ES2266265T3 - Metodo para la produccion de glucosa con una mezcla de celulosa que comprende una celulosa modificada. - Google Patents
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Abstract
Un método para convertir celulosa en glucosa, que comprende tratar un substrato lignocelulósico pretratado con una mezcla de enzimas que comprende: una CBHI modificada, seleccionada del grupo que consiste en núcleo de CBHI, núcleo de CBHI más enlazador, CBHI con dominio de unión a celulosa inactivado y combinaciones de los mismos; y enzimas celulasa, seleccionadas del grupo que consiste en endoglucanasas (EG), exo- celobiohidrolasas (CBH), a-glucosidasas y combinaciones de las mismas, dicha CBHI modificada presente en dicha mezcla de enzimas en de 55 a 100% en peso, con relación a todas las enzimas tipo CBHI, en donde dicho substrato lignocelulósico pretratado comprende al menos 10% de lignina.
Description
Método para la producción de glucosa con una
mezcla de celulasas que comprende una celulasa modificada.
La presente invención se refiere a la conversión
enzimática de celulosa en glucosa. Más específicamente, la presente
invención proporciona un método para la conversión de substratos
lignocelulósicos pretratados usando proteína CBHI modificada y a la
recuperación y la reutilización de la proteína CBHI modificada.
Una lista completa de referencias puede
encontrarse al final de la memoria descriptiva.
La celulosa es uno de los polímeros más
abundantes encontrados en la naturaleza y consiste en unidades de
glucosa conectadas mediante enlaces beta 1,4. Los enlaces beta 1,4
que conectan unidades de glucosa individuales no se degradan o
despolimerizan fácilmente. Sin embargo, existe una variedad de
enzimas celulasa que son capaces de hidrolizar enzimáticamente la
celulosa.
Las celulasas son enzimas producidas por un
número de microorganismos que catalizan la hidrólisis de celulosa en
productos tales como glucosa, celobiosa y otros
celo-oligosacáridos. La celulasa es generalmente un
término genérico que indica una mezcla de varias enzimas que
comprende exo-celobiohidrolasas (CBH),
endoglucanasas (EG) y \beta-glucosidasas. La
celulasa producida por los hongos filamentosos Trichoderma
longibrachiatum comprende al menos dos enzimas celobiohidrolasa
denominadas CBHI y CBHII y al menos 4 enzimas EG.
Las enzimas celulasa trabajan sinérgicamente
para degradar la celulosa en glucosa. CBHI y CBHII actúan
generalmente sobre los extremos de los polímeros de glucosa en las
microfibrillas de celulosa liberando celobiosa (Teeri y Koivula,
1995), mientras que las endoglucanasas actúan en posiciones
aleatorias sobre la celulosa. Juntas, estas enzimas hidrolizan la
celulosa en celo-oligosacáridos menores tales como
celobiosa. La celobiosa es hidrolizada hasta glucosa por la
\beta-glucosidasa.
Los genes que codifican CBHI, CBHII (Shoemaker y
otros, 1983; Teeri y otros, 1987), EG I y EG II (Penttila y otros,
1986; Saloheimo y otros, 1988) se han clonado y aislado de hongos
filamentosos tales como T. reesei y T.
longibrachiatum. Las CBHI, CBHII y la mayoría de las enzimas EG
principales comprenden un dominio central catalítico y un dominio de
unión a celulosa (CBD) separados por una región enlazadora flexible.
El dominio de unión a celulosa (CBD) promueve la adsorción de la
enzima a regiones del substrato celulósico (Tomme y otros., 1988;
Gilkes y otros, 1992), mientras que el dominio central es
responsable de catalizar la segmentación de celulosa. La región
enlazadora puede asegurar una distancia interdominial óptima entre
el dominio central y el dominio de unión a celulosa (Teeri y otros,
1992).
Se han producido y estudiado proteínas que
consisten en el CBD aislado o la proteína central. Proteínas
centrales de CBHI también se encuentran en cantidades de menos de
aproximadamente 10% en mezclas de celulasas obtenidas de fuentes
naturales. Estudios sobre el dominio catalítico fúngico aislado
(proteína central) sugieren que esta proteína es capaz de unirse a
celulosa aunque con afinidad reducida en comparación con la proteína
natural (holo) (Tomme y otros, 1988). La fuerte unión impartida a
las celulasas por su CBD sugiere que la adsorción de varias
celulasas a celulosa es esencialmente irreversible (Beldman y otros,
1987; Kyriacou y otros, 1989).
La proteína central CBHI de Trichoderma
reesei no se une tan estrechamente a la celulosa como CBHI. La
proteína central de CBHI es completamente activa contra substratos
solubles pequeños tales como los glicósidos cromóforos derivados de
las celodextrinas y lactosa. Sin embargo, su actividad contra un
substrato celulósico insoluble tal como Avicel (un tipo cristalino
de celulosa) es muy reducida en comparación con CBHI (Van Tilbeurgh
y otros, 1986). Van Tilbeurgh mostraba que el núcleo de CBHI era
menos de 1% tan activo como CBHI. Esto se atribuyó al hecho de que
88% de la CBHI se adsorbía a la celulosa frente a solo 36% de la
proteína central de CBHI. Kim y otros (1997) examinaron la
absorción y las actividades de CBHI, el núcleo de CBHI y otras
mezclas de proteínas sobre Avicel. Describen que el núcleo de CBHI
producía menos de 1/4 la cantidad de azúcar reductor a partir de
Avicel que CBHI. La mayor velocidad de hidrólisis mediante CBHI se
atribuyó a su mejor unión. En experimentos similares con sauce
pretratado con vapor de agua, Kotiranta y otros (1999) observaron
una velocidad de hidrólisis drásticamente reducida para el núcleo de
CBHI en comparación con CBHI intacta y concluyeron que CBHI necesita
un CBD para la adsorción y la hidrólisis eficaces. Nidetsky y otros
(1994) observaron tendencias similares entre el núcleo de CBHI y
CBHI. Por encima de 80% de la CBHI se adsorbía a papel de filtro de
celulosa, en comparación con solo 40% del núcleo de CBHI. Las
velocidades de hidrólisis del núcleo y CBHI eran directamente
proporcionales a la cantidad de proteína adsorbida, siendo la CBHI
por encima de dos veces más activa que el núcleo de CBHI. Estos
estudios indican que no existe beneficio en usar núcleo de CBHI en
lugar de CBHI para la hidrólisis de celulosa, ya que la actividad
del núcleo de CBHI contra celulosa cristalina es mucho más lenta que
la de la CBHI.
La conversión de celulosa a partir de material
celulósico en glucosa es importante en muchos procedimientos
industriales, tales como la bioconversión de celulosa en etanol
combustible. Desgraciadamente, la celulosa contenida en la mayoría
de la materia de la planta no es fácilmente convertible en glucosa,
y esta etapa representa un obstáculo principal en la
comercialización de tal procedimiento. Se creyó originalmente que la
conversión eficaz de celulosa a partir de material celulósico en
glucosa implicaba liberar celulosa y hemicelulosa de su complejo con
lignina. Sin embargo, procedimientos más recientes se enfocan a
incrementar la accesibilidad a celulosa dentro de la biomasa
lignocelulósica seguido por despolimerización de polímeros de
carbohidrato de celulosa en glucosa. Incrementar la accesibilidad a
la celulosa se acompaña lo más a menudo por precalentar el substrato
celulósico.
El objetivo de la mayoría de los métodos de
pretratamiento es aportar una combinación suficiente de acción
mecánica y química, a fin de romper la estructura de las fibras y
mejorar la accesibilidad del material de alimentación a enzimas
celulasa. La acción mecánica típicamente incluye el uso de presión,
trituración, molienda, agitación, picado, compresión/expansión u
otros tipos de acción mecánica. La acción química incluye
típicamente el uso de calor (a menudo vapor de agua), ácido y
disolventes. Por ejemplo, uno de los enfoques principales para el
pretratamiento es mediante explosión de vapor de agua, usando las
condiciones de procesamiento descritas en U.S. 4.461.648 y también
en Foody y otros, 1980. En este procedimiento, la biomasa
lignocelulósica se carga a una pistola de vapor de agua y hasta 5%
de ácido se añade opcionalmente a la biomasa en la pistola de vapor
de agua o en una preinmersión anterior a la carga de la pistola de
vapor de agua. La pistola de vapor de agua se llena a continuación
muy rápidamente con vapor de agua y se mantiene a alta presión
durante un espacio de tiempo de cocción fijado. Una vez que
transcurre el tiempo de cocción el recipiente se despresuriza
rápidamente para expulsar la biomasa pretratada.
Otro enfoque descrito en U.S. 4.237.226 describe
el pretratamiento de roble, papel para periódicos, álamo y tallos de
maíz mediante un reactor continuo de gasto tipo pistón, un
dispositivo que es similar a una extrusora. Tornillos giratorios
conducen una suspensión de material de alimentación a través de un
pequeño orificio, donde la acción mecánica y química rompe las
fibras.
Se ha sugerido que el pretratamiento aumenta la
deslignificación del substrato celulósico (Fan y otros, 1981), crea
microporos mediante la retirada de la hemicelulosa, cambia la
cristalinidad del substrato y reduce el grado de polimerización de
la celulosa (Knappert y otros, 1980) e incrementa la superficie
específica del substrato celulósico (Grethlein and Converse, 1991;
Grohman y otros, 1985).
Desgraciadamente, hasta la fecha, el enfoque de
un pretratamiento acoplado con hidrólisis enzimática no ha podido
producir glucosa a un coste suficientemente bajo, a fin de hacer la
conversión de celulosa en etanol comercialmente atractiva. Incluso
con el más eficaz de los procedimientos de pretratamiento conocidos
actualmente, la cantidad de enzima celulasa requerida para convertir
celulosa en glucosa es alta y esto representa un coste significativo
en la producción de etanol. La opción de añadir menos celulasa al
sistema habitualmente disminuye la cantidad de glucosa producida
hasta una extensión inaceptable. El enfoque de disminuir la cantidad
de enzima requerida incrementando el espacio de tiempo en el que la
enzima actúa sobre la celulosa conduce a una productividad
antieconómica del procedimiento, procedente del alto coste asociado
con retener las mezclas enzimáticas en depósitos de hidrólisis.
Así, existe una necesidad dentro de la técnica
de identificar nuevos métodos que potencien la conversión de
celulosa dentro de un substrato celulósico en glucosa. Además,
existe una necesidad en la técnica de identificar enzimas o mezclas
de enzimas que potencien la conversión de celulosa en glucosa y que
sean recuperables, reciclables y reutilizables.
