14 mukainen CBHII/Cel6A-polypeptidi, jossa mainittua polypeptidiä koodaa eristetty nukleiinihappomolekyyli, joka käsittää polynukleotidisekvenssin, joka sisältyy sekvenssiin nro 11 tai sen osasekvenssin.
16. Minkä tahansa patenttivaatimuksista 10-15 mukainen CBHII/Cel6A-polypeptidi, jossa mainittua polypeptidiä koodaa eristetty nukleiinihappomolekyyli, joka hybridisoituu ankarissa olosuhteissa polynukleotidisekvenssiin, joka sisältyy sekvenssiin nro 11, sekvenssiin nro 7, tai näiden osasekvenssiin.
17. Minkä tahansa patenttivaatimuksista 10-16 mukainen CBHII/Cel6A-polypeptidi, c\j 5 jossa mainittua polypeptidiä koodaa eristetty nukleiinihappomolekyyli, joka käsittää (M lq polynukleotidisekvenssin, joka sisältyy sekvenssiin nro 11. o ''t 0
18. Minkä tahansa patenttivaatimuksista 10-17 mukainen CBHII/Cel6A-polypeptidi, cc “ jossa mainittua polypeptidiä koodaa polynukleotidisekvenssi, joka sisältyy plasmidiin iM ^ pALK2582, joka on talletettu Escherichia colissa talletusnumerolla DSM 22946. co
01. O CM
19. Minkä tahansa patenttivaatimuksista 10-18 mukainen CBHII/Cel6A-polypeptidi, jossa mainittu polypeptidi tuotetaan rekombinanttisesta ekspressiovektorista, joka käsittää nukleiinihappomolekyylin, joka koodaa minkä tahansa patenttivaatimuksista 10-18 mukaista CBHII/Cel6A-entsyymiä, toiminnallisesti liitettynä säätelysekvensseihin, jotka kykenevät ohjaamaan CBHII/Cel6A:ta koodaavan nukleiinihappomolekyylin ilmentymistä soveltuvassa isännässä.
20. Minkä tahansa patenttivaatimuksista 10-19 mukainen CBHII/Cel6A-polypeptidi, jossa mainittu polypeptidi tuotetaan heterologisessa isännässä, edullisesti mikrobi-isännässä.
21. Minkä tahansa patenttivaatimuksista 10-20 mukainen CBHII/Cel6A-polypeptidi, jossa mainittu polypeptidi tuotetaan isännässä, joka kuuluu sukuun Trichoderma, Aspergillus, Fusarium, Humicola, Chrysosporium, Neurospora, Rhizopus, Penicillium tai Mortiriella.
22. Minkä tahansa patenttivaatimuksista 10-21 mukainen CBHII/Cel6A-polypeptidi, jossa mainittu polypeptidi tuotetaan suvussa Trichoderma tai Aspergillus, edullisesti lajissa Trichoderma reesei.
23. Minkä tahansa patenttivaatimuksista 10-22 mukainen CBHII/Cel6A-polypeptidi, jossa mainittu CBHII/CelöA-polypeptidi on peräisin kannasta A. thermophilum CBS 116240 ja sillä on sekvenssin nro 12 aminohapposekvenssi. (M
24. Eristetty nukleiinihappomolekyyli, joka koodaa sieniperäistä CBHII/Cel6A- i cp polypeptidiä, joka on valittu ryhmästä, jonka muodostavat: st o ir (a) nukleiinihappomolekyyli, joka koodaa polypeptidiä, jolla on (M sellobiohydrolaasiaktiivisuutta ja joka käsittää sekvenssissä nro 12 esitetyn täyspitkän S aminohapposekvenssin tai sen fragmentin tai variantin, jolla on samankaltaisia CD o ominaisuuksia; (M (b) nukleiinihappomolekyyli, joka koodaa polypeptidiä, jolla on sellobiohydrolaasiaktiivisuutta ja joka on vähintään 78-prosenttisesti identtinen sekvenssin nro 12 täyspitkän aminohapposekvenssin kanssa, tai näiden fragmenttia tai varianttia, jolla on samankaltaisia ominaisuuksia; (c) nukleiinihappo molekyyli, joka käsittää sekvenssissä nro 11 kuvatun polynukleotidisekvenssin koodaavan sekvenssin; (d) nukleiinihappomolekyyli, joka käsittää DSM 22946:n sisältämän polynukleotidisekvenssin koodaavan sekvenssin; (e) nukleiinihappomolekyyli, jonka koodaava sekvenssi eroaa minkä tahansa kohdista (c)-(d) nukleiinihappomolekyylin koodaavasta sekvenssistä geneettisen koodin degeneraation vuoksi; ja (f) nukleiinihappomolekyyli, joka hybridisoituu ankarissa olosuhteissa DSM 22946:n sisältämään nukleiinihappomolekyyliin ja joka koodaa polypeptidiä, jolla on sellobiohydrolaasiaktiivisuutta ja aminohapposekvenssi, joka on vähintään 78-prosenttisesti identtinen sekvenssin nro 12 täyspitkän aminohapposekvenssin kanssa, tai näiden fragmenttia tai varianttia, jolla on samankaltaisia ominaisuuksia.
25. Patenttivaatimuksen 24 mukainen nukleiinihappomolekyyli, jossa mainittua CBHII/Cel6A:ta koodaava nukleiinihappomolekyyli on peräisin kannasta A. thermophilum CBS 116240 ja sillä on sekvenssin nro 11 polynukleotidisekvenssi.
