RU2529949C2 - Ферментная композиция, способная эффективно разлагать целлюлозный материал - Google Patents
Ферментная композиция, способная эффективно разлагать целлюлозный материал Download PDFInfo
- Publication number
- RU2529949C2 RU2529949C2 RU2010148388/10A RU2010148388A RU2529949C2 RU 2529949 C2 RU2529949 C2 RU 2529949C2 RU 2010148388/10 A RU2010148388/10 A RU 2010148388/10A RU 2010148388 A RU2010148388 A RU 2010148388A RU 2529949 C2 RU2529949 C2 RU 2529949C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- swollenin
- cellulose
- cellulase
- composition
- spp
- Prior art date
Links
- 239000000203 mixture Substances 0.000 title abstract description 85
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 title abstract description 79
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 title abstract description 79
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 title abstract description 41
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 title abstract description 41
- 239000000463 material Substances 0.000 title abstract description 10
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 title abstract 2
- 108010059892 Cellulase Proteins 0.000 abstract description 97
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 abstract description 24
- 239000008103 glucose Substances 0.000 abstract description 23
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 abstract description 18
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 15
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 13
- 108010047754 beta-Glucosidase Proteins 0.000 abstract description 10
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 abstract description 9
- 108010008885 Cellulose 1,4-beta-Cellobiosidase Proteins 0.000 abstract description 9
- 241000499912 Trichoderma reesei Species 0.000 abstract description 9
- 102000006995 beta-Glucosidase Human genes 0.000 abstract description 9
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 abstract description 8
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 5
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract 1
- 229940106157 cellulase Drugs 0.000 description 83
- 235000010980 cellulose Nutrition 0.000 description 71
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 58
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 39
- 238000000034 method Methods 0.000 description 36
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 36
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 32
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 28
- 108010084185 Cellulases Proteins 0.000 description 26
- 102000005575 Cellulases Human genes 0.000 description 26
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 23
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 23
- 239000002023 wood Substances 0.000 description 17
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 16
- 229920005610 lignin Polymers 0.000 description 14
- 229920001131 Pulp (paper) Polymers 0.000 description 12
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 12
- 239000010902 straw Substances 0.000 description 12
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 11
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 10
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 10
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 10
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 10
- 229920002488 Hemicellulose Polymers 0.000 description 9
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 9
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 9
- 241000223259 Trichoderma Species 0.000 description 8
- 230000001461 cytolytic effect Effects 0.000 description 8
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 8
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 8
- 239000000123 paper Substances 0.000 description 8
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 8
- 239000011122 softwood Substances 0.000 description 8
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 8
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 description 7
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 description 7
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 7
- 230000008569 process Effects 0.000 description 7
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 description 7
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 6
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 6
- YPHMISFOHDHNIV-FSZOTQKASA-N cycloheximide Chemical compound C1[C@@H](C)C[C@H](C)C(=O)[C@@H]1[C@H](O)CC1CC(=O)NC(=O)C1 YPHMISFOHDHNIV-FSZOTQKASA-N 0.000 description 6
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 6
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 6
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 6
- 230000003301 hydrolyzing effect Effects 0.000 description 6
- 238000002203 pretreatment Methods 0.000 description 6
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 6
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 6
- GUBGYTABKSRVRQ-CUHNMECISA-N D-Cellobiose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-CUHNMECISA-N 0.000 description 5
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 5
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 5
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 5
- 235000013339 cereals Nutrition 0.000 description 5
- 239000013256 coordination polymer Substances 0.000 description 5
- 230000007071 enzymatic hydrolysis Effects 0.000 description 5
- 238000006047 enzymatic hydrolysis reaction Methods 0.000 description 5
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 5
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 5
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 5
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 5
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 5
- 239000002699 waste material Substances 0.000 description 5
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229920000742 Cotton Polymers 0.000 description 4
- SRBFZHDQGSBBOR-IOVATXLUSA-N D-xylopyranose Chemical compound O[C@@H]1COC(O)[C@H](O)[C@H]1O SRBFZHDQGSBBOR-IOVATXLUSA-N 0.000 description 4
- 229920001503 Glucan Polymers 0.000 description 4
- 101000955266 Homo sapiens Mediator of RNA polymerase II transcription subunit 28 Proteins 0.000 description 4
- 101000906480 Sclerotinia sclerotiorum Endoglucanase 1 Proteins 0.000 description 4
- 101001036019 Sclerotinia sclerotiorum Endoglucanase 2 Proteins 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 244000062793 Sorghum vulgare Species 0.000 description 4
- RAHZWNYVWXNFOC-UHFFFAOYSA-N Sulphur dioxide Chemical compound O=S=O RAHZWNYVWXNFOC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000209140 Triticum Species 0.000 description 4
- 235000021307 Triticum Nutrition 0.000 description 4
- 101150052795 cbh-1 gene Proteins 0.000 description 4
- 101150114858 cbh2 gene Proteins 0.000 description 4
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 4
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 4
- 235000019713 millet Nutrition 0.000 description 4
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 4
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 4
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 4
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 4
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 3
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 3
- 229920002134 Carboxymethyl cellulose Polymers 0.000 description 3
- 244000060011 Cocos nucifera Species 0.000 description 3
- 235000013162 Cocos nucifera Nutrition 0.000 description 3
- 101710121765 Endo-1,4-beta-xylanase Proteins 0.000 description 3
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 3
- PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N arabinose Natural products OCC(O)C(O)C(O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N beta-D-Pyranose-Lyxose Natural products OC1COC(O)C(O)C1O SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 3
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 3
- 235000010948 carboxy methyl cellulose Nutrition 0.000 description 3
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 3
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 3
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 3
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 3
- 239000000446 fuel Substances 0.000 description 3
- 239000010903 husk Substances 0.000 description 3
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 3
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 3
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 3
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 3
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 3
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 3
- 150000004804 polysaccharides Chemical class 0.000 description 3
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 3
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 3
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 3
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 3
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 3
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 3
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 3
- 239000003643 water by type Substances 0.000 description 3
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 2
- 241000228212 Aspergillus Species 0.000 description 2
- 229920002498 Beta-glucan Polymers 0.000 description 2
- 125000002353 D-glucosyl group Chemical group C1([C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O1)CO)* 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108050000194 Expansin Proteins 0.000 description 2
- 108050001049 Extracellular proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000004157 Hydrolases Human genes 0.000 description 2
- 108090000604 Hydrolases Proteins 0.000 description 2
- 229920000168 Microcrystalline cellulose Polymers 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- 241000209504 Poaceae Species 0.000 description 2
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 2
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 2
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 2
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 2
- 239000003513 alkali Substances 0.000 description 2
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 2
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 2
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 description 2
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 2
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 2
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 2
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 description 2
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000001768 carboxy methyl cellulose Substances 0.000 description 2
- 239000008112 carboxymethyl-cellulose Substances 0.000 description 2
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 2
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 2
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 2
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 2
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 2
- 235000013399 edible fruits Nutrition 0.000 description 2
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 2
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 2
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 2
- 238000000227 grinding Methods 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 2
- 229940059442 hemicellulase Drugs 0.000 description 2
- 108010002430 hemicellulase Proteins 0.000 description 2
- 235000008216 herbs Nutrition 0.000 description 2
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 2
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 2
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 2
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 2
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 2
- 239000002655 kraft paper Substances 0.000 description 2
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 2
- 235000019813 microcrystalline cellulose Nutrition 0.000 description 2
- 239000008108 microcrystalline cellulose Substances 0.000 description 2
- 229940016286 microcrystalline cellulose Drugs 0.000 description 2
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 2
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 2
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 2
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 2
- 239000001814 pectin Substances 0.000 description 2
- 229920001277 pectin Polymers 0.000 description 2
- 235000010987 pectin Nutrition 0.000 description 2
- 239000005373 porous glass Substances 0.000 description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 2
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 2
- 230000001502 supplementing effect Effects 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 2
- 230000003313 weakening effect Effects 0.000 description 2
- UDPGUMQDCGORJQ-UHFFFAOYSA-N (2-chloroethyl)phosphonic acid Chemical compound OP(O)(=O)CCCl UDPGUMQDCGORJQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LUEWUZLMQUOBSB-FSKGGBMCSA-N (2s,3s,4s,5s,6r)-2-[(2r,3s,4r,5r,6s)-6-[(2r,3s,4r,5s,6s)-4,5-dihydroxy-2-(hydroxymethyl)-6-[(2r,4r,5s,6r)-4,5,6-trihydroxy-2-(hydroxymethyl)oxan-3-yl]oxyoxan-3-yl]oxy-4,5-dihydroxy-2-(hydroxymethyl)oxan-3-yl]oxy-6-(hydroxymethyl)oxane-3,4,5-triol Chemical compound O[C@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@@H](O[C@@H]2[C@H](O[C@@H](OC3[C@H](O[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H]3O)CO)[C@@H](O)[C@H]2O)CO)[C@H](O)[C@H]1O LUEWUZLMQUOBSB-FSKGGBMCSA-N 0.000 description 1
- PKAUICCNAWQPAU-UHFFFAOYSA-N 2-(4-chloro-2-methylphenoxy)acetic acid;n-methylmethanamine Chemical compound CNC.CC1=CC(Cl)=CC=C1OCC(O)=O PKAUICCNAWQPAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UHPMCKVQTMMPCG-UHFFFAOYSA-N 5,8-dihydroxy-2-methoxy-6-methyl-7-(2-oxopropyl)naphthalene-1,4-dione Chemical compound CC1=C(CC(C)=O)C(O)=C2C(=O)C(OC)=CC(=O)C2=C1O UHPMCKVQTMMPCG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000235389 Absidia Species 0.000 description 1
- 241001019659 Acremonium <Plectosphaerellaceae> Species 0.000 description 1
- 241000222518 Agaricus Species 0.000 description 1
- 241000609240 Ambelania acida Species 0.000 description 1
- 241001510441 Anaeromyces Species 0.000 description 1
- 101100422889 Arabidopsis thaliana SWI3A gene Proteins 0.000 description 1
- 241001513093 Aspergillus awamori Species 0.000 description 1