Un objetivo de la presente invención es vencer
las desventajas de la técnica anterior.
El objetivo anterior se cumple mediante una
combinación de las características de las reivindicaciones
principales. Las subreivindicaciones describen modalidades
ventajosas adicionales de la invención.
La presente invención se refiere a la conversión
enzimática de celulosa en glucosa.
De acuerdo con la presente invención, se
proporciona un método para convertir celulosa en glucosa, que
comprende: tratar un substrato lignocelulósico pretratado con una
mezcla de enzimas que comprende enzima celulasa y una CBHI
modificada, en donde la CBHI modificada está presente en dicha
mezcla de enzimas en una cantidad con relación a toda la enzima tipo
CBHI de 55 a 100% y el substrato lignocelulósico pretratado
comprende al menos 10% de lignina. Preferiblemente, la cantidad de
CBHI modificada en la mezcla de enzimas es de 70 a 100%. Más
preferiblemente, la cantidad de CBHI modificada en la mezcla de
enzimas es de 80 a 100%. Por otra parte, esta invención trata del
método anterior en el que la CBHI modificada se recupera después de
la etapa de tratamiento. Esta invención trata del método anterior en
el que la CBHI modificada se selecciona de núcleo de CBHI, núcleo de
CBHI más enlazador y CBHI con dominio de unión a celulosa inactivado
y combinaciones de los mismos. Además, la presente invención se
refiere al método anterior en el que el substrato lignocelulósico
pretratado se pretrata usando una cocción con vapor de agua
ácido.
Un aspecto de esta invención trata de un método
para convertir celulosa dentro de un substrato celulósico en
glucosa, que comprende: tratar un substrato lignocelulósico
pretratado con una mezcla de enzimas que comprende CBHI, CBHII, EG
I, EG II, \beta-glucosidasa y CBHI modificada, en
donde la CBHI modificada está presente en dicha mezcla de enzimas en
una cantidad con relación a toda la enzima tipo CBHI de 55 a 100% y
el substrato lignocelulósico pretratado comprende al menos 10% de
lignina. Preferiblemente, la cantidad de CBHI modificada en la
mezcla de enzimas es de 70 a 100%. Más preferiblemente, la cantidad
de CBHI modificada en la mezcla de enzimas es de 80 a 100%. Por otra
parte, esta invención trata del método anterior en el que la CBHI
modificada se recupera después de la etapa de tratamiento. Esta
invención trata del método que se acaba de describir en el que la
CBHI modificada se selecciona de núcleo de CBHI, núcleo de CBHI más
enlazador y CBHI con dominio de unión a celulosa inactivado y
combinaciones de los mismos.
La presente invención abarca métodos como los
definidos anteriormente en los que el substrato lignocelulósico
pretratado se selecciona del grupo que consiste en residuos
agrícolas, residuos resultantes de la retirada de almidón o azúcar,
cultivos para etanol especializados, productos forestales y
productos de pasta papelera y papel y combinaciones de los mismos.
Preferiblemente, los residuos agrícolas se seleccionan del grupo que
consiste en tallos de maíz, paja de trigo, paja de cebada, tallos
de soja; los residuos resultantes de la retirada de almidón o azúcar
se seleccionan del grupo que consiste en cáscaras de avena, cáscaras
de arroz, bagazo de caña de azúcar y fibra de maíz; los cultivos
para etanol especializados se seleccionan del grupo que consiste en
mijo perenne, miscantus, espartina y ballico; los productos
forestales se seleccionan del grupo que consiste en madera de
angiospermas, madera de coníferas, eucalipto y serrín, y los
productos de pasta papelera y papel son
Solka-floc.
La presente invención también se refiere a los
métodos de hidrólisis lignocelulósica que se definen anteriormente,
en los que el substrato lignocelulósico se caracteriza por tener un
E_{I} de al menos aproximadamente 0,5 y un R_{I} de
aproximadamente 45 a aproximadamente 100.
La invención también incluye los métodos
anteriores en los que el E_{I} es de aproximadamente 1,0 a
aproximadamente 4,0 y el R_{I} es de aproximadamente 60 a
aproximadamente 100.
También se incluye en la presente invención un
método como el definido anteriormente en el que el substrato
lignocelulósico pretratado está presente en la mezcla de enzimas en
una concentración de aproximadamente 1% en peso a aproximadamente
25% en peso en suspensión acuosa. Preferiblemente, el substrato
lignocelulósico está presente en la mezcla de enzimas en una
concentración de aproximadamente 10% en peso a aproximadamente 16%
en peso en suspensión acuosa.
También se describe aquí un método para
hidrolizar celulosa en glucosa, que comprende tratar un substrato
lignocelulósico pretratado caracterizado por un E_{I} de
aproximadamente 0,5 a aproximadamente 4 con una mezcla de enzimas
que comprende enzima celulasa con enzimas tipo CBHI, en donde dichas
enzimas tipo CBHI comprenden de 20% a 100% de núcleo de CBHI.
Un aspecto del método de la invención puede
comprender un método para convertir celulosa dentro de un substrato
celulósico en glucosa, que comprende: tratar un substrato
lignocelulósico pretratado con una mezcla de enzimas que comprende
núcleo de CBHI y una o más de CBHII, CBHII, EG I, EG II y
\beta-glucosidasa, en donde el núcleo de CBHI está
presente en la mezcla de enzimas en una cantidad con relación a toda
la enzima tipo CBHI de 15 a 100%. Preferiblemente, la cantidad de
núcleo de CBHI en la mezcla de enzimas es de 50 a 100%, más
preferiblemente, la cantidad de núcleo de CBHI en la mezcla de
enzimas es de 80 a 100%.
Por otra parte, en un aspecto, el método de la
presente invención puede comprender un método para convertir
celulosa en glucosa, que comprende tratar un substrato
lignocelulósico pretratado con una mezcla de enzimas que comprende
núcleo de CBHI más enlazador y una o más de CBH1I, CBHII, EG I, EG
II y \beta-glucosidasa, en donde dicho núcleo de
CBHI más enlazador está presente en dicha mezcla de enzimas en una
cantidad de 50% a 100%, con relación a todas las enzimas tipo CBHI.
Preferiblemente, la cantidad de núcleo de CBHI más enlazador en la
mezcla de enzimas es de 70 a 100%. Más preferiblemente, la cantidad
de núcleo de CBHI más enlazador en dicha mezcla de enzimas es de 80
a 100%.
También se describe una composición de celulasas
que comprende CBHI modificada y una o más de CBHI, CBHII, EG I, EG
II y \beta-glucosidasa, en donde la CBHI
modificada está presente en la composición de celulasas en una
cantidad relativa a toda la enzima tipo CBHI de 55 a 100% en peso.
La CBHI modificada puede ser de 70 a 100% en peso o puede ser de 80
a 100% en peso. La CBHI modificada de esta composición de celulasas
puede ser una CBHI de Trichoderma modificada.
También se describe una composición de celulasas
que comprende una enzima tipo CBHI y una o más de CBHII, EG I, EG II
y \beta-glucosidasa, en donde el núcleo de CBHI
está presente en la composición de celulasas en una cantidad
relativa a toda la enzima tipo CBHI de 15 a 100% en peso. El núcleo
de CBHI puede ser de 50 a 100% en peso o de 80 a 100% en peso. El
núcleo de CBHI de esta composición de celulasas puede obtenerse a
partir de CBHI de Trichoderma.
También se describe una composición de celulasas
que comprende CBHI modificada y una o más de CBHII, EG I, EG II y
\beta-glucosidasa, en la que la CBHI modificada
está presente en la composición de celulasas en de 50 a 90% en peso
con relación a las otras enzimas celulasa. La CBHI modificada puede
ser una CBHI de Trichoderma modificada.
Este resumen no describe necesariamente todas
las características necesarias de la invención sino que la invención
también puede residir en una subcombinación de las características
descritas.
Estas y otras características de la invención se
harán más evidentes a partir de la siguiente descripción en la que
se hace referencia a los dibujos adjuntos, en los que:
La Figura 1 muestra una representación gráfica
del porcentaje de conversión de celulosa en glucosa usando
diferentes substratos lignocelulósicos pretratados y cantidades
variables de CBHI y proteína de núcleo de CBHI. La Figura 1A muestra
la hidrólisis de tallos de maíz lavados pretratados usando
cantidades crecientes de CBHI o núcleo de CBHI. La Figura 1B muestra
la conversión de cáscaras de avena pretratadas después de 3 horas de
incubación usando diversas mezclas de CBHI y proteína de núcleo de
CBHI. La Figura 1C muestra una representación gráfica del porcentaje
de conversión de celulosa en glucosa a partir de álamo pretratado
después de 3 horas de incubación usando diversas concentraciones de
proteína de CBHI y núcleo de CBHI.
La Figura 2 muestra una representación gráfica
del efecto de variar la concentración de substrato celulósico
dentro de una mezcla de reacción. La Figura 2A muestra la hidrólisis
de celulosa en glucosa usando concentraciones variables de
SIGMACELL™. La Figura 2B muestra la hidrólisis de celulosa en
glucosa usando concentraciones variables de álamo pretratado. La
Figura 2C muestra un sumario de los datos obtenidos a partir de las
Figuras 2A y 2B que compara el E_{I} con concentraciones variadas
de substrato.
La Figura 3 muestra una representación gráfica
de la relación entre la velocidad relativa de hidrólisis de núcleo
de CBHI y CBHI, y la cantidad de núcleo de CBHI recuperada de la
mezcla de reacción. El alto nivel de recuperación de núcleo de CBHI
es un resultado directo de la cantidad de núcleo de CBHI en solución
en la mezcla de reacción.
La Figura 4 muestra una representación gráfica
de la relación de la actividad de CBHI y núcleo de CBHI en mezclas
de enzimas celulasa que comprenden CBHII, EG1 (endoglucanasa I) y BG
(\beta-glucosidasa).
La presente invención se refiere a la conversión
enzimática de celulosa en glucosa. Más específicamente, la presente
invención proporciona un método para la conversión de substratos
lignocelulósicos pretratados usando proteína de CBHI modificada y a
la recuperación y la reutilización de la proteína de CBHI
modificada.
La siguiente descripción es de una modalidad
preferida solo a modo de ejemplo y sin limitarse a la combinación de
características necesarias para llevar a efecto la invención.
Se sabe bien en la técnica que la celulosa en
muchos materiales lignocelulósicos no puede ser fácilmente
hidrolizable mediante enzimas. Así, se prefiere que el substrato
celulósico para la hidrólisis enzimática que se describe aquí se
pretrate antes de tratarse con enzimas.