26. Rekombinanttinen ekspressiovektori, joka käsittää patenttivaatimuksen 25 mukaisen nukleiinihappomolekyylin, joka on toiminnallisesti liitetty c\j säätelysekvensseihin, jotka kykenevät ohjaamaan mainitun CBHII/Cel6A- ° sellobiohydrolaasia koodaavan nukleiinihappomolekyylin ilmentymistä soveltuvassa i tn ....... o isännässä. sj- o
27. Isäntäsolu, joka käsittää patenttivaatimuksen 26 mukaisen rekombinanttisen cm ekspressiovektorin. sj- CD CD o o (M
28. Patenttivaatimuksen 27 mukainen isäntäsolu, tunnettu siitä, että mainittu isäntä on mikrobi-isäntä.
29. Patenttivaatimuksen 27 tai 28 mukainen isäntäsolu, tunnettu siitä, että mainittu isäntä on rihmasieni.
30. Minkä tahansa patenttivaatimuksista 27-29 mukainen isäntäsolu, tunnettu siitä, että isäntä kuuluu johonkin suvuista Trichoderma, Aspergillus, Fusarium, Humicola, Chrysosporium, Neurospora, Rhizopus, Penicillium ja MorUriel la.
31. Patenttivaatimuksen 30 mukainen isäntäsolu, tunnettu siitä, että mainittu isäntä on Trichoderma tai Aspergillus, edullisesti Trichoderma reesei.
32. Minkä tahansa patenttivaatimuksista 27-29 mukainen isäntäsolu, tunnettu siitä, että mainittu isäntä on fermentatiivinen mikro-organismi. 1 2 3 4 5 6 7 8 Menetelmä sellaisen polypeptidin valmistamiseksi, jolla on sellobiohydrolaasiaktiivisuutta, mainitun menetelmän käsittäessä vaiheet minkä tahansa patenttivaatimuksista 27-32 mukaisen isäntäsolun viljelemiseksi ja polypeptidin talteen ottamiseksi. 2 Polypeptidi, jolla on sellobiohydrolaasiaktiivisuutta ja jota koodaa patenttivaatimuksen 24 tai 25 mukainen nukleiinihapposekvenssi ja joka on saatavissa patenttivaatimuksen 33 mukaisella menetelmällä. OJ cm 35. Menetelmä entsyymivalmisteen aikaansaamiseksi, menetelmän käsittäessä o vaiheet, joissa viljellään minkä tahansa patenttivaatimuksista 27-32 mukaista isäntäsolua o ja joko valmistetaan koko viljelyliemi tai erotetaan solut elatusaineesta ja otetaan talteen 3 ir supematantti. 4 cm 5
36. Entsyymivalmiste, joka on saatavissa patenttivaatimuksen 35 mukaisella 6 σ> 7 o menetelmällä. 8 cm
37. Entsyymivalmiste, joka käsittää minkä tahansa patenttivaatimuksista 10-23 mukaista CBHII/CelöA-entsyymiä.
38. Patenttivaatimuksen 37 mukainen entsyymivalmiste, jossa CBHII/Cel6A-sellobiohydrolaasi on peräisin Acremonium thermophilumista ja sillä on sekvenssin nro 12 aminohapposekvenssi.
39. Minkä tahansa patenttivaatimuksista 36-38 mukainen entsyymivalmiste, tunnettu siitä että mainittu valmiste käsittää muita entsyymejä, jotka on valittu ryhmästä, johon sisältyvät sellobiohydrolaasi, endoglukanaasi, beeta-glukosidaasi, beeta-glukanaasi, ksyloglukanaasi, ksylanaasi, beeta-ksylosidaasi, mannanaasi, beeta-mannosidaasi, α-glukuronidaasi, asetyyliksylaaniesteraasi, α-arabinofuranosidaasi, a-galaktosidaasi, pektinaasi, käsittäen endo- ja ekso-a-L-arabinaasit, a-galaktosidaasin, endo- ja ekso-galaktoronaasin, endopektiinilyaasin, pektaattilyaasin ja pektiiniesteraasin, fenoliesteraasi, ligninaasi käsittäen ligniiniperoksidaasin, mangaaniriippuvaisen peroksidaasin, P^Ckia generoiva entsyymin ja lakkaasin, mediaattorin kanssa tai ilman.
40. Minkä tahansa patenttivaatimuksista 36-39 mukainen entsyymivalmiste, tunnettu siitä, että mainittu entsyymivalmiste on koko viljelyliemen, käytetyn elatusaineen, nesteen, jauheen tai rakeiden muodossa. 1 Minkä tahansa patenttivaatimuksista 10-23 mukaisen CBHII/Cel6A-polypeptidin cm tai minkä tahansa patenttivaatimuksista 36^-0 mukaisen entsyymivalmisteen käyttö cm biopolttoaineen tuotannossa, pesuaineissa, kuitujen käsittelyssä, elintarvikkeiden tai i o rehun käsittelyssä, massan- tai paperinvalmistuksessa, juomateollisuudessa tai missä 0 tahansa sovelluksissa, joihin liittyy selluloosamateriaalin hydrolyysi tai muuntelu. cc CL cyj 42. Minkä tahansa patenttivaatimuksista 10-23 mukaisen CBHII/Cel6A-polypeptidin 2 tai minkä tahansa patenttivaatimuksista 36M0 mukaisen entsyymivalmisteen käyttö CD o biopolttoaineen valmistuksessa. (M
FI20096412A 2009-12-30 2009-12-30 Menetelmä selluloosamateriaalin käsittelemiseksi sekä tässä käyttökelpoiset CBH II/Cel6A entsyymit FI122937B (fi)