- 241000228197 Aspergillus flavus Species 0.000 description 1
- 241000892910 Aspergillus foetidus Species 0.000 description 1
- 241001225321 Aspergillus fumigatus Species 0.000 description 1
- 241000351920 Aspergillus nidulans Species 0.000 description 1
- 241000228245 Aspergillus niger Species 0.000 description 1
- 240000006439 Aspergillus oryzae Species 0.000 description 1
- 241001465318 Aspergillus terreus Species 0.000 description 1
- 241000203233 Aspergillus versicolor Species 0.000 description 1
- 235000007319 Avena orientalis Nutrition 0.000 description 1
- 244000075850 Avena orientalis Species 0.000 description 1
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 1
- 208000023514 Barrett esophagus Diseases 0.000 description 1
- 241001530515 Candida sake Species 0.000 description 1
- 244000025254 Cannabis sativa Species 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000186321 Cellulomonas Species 0.000 description 1
- 229920003043 Cellulose fiber Polymers 0.000 description 1
- 241000221955 Chaetomium Species 0.000 description 1
- 241000123346 Chrysosporium Species 0.000 description 1
- 241000193403 Clostridium Species 0.000 description 1
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 1
- 241000222511 Coprinus Species 0.000 description 1
- 241000195493 Cryptophyta Species 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N D-mannopyranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N 0.000 description 1
- 108090000371 Esterases Proteins 0.000 description 1
- 101710112457 Exoglucanase Proteins 0.000 description 1
- 241000605896 Fibrobacter succinogenes Species 0.000 description 1
- 241000223218 Fusarium Species 0.000 description 1
- 241000577870 Fusarium decemcellulare Species 0.000 description 1
- 241000223221 Fusarium oxysporum Species 0.000 description 1
- 241000427940 Fusarium solani Species 0.000 description 1
- 241000577872 Fusarium striatum Species 0.000 description 1
- 241000896533 Gliocladium Species 0.000 description 1
- 108010073178 Glucan 1,4-alpha-Glucosidase Proteins 0.000 description 1
- 108010032083 Glucan 1,4-beta-Glucosidase Proteins 0.000 description 1
- 102100022624 Glucoamylase Human genes 0.000 description 1
- 229920002581 Glucomannan Polymers 0.000 description 1
- 241000055915 Heterocoma lanuginosa Species 0.000 description 1
- 241000223198 Humicola Species 0.000 description 1
- 241001480714 Humicola insolens Species 0.000 description 1
- 229920000057 Mannan Polymers 0.000 description 1
- 241000235395 Mucor Species 0.000 description 1
- 241000226677 Myceliophthora Species 0.000 description 1
- 241000233892 Neocallimastix Species 0.000 description 1
- 241000221960 Neurospora Species 0.000 description 1
- 241000221961 Neurospora crassa Species 0.000 description 1
- 244000070804 Neurospora sitophila Species 0.000 description 1
- 241001489174 Ogataea minuta Species 0.000 description 1
- 241000233654 Oomycetes Species 0.000 description 1
- 241001502335 Orpinomyces Species 0.000 description 1
- 241000228143 Penicillium Species 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 241000222385 Phanerochaete Species 0.000 description 1
- 241000222395 Phlebia Species 0.000 description 1
- 235000014676 Phragmites communis Nutrition 0.000 description 1
- 241000235379 Piromyces Species 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 1
- 241000589516 Pseudomonas Species 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 1
- 241000235527 Rhizopus Species 0.000 description 1
- 241000223253 Rhodotorula glutinis Species 0.000 description 1
- 241000223254 Rhodotorula mucilaginosa Species 0.000 description 1
- 241000282849 Ruminantia Species 0.000 description 1
- 241000222480 Schizophyllum Species 0.000 description 1
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 241000228390 Sporobolomyces johnsonii Species 0.000 description 1
- 241000187747 Streptomyces Species 0.000 description 1
- 241000187134 Streptomyces olivochromogenes Species 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 241000203640 Thermomonospora Species 0.000 description 1
- 241000222354 Trametes Species 0.000 description 1
- 241000223261 Trichoderma viride Species 0.000 description 1
- 241001464837 Viridiplantae Species 0.000 description 1
- 241000307264 Zygorhynchus Species 0.000 description 1
- UGXQOOQUZRUVSS-ZZXKWVIFSA-N [5-[3,5-dihydroxy-2-(1,3,4-trihydroxy-5-oxopentan-2-yl)oxyoxan-4-yl]oxy-3,4-dihydroxyoxolan-2-yl]methyl (e)-3-(4-hydroxyphenyl)prop-2-enoate Chemical compound OC1C(OC(CO)C(O)C(O)C=O)OCC(O)C1OC1C(O)C(O)C(COC(=O)\C=C\C=2C=CC(O)=CC=2)O1 UGXQOOQUZRUVSS-ZZXKWVIFSA-N 0.000 description 1
- 241000192303 [Candida] torresii Species 0.000 description 1
- 241000222295 [Candida] zeylanoides Species 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 239000008186 active pharmaceutical agent Substances 0.000 description 1
- 238000001261 affinity purification Methods 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N alpha-D-galactose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N 0.000 description 1
- -1 arabanan Polymers 0.000 description 1
- PYMYPHUHKUWMLA-WDCZJNDASA-N arabinose Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-WDCZJNDASA-N 0.000 description 1
- 229920000617 arabinoxylan Polymers 0.000 description 1
- 239000010905 bagasse Substances 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 238000010170 biological method Methods 0.000 description 1
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 1
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 1
- 229940035633 candida torresii Drugs 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 1
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 108010091371 endoglucanase 1 Proteins 0.000 description 1
- 108010091384 endoglucanase 2 Proteins 0.000 description 1
- 108010092450 endoglucanase Z Proteins 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 210000003754 fetus Anatomy 0.000 description 1
- 239000000945 filler Substances 0.000 description 1
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 239000002816 fuel additive Substances 0.000 description 1
- 229930182830 galactose Natural products 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 1
- 235000003869 genetically modified organism Nutrition 0.000 description 1
- 229940046240 glucomannan Drugs 0.000 description 1
- 230000009229 glucose formation Effects 0.000 description 1
- 229930182478 glucoside Natural products 0.000 description 1
- 150000008131 glucosides Chemical class 0.000 description 1
- 239000003292 glue Substances 0.000 description 1
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 1
- 239000005431 greenhouse gas Substances 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 210000004209 hair Anatomy 0.000 description 1
- 239000011121 hardwood Substances 0.000 description 1
- 125000004435 hydrogen atom Chemical group [H]* 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 238000001471 micro-filtration Methods 0.000 description 1
- 210000001724 microfibril Anatomy 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 229920001542 oligosaccharide Polymers 0.000 description 1
- 150000002482 oligosaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 230000003204 osmotic effect Effects 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 1
- 230000000737 periodic effect Effects 0.000 description 1
- 238000000053 physical method Methods 0.000 description 1
- 230000008635 plant growth Effects 0.000 description 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 1
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 230000001323 posttranslational effect Effects 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 230000001376 precipitating effect Effects 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 1
- 210000001938 protoplast Anatomy 0.000 description 1
- 229920002477 rna polymer Polymers 0.000 description 1
- 210000004767 rumen Anatomy 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 238000010025 steaming Methods 0.000 description 1
- 229960004793 sucrose Drugs 0.000 description 1
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 1
- 230000009469 supplementation Effects 0.000 description 1
- 230000008961 swelling Effects 0.000 description 1
- 230000002195 synergetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 235000013311 vegetables Nutrition 0.000 description 1
- 229920001221 xylan Polymers 0.000 description 1
- 150000004823 xylans Chemical class 0.000 description 1
- 150000008498 β-D-glucosides Chemical class 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/37—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from fungi
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Mycology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Paper (AREA)
Abstract
Изобретение относится к ферментной композиции, способной эффективно расщеплять целлюлозный материал, и может быть использовано при производстве сахаров из целлюлозной биомассы. Композиция включает смешанную целлюлазную композицию и рекомбинантный сволленин, продуцируемый Trichoderma reesei. Смешанная целлюлазная композиция включает эндоглюканазу, целлобиогидролазы и β-глюкозидазу. Соотношение смешанной целлюлазной композиции и сволленина в предложенной композиции находится между приблизительно 10:1 и приблизительно 1:2. Использование предложенной композиции при расщеплении целлюлозы обеспечивает увеличение выхода глюкозы. 4 з.п. ф-лы, 5 ил., 4 табл., 5 пр.
Description
ПРИОРИТЕТ
Настоящая заявка заявляет приоритет предварительной заявки на патент США № 61/048807, поданной 29 апреля 2008 года, которая включена в настоящее изобретение посредством ссылки.
ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ
Композиции и способы относятся к увеличению эффективности целлюлазы при производстве сахаров из целлюлозных биомасс с использованием полипептида сволленина.
ПРЕДПОСЫЛКИ СОЗДАНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ
В настоящее время возрастает интерес к этанолу в качестве возобновляемого топлива. Использование этанола в качестве присадки к топливу возросло за последние несколько лет и, как ожидается, продолжит расти в обозримом будущем. Использование этанола уменьшает зависимость от импортной нефти, способствует уменьшению выделения вызывающих парниковый эффект газов, обеспечивает экономические выгоды для сельских жителей и создает основу для экономики на основе биоресурсов.
Возможное сырье для целлюлозного этанола включает кукурузную солому, пшеничную солому, тростниково-сахарную багассу, стебли риса, бумажную массу, древесную стружку и биомассу из сельскохозяйственных культур, используемых в качестве источника топлива, таких как быстрорастущие деревья и травы (просо прутьевидное, спороболус, китайский тростник), значительно расширяющие имеющийся в наличии материал для продукции этанола. Хотя целлюлозная биомасса имеется в наличии в больших количествах, основная трудность при промышленном внедрении заключается в снижении затрат на комплексный процесс получения топлива из биомассы, с помощью которого в конечном счете получают этанол. В отличие от крахмала, который содержит гомогенные и легко гидролизуемые полимеры, типичные целлюлозные субстраты/сырье для использования при получении этанола не являются гомогенными по природе. Помимо поддающейся превращению целлюлозы и гемицеллюлозы, они также содержат лигнин и другие компоненты, которые не могут быть легко превращены в сбраживаемые сахара.
Как правило, сырая биомасса должна быть подвергнута тщательной предварительной обработке химическим, физическим или биологическим способом для получения подходящего субстрата/сырья для продукции этанола. Физические методы предварительной обработки включают один или более различных типов измельчения, дробления, облучения, пропаривания/обработки паром и гидротермолиза. Химические методы предварительной обработки включают кислоту, щелочь, органический растворитель, аммиак, диоксид серы, диоксид углерода и гидротермолиз с контролированием рН.
Сохраняется насущная необходимость в уменьшении количества гидролитических ферментов, необходимых для превращения биомассы в сбраживаемый сахар, и/или уменьшении степени предварительной обработки, необходимой для того, чтобы биомасса стала доступной для гидролитических ферментов.
КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
В одном аспекте предоставляется способ увеличения эффективности целлюлазы, включающий (а) объединение целлюлозного субстрата, количества цельной целлюлазы и количества сволленина и (b) инкубирование целлюлозного субстрата, смешанной целлюлазной композиции и сволленина в условиях, благоприятных для гидролиза целлюлозы. В предпочтительном осуществлении целлюлозный субстрат включает молекулы, связанные водородной связью. Целлюлозный субстрат может быть выбран из группы, состоящей из древесины, древесной массы, пульпы для изготовления бумаги, совокупности отходов всех видов бумажной массы, прессованной древесины, кукурузной соломы, кукурузного волокна, риса, отходов производства бумаги и целлюлозы, древесных или травянистых растений, трав, рисовой шелухи, соломы хлопчатника, стержней кукурузного початка, зерновой барды, листьев, пшеничной соломы, волокна кокосового ореха, проса прутьевидного и их смесей.
В связанном аспекте предоставляется способ увеличения эффективности гидролиза целлюлозы путем использования целлюлазы, включающий (а) объединение целлюлозного субстрата, целлюлазной композиции и рекомбинантного сволленина и (b) инкубирование целлюлозного субстрата, целлюлазной композиции и сволленина в условиях, благоприятных для гидролиза целлюлозы, причем присутствие рекомбинантного сволленина увеличивает эффективность гидролиза целлюлозы целлюлазной композицией по сравнению с эффективностью, получаемой с использованием целлюлазной композиции в отсутствие сволленина.
В некоторых вариантах осуществления целлюлазная композиция являются цельной целлюлазной композицией. В некоторых вариантах осуществления целлюлазная композиция являются смешанной целлюлазной композицией. В некоторых вариантах осуществления целлюлазная композиция включает эндоглюканазу, целлобиогидролазы и β-глюкозидазу.
В некоторых вариантах осуществления целлюлазная композиция включает одну или несколько первичных целлюлаз. В некоторых вариантах осуществления целлюлазная композиция состоит по существу из одной или нескольких первичных целлюлаз. В конкретных вариантах осуществления первичные целлюлазы выбирают из CBH1, CBH2, EG1, EG2 и β-глюкозидазы.
В некоторых вариантах осуществления способ выполняют в отсутствие вспомогательных ферментов, отличных от сволленина.