Existe un número de procedimientos de
pretratamiento conocidos en la técnica que emplean métodos térmicos,
mecánicos, químicos o combinaciones de estos para romper la
estructura fibrosa de substratos celulósicos y que potencian la
hidrólisis enzimática subsiguiente del substrato celulósico.
Cualquier procedimiento de pretratamiento que potencie la hidrólisis
enzimática puede emplearse en combinación con el método de la
presente invención. Por ejemplo, pero sin querer limitarse, puede
usarse el procedimiento de pretratamiento descrito en U.S. 4.461.648
o U.S. 4.237.226, o cualquiera de los procedimientos de reducción a
pasta papelera conocidos dentro de la técnica (por ejemplo, Rydholm
S.A. 1985, Pulping Processes, Kreiger Pub. Co), incluyendo reducción
a pasta papelera tipo Kraft, al sulfito, mecánica, térmica y
quimio-térmico-mecánica.
Alternativamente, los procedimientos de pretratamiento también
pueden implicar la adición de disolventes orgánicos para ayudar a la
fraccionación de lignina, celulosa y hemicelulosa a partir de
materias primas lignocelulósicas. Estos procedimientos de
pretratamiento pueden incluir, pero no se limitan a, los descritos
en U.S. 3.932.307, que muestran la impregnación de materia prima
lignocelulósica con una solución de reaccionante que solubiliza
lignina en un disolvente orgánico y subsiguientemente la inmersión
del material impregnado en un disolvente que no es ni soluble ni
miscible con la solución que contiene reaccionante con la que se ha
impregnado el material lignocelulósico; U.S. 4.826.522, que usa
mezclas de disolventes tales como trietilenglicol con ácidos
alilsulfónicos u otros; U.S. 5.859.236, que muestra la impregnación
de material lignocelulósico con un licor de extracción que contiene
un glicol y un ácido de Lewis; y U.S. 5.730.837, que muestra el
tratamiento de material lignocelulósico con una combinación de
alcohol, agua y disolvente orgánico inmiscible con agua, por ejemplo
una
acetona.
acetona.
Un procedimiento de tratamiento preferido es una
cocción con vapor de agua ácido, según se describe en U.S.
4.461.648, en la que un ácido, por ejemplo ácido sulfúrico de
aproximadamente 0 a aproximadamente 5%, se añade a un substrato
lignocelulósico, y la mezcla acidificada se cuece durante de
aproximadamente 5 segundos a aproximadamente 2 minutos, a una
temperatura de aproximadamente 180 a aproximadamente 250ºC.
Sin querer limitarse por una teoría, se cree que
el procedimiento de pretratamiento potencia la hidrólisis enzimática
subsiguiente de celulosa incrementando la deslignificación, creando
microporos en la celulosa, cambiando la forma cristalina de la
celulosa, reduciendo la polimerización de la celulosa, incrementando
la superficie específica de la celulosa, o sus combinaciones. Como
una gran porción de la celulosa dentro de muchos tipos de substrato
celulósico normalmente es inaccesible para la conversión enzimática
en glucosa sin pretratamiento, la eficacia de la fase de
pretratamiento puede influir en la eficacia y la aplicación
comercial para convertir enzimáticamente celulosa en glucosa.
Por el término "substrato celulósico" se
entiende cualquier material que comprende celulosa que puede
convertirse en glucosa mediante hidrólisis enzimática. El substrato
celulósico es preferiblemente un substrato lignocelulósico
pretratado, que comprende al menos aproximadamente 10% de lignina.
Por ejemplo, pero sin querer limitarse, el substrato celulósico
adecuado para el pretratamiento puede comprender:
- \bullet
- residuos agrícolas (contenido de lignina aproximadamente 15%) tales como, pero no limitados a, tallos de maíz, paja de trigo, paja de cebada, tallos de soja;
- \bullet
- residuos resultantes de la retirada de almidón o azúcar, por ejemplo, pero no limitados a, cáscaras de avena, cáscaras de arroz, fibra de maíz, bagazo de caña de azúcar, pulpa de caña de azúcar;
- \bullet
- cultivos para etanol especializados, tales como, pero no limitados a mijo perenne, miscantus, espartina, ballico;
- \bullet
- productos forestales, por ejemplo, pero no limitados a, madera de angiospermas (por ejemplo, álamo; contenido de lignina aproximadamente 25%), madera de coníferas (contenido de lignina aproximadamente 35%), eucalipto y residuos forestales, serrín; y
- \bullet
- otros substratos lignocelulósicos pretratados incluyendo productos de pasta papelera y papel, por ejemplo, pero no limitados a, Solka floc,
o combinaciones de los mismos. La
madera de angiospermas o los residuos agrícolas pretratados,
incluyendo substratos celulósicos de tallos de maíz, cáscaras de
avena, paja de cebada o paja de trigo producidos mediante el método
descrito en U.S. 4.461.648, son substratos lignocelulósicos
preferidos.
La hidrólisis enzimática de celulosa puede
seguir al pretratamiento directamente o, alternativamente, un número
de etapas puede seguir al pretratamiento y preceder a la hidrólisis
enzimática de celulosa, por ejemplo, pero sin querer limitarse, el
substrato celulósico pretratado puede lavarse con agua para retirar
productos químicos, contaminantes o combinaciones de los mismos que
podrían impedir la conversión enzimática de celulosa en glucosa.
Por "CBHI" se entiende una proteína que
comprende un dominio de unión a celulosa, una región enlazadora y
una región de núcleo de CBHI, o derivados de los mismos, que digiere
un polímero de celulosa desde el extremo reductor y libera
celobiosa. Un ejemplo no limitativo de un derivado de CBHI es CBHI
fosforilada. Hasta la fecha, las enzimas CBHI se han clasificado en
la Familia 7 y la Familia 48 y comprenden un intervalo de pesos
moleculares. Preferiblemente, la CBHI se obtiene de
Trichoderma. La proteína de CBHI de Trichoderma reesei
es de aproximadamente 65 kDa comprendiendo un dominio de unión a
celulosa C-terminal, una región enlazadora y una
región de núcleo de CBHI y digiere celulosa desde el extremo
reductor liberando celobiosa (Shoemaker, 1983). Sin embargo, ha de
entenderse que la proteína de CBHI puede obtenerse también de otras
fuentes (Barr y otros, 1996, Biochemistry
35:586-592; Birch 1998, Current Genetics
33:70-76; Henrissat 1998, Biochemical society
transactions 21(2):153-156; Henrissat y
Bairoch 1996, Biochem. J. 316:695-696; Liman y
otros, 1995, Enzyme and Microbial Technology 17:340.346; Parsiegla y
otros, 2000, Biochemistry 39:11238-11246; Schulein
1997, Journal of Biotechnology 57:71-81; Shen y
otros, 1995, Biochem. J 311:67-74; Teeri y otros,
1997, Biochemical society transactions
26(2):173-178).
Por "núcleo de CBHI" se entiende la porción
de CBHI que comprende el dominio catalítico de CBHI, y que es capaz
de hidrolizar un substrato celulósico según se define aquí. Por
ejemplo, lo que no ha de considerarse limitativo de ningún modo, el
núcleo de CBHI de Trichoderma es de aproximadamente 56 kDa.
El núcleo de CBHI puede producirse mediante segmentación
proteolítica de la proteína de CBHI usando una proteasa adecuada,
por ejemplo, pero no limitada a, papaína (por ejemplo, usando el
método de van Tillbeurgh y otros, 1986; Offord y otros). De esta
manera, una proteasa, por ejemplo, pero no limitada a, papaína,
también puede añadirse a una mezcla de enzimas en bruto para
producir núcleo de CBHI dentro de la mezcla. En esta modalidad,
dependiendo de la proteasa añadida, también pueden producirse otras
enzimas nucleares. El núcleo de CBHI también puede producirse usando
tecnología recombinante, por ejemplo, usando el método descrito en
U.S. 5.874.276. De esta manera, CBHI y núcleo de CBHI pueden
coexpresarse en el mismo organismo huésped, o el huésped puede
modificarse genéticamente de modo que la expresión de CBHI natural
se reduzca o elimine, y complementarse o reemplazarse,
respectivamente, con expresión de núcleo de CBHI recombinante. Debe
entenderse que el núcleo de CBHI también incluye fragmentos o
derivados de núcleo de CBHI, incluyendo substituciones, deleciones,
inserciones dentro de la secuencia del núcleo de CBHI como será
conocido por un experto en la técnica, con tal de que estos
fragmentos y derivados exhiban actividad de núcleo de CBHI debido a
que sean capaces de hidrolizar celulosa. Un ejemplo no limitativo de
un núcleo de CBH derivado es un núcleo de CBHI fosforilado. También
debe entenderse que el núcleo de CBHI debe aislarse de un organismo
en el que la proteína de CBHI no comprenda un dominio de unión a
celulosa o una región enlazadora.
Por el término "núcleo de CBHI más
enlazador" se entiende un fragmento de una proteína de CBHI que
comprende proteína del núcleo de CBHI y la secuencia de aminoácidos
enlazadora, o un fragmento de la misma, que enlaza la proteína del
núcleo de CBHI al CBD de la proteína de CBHI. La porción enlazadora
del núcleo de CBHI más enlazador puede comprender cualquier longitud
de la secuencia de aminoácidos. Además, ha de entenderse que el
núcleo de CBHI más enlazador también incluye fragmentos o derivados
de núcleo de CBHI más enlazador, incluyendo substituciones,
deleciones, inserciones dentro de la secuencia del núcleo de CBHI
más enlazador, como será conocido por un experto en la técnica, con
tal de que estos fragmentos y derivados de núcleo de CBHI más
enlazador exhiban actividad del núcleo de CBHI. Un ejemplo no
limitativo de un núcleo de CBH más enlazador derivado es un núcleo
de CBHI más enlazador fosforilado. También debe entenderse que el
núcleo de CBHI más enlazador puede aislarse de un organismo en el
que la proteína de CBHI no comprende un dominio de unión a
celulosa.