Priority Applications (11)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FI20096412A FI122937B (fi) 2009-12-30 2009-12-30 Menetelmä selluloosamateriaalin käsittelemiseksi sekä tässä käyttökelpoiset CBH II/Cel6A entsyymit
PCT/EP2010/070927 WO2011080317A2 (en) 2009-12-30 2010-12-30 Method for treating cellulosic material and cbhii/cel6a enzymes useful therein
AP2012006392A AP3652A (en) 2009-12-30 2010-12-30 Method for treating cellulosic material and cbhii/cel6a enzymes useful therein
CN201080060251.9A CN102712917B (zh) 2009-12-30 2010-12-30 用于处理纤维素材料的方法和适用于该方法的cbhii/cel6a酶
ES10796442.1T ES2612512T3 (es) 2009-12-30 2010-12-30 Procedimiento para tratar el material celulósico y enzimas CBHII/CEL6A útiles en el mismo
DK10796442.1T DK2519630T3 (en) 2009-12-30 2010-12-30 METHOD OF TREATING CELLULOS MATERIAL AND CBHII / CEL6A ENZYMES THAT CAN BE USED THEREOF
EP10796442.1A EP2519630B1 (en) 2009-12-30 2010-12-30 Method for treating cellulosic material and cbhii/cel6a enzymes useful therein
CA2785944A CA2785944C (en) 2009-12-30 2010-12-30 Method for treating cellulosic material and cbhii/cel6a enzymes useful therein
BR112012016320A BR112012016320B8 (pt) 2009-12-30 2010-12-30 Método para tratar material celulósico, polipeptídeo, molécula de ácido nucleico isolada, vetor de expressão recombinante, célula hospedeira, processos para produzir um polipeptídeo, e para obter uma preparação de enzima, preparação de enzima, e, uso do polipeptídeo ou da preparação de enzima
US12/930,189 US8580552B2 (en) 2009-12-30 2010-12-30 Method for treating cellulosic material and CBHII/CEL6A enzymes useful therein
US14/049,671 US9200267B2 (en) 2009-12-30 2013-10-09 Method for treating cellulosic material and CBHII/Cel6A enzymes useful therein