В некоторых вариантах осуществления способ выполняют в отсутствие EG4 и CIP1. В некоторых вариантах осуществления способ выполняют в отсутствие рекомбинантного EG4 или рекомбинантного CIP1. В некоторых вариантах осуществления способ выполняют в отсутствие рекомбинантного EG4 и рекомбинантного CIP1.
В некоторых вариантах осуществления соотношение целлюлаз в целлюлазной композиция и сволленина (в весовом отношении) составляет между приблизительно 20:1 и приблизительно 1:5. В некоторых вариантах осуществления соотношение целлюлаз в целлюлазной композиция и сволленина (в весовом отношении) составляет между приблизительно 10:1 и приблизительно 1:2. В некоторых вариантах осуществления соотношение целлюлаз в целлюлазной композиция и сволленина (в весовом отношении) составляет между приблизительно 5:1 и приблизительно 1:1,5.
В некоторых вариантах осуществления сволленин и целлюлазы присутствуют в приблизительно равном количестве (в весовом отношении). Приводимые в качестве примеров количества сволленина составляют от приблизительно 30% до приблизительно 70%, от приблизительно 40% до приблизительно 60% и приблизительно 50% от общего количества используемых в способе ферментов (в весовом отношении).
В некоторых вариантах осуществления целлюлозный субстрат выбирают из группы, состоящей из древесины, древесной массы, пульпы для изготовления бумаги, совокупности отходов всех видов бумажной массы, прессованной древесины, кукурузной соломы, кукурузного волокна, риса, отходов производства бумаги и целлюлозы, древесных или травянистых растений, трав, рисовой шелухи, соломы хлопчатника, стержней кукурузного початка, зерновой барды, листьев, пшеничной соломы, волокна кокосового ореха, проса прутьевидного и их смесей. В некоторых вариантах осуществления целлюлозным субстратом является древесина мягких пород деревьев (хвойная древесина). В некоторых вариантах осуществления целлюлозным субстратом является субстрат с высоким содержанием лигнина. В некоторых вариантах осуществления целлюлозный субстрат имеет перманганатное число, составляющее 80 или ее.
В некоторых вариантах осуществления увеличение в процентах эффективности целлюлазы составляет по крайней мере приблизительно 10%, по крайней мере приблизительно 15% или даже по крайней мере приблизительно 20%.
В другом аспекте предоставляется ферментная композиция, включающая смешанную или цельную целлюлазную композицию и сволленин. Соотношение смешанной/цельной целлюлазы и сволленина (в весовом отношении) может находиться между приблизительно 20:1 и приблизительно 1:5, включительно. Соотношение смешанной целлюлазы и сволленина (в весовом отношении) может, кроме того, находиться между приблизительно 10:1 и приблизительно 1:2, включительно. Соотношение смешанной целлюлазы и сволленина (в весовом отношении) может даже находиться между приблизительно 5:1 и приблизительно 1:1,5, включительно.
В связанном аспекте предоставляется ферментная композиция, включающая (а) смешанную целлюлазную композицию, включающую эндоглюканазу, целлобиогидролазы и β-глюкозидазу, и (b) рекомбинантный сволленин.
В некоторых вариантах осуществления композиция не включает EG4 или CIP1. В некоторых вариантах осуществления композиция не включает рекомбинантный EG4 или рекомбинантный CIP1. В некоторых вариантах осуществления композиция не включает рекомбинантный EG4 и не включает рекомбинантный CIP1.
В некоторых вариантах осуществления смешанная целлюлазная композиция состоит по существу из основных целлюлаз.
В другом связанном аспекте предоставляется ферментная композиция, состоящая по существу из (а) смешанной целлюлазной композиции, включающей эндоглюканазу, целлобиогидролазы и β-глюкозидазу, и (b) рекомбинантного сволленина.
В некоторых вариантах осуществления соотношение целлюлаз в любой из смешанных целлюлазных композиций и сволленина (в весовом отношении) находится между приблизительно 20:1 и приблизительно 1:5. В некоторых вариантах осуществления соотношение целлюлаз в любой из смешанных целлюлазных композиций и сволленина (в весовом отношении) находится между приблизительно 10:1 и приблизительно 1:2. Заявлена композиция, в которой соотношение целлюлаз в любой из смешанных целлюлазных композиций и сволленина (в весовом отношении) находится между приблизительно 5:1 и приблизительно 1:1,5. В некоторых вариантах осуществления сволленин и целлюлазы присутствуют в приблизительно равном количестве (в весовом отношении).
В некоторых вариантах осуществления количество сволленина (в весовом отношении) в композиции замещает приблизительно равное количество целлюлаз (в весовом отношении) в композиции относительно эффективности целлюлаз на целлюлозном субстрате.
Эти и другие аспекты композиций и способов будут очевидны из следующего описания.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
На фиг.1 иллюстрируется продукция глюкозы с помощью смешанной целлюлазной композиции в присутствии сволленина и в его отсутствие.
На фиг.2А и 2В иллюстрируется влияние сволленина на гидролиз различных целлюлозных субстратов.
На фиг.3 иллюстрируется получение глюкозы с помощью 30 мг общего фермента на г целлюлозы, при этом для фермента предусматривались различные соотношения смешанной целлюлазы и сволленина.
На фиг.4 иллюстрируется расщепление в процентах хвойной целлюлозы при различных относительных концентрациях смешанной целлюлазы и сволленина.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
I. Определения
Перед описанием композиций и способов настоящего изобретения даются определения следующих терминов и выражений. Не определенным терминам должно соответствовать их обычное значение, используемое в данной области техники.
Как используется в тексте заявки термин «сволленин» относится к белку/полипептиду, который способствует потере прочности фильтровальной бумаги и набуханию хлопковолокна без проявления целлюлолитической активности, т.е. каталитической активности, включающей расщепление отдельных цепей целлюлозы до мономера (глюкозы) или олигомера (полисахаридов). Хотя он применим для приблизительной характеристики сволленинов в рамках белков экспансинов, описанных McQueen-Mason (1992) в Plant Cell 4: 1425-1433, также очевидно, что микробные сволленины отличаются по свойствам, например микробные сволленины больше, чем экспансины растений, и имеют низкий уровень идентичности последовательностей с экспансинами растений. Кроме того, некоторые микробные белки сволленины существуют в соединении со связывающим целлюлозу доменом и могут, кроме того, существовать в соединении с каталитическим доменом целлюлазы.
Используемый здесь термин «целлюлозный субстрат» или «целлюлозное сырье» относится к материалам, состоящим из целлюлозы, гемицеллюлозы и β-глюканов, которые являются сшитыми друг с другом и с лигнином. Такие целлюлозные субстраты могут также содержать другие материалы, такие как пектины, белки, крахмал и липиды, но предпочтительно будут иметь целлюлозу, гемицеллюлозу и β-глюканы в качестве основных компонентов.
Используемые здесь термины «очистка» и «выделение», со ссылкой на сволленин, относится к отделению сволленина от некоторых или всех встречающихся в природе компонентов, с которыми он связан в природе, или от некоторых или всех компонентов, с которыми он связан после гетерологичной экспрессии. Термин «компоненты» обычно относится к другим белкам, нуклеиновым кислотам, липидам, материалу клеточной стенки и другим клеточным компонентам.
Используемый здесь термин «перманганатное число» относится к степени лигнификации целлюлозного субстрата. Перманганатные числа можно определить, используя, например, документ Международной организации по стандартизации ISO 302: 2004.
Используемый здесь термин «целлюлоза» относится к полисахариду, состоящему из β(1→4)-связанных единиц D-глюкозы, имеющему общую формулу (С6Н10О5)n. Целлюлоза является структурным компонентом первичной клеточной стенки зеленых растений, многих форм водорослей и оомицетов.
Используемый здесь термин «целлюлаза» относится к ферменту, способному к гидролизу полимеров - целлюлозы на более короткие олигомеры и/или глюкозу.
Используемый здесь термин «цельная целлюлазная композиция/препарат/смесь» или т.п. относится как к встречающимся в природе, так и к не встречающимся в природе композициям, которые включают множество целлюлаз, продуцируемых организмом, например нитчатым грибом. Одним примером цельной целлюлазной композиции является среда (т.е. бульон), в которой культивируют нитчатые грибы, которая включает секретируемые целлюлазы, такие как одна или несколько целлобиогидролаз, одна или несколько эндоглюканаз и одна или несколько β-глюкозидаз в заданном соотношении.
Как используется в тексте заявки «эндоглюканаза (EG)» является ферментом (ЕС 3.2.1.4), который воздействует, главным образом, на аморфные части целлюлозного волокна с гидролизом внутренних β-1,4-глюкозидных связей в районах низкой кристалличности.
Как используется в тексте заявки «целлобиогидролаза (СВН)» или «экзоглюканаза является ферментом (ЕС 3.2.1.91), который гидролизует целлобиозу с восстанавливающего или невосстанавливающего конца целлюлозы с деградацией кристаллической целлюлозы.
Как используется в тексте заявки «β-глюкозидаза» или «β-D-глюкозид-глюкогидроза» является ферментом (ЕС 3.2.1.21), который действует с высвобождением единиц D-глюкозы из целлобиозы, целлоолигосахаридов и других глюкозидов.
Как используется в тексте заявки «гемицеллюлаза» является полимерным компонентом растительных материалов, который содержит сахарные мономеры, отличные от глюкозы, в противоположность целлюлозе, которая содержит только глюкозу. Помимо глюкозы, гемицеллюлоза может включать ксилозу, маннозу, галактозу, рамнозу и арабинозу и т.п., при этом самым часто встречающимся сахарным мономером является ксилоза. Гемицеллюлозы содержат большинство из D-пентозных сахаров и изредка небольшие количества L-сахаров. Сахара в гемицеллюлозе могут быть связаны сложноэфирными связями, а также гликозидными связями. Приводимые в качестве примеров формы гемицеллюлозы включают, но без ограничения, галактан, маннан, ксилан, арабанан, арабиноксилан, глюкоманнан, галактоманан и т.п.
Используемый здесь термин «гемицеллюлаза» относится к классу ферментов, способных к разрыву гемицеллюлозы на составляющие его сахара или более короткие полимеры, и включает эндодействующие гидролазы, экзодействующие гидролазы и различные эстеразы.
Как используется в тексте заявки «основная целлюлаза» или «основной целлюлолитический фермент» представляет собой целлюлазу, которая необходима для эффективного гидролиза целлюлозы или для продукции глюкозы из целлюлозного субстрата. Основные целлюлазы включают CBH1, CBH2, EG1, EG2 и β-глюкозидазу.
Используемый термин «вспомогательный фермент» относится к ферменту, который может быть включен в целлюлазную композицию для увеличения эффективности целлюлазы (или комбинации целлюлаз), но не требуется для эффективного гидролиза целлюлозы или продукции глюкозы из целлюлозного субстрата. Вспомогательные ферменты включают сволленин, EG4, стимулируемый целлюлозой белок (CIP1) и ксиланазу.
Как используется в тексте заявки «встречающаяся в природе» композиция является композицией, которая продуцируется в природе или организмом, который встречается в природе.