Por el término "CBHI con dominio de unión a
celulosa inactivo" se entiende una proteína que comprende núcleo
de CBHI o núcleo de CBHI más enlazador y un dominio de unión a
celulosa (CBD) que se ha inactivado. La inactivación de un CBD puede
realizarse mediante métodos conocidos en la técnica, por ejemplo,
pero no limitados a, Linder y otros (Linder y otros, 1995, Protein
Science, 4; 1056-1064; y Linder y otros, 1999, FEBS
Letters 447, 13-16). Un CBD inactivado da como
resultado una capacidad reducida del CBD para unirse a celulosa en
comparación con la actividad de unión asociada con una CBHI
silvestre correspondiente y ensayada bajo condiciones idénticas
(por ejemplo, según se descubre en los estudios de unión de Linder y
otros, 1999, FEBS Letters 447, 13-16). Además, debe
entenderse que la CBHI con dominio de unión a celulosa inactivo
también incluye fragmentos o derivados de CBHI incluyendo
substituciones, deleciones, inserciones dentro de la secuencia de
CBHI, enlazador, CBD o combinaciones de los mismos, como será
conocido para un experto en la técnica, con tal de que estos
fragmentos y derivados exhiban actividad del núcleo de CBHI y
exhiban una capacidad reducida para unirse a celulosa. Un ejemplo no
limitativo de una CBH derivada con dominio de unión a celulosa
inactivo es una CBHI fosforilada con dominio de unión a celulosa
inactivo. También ha de entenderse que una CBHI con dominio de
unión a celulosa inactivo puede aislarse de un organismo en el que
la proteína de CBHI comprende un dominio de unión a celulosa, sin
embargo, el CBD exhibe escasa actividad de unión a celulosa. Una
CBHI que exhibe escasa actividad de unión a celulosa exhibe menos de
aproximadamente 70% de la actividad de unión a celulosa de una CBHI
obtenida de Trichoderma reesei usando el mismo substrato.
Preferiblemente, la CBHI que exhibe escasa actividad de unión a
celulosa exhibe menos de aproximadamente 50% de la actividad de
unión a celulosa de CBHI de Trichoderma reesei. Se conoce una
gama de enzimas CBHI en la técnica e incluyen, pero no se limitan a,
las descritas en Barr y otros, (1996, Biochemistry
35:586-592), Birch (1998, Current Genetics
33:70-76), Henrissat (1998, Biochemical society
transactions 21(2):153-156), Henrissat y
Bairoch (1996, Biochem. J. 316:695-696), Liman y
otros, (1995, Enzyme and Microbial Technology
17:340-346), Parsiegla y otros, (2000, Biochemistry
39:11238-11246), Schulein (1997, Journal of
Biotechnology 57:71-81), Shen y otros, (1995,
Biochem. J 311:67-74), y Teeri y otros, (1997,
Biochemical society transactions
26(2):173-178).
Por "CBHI modificada" se entiende una
proteína que comprende núcleo de CBHI, núcleo de CBHI más enlazador,
CBHI con dominio de unión a celulosa inactivo o una combinación de
los mismos. Una proteína de CBHI modificada se caracteriza por tener
actividad de núcleo de CBHI, junto con actividad de unión a celulosa
reducida o ausente.
Según se describe con más detalle
posteriormente, se ha observado que, sobre varios substratos
lignocelulósicos pretratados, la velocidad de hidrólisis usando una
proteína de CBHI modificada, por ejemplo, pero no limitada a, núcleo
de CBHI, es equivalente a, o en algunos casos supera, la velocidad
de hidrólisis observada usando CBHI. Esto es contrario a informes
previos en los que se describe que la CBHI es mucho más rápida que
el núcleo de CBHI o la celulosa pura. Sin querer limitarse por una
teoría, es posible que las actividades equivalentes entre CBHI y
núcleo de CBHI, u otras proteínas de CBHI modificadas, sobre
lignocelulosa pretratada, puedan deberse al hecho de que los
substratos lignocelulósicos que se han pretratado tienen una gran
superficie específica y esto incrementa el acceso a la proteína de
CBHI modificada, tal como la proteína del núcleo de CBHI, para
digerir el substrato. Será apreciado fácilmente por un experto en la
técnica que los resultados observados con núcleo de CBHI también
pueden obtenerse usando CBHI modificada según se define aquí, que
comprende núcleo de CBHI más enlazador, CBHI con dominio de unión a
celulosa inactivo o una combinación de los mismos.
Por otra parte, también se ha observado que
incrementado la concentración de substrato de celulosa, la CBHI
modificada, por ejemplo, pero no limitada a, núcleo de CBHI,
convierte la celulosa más rápidamente (véanse las Figuras 2A y B).
Sin querer limitarse por una teoría, una concentración incrementada
de substrato puede reducir los tiempos de migración de la proteína
de CBHI modificada dentro de la mezcla de reacción incrementando de
ese modo la velocidad de hidrólisis del substrato.
Los beneficios asociados con el uso de CBHI
modificada, por ejemplo, pero no limitada a, núcleo de CBHI, o
mezclas de enzimas que comprenden la proteína del núcleo de CBHI,
sobre el de solo CBHI, incluyen la capacidad incrementada para
recuperar la CBHI modificada de la mezcla de reacción (especialmente
cuando se compara con CBHI) después de la digestión (por ejemplo,
véase la Tabla 3, el Ejemplo 1 y la Figura 3). Por otra parte, con
algunos substratos, existe una conversión superior o más rápida del
substrato lignocelulósico en glucosa usando CBHI modificada, por
ejemplo, pero no limitada a, núcleo de CBHI, en comparación con
CBHI, reduciendo de ese modo costes asociados con reintroducir
nueva enzima en la mezcla de hidrólisis, y reduciendo la utilización
de la enzima. En algunos casos, dependiendo del substrato celulósico
que ha de hidrolizarse, puede ser deseable usar mezclas de CBHI
modificada-CBHI, por ejemplo, lo que no debe
considerarse limitativo de ningún modo, mezclas de núcleo de
CBHI-CBHI, para optimizar la hidrólisis del
substrato (Figuras 1B y C). En estas circunstancias, pueden
alcanzarse ahorros de coste debido a la recuperación de la proteína
de CBHI modificada y las velocidades de reacción incrementadas,
puesto que solo existe una pérdida parcial de enzima añadida y la
actividad incrementada permite el uso de menos enzima o tiempos de
reacción reducidos.
\newpage
Para poner en práctica la invención, la
hidrólisis enzimática de celulosa se lleva a cabo usando una mezcla
de enzimas celulasa. Los expertos en la técnica saben que una mezcla
de celulasas eficaz contiene tipo CBHI, tipo CBHII, EG,
\beta-glucosidasa y otras enzimas que se requieren
para efectuar toda la gama de reacciones de hidrólisis necesarias.
El experto también sabe que el término "tipo CBHI" abarca la
enzima holo. La CBHI de Trichoderma tiene un peso molecular
de aproximadamente 65 Kd, comprendiendo el núcleo de CBHI, el
enlazador y las regiones de dominios de unión a celulosa. "Tipo
CBHI" también incluye:
- \bullet
- proteína del núcleo de CBHI, por ejemplo en el caso de Trichoderma, que tiene un peso molecular de aproximadamente 56 Kd,
- \bullet
- proteína del núcleo de CBHI con enlazador ligado ("núcleo de CBHI más enlazador"), con un peso molecular en el caso de Trichoderma de aproximadamente 60 Kd,
- \bullet
- CBHI fosforilada, que tiene, por ejemplo en Trichoderma, un peso molecular de aproximadamente 65 Kd,
- \bullet
- CBD (dominio de unión a celulosa) de CBHI aislado,
así como diversas formas de
diferentes grados de glicosilación y otras características
estructurales que se presentan en pequeñas cantidades. También debe
entenderse que la enzima tipo CBHI también puede incluir CBHI
modificada según se describe aquí, incluyendo CBHI con dominio de
unión a celulosa
inactivado.
En el contexto de la presente invención, las
enzimas tipo CBHI son preferiblemente al menos 55% de CBHI
modificada, por ejemplo, pero no limitado a, proteína del núcleo de
CBHI. La proporción de proteína de CBHI modificada puede ascender a
100% de la enzima tipo CBHI total presente.
La determinación del porcentaje de CBHI
modificada, por ejemplo, pero no limitada a, núcleo de CBHI, dentro
de las enzimas tipo CBHI se lleva a cabo usando una electroforesis
de enfoque isoeléctrico capilar (CIEF). El método de electroforesis
CIEF se describe en el Ejemplo 4.
La invención se pone en práctica en un sistema
de hidrólisis en el que el índice de eficacia E_{I} es mayor que
0,5. El índice de eficacia, E_{I}, que se mide usando los
procedimientos del Ejemplo 1, es la relación de la velocidad de
hidrólisis de CBHI modificada, por ejemplo, pero no limitada a,
núcleo de CBHI, a la de CBHI intacta, donde:
E_{I} =
[actividad \ de \ CBHI \ modificada]/[actividad \ de \
CBHI]
La determinación de E_{I} se realiza a una
concentración de substrato constante y se realiza usando una base
comparable de enzima, por ejemplo sobre una base por mg de proteína.
Para la determinación de E_{I} según se describe aquí, se usó una
concentración de substrato de 2% de celulosa y 10 mg de proteína. La
presente invención contempla usar substratos lignocelulósico
caracterizados por tener un E_{I} de aproximadamente 0,5 a
aproximadamente 4,0. Un E_{I} preferido es de aproximadamente 0,7
a aproximadamente 2,0. Más preferiblemente, el E_{I} es de
aproximadamente 0,8 a aproximadamente 1,5.
Según se describe aquí, sobre substratos
lignocelulósicos pretratados, E_{I} tiene un valor cercano a o
incluso que supera la unidad. Esto sugiere que la CBHI modificada,
por ejemplo, pero no limitada a, núcleo de CBHI, puede hidrolizar
estos materiales tan rápidamente o más rápidamente que la CBHI. Este
hallazgo en oposición directa con las enseñanzas de la literatura en
las que la velocidad de CBHI es mucho más rápida que la del núcleo
de CBHI (por ejemplo, Kim, 1997; Van Tilbeurgh y otros, 1986,
Ndetsky y otros, 1994).
En un aspecto de una modalidad de la presente
invención, CBHI modificada, por ejemplo, pero no limitada a,
proteína del núcleo de CBHI, se recupera y se reutiliza después de
la hidrólisis. Los métodos que pueden usarse para recuperar y
reutilizar proteínas solubles son bien conocidos en la técnica y
pueden aplicarse a cualquier CBHI modificada, por ejemplo núcleo de
CBHI. Estos métodos implican separar el residuo de sólidos insoluble
del licor de hidrólisis y enviar el licor de hidrólisis de nuevo
hacia substrato reciente (no hidrolizado). Alternativamente, la
enzima puede retirarse del licor de hidrólisis mediante
precipitación; por ejemplo, pero no limitada a, precipitación por
pH, sal, temperatura; extracción, por ejemplo, pero no limitada a,
extracción con disolventes; o filtración, por ejemplo, pero no
limitada a, ultrafiltración; y añadirse de nuevo a la hidrólisis. En
el caso de la retirada de enzima usando ultrafiltración, una
membrana preferida tiene una separación de pesos moleculares de
aproximadamente 1.000 a aproximadamente 20.0000. Más
preferiblemente, la separación es de aproximadamente 5.000 a
aproximadamente 10.000.