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US33506309P 2009-12-30 2009-12-30
FI20096412A FI122937B (fi) 2009-12-30 2009-12-30 Menetelmä selluloosamateriaalin käsittelemiseksi sekä tässä käyttökelpoiset CBH II/Cel6A entsyymit
US33506309 2009-12-30
FI20096412 2009-12-30

Publications (3)

Publication Number Publication Date
FI20096412A0 FI20096412A0 (fi) 2009-12-30
FI20096412A FI20096412A (fi) 2011-07-01
FI122937B true FI122937B (fi) 2012-09-14

Family

ID=46752271

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
FI20096412A FI122937B (fi) 2009-12-30 2009-12-30 Menetelmä selluloosamateriaalin käsittelemiseksi sekä tässä käyttökelpoiset CBH II/Cel6A entsyymit

Country Status (10)

Country Link
US (2) US8580552B2 (fi)
EP (1) EP2519630B1 (fi)
CN (1) CN102712917B (fi)
AP (1) AP3652A (fi)
BR (1) BR112012016320B8 (fi)
CA (1) CA2785944C (fi)
DK (1) DK2519630T3 (fi)
ES (1) ES2612512T3 (fi)
FI (1) FI122937B (fi)
WO (1) WO2011080317A2 (fi)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103484390A (zh) * 2013-09-17 2014-01-01 山东农业大学 表达9家族糖苷水解酶基因CtAA9b的毕赤酵母工程菌株