Как используется в тексте заявки «вариант» белка отличается от «родительского» белка, из которого он происходит, при замене, делеции или добавлении небольшого числа аминокислотных остатков, например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 или более аминокислотных остатков. В некоторых случаях исходным белком является полипептид «дикого типа», «природный» полипептид или полипептид «природного происхождения». Варианты белков можно охарактеризовать как белки, имеющие определенный процент идентичности последовательностей с родительским белком, например, по крайней мере 80%, по крайней мере 81%, по крайней мере 82%, по крайней мере 83%, по крайней мере 84%, по крайней мере 85%, по крайней мере 86%, по крайней мере 87%, по крайней мере 88%, по крайней мере 89%, по крайней мере 90%, по крайней мере 91%, по крайней мере 92%, по крайней мере 93%, по крайней мере 94%, по крайней мере 95%, по крайней мере 96%, по крайней мере 97%, по крайней мере 98%, даже по крайней мере 99%, который можно определить, используя любую подходящую программу, известную в данной области техники, например, программы, описанные в Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al. (eds.) (1987) Supplement 30, section 7.7.18). Предпочтительные программы включают VECTOR NTI ADVANCETM 9.0 (Invitrogen Corp. Carlbad, CA), программу GCG PILEUP, FASTA (Pearson et al. (1988) Pros. Natl. Acad. Sci. USA 85: 2444-2448) и BLAST (BLAST Manual, Altschul et al., Nat'l. Cent. Biotechnol. Inf., Nat'l Lib. Med. (NCIB NLM NIH), Bethesda, Md., и Altschul et al. (1987) Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402). Другой предпочтительной программой совмещения является ALIGN Plus (Scientific and Educational Software, PA), используя предпочтительно параметры по умолчанию. Другой программой для последовательностей, которая находит применение, является программа для поиска данных TFASTA, имеющаяся в версии 6.0 пакета программ для последовательностей (Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Madison, WI).
Использование единственного числа включает множественное число, кроме особо оговоренных случаев, а использование «или» означает «и/или», кроме особо оговоренных случаев. Не предполагается, что термины «включают», «включающий» и «включает» являются ограничивающими. Термин «по существу состоящий из» означает, что другие компоненты или стадии могут необязательно присутствовать, но они не являются существенными для вызова описываемого эффекта.
Все упоминаемые здесь патенты и публикации, в том числе все аминокислотные и нуклеотидные последовательности, раскрытые в таких патентах и публикациях, включены посредством ссылки.
Следующие сокращения/акронимы имеют следующие значения, кроме случаев, оговоренных особо:
| °С | градусы по Цельсию |
| BSA | бычий сывороточный альбумин |
| CBD | углеродсвязывающий домен |
| кДНК | комплементарная ДНК |
| CMC | карбоксиметилцеллюлоза |
| dH2O или DI | деионизированная вода |
| dIH2O | деионизированная вода, фильтрация через Milli-Q |
| ДНК | дезоксирибонуклеиновая кислота |
| ds или DS | содержимое в виде сухих твердых веществ |
| EDTA | этилендиаминтетрауксусная кислота |
| eq. | эквивалент |
| ETOH | этанол |
| г | грамм |
| GA | глюкоамилаза |
| Genencor | Danisco US Inc, Genencor Division, Palo Alto, CA, США |
| dH2O | вода |
| HPLC | жидкостная хроматография высокого разрешения |
| ч | час |
| IPTG | изопропил-β-D-тиогалактозид |
| МЕ | международная единица |
| кДа | килоДальтон |
| кг | килограмм |
| л | литр |
| М | молярный |
| мг | миллиграмм |
| мин | минута |
| мл | миллилитр |
| мм | миллиметр |
| мМ | миллимолярный |
| М.м. | молекулярная масса |
| Н | нормальный |
| PCS | предварительно обработанная кукурузная солома |
| PEG | полиэтиленгликоль |
| pI | изоэлектрическая точка |
| pNPG: | пара-нитрофенил-α-D-глюкопиранозид |
| РНК | рибонуклеиновая кислота |
| RPM | оборотов в минуту |
| электрофорез в SDS-ПААГ | электрофорез в полиакриламидном геле с натрия додецилсульфатом |
| сек | секунда |
| sp./spp. | вид (единственное число/множественное число) |
| Spz. | SPEZYME |
| Е | единица |
| UFC | полученный с помощью ультрафильтрации концентрат |
| об./об. | в объемом отношении |
| вес/об. | в отношении веса к объему |
| вес/вес | в весовом отношении |
| вес.%: | процент по весу |
| мкг | микрограмм |
| мкл | микролитр |
| мкм | микрометр |
| мкМ | микромолярный |
II. Применение сволленина для увеличения выхода сахара из целлюлозного сырья
Аспект композиций и способов относится к увеличению выхода сахара из целлюлозного сырья/целлюлозных субстратов путем дополнения целлюлазной композиции сволленином. В одном аспекте предоставляется способ усиления ферментативного гидролиза целлюлозы, включающий (а) объединение целлюлозного субстрата, смешанной целлюлазной композиции и сволленина и (b) инкубирование целлюлозного субстрата, смешанной целлюлазной композиции и сволленина в условиях, благоприятных для гидролиза целлюлозы. Композиции и способы основываются на удивительном экспериментальном определении того, что замещение вплоть до 50% смешанной целлюлазной композиции сволленином может в значительной степени увеличить количество сбраживаемого сахара, образуемого из целлюлозного субстрата.
Был идентифицирован ряд белков, названных «экспансинами», в ряде пищевых растений. Полагают, что эти экспансины усиливают поступление воды по осмотическому пути, которое является движущей силой растяжения клеток растений. По мере того как вода поступает в клетку, протопласт увеличивается в объеме, но сдерживается клеточной стенкой, которая удерживается от распада устойчивым комплексом полимеров микрофибрилл целлюлозы, встроенных в клеевидный матрикс из пектинов, гемицеллюлозы и белков. Семейство белков экспансинов, обнаруженных в различных фруктах, овощах, зернах и овсе, функционирует в качестве такого «ослабляющего стенку» фактора, который изменяет механические свойства стенки незрелой клетки и позволяет ей подвергаться процессу растяжения (смотри, например, Shcherban et al. (1995) Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 92: 9245-9249; Wang et al. (1994) Biotech. Lett. 16: 955-958; Keller et al. (1995) The Plant Journal 8: 795-802; Li et al. (1993) Planta, Vol. 191, p. 349-356). Экспансины играют важную роль в росте клеток растений, размягчении мякоти плода, сбрасывании, появлении корневых волосков, проникновении пыльцевых трубок с рыльца и столбика, функционировании меристемы и в других процессах развития, при которых имеет место ослабление клеточной стенки.
Совсем недавно были идентифицированными подобные экспансинам ферменты в микробах в качестве хозяина. Один такой фермент, названный «сволленином», полученный из Trichoderma reesei, описывается в патенте США № 6458928 (включенном сюда посредством ссылки). Последовательность сволленина частично сходна с экспансинами растений, которые, как полагают, разрывают водородные связи между полисахаридами в клеточной стенке. Последовательность природного полипептида, включающая N-концевой сигнальный пептид, представлена как SEQ ID NO: 1. Последовательность зрелого полипептида представлена как SEQ ID NO: 2. В отличие от экспансинов зрелый сволленин включает на своем N-конце связывающий целлюлозу домен (CBD), который связан через линкерный участок с экспансиноподобным доменом. CBD этого вида также встречается в широко известных целлюлазах T.reesei, таких как CBH I и EG II. В отличие от сволленина целлюлазы являются гидролитическими ферментами, по крайней мере в некоторой степени.
MetAlaGlyLysLeuIleLeuValAlaLeuAlaSerLeuValSerLeuSerlleGlnGln AsnCysAlaAlaLeuPheGlyGlnCysGlyGlylleGlyTrpSerGlyThrThrCysCys ValAlaGlyAlaGlnCysSerPheValAsnAspTrpTyrSerGlnCysLeuAlaSerThr GlyGlyAsnProProAsnGlyThrThrSerSerSerLeuValSerArgThrSerSerAla SerSerSerValGlySerSerSerProGlyGlyAsnSerProThrGlySerAlaSerThr TyrThrThrThrAspThrAlaThrValAlaProHisSerGlnSerProTyrProSerlle AlaAlaSerSerCysC-lySerTrpThrLeuValAspAsnValCysCysProSerTyrCys AlaAsnAspAspThrSerGluSerCysSerGlyCysGlyThrCysThrThrProProSer AlaAspCysLysSerC-lyThrMetTyrProGluValHisHisValSerSerAsnGluSer TrpHisTyrSerArgSerThrHisPheGlyLeuThrSerGlyGlyAlaCysGlyPheGly LeuTyrGlyLeuCysThrLysGlySerValThrAlaSerTrpThrAspProMetLeuGly AlaThrCysAspAlaPheCysThrAlaTyrProLeuLeuCysLysAspProThrGlyThr ThrLeuArgGlyAsnPheAlaAlaProAsnGlyAspTyrTyrThrGlnPheTrpSerSer LeuProGlyAlaLeuAspAsnTyrLeuSerCysGlyGluCysIleGluLeuIleGlnThr LysProAspGlyThrAspTyrAlaValGlyGluAlaGlyTyrThrAspProIleThrLeu GluIleValAspSerCysProCysSerAlaAsnSerLysTrpCysCysGlyProGlyAla AspHisCysGlyGluIleAspPheLysTyrGlyCysProLeuProAlaAspSerlleHis LeuAspLeuSerAspIleAlaMetGlyArgLeuGlnGlyAsnGlySerLeuThrAsnGly VallleProThrArgTyrArgArgValGlnCysProLysValGlyAsnAlaTyrlleTrp LeuArgAsnGlyGlyGlyProTyrTyrPheAlaLeuThrAlaValAsnThrAsnGlyPro GlySerValThrLysIleGluIleLysGlyAlaAspThrAspAsnTrpValAlaLeuVal HisAspProAsnTyrThrSerSerArgProGlnGluArgTyrGlySerTrpValllePro GlnGlySerGlyProPheAsnLeuProValGlylleArgLeuThrSerProThrGlyGlu GlnlleValAsnGluC-lnAlalleLysThrPheThrProProAlaThrGlyAspProAsn PheTyrTyrlleAspIleGlyValGlnPheSerGlnAsn (SEQ ID NO: 1)
GlnGlnAsnCysAlaAlaLeuPheGlyGlnCysGlyGlylleGlyTrpSerGlyThrThr CysCysValAlaGlyAlaGlnCysSerPheValAsnAspTrpTyrSerGlnCysLeuAla SerThrGlyGlyAsnProProAsnGlyThrThrSerSerSerLeuValSerArgThrSer SerAlaSerSerSerValGlySerSerSerProGlyGlyAsnSerProThrGlySerAla SerThrTyrThrThrThrAspThrAlaThrValAlaProHisSerGlnSerProTyrPro SerlleAlaAlaSerSerCysGlySerTrpThrLeuValAspAsnValCysCysProSer TyrCysAlaAsnAspAspThrSerGluSerCysSerGlyCysGlyThrCysThrThrPro ProSerAlaAspCysLysSerGlyThrMetTyrProGluValHisHisValSerSerAsn GluSerTrpHisTyrSerArgSerThrHisPheGlyLeuThrSerGlyGlyAlaCysGly PheGlyLeuTyrGlyLeuCysThrLysGlySerValThrAlaSerTrpThrAspProMet LeuGlyAlaThrCysAspAlaPheCysThrAlaTyrProLeuLeuCysLysAspProThr GlyThrThrLeuArgC-lyAsnPheAlaAlaProAsnGlyAspTyrTyrThrGlnPheTrp
SerSerLeuProGlyAlaLeuAspAsnTyrLeuSerCysGlyGluCysIleGluLeuIle GlnThrLysProAspC-lyThrAspTyrAlaValGlyGluAlaGlyTyrThrAspProIle ThrLeuGluIleValAspSerCysProCysSerAlaAsnSerLysTrpCysCysGlyPro GlyAlaAspHisCysGlyGluIleAspPheLysTyrGlyCysProLeuProAlaAspSer IleHisLeuAspLeuSerAspIleAlaMetGlyArgLeuGlnGlyAsnGlySerLeuThr AsnGlyVallleProThrArgTyrArgArgValGlnCysProLysValGlyAsnAlaTyr IleTrpLeuArgAsnC-lyGlyGlyProTyrTyrPheAlaLeuThrAlaValAsnThrAsn GlyProGlySerValThrLysIleGluIleLysGlyAlaAspThrAspAsnTrpValAla LeuValHisAspProAsnTyrThrSerSerArgProGlnGluArgTyrGlySerTrpVal IleProGlnGlySerGlyProPheAsnLeuProValGlylleArgLeuThrSerProThr GlyGluGlnlleValAsnGluGlnAlalleLysThrPheThrProProAlaThrGlyAsp ProAsnPheTyrTyrlleAspIleGlyValGlnPheSerGlnAsn (SEQ ID NO:2)
В некоторых вариантах осуществления сволленин является встречающимся в природе вариантом сволленина T.reesei, аминокислотная последовательность которого идентична на по крайней мере 80%, по крайней мере 85%, по крайней мере 90%, по крайней мере 91%, по крайней мере 92%, по крайней мере 93%, по крайней мере 94%, по крайней мере 95%, по крайней мере 96%, по крайней мере 97%, по крайней мере 98% или даже по крайней мере 99% аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1. В некоторых вариантах осуществления сволленин получен из отличного организма и его аминокислотная последовательность идентична на по крайней мере 80%, по крайней мере 85%, по крайней мере 90%, по крайней мере 91%, по крайней мере 92%, по крайней мере 93%, по крайней мере 94%, по крайней мере 95%, по крайней мере 96%, по крайней мере 97%, по крайней мере 98% или даже по крайней мере 99% аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1.