Por lo tanto, la presente invención proporciona
un método para convertir celulosa en glucosa, que comprende tratar
un substrato lignocelulósico pretratado con una mezcla de enzimas
que comprende enzima celulasa y una CBHI modificada, en donde la
CBHI modificada está presente en la mezcla de enzimas en una
cantidad con relación a toda la enzima tipo CBHI de 55 a 100% en
peso. Preferiblemente, la cantidad de CBHI modificada en dicha
mezcla de enzimas es de 70 a 100% en peso, más preferiblemente, la
cantidad de CBHI modificada en la mezcla de enzimas es de 80 a 100%
en peso.
\newpage
También se describe una composición de celulasas
que comprende CBHI modificada y una o más de CBHI, CBHII, EG I, EG
II y \beta-glucosidasa, en donde la CBHI
modificada está presente en la composición de celulasas en una
cantidad con relación a toda la enzima tipo CBHI de 55 a 100% en
peso. La CBHI modificada puede ser de 70 a 100% en peso y puede ser
de 80 a 100% en peso. También se prefiere que la CBHI modificada sea
una CBHI de Trichoderma modificada.
También se describe un método para convertir
celulosa en glucosa, que comprende tratar un substrato
lignocelulósico con una mezcla de enzimas que comprende CBHI, o una
mezcla que comprende celulasa, y CBHI modificada, por ejemplo, pero
no limitada a, proteína del núcleo de CBHI. Si se usa una mezcla de
CBHI y núcleo de CBHI, la cantidad de CBHI o núcleo de CBHI en la
mezcla de reacción de enzimas es de 10% a 100% en peso de la
proteína de CBHI y núcleo de CBHI (donde CBHI más núcleo de CBHI
comprende hasta 100% en peso de las enzimas tipo CBHI; véanse las
Figuras 1B y 1C). La cantidad de CBHI o núcleo de CBHI puede ser de
20% a 80% en peso de la proteína de CBHI y núcleo de CBHI dentro de
la mezcla de reacción. Por ejemplo, lo que no se considera de ningún
modo limitativo, una mezcla de reacción adecuada puede comprender
entre 20% en peso de CBHI y 80% en peso de CBHI (de la proteína de
CBHI y núcleo de CBHI).
También se describe un método para convertir
celulosa en glucosa, que comprende tratar un substrato celulósico
con una mezcla de enzimas que comprende CBHI y CBHI modificada, por
ejemplo núcleo de CBHI, como las únicas enzimas tipo CBHI, y una o
más de otras enzimas celulasa, incluyendo CBHII, EG I, EG II y
\beta-glucosidasa, en donde la relación en peso de
CBHI o núcleo de CBHI, como un ejemplo de una CBHI modificada, en la
mezcla de enzimas está en el intervalo de aproximadamente 10% a
aproximadamente 100% en peso del tipo CBHI. La cantidad de CBHI o
núcleo de CBHI puede ser de 20% a 80% en peso del tipo CBHI. En este
método, el núcleo de CBHI puede añadirse a una mezcla de celulasas
(que comprende una o más de CBHI, CBHII, EG I, EG II y
\beta-glucosidasa) producida por, por ejemplo,
pero no limitado a, un hongo filamentoso. Preferiblemente, el hongo
filamentoso es Trichoderma. De forma similar, el núcleo de
CBHI puede ser expresado por un huésped capaz de producir una mezcla
de enzimas celulasa (que comprende CBHI, CBHII, EG I, EG II y
\beta-glucosidasa).
También se describe una composición de celulasas
que comprende una enzima CBHI, por ejemplo obtenida de
Trichoderma, y una o más de CBHII, EG I, EG II y
\beta-glucosidasa, en donde el núcleo de CBHI está
presente en la composición de celulasas en una cantidad relativa a
toda la enzima tipo CBHI de 15 a 100% en peso. El núcleo de CBHI
puede ser de 50 a 100% en peso y también puede ser de 80 a 100% en
peso.
También se describe aquí una composición de
celulasas que comprende CBHI modificada y una o más de enzimas
distintas de CBHI, por ejemplo, pero no limitadas a, CBHII, EG I, EG
II y \beta-glucosidasa, en donde la CBHI
modificada está presente en la composición de celulasas en de 50 a
90% en peso con relación a otras enzimas celulasa como será conocido
para un experto en la técnica. Otras enzimas celulasa pueden incluir
enzimas naturales además de las enzimas listadas anteriormente, por
ejemplo, pero no limitadas a, EG III o derivados de enzimas celulasa
naturales que exhiben actividad de celulasa, incluyendo, pero no
limitadas a, CBHII, EG I, EG II, EG III o
\beta-glucosidasa. La CBHI modificada puede ser
una CBHI de Trichoderma modificada.
También se contempla mediante un aspecto de una
modalidad de la invención proporcionar un método para convertir
celulosa en glucosa usando una mezcla de enzimas que comprende CBHI
y una CBHI modificada, por ejemplo núcleo de CBHI más enlazador, y
una o más de otras enzimas celulasa, incluyendo CBHII, EG I, EG II y
\beta-glucosidasa, en donde la relación en peso de
núcleo de CBHI más enlazador en la mezcla de enzimas es de 50% a
100% de las enzimas tipo CBHI. Preferiblemente, la cantidad de
núcleo de CBHI más enlazador es de 70% a 100% en peso de las
enzimas tipo CBHI. Más preferiblemente, la cantidad de núcleo de
CBHI más enlazador es de 80% a 100% en peso del peso de enzimas tipo
CBHI.
También se contempla por un aspecto de una
modalidad de la presente invención un método para convertir celulosa
en glucosa usando una mezcla de enzimas que comprende CBHI con un
dominio de unión a celulosa inactivo. La inactivación del CBD de
CBHI puede efectuarse usando cualquier método adecuado como será
conocido dentro de la técnica, por ejemplo, pero no limitado a
Linder y otros (1995, citado anteriormente) o Linder y otros (1999,
citado anteriormente). Estas referencias describen cambios en
aminoácidos sencillos dentro del CBD de CBHI que dan como resultado
la pérdida parcial o completa de la capacidad para que el CBD se una
a celulosa. Otros métodos para la inactivación del CBD pueden
incluir la deleción de una porción del CBD o la inserción de una
secuencia peptídica dentro del CBD para interrumpir la actividad de
unión de CBD.
Los expertos en la técnica saben que la
hidrólisis de celulosa puede producirse bajo una variedad de
condiciones. Preferiblemente, la hidrólisis de celulosa se realiza
mediante enzimas celulasa en una suspensión de agua y celulasa que
comprende de aproximadamente 0,5% a aproximadamente 15% de celulosa
a un pH de aproximadamente 4 a aproximadamente 5 y a una temperatura
de aproximadamente 50ºC. Esas condiciones son adecuadas para la
mayoría de las enzimas celulasa. Sin embargo, la presente invención
también contempla hidrolizar celulosa bajo otras condiciones que
pueden ser más adecuadas para una mezcla particular de
celulasa/núcleo de CBHI, CBHI-núcleo de CBHI u
otras que comprenden CBHI modificada según se define aquí. Tales
condiciones pueden ser determinadas fácilmente por un experto en la
técnica.
Puede usarse cualquier fuente del sistema de
enzimas celulasa de acuerdo con el método de la presente invención.
Preferiblemente, las enzimas celulasa son de Trichoderma
longibrachiatum y Trichoderma reesei, o una combinación
de las mismas. Por otra parte, las proteínas de CBHI y CBHI
modificada, por ejemplo, pero no limitada a, núcleo de CBHI, también
se obtienen preferiblemente de T. longibrachiatum y T.
reesei, o una combinación de las mismas.
Las enzimas celulasa de Trichoderma en
bruto usadas como una base para el método de la presente invención
pueden obtenerse directamente a través de cultivo del microorganismo
apropiado, o las enzimas pueden adquirirse comercialmente (por
ejemplo de Iogen Corporation). El núcleo de CBHI puede obtenerse
expresando la secuencia genética apropiada en una célula huésped
adecuada, como se realiza comúnmente en la técnica y según se
describe en US 5.874.276, o el núcleo de CBHI puede prepararse
mediante segmentación enzimática de CBHI según se describe
anteriormente. De forma similar, puede obtenerse CBHI más enlazador
expresando una secuencia de nucleótidos que comprende el núcleo de
CBHI y la región enlazadora, o a través de segmentación proteolítica
de la holoenzima. CBHI dentro del dominio de unión a celulosa
inactivo puede obtenerse como se describe anteriormente, expresando
la secuencia génica apropiada que codifica un CBD inactivo a través
de substitución, deleción o inserción, o como es conocido por un
experto en la técnica.
El experto apreciará que la cantidad de enzima
celulasa que ha de usarse en la hidrólisis de celulosa en glucosa
puede estar determinada por la naturaleza del substrato celulósico,
el procedimiento de pretratamiento, el coste de las enzimas, el
tiempo de hidrólisis deseado y el rendimiento de glucosa deseado a
partir del substrato en celulosa. Un intervalo de dosificación de
enzimas típico es de aproximadamente 1 a aproximadamente 50 unidades
de papel de filtro (FPU) de celulasa por gramo de celulosa durante
un período de tiempo de aproximadamente 3 a aproximadamente 200
horas. En una modalidad preferida, la dosificación de enzima
celulasa es de aproximadamente 1 a aproximadamente 10 FPU por gramo
de celulosa.
El experto sabe que la concentración de celulosa
se elige para ajustase a las capacidades de las bombas para manejar
y mezclar los sólidos. Dependiendo del material, se usa una
concentración de celulosa de aproximadamente 1% a aproximadamente
25%. Sin embargo, según se describe aquí, se ha observado que
concentraciones de celulosa superiores favorecen la hidrólisis
usando CBHI modificada, por ejemplo, pero no limitada a, núcleo de
CBHI (véase el Ejemplo 3). Una concentración preferida de celulosa
dentro de la mezcla de reacción es de aproximadamente 10% a
aproximadamente 16%. Una concentración de celulosa más preferida es
de aproximadamente 12% a aproximadamente 16%.