Families Citing this family (28)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7407788B2 (en) * 2002-11-21 2008-08-05 Danisco A/S, Genencor Division BGL7 beta-glucosidase and nucleic acids encoding the same
MX2012009282A (es) * 2010-02-11 2012-09-07 Dsm Ip Assets Bv Polipeptido que tiene actividad de celobiohidrolasa y usos del mismo.
EP2569426A4 (en) 2010-05-14 2013-10-09 Codexis Inc ZELLBIOHYDROLASE VARIANTS
MX2013007720A (es) 2011-01-26 2013-08-09 Novozymes As Polipeptidos que tienen actividad celobiohidrolasa y polinucleotidos que codifican para los mismos.
BR112013019247B1 (pt) * 2011-01-26 2021-03-30 Novozymes A/S Método para produzir um polipeptídeo
CA2833583A1 (en) * 2011-04-27 2012-11-01 Codexis, Inc. Cellobiohydrolase variants
EP2748187A4 (en) 2011-08-23 2015-03-04 Codexis Inc VARIANTS OF CELLOBIOHYDROLASE
WO2013071883A1 (en) * 2011-11-18 2013-05-23 Novozymes, Inc. Polypeptides having endoglucanase activity and polynucleotides encoding same
US9708591B2 (en) 2011-11-18 2017-07-18 Novozymes Inc. Polypeptides having endoglucanase activity and polynucleotides encoding same
US9441256B2 (en) 2012-02-23 2016-09-13 Purdue Research Foundation Lignases and aldo-keto reductases for conversion of lignin-containing materials to fermentable products
WO2013166312A1 (en) * 2012-05-02 2013-11-07 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Biofuel production enzymes and uses thereof
US8975058B2 (en) 2012-05-24 2015-03-10 Roal Oy Endoglucanases for treatment of cellulosic material
US9458440B2 (en) 2012-06-07 2016-10-04 Roal Oy Proteins for the treatment of cellulosic material
FI124477B (fi) 2012-06-07 2014-09-15 Roal Oy Uusia proteiineja selluloosamateriaalin käsittelyyn
US9434929B2 (en) 2012-10-26 2016-09-06 Roal Oy Esterases useful in the treatment of cellulosic and lignocellulosic material
US9850512B2 (en) 2013-03-15 2017-12-26 The Research Foundation For The State University Of New York Hydrolysis of cellulosic fines in primary clarified sludge of paper mills and the addition of a surfactant to increase the yield
CN103343111B (zh) * 2013-07-05 2015-08-26 山东尤特尔生物科技有限公司 一种嗜热毛壳菌纤维素酶及其制备方法和应用
CN103509727A (zh) * 2013-09-17 2014-01-15 山东农业大学 表达9家族糖苷水解酶基因CtAA9c的毕赤酵母工程菌株
CN103525709B (zh) * 2013-09-27 2015-09-09 中国科学院成都生物研究所 一种普通镰刀菌、制备降粘酶的方法及其应用
CN103556474B (zh) * 2013-10-23 2016-01-06 浙江省纺织测试研究院 一种废旧纺织品中的纤维素纤维酶处理回收法
US9951363B2 (en) 2014-03-14 2018-04-24 The Research Foundation for the State University of New York College of Environmental Science and Forestry Enzymatic hydrolysis of old corrugated cardboard (OCC) fines from recycled linerboard mill waste rejects
US20170233707A1 (en) * 2014-09-30 2017-08-17 Danisco Us Inc Compositions comprising beta-mannanase and methods of use
CN106190874B (zh) * 2015-05-06 2020-06-26 中国科学院天津工业生物技术研究所 一种强化丝状真菌蛋白质生产的方法
CN106282142B (zh) * 2016-08-05 2019-05-31 南京林业大学 一种β-甘露糖苷酶含量低的α-半乳糖苷酶的制备方法
CN106243391B (zh) * 2016-08-05 2018-12-11 南京林业大学 透明木材的制备方法
US20180265910A1 (en) * 2017-03-17 2018-09-20 New England Biolabs, Inc. Cleavage of Fucose in N-Glycans
CN108976302B (zh) * 2018-08-17 2021-04-13 中国科学院青岛生物能源与过程研究所 用于催化木质纤维素糖化的纤维小体酶制剂
CN110755459B (zh) * 2019-11-22 2021-06-29 广西南亚热带农业科学研究所 一种番荔枝叶多酚的提取工艺