В дальнейших вариантах осуществления сволленин является искусственно созданным вариантом сволленина, который включает по крайней мере одну замену, вставку или делецию, которая придает выгодное свойство сволленину и в котором оставшаяся часть аминокислотной последовательности (т.е. не включающая одну или несколько замен, вставок или делеций) идентична на по крайней мере 80%, по крайней мере 85%, по крайней мере 90%, по крайней мере 91%, по крайней мере 92%, по крайней мере 93%, по крайней мере 94%, по крайней мере 95%, по крайней мере 96%, по крайней мере 97%, по крайней мере 98% или даже по крайней мере 99% аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1. Замена, вставка или делеция может быть в N-концевом CBD, что оказывает влияние на связывание с целлюлозой, или в части полипептида, отличной от CBD, что оказывает влияние, например, на разрыв водородных связей в целлюлозном субстрате. В связанных вариантах осуществления сволленин представляет собой фрагмент или домен сволленина, который сохраняют описанную здесь биологическую активность. В конкретных вариантах осуществления во фрагменте отсутствует CBD.
Подходящие для использования со сволленином целлюлозные субстраты включают древесину, древесную массу, пульпу для изготовления бумаги, совокупности отходов всех видов бумажной массы, прессованную древесину, кукурузную солому, кукурузное волокно, рис, отходы производства бумаги и целлюлозы, древесные или травянистые растения, травы, рисовую шелуху, солому хлопчатника, стержни кукурузного початка, зерновую барду, листья, пшеничную солому, волокно кокосового ореха, просо прутьевидного и их смеси. Аспектом композиций и способов настоящего изобретения является обнаружение того, что добавление сволленина к целлюлазе увеличивает продукцию сахара при использовании субстратов на основе древесных и травянистых растений. С одной стороны, полагают, что сволленин не является полезным при использовании с субстратами на основе зерен или фруктов. Как правило, благодаря способности сволленина к разрыву водородной связи любой субстрат, в котором водородная связь является преобладающей (например, кристаллическая целлюлоза), по-видимому, является чувствительным к активности сволленина и, следовательно, является подходящим субстратом. Приводимые в качестве примеров целлюлозные субстраты имеют высокое содержание лигнина, как в случае, например, хвойных древесин. В некоторых случаях целлюлозный субстрат имеет перманганатное число, составляющее 80 или больше, например, 80, 81, 82 или больше.
Целлюлозный субстрат может использоваться непосредственно (т.е. без предварительной обработки) или может быть подвергнут предварительной обработке с использованием общепринятых способов, которые известны в данной области техники. Приводимые в качестве примеров варианты осуществления предварительной обработки являются химические, физические и биологические вариант(ы) предварительных обработок. Физические методы предварительной обработки включают, без ограничения, различные типы измельчения, дробления, пропаривания/обработки паром, облучения и гидротермолизиса. Химические методы предварительной обработки включают, без ограничения, разбавленную кислоту, щелочь, органический растворитель, аммиак, диоксид серы, диоксид углерода и гидротермолизис с контролированием рН. Биологические методы предварительной обработки включают, без ограничения, применение растворяющих лигнин микроорганизмов к субстрату.
Ферментативный гидролиз целлюлозы предпочтительно выполняют при температуре в диапазоне от приблизительно 45°С до приблизительно 75°С и при рН от приблизительно 3,5 до приблизительно 7,5. Исходная концентрация целлюлозы в предназначенном для гидролиза реакторе, до начала гидролиза, предпочтительно составляет от приблизительно 4% (в весовом отношении) до приблизительно 15% (в весовом отношении). Объединенная доза всех ферментов в виде основных целлюлаз может составлять от приблизительно 5 до приблизительно 45 мг белка на грамм целлюлозы. Гидролиз может выполняться в течение периода времени, составляющего от приблизительно 12 часов до приблизительно 200 часов. Предпочтительно гидролиз выполняют в течение периода времени, составляющего от приблизительно 15 часов до 100 часов. Должно быть понятно, что условия реакции, как подразумевается, не ограничивают настоящее изобретение никоим образом и могут регулироваться по желанию квалифицированными в данной области техники специалистами.
Предпочтительно процесс гидролиза превращает от приблизительно 80% до приблизительно 100%, или любой занимающий промежуточное положение диапазон, целлюлозы в растворимые сахара. Более предпочтительно процесс ферментативного гидролиза превращает от приблизительно 90% до приблизительно 100% целлюлозы в растворимые сахара или даже от приблизительно 98% до приблизительно 100% целлюлозы в растворимые сахара.
Гидролиз с использованием смешанной целлюлазной композиции и сволленина может быть периодическим гидролизом, непрерывным гидролизом или их комбинацией. Гидролиз может быть с перемешиванием, без перемешивания или их комбинацией. Гидролиз обычно выполняют в предназначенном для гидролиза реакторе. Ферменты в виде основной целлюлазы и сволленина добавляют к предварительного обработанному целлюлозному сырью (также называемому «субстратом») до, во время или после добавления субстрата в предназначенный для гидролиза реактор. Целлюлаза и сволленин могут добавляться одновременно или последовательно в предназначенный для гидролиза реактор. В течение длительного периода времени гидролиза добавляют дополнительную целлюлазу и/или сволленин к частично расщепленному целлюлозному субстрату.
Сволленин можно выделить из микробного штамма, который продуцирует его природно, но предпочтительно он продуцируется генетически модифицированным организмом, в котором кодирующий сволленин или его активный фрагмент ген функционально связан с сильным промотором для сверхэкспрессии белка. Результирующую генную конструкцию (т.е. последовательность нуклеиновой кислоты), включающую по крайней мере часть кодирующего сволленин гена, используют для трансформации гетерологичной или гомологичной клетки-хозяина, которую впоследствии культивируют в условиях, чтобы экспрессировать желаемый белок. Способы экспрессии рекомбинантных белков известны в данной области техники. Подходящие клетки-хозяева включают, например, нитчатые грибы, такие как Trichoderma spp. или Aspergillus spp., и дрожжи. Предпочтительный способ приготовления сволленина осуществляют через трансформацию клетки-хозяина Trichoderma spp. ДНК-конструкцией, включающей по крайней мере фрагмент ДНК, кодирующий часть или весь сволленин, который функционально связан с промотором. Трансформированную клетку-хозяина затем выращивают в условиях, чтобы экспрессировать желаемый белок.
Предпочтительно сволленин продуцируют в виде экстраклеточного белка, который секретируется в среду для культивирования, которую можно использовать в качестве источника сволленина непосредственно (например, в виде бульона) или использовать для дальнейшего выделения и/или очистки сволленина, используя известные в области белков способы. В альтернативном случае, если сволленин экспрессируется в виде внутриклеточного белка, клетки разрушают с последующим выделением и/или очисткой внутриклеточного сволленина.
Если требуется получение белка сволленина в отсутствие целлюлолитической активности, для такого получения применим штамм клетки-хозяина Trichoderma, из которого был делетирован один или несколько генов целлюлаз до введения ДНК-конструкции или плазмиды, содержащей кодирующий сволленин фрагмент ДНК. Такие штаммы можно приготовить с помощью способа, описанного в патенте США № 5246852 и WO 92/06208, сообщенная информация в которых включена таким образом посредством ссылки. При экспрессии сволленина в микроорганизме-хозяине, в котором отсутствует один или несколько генов целлюлаз, процедуры идентификации и последующей очистки упрощаются. Однако для применения в настоящем изобретении нет необходимости в полном удалении целлюлолитических ферментов из очищенного сволленина.
В конкретных вариантах осуществления сволленин или его производное извлекают в активной форме из клетки-хозяина после выращивания в жидких средах. Сволленин может включать соответствующий посттрансляционный процессинг. Экспрессированный сволленин можно извлечь из среды с помощью общепринятых методов, включающих отделения клеток от среды с помощью центрифугирования, фильтрации и преципитации белков в супернатанте или фильтрате с использованием соли, например аммония сульфата. Альтернативно или дополнительно, можно использовать хроматографические способы, такие как ионообменная хроматография или аффинная хроматография. Можно индуцировать антитела (поликлональные или моноклональные) против очищенного сволленина, фрагментов очищенного сволленина или синтетических пептидов, соответствующих частям сволленина.
В некоторых вариантах осуществления белки сволленины отделяют или очищают от других компонентов, с которыми они связаны в природе, или другого компонента клеток, использованных для экспрессии сволленина. Очищенный сволленин не обязательно должен быть лишен всех других компонентов, но имеет более высокое соотношение сволленина и экстраклеточных белков (и/или других компонентов), чем то, которое обнаруживается в природном состоянии, в среде для культивирования или в подвергнутых лизису клетках. Очистку можно выполнить с помощью общепризнанных методов разделения, таких как ионообменная хроматография, аффинная хроматография, разделение на основе гидрофобных взаимодействий, диализ, обработка протеазами, преципитация сульфатом аммония или другой солью, центрифугирование, гель-фильтрация, фильтрация, микрофильтрация, гель-электрофорез или разделение на градиенте для удаления целых клеток, клеточного дебриса, загрязняющих примесей, посторонних белков (в том числе ферментов), которые нежелательны в конечной композиции. Кроме того, возможно последующее добавление компонентов в содержащую сволленин композицию, которые дают дополнительные преимущества, например активирующих агентов, агентов против ингибирования, ионов, соединений для контролирования рН или других ферментов, таких как целлюлаза.
Количество сволленина, добавляемого к гидролитической смеси, может меняться в соответствии с подвергаемой обработке биомассой, но обычно составляет от приблизительно 0,1 до приблизительно 30 мг/г целлюлозы, предпочтительно от приблизительно 2 мг/г до приблизительно 20 мг/г целлюлозы или даже от приблизительно 5 мг/г до приблизительно 15 мг/г целлюлозы. Альтернативно, количество сволленина, используемого в настоящем изобретении, можно определить на основе общего количества целлюлозного субстрата или общего количества сырой или предварительно обработанной биомассы. Обработку сволленином проводят при приблизительно 20 - приблизительно 80°С, предпочтительно при приблизительно 30 - приблизительно 50°С, в диапазоне рН, составляющем от приблизительно 3 до приблизительно 10, предпочтительно от приблизительно 4 до приблизительно 6, в течение от приблизительно 0,1 до приблизительно 24 часов, предпочтительно от приблизительно 2 до приблизительно 6 часов, при загрузке твердых веществ (сухих), составляющей от приблизительно 1% до приблизительно 30%, предпочтительно от приблизительно 15% до приблизительно 25%.