La Figura 1 muestra el porcentaje de conversión
de celulosa en glucosa para un substrato lignocelulósico pretratado,
en este caso, tallos de maíz lavados pretratados, usando diversas
cantidades de proteína de CBHI o núcleo de CBHI. El porcentaje de
conversión de substrato lignocelulósico pretratado después de una
reacción de tres horas es mayor con proteína de núcleo de CBHI que
con la enzima CBHI a concentraciones de enzima entre aproximadamente
1 y aproximadamente 10 mg de enzima por gramo de celulosa. También
se han observado resultados similares para otros substratos
lignocelulósicos pretratados, incluyendo, pero no limitados a,
cáscaras de avena, tallos de maíz y paja de trigo (resultados
resumidos en la Figura 3).
También se examinó el efecto de incrementar la
concentración de substrato celulósico en la mezcla de reacción, y
una muestra de los resultados, usando SIGMACELL™ o madera de
angiospermas pretratada, se presentan en las Figuras 2A, B y C. En
general, se observó la conversión incrementada de celulosa en
glucosa mediante CBHI, con una concentración incrementada del
substrato celulósico. Como se muestra en la Figura 2C, la actividad
de CBHI típicamente supera la del núcleo de CBHI (relación de núcleo
de CBHI:CBHI <1) a concentraciones bajas de substrato, sin
embargo, a concentraciones superiores de substrato, la actividad del
núcleo de CBHI supera la de CBHI. Estos datos también sugieren que
se observa actividad del núcleo de CBHI incrementada (con relación a
la actividad de CBHI) a diferentes concentraciones de substrato
dependiendo del substrato usado. Sin embargo, con todos los
substratos probados, un incremento en la concentración de substrato
daba como resultado un incremento en la conversión de substrato
usando núcleo de CBHI. En el caso de SIGMACELL™, la actividad del
núcleo de CBHI supera la actividad de la holoenzima a de
aproximadamente 6 a aproximadamente 7% en peso de concentración de
substrato, mientras que sobre madera de angiospermas pretratada este
umbral se alcanza a aproximadamente 3% en peso de celulosa. Sin
embargo, debe entenderse que aun cuando la actividad del núcleo
supere la actividad de la holoenzima a una cierta concentración de
substrato dependiendo el substrato, la proteína del núcleo todavía
se activa en soluciones de celulosa más diluidas con un substrato
lignocelulósico pretratado. Por lo tanto, el núcleo de CBHI todavía
puede usarse eficazmente a concentraciones de substrato inferiores,
si se desea. La consideración de la cantidad de núcleo de CBHI y
substrato que ha de usarse dependerá de diversas variables de la
mezcla de reacción incluyendo el tiempo de reacción, la temperatura
de reacción, el substrato celulósico que ha de hidrolizarse, etc.,
como será conocido para un experto en la técnica.
El análisis de la adsorción de CBHI o núcleo de
CBHI a diferentes substratos celulósicos (véase la Tabla 3, Ejemplo
1) indica que para la mayoría de los substratos, el núcleo de CBHI
puede recuperarse eficazmente, mientras que la CBHI es retenida más
fácilmente por el substrato. La cantidad de núcleo de CBHI
recuperable de una mezcla de reacción puede expresarse como un
"índice de recuperabilidad" o "R_{I}", donde R_{I} es
una medida de la proteína, en este caso CBHI más núcleo de CBHI, en
solución como una función de la proteína, es decir CBHI más núcleo
de CBHI, total añadida inicialmente:
R_{I} =
[cantidad \ de \ prote\text{í}na \ en \ solución]/[prote\text{í}na \
total \ añadida \ inicialmente] X
100
La determinación de R_{I} se realiza a una
concentración de substrato constante, por ejemplo, según se describe
aquí, a 2% de celulosa. Usando madera de angiospermas (por ejemplo,
álamo) pretratada como el substrato lingocelulósico, a una
concentración de 2% de celulosa, se observa un R_{I} de 96 en
mezclas de reacción que comprenden 110% de núcleo de CBHI. Esto
indica que aproximadamente 96% de la enzima añadida es recuperable
de la mezcla de reacción. En mezclas que comprenden 50% de núcleo de
CBHI y 50% de CBHI, el R_{I} es aproximadamente 60, mientras que
en mezclas que comprenden 100% de CBHI, el R_{I} es
aproximadamente 24. Estos datos están de acuerdo con informes
previos de que la CBHI se une a celulosa preferentemente y no se
retira fácilmente del substrato.
Los resultados presentados en las Figuras 1 a 4
demuestran que una variedad de substratos celulósicos pretratados,
preferiblemente substratos lignocelulósicos, es muy adecuada para la
hidrólisis usando proteína de núcleo de CBHI. En varios casos y bajo
ciertas circunstancias, la velocidad absoluta de hidrólisis es
superior usando núcleo de CBHI en comparación con CBHI, aun cuando
la cantidad de núcleo de CBHI unido al substrato en cualquier
momento dado sea baja, a menudo menor que aproximadamente 10% (véase
la Figura 3, donde R_{I} > 90).
Por lo tanto, esta invención se dirige a la
hidrólisis de substratos celulósicos usando una CBHI modificada, por
ejemplo, pero no limitada a, una proteína de núcleo de CBHI, que se
caracteriza por tener una baja tendencia a unirse a substratos
celulósicos, pero que todavía exhibe alta actividad.
También se describe un método para la hidrólisis
de un substrato celulósico, que comprende añadir una cantidad
suficiente de CBHI modificada, por ejemplo, pero no limitada a,
núcleos de CBHI, a una mezcla de enzimas celulasa y dejar que la
reacción avance durante un período de tiempo suficiente para
hidrolizar la celulosa en glucosa.
También se describe un método para la hidrólisis
de un substrato celulósico usando mezclas de proteínas de CBHI y
núcleo de CBHI, a lo largo de un intervalo de mezcla de
aproximadamente 20% en peso de núcleo de CBHI y aproximadamente 80%
en peso de CBHI a aproximadamente 100% en peso de núcleo de
CBHI.
Con referencia a la Figura 1A, se muestra el
porcentaje de conversión de celulosa en glucosa a partir de tallos
de maíz lavados 3 horas después de la incubación con proteína de
CBHI o núcleo de CBHI. Existe un incremento en la conversión de
celulosa en glucosa con la dosificación creciente de CBHI y núcleo
de CBHI. A todas las dosificaciones, el núcleo de CBHI alcanza una
conversión superior que la CBHI.
En referencia ahora a las Figuras 1B y 1C, se
muestra el porcentaje de conversión de celulosa en glucosa a partir
de cáscaras de avena y madera de angiospermas pretratadas,
respectivamente, después de tres horas de incubación en presencia de
diversas combinaciones de proteína de CBHI-núcleo de
CBHI. La mayor conversión de celulosa en glucosa se observa para una
mezcla de proteína de CBHI y núcleo de CBHI que comprende
aproximadamente 20% en peso de CBHI y aproximadamente 80% en peso de
proteína de núcleo de CBHI a aproximadamente 80% en peso de CBHI y
aproximadamente 20% en peso de núcleo de CBHI.
Los resultados para la hidrólisis de celulosa
usando CBHI modificada, por ejemplo, pero no limitada a, núcleo de
CBHI, o mezclas de proteína de CBHI y núcleo de CBHI, descritas
anteriormente, se determinaron, a no ser que se indique otra cosa,
en ensayos que comprenden 2% de celulosa como un substrato. También
se han obtenido resultados que demuestran la eficacia de usar núcleo
de CBHI usando concentraciones de celulosa de hasta aproximadamente
8% en peso, con propósitos agrícolas, o hasta aproximadamente 12%,
para madera de angiospermas pretratada (por ejemplo, véanse las
Figuras 2A, B y C). Así, la presente invención contempla usar CBHI
modificada sola, por ejemplo, pero no limitada a, núcleo de CBHI, o
mezclas de proteína de CBHI y CBHI modificada, por ejemplo, pero no
limitada a, núcleo de CBHI, para convertir celulosa en glucosa en
mezclas en las que la mezcla de celulosa inicial puede comprender de
aproximadamente 0,5% en peso a aproximadamente 15% en peso de
celulosa. Preferiblemente, la concentración de celulosa es de
aproximadamente 1% en peso a aproximadamente 12% en peso. Más
preferiblemente, el substrato lignocelulósico correspondiente, que
es aproximadamente 50% de celulosa, está presente en la mezcla de
enzimas en una concentración de aproximadamente 2% en peso a
aproximadamente 25% en peso.
Con referencia a la Figura 3, se muestra un
resumen de las actividades de CBHI y CBHI modificada, en este
ejemplo núcleo de CBHI, sobre diferentes substratos
lignocelulósicos, y la recuperabilidad de estas proteínas a partir
de estos substratos. La Figura 3 compara valores de R_{I} y
E_{I} para una gama de diferentes substratos. Pueden identificarse
tres clases de substratos a partir de los datos presentados en la
Figura 3:
- 1)
- una clase de substrato caracterizada por tener un R_{I} bajo y un E_{I} bajo (situado en el cuadrante izquierdo inferior de la gráfica; "substrato clase uno"). Un ejemplo de tal substrato es Sigmacell™ con un R_{I} de aproximadamente 36 y un E_{I} de aproximadamente 0,1, que demuestra que la velocidad de CBHI es mucho mayor que la del núcleo de CBHI, y que la recuperabilidad del núcleo de CBHI es baja;
- 2)
- una clase de substrato caracterizada por tener un R_{I} intermedio, de entre aproximadamente 45 y 75, y un E_{I} mayor que aproximadamente 0,75 (clase situada en el intervalo medio de la gráfica, "substrato clase dos"). Ejemplos de estos substratos incluyen paja de trigo con un R_{I} de aproximadamente 64 y un E_{I} de aproximadamente 1,1, que demuestran que la velocidad del núcleo de CBHI es aproximadamente equivalente a la de CBHI, y que la recuperabilidad del núcleo de CBHI es mayor que aproximadamente 50%; y
\newpage
- 3)
- una tercera clase de substratos caracterizada por tener un R_{I} mayor que 75 y un E_{I} mayor que 1 ("clase de substrato tres"). Ejemplos de esta clase de substratos incluyen cáscaras de avena (un R_{I} de aproximadamente 98 y un E_{I} de aproximadamente 0,75), paja de maíz (un R_{I} de aproximadamente 98 y un E_{I} de aproximadamente 1,1), H60 (un R_{I} de aproximadamente 96 y un E_{I} de aproximadamente 1,1) y Solka-floc (un R_{I} de aproximadamente 97 y un E_{I} de aproximadamente 3,3).