Family Cites Families (26)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB8610600D0 (en) 1986-04-30 1986-06-04 Novo Industri As Transformation of trichoderma
ES2153037T3 (es) 1994-06-03 2001-02-16 Novo Nordisk Biotech Inc Lacasas purificadas de scytalidium y acidos nucleicos que las codifican.
US5770418A (en) 1994-06-24 1998-06-23 Novo Nordisk A/S Purified polyporus laccases and nucleic acids encoding same
US6008029A (en) 1995-08-25 1999-12-28 Novo Nordisk Biotech Inc. Purified coprinus laccases and nucleic acids encoding the same
US7883872B2 (en) 1996-10-10 2011-02-08 Dyadic International (Usa), Inc. Construction of highly efficient cellulase compositions for enzymatic hydrolysis of cellulose
AU771539C (en) 1998-10-06 2005-01-13 Dyadic International (Usa), Inc. Transformation system in the field of filamentous fungal hosts
WO2001060752A1 (en) 2000-02-17 2001-08-23 Forskningscenter Risø A method for processing lignocellulosic material
CA2422558C (en) 2000-09-25 2012-02-14 Iogen Energy Corporation Method for glucose production with a modified cellulase mixture
EP1421224B1 (en) 2001-06-26 2012-10-17 Novozymes A/S Polypeptides having cellobiohydrolase i activity and polynucleotides encoding same
US20040005674A1 (en) 2002-04-30 2004-01-08 Athenix Corporation Methods for enzymatic hydrolysis of lignocellulose
DK1578964T4 (da) 2002-12-20 2013-12-02 Novozymes As Polypeptider med cellobiohydrolase II-aktivitet og polynukleotider, der koder for samme
CN102876754A (zh) 2004-01-16 2013-01-16 诺维信股份有限公司 降解木质素纤维素材料的方法
EP1733033B1 (en) 2004-02-06 2012-06-20 Novozymes Inc. Polypeptides having cellulolytic enhancing activity and polynucleotides encoding same
EP1737951B1 (en) 2004-04-16 2010-05-26 AB Enzymes Oy Method and dna constructs for increasing the production level of carbohydrate degrading enzymes in filamentous fungi
DK2302049T3 (en) 2004-12-30 2017-05-01 Danisco Us Inc CBH2 CELLULASE VARIETIES OF HYPOCREA JECORINA
ES2358243T5 (es) * 2005-01-06 2014-06-09 Novozymes, Inc. Polipéptidos con actividad celobiohidrolasa y polinucleótidos que los codifican
CN1757709A (zh) 2005-07-15 2006-04-12 山东农业大学 表达cbh2基因的酵母工程菌株及其构建方法
FI120045B (fi) * 2005-12-22 2009-06-15 Roal Oy Selluloosamateriaalin käsittely ja siinä käyttökelpoiset entsyymit
DK2450439T3 (da) 2006-02-10 2014-02-10 Verenium Corp Cellulosenedbrydende enzymer, nucleinsyrer, der koder for dem, og fremgangsmåder til at fremstille og benytte dem
AU2008210495B2 (en) 2007-01-30 2014-02-27 Bp Corporation North America, Inc. Enzymes for the treatment of lignocellulosics, nucleic acids encoding them and methods for making and using them
US7923236B2 (en) 2007-08-02 2011-04-12 Dyadic International (Usa), Inc. Fungal enzymes
US8486680B2 (en) 2007-10-03 2013-07-16 Bp Corporation North America Inc. Xylanases, nucleic acids encoding them and methods for making and using them
CN101910406A (zh) 2007-11-01 2010-12-08 诺维信股份有限公司 减少氧化还原活性金属离子对纤维素材料酶水解抑制作用的方法
EP2245050A2 (en) 2007-12-19 2010-11-03 Novozymes A/S Polypeptides having cellulolytic enhancing activity and polynucleotides encoding same
CN101945889A (zh) 2007-12-19 2011-01-12 诺维信公司 具有纤维素分解增强活性的多肽和编码该多肽的多核苷酸
AU2009204629A1 (en) 2008-01-18 2009-07-23 Iogen Energy Corporation Cellulase variants with reduced inhibition by glucose

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103484390A (zh) * 2013-09-17 2014-01-01 山东农业大学 表达9家族糖苷水解酶基因CtAA9b的毕赤酵母工程菌株

Also Published As

Publication number Publication date
US20110159544A1 (en) 2011-06-30
WO2011080317A3 (en) 2011-10-13
BR112012016320A2 (pt) 2017-02-21
FI20096412A0 (fi) 2009-12-30
CN102712917B (zh) 2015-09-23
FI20096412A (fi) 2011-07-01
EP2519630B1 (en) 2016-11-02
BR112012016320B1 (pt) 2021-04-20
AP2012006392A0 (en) 2012-08-31
BR112012016320B8 (pt) 2022-09-27
ES2612512T3 (es) 2017-05-17
US20140065693A1 (en) 2014-03-06
CA2785944C (en) 2019-07-16
AP3652A (en) 2016-04-01
CN102712917A (zh) 2012-10-03
US8580552B2 (en) 2013-11-12
US9200267B2 (en) 2015-12-01
CA2785944A1 (en) 2011-07-07
EP2519630A2 (en) 2012-11-07
WO2011080317A2 (en) 2011-07-07
DK2519630T3 (en) 2017-02-06

Similar Documents

Publication Publication Date Title
FI122937B (fi) Menetelmä selluloosamateriaalin käsittelemiseksi sekä tässä käyttökelpoiset CBH II/Cel6A entsyymit
US9758777B2 (en) Treatment of cellulosic material and enzymes useful therein
US8975058B2 (en) Endoglucanases for treatment of cellulosic material
EP2855673B1 (en) Improved endoglucanases for treatment of cellulosic material
FI124477B (fi) Uusia proteiineja selluloosamateriaalin käsittelyyn
CA2994320C (en) Treatment of cellulosic material and enzymes useful therein
Rana et al. Role of microorganisms in lignocellulosic biodegradation

Legal Events

Date Code Title Description
FG Patent granted

Ref document number: 122937

Country of ref document: FI

Kind code of ref document: B