Как правило, ферменты будут использовать в соотношении целлюлаза:сволленин, составляющем от приблизительно 5:1 до приблизительно 1:5. Более предпочтительно, когда ферменты используются в соотношении целлюлаза:сволленин, составляющем от приблизительно 2:1 до приблизительно 1:2. Относительный показатель фермента может меняться в зависимости от типа целлюлозного субстрата. В некоторых случаях сволленин представляет приблизительно равное количество фермента в композиции для обработки целлюлозного материала, по сравнению с количеством целлюлазы в композиции. Приблизительно равное количество означает, что приблизительно 40-60%, например, приблизительно 50%, ферментов представляют собой сволленин. Для микрокристаллического целлюлозного субстрата (т.е. хвойной целлюлозы), богатой водородными связями, может потребоваться больше сволленина, чем для аморфного субстрата (т.е. фосфорная кислота-сволленин-целлюлозы) с относительно более низкой степенью водородных связей.
Смешанная целлюлазная композиция для описанного применения может обладать тремя синергетическими целлюлолитическими активностями: активностями эндо-1,4-β-D-глюканазы, экзо-1,4-β-глюкозидазы и β-D-глюкозидазы. Каждая из этих активностей может обеспечиваться одним или несколькими ферментами целлюлазами, которые являются основными целлюлазами (и их активностями) в композициях и способах настоящего изобретения. Любой фермент целлюлаза в смешанной целлюлазной композиции может обеспечить одну или более из трех целлюлолитических активностей. Приводимые в качестве примеров основные целлюлазы включают CHB1, CBH2, EG1, EG2 и β-глюкозидазу. Целлюлазная композиция может быть раствором белка в воде, суспензией белка в воде, твердым порошком или гранулой или гелем. Смесь, включающая ферменты целлюлазы, может включать добавки, такие как буферы, детергенты, стабилизаторы, наполнители или другие такие добавки, которые хорошо известны квалифицированным в данной области техники специалистам.
В некоторых вариантах осуществления для композиций и способа настоящего изобретения не требуется дополнительный вспомогательный фермент (т.е. отличный от сволленина) в комбинации с основной целлюлазой или комбинацией целлюлаз, которую можно обнаружить в цельном целлюлазном бульоне. Такие дополнительные вспомогательные ферменты включают EG4, CIP1 и ксиланазу. Таким образом, в определенных вариантах осуществления композиции и способы настоящего изобретения по существу состоят из сволленина и одной или нескольких основных целлюлаз в отсутствие вспомогательных ферментов, таких как EG4, CIP1 и/или ксиланаза. В конкретных вариантах осуществления композиции и способы по существу состоят из сволленина и одной или нескольких основных целлюлаз в отсутствие EG4 или CIP1. В более конкретном варианте осуществления композиции и способы по существу состоят из сволленина и одной или нескольких основных целлюлаз в отсутствие EG4 и CIP1.
Целлюлаза и/или сволленин могут происходить из микробов и, в частности, из грибов или бактерий. Микроорганизмы, обладающие целлюлолитическими способностями, могут быть источниками обоих белков целлюлазы и сволленина. В некоторых вариантах осуществления целлюлаза и/или сволленин происходят из Trichoderma spp., в частности, Trichoderma reesei (longibrachiatum). Однако целлюлаза и/или сволленин могут также происходить из гриба, такого как Absidia spp.; Acremonium spp.; Agaricus spp.; Anaeromyces spp.; Aspergillus spp., включающие A. auculeatus, A. awamori, A. flavus, A. foetidus, A. fumaricus, A. fumigatus, A. nidulans, A. niger, A. oryzae, A. terreus и A. versicolor; Aerobasidium spp.; Cepha/osporum spp.; Chaetomium spp.; Chrysosporium spp.; Coprinus spp.; Dactyllum spp.; Fusarium spp., включающие F. conglomerans, F. decemcellulare, F. javanicum, F. lini, Foxysporum и F. solani; Gliocladium spp.; Humicola spp., включающие H. insolens и H. lanuginosa; Mucor spp., Neurospora spp., включающие N. crassa и N. sitophila; Neocallimastix spp.; Orpinomyces spp.; Penicillium spp.; Phanerochaete spp.; Phlebia spp.; Piromyces spp.; Pseudomonas spp.; Rhizopus spp.; Schizophyllum spp.; Trametes spp.; Trichoderma spp., включающие T. reesei, T. reesei (longibrachiatum) и T. viride; и Zygorhynchus spp. Также предусматривается, что сволленин и/или кодирующую сволленин ДНК можно обнаружить в целлюлолитических бактериях, таких как Bacillus spp.; Cellulomonas spp.; Clostridium spp.; Myceliophthora spp.; Thermomonospora spp.; Streptomyces spp., включающие S. olivochromogenes; особенно деградирующих волокна бактериях из рубца жвачных, таких как Fibrobacter succinogenes; и в дрожжах, включающих Candida torresii; C. parapsllosis; C. sake; C. zeylanoides; Pichia minuta; Rhodotorula glutinis; R. mucilaginosa и Sporobolomyces holsaticus.
Аспекты композиций и способов настоящего изобретения могут быть дополнительно поняты с учетом следующих примеров, которые не следует истолковывать как ограничивающие. Квалифицированным в данной области техники специалистам будут очевидны модификации материалов и способов.
ПРИМЕРЫ
Для иллюстрации композиций и способов предоставляются следующие примеры.
Пример 1: Оценка сволленина на хвойно-древесной массе
Хвойно-древесную массу в количестве, эквивалентном 0,1 г целлюлозы, добавляли в 20 мл стеклянный сцинтилляционный флакон для каждого анализа. Путем добавления дистиллированной воды каждый флакон доводили до общего объема 10 мл минус количество фермента, добавляемого при каждом анализе. Содержимое каждого флакона доводили до 50οС нагреванием в термостате, установленном на 50±1°С. В каждый флакон добавляли 1 или 2 мг цельной целлюлазной композиции, полученной из Trichoderma, (т.е. SPEZYME® CP, специфическая активность = 3200-4110 МЕ/г; Genencor International, Inc., Palo Alto, CA, США) до конечной концентрации целлюлазы, составляющей 10 мг целлюлазы на г целлюлозы или 20 мг целлюлазы на г целлюлозы (как описано в таблице 1). Очищенный сволленин или бычий сывороточный альбумин (BSA, Sigma) в качестве контроля добавляли до конечной концентрации, составляющей 10 мг/г целлюлозы (таблица 1). Сволленин приготовляли, очищали и определяли характеристики в соответствии со способом, описанным Saloheimo и др. (2002) в Eur. J. Biochem. 269: 4202-4211 (смотри таблицу 5, ниже). Концентрацию белка сволленина определяли с помощью гель-электрофореза, и она составляла приблизительно 3 мг/г в обоих препаратах.
Флаконы закрывали и инкубировали с острожным вращением (180 оборотов в минуту) при 50°С в течение периода времени, составляющего 24 часа. Для анализа отбирали аликвоту. Твердые вещества удаляли центрифугированием. Супернатант подвергали анализу глюкозы, используя или анализатор глюкозы YSI, или систему HPLC Waters Alliance. Результаты представлены в таблице 1 и на фиг.1. После дополнения сволленином целлюлаза увеличивала концентрацию глюкозы и при использовании хвойно-древесного субстрата, и при использовании субстрата PCS через 24 ч. При тех же условиях загрузки общего белка (20 мг) 10 мг сволленина были по существу способны заместить 10 мг целлюлазы. Контрольный белок (BSA) не вызывал тот же эффект.
| Таблица 1 | ||
| Фермент (/г целлюлозы) | Глюкоза (г/л) | |
| хвойная древесина | PCS 7,2% | |
| 10 мг | 10,7 | 46 |
| 20 мг целлюлозы | 13,6 | 51,9 |
| 10 мг целлюлозы + 10 мг сволленина | 16,4 | 49 |
| 10 мг целлюлозы + 10 мг бычьего сывороточного альбумина | 11,4 | 45,5 |
Пример 2: Субстратная избирательность сволленина
Для увеличения продукции глюкозы после добавления сволленина были проанализированы карбоксиметилцеллюлоза (СМС), 1%; Solka-Floka (синтетическая, чистая микрокристаллическая целлюлоза), 1%; хвойная древесина (перманганатное число = 0); хвойная древесина (перманганатное число = 82); твердая смешанная древесина (перманганатное число = 81); хвойная древесина (перманганатное число = 80) и отработанная древесная масса (перманганатное число = 60). Каждый целлюлозный субстрат в количестве, эквивалентном 0,1 г целлюлозы, добавляли в 20 мл стеклянный сцинтилляционный флакон для каждого анализа. В каждый флакон добавляли 5,0 мл раствора, содержащего 0,1 М натрийцитратный буфер (рН 4,8), 40 мкл (400 мкг) тетрациклина и 30 мкл (300 мкг) циклогексимида. Путем добавления дистиллированной воды каждый флакон доводили до общего объема 10 мл минус количество фермента, добавляемого при каждом анализе. Содержимое каждого флакона доводили до 50°С нагреванием в термостате, установленном на 50±1°С. В каждый флакон добавляли цельную целлюлазную композицию, полученную из Trichoderma, (т.е. SPEZYME® CP, специфическая активность = 3200-4110 МЕ/г; Genencor International, Inc., Palo Alto, CA, США) до конечной концентрации целлюлазы, составляющей 20 мг целлюлазы на г целлюлозы. Кроме того, добавляли β-глюкозидазу до конечной концентрации 64 pNPG Е/г целлюлозы.
Полуочищенный сволленин добавляли до конечной концентрации, составляющей 10 мг/г целлюлозы (ссылаясь на таблицу 1). Как и ранее, сволленин приготовляли, очищали и определяли характеристики в соответствии со способом, описанным Saloheimo и др. (2002) в Eur. J. Biochem. 269: 4202-4211 (смотри пример 5, ниже). Концентрацию белка сволленина определяли с помощью гель-электрофореза, и она составляла приблизительно 2 мг/г в обоих препаратах.
Флаконы закрывали и инкубировали с острожным вращением (180 оборотов в минуту) при 50°С в течение периода времени, составляющего 24 часа. Для анализа отбирали аликвоту. Твердые вещества удаляли центрифугированием. Супернатант подвергали анализу глюкозы, используя или анализатор глюкозы YSI, или систему HPLC Waters Alliance. Результаты представлены в таблице 2 и на фиг.2А и 2В.
| Таблица 2 | |||
| Субстрат | Перманганатное число | Глюкоза (г/л) | |
| без сволленина | 10 мг/г сволленина | ||
| СМС | 0 | 1 | 1,1 |
| Solka Floka | 0 | 4,7 | 5,4 |
| Хвойная древесина | 0 | 9,4 | 10,4 |
| 82 | 2,4 | 5,1 | |
| 80 | 2,5 | 4,8 | |
| Твердая древесина | 81 | 5 | 6,65 |
| Отработанная древесная масса | 60 | 4,75 | 5,3 |
По сравнению с таким синтетическим субстратом, как СМС или Solka-Floka, больший эффект от присутствия сволленина был получен с использованием такой целлюлозный субстрат, как хвойно-древесная или твердодревесная масса, как подтверждено экспериментальным определением того, что больше сахара глюкозы высвобождается из субстрата. Этот эффект является более выраженным при использовании субстрата с высоким содержанием лигнина (например, хвойно-древесной массы, перманганатное число = 82), чем субстрата с нулевым содержанием лигнина (например, хвойно-древесной массы, перманганатное число = 0). Таким образом, добавление сволленина может быть более полезным в случае в высокой степени стабильного (неразлагаемого) субстрата, например, если процесс предварительной обработки субстрата не был оптимизирован, содержание лигнина является высоким, и/или водородные связи в субстрате все еще являются незатронутыми.