En referencia ahora a la Figura 4, se muestran
resultados obtenidos a partir de la hidrólisis de cáscaras de avena
pretratadas mediante mezclas de celulasa que comprenden CBHI o CBHI
modificada, por ejemplo, pero no limitada a, núcleo de CBHI. La
mezcla de celulasas que comprende CBHI modificada exhibe resultados
similares a mezclas que comprenden CBHI, sugiriendo que la CBHI
modificada es eficaz para hidrolizar mezclas de celulasas. Además,
la CBHI modificada, por ejemplo, pero no limitada a, núcleo de CBHI,
puede recuperarse más fácilmente que la CBHI, y este atributo puede
ser ventajoso en la hidrólisis de celulosa.
Por lo tanto, también se describe un método para
la hidrólisis de un substrato lignocelulósico, usando CBHI
modificada, por ejemplo, pero no limitada a, núcleo de CBHI, o
mezclas de CBHI modificada-CBHI, donde el substrato
se caracteriza por ser un substrato de clase dos o tres. Por otra
parte, este método se dirige a un método de hidrólisis
lignocelulósica en la que el substrato se caracteriza por tener un
E_{I} de al menos aproximadamente 0,75 y un R_{I} de al menos
aproximadamente 45 a aproximadamente 100. El substrato puede
caracterizarse por tener un E_{I} de más de aproximadamente 1,0 y
un R_{I} de más de aproximadamente 70. Alternativamente, el
E_{I} puede ser de aproximadamente 1,0 a aproximadamente 4,0 y el
R_{I} puede ser de aproximadamente 60 a aproximadamente 100.
También se describe un método para la hidrólisis
de un substrato lignocelulósico en el que el substrato se
caracteriza por tener un R_{I} de aproximadamente 45 a
aproximadamente 98. El R_{I} puede ser de aproximadamente 60 a
aproximadamente 98. Alternativamente, el R_{I} puede ser de
aproximadamente 80 a aproximadamente 98.
La presente invención también abarca un método
para la hidrólisis de un substrato lignocelulósico, en el que el
substrato se caracteriza por tener un E_{I} de aproximadamente
0,75 a aproximadamente 4,0. Preferiblemente, el E_{I} es de
aproximadamente 0,9 a aproximadamente 4,0. Más preferiblemente, el
E_{I} es de aproximadamente 1 a aproximadamente 3,6.
La descripción anterior no pretende limitar la
invención reivindicada de ningún modo. Por otra parte, la
combinación de características analizada podría no ser
absolutamente necesaria para la resolución de la invención.
La presente invención se ilustrará
adicionalmente en los siguientes ejemplos. Sin embargo, ha de
entenderse que estos ejemplos tienen solamente propósitos
ilustrativos y no deben usarse para limitar el alcance de la
presente invención de ningún modo.
Los substratos usados se listan en la Tabla 1 y
las enzimas se prepararon como sigue:
| Substrato | Celulosa (%) | Fuente |
| SigmaCell | 100 | Sigma Chemical Co. |
| Solka floc | 92 | Fibre Sales \amp{1} Dev. Corp. |
| Paja de trigo pretratada | 45 | Iogen* |
| Tallos de maíz pretratados | 55 | Iogen* |
| Álamo pretratado | 53 | Iogen* |
| Cáscaras de avena pretratadas | 55 | Iogen* |
| * \begin{minipage}[t]{150mm}como para US 4.461.648; el procedimiento de pretratamiento implicaba añadir ácido sulfúrico de aproximadamente 0 a aproximadamente 5% a un substrato lignocelulósico, y la mezcla acidificada se hervía durante de aproximadamente 5 segundos a aproximadamente 2 minutos a una temperatura de aproximadamente 180 a aproximadamente 250^{o}C.\end{minipage} |
Se obtuvo CBHI purificada de un caldo de
celulasa de Trichoderma en bruto filtrando en primer lugar el
caldo a través de papel de filtro de microfibra de vidrio. El
líquido de celulasa se dializó a continuación usando una membrana
de separación de peso molecular 10.000 para disminuir su
conductividad hasta 12.000 \muS. La CBHI se enriqueció cargando
190 mg de proteína/ml de resina sobre resina de intercambio iónico
de DEAE-Sepharose de pH 6. Los otros componentes se
desorbieron de la resina antes del CBHI, haciendo pasar fosfato 50
mM, tampón de NaCl 25 mM a una conductividad de 9.000 \muS a
través de la columna. La CBHI se desorbió haciendo pasar tampón de
fosfato 50 mM, NaCl 300 mM a una conductividad de 30.000 \muS a
través de la columna. La CBHI se concentró a continuación mediante
ultrafiltración y su pureza se determinó mediante una unidad de
electroforesis de enfoque isoeléctrico LKB Bromma.
La proteína del núcleo de CBHI se obtuvo de CBHI
mediante una digestión con papaína Quest del componente puro a una
dosificación de 0,05 g de papaína/g de proteína durante 2 días. El
pH y la temperatura del digesto eran 4,5 y 37ºC, respectivamente.
El digesto se filtró a continuación a través de papel de filtro de
microfibra de vidrio. La pureza de la CBHI se determina a
continuación mediante una unidad de electroforesis de enfoque
isoeléctrico LKB Bromma.
Las mezclas de hidrólisis pesaban un total de 10
gramos. La cantidad de substrato añadida era tal que estaban
presentes 0,2 gramos de celulosa. Además, se añadió tensioactivo
Neodox 23-6 (4 mg/gramo de celulosa), junto con 80
UI de beta-glucosidasa Novozyme 188, que tiene una
actividad de reserva de 1444 unidades por mililitro. El
tensioactivo y la beta-glucosidasa controlan la
espumación y la formación de celobiosa, respectivamente. La mezcla
se llevó hasta un total de 10 gramos (excluyendo CBHI o núcleo de
CBHI) con tampón de citrato sódico 50 mM, pH 4,8. La dosificación
de CBHI o núcleo de CBHI era 10 mg de proteína por gramo de
celulosa.
Las mezclas se incubaron a 50ºC con remoción a
250 RPM durante 3 horas. En este momento, se tomó una muestra de la
mezcla y se filtró a través de papel de filtro de microfibra de
vidrio. La concentración de glucosa en la muestra se midió mediante
el Analizador de Glucosa YSI de Yellow Springs Instruments, Yellow
Springs, Ohio. La concentración de glucosa se expresa como un
porcentaje de conversión de la celulosa en el substrato. Los
resultados de incubar los substratos de la Tabla 1 con las enzimas
obtenidas anteriormente se listan en la Tabla 2.
\vskip1.000000\baselineskip
| Substrato | Conversión (%) después de 3 h de hidrólisis | E_{I} | |
| Núcleo de CHBI | CBHI | ||
| SigmaCell | 1,9 | 4,5 | 0,42 |
| Kim y otros (1997) | 0,14* | ||
| Van Tilbeurgh y otros (1986) | 0,01* | ||
| Nidetsky y otros (Filter paper; 1994) | 0,44* | ||
| Tallos de algodón | 14,8 | 13,6 | 1,09 |
| Solka floc | 10,0 | 2,9 | 3,45 |
| Álamo | 6,9 | 7,2 | 0,96 |
| Cáscaras e avena | 7,4 | 9,2 | 0,80 |
| Paja de trigo | 9,8 | 9,2 | 1,07 |
| * estimado de velocidades de actividad presentadas de CBHI y núcleo de CBHI |
\vskip1.000000\baselineskip
El índice de eficacia E_{I} es la relación de
conversión de núcleo de CBHI a CBHI bajo las condiciones usadas en
este ejemplo. A E_{I} = 0, el núcleo de CBHI es completamente
incapaz de hidrolizar un substrato, a E_{I} entre 0 y la unidad,
la velocidad del núcleo de CBHI es inferior que la velocidad de la
CBHI. A E_{I} = 1, la velocidad del núcleo de CBHI es igual que
la de CBHI. A E_{I} > 1, el núcleo de CBHI es más rápido que
la CBHI.
Para SigmaCell, la E_{I} es 0,42 (véase la
Figura 3). Esto está de acuerdo con los resultados de Van Tilbeurgh
y otros (1986), Kim y otros (1997) y Nidetsky y otros (1994), todos
los cuales presentaron velocidades de hidrólisis mucho más lentas
mediante núcleo de CBHI que mediante CBHI que corresponden a
relaciones bajas de actividad del núcleo de CBHI:actividad de CBHI.
Esto es similar a una E_{I} baja, aunque los procedimientos no
son iguales que los usados para la determinación de E_{I}.
Sorprendentemente, sobre los otros substratos,
E_{I} está entre 0,8 y 1,09, excepto Solka floc, que se
hidrolizaba con un E_{I} de más de 3 (Figura 3).
La cantidad de proteína en solución se midió
para varios de los substratos, después de 3 horas de hidrólisis.
Esta medida se realizó mediante un ensayo de proteínas Biorad usando
celulasa Iiogen (90 g/l) como un patrón. Los resultados se muestran
en la Tabla 3.
| Substrato | Proteína en solución (%) | |
| CBHI | Núcleo de CBHI | |
| Tallos de maíz | 56 | 98 |
| Cáscaras de avena | 51 | 97 |
| Solka floc | 44 | 99 |
| Álamo | 24 | 96 |
La cantidad de núcleo de CBHI en solución es muy
alta, muy por encima de 90% de la proteína total. La cantidad de
CBHI en solución es mucho menor. Por lo tanto, el núcleo de CBHI
ofrece la oportunidad de recuperarse y reutilizarse, con una
velocidad de hidrólisis virtualmente tan rápida como la CBHI.
Se repitieron los procedimientos del Ejemplo 1,
excepto que el núcleo de CBHI y la CBHI se usaron en mezclas. Las
combinaciones de CBHI/núcleo de CBHI eran 0/100, 20/80, 40/60,
60/40, 80/20 y 100/0, como un porcentaje de proteína total. La
proteína total era 10 mg por gramo de celulosa.
Los resultados para cáscaras de avena
pretratadas como un substrato se muestran en la Figura 1B, y para
madera de angiospermas (álamo) pretratada se presentan en la Figura
1C. Sorprendentemente, las combinaciones de CBHI/núcleo de CBHI de
20/80, 40/60, 60/40 y 80/20 superan a la CBHI sola (100/0). Esto
sugiere que existe una sinergia entre CBHI y núcleo de CBHI. La
mezcla óptima, aproximadamente 50/50, es 20% más eficaz que la
propia CBHI.
Se repitieron los procedimientos del Ejemplo 1,
excepto que la concentración de celulosa era 0,5%, 2%, 5% y 10%.
Los resultados se muestran en la Figura 2. A
medida que la concentración de celulosa se incrementa, los valores
de E_{I} se incrementan sobre SigmaCell (Figura 2A) y álamo
(Figura 2B). La alta concentración de celulosa favorece al núcleo
de CBHI en la hidrólisis (Figura 2C).