Пример 3: Оценка действия сволленина на гидролитическую характеристику целлюлазы на хвойной целлюлозе
Небеленую хвойную целлюлозу с перманганатным числом 82 получали от Smurft Facture (Biganos, FR). Небеленую целлюлозу получали методом Крафта, мыли и затем сушили на воздухе. Каждый образец готовили для обеспечения конечной композиции, содержащей 4% целлюлозы (глюкана) по сухому весу в 10 мл объеме реакционной смеси. Ферменты добавляли к пробному субстрату (как изложено в таблице 2) в 20 мл сцинтилляционных флаконах до общего объема жидкости 10 мл, который включал 50 мМ натрийцитратный буфер (рН 4,8) и антибиотики (тетрациклин и циклогексимид). Цельную целлюлазную композицию, полученную из Trichoderma, (т.е. SPEZYME® CP, Genencor International, Inc., Palo Alto, CA, США), использовали в качестве источника целлюлазы в экспериментах ферментативного гидролиза. Специфическая активность SPEZYME CP составляет 3200-4110 МЕ/г.
Суспензии инкубировали с острожным вращением (180 оборотов в минуту) при 50°С в течение 72 часов. Анализ содержания глюкозы выполняли через 24 и 72 часа следуя стандартным способам. Результаты представлены в таблице 3 и на фиг.3.
| Таблица 3 | ||||
| Целлюлаза (мг/г целлюлозы) | Сволленин Содержание сволленина | Сволленин | Глюкоза (г/л) | |
| 24 ч | 72 ч | |||
| 30 | 0 | 0% | 19,4 | 28,6 |
| 27 | 3 | 10% | 21,6 | 29,8 |
| 24 | 6 | 20% | 22,7 | 33,2 |
| 18 | 12 | 40% | 21,4 | 31,5 |
| 12 | 18 | 60% | 20,3 | 29,2 |
| 6 | 24 | 80% | 15,1 | 22,6 |
| 0 | 30 | 100% | 3 | 4 |
Пример 4: Диаграмма дозирования сволленина на целлюлозных и бумажных субстратах
Два образца небеленной хвойной целлюлозы были получены от Smurft Facture (Biganos, FR). Один образец (названый «с высоким содержанием лигнина») имел высокое содержание лигнина (~15%) и перманганатное число (степень лигнификации) 82. Второй образец (названый «с низким содержанием лигнина») имел низкое содержание лигнина (~5%) и перманганатное число (степень лигнификации) 12. Небеленную целлюлозу получали методом Крафта, мыли и затем сушили на воздухе. Каждый образец отвешивали для получения конечной композиции, содержащей 4% целлюлозы (глюкана) по сухому весу в 10 мл объеме реакционной смеси.
Используемую хвойную целлюлозу отвешивали так, чтобы каждый образец содержал точно 0,4 г целлюлозы (глюкана) по сухому весу, и дозировали, как показано в таблице 3. Ферменты добавляли к пробному субстрату в 20 мл сцинтилляционном флаконе до общего объема жидкости 10 мл, который включал 50 мМ натрийцитратный буфер (рН 4,8) и антибиотики (тетрациклин и циклогексимид). Целлюлазный ферментный комплекс, полученный из генетически модифицированного штамма Trichoderma reesei, (т.е. Accellerase 1000TM, Genencor), использовали в качестве источника целлюлазы в экспериментах ферментативного гидролиза. Сволленин использовали в виде очищенного препарата, как указано выше и описано в примере 5. Концентрация сволленина по оценке с помощью гель-электрофореза составляла приблизительно 2 мг/г. Известно, что очищенный экстракт не обладает целлюлазной активностью. Загрузка твердых веществ составляла 0,4 г целлюлозы в общем объеме жидкости 10 мл, что дает 4% целлюлозную (глюкановую) загрузку.
Реакционную смесь инкубировали с острожным встряхиванием (200 оборотов в минуту) при 50°С в течение 72 ч. Анализ концентраций глюкозы и целлобиозы выполняли используя систему HPLC Waters. Используемую для анализа сахара колонку для HPLC покупали у BioRad (Aminex HPX-87H, BioRad Inc., Hercules, CA). Определяли продукцию и глюкозы, и целлобиозы. Расщепление целлюлозы в процентах (образованная глюкоза плюс образованная целлобиоза, разделенные на вводимую целлюлозу) суммировано в таблице 4 и на фиг.4. При тех же условиях загрузки общего белка (30 мг) сволленин был по существу способен заместить 50% целлюлазы из Spezyme CP (таблица 3). Дополнение ACCELLERASE сволленином вызывало благоприятный эффект при использовании субстратов как с высоким, так и с низким содержанием лигнина (таблица 4).
| Таблица 4 | |||
| Целлюлаз (мг/г целлюлозы) |
Сволленин (мг/г целлюлозы) |
% расщепления целлюлозы | |
| С высоким содержанием лигнина | С низким содержанием лигнина | ||
| 10 | 0 | 10,6 | 25,4 |
| 20 | 0 | 17,8 | 41,6 |
| 10 | 5 | 13,1 | 30,2 |
| 10 | 10 | 13,2 | 29,7 |
| 10 | 15 | 13,6 | 29,2 |
| 10 | 20 | 14,8 | 30,0 |
| 10 | 30 | 17,1 | 31,5 |
Пример 5: Очистка сволленина
Буфер (50 мМ Трис, рН 7,0) и натрия хлорид (200 мм) добавляли к 2 л полученного с помощью ультрафильтрации концентрата (UFC) культуры штамма T. reesei, из которого были делетированы четыре основные целлюлазы (CBH1, CBH2, EG1 и EG2) и в котором ген сволленина сверхэкспресировался под контролем промотора cbh1, при перемешивании. рН доводили до 7,0. К этой смеси добавляли 50 мл агента для аффинной очистки связывающего целлюлозу домена (CDB) (т.е. смолы Cbind 200, каталожный № 70121, Novozymes A/S, Bagsvaerd, DK) с последующим перемешиванием в течение 1 ч. Эту смесь затем подвергали фильтрации, используя фильтрующий элемент из пористого стекла, и собирали несвязавшийся материал. Смолу со связанным сволленином промывали дважды, используя 2 л 50 мМ Трис, рН 7,0 и 200 мМ натрия хлорид. Сволленин элюировали со смолы путем смешивания смолы со связанным сволленином с водой MilliQ (2 л) в течение 0,5 ч и затем фильтрования смеси, используя фильтрующий элемент из пористого стекла, в 2 л резервуар. Этот процесс элюции водой повторяли для обеспечения полной элюции сволленина.
Элюат концентрировали, используя систему для ультрафильтрации с предельным пропусканием М.м. 10 кДа. Концентрат (800 мл) был готов для анализа и дальнейшего использования. Концентрация белка сволленина по оценке с помощью гель-электрофореза составляла приблизительно 3 мг/г. Обратите внимание, что предварительно очищенный экстракт, как известно, не обладает значительной целлюлазной активностью.
Claims (5)
1. Ферментная композиция, способная эффективно разлагать целлюлозный материал, включающая
(a) смешанную целлюлазную композицию, включающую эндоглюканазу, целлобиогидролазы и β-глюкозидазу, и
(b) рекомбинантный сволленин, продуцируемый Trichoderma reesei, в которой соотношение целлюлаз, включающих эндоглюканазу, целлобиогидролазы и β-глюкозидазу в смешанной целлюлазной композиции, и сволленина в весовом отношении находится между приблизительно 10:1 и приблизительно 1:2.
(a) смешанную целлюлазную композицию, включающую эндоглюканазу, целлобиогидролазы и β-глюкозидазу, и
(b) рекомбинантный сволленин, продуцируемый Trichoderma reesei, в которой соотношение целлюлаз, включающих эндоглюканазу, целлобиогидролазы и β-глюкозидазу в смешанной целлюлазной композиции, и сволленина в весовом отношении находится между приблизительно 10:1 и приблизительно 1:2.
2. Композиция по п.1, которая не включает EG4 или CIP1.
3. Композиция по п.1, которая не включает рекомбинантный EG4 или рекомбинантный CIP1.
4. Композиция по п.1, которая не включает рекомбинантный EG4 и не включает рекомбинантный CIP1.
5. Композиция по любому из пп.1-4, в которой смешанная целлюлазная композиция состоит по существу из основных целлюлаз.