Se usó un instrumento de electroforesis capilar
Beckman MDQ de PAGE en el modo de enfoque isoeléctrico capilar
(CIEF) para determinar la cantidad de núcleo de CBHI, núcleo de CBHI
más enlazador, CBHI fosforilada y oloenzima en una muestra de CBHI
obtenida de Trichoderma. CIEF es un procedimiento en dos
etapas que implica 1) enfoque y 2) movilización. Una muestra de 10
\mul de proteínas al 10% se mezcla con 200 \mul de anfolito
neutro y se inyecta en un capilar. Se crea un gradiente de pH (de pH
3-10) mediante los anfolitos bajo la influencia de
un campo eléctrico. Las proteínas migran en la dirección opuesta a
su carga hasta que alcanzan un estado neutro cuando se enfocan.
Esto es seguido por una movilización a baja presión (a 0,8 psi [0,06
kg/cm^{2}]) de las proteínas cuando se explora mediante un
detector UV a 280 nm. Se genera un electroferograma que muestra
picos correspondientes a lecturas de absorbancia a tiempos de
migración particulares. Usando patrones de proteínas, los
diferentes picos pueden identificarse de acuerdo con valores de pI
conocidos.
Bajo estas condiciones, la CBHI de
Trichoderma exhibe un tiempo de migración típico de
aproximadamente 22,1 min, el núcleo de CBHI más enlazador de
Trichoderma un tiempo de migración de aproximadamente 22,5
minutos, el núcleo de CBHI de Trichoderma un tiempo de
migración de aproximadamente 24,7 minutos y la CBHI fosforilada de
Trichoderma de aproximadamente 23 minutos. Estos tiempos de
migración pueden variar en aproximadamente \pm 2 minutos y
habitualmente se comprueban usando patrones. La concentración de las
proteínas se determina a partir del área de los picos
correspondientes a las proteínas, por ejemplo según se indica en la
Tabla 4.
| Celulasa | Tipo CBHI | % | % | % | % |
| total (%) | |||||
| Celulasa Iogen | CBHI | Núcleo de | Núcleo de CBHI | CBHI | |
| CBHI | más enlazador | fosforilada | |||
| 240-226 | 74,5 | 70 | 4,7 | 19,4 | 5,8 |
| 230-812 | 74,5 | 36,7 | 11,9 | 39 | 12,4 |
| 230-799 | 70,3 | 56,7 | 9,4 | 22,9 | 11 |
| 230-685 | 70,8 | 73,1 | 6,3 | 16,3 | 4,4 |
| 230-330 | 72,4 | 65,2 | 7 | 24 | 3,7 |
Se suspendieron muestras de 0,226 gramos de
cáscaras de avena pretratadas con vapor de agua (base en seco) en
tampón de citrato sódico 50 mM más benzoato sódico al 0,5%, pH 5,0,
hasta un peso total de 2,5 gramos en tubos de centrífuga de 15 ml.
La suspensión constituía 5% de celulosa. A un grupo de tubos se
añade una mezcla de núcleo de CBHI junto con CBHI, EGI y
beta-glucosidasa. Las cantidades relativas de
CBHI/CBHII/EGI son 60%/20%/20%, respectivamente. Además, se añade
beta-glucosidasa Novozym 188 a una concentración de
125 unidades BG por gramo de celulosa. Para un segundo grupo de
tubos, el núcleo de CBHI se reemplaza por CBHI, con el resto de la
mezcla inalterado. Las dosificaciones de enzimas totales están entre
12 y 95 mg por gramo de celulosa, excluyendo la
beta-glucosidasa. Los matraces se incuban a 50ºC y
se remueven durante 24 horas. En este momento, se toman muestras y
se analizan con respecto a la concentración de celulosa residual. La
concentración de celulosa se determina centrifugando la suspensión,
lavando con agua y suspendiendo en ácido sulfúrico al 82% para
obtener una concentración de ácido sulfúrico puro de 70%. La
suspensión se incuba a 40ºC durante 30 minutos, seguido por
dilución en agua desionizada hasta ácido sulfúrico al 2%. En este
punto temporal, las muestras se tratan en autoclave al vapor de
agua a 125ºC durante 1 hora, para convertir los oligómeros en
glucosa monómera. La concentración de glucosa se mide y se compara
con la concentración de celulosa inicial para determinar el
porcentaje de conversión de celulosa.
Los resultados obtenidos de la hidrólisis de
cáscaras de avena pretratadas mediante mezclas de celulasas que
comprenden núcleo de CBHI se muestran en la Figura 4. La mezcla de
celulasas que comprende núcleo de CBHI exhibe los mismos resultados
que mezclas que comprenden CBHI, demostrando que el núcleo de CBHI
es eficaz para hidrolizar celulosa usando mezclas de celulasas.
Además, como el núcleo de CBHI, o cualquier otra enzima CBHI
modificada, puede recuperarse después de la hidrólisis de celulosa,
la CBHI modificada puede reciclarse y reutilizarse reduciendo los
costes asociados con la producción de glucosa.
La presente invención se ha descrito con
respecto a modalidades preferidas, sin embargo, será obvio para los
expertos en la técnica que puede realizarse un número de variaciones
y modificaciones sin apartarse del alcance de la invención según se
describe aquí.
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Claims (19)
1. Un método para convertir celulosa en glucosa,
que comprende tratar un substrato lignocelulósico pretratado con
una mezcla de enzimas que comprende:
- una CBHI modificada, seleccionada del grupo que consiste en núcleo de CBHI, núcleo de CBHI más enlazador, CBHI con dominio de unión a celulosa inactivado y combinaciones de los mismos; y
- enzimas celulasa, seleccionadas del grupo que consiste en endoglucanasas (EG), exo-celobiohidrolasas (CBH), \beta-glucosidasas y combinaciones de las mismas,
dicha CBHI modificada presente en
dicha mezcla de enzimas en de 55 a 100% en peso, con relación a
todas las enzimas tipo CBHI, en donde dicho substrato
lignocelulósico pretratado comprende al menos 10% de
lignina.
2. El método de acuerdo con la reivindicación 1,
en el que la celulosa en el substrato lignocelulósico pretratado
está presente en la etapa de tratamiento a una concentración de 1%
en peso a 25% en peso.
3. El método de acuerdo con la reivindicación 1
o la reivindicación 2, en el que la celulosa en el substrato
lignocelulósico pretratado está presente en la etapa de tratamiento
en una concentración de 10% en peso a 16% en peso.
4. El método de acuerdo con cualquier
reivindicación precedente, en el que dicha CBHI modificada es una
CBHI de Trichoderma modificada.
5. El método de acuerdo con cualquier
reivindicación precedente, en el que dicha CBHI modificada se
recupera después de dicha etapa de tratamiento.
6. El método de acuerdo con cualquier
reivindicación precedente, en el que dicha CBHI modificada se
reutiliza después de dicha etapa de recuperación.
7. El método de acuerdo con la reivindicación 6,
en el que dicha etapa de recuperación comprende usar una membrana de
ultrafiltración.
8. El método de acuerdo con cualquier
reivindicación precedente, en el que dicho substrato lignocelulósico
pretratado se selecciona del grupo que consiste en residuos
agrícolas, residuos resultantes de la retirada de almidón o azúcar,
cultivos para etanol especializados, productos forestales y
productos de pasta papelera y papel o combinaciones de los
mismos.
9. El método de acuerdo con la reivindicación 8,
en el que:
- dichos residuos agrícolas se seleccionan del grupo que consiste en tallos de maíz, paja de trigo, paja de cebada y tallos de soja;
- dichos residuos resultantes de la retirada de almidón o azúcar se seleccionan del grupo que consiste en cáscaras de avena, cáscaras de arroz, bagazo de caña de azúcar y fibra de maíz;
- dichos cultivos para etanol especializados se seleccionan del grupo que consiste en mijo perenne, miscantus, espartina y ballico;
- dichos productos forestales se seleccionan del grupo que consiste en madera de angiospermas, madera de coníferas, eucalipto y serrín, y
- dichos productos de pasta papelera y papel son Solka floc.
10. El método de acuerdo con la reivindicación
1, en el que dicha mezcla de enzimas comprende CBHI modificada y
enzimas celulasa seleccionadas del grupo que consiste en CBHI,
CBHII, EG I, EG II, \beta-glucosidasa y
combinaciones de las mismas.
11. El método de acuerdo con la reivindicación
10, en el que dicha CBHI modificada es una CBHI de
Trichoderma modificada.
12. El método de acuerdo con la reivindicación
10 o la reivindicación 11, en el que dicha CBHI modificada se
recupera después de dicha etapa de tratamiento.
13. El método de acuerdo con la reivindicación
12, en el que dicha CBHI modificada se reutiliza después de dicha
etapa de recuperación.
\newpage
14. El método de acuerdo con la reivindicación
10, en el que la CBHI modificada es CBHI con un dominio de unión a
celulosa inactivo.
15. El método de acuerdo con la reivindicación
10, en el que dicha CBHI modificada es núcleo de CBHI.
16. El método de acuerdo con la reivindicación
15, en el que dicho núcleo de CBHI se obtiene de CBHI de
Trichoderma.
17. El método de acuerdo con la reivindicación
10, en el que dicha CBHI modificada es núcleo de CBHI más
enlazador.
18. El método de acuerdo con la reivindicación
17, en el que dicho núcleo de CBHI más enlazador se obtiene de CBHI
de Trichoderma.
19. Un método para convertir celulosa en
glucosa, que comprende tratar un substrato lignocelulósico
pretratado con una mezcla de enzimas que comprende:
- CBHI modificada, seleccionada del grupo que consiste en núcleo de CBHI, núcleo de CBHI más enlazador, CBHI con dominio de unión a celulosa inactivado y combinaciones de los mismos; y
- enzimas celulasa, seleccionadas del grupo que consiste en endoglucanasas (EG), exo-celobiohidrolasas (CBH), \beta-glucosidasas y combinaciones de las mismas,
dicha CBHI modificada presente en
dicha mezcla de enzimas en de 55 a 100% en peso, con relación a
todas las enzimas tipo
CBHI,
en donde dicho substrato
lignocelulósico pretratado se selecciona del grupo que consiste en
tallos de maíz, paja de trigo, paja de cebada y tallos de soja,
cáscaras de avena, cáscaras de arroz, bagazo de caña de azúcar y
fibra de maíz, mijo perenne, miscantus, espartina y ballico, madera
de angiospermas, eucalipto y
serrín.
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