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US4880708P | 2008-04-29 | 2008-04-29 | |
| US61/048,807 | 2008-04-29 | ||
| PCT/US2009/042102 WO2009134878A1 (en) | 2008-04-29 | 2009-04-29 | Swollenin compositions and methods of increasing the efficiency of a cellulase |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2010148388A RU2010148388A (ru) | 2012-06-10 |
| RU2529949C2 true RU2529949C2 (ru) | 2014-10-10 |
Family
ID=40829628
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2010148388/10A RU2529949C2 (ru) | 2008-04-29 | 2009-04-29 | Ферментная композиция, способная эффективно разлагать целлюлозный материал |
Country Status (13)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US20110136182A1 (ru) |
| EP (1) | EP2283145A1 (ru) |
| JP (1) | JP5439473B2 (ru) |
| KR (1) | KR20110004861A (ru) |
| CN (1) | CN102016055A (ru) |
| AU (1) | AU2009243081B2 (ru) |
| BR (1) | BRPI0910940A2 (ru) |
| CA (1) | CA2725430A1 (ru) |
| CO (1) | CO6311117A2 (ru) |
| MX (1) | MX2010011722A (ru) |
| MY (1) | MY152682A (ru) |
| RU (1) | RU2529949C2 (ru) |
| WO (1) | WO2009134878A1 (ru) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2696074C1 (ru) * | 2018-11-16 | 2019-07-30 | Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Федеральный исследовательский центр питания, биотехнологии и безопасности пищи | Штамм мицелиального гриба trichoderma reesei - продуцент комплекса эндоглюканазы, ксиланазы и пектиназ для получения белковых добавок на основе зернового и зернобобового сырья для применения в кормопроизводстве |
| US11124460B2 (en) | 2016-03-16 | 2021-09-21 | Spogen Biotech Inc. | Methods for promoting plant health using free enzymes and microorganisms that overexpress enzymes |
| RU2763378C2 (ru) * | 2016-09-23 | 2021-12-28 | ДюПон НЬЮТРИШН БАЙОСАЙЕНСИЗ АпС | ПРИМЕНЕНИЕ АКТИВНЫХ ПРИ НИЗКОМ ЗНАЧЕНИИ pH АЛЬФА-1,4/1,6-ГЛИКОЗИДГИДРОЛАЗ В КАЧЕСТВЕ КОРМОВОЙ ДОБАВКИ ДЛЯ ЖВАЧНЫХ ЖИВОТНЫХ ДЛЯ УЛУЧШЕНИЯ ПЕРЕВАРИВАНИЯ КРАХМАЛА |
| RU2791882C2 (ru) * | 2016-09-23 | 2023-03-14 | ДюПон НЬЮТРИШН БАЙОСАЙЕНСИЗ АпС | ПРИМЕНЕНИЕ АКТИВНЫХ ПРИ НИЗКОМ ЗНАЧЕНИИ pH АЛЬФА-1,4/1,6-ГЛИКОЗИДГИДРОЛАЗ В КАЧЕСТВЕ КОРМОВОЙ ДОБАВКИ ДЛЯ ЖВАЧНЫХ ЖИВОТНЫХ ДЛЯ УЛУЧШЕНИЯ ПЕРЕВАРИВАНИЯ КРАХМАЛА |
Families Citing this family (15)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DK2480660T5 (da) | 2009-09-23 | 2020-11-09 | Danisco Us Inc | Hidtil ukendte glycosylhydrolaseenzymer og anvendelser heraf |
| US8391667B2 (en) | 2009-10-05 | 2013-03-05 | Finisar Corporation | Latching mechanism for a module |
| CN107287250A (zh) * | 2009-12-23 | 2017-10-24 | 丹尼斯科美国公司 | 提高同步糖化发酵反应效率的方法 |
| BR112012033396A2 (pt) * | 2010-06-29 | 2015-06-23 | Dsm Ip Assets Bv | Polipetídeo tendo atividade swollenin e seus usos. |
| JP5881234B2 (ja) * | 2010-07-14 | 2016-03-09 | 東レ株式会社 | 変異型βグルコシダーゼ、バイオマス分解用酵素組成物および糖液の製造方法 |
| CA2830508A1 (en) | 2011-03-17 | 2012-09-20 | Danisco Us Inc. | Method for reducing viscosity in saccharification process |
| WO2013121551A1 (ja) * | 2012-02-16 | 2013-08-22 | 日揮株式会社 | グルコースを主成分とする糖類の製造方法 |
| CN102618598B (zh) * | 2012-04-16 | 2013-08-21 | 山东省农业科学院农业资源与环境研究所 | 一种利用扩张蛋白提高虫草多糖产量的液体发酵方法 |
| WO2013165568A1 (en) * | 2012-05-01 | 2013-11-07 | Enzymatic Deinking Technologies, Llc | Pulp fiber modification using expansin or swollenin in combinations with one or more enzymes |
| JP6131321B2 (ja) | 2012-06-08 | 2017-05-17 | フレゼニウス メディカル ケア ホールディングス インコーポレイテッド | 断片的バイオインピーダンスを使用した腹膜透析の際に限外濾過体積をモニタリングおよび制御するシステムおよび方法 |
| US9354407B2 (en) | 2012-08-10 | 2016-05-31 | Finisar Corporation | Biasing assembly for a latching mechanism |
| JP6327822B2 (ja) * | 2013-09-27 | 2018-05-23 | 国立大学法人富山大学 | 糸状菌を用いる木質系バイオマスからのエタノールの製造方法 |
| CN103981235B (zh) * | 2014-04-18 | 2016-07-06 | 山东龙力生物科技股份有限公司 | 一种提高纤维素酶水解木质纤维素效率的方法 |
| CN112461632B (zh) * | 2020-09-10 | 2022-05-27 | 南京农业大学 | 一种从花粉管中提取纤维素的方法 |
| CN117924452B (zh) * | 2024-03-21 | 2024-07-09 | 华南农业大学 | 一种重组玉米膨胀蛋白及其协同纤维素酶在降解木质纤维素中的应用 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| SU771153A1 (ru) * | 1979-01-10 | 1980-10-15 | Всесоюзный Научно-Исследовательский Институт Продуктов Брожения | Способ гидролиза растительного сырь |
| WO1999002693A2 (en) * | 1997-07-11 | 1999-01-21 | Genencor International, Inc. | Microbial swollenin protein; dna sequences encoding such swollenins and method of producing such swollenins |
| DE102004042689A1 (de) * | 2004-09-01 | 2006-03-02 | Biopract Gmbh | Verfahren zur Beschleunigung und Effizienzsteigerung des Faulprozesses von Klärschlämmen |
Family Cites Families (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5246853A (en) * | 1990-10-05 | 1993-09-21 | Genencor International, Inc. | Method for treating cotton-containing fabric with a cellulase composition containing endoglucanase components and which composition is free of exo-cellobiohydrolase I |
| CA2350605A1 (en) * | 1998-12-10 | 2000-06-15 | Genencor International, Inc. | Improved cellulase treatments for fabric |
| EP1485495B1 (en) * | 2002-03-15 | 2010-09-15 | Iogen Energy Corporation | Method for glucose production using endoglucanase core protein for improved recovery and reuse of enzyme |
| RU2008144018A (ru) * | 2006-04-06 | 2010-05-20 | Энститю Франсэ дю Петроль (FR) | Слитые белки ферментов, разрушающих стенки растительных клеток, и сволленина и их применение |
| US8017373B2 (en) * | 2006-08-31 | 2011-09-13 | Iogen Energy Corporation | Process for enzymatic hydrolysis of pretreated lignocellulosic feedstocks |
| DK2188381T3 (da) * | 2007-08-30 | 2012-04-02 | Iogen Energy Corp | Enzymatisk hydrolyse af lignocellulosisk råmateriale med anvendelse af accessoriske enzymer |
-
2009
- 2009-04-29 BR BRPI0910940A patent/BRPI0910940A2/pt not_active IP Right Cessation
- 2009-04-29 US US12/990,467 patent/US20110136182A1/en not_active Abandoned
- 2009-04-29 CA CA2725430A patent/CA2725430A1/en not_active Abandoned
- 2009-04-29 EP EP09739680A patent/EP2283145A1/en not_active Withdrawn
- 2009-04-29 WO PCT/US2009/042102 patent/WO2009134878A1/en active Application Filing
- 2009-04-29 AU AU2009243081A patent/AU2009243081B2/en not_active Ceased
- 2009-04-29 MX MX2010011722A patent/MX2010011722A/es active IP Right Grant
- 2009-04-29 MY MYPI20104471 patent/MY152682A/en unknown
- 2009-04-29 RU RU2010148388/10A patent/RU2529949C2/ru not_active IP Right Cessation
- 2009-04-29 CN CN200980115209XA patent/CN102016055A/zh active Pending
- 2009-04-29 KR KR1020107024210A patent/KR20110004861A/ko not_active Application Discontinuation
- 2009-04-29 JP JP2011507611A patent/JP5439473B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
2010
- 2010-10-25 CO CO10132157A patent/CO6311117A2/es not_active Application Discontinuation
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| SU771153A1 (ru) * | 1979-01-10 | 1980-10-15 | Всесоюзный Научно-Исследовательский Институт Продуктов Брожения | Способ гидролиза растительного сырь |
| WO1999002693A2 (en) * | 1997-07-11 | 1999-01-21 | Genencor International, Inc. | Microbial swollenin protein; dna sequences encoding such swollenins and method of producing such swollenins |
| DE102004042689A1 (de) * | 2004-09-01 | 2006-03-02 | Biopract Gmbh | Verfahren zur Beschleunigung und Effizienzsteigerung des Faulprozesses von Klärschlämmen |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| LEVASSEUR A. ET AL. Production of a chimeric enzyme tool associating. the Trichoderma reesei swollenin with the Aspergillus niger feruloyl esterase A for release of ferulic acid // Appl Microbiol Biotechnol, 2006, 73:872-880. SALOHEIMO M. ET AL. Swollenin, a Trichoderma reesei protein with sequence similarity to the plant expansins, exhibits disruption activity on cellulosic materials // Eur. J. Biochem., 269, 4202-4211 (2002) * |
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US11124460B2 (en) | 2016-03-16 | 2021-09-21 | Spogen Biotech Inc. | Methods for promoting plant health using free enzymes and microorganisms that overexpress enzymes |
| RU2802848C2 (ru) * | 2016-03-16 | 2023-09-05 | Споген Биотек Инк. | Способы улучшения здоровья растения с применением свободных ферментов и микроорганизмов, экспрессирующих ферменты на повышенном уровне |
| RU2802848C9 (ru) * | 2016-03-16 | 2023-12-07 | Споген Биотек Инк. | Способы улучшения здоровья растения с применением свободных ферментов и микроорганизмов, экспрессирующих ферменты на повышенном уровне |
| RU2763378C2 (ru) * | 2016-09-23 | 2021-12-28 | ДюПон НЬЮТРИШН БАЙОСАЙЕНСИЗ АпС | ПРИМЕНЕНИЕ АКТИВНЫХ ПРИ НИЗКОМ ЗНАЧЕНИИ pH АЛЬФА-1,4/1,6-ГЛИКОЗИДГИДРОЛАЗ В КАЧЕСТВЕ КОРМОВОЙ ДОБАВКИ ДЛЯ ЖВАЧНЫХ ЖИВОТНЫХ ДЛЯ УЛУЧШЕНИЯ ПЕРЕВАРИВАНИЯ КРАХМАЛА |
| RU2791882C2 (ru) * | 2016-09-23 | 2023-03-14 | ДюПон НЬЮТРИШН БАЙОСАЙЕНСИЗ АпС | ПРИМЕНЕНИЕ АКТИВНЫХ ПРИ НИЗКОМ ЗНАЧЕНИИ pH АЛЬФА-1,4/1,6-ГЛИКОЗИДГИДРОЛАЗ В КАЧЕСТВЕ КОРМОВОЙ ДОБАВКИ ДЛЯ ЖВАЧНЫХ ЖИВОТНЫХ ДЛЯ УЛУЧШЕНИЯ ПЕРЕВАРИВАНИЯ КРАХМАЛА |
| RU2696074C1 (ru) * | 2018-11-16 | 2019-07-30 | Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Федеральный исследовательский центр питания, биотехнологии и безопасности пищи | Штамм мицелиального гриба trichoderma reesei - продуцент комплекса эндоглюканазы, ксиланазы и пектиназ для получения белковых добавок на основе зернового и зернобобового сырья для применения в кормопроизводстве |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO2009134878A1 (en) | 2009-11-05 |
| AU2009243081B2 (en) | 2013-08-15 |
| JP5439473B2 (ja) | 2014-03-12 |
| CA2725430A1 (en) | 2009-11-05 |
| BRPI0910940A2 (pt) | 2015-10-06 |
| JP2011518576A (ja) | 2011-06-30 |
| KR20110004861A (ko) | 2011-01-14 |
| RU2010148388A (ru) | 2012-06-10 |
| CN102016055A (zh) | 2011-04-13 |
| MX2010011722A (es) | 2010-11-30 |
| MY152682A (en) | 2014-10-31 |
| EP2283145A1 (en) | 2011-02-16 |
| US20110136182A1 (en) | 2011-06-09 |
| CO6311117A2 (es) | 2011-08-22 |
| AU2009243081A1 (en) | 2009-11-05 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| RU2529949C2 (ru) | Ферментная композиция, способная эффективно разлагать целлюлозный материал | |
| EP1320588B2 (en) | Method for glucose production with a cellulase mixture comprising a modified cellulase | |
| CA2479248C (en) | Method for glucose production using endoglucanase core protein for improved recovery and reuse of enzyme | |
| EA035176B1 (ru) | Способ ферментативного гидролиза лигноцеллюлозного материала и ферментации сахаров | |
| CA2824494A1 (en) | Mutant cellobiohydrolase | |
| US20240254520A1 (en) | Polypeptides and compositions with lytic polysaccharide oxidase activity | |
| CN104428422A (zh) | 使用来自木质纤维素材料的生物化学转化过程的液体残余物生产酶混合物的方法 | |
| EP2553094A2 (en) | Novel cbh1-eg1 fusion proteins and use thereof | |
| WO2022214459A1 (en) | Enzyme composition | |
| EP4320257A1 (en) | Enzyme composition | |
| EP4028536A1 (en) | Enzyme composition | |
| WO2016169892A1 (en) | Process for enzymatic hydrolysis of lignocellulosic material and fermentation of sugars | |
| EP4320252A1 (en) | Enzyme composition | |
| BR112020023198A2 (pt) | processo para produção de um polipeptídeo | |
| BR112019009796A2 (pt) | composição de enzimas | |
| EA041359B1 (ru) | Способ ферментативного гидролиза лигноцеллюлозного материала и ферментации сахаров |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20160430